CN108646019B - 新重组因子c、其制造方法、及内毒素的测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新重组因子C、其制造方法、及内毒素的测定法。本发明提供一种制造鲎的重组因子C的方法。将CHO DG44及HEK293等哺乳类细胞用作宿主细胞而表达鲎的因子C，从而制造鲎的重组因子C。

Description

新重组因子C、其制造方法、及内毒素的测定法
本申请是申请日为2013年12月10日、进入中国的申请号为201380064649.3、发明名称为“新重组因子C、其制造方法、及内毒素的测定法”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及新重组因子C、其制造方法、及内毒素的测定法。
背景技术
内毒素是存在于革兰氏阴性细菌的细胞壁外膜上的脂多糖，且己知是强致热原。此外，己知的是，即使少量的内毒素也会造成归因于细菌感染的不同疾病状态，诸如由巨噬细胞活化引起的炎症性细胞因子的释放和内毒素性休克的诱导以及发热。因此，以注射用药为代表的药物、水、医疗设备等中的内毒素的检测是重要的。此外，内毒素被认为是革兰氏阴性细菌感染中的休克的主要原因，因此，通过测量血液中的内毒素，可以判定感染的有无及治疗效果。
此外，己知的是，若革兰氏阴性细菌感染美洲鲎(Limulus polyphemus)，则会引起血液凝固，该现象被用于内毒素的检测。
即，已知使用鲎血细胞提取液(鲎的变形细胞溶解物，下文中也称为“溶解物”)测定内毒素的方法(例如，非专利文献1)。该方法被称为鲎试验，利用存在于溶解物中的各种蛋白质的级联反应，该反应是通过使内毒素与溶解物接触而发生的。级联反应的示意图示于图1。
在内毒素与溶解物接触后，存在于溶解物中的作为丝氨酸蛋白酶前体的因子C被活化而生成活化型因子C。该活化型因子C使存在于溶解物中的因子B活化，生成活化型因子B。该活化型因子B使存在于溶解物中的凝固酶原活化，生成凝固酶。
该凝固酶将存在于溶解物中的凝固蛋白原分子中的特定部位水解。由此，生成凝固蛋白凝胶，以使溶解物凝固。因此，通过测定溶解物的凝固反应，可以测定内毒素。
此外，通过使凝固酶与合成底物发生作用，从而使显色反应进行，也可以测定内毒素。例如，凝固酶作用于作为合成底物的叔丁氧羰基-亮氨酰基-甘氨酰基-精氨酰基-pNA(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA)，将其酰胺键水解，使pNA游离。由此，通过使反应体系中存在所述合成底物，可以测定显色物质(pNA)的吸光度(405nm)，从而可以对内毒素进行定量。
此外，已知的是，使用从日本鲎的溶解物纯化出的因子C、因子B及凝固酶原，可以重构级联反应体系(非专利文献2)。
但是，为了利用溶解物或由此纯化出的因子C、因子B及凝固酶原，需要捕获鲎并采集血液，从保护生物资源的观点出发，难以无限地供给这些成分。因此，需要通过基因工程学的方式生产这些成分并重构级联反应体系的技术。
例如，已知下述例子：使用昆虫细胞作为宿主细胞来表达因子C、因子B及凝固酶原，重构级联反应体系(专利文献1、2)。但是报道了：在该重构体系中，通过使反应体系中存在氯化钠、硫酸镁或氯化钙，可抑制级联反应(专利文献1)。
另一方面，作为使用哺乳类细胞作为宿主细胞的例子，已知下述例子：使用非洲绿猴肾细胞来源的细胞株COS-1作为宿主细胞，表达新加坡鲎(Carcinoscorpiusrotundicauda，圆尾鲎)来源的因子C。但是，在使用COS-1作为宿主细胞的情况下，据报道所表达的因子C为不溶性(非专利文献3、4)。即，尚未知将哺乳类细胞用作宿主细胞来生产功能性的因子C的例子。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2008/004674号小册子
专利文献2：国际公开第2012/118226号小册子
非专利文献
非专利文献1：Iwanaga S.,Curr.Opin.Immunol.Feb；5(1):74-82(1993)
非专利文献2：Nakamura T.,et al.,J.Biochem.Mar；99(3):847-57(1986)
非专利文献3：Roopashree S.Dwarakanath,et al.,Biotechnology letters 19(4):357-361(1997)
非专利文献4：Jing Wang,Bow Ho and Jeak L.Ding,Biotechnology letters23:71-76(2001)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于提供鲎的新重组因子C及制造该重组因子C的方法。
此外，注射至生物体内的注射剂大多含有各种盐(离子)。另一方面，在它们的制造中，各国药典赋予了确认内毒素的义务。因此，本发明的一个方式的课题在于，提供一种在盐(离子)的存在下难以受到反应抑制的级联反应的重构体系。
