CN1512178A - 定量法乙肝病毒前s1抗原酶联免疫测定试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属免疫诊断试剂。本发明公开了一种“定量法乙肝病毒前S1蛋白酶免测定试剂盒”。该试剂盒能定量检出完整HBV，并且具有简便、灵敏和稳定等特点，操作简便快速，可以补充或替代常规的“两对半”和PCR检测法。本发明提供了制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及免疫诊断试剂，具体涉及一种定量法乙肝病毒前S1(PreS1)抗原(Ag)酶联免疫测定试剂盒及制备方法。
背景技术
长期以来，临床医生是根据“二对半”试剂盒检验结果判断乙肝患者的病情。但是“二对半”试剂查的是与乙型肝炎病毒(HBV)相关的表面和核内抗原和抗体，不是直接查HBV。因此该方法不能确定患者有无HBV。此外，用“二对半”试剂盒检查结果表明全世界约有3亿人为乙肝表面抗原(HbsAg)携带者，我国约有1.3亿，已成为世界之最，但实际上其中的部分人既无临床症状，转氨酶也不高，因此，并非所有HbsAg阳性者都携带HBV。况且“二对半”仅能定性不能定量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，设计“定量法HBV-PreS1 Ag(乙肝病毒-前S1抗原)的酶免测定试剂盒”。
本发明提供了一种“定量法HBV-PreS1 Ag酶联免疫测定试剂盒”。该试剂盒是由主要成份为抗体预包被反应条、酶标记抗前S1抗体、PreS1 Ag标准品及次要成份为阳性对照液1支、阴性对照液1支、20倍浓洗涤液1瓶、底物缓冲液甲1瓶、底物缓冲液乙1瓶和终止液1瓶组成。
本发明的试剂盒中所述PreS1 Ag标准品为灭活的HBV-DNA；抗体预包被反应条为48-96孔；阳性对照液为HBV-DNA和HbeAg均阳性血清；酶标记的PreS1抗体为辣根过氧化物酶；阴性对照液为正常人血清；底物缓冲液甲为H2O2；底物缓冲液乙为3，3’5.5’-四甲基联苯胺(TMB)和终止液为4NH2SO4。
“定量法乙肝病毒PreS1 Ag酶免测定试剂盒”。因为已证明PreS1Ag是HBV-DNA复制的必然标志物，若检测出病人PreS1 Ag阳性，说明其HBV-DNA存在。若进一步检测出病人PreS1 Ag的含量，就是HBV-DNA含量。
定量法PreS1 Ag酶免试剂盒的方法学研究
1.实验方法
1.1.定量PreS1 Ag检测：按“定量法HBV-PreS1 Ag酶联免疫测定试剂盒”说明书进行操作如下：
(1)取出已包被条孔，插入支架上，用胶布固定，以防脱落。
(2)反应孔中分别加各浓度标准品每孔加0、2、10、20、30ng/ml、待检血清、阴性对照血清及阳性质控血清各50μl，每次实验设空白1孔，加蒸馏50μl，然后除空白孔外各孔加酶标记液50μl，置37℃中反应30分钟。
(3)甩去反应孔内液体在草纸上拍2-3下，然后用洗涤液洗5次，每次孔中加满洗涤液后停留30秒钟，甩去洗涤液后都要在草纸上拍干，以便洗涤彻底。(20倍浓洗涤液1ml+19ml蒸馏水即为工作洗涤液)
(4)各孔滴加底物缓冲液甲、乙各1滴，37℃中反应10分钟后再各孔滴加终止液1滴，置酶标仪450nm波长读取各孔A值。
(5)以标准品浓度为横座标，A值为纵座标绘出标准曲线，以各待测血清A值在标准曲线上查出该血清的前S1抗原浓度。(详见定量法HBV-PreS1 Ag酶免试剂盒标准曲线)
1.2.定量法测PreS1 Ag酶免试剂盒方法学鉴定
定量法PreS1 Ag酶免试剂盒与二步法PreS1 Ag酶免试剂盒检测的比较。
用中国药品生物制品检定所拟定的二步法PreS1 Ag酶免试剂盒，61份标准参考品来检定二步法和“定量法PreS1 Ag酶免试剂盒”其检定结果完全一致，结果如下：
检验项目 标准规定 检验结果
阴性参考品符合率 不得出现假阳性(0/27)(+/-) 0/27
阳性参考品符合率 允许出现1份假阴性(1/30)(-/+) 1/30
精密性CV(％) ≤15 15
灵敏度：1# ≥1∶64 1∶512
2# ≥1∶128 1∶1024
3# ≥1∶32 1∶256
稳定性 37℃放3天后，检定指标达到要求 合格
说明“定量法测PreS1 Ag酶免试剂盒”的特异性、精密性、灵敏度和稳定性是良好的合格的。
1.3.定量法HBV-PreS1 Ag酶免试剂盒的定量标准曲线的制定。
