CN102707068A - 补体h因子用作甲基苯丙胺成瘾患者的基因表达产物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种甲基苯丙胺成瘾的检测方法与补体H因子(Complement factor，CFH)用作甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)成瘾相关人群的基因表达产物中的应用，发明人通过大量的实验发现，CFH和α1酸性糖蛋白2(Alpha-1-acid glycoprotein 2)，转甲状腺素蛋白(Transthyretin)，载脂蛋白L1(Apolipoprotein L1)，和结合珠蛋白(Haptoglobin)在METH成瘾患者血清中稳定表达上调，可以作为METH成瘾相关的基因表达产物。采用免疫印迹法或酶联免疫试剂盒定量检测人血清中的CFH蛋白含量，并将人血清中CFH蛋白含量表达上调用作鉴定METH成瘾的方法中的应用。

Description

补体H因子用作甲基苯丙胺成瘾患者的基因表达产物中的应用

技术领域

本发明涉及蛋白质的检测方法，具体涉及甲基苯丙胺成瘾的检测方法与补体H因子(Complement factor，CFH)用作甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)成瘾相关人群的基因表达产物中的应用。 

背景技术

药物滥用和药物依赖既是全球普遍存在的公共卫生问题，又是危害严重的社会问题。药物依赖性是指由药物与机体相互作用所造成的一种精神状态，有时也包括身体状态，表现出一种强迫性要求连续或定期应用该药的行为和其它反应，目的是要去感受它的精神效应，或是为了避免停药引起的不适，包括精神依赖性和身体依赖性两方面。甲基苯丙胺(Methamphetamine，METH)俗称冰毒，属于苯丙胺类兴奋剂(amphetamine-type stimulants，ATS)，其结构与苯丙胺和MDMA(摇头丸)近似，是我国规定管制的精神药品。METH是苯丙胺类毒品的代表，曾是一种处方药，用于治疗注意力不足过动症(ADHD)、嗜睡症、极端的肥胖症，后发现它具有很强的耐受性和成瘾性，使用后会产生强烈快感或兴奋，长期使用可产生身体依赖和心理依赖，在停药后出现严重的戒断症状。METH具有药物依赖、中枢兴奋、致幻、食欲抑制及拟交感能等效应，并能够对机体各器官产生一定损伤。滥用者会处于强烈兴奋状态，可以使人有能力增加、觉醒程度提高的感觉，表现出精神振奋、清醒、机敏、思维活跃、情绪高涨、注意力集中、工作能力(特别是技巧性工作能力)提高，而药效过后会出现反应迟钝，疲劳乏力，头痛头昏，心悸气怠，焦躁激动等现象。大剂量使用METH可导致急性中毒，长期滥用可造成慢性中毒，出现被害妄想、幻觉等苯丙胺精神病，心悸、心律不齐等心血管系统表现，肠胃功能障碍、脑血管病变、窒息、肺水肿、肺衰竭、肾衰竭等，严重的还可产生惊厥、脑出血、昏迷致死等。同时，静脉注射方式滥用者可引起各种感染合并症，包括肝炎、败血症和爱滋病等。此外，METH的耐受性随长期使用而增加，长期滥用者为了达到初期使用时的欣快效应，竟可将剂量增加60倍以上，这极易引起急性中毒，可造成惊阙、昏迷甚至死亡。 

METH由于其强烈的兴奋作用和相对易于制作的特性，使它刚应用于临床不久就开始被滥用，成为一种高度心理成瘾的新型毒品。METH见效快、药效维持时间长，第一次使用便可能会上瘾，被称为“毒品之王”。现如今，METH的滥用和成瘾已呈现全球流行趋势。根据中国国家禁毒委员会办公室发布的《2011年中国禁毒报告》，截至2010年底，我国登记在册的吸毒人员154.5万人，其中，以METH为首的滥用合成毒品的问题较往年更加突出，仅查获登记的就有43.2万名，新查获11.94万名，多数是25岁以下的青年。根据2009年国家药物滥用监测年度报告，METH是新发生药物滥用者主要滥用物质，与2005年比，METH滥用比例增长31.4％。根据联合国毒品与犯罪署发布的《2011年世界毒品报告》，2009-2010年度，苯丙胺类兴奋剂中苯丙胺类物质滥用的流行率为全球年龄介于15-64岁的人口的0.8％±0.5％，这个数据高于阿片类物质(0.65％±0.15％)和可卡因(0.4％±0.1％)的滥用率，在所有种类毒品中的流行率 仅次于大麻(3.65％±0.85％)的滥用。该数据表明，2009年，世界范围内约有一千四百万到五千七百万的15-64岁人口滥用苯丙胺类物质，而大部分滥用人群分布在亚洲地区。METH是全球范围内最为广泛生产的一种苯丙胺类兴奋剂，近年来在人群中的使用呈现明显上升趋势。我国METH的消费已居所有非法药品交易的前三位。由于其危害性已经逐渐超过了海洛因等阿片类毒品，成为21世纪最危险的新型毒品之一，METH的滥用和成瘾已经成为中国乃至全球亟待解决的公共卫生问题。 