用于解决问题的方案
本发明人发现，通过将人细胞或中国仓鼠细胞用作宿主细胞，可以制造鲎的重组因子C；以及通过使用如此制造的重组因子C，可以在盐(离子)的存在下降低反应抑制，测定内毒素，由此完成了本发明。
即，本发明包括以下的方案。
[1]
一种鲎的因子C，其具有因子C的活性。
[1.1.1]
上述因子C，其具有唾液酸。
[1.1.2]
上述因子C，其具有(α-2,3)键的末端唾液酸。
[1.1.3]
上述因子C，其与天然因子C相比具有较多的(α-2,3)键的末端唾液酸。
[1.1.4]
上述因子C，其与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C相比，具有较多的(α-2,3)键的末端唾液酸。
[1.1.5]
上述因子C，其中，在用怀槐凝集素(Maackia amurensis Agglutinin)进行凝集素印迹时，与天然因子C相比显示出较高的反应性。
[1.1.6]
上述因子C，其中，在用怀槐凝集素(Maackia amurensis Agglutinin)进行凝集素印迹时，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C相比显示出较高的反应性。
[1.2.1]
上述因子C，在21mM的柠檬酸钠的存在下，显示出10％以上的残留活性。
[1.2.2]
上述因子C，在21mM的柠檬酸钠的存在下，显示出20％以上的残留活性。
[1.2.3]
上述因子C，在52mM的碳酸氢钠的存在下，显示出25％以上的残留活性。
[1.2.4]
上述因子C，在52mM的碳酸氢钠的存在下，显示出35％以上的残留活性。
[1.2.5]
上述因子C，在214mM的氯化钠的存在下，显示出25％以上的残留活性。
[1.2.6]
上述因子C，在214mM的氯化钠的存在下，显示出35％以上的残留活性。
[1.2.7]
上述因子C，在16mM的硫酸镁的存在下，显示出15％以上的残留活性。
[1.2.8]
上述因子C，在16mM的硫酸镁的存在下，显示出25％以上的残留活性。
[1.2.9]
上述因子C，在2.5mM的氯化钙的存在下，显示出35％以上的残留活性。
[1.2.10]
上述因子C，在2.5mM的氯化钙的存在下，显示出45％以上的残留活性。
[1.2.11]
上述因子C，在21mM的柠檬酸钠的存在下，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C和/或天然因子C相比，显示出较高的残留活性。
[1.2.12]
上述因子C，在52mM的碳酸氢钠的存在下，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C和/或天然因子C相比，显示出较高的残留活性。
[1.2.13]
上述因子C，在214mM的氯化钠的存在下，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C和/或天然因子C相比，显示出较高的残留活性。
[1.2.14]
上述因子C，在16mM的硫酸镁的存在下，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C和/或天然因子C相比，显示出较高的残留活性。
[1.2.15]
上述因子C，在2.5mM的氯化钙的存在下，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C和/或天然因子C相比，显示出较高的残留活性。
[1.3.1]
上述因子C，其为下述(A)、(B)、(C)、或(D)所示的蛋白质：
(A)包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质；
(B)包含在序列号2所示的氨基酸序列中含有一个或几个氨基酸的置换、缺失、插入或添加的氨基酸序列、且具有因子C的活性的蛋白质；
(C)包含序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质；
(D)包含在序列号4所示的氨基酸序列中含有一个或几个氨基酸的置换、缺失、插入或添加的氨基酸序列、且具有因子C的活性的蛋白质。
[1.3.2]
上述因子C，其为下述(A)或(B)所示的蛋白质：
(A)包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质；
(B)包含在序列号2所示的氨基酸序列中含有一个或几个氨基酸的置换、缺失、插入或添加的氨基酸序列、且具有因子C的活性的蛋白质。
[1.4]
上述因子C，其为重组蛋白。
[1.5.1]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为115kDa～140kDa。