1.4.正常人HBV-PreS1 Ag含量选369例体检正常人(与献血员相当)血用“定量法HBV-PreS1 Ag酶免试剂盒”测定结果如下：
酶标板代码：2002102314161900
测量操作者：缺省
测量样本类型：血清
酶标仪测量类型(Single Wavelength)
酶标仪进板方式(连续)
测量主波长：450nm
酶标仪主波长测量(空白参考值0.000)：
0.082 0.086 0.084 0.087 0.079 0.083 0.077 0.081 0.076 0.076 0.081 0.077
0.081 0.087 0.076 0.075 0.081 0.077 0.086 0.085 0.078 0.086 0.081 0.090
0.091 0.080 0.076 0.079 0.083 0.087 0.082 0.078 0.076 0.093 0.087 0.088
0.094 0.074 0.073 0.088 0.084 0.089 0.087 0.074 0.075 0.083 0.076 0.089
0.080 0.085 0.083 0.075 0.078 0.080 0.091 0.083 0.080 0.120 0.079 0.078
0.092 0.079 0.079 0.078 0.078 0.091 0.078 0.084 0.077 0.078 0.075 0.086
0.095 0.087 0.104 0.077 0.076 0.079 0.075 0.075 0.104 0.086 0.078 0.092
0.084 0.079 0.085 0.085 0.080 0.088 0.087 0.081 0.088 0.091 0.079 0.095
0.082 0.075 0.072 0.085 0.085 0.082 0.076 0.082 0.080 0.096 0.079 0.079
0.074 0.072 0.072 0.075 0.078 0.074 0.072 0.078 0.073 0.071 0.071 0.077
0.082 0.080 0.076 0.077 0.078 0.078 0.077 0.073 0.072 0.077 0.082 0.081
0.082 0.074 0.071 0.072 0.071 0.076 0.075 0.074 0.083 0.072 0.069 0.087
0.081 0.075 0.071 0.079 0.074 0.077 0.074 0.066 0.086 0.106 0.090 0.073
0.076 0.076 0.074 0.077 0.077 0.071 0.076 0.073 0.078 0.073 0.076 0.075
0.086 0.081 0.079 0.075 0.075 0.077 0.078 0.078 0.079 0.080 0.080 0.079
0.084 0.080 0.076 0.075 0.067 0.077 0.078 0.082 0.082 0.083 0.072 0.084
0.076 0.079 0.079 0.071 0.077 0.074 0.077 0.075 0.076 0.076 0.076 0.073
0.073 0.076 0.068 0.070 0.073 0.075 0.076 0.082 0.070 0.075 0.075 0.075
0.090 0.089 0.073 0.081 0.080 0.076 0.072 0.082 0.097 0.080 0.074 0.081
0.076 0.076 0.070 0.076 0.072 0.073 0.073 0.074 0.071 0.072 0.074 0.076
0.071 0.075 0.076 0.073 0.091 0.075 0.079 0.082 0.072 0.078 0.083 0.078
0.081 0.081 0.074 0.082 0.078 0.077 0.075 0.072 0.073 0.074 0.079 0.082
0.088 0.086 0.078 0.073 0.079 0.078 0.083 0.094 0.076 0.071 0.082 0.075
0.088 0.071 0.079 0.074 0.083 0.082 0.071 0.085 0.085 0.071 0.079 0.078