对METH滥用和成瘾的诊断通常采用国际通用的国际疾病分类第十版(International Classification of Diseases，ICD-10)和美国精神病学协会(American Psychiatric Association，APA)2000年修订的第四版精神病诊断与统计手册(The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-IV，DSM-IV)中的苯丙胺类药物依赖诊断标准。这两种诊断标准均主要从用药行为着眼，判断目标个体或人群是否不当使用METH或对此种药品产生了依赖，但由于用药行为的隐蔽性以及苯丙胺类物质的戒断反应不甚明显，目前还缺乏有效手段准确甄别个体是否对METH产生了依赖性，对刑事鉴定及临床诊断带来了难题。生物标记物是客观衡量和评估正常生理过程、病理过程或在治疗干预中对药物反应的一种特定指示物，与METH成瘾相关的稳定生物标记物，可以为其滥用情况的评估提供有效依据。目前，还未见补体因子H(Complement factor H，CFH)与METH之间存在关系的任何报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供补体H因子(Complement factor，CFH)用作甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)成瘾相关人群的基因表达产物中的应用。 

本发明的目的在于提供人血清中CFH含量表达上调用于鉴定或确认METH成瘾相关人群的方法中的应用，优选所述的人血清中CFH含量选自CFH绝对含量、CFH相对含量的任一种或其组合，更优选所述的CFH相对含量为血清中CFH相对于血清总蛋白的质量百分比。 

本发明的优选技术方案中，所述方法通过检测人血清中的CFH蛋白含量，并将人血清中CFH蛋白含量表达上调用作鉴定METH成瘾的方法中的应用。 

本发明的另一目的在于提供免疫印迹法用于定量检测人血清中CFH蛋白含量的方法中的应用。 

本发明的目的在于提供一种用于双向电泳(2-DE)分析的血清样品的预处理方法，包括下述步骤： 

1)静脉穿刺，分别抽取METH成瘾患者组和正常对照组的血液样品； 

2)将抽取的待测血液样品置于4℃下，3,000g转速离心10min，分离血清，再用白蛋白/IgG去除试剂盒去除血清中的白蛋白和IgG，即得。 

血清中高丰度的白蛋白和IgG会影响其他低丰度蛋白在双向电泳(2-DE)分析图谱中的检测，而低丰度蛋白(如CFH)一般为生物样本中重要的生物标记物或药物靶点，并与特定的病生理机制相关。 

本发明采用白蛋白/IgG去除试剂盒对血清样品进行去除白蛋白和IgG的预处理后，再进行双向电泳分析，寻找和分析差异表达蛋白后，使用生物质谱技术对差异表达蛋白进行结构 确认，结果显示，CFH和α1酸性糖蛋白2(Alpha-1-acid glycoprotein 2)，转甲状腺素蛋白(Transthyretin)，载脂蛋白L1(Apolipoprotein L1)，和结合珠蛋白(Haptoglobin)在METH成瘾患者血清中稳定表达上调，可以作为METH成瘾相关的基因表达产物。 

CFH为METH成瘾患者血清中的差异表达蛋白之一。再利用酶联免疫吸附法和/或免疫印迹法检测待测血清中的CFH含量，再次验证了METH成瘾患者血清以及METH成瘾条件性位置偏爱模型大鼠血清和成瘾相关脑区(海马、腹侧被盖区)中的CFH水平表达稳定上调，从而确认CFH为METH成瘾的相关蛋白，并将人血清中CFH蛋白含量表达上调作为鉴定METH成瘾的指标。 

本发明的另一个目的在于提供一种血清差异表达蛋白的鉴定方法，包括下述步骤： 

1)分别抽取METH成瘾患者组和正常对照组的血清样品，将其使用白蛋白/IgG去除试剂盒去除血清中的白蛋白和IgG，获得待测血清样品； 

2)将待测血清样品采用双向电泳进行分离，包括第一向等电聚焦电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺电泳，得到蛋白分离凝胶； 

3)将步骤2)得到的蛋白分离凝胶进行硝酸银染色，得到METH成瘾患者组和正常对照组的血清样品的双向电泳图谱； 

4)将步骤3)中得到的双向电泳图谱进行比对，选取变化稳定(重复3次及以上)、分离度较好、易切取的蛋白质斑点，斑点切下后，经过脱色和酶切后，进行生物质谱分析，得到蛋白质斑点的肽质量指纹图谱； 