[1.5.2]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为115kDa～130kDa。
[1.5.3]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为120kDa～130kDa。
[1.5.4]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为120kDa～128kDa。
[1.5.5]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为127kDa±5kDa。
[1.5.6]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为128kDa±2kDa。
[1.5.7]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为127kDa±2kDa。
[1.5.8]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为126kDa±2kDa。
[1.5.9]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为127kDa±1kDa。
[1.6]
上述因子C，其为水溶性。
[1.7]
上述因子C，其为包含因子C的培养上清。
[1.8]
上述因子C，其具有下述(1)～(3)所示的性质：
(1)具有因子C的活性；
(2)在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为115kDa～130kDa；及
(3)在21mM的柠檬酸钠的存在下，显示出10％以上的残留活性。
[2]
一种制造鲎的因子C的方法，该方法包括将哺乳类细胞用作宿主细胞而表达鲎的因子C。
[2.1.1]
上述方法，其中，所述哺乳类细胞为COS-1以外的哺乳类细胞。
[2.1.2]
上述方法，其中，所述哺乳类细胞为选自由灵长类和啮齿类组成的组中的哺乳动物的细胞。
[2.1.3]
上述方法，其中，所述哺乳类细胞为灵长类的细胞。
[2.1.4]
上述方法，其中，所述哺乳类细胞为啮齿类的细胞。
[2.1.5]
上述方法，其中，所述哺乳类细胞为选自由除猴外的灵长类和啮齿类组成的组中的哺乳动物的细胞。
[2.1.6]
上述方法，其中，所述哺乳类细胞为中国仓鼠的细胞或人的细胞。
[2.1.7]
上述方法，其中，所述哺乳类细胞为中国仓鼠的细胞。
[2.1.8]
上述方法，其中，所述哺乳类细胞为人的细胞。
[2.1.9]
上述方法，其中，所述哺乳类细胞为CHO或HEK。
[2.1.10]
上述方法，其中，所述哺乳类细胞为CHO。
[2.1.11]
上述方法，其中，所述哺乳类细胞为HEK。
[2.1.12]
上述方法，其中，所述哺乳类细胞为CHO DG44或HEK293。
[2.1.13]
上述方法，其中，所述哺乳类细胞为CHO DG44。
[2.1.14]
上述方法，其中，所述哺乳类细胞为HEK293。
[2.2.1]
上述方法，其中，所述因子C为下述(A)、(B)、(C)或(D)所示的蛋白质：
(A)包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质；
(B)包含在序列号2所示的氨基酸序列中含有一个或几个氨基酸的置换、缺失、插入或添加的氨基酸序列、且具有因子C的活性的蛋白质；
(C)包含序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质；
(D)包含在序列号4所示的氨基酸序列中含有一个或几个氨基酸的置换、缺失、插入或添加的氨基酸序列、且具有因子C的活性的蛋白质。
[2.2.2]
上述方法，其中，所述因子C为下述(A)或(B)所示的蛋白质：
(A)包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质；
(B)包含在序列号2所示的氨基酸序列中含有一个或几个氨基酸的置换、缺失、插入或添加的氨基酸序列、且具有因子C的活性的蛋白质。
[3]
一种鲎的因子C，其可以利用所述方法制造。
[3.1]
上述因子C，其具有因子C的活性。
[3.2.1]
上述因子C，其具有唾液酸。
[3.2.2]
上述因子C，其具有(α-2,3)键的末端唾液酸。
[3.2.3]
上述因子C，其与天然因子C相比具有较多的(α-2,3)键的末端唾液酸。
[3.2.4]
上述因子C，其与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C相比，具有较多的(α-2,3)键的末端唾液酸。
[3.2.5]
上述因子C，其中，在用怀槐凝集素(Maackia amurensis Agglutinin)进行凝集素印迹时，与天然因子C相比显示出较高的反应性。
