CN1704756A - 乙型肝炎e抗原酶联免疫定量法测定试剂盒及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫诊断试剂技术领域。本发明公开了一种乙型肝炎e抗原酶联免疫定量法测定试剂盒。本发明的试剂盒包括HbeAg标准品、抗体预包被反应条、酶标记乙型肝炎e抗体和阳性对照液、阴性对照液、洗涤液、底物缓冲液与终止液组成。本发明的试剂盒与HBV－PVC荧光法想必具有快速、简便、灵敏、价廉、重复性好的优点，是对HBV感染、复制和乙肝病人的诊断、治疗和预后有很好的量化方法，有较高的临床使用价值。本发明提供了制备方法。

Description

乙型肝炎e抗原酶联免疫定量法测定试剂盒及制备方法

技术领域

本发明属于免疫诊断试剂技术领域。具体涉及一种乙型肝炎e抗原酶联免疫定量法测定试剂盒及制备方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)肝炎是一种较常见的疾病，在全世界乙型肝炎e抗原(BbsAg)携带者约有1.3亿人。长期以来，临床医生是根据“二对半”五种试剂盒检验结果判断乙肝患者的病情。但是这五种试剂查的是与乙型肝炎病毒(HBV)相关的表面和核内抗原和抗体。仅能定性，不能定量。对治疗效果及病情变化较难做出确切的判断。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，设计乙型肝炎e抗原酶联免疫定量法测定试剂盒。

本发明提供了一种乙型肝炎e抗原酶联免疫定量法测定试剂盒(定量HbeAg酶免试剂盒)。本发明的试剂盒包括主要成分为乙型肝炎e抗原(HbeAg)标准品、抗体预包被反应条、酶标记抗乙型肝炎e抗体(HbeAg)单抗与次要成分为阳性对照液1支、阴性对照液1支、20倍浓洗涤液1瓶、底物缓冲液2瓶和终止液1瓶组成。

本发明的试剂盒中所述乙型肝炎e抗原标准品为用HBV(乙型肝炎病毒)重组的HbeAg片断1-178氨基酸(aa)，用抗HbeAb多抗预包被反应条为48或96孔；酶标记的HbeAb单抗为辣根过氧物酶；阳性对照液为HbeAb阳性血清；阴性对照液为正常人血清；底物缓冲液分别为H₂O₂和3，3’5.5’-四甲基联苯胺(TMB)各一瓶，终止液为4NH₂SO₄。

本发明“乙肝病毒HbeAg酶免定量法测定试剂盒”检测的HbeAg含量与聚合酶链反应(PCR)有非常显著的一致性，所以检测出病人HbeAg的含量，就能知道HBV-DNA含量，可以根据乙型肝炎e抗原的含量的多少判断治疗乙肝病人药物的效果及其病情的变化。

一、定量法HbeAg酶免试剂盒的实验方法

定量HbeAg检测的具体操作如下：

(1)取出已包被条孔，插入支架上，用胶布固定，以防脱落。

(2)反应孔中分别加各浓度标准品每孔加0、7.5、31.15、125.0、250.0、500.0ng/ml、待检血清、阴性对照血清及阳性质控血清各50μl，每次实验设空白1孔，加蒸馏水50μl，然后除空白孔外各孔加酶标记液50μl，置37℃中反应30分钟。

(3)甩去反应孔内液体在草纸上拍2-3下，然后用洗涤液洗5次，每次孔中加满洗涤液后停留30秒钟，甩去洗涤液后都要在草纸上拍干，以便洗涤彻底。(20倍浓洗涤液1ml+19ml蒸馏水即为工作洗涤液)