0.072 0.071 0.071 0.077 0.078 0.080 0.073 0.075 0.082 0.088 0.077 0.072
0.076 1.152 0.067 0.069 0.071 0.082 0.081 0.076 0.075 0.074 0.071 0.071
0.065 0.073 0.070 0.071 0.077 0.077 0.070 0.071 0.073 0.071 0.071 0.066
0.206 0.073 0.297 0.076 0.077 0.077 0.092 0.073 0.150 0.079 0.131 0.143
0.080 0.093 0.122 0.085 0.068 0.069 0.083 0.072 0.074 0.122 0.158 0.114
0.067 0.082 0.072 0.071 0.073 0.074 0.075 0.074 0.130 0.071 0.137 0.112
0.066 0.068 0.071 0.086 0.074 0.068 0.072 0.073 0.077
上述体检的正常人(与献血员相当)血369例的A450值的均值X＝0.083694 标准偏差SD＝0.058291
因此其cut off值(临界值)为均值X+3SD＝0.258＝2.5ng/ml血即A450值大于0.258(2.5ng/ml血)为阳性。
而灰区范围：正常人A450值
X-
X+3SD为0.0836-0.258，遇到灰区范围的A450值要复查。
定量HBV-PreS1 Ag酶免试剂盒的临床应用和与定量PCR荧光试剂盒比较
2000年8月至2002年2月第二军医大学附属于长海医院、上海第二医科大学附属新华医院和上海市传染病医院使用我们研制建成的“定量法HBV-PreS1 Ag酶免试剂盒”和“HBV的PCR荧光定量法检测试剂盒”同时检测乙肝患者阳性血清146份，以比较两种定量之间的相关性。
1.临床血清标本的来源：
各医院临床收集乙肝患者血清标本总数为146份，其中长海医院66份、新华医院36份、传染病医院44份，共146份。另外，从长海医院收集到体检正常(与献血员相当)血369份(做正常值用)
2.使用定量法HBV-PreS1酶免法与HBV-PCR荧光定量法比较
2.1.方法
三个医院分别使用“定量法HBVA-PreS1 Ag酶免试剂盒”(按其说明书操作)和PCR荧光定量法试剂盒(按HBV-PCR荧光检测试剂盒说明书操作—深圳匹基生物技术开发有限公司)检测同一血样146份，并经统计学处理结果表明，该两种方法检测的结果非常显著的相关，以表1和图1-3显示如下：
2.2.结果
三个医院分别使用“定量法PreS1 Ag酶免试剂盒”和PCR荧光定量法试剂盒检测同一血样146份结果。
表1 三个医院两种方法比较
医院 血样数 相关系数(r) P值 备注
长海 66 0.659 0.000 非常显著相关
新华 36 0.508 0.001 非常显著相关
传染 44 0.407 0.002 非常显著相关
上海三个医院使用“定量法HBV-PreS1 Ag酶免试剂盒”与“HBV-PCR荧光定量试剂盒”测定同一血样的比较结果，两种方法均非常显著相关，均P值＜0.01。说明两种方法具有同等的使用价值，“定量法HBV-PreS1 Ag酶免试剂盒”与“HBV-PCR荧光定量试剂盒”相媲美。
讨论
PreS1蛋白是HBVS区基因编码产物，它和PreS2蛋白一起在HBV附着和侵入肝细胞的机制中起重要作用。PreS1蛋白主要存在于Dane颗粒中。已证实HBV的PreS1蛋白的P21-47肽是吸附于靶细胞受体的配体。
目前，通过血清学检查以判断HBV感染状态的常用手段是检测HBV-M，即所谓“两对半”：HbsAg-HbsAb，HbeAg-HbeAb和HbcAb，其中HbeAg和HbcAb阳性，表明HBV在肝内复制。然而，常规HBV-M检测方法繁琐、耗时，且结果分析比较复杂。PCR法定量测定HBV-DNA(PCR定量法)亦已在一些大医院开展，但是尽管该方法有敏感性高等特点，亦因其操作步骤繁琐、费时、技术要求高、消耗性试剂昂贵收费价又高，很难被普遍应用。Theilman等首先报告用western blot技术检测了HbsAg阳性病人血清PreS1蛋白，认为该蛋白与HbeAg和HBV-DNA有良好的相关性，是HBV在体内复制的标志。