[3.2.6]
上述因子C，其中，在用怀槐凝集素(Maackia amurensis Agglutinin)进行凝集素印迹时，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C相比显示出较高的反应性。
[3.3.1]
上述因子C，在21mM的柠檬酸钠的存在下，显示出10％以上的残留活性。
[3.3.2]
上述因子C，在21mM的柠檬酸钠的存在下，显示出20％以上的残留活性。
[3.3.3]
上述因子C，在52mM的碳酸氢钠的存在下，显示出25％以上的残留活性。
[3.3.4]
上述因子C，在52mM的碳酸氢钠的存在下，显示出35％以上的残留活性。
[3.3.5]
上述因子C，在214mM的氯化钠的存在下，显示出25％以上的残留活性。
[3.3.6]
上述因子C，在214mM的氯化钠的存在下，显示出35％以上的残留活性。
[3.3.7]
上述因子C，在16mM的硫酸镁的存在下，显示出15％以上的残留活性。
[3.3.8]
上述因子C，在16mM的硫酸镁的存在下，显示出25％以上的残留活性。
[3.3.9]
上述因子C，在2.5mM的氯化钙的存在下，显示出35％以上的残留活性。
[3.3.10]
上述因子C，在2.5mM的氯化钙的存在下，显示出45％以上的残留活性。
[3.3.11]
上述因子C，在21mM的柠檬酸钠的存在下，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C和/或天然因子C相比，显示出较高的残留活性。
[3.3.12]
上述因子C，在52mM的碳酸氢钠的存在下，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C和/或天然因子C相比，显示出较高的残留活性。
[3.3.13]
上述因子C，在214mM的氯化钠的存在下，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C和/或天然因子C相比，显示出较高的残留活性。
[3.3.14]
上述因子C，在16mM的硫酸镁的存在下，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C和/或天然因子C相比，显示出较高的残留活性。
[3.3.15]
上述因子C，在2.5mM的氯化钙的存在下，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C和/或天然因子C相比，显示出较高的残留活性。
[3.4]
上述因子C，其为重组蛋白。
[3.5.1]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为115kDa～140kDa。
[3.5.2]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为115kDa～130kDa。
[3.5.3]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为120kDa～130kDa。
[3.5.4]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为120kDa～128kDa。
[3.5.5]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为127kDa±5kDa。
[3.5.6]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为128kDa±2kDa。
[3.5.7]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为127kDa±2kDa。
[3.5.8]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为126kDa±2kDa。
[3.5.9]
上述因子C，其在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为127kDa±1kDa。
[3.6]
上述因子C，其为水溶性。
[3.7]
上述因子C，其为包含因子C的培养上清。
[4]
一种内毒素测定剂，其包含所述因子C。
[4.1]
上述测定剂，其进一步包含鲎的因子B及鲎的凝固酶原。
[4.2]
上述测定剂，其中，所述因子B为下述(E)或(F)所示的蛋白质，所述凝固酶原为下述(G)或(H)所示的蛋白质：
(E)包含序列号6所示的氨基酸序列的蛋白质；
(F)包含在序列号6所示的氨基酸序列中含有一个或几个氨基酸的置换、缺失、插入或添加的氨基酸序列、且具有因子B的活性的蛋白质；
(G)包含序列号8所示的氨基酸序列的蛋白质；