(4)各孔滴加底物缓冲液甲、乙各1滴，37℃中反应10分钟后再各孔滴加终止液1滴，置酶标仪450nm波长读取各孔光密度(OD)值。

(5)以标准品浓度为横座标，OD值为纵座标绘出标准曲线，以各待测血清OD值在标准曲线上查出该血清的HbeAg浓度。

二、定量法测HbeAg酶免试剂盒方法学鉴定

用国家药品生物制品检定所提供的参考品进行检定，见下表1：

表1

检验项目	标准规定	检验结果
			阴性参考品符合率	不得出现假阳性(0/15)(+/-)	0/15
阳性参考品符合率	允许出现1份假阴性(1/10)(-/+)	1/10
			精密性CV(％)	≤15％(n＝10)	≤15％(n＝10)
灵敏度	≤2NCU/ml	≤2NCU/ml
			稳定性	试剂各组分置37℃至少3天	符合标准

说明“定量法HbeAg酶免试剂盒”的特异性、精密性、灵敏度和稳定性是良好的合格的。

三、定量法HbeAg酶免试剂盒的定量标准曲线的制定

用HBV-DNA重组HbeAg基因片断的1-178氨基酸(aa)经纯化后，分装成标准品为0、7.5、31.15、125.0、250.0、500.0ng/ml共6支。用本试剂盒检测的6种标准的OD值为纵坐标，HbeAg的6个标准含量为横坐标绘制成HbeAg试剂盒的定量标准曲线；

四、正常人HbeAg含量及灰区的确定

随机取288名献血员血清用“定量法乙肝病毒HbeAg酶联免疫测定试剂盒测定结果如下：

288名献血员血清HbeAg测定的OD值均值(X)＝0.113，标准差(SD)＝0.0474。所以其OD值的cut off值(临界值)为均值(X)+3SD＝0.113+0.142＝0.255。再查标准曲线光密度0.255＝6.8ng/ml血清。即450nM测定血清OD值大于0.255＝6.8ng/ml血清者为阳性。

灰区范围的确定：

HbeAg阴性或正常(献血员)人的OD值为(X)＝0.113，HbeAg阳性的OD值为X(0.113)+3SD(0.142)＝0.255，其HbeAg含量为6.8ng/ml血清。则灰区OD值范围就是0.113至0.255之间，遇灰区患者视为可凝要复查。(附表1：288名献血员HBeAg的OD值)

本发明定量HbeAg酶免试剂盒的临床应用和与定量PCR荧光试剂盒比较

第二军医大学附属长海医院、南京市第二医院和上海市传染病医院使用本发明的“定量法HbeAg酶免试剂盒”和“HBV的PCR荧光定量法检测试剂盒”同时检测乙肝患者阳性血清168份，以比较两种定量之间的相关性。

一、临床血清标本的来源：

各医院临床收集乙肝患者血清标本总数为168份，其中长海医院79份、南京二院55份、传染病医院34份，共168份。

另外，从长海医院收集到献血员血288份(做正常值用)

二、使用定量法HbeAg酶免法与HBV-PCR荧光定量法比较

(1)方法

三个医院分别使用“定量法HbeAg酶免试剂盒”(按其说明书操作)和PCR荧光定量法试剂盒(按HBV-PCR荧光检测试剂盒说明书操作-深圳匹基生物技术开发有限公司)检测同一血样168份，并经统计学处理结果表明，该两种方法检测的结果非常显著的相关，以表2和图2-4显示如后：