我们用重组PreS1 Ag免疫豚鼠制备多体或免疫Balb/c小鼠得抗PreS1单抗，经过(NH4)2SO4粗提，再柱层析(DE52)，获高效价多体或单抗。用Sepharos 4B亲和层析柱纯化乙肝患者血清中的HBV-DNA，再用抗正常人(IgG)Sepharos 4B柱得进一步纯化的HBV-DNA做标准品。在国内首先建成了“定量法乙肝病毒PreS1 Ag酶免试剂盒”。经方法学鉴定证明“定量法乙肝病毒PreS1 Ag酶免试剂盒”的特异性、精密性、灵敏度和稳定性合格，定量是准确的。经过临床应用结果表明，定量法HBV-PreS1 Ag检测试剂盒在下述两个方面具有重要价值。
首先，“定量法乙肝病毒PreS1 Ag酶免试剂盒”不仅能查出HBV的感染(或载毒)，而且还能查到感染者HBV的含量，可与“HBV-PCR荧光测定试剂盒”相媲美。这对乙肝患者的防治，特别疗效的判定指标明确，治疗能使HBV减多少可判定之。
另外，“定量法乙肝病毒PreS1 Ag酶免试剂盒”也具有操作简便、快速和经济的特点，40分钟出报告，广大临床检验工作者省时、省费用，而乙肝患者省费用，所以很受欢迎。
本发明的另一所要解决的问题是提供了“定量法(立可读)PreS1Ag酶免测定试剂盒”的制备方法。该方法包括下列步骤：
1.抗体制备：
1.1.制备抗原：HBV-DNA重组PreS1 Ag基因片断的21-47aa及1-199aa；
1.2.制备抗体：
1.2.1.用上述重组抗原免疫豚鼠，得抗PreS1抗血清或免疫Balb/C小鼠得阳性鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，筛选阳性克隆建株，得腹水；
1.2.2.抗血清或腹水用(NH4)2SO4或正辛酸沉淀处理，得粗提抗PreS1抗体；
1.2.3.用DE52离子交换层析法得纯抗PreS1抗体；
1.2.4.经高压液相色谱(HPLC)检定，纯抗PreS1抗体呈单一峰，其纯度95％以上。
2.HRP-抗前S1抗体制备：辣根过氧化物酶(HRP)与纯化的抗前S1抗体偶联；
3.前S1 Ag标准品的制备：收集乙肝患者阳性血清，过Sepharos4B亲和层析柱，再过抗常人(IgG)Sepharos 4B柱后，测HBV-DNA含量。经钴60r-线照射使HBV-DNA灭活。分装成0、2、10、20、30、40ng/ml共5支。
4.包被抗体成为予包被反应条：用抗HBS或抗PreS1豚抗；
5.分装试剂盒其余7种成份，按试剂盒需要量分装在小瓶或尖底离心管中；
6.检定试剂盒的特异性、灵敏度、精密度、稳定性合格；
7.组装成为成品。
本发明的试剂盒在使用时可以如下操作：
1.取出已包被条孔，插入支架上，用胶布固定，以防脱落。
2.反应孔中，分别加各浓度标准品。待检血清50μl，各板设阳性对照1孔(50μl)阴性对照1孔(50μl)，空白对照1孔(加蒸馏水50μl)，然后除空白对照孔外各孔加酶标记液50μl，置37℃中反应30分钟。
3.取出反应板甩去孔内液体后停留30秒钟，每次甩去洗涤液后都要在草纸上拍干，以便洗涤彻底。(20倍浓洗涤液1ml+19ml蒸馏水即为工作洗涤液)
4.各孔滴加底物缓冲液甲、乙各1滴，室温避光10-15分钟后再每孔滴加终止液1滴，置酶标仪中450nm波长读数。
5.结果判定
以标准品浓度为横座标，以待检血清A值为纵座标绘出标准曲线，从各待检血清A值就可在标准曲线上查出该血清的PreS1 Ag浓度。
本发明的试剂盒能非常专一地定量测出检测患者血清中HBV-PreS1蛋白的含量。它具有简便、灵敏和稳定等特点。且本试剂盒操作简便快速，采用一步法可在40分钟左右获得实验结果，比PCR检测法省时(PCR法最快需6-8小时完成实验)，经临床试用PreS1蛋白定量法与PCR定量的HBV-DNA有很好的符合率，因而本试剂盒对判断病人是否有病毒复制和定量，确定乙肝感染病程预后及用药后的疗效具有十分重要的参考意义。本试剂盒与PCR法相比，PCR法需贵重的仪器设备，消耗性试剂昂贵，收费价又高，而本试剂盒整个实验中无需贵重仪器设备，消耗性试剂便宜且收费价低廉，能适用于各级医院及临床测试中心，也可用于流行病学普查。定量法PreS1Ag试剂盒，具有简便、灵敏、重复性好的优点，能检出病人完整HBV含量，将可被普遍使用，做为HBV感染，复制和乙肝病人诊断、治疗和预后的一个新的标志，与其抗PreS1抗体联合可成为新的乙肝检测系统。
具体实施方式