(H)包含在序列号8所示的氨基酸序列中含有一个或几个氨基酸的置换、缺失、插入或添加的氨基酸序列、且具有凝固酶原的活性的蛋白质。
[5]
一种内毒素测定用试剂盒，其包含所述测定剂。
[6]
一种测定待测试样中的内毒素的方法，其包括将所述测定剂与待测试样混合的工序；及测定级联反应的进行的工序。
[6.1.1]
上述方法，其中，所述待测试样含有离子。
[6.1.2]
上述方法，其中，所述待测试样含有阳离子。
[6.1.3]
上述方法，其中，所述待测试样含有金属离子。
[6.1.4]
上述方法，其中，所述待测试样含有碱金属离子或碱土金属离子。
[6.1.5]
上述方法，其中，所述待测试样含有碱金属离子。
[6.1.6]
上述方法，其中，所述待测试样含有碱土金属离子。
[6.2.1]
上述方法，其中，所述待测试样含有选自由钠离子、钾离子、钙离子及镁离子组成的组中的1种或1种以上的离子。
[6.2.2]
上述方法，其中，所述待测试样含有钠离子。
[6.2.3]
上述方法，其中，所述待测试样含有钾离子。
[6.2.4]
上述方法，其中，所述待测试样含有钙离子。
[6.2.5]
上述方法，其中，所述待测试样含有镁离子。
[6.3.1]
上述方法，其中，所述待测试样中的离子的含量是来自该待测试样的阳离子的浓度以将该待测试样与所述测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到1mM以上的量。
[6.3.2]
上述方法，其中，所述待测试样中的离子的含量是来自该待测试样的阳离子的浓度以将该待测试样与所述测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到2mM以上的量。
[6.3.3]
上述方法，其中，所述待测试样中的离子的含量是来自该待测试样的阳离子的浓度以将该待测试样与所述测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到5mM以上的量。
[6.3.4]
上述方法，其中，所述待测试样中的离子的含量是来自该待测试样的阳离子的浓度以将该待测试样与所述测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到10mM以上的量。
[6.3.5]
上述方法，其中，所述待测试样中的离子的含量是来自该待测试样的阳离子的浓度以将该待测试样与所述测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到20mM以上的量。
[6.3.6]
上述方法，其中，所述待测试样中的离子的含量是来自该待测试样的阳离子的浓度以将该待测试样与所述测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到50mM以上的量。
[6.3.7]
上述方法，其中，所述待测试样中的离子的含量是来自该待测试样的阳离子的浓度以将该待测试样与所述测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到100mM以上的量。
[6.4]
上述方法，其中，所述待测试样为注射剂。
[6.5.1]
上述方法，其中，所述待测试样含有选自由氯化钠、硫酸镁、碳酸氢钠、柠檬酸钠、氯化钙、氯化钾、碘他拉酸钠、依地酸二钠钙及磷酸二氢钠组成的组中的1种或1种以上的盐。
[6.5.2]
上述方法，其中，所述待测试样含有氯化钠。
[6.5.3]
上述方法，其中，所述待测试样含有硫酸镁。
[6.5.4]
上述方法，其中，所述待测试样含有碳酸氢钠。
[6.5.5]
上述方法，其中，所述待测试样含有柠檬酸钠。
[6.5.6]
上述方法，其中，所述待测试样含有氯化钙。
[6.5.7]
上述方法，其中，所述待测试样含有氯化钾。
[6.5.8]
上述方法，其中，所述待测试样含有碘他拉酸钠。
[6.5.9]
上述方法，其中，所述待测试样含有依地酸二钠钙。
[6.5.10]
上述方法，其中，所述待测试样含有磷酸二氢钠。
[6.6.1]
上述方法，其中，所述待测试样中的盐的含量是来自该待测试样的盐的浓度以将该待测试样与所述测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到1mM以上的量。
[6.6.2]
上述方法，其中，所述待测试样中的盐的含量是来自该待测试样的盐的浓度以将该待测试样与所述测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到2mM以上的量。
[6.6.3]
上述方法，其中，所述待测试样中的盐的含量是来自该待测试样的盐的浓度以将该待测试样与所述测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到5mM以上的量。
[6.6.4]