(2)结果

三个医院分别使用“定量法HbeAg酶免试剂盒”和HBV-PCR荧光定量法试剂盒检测同一血样168份结果(见表3)。

表2 288名鲜血员HBeAg的OD值

0.049	0.075	0.076	0.080	0.071	0.082	0.088	0.052	0.071	0.070	0.071	0.063
												0.063	0.075	0.079	0.079	0.075	0.150	0.076	0.067	0.075	0.067	0.074	0.080
0.075	0.258	0.077	0.081	0.073	0.083	0.075	0.082	0.094	0.070	0.074	0.072
												0.063	0.072	0.076	0.083	0.077	0.083	0.075	0.086	0.0.77	0.089	0.064	0.070
0.066	0.070	0.077	0.077	0.074	0.074	0.084	0.078	0.079	0.069	0.066	0.053
												0.069	0.084	0.075	0.076	0.083	0.086	0.071	0.075	0.084	0.080	0.067	0.076
0.125	0.067	0.072	0.088	0.079	0.082	0.086	0.087	0.074	0.076	0.089	0.075
												0.069	0.077	0.070	0.079	0.073	0.091	0.068	0.073	0.080	0.078	0.070	0.074
0.074	0.071	0.077	0.079	0.070	0.067	0.089	0.070	0.191	0.069	0.129	0.068
												0.076	0.089	0.077	0.075	0.088	0.141	0.082	0.079	0.088	0.072	0.067	0.125
0.075	0.232	0.081	0.156	0.074	0.069	0.082	0.082	0.074	0.074	0.083	0.067
												0.056	0.070	0.074	0.081	0.079	0.086	0.075	0.074	0.077	0.077	0.071	0.065
0.072	0.067	0.097	0.080	0.086	0.074	0.083	0.079	0.082	0.078	0.074	0.065
												0.075	0.075	0.073	0.096	0.085	0.076	0.083	0.075	0.078	0.079	0.261	0.074
0.082	0.073	0.069	0.075	0.067	0.077	0.150	0.076	0.077	0.079	0.076	0.062
												0.068	0.074	0.074	0.074	0.057	0.092	0.085	0.073	0.083	0.079	0.083	0.053
0.049	0.076	0.077	0.086	0.072	0.084	0.089	0.051	0.073	0.071	0.071	0.064
												0.080	0.101	0.080	0.113	0.077	0.152	0.077	0.068	0.075	0.069	0.134	0.151
0.087	0.174	0.078	0.078	0.077	0.082	0.074	0.083	0.094	0.092	0.073	0.219
												0.062	0.073	0.077	0.082	0.079	0.108	0.109	0.152	0.078	0.091	0.065	0.188
0.065	0.071	0.115	0.128	0.138	0.138	0.085	0.148	0.079	0.072	0.068	0.054
												0.069	0.138	0.076	0.077	0.089	0.086	0.072	0.075	0.126	0.082	0.225	0.076
0.126	0.068	0.073	0.089	0.081	0.084	0.157	0.089	0.075	0.078	0.089	0.076
												0.069	0.147	0.071	0.144	0.073	0.093	0.135	0.144	0.080	0.078	0.071	0.074

表3 三个医院两种方法比较

医院	血样数	相关系数(r)	P值	备注
					长海新华传染	795534	0.6070.6980.591	＜0.01＜0.01＜0.01	非常显著相关非常显著相关非常显著相关

三个医院使用“定量法HbeAg酶免试剂盒”与“HBV-PCR荧光定量试剂盒”测定同一血样的比较结果，两种方法均非常显著相关，均P值＜0.01。说明两种方法具有同等的使用价值，“定量法HbeAg酶免试剂盒”与“HBV-PCR荧光定量试剂盒”相比美。

本发明的另一目的是提供了乙型肝炎e抗原酶联免疫定量法测定试剂盒的制备方法。该方法包括下列步骤：

一、HBeAg的制备：

用乙肝病人血提取纯化HBV-DNA，用HBV-DNA重组HBeAg基因片断的1-178氨基酸序列测序和检定；

(1)乙型肝炎e抗原的融合表达

材料和方法

材料：HBV-DNA从用乙肝患者血中提取、纯化，PCR Kit、限制性内切酶购自Tkara公司，T4DNA连接酶购自Promega公司，GST，还原型4B购自Sigma公司，上海捷倍思公司合成上又引物5’-GGATCCATGCAACTT TTTCACCTCTGC-3’，下游引物5’-CTCGAGAACAACAGTAGTTTCCGGAAG-3’；