5)将步骤4)得到的蛋白质斑点的肽质量指纹图谱在SwissProt蛋白序列数据库中检索，得到差异表达蛋白质的名称及其相关信息。 

本发明的优选技术方案中，所述的对照样品包括空白调零对照、空白对照、标准对照的任一种，其中，空白调零对照为加入过氧化氢-四甲基联苯胺底物及终止溶液的对照样品，用于检测时调零OD值；空白对照为加入稀释液的对照样品；标准对照为加入已知浓度的CFH蛋白标准样品的对照样品。 

本发明的另一目的在于提供一种酶联免疫试剂盒，所述试剂盒由包被CFH蛋白的特异性多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、抗原标准品、CFH蛋白的特异性多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗CFH多克隆抗体的二抗、浓缩洗涤液、底物和终止液，其中，所述的封闭液为含1％牛血清白蛋白的PBST溶液，所述的样品稀释液为0.01MTris-HCl(pH 7.4)缓冲液，所述抗原标准品为纯化的重组人CFH蛋白抗原，所述的浓缩洗涤液为25×PBST缓冲液，所述的底物为过氧化氢-四甲基联苯胺，所述的终止液为酸溶液，优选为2M的硫酸溶液。 

本发明的优选技术方案中，所述的PBST缓冲液的组成为，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L，TWEEN-20 0.05％，pH 7.4。 

本发明的目的在于提供一种夹心式酶联免疫法定量检测人血清CFH蛋白的方法，所述的方法包括下述步骤： 

1)将血清样品用0.01M Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液稀释20-50倍(优选稀释为30倍)， 制得待测样品； 

2)将对照样品和待测样品分别加入包被了浓度为100ng/mL-20ug/mL人CFH蛋白的特异性多克隆抗体的微孔板上的微孔中，振摇，使CFH蛋白与人CFH蛋白的特异性多克隆抗体充分结合； 

3)用PBST缓冲液冲洗微孔板，去除未结合的其他组分后，加入以封闭液稀释的CFH蛋白特异性多克隆抗体稀释液，充分结合； 

4)弃去孔内液体后，用PBST缓冲液冲洗，去除未结合的抗体及其它组分，加入以封闭液稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗CFH多克隆抗体的二抗，充分结合； 

5)弃去孔内液体后，用PBST缓冲液冲洗，去除未结合的抗体及其它组分，HRP标记的抗体后，加入过氧化氢-四甲基联苯胺底物，与HRP反应； 

6)加入终止液，使反应停止，在450nm波长处，测定黄色反应产物的吸收度，获得CFH蛋白的绝对含量。 

本发明的优选技术方案中，所述的对照样品包括空白调零对照、空白对照、标准对照的任一种，其中，空白调零对照为加入过氧化氢-四甲基联苯胺底物及终止溶液的对照样品，用于检测时调零OD值；空白对照为加入稀释液的对照样品；标准对照为加入已知浓度的CFH蛋白标准样品的对照样品。 

本发明的优选技术方案中，所述的终止液为酸溶液，优选酸溶液为2mol/L的硫酸溶液。 

本发明的优选技术方案中，黄色反应产物的吸收度与CFH蛋白的浓度呈正比，可通过测量黄色反应产物的吸收度来定量检测CFH蛋白的浓度。 

本发明的优选技术方案中，进一步采用双金鸡宁酸(BCA)法测定血清样品中的总蛋白浓度，计算CFH蛋白相对于样品中总蛋白的含量百分比，获得CFH蛋白的相对含量。 

本发明的优选技术方案中，所述的双金鸡宁酸(BCA)法采用BCA蛋白定量试剂盒测定血清样品中的总蛋白浓度。 

本发明的另一目的在于提供一种甲基苯丙胺成瘾的检测方法，采用免疫印迹法或者酶联免疫试剂盒定量检测人血清中的CFH蛋白含量，并将人血清中CFH含量表达上调用于鉴定或确认METH成瘾相关人群，优选所述的人血清中CFH含量选自CFH绝对含量、CFH相对含量的任一种或其组合，更优选所述的CFH相对含量为血清中CFH相对于血清总蛋白的质量百分比。 

为了清楚地表述本发明的保护范围，本发明对术语进行如下界定： 

本发明所述的人CFH蛋白的特异性多克隆抗体指由人CFH蛋白作为抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与人CFH蛋白有特异性结合能力的一组球蛋白，每种免疫球蛋白能识别人CFH蛋白分子上的一个表位。 

本发明所述的对照样品包括空白调零对照、空白对照、标准对照的任一种，其中，空白调零对照为加入过氧化氢-四甲基联苯胺底物及终止溶液的对照样品，用于检测时调零OD值；空白对照为加入稀释液的对照样品；标准对照为加入已知浓度的CFH蛋白标准样品的的对照样品。 