上述方法，其中，所述待测试样中的盐的含量是来自该待测试样的盐的浓度以将该待测试样与所述测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到10mM以上的量。
[6.6.5]
上述方法，其中，所述待测试样中的盐的含量是来自该待测试样的盐的浓度以将该待测试样与所述测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到20mM以上的量。
[6.6.6]
上述方法，其中，所述待测试样中的盐的含量是来自该待测试样的盐的浓度以将该待测试样与所述测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到50mM以上的量。
[6.6.7]
上述方法，其中，所述待测试样中的盐的含量是来自该待测试样的盐的浓度以将该待测试样与所述测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到100mM以上的量。
[6.7]
上述方法，其中，包括将用于检测级联反应的进行的底物添加至反应体系的工序。
[6.8]
上述方法，其中，进一步包括计算出待测试样中的内毒素量的工序。
附图说明
图1是表示鲎试验的级联反应体系的图。
图2是表示日本产鲎东方鲎(Tachypleus tridentatus)来源的4种因子C(Sf9、CHO、HEK、TAL)在非还原条件下的蛋白质印迹的结果的照片。
图3是表示日本产鲎东方鲎来源的天然因子C(TAL)及重组因子C(CHO)的分子量的照片(SDS-PAGE)。
图4是表示因子C的活性测定的方案的图。
图5是表示重构级联反应体系的图。
图6是表示日本产鲎东方鲎来源的4种因子C(Sf9、CHO、HEK、TAL)的活性的图。
图7是表示日本产鲎东方鲎来源的4种因子C(Sf9、CHO、HEK、TAL)的、基于各种注射剂的活性抑制的图。
图8是表示东方鲎的因子C(TtFC)和圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)的因子C(834CrID4)的比对的图(接于图9)。下划线表示能够发生N型糖链修饰的共有序列。
图9是表示东方鲎的因子C(TtFC)和圆尾鲎的因子C(834CrID4)的比对的图(图8的续图)。下划线表示能够发生N型糖链修饰的共有序列。
图10是表示在还原条件下及非还原条件下的因子C与特异性抗体的反应部位的示意图。
图11是表示日本产鲎东方鲎来源的4种纯化因子C的分子量的照片(SDS-PAGE)。
图12是表示日本产鲎东方鲎来源的4种纯化因子C的分子量的照片(蛋白质印迹)。
图13是表示日本产鲎东方鲎来源的4种纯化因子C的基于糖肽酶F的N型糖链的除去结果的照片(蛋白质印迹)。
图14中，(a)是表示日本产鲎东方鲎来源的4种纯化因子C的基于凝集素印迹的N型糖链的检测结果的照片；(b)是表示凝集素的结合特异性的图；(c)是表示由实验结果和文献报告预测的重组因子C的N型糖链的结构的示意图。
具体实施方式
本发明中，有时将通过内毒素活化因子C而生成活化型因子C、通过活化型因子C活化因子B而生成活化型因子B、通过活化型因子B活化凝固酶原而生成凝固酶的一系列的反应称为“级联反应”。
(1)本发明的因子C
本发明的因子C为鲎来源的因子C。本发明的因子C为重组蛋白。“重组蛋白”是指通过将编码蛋白质的基因导入宿主细胞进行异源表达而得到的蛋白质。本发明的因子C具有因子C的活性。
作为鲎，可以举出作为日本产鲎的东方鲎(Tachypleus tridentatus)、作为美国产鲎的美洲鲎(Limulus polyphemus)、作为东南亚产(新加坡产)鲎的圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)、作为东南亚产鲎的南方鲎(Tachypleus gigas)。这些之中，优选作为日本产鲎的东方鲎、或作为东南亚产(新加坡产)鲎的圆尾鲎来源的鲎。此外，这些之中，更优选作为日本产鲎的东方鲎来源的鲎。将东方鲎的因子C的氨基酸序列示于序列号2。此外，将编码东方鲎的因子C的基因的碱基序列示于序列号1。将圆尾鲎的因子C的氨基酸序列示于序列号4。此外，将编码圆尾鲎的因子C的基因的碱基序列示于序列号3。
本发明的因子C可以进行N型糖链修饰。N型糖链是指与蛋白质的天冬酰胺残基结合的糖链。在东方鲎的因子C和圆尾鲎的因子C中保存有能够发生N型糖链修饰的氨基酸残基。将两因子C的比对和能够发生N型糖链修饰的共有序列(Asn-Xaa-Ser/Thr(Xaa表示任意的氨基酸残基))示于图8、9。由此，认为尤其是圆尾鲎的因子C与东方鲎的因子C同样地为合适的因子C。