方法：反应在PCR合成仪上进行，反应条件为94℃30S，60℃30S，72℃30S，35个循环。PCR产物由基康公司测序；

表达和纯化：将PCR产物用BamHI和EcoRI酶切，在1％琼脂糖凝胶上电泳回收387bp的片段，与相同酶切的载体Ggex-4T-1连接，转化大肠杆菌HB101株，诱导用IPTG，终浓度1mmol/1，SDS-PAGE分析结果，按Sepharoses 4B说明书纯化表达融合蛋白产物，采用间接ELISA法检测HBeAg，以检定HBeAg；

(2)乙型肝炎病毒e抗原的氨基酸(1-178)如下：

1        10        20        30        40

MQLFHLCLIISCSCPTVQASKLCLGWLWGMDIDPYKEFGASVELL

  50        60        70        80       90

SFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWG

         100       110       120      130

ELMNLATWVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCL

  140      150      160        170    178

TFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV

二、HbeAb的制备：

(1)用上述重组抗原免疫豚鼠，得抗HbeAg抗血清并免疫Balb/C小鼠得阳性鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，筛选阳性克隆建株，得腹水；

(2)抗血清和腹水用(NH₄)₂SO₄或正辛酸沉淀处理，得粗提抗HbeAb抗体和单抗；

(3)用DE₅₂离子交换层析法得纯抗HbeAb多抗和抗HbeAb单抗；

(4)经高压液相色谱(HPLC)检定，纯抗HbeAb多抗和抗HbeAb单抗呈单一峰，其纯度95％以上；

三、HRP-抗HbeAb单抗制备：辣根过氧化物酶(HRP)与纯化的抗HbeAb单抗偶联；

四、前HbeAg标准品的制备：用HBV-DNA重组的HbeAg纯品1-178aa；分装成0、7.5、31.15、25.0、250.0、500.0ng/ml共6支；

五、包被抗体成为予包被反应条：用抗HbeAb多抗；

六、分装试剂盒其余7种成份，按试剂盒需要量分装在小瓶或尖底离心管中；

七、检定试剂盒的特异性、灵敏度、精密度、稳定性合格；

八、组装成为成品。

本发明的试剂盒在使用时可以如下操作：

(1)取出已包被条孔，插入支架上，用胶布固定，以防脱落。

(2)反应孔中，分别加各浓度标准品。待检血清50μl，各板设阳性对照l孔(50μl)阴性对照1孔(50μl)，空白对照1孔(加蒸馏水50μl)，然后除空白对照孔外各孔加酶标记液50μl，置37℃中反应30分钟。

(3)取出反应板甩去孔内液体后停留30秒钟，每次甩去洗涤液后都要在草纸上拍干，以便洗涤彻底。(20倍浓洗涤液lml+19ml蒸馏水即为工作洗涤液)

(4)各孔滴加底物缓冲液甲、乙各1滴，室温避光10-15分钟后再每孔滴加终止液1滴，置酶标仪中450nm波长读数(测OD值)。

(5)结果判定

以标准品浓度为横座标，以标准品的OD值为纵座标，给出标准曲线图，从各待检血清OD值就可在标准曲线上查出该血清的HbeAg浓度(HBeAg ng/ml血)。

本发明的试剂盒能非常专一地定量测出检测患者血清HbeAg的含量。它具有简便、灵敏和稳定等特点。且本试剂盒操作简便快速，采用一步法可在短时间内，约40分钟左右获得实验结果，比PCR检测法(PCR法最快需6-8小时完成实验)快速；经临床试用HbeAg定量法与PCR定量的HBV-DNA有很好的符合率，因而本试剂盒对判断病人是否有病毒复制和定量，对确定乙肝感染病程预后及用药后的疗效具有十分重要的参考意义；PCR法需贵重的仪器设备，试剂昂贵，收费高，而本试剂盒整个实验中无需贵重仪器设备，试剂便宜且收费低廉，能适用于各级医院及临床测试中心，也可用于流行病学普查，因而具有简便、灵敏、重复性好的优点，是一种对HBV感染、复制和乙肝病人诊断、治疗和预后具有HBV的量化的新方法。

附图说明

图1本发明定量HbeAg酶免试剂盒标准曲线图

(横坐标为HBeAg标准品的浓度)