本发明所述的PBST缓冲液的组成为，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L，TWEEN-20 0.05％，pH 7.4。 

本发明所述的“抗原”广义地包括了在适当条件下能直接或间接引起特异性免疫反应，且与该反应的产物反应(即与特异性抗体或特异性致敏的T淋巴细胞的任一种或其组合反应)的任何物质，如蛋白/肽、多糖、脂类和多或寡核苷酸。 

本发明所述的免疫检定方法包括基础夹心检定法(basic sandwich assay)、三联夹心检定(triple sandwich assay)法和免疫色谱检定法等。 

本发明所述的基础夹心检定法，需要二个一级抗体，其中，一个一级抗体与固定载体结合，而另一个一级抗体用检测试剂标记。 

本发明所述的夹心检定法中，夹心检定的固体载体选自塑料珠、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯等；检测试剂可以是酶标记物(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)、荧光或发光试剂(如荧光黄，罗明丹，或吖啶颜料(acridium))、放射性同位素标记(如I¹²⁵)、有色颗粒(如金、银、蓝色乳液或硒)等。 

除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。 

与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果： 

1、针对目前国际上对METH成瘾的鉴别诊断还停留在行为学指标上，缺乏有效的生物学指标，本发明采用双向电泳联用生物质谱技术，发现补体因子H(Complement factor H，CFH)和α1酸性糖蛋白2(Alpha-1-acid glycoprotein 2)，转甲状腺素蛋白(Transthyretin)，载脂蛋白L1(Apolipoprotein L1)，和结合珠蛋白(Haptoglobin)在METH成瘾患者血清中稳定表达上调，可以作为METH成瘾相关的基因表达产物，并将人血清中CFH蛋白含量表达上调作为鉴定METH成瘾的指标。 

2、本发明提供了人血清中CFH含量表达上调用于鉴定或确认METH成瘾相关人群的方法中的应用，优选所述的人血清中CFH含量选自CFH绝对含量、CFH相对含量的任一种或其组合，更优选所述的CFH相对含量为血清中CFH相对于血清总蛋白的质量百分比。 

3、本发明采用白蛋白/IgG去除试剂盒对血清样品进行去除白蛋白和IgG的预处理后，再进行双向电泳分析，寻找和分析差异表达蛋白后，使用生物质谱技术对差异表达蛋白进行结构确认，结果显示，补体因子H(Complement factor H，CFH)和α1酸性糖蛋白2(Alpha-1-acid glycoprotein 2)，转甲状腺素蛋白(Transthyretin)，载脂蛋白L1(Apolipoprotein L1)，和结合珠蛋白(Haptoglobin)在METH成瘾患者血清中稳定表达上调，可以作为METH成瘾相关的基因表达产物。CFH为METH成瘾患者血清中的差异表达蛋白之一。再利用酶联免疫吸附法和/或免疫印迹法检测待测血清中的CFH含量，再次验证了METH成瘾患者血清以及METH成瘾条件性位置偏爱模型大鼠血清和成瘾相关脑区(海马、腹侧被盖区)中的CFH水平表达稳定上调，从而确认CFH为METH成瘾的相关蛋白，并将人血清中CFH蛋白含量表达上调作为鉴定METH成瘾的指标。 