本发明的因子C可以具有唾液酸。作为唾液酸，例如可以举出N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。“具有唾液酸”是指，在本发明的因子C上结合有唾液酸。唾液酸可以与因子C直接结合，也可以间接结合。例如，通过将包含唾液酸的糖链与因子C结合，从而唾液酸也可以间接地与因子C结合。唾液酸例如可以为(α-2,3)键的唾液酸，更具体而言，可以为(α-2,3)键的末端唾液酸。“(α-2,3)键的唾液酸”是指，通过(α-2,3)糖苷键与糖结合的唾液酸。“(α-2,3)键的末端唾液酸”是指，通过(α-2,3)糖苷键与糖结合且位于糖链的末端的唾液酸。作为糖链，例如可以举出N型糖链。对于唾液酸来说，例如通过在宿主细胞(该宿主细胞可以通过翻译后修饰将包含唾液酸的糖链附加至蛋白质)中表达因子C，从而可以附加至因子C中。作为这样的宿主细胞，可以举出哺乳类细胞。唾液酸例如可以通过糖链解析而检测出。糖链解析可以通过公知的方法进行。例如，可以利用凝集素或糖链抗体进行糖链解析。具体而言，例如，可以利用怀槐凝集素(MAM)进行凝集素印迹，从而特异性地检测出(α-2,3)键的末端唾液酸。
本发明的因子C与对照的因子C相比具有较多的唾液酸。“与对照的因子C相比具有较多的唾液酸”是指，在换算成每一分子因子C的唾液酸的分子数时，与本发明的因子C结合的唾液酸的量大于与对照的因子C结合的唾液酸的量。例如，在换算成每一分子因子C的唾液酸的分子数时，与本发明的因子C结合的唾液酸的量可以为与对照的因子C结合的唾液酸的量的1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.5倍以上、2.0倍以上、2.5倍以上、或3.0倍以上。
作为对照的因子C，可以举出在昆虫细胞Sf9中表达的重组因子C或天然的因子C。“将Sf9作为宿主细胞所表达的因子C”是指，通过将Sf9作为宿主细胞来表达编码包含与本发明的因子C相同的氨基酸序列的因子C的基因而得到的因子C。“天然的因子C”是指，由鲎的溶解物分离纯化的因子C。天然的因子C也可以是由本发明的因子C来源的鲎的溶解物所分离纯化的因子C。即，具体而言，例如，在本发明的因子C为东方鲎的重组因子C或其变体的情况下，天然的因子C可以为由东方鲎的溶解物所分离纯化的因子C。
“与对照的因子C相比是否具有较多的唾液酸”，可以通过用本发明的因子C和对照的因子C比较唾液酸的量来确认。唾液酸的量例如可以通过糖链解析来确定。糖链解析可以通过公知的方法进行。例如，可以利用凝集素或糖链抗体进行糖链解析。具体而言，例如通过利用怀槐凝集素(MAM)进行凝集素印迹，从而可以特异性地定量(α-2,3)键的末端唾液酸。在用MAM进行凝集素印迹时显示出越高的反应性，则可以确定(α-2,3)键的末端唾液酸的量越大，即，具有越多的(α-2,3)键的末端唾液酸。即，本发明的因子C与对照的因子C相比，在用MAM进行凝集素印迹时可以显示出高的反应性。“与对照的因子C相比，在用MAM进行凝集素印迹时可以显示出高的反应性”是指，在对等量的本发明的因子C与对照的因子C分别用MAM进行凝集素印迹时，本发明的因子C的斑点的检测强度(显色的程度等)高于对照的因子C的斑点的检测强度。
本发明的因子C可以未在C末端附加有His标签。此外，本发明的因子C可以未在C末端附加有V5标签。此外，本发明的因子C可以未在C末端附加任何肽。此外，本发明的因子C可以未在N末端附加任何肽。此外，本发明的因子C可以未在两末端附加任何肽。
本发明的因子C只要具有因子C的活性，则也可以为上述各种鲎的因子C、例如具有序列号2或4所示的氨基酸序列的蛋白质的变体。变体例如包括上述因子C的同系物或人工变异体。需要说明的是，变体的氨基酸序列不需要实际上在鲎中被发现。即，“鲎的/鲎来源的”因子C还包括在鲎中被发现的因子C的变体，且该变体具有在鲎中未被发现的氨基酸序列。
因子C的活性是指，在内毒素的存在下成为活化型、使因子B变化为活化型的活性。“具有因子C的活性”例如可以如下确认：在将本发明的因子C与适当的因子B及适当的凝固酶原组合时，在内毒素的存在下检测级联反应的进行，从而可以确认。具体而言，例如，可以使用序列号6的蛋白质作为适当的因子B，使用序列号8的蛋白质作为适当的凝固酶原。级联反应的进行可以利用后述的检测用底物进行测定。
本发明的因子C只要具有因子C的活性，则也可以是具有在上述因子C的氨基酸序列、例如序列号2或4所示的氨基酸序列中含有在一个或几个位置的、一个或几个氨基酸的置换、缺失、插入或添加等的序列的蛋白质。所述“一个或几个”是指，虽然根据氨基酸残基在蛋白质的空间结构中的位置或氨基酸残基的种类而不同，但具体而言优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～5个、特别优选为1～3个。上述一个或几个氨基酸的置换、缺失、插入或添加是可正常维持蛋白质的功能的保守突变。保守突变的代表性例子为保守置换。保守置换是指，例如，在置换部位为芳香族氨基酸的情况下，在Phe、Trp、Tyr间相互置换的突变；在置换部位为疏水性氨基酸的情况下，在Leu、Ile、Val间相互置换的突变；在为极性氨基酸的情况下，在Gln、Asn间相互置换的突变；在为碱性氨基酸的情况下，在Lys、Arg、His间相互置换的突变；在为酸性氨基酸的情况下，在Asp、Glu间相互置换的突变；在为具有羟基的氨基酸的情况下，在Ser、Thr间相互置换的突变。作为被视作保守置换的置换，具体而言，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，上述的氨基酸的置换、缺失、插入或添加等还包括起因于基因所来源的鲎的个体差异、株、种的差异时等的天然产生的突变。