实施例1 制备定量法乙肝病毒前S1蛋白酶免试剂盒的生产步骤
(一)纯化包被抗体(HbsAb)：
HbsAg免疫豚鼠得单抗或用重组PreS1 Ag免疫豚鼠得抗PreS1多抗。加等体积的饱和(NH4)2SO4沉淀，粗提后再经DE-52柱纯化，收集蛋白峰，PBS透析得抗HBs或抗PreS1多抗纯品。经HPLC检定得纯抗PreS1抗体，呈现单一峰。纯度＞95％，效价＞10万。
(二)酶标记抗体制备
1.抗体制备：基因重组的PreS1 Ag(21-47aa)及(1-119aa)免疫豚鼠得抗PreS1抗体或重组PreS1 Ag免疫Balb/c小鼠得腹水。用饱和(NH4)2SO4沉淀粗提两次，再经DE-52柱纯化，得纯抗PreS1抗体或单克隆抗体。效价＞10万，经HPLC鉴定纯度在95％以上。
2.酶标记抗体制备
抗PreS1抗体用过碘酸钠法与辣根过氧化物偶联对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存。效价＞2000。
3.前S1 Ag标准品的制备：
收集乙肝患者阳性血清，过Sepharos 4B亲和层析柱，再过抗正常人(IgG)Sepharos 4B柱，测HBV-DNA含量。经钴60r-线照射使HBV-DNA灭活。分装成0、2、10、20、30ng/ml共5支。
4.酶标记抗体浓度选定
采用方阵滴定法选择酶标记抗体的工作浓度大于1∶2000。PreS1重组抗原从10μg/ml倍增稀释，包被酶标板，加梯度稀释的酶标抗体测定，以确定最适稀释度。
(三)预包被抗体板的制备
1.包被
Na2CO3 0.6g
NaHCO3 1.58g
重蒸水 500ml
加入适量Anti-S抗体，调整PH至9.5，加入微孔板各孔中，置湿盒中加盖，4℃过夜甩干。
2.洗涤
Na2HPO4·12H2O 2.6g
NaH2PO4·2H2O 0.4g
20％Tween-20 2.5ml
NaCL 8.2g
重蒸水 100ml
调整PH至7.2，1∶10稀释后，加入微孔板各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复三次，以除去剩余抗体。
3.封闭
明胶 1.1g 微波炉加温 注入酶标
BSA 5.0g 至呈透明溶液 板各孔中
0.1N PBS 20ml—→ 冷却至室温—→
蒸馏水至100ml
弃去液体
放入湿盒中(加盖) 吸水纸上拍干重复一次，待干燥后，
——→37℃1hr—→ 放入有干燥剂的塑料袋
封口，保存于4℃。
(四)阳性对照的制备
HBeAg和HBV-DNA同时呈阳性的乙肝患者血清，60℃放置1个小时，除菌过滤，用本药盒测定A值＞0.3，备用，分装。
(五)阴性对照的制备
用本试剂盒测定正常人血清A值在0-0.03，加万分之二硫柳汞，分装备用。
(六)酶标单抗配置——————→
10％小牛血清
90％0.15MPBS
Anti-preS1-HRP————————→稀释20倍，分装。
(稀释度1∶2000)
(七)酶标单抗稀释液
BSA 0.5g
Na2HPO4·12H2O 2.6g
NaH2PO4·2H2O 0.4g
NaCL 8.2g
20％Tween-20 100ml
调整PH至7.2
(八)底物液A
Na2HPO4·12H2O 1.7g
柠檬酸.H2O 0.5g
3％H2O2 200μl
重蒸水 100ml
调整PH至5.0
(九)底物液B
Na2HPO4·12H2O 1.7g
柠檬酸.H2O 0.5g
重蒸水 100ml
调整PH至5.0后，加入10mlDMSO含60mgTMB的溶液25μl
(十)终止液
浓H2SO4 10ml
重蒸水 80ml
(十一)10x洗涤液
Na2HPO4·12H2O 2.6g
NaH2PO4·2H2O 0.4g
20％Tween-20 2.5ml
重蒸水 100ml
调整PH至7.2
(十二)半成品及成品的组成
上述(一)→(十一)步骤所得产品装入小瓶及尖底离心管中，即为半成品。抽出三份经过特异性、稳定性、灵敏度及精密度检定合格才能组装成preS1试剂盒。组装成盒后还需抽出三份同半成品一样经过检定合格才能出售。
Claims (3)
1.一种“定量法乙肝病毒PreS1抗原酶联免疫测定试剂盒”，其特征在于该试剂盒是由主要成份前S1抗原标准品5支、抗体预包被反应条48-96孔、酶标记前S1抗体和次要成份阳性对照液1支、阴性对照液1支、20倍浓洗涤液1瓶、底物缓冲液甲1瓶、底物缓冲液乙1瓶及终止液(4N H2SO4)1瓶组成。