图2长海医院使用本发明定量HBeAg酶免试剂盒与HBV-PCR荧光法比较图

横坐标X为定量HBeAg酶免法(HBeAg ng/ml血)

纵坐标Y为HBV-PCR荧光法(HBV拷贝数/ml血)

两种方法相关系数(r)＝0.607 P值＜0.01

直线方程：Y＝4.376+0.501X

图3南京市二院使用本发明定量HBeAg酶免试剂盒与HBV-PCR荧光法比较图

横坐标X为定量HBeAg酶免法(HBeAg ng/ml血)

纵坐标Y为HBV-PCR荧光法(HBV拷贝数/ml血)

两种方法相关系数(r)＝0.698 P值＜0.01

直线方程：Y＝0.236+1.306X

图4上海传染病医院使用本发明定量HBeAg酶免试剂盒与HBV-PCR荧光法比较图

横坐标X为定量HBeAg酶免法(HBeAg ng/ml血)

纵坐标Y为HBV-PCR荧光法(HBV拷贝数/ml血)

两种方法相关系数(r)＝0.591 P值＜0.01

直线方程：Y＝1.163+0.258X

具体实施方式

实施例1  定量法HbeAg酶免试剂盒的生产步骤

一、首先从乙肝患者血中提取纯化HBV-DNA

(1)取乙肝患者血清过亲和层析柱，得纯HBV-DNA

(2)用HBV-DNA重组HbeAg1-178aa测序并检定，得到HbeAg片断1-178aa序列；

二、制备并纯化包被抗体HbeAb：

用重组的HbeAg1-178aa免疫小鼠得单抗和用重组HbeAg1-178aa免疫豚鼠得抗HbeAg多抗。加等体积的饱和(NH₄)₂SO₄沉淀，粗提后再经DE-52柱纯化，收集蛋白峰，PBS透析得抗HbeAb单抗或抗HbeAb多抗纯品。经HPLC检定得纯抗HbeAb多抗和单抗，呈现单一峰。纯度＞95％，效价：多抗2-3万，单抗8-10万。

三、酶标记抗体制备

抗HbeAg抗体用过碘酸钠法与辣根过氧化物偶联

对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存。效价＞2000。

四、HBeAg标准品的制备：

用HBV-DNA重组的HbeAg纯品1-178aa分装成0、7.5、31.15、125.0、250.0、500.0ng/ml共6支。

五、酶标记抗体浓度选定

采用方阵滴定法选择酶标记抗体的工作浓度大于1∶2000。

HbeAg重组从10μg/ml倍增稀释，包被酶标板，加梯度稀释的酶标抗体测定，以确定最适稀释度。

六、预包被抗体板的制备

(1)包被

Na₂CO₃      0.6g

NaHCO₃       1.58g

重蒸水         500ml

加入适量HBeAg多抗，调整PH至9.5，加入微孔板各孔中，置湿盒中加盖，4℃过夜甩干。

(2)洗涤

Na₂HPO₄·12H₂O    2.6g

NaH₂PO₄·2H₂O     0.4g

20％Tween-20          2.5ml

NaCL                  8.2g

重蒸水                100ml

调整PH至7.2，1∶10稀释后，加入微孔板各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复三次，以除去剩余抗体。

(1)封闭

明胶    1.1g        微波炉加温      注入酶标

BSA     5.0g        至呈透明溶液    板各孔中

0.1N PBS 20ml——→ 冷却至室温——→

蒸馏水至100ml

                    弃去液体

放入湿盒中(加盖)   吸水纸上拍干 重复一次，待干燥后，

——→37℃1hr——→放入有干燥剂的塑料袋

                   封口，保存于4℃。

七、阳性对照的制备

HBeAg和HBV-DNA同时呈阳性的乙肝患者血清，60℃放置1个小时，除菌过滤，用本药盒测定OD值＞0.3，备用，分装。

八、阴性对照的制备

用本试剂盒测定正常人血清OD值在0-0.03，加万分之二硫柳汞，分装备用。

酶标单抗配置——————→

            10％小牛血清

            90％0.15MPBS

HBeAb-HRP———————→稀释20倍，分装。

(稀释度1∶2000)