附图说明

图1METH患者与对照血清蛋白双向电泳图谱； 

图2表达差异蛋白区域放大及表达量分析结果； 

图31号蛋白斑点肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting，PMF)检测结果。 

图41号蛋白斑点数据库检索结果。 

图52号蛋白斑点肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting，PMF)检测结果。 

图62号蛋白斑点数据库检索结果。 

图73号蛋白斑点肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting，PMF)检测结果。 

图83号蛋白斑点数据库检索结果。 

图94号蛋白斑点肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting，PMF)检测结果。 

图104号蛋白斑点数据库检索结果。 

图115号蛋白斑点肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting，PMF)检测结果。 

图125号蛋白斑点数据库检索结果。 

图136号蛋白斑点肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting，PMF)检测结果。 

图146号蛋白斑点数据库检索结果。 

图157号蛋白斑点肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting，PMF)检测结果。 

图167号蛋白斑点数据库检索结果。 

图17METH成瘾条件性位置偏爱大鼠模型建立方法的示意图； 

图18大鼠条件性位置偏爱(CPP)实验结果(与正常对照组相比：***P＜0.001)； 

图19免疫印迹分析法分析METH成瘾患者及大鼠血清CFH表达变化情况(与正常对照组相比：*P＜0.05；**P＜0.01)； 

图20ELISA分析法分析METH成瘾患者及大鼠血清CFH表达变化情况(与正常对照组相比：*P＜0.05；**P＜0.01)； 

图21免疫印迹分析法分析METH成瘾大鼠相关脑区CFH表达变化情况(与正常对照组相比：*P＜0.05；**P＜0.01)。 

具体实施方式

以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。 

实施例1人血清样本的制备和CFH的分离 

1、受试人群 

METH成瘾患者经由北京大学中国药物依赖性研究所协助、从深圳市强制隔离戒毒所招募；正常对照(健康志愿者)从北京大学第三医院招募。所有受试者签署知情同意书后，由成瘾相关专业人员进行评估诊断。METH成瘾患者的选取依据中华人民共和国《吸毒成瘾认定办法》(公安部令第115号)、《苯丙胺类药物依赖诊断治疗指导原则》以及国际相关标准国际疾病分类第十版(International Classification of Diseases，ICD-10)和美国精神病学协会(American Psychiatric Association，APA)2000年修订的第四版精神病诊断与统计手册(The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-IV，DSM-IV)中的苯丙胺类药物依赖诊断标 准。 

评估项目包括：苯丙胺类药物滥用行为、用药时间、减药或停药后的戒断症状、药物耐受性以及社会功能等。 

METH成瘾患者组和正常对照组中的研究对象均为中国汉族男性，每组30名。 

METH成瘾患者组的患者为口服方式成瘾者(见表1)，年龄在25.9±4.0岁之间。采血时间为末次使用苯丙胺类药物48小时之内，且未经任何成瘾相关治疗。所有患者尿毒品检测结果均为阳性，并有自供或他供METH药物滥用史。 

正常对照组从非METH成瘾的健康志愿者中招募(见表1)，年龄在18-22岁之间，没有苯丙胺类药物滥用史，经过DSM-IV苯丙胺类药物依赖诊断标准的评定，排除METH成瘾以及其它精神类疾病。 

表1.受试者统计学信息 

2、受试血清样品的预处理 

由专业护理人员进行静脉穿刺，获得METH成瘾患者组和正常对照组的血液样品。抽取血液后，立即在4℃下，3,000g转速离心10min，分离血清。血清样品分装，储存于-80℃冰箱备用。 

从血清样本中随机选取患者和正常对照各12例，采用Calbiochem公司(U.S.A)的白蛋白/IgG去除试剂盒(Albumin/IgG Removal Kit)去除血清中的白蛋白和IgG。 

将处理后的血清样品溶于500μL水化上样缓冲液(尿素8M，CHAPS 4％，DTT 65mM，Bio-Lyte0.2％，溴酚蓝0.001％)中，采用Bradford法定量检测血清样品中的总蛋白含量后，调整待测血清样品中的蛋白浓度至4μg/μL。 

3.双向电泳(2-DE) 

将蛋白浓度调整至4μg/μL的血清样品进行双向电泳分析(按照Bio-Rad公司双向电泳操作手册进行操作)。其中，第一向等电聚焦电泳程序见表2。第二向SDS-PAGE电泳使用12.5％的凝胶，起始时恒流15mA/gel，至样品完全走出IPG胶条，加大电流至25-30mA/gel，待溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止。 

取出凝胶，放入固定液(甲醇50％，醋酸10％，40％去离子水)过夜，硝酸银染色(按照Bio-Rad公司双向电泳操作手册进行)后，用凝胶扫描仪获取凝胶图谱，并用PDQuest软件(Version 7.1；Bio-Rad，U.S.A)进行图谱分析。 

METH成瘾患者与正常对照血清蛋白样品的代表性2-DE图谱如图1所示。样品采用17cm，pH 4-7的IPG胶条，硝酸银染色法进行染色。在所有表达发生变化的蛋白质斑点中选取变化稳定且分离度较好的7个差异蛋白质斑点进行后续的质谱鉴定(图2)，7个斑点的局部放大图以及相对表达量如图2所示。 

采用PDQuest软件统计分析7个差异蛋白质斑点的光密度测定值及相对变化值，结果见表3。 

表2等电聚焦程序表(17cm IPG胶条) 

表3 

说明：表3中的斑点编号(spot no.)与图1和图2一致。点光密度为各个实验组的三个独立样本实验结果的平均值；CV为这些样本结果的变异系数；P值由t检验(student’s t-test)得到。 