2.一种如权利要求1所述的一种“定量法乙肝病毒PreS1抗原酶联免疫测定试剂盒”的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
I.抗体制备：
(1)制备抗原：HBV-DNA重组PreS1 Ag基因片断的21-47aa及1-199aa；
(2)制备抗体：
用上述重组抗原免疫豚鼠，得抗PreS1抗血清或免疫Balb/C小鼠得阳性鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，筛选阳性克隆建株，得腹水；
抗血清或腹水用(NH4)2SO4或正辛酸沉淀处理，得粗提抗PreS1抗体；
用DE52离子交换层析法得纯抗PreS1抗体；
经高压液相色谱(HPLC)检定，纯抗PreS1抗体呈单一峰，其纯度95％以上。
(3)PreS1 Ag标准品的制备：
收集乙肝患者阳性血清，过Sepharos 4B亲和层析柱，再过抗正常人(IgG)Sepharos 4B柱，测HBV-DNA含量。经钴60r-线照射使HBV-DNA灭活。分装成0、2、10、20、30ng/ml共5支。
(4)HRP-抗前S1抗体制备：辣根过氧化物酶(HRP)与纯化的抗前S1抗体偶联；
(5)包被抗体成为予包被反应条：用抗HBs或抗PreS1豚抗；
(6)分装试剂盒其余7种成份，按试剂盒需要量分装在小瓶或尖底离心管中；
(7)检定试剂盒的特异性、灵敏度、精密度、稳定性合格；
(8)组装成为成品。
3.根据权利要求1所述的一种“定量法乙肝病毒PreS1抗原酶联免疫测定试剂盒”，其特征在于其中所述的前S1抗原标准品为灭活的HBV-DNA、5支、抗体预包被反应条为48-96孔、酶标记抗体、阳性对照液为HBV-DNA和HBeAg均阳性血清、酶标记的前S1抗体为辣根过氧物酶、阴性对照液为正常人血清、浓洗涤液磷酸-Tween-20、底物缓冲液甲为H2O2、底物缓冲液乙为3，3’.5.5’-四甲基联苯胺、终止液为4NH2SO4。
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|---|---|---|---|
| CNA021517274A CN1512178A (zh) | 2002-12-27 | 2002-12-27 | 定量法乙肝病毒前s1抗原酶联免疫测定试剂盒及制备方法 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008003236A1 (fr) * | 2006-06-27 | 2008-01-10 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. | Procédé de détection conjointe de l'antigène pres1 et de l'antigène de noyau de vhb, coffret d'expérimentation, substrat solide et solution de lyse de virus |
| CN103048456A (zh) * | 2012-10-08 | 2013-04-17 | 武汉康珠生物技术有限公司 | 一种一步法乙肝病毒PreS1抗原酶联免疫测定试剂盒 |
-
2002
- 2002-12-27 CN CNA021517274A patent/CN1512178A/zh active Pending
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| WO2008003236A1 (fr) * | 2006-06-27 | 2008-01-10 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. | Procédé de détection conjointe de l'antigène pres1 et de l'antigène de noyau de vhb, coffret d'expérimentation, substrat solide et solution de lyse de virus |
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