九、酶标单抗稀释液

BSA                0.5g

Na₂HPO₄·12H₂O 2.6g

NaH₂PO₄·2H₂O  0.4g

NaCL               8.2g

20％Tween-20       100ml

调整PH至7.2

十、底物液A

Na₂HPO₄·12H₂O 1.7g

柠檬酸·H₂O       0.5g

3％H₂O₂          200μl

重蒸水             100ml

调整PH至5.0

十一、底物液B

Na₂HPO₄·12H₂O 1.7g

柠檬酸.H₂O        0.5g

重蒸水             100ml

调整PH至5.0后，加入10mlDMSO含60mgTMB的溶液25μl

十二、终止液

浓H₂SO₄          10ml

重蒸水              80ml

十三、10x洗涤液

Na₂HPO₄·12H₂O  2.6g

NaH₂PO₄·2H₂O   0.4g

20％Tween-20        2.5ml

重蒸水              100ml

调整PH至7.2

十四、半成品及成品的组成

上述(一)→(十四)步骤所得产品装入小瓶及尖底离心管中，即为半成品。抽出三份经过特异性、稳定性、灵敏度及精密度检定合格才能组装成定量HBeAg试剂盒。组装成盒后还需抽出三份同半成品一样经过检定合格才能出售。

Claims (3)

1.一种乙型肝炎e抗原酶联免疫定量法测定试剂盒，其特征在于该试剂盒包括主要成份为HbeAg标准品6支、抗体预包被反应条48或96孔、酶标记乙型肝炎e抗体和次要成份阳性对照液1支、阴性对照液1支、20倍浓洗涤液1瓶、底物缓冲液2瓶及终止液1瓶组成。

2.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎e抗原酶联免疫定量法测定试剂盒，其特征在于其中HbeAg标准品为HBV-DNA重组的HbeAg片断1-178aa 6支、抗体预包被反应条为48或96孔、酶标记抗HbeAb单抗为偶联辣根过氧物酶、阳性对照液为HbeAb阳性血清、阴性对照液为正常人血清、浓洗涤液为磷酸-Tween-20、底物缓冲液为H₂O₂和3，3’.5.5’-四甲基联苯胺、终止液为4NH₂SO₄。

3.一种如权利要求1所述的一种“定量法HbeAg酶联免疫测定试剂盒”的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)HbeAg制备：

用亲和层析法从乙肝患者血中提取和纯化HBV-DNA，用HBV-DNA重组HbeAg基因片断的1-178氨基酸(aa)并测序和检定，用于制备标准品和免疫源；

(2)HbeAb制备：

用上述重组HbeAg免疫豚鼠，得抗HbeAb多抗和免疫Balb/C小鼠得阳性鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，筛选阳性克隆建株，得腹水；

抗HbeAb多抗和腹水用(NH₄)₂SO₄或正辛酸沉淀处理，得粗提抗HbeAb多抗和单抗；

用DE₅₂离子交换层析法得纯抗HbeAb多抗和单抗；经高压液相色谱(HPLC)检定，纯抗HbeAb多抗和单抗均呈单一峰，其纯度95％以上；

(3)PreS1 Ag标准品的制备：

用HBV-DNA重组HbeAg纯品1-178aa，分装成0、7.5、31.15、125.0、250.0、500.0ng/ml共6支；

(4)HRP-抗HbeAb单抗体制备：辣根过氧化物酶(HRP)与纯化的抗HbeAb偶联；

(5)包被抗体成为予包被反应条：用抗HbeAb多抗包被；

(6)分装试剂盒其余7种成份，按试剂盒需要量分装在小瓶或尖底离心管中；

(7)检定试剂盒的特异性、灵敏度、精密度、稳定性合格；

(8)组装成为成品。

Images