4.蛋白鉴定及数据库检索 

选取变化稳定(重复3次及以上)、分离度较好、易切取的蛋白质斑点，斑点切下后，经过脱色和酶切后，进行生物质谱分析。 

生物质谱分析采用美国ABI公司的Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyzer MALDI-TOF/TOF质谱仪，用标准Marker峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，获得肽质量指纹图谱。反射器正极重复率为200Hz，波长255nm。加速电压2kV。用肽标准试剂盒对仪器 进行自动校正。二级质谱用Glu1-fibrinopeptide B的碎片峰进行校准。所有的一级质谱谱图、二级质谱谱图均通过各自收集积累至少1000个到3000个激光点数据得到。结合一级质谱和二级质谱数据，用GPS Explorer软件(Version 3.5，Applied Biosystems)在SwissProt蛋白序列数据库中检索。检索参数包括：允许1处胰蛋白酶切位点漏切，一级质谱和二级质谱的允错值为±0.2Da，种属选择为人。 

鉴定结果包括蛋白名称、数据库登录号、MOWSE得分、序列覆盖率、等电点、分子量、相对表达量变化情况等方面，结果见表4。 

表4蛋白斑点质谱鉴定结果 

说明：斑点编号(spot no.)与图1和图2一致。分子量为按照氨基酸序列计算得到的蛋白理论分子量；等电点为按照氨基酸序列计算得到的蛋白理论等电点；比率METH成瘾组/正常对照组表示各组斑点光密度值的比值。 

由表3可见，3号斑点即为本发明的CFH。 

各差异蛋白质斑点的肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting，PMF)检测结果及数据库检索结果见图3-图16。 

实施例2大鼠条件性位置偏爱(CPP)实验及大鼠血清和相关脑区组织的获取 

为确认METH成瘾患者血清蛋白质组学的结果，我们制备了METH成瘾大鼠模型，并用CPP实验验证模型成功后，获取模其血清及成瘾相关脑区组织进行差异表达蛋白的验证。 

雄性SD大鼠，30只，随即分为对照组(C组)和模型组(M组)，每组15只。每天“handle”大鼠(用给药时所用手套捉拿大鼠并抚摸其腹部)使之适应之后的腹腔给药方式，适应3日后开始正式实验。正式实验分为三部分：训练前测试(pre-conditioning test)，条件化训练(conditioning)和训练后测试(post-conditioning test)(见图17A)。主要实验方法如下： 

CPP箱：本实验使用无偏爱箱，由三个小箱构成。两端两个小箱，即条件作用隔室(conditioning compartments)，分别标记为A箱和B箱，三个小箱之间由两个附有可控开关小门的挡板隔开。A箱和B箱由箱壁灯光和地面脚感两种感知觉信号区分，A箱中为5个排列呈放射状的灯源和不锈钢条纹地板，B箱中为4个排列呈正方形的灯源和不锈钢网状地板。实验动物在CPP箱中的位置及活动情况由各小箱中的两道红外光束监测，并由计算机自动记录。 

训练前测试：未给药前，记录大鼠在A、B箱中停留时间，计算CPP分值，即大鼠在伴药箱(B箱)停留时间与非伴药箱(A箱)停留时间的差值。时间差超过120s的大鼠淘汰不用。 

条件化训练：在训练前测试后一天开始给药，腹腔注射METH，剂量为1ml/kg，给药方案见图17B。每只大鼠在6天中每日给药时间不得相差超过15min，给药后立刻放入指定箱中训练1h，关闭隔板间小门，使大鼠停留在一个箱中，其中B箱为伴药箱。训练方案见图17C。 

训练后后测试：给药结束后第二天，将大鼠置于隔板间小门打开的CPP箱中，记录大鼠在不同箱中的停留时间，计算CPP分值。 

训练前测试中，模型组大鼠与对照组大鼠CPP分值无显著性差异(图18A)，即M组合C组大鼠在伴药箱(B箱)停留时间与非伴药箱(A箱)停留时间的差值之间无显著性差异，符合实验要求及平行对照原则。经过6天训练后，第7天的训练后测试结果表明，模型组大鼠CPP分值与对照组大鼠相比显著性增高(图18B)，即M组大鼠在伴药箱(B箱)停留时间与非伴药箱(A箱)停留时间的差值与C组相比显著性增大，表明模型组大鼠出现对METH的觅药行为，大鼠METH成瘾CPP模型制备成功，采集其血清和分离获取成瘾相关脑区组织用于后续实验。 

大鼠METH成瘾CPP模型建立成功后，将大鼠断头取血，冰上操作，迅速获取成瘾相关脑区组织：黑质(nigra)、纹状体(striatum)、海马(hippocampus)、伏隔核(NAc)、腹侧被盖区(VTA)和大脑皮层(cerebral cortex)等。 

大鼠血清的获得方法同前述人血清获得方法。 

组织称重后-80℃冰箱保存备用。在进行免疫印迹分析前，将大鼠各脑区组织匀浆，12,000rpm离心1h，抽取上清获得蛋白，分装，-80℃冰箱保存备用。 

实施例3免疫印迹分析 

为验证2-DE以及质谱得到的结果，确认CFH在成瘾人群及大鼠血清中与正常对照血清中存在差异表达，进行如下免疫印迹分析实验： 

①患者血清免疫印迹分析 

血清样品用Tris-HCl(0.01M，pH 7.4)缓冲液稀释30倍后上样，SDS-PAGE采用7.5％聚丙烯酰胺凝胶作为分离胶。5％脱脂牛奶封闭，一抗为CFH单克隆抗体(Santa Cruz，U.S.A)，稀释比例1∶500。二抗为HRP标记IgG(Proteintech Group，U.S.A)，稀释比例1∶2500。为保证蛋白上样量一致，加入内参。内参选用GAPDH，一抗为GAPDH多克隆抗体(Millipore，U.S.A)，稀释比例1∶1000；二抗为HRP标记IgG(Proteintech Group，U.S.A)，稀释比例1∶10000。ECL发光采用ECL超敏发光液试剂盒(北京普利莱公司)。 

②大鼠血清及成瘾相关脑区免疫印迹分析 

血清样品用Tris-HCl(0.01M，pH 7.4)缓冲液稀释30倍后上样，SDS-PAGE采用7.5％聚丙烯酰胺凝胶作为分离胶。5％脱脂牛奶封闭，一抗为CFH多克隆抗体(Santa Cruz，U.S.A)，稀释比例1∶500。二抗为HRP标记IgG(Proteintech Group，U.S.A)，稀释比例1∶2500。为保证蛋白上样量一致，加入内参。内参选用GAPDH，一抗为GAPDH多克隆抗体(Millipore，U.S.A)，稀释比例1∶250；二抗为HRP标记IgG(Proteintech Group，U.S.A)，稀释比例1∶10000。ECL发光采用ECL超敏发光液试剂盒(北京普利莱公司)。 

患者、大鼠血清免疫印迹分析结果见图19。 

由图19可见，无论在METH成瘾患者还是大鼠血清中，与对照组相比，CFH在METH成瘾组发生上调，并具有显著性差异，变化趋势与2-DE和质谱鉴定的结果一致。 

实施例4酶联免疫吸附实验(ELISA) 

为进一步定量验证CFH在成瘾人群及大鼠血清中与正常对照的表达差异，采用ELISA定量测定CFH在成瘾人群和成瘾大鼠血清中的含量。 

①患者血清ELISA 

采用人CFH酶联免疫分析试剂盒(Cusabio Biotech Co.，Ltd；产品编号：CSB-E08931h)分析人血清样品中的CFH含量。 

②大鼠血清ELISA 

采用大鼠CFH酶联免疫分析试剂盒(Cusabio Biotech Co.，Ltd；产品编号：CSB-E08932r)分析大鼠血清样品中的CFH含量。 

患者、大鼠血清ELISA实验结果见图20。 

由图20可见，与对照组相比，成瘾人和成瘾大鼠血清中的CFH在成瘾组含量均明显升高，并具有显著性差异，与之前的实验相符。 

实施例5大鼠成瘾相关脑区CFH的免疫印迹分析 

采用Bradford法检测成瘾大鼠6个相关脑区组织匀浆液中的总蛋白含量，取含有20μg蛋白质的样品上样，SDS-PAGE采用7.5％聚丙烯酰胺凝胶作为分离胶。5％脱脂牛奶封闭，一抗为CFH多克隆抗体(Santa Cruz，U.S.A)，稀释比例1∶100。二抗为HRP标记IgG(Proteintech Group，U.S.A)，稀释比例1∶2500。为保证蛋白上样量一致，加入内参。内参选用Actin，一抗为Act in多克隆抗体(Santa Cruz，U.S.A)，稀释比例1∶500；二抗为HRP标记IgG(Proteintech Group，U.S.A)，稀释比例1∶1000。ECL发光采用ECL超敏发光液试剂盒(北京普利莱公司)。结果见图21。 

由图21可见，与对照组相比，CFH的表达在大鼠海马、腹侧被盖区组织中表达上调，具有显著性差异；而在大脑皮层、伏隔核、纹状体、黑质中的表达未见明显差异。 

Claims (11)

1.补体H因子(Complement factor，CFH)用作甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)成瘾相关人群的基因表达产物中的应用。

2.人血清中CFH含量表达上调用于鉴定或确认METH成瘾相关人群的方法中的应用，优选所述的人血清中CFH含量选自CFH绝对含量、CFH相对含量的任一种或其组合，更优选所述的CFH相对含量为血清中CFH相对于血清总蛋白的质量百分比。

3.免疫印迹法用于定量检测人血清中CFH蛋白含量的方法中的应用。

4.一种用于双向电泳(2-DE)分析的血清样品的预处理方法，包括下述步骤：

1)静脉穿刺，分别抽取METH成瘾患者组和正常对照组的血液样品；

2)将抽取的待测血液样品置于4℃下，3,000g转速离心10min，分离血清，再用白蛋白/IgG去除试剂盒去除血清中的白蛋白和IgG，即得。

5.一种血清差异表达蛋白的鉴定方法，包括下述步骤：

1)分别抽取METH成瘾患者组和正常对照组的血清样品，将其使用白蛋白/IgG去除试剂盒去除血清中的白蛋白和IgG，获得待测血清样品；

2)将待测血清样品采用双向电泳进行分离，包括第一向等电聚焦电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺电泳，得到蛋白分离凝胶；

3)将步骤2)得到的蛋白分离凝胶进行硝酸银染色，得到METH成瘾患者组和正常对照组的血清样品的双向电泳图谱；

4)将步骤3)中得到的双向电泳图谱进行比对，选取变化稳定(重复3次及以上)、分离度较好、易切取的蛋白质斑点，斑点切下后，经过脱色和酶切后，进行生物质谱分析，得到蛋白质斑点的肽质量指纹图谱；

5)将步骤4)得到的蛋白质斑点的肽质量指纹图谱在SwissProt蛋白序列数据库中检索，得到差异表达蛋白质的名称及其相关信息。这些差异高表达的蛋白是补体因子H(Complementfactor H，CFH)，α1酸性糖蛋白2(Alpha-1-acid glycoprotein 2)，转甲状腺素蛋白(Transthyretin)，载脂蛋白L1(Apolipoprotein L1)，和结合珠蛋白(Haptoglobin)。

6.根据权利要求5所述的鉴定方法，所述的对照样品包括空白调零对照、空白对照、标准对照的任一种，其中，空白调零对照为加入过氧化氢-四甲基联苯胺底物及终止溶液的对照样品，用于检测时调零OD值；空白对照为加入稀释液的对照样品；标准对照为加入已知浓度的CFH蛋白标准样品的对照样品。

7.一种酶联免疫试剂盒，所述试剂盒由包被CFH蛋白的特异性多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、抗原标准品、CFH蛋白的特异性多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗CFH多克隆抗体的二抗、浓缩洗涤液、底物和终止液，其中，所述的封闭液为含1％牛血清白蛋白的PBST溶液，所述的样品稀释液为0.01M Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液，所述抗原标准品为纯化的重组人CFH蛋白抗原，所述的浓缩洗涤液为25×PBST缓冲液，所述的底物为过氧化氢-四甲基联苯胺，所述的终止液为酸溶液，优选为2M的硫酸溶液。

8.一种夹心式酶联免疫法定量检测人血清CFH蛋白的方法，所述的方法包括下述步骤：

1)将血清样品用0.01M Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液稀释20-50倍(优选稀释为30倍)，制得待测样品；

2)将对照样品和待测样品分别加入包被了浓度为100ng/mL-20ug/mL人CFH蛋白的特异性多克隆抗体的微孔板上的微孔中，振摇，使CFH蛋白与人CFH蛋白的特异性多克隆抗体充分结合；

3)用PBST缓冲液冲洗微孔板，去除未结合的其他组分后，加入以封闭液稀释的CFH蛋白特异性多克隆抗体稀释液，充分结合；

4)弃去孔内液体后，用PBST缓冲液冲洗，去除未结合的抗体及其它组分，加入以封闭液稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗CFH多克隆抗体的二抗，充分结合；

5)弃去孔内液体后，用PBST缓冲液冲洗，去除未结合的抗体及其它组分，HRP标记的抗体后，加入过氧化氢-四甲基联苯胺底物，与HRP反应；

6)加入终止液，使反应停止，在450nm波长处，测定黄色反应产物的吸收度，获得CFH蛋白的绝对含量。

9.根据权利要求8所述的方法，进一步采用双金鸡宁酸(BCA)法测定血清样品中的总蛋白浓度，计算CFH蛋白相对于样品中总蛋白的含量百分比，获得CFH蛋白的相对含量。

10.根据权利要求8或9所述的方法，所述的双金鸡宁酸(BCA)法采用BCA蛋白定量试剂盒测定血清样品中的总蛋白浓度。

11.一种甲基苯丙胺成瘾的检测方法，采用免疫印迹法或者酶联免疫试剂盒定量检测人血清中的CFH蛋白含量，并将人血清中CFH含量表达上调用于鉴定或确认METH成瘾相关人群，优选所述的人血清中CFH含量选自CFH绝对含量、CFH相对含量的任一种或其组合，更优选所述的CFH相对含量为血清中CFH相对于血清总蛋白的质量百分比。

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