此外，本发明的因子C也可以是相对于上述因子C的氨基酸序列整体、例如序列号2或4所示的氨基酸序列整体具有80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、更优选为97％以上、特别优选为99％以上的同源性或同一性、且具有因子C的活性的蛋白质。
编码本发明的因子C的基因只要可编码上述本发明的因子C即可，没有特别限制。编码本发明的因子C的基因可以是可由公知的基因序列制备的探针，例如为下述DNA：其在严谨条件下与序列号1或3所示的碱基序列的全部或一部分的互补序列杂交，并编码具有因子C的活性的蛋白质。此处，“严谨条件”是指下述条件：形成所谓的特异性的杂交物，但不形成非特异性的杂交物。若示出一例，则可以举出下述条件：同源性高的DNA彼此杂交，例如具有80％以上、优选具有90％以上、更优选具有95％以上、更优选具有97％以上、特别优选具有99％以上的同源性的DNA彼此杂交，而同源性低于上述值的DNA彼此不杂交；或者在与通常的Southern杂交的清洗条件即60℃、1×SSC、0.1％SDS、优选60℃、0.1×SSC、0.1％SDS、进一步优选68℃、0.1×SSC、0.1％SDS相当的盐浓度、温度下进行1次、更优选2～3次清洗。
此外，对于编码本发明的因子C的基因来说，可以将任意的密码子置换为与其等价的密码子。例如，编码本发明的因子C的基因可以按照对哺乳类细胞中的表达最优化的方式来变更密码子的组合。例如可以利用一般的委托服务来进行最优化。需要说明的是，编码本发明的因子C的基因也可以是密码子的组合对哺乳类细胞中的表达进行了最优化的DNA的变体。
需要说明的是，上述关于基因及蛋白质的变体的记载可以适用于因子B和凝固酶原、以及编码它们的基因。
本发明的因子C在非还原SDS-PAGE中测定的分子量可以为115kDa～140kDa、115kDa～130kDa、120kDa～130kDa、或120kDa～128kDa。此外，本发明的因子C在非还原SDS-PAGE中测定的分子量可以为127kDa±5kDa、128kDa±2kDa、127kDa±2kDa、126kDa±2kDa、或127kDa±1kDa。此外，本发明的因子C在非还原SDS-PAGE中测定的分子量可以为128kDa或126kDa。
此外，本发明的因子C可以具有难以受到离子导致的活性抑制的性质。“具有难以受到离子导致的活性抑制的性质”是指，本发明的因子C与对照的因子C相比，在离子的存在下显示出较高的残留活性。作为对照的因子C，可以举出在昆虫细胞Sf9中表达的重组因子C及天然的因子C。关于“显示出较高的残留活性”，只要本发明的因子C的残留活性高于对照的因子C的残留活性就没有特别限制，例如，可以指本发明的因子C的残留活性为对照的因子C的残留活性的1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.5倍以上、2.0倍以上、2.5倍以上、或3.0倍以上。作为“难以受到离子导致的活性抑制的性质”，具体而言，例如可以举出：与对照的因子C相比，在21mM的柠檬酸钠的存在下显示出较高的残留活性的性质；在52mM的碳酸氢钠的存在下显示出较高的残留活性的性质；在214mM的氯化钠的存在下显示出较高的残留活性的性质；在16mM的硫酸镁的存在下显示出较高的残留活性的性质；在2.5mM的氯化钙的存在下显示出较高的残留活性的性质。此外，作为“难以受到离子导致的活性抑制的性质”，具体而言，例如还可以举出：在21mM的柠檬酸钠的存在下显示出10％以上或20％以上的残留活性的性质；在52mM的碳酸氢钠的存在下显示出25％以上或35％以上的残留活性的性质；在214mM的氯化钠的存在下显示出25％以上或35％以上的残留活性的性质；在16mM的硫酸镁的存在下显示出15％以上或25％以上的残留活性的性质；在2.5mM的氯化钙的存在下显示出35％以上或45％以上的残留活性的性质。本发明的因子C可以具有这些性质中的一种，也可以具有这些性质中的两种或两种以上。需要说明的是，“残留活性”如下表示：在图4所示的测试体系中，将在注射用水中添加了内毒素的物质(内毒素浓度0.05EU/mL)作为测定试样并将此时的反应性设为100％的情况下，用将在包含离子的待测试样中添加了内毒素的物质(内毒素浓度0.05EU/mL)作为测定试样时的反应性的相对值(％)来表示该“残留活性”。
此外，本发明的因子C可以为水溶性。此处所说的“水溶性”是指，将本发明的因子C在适当的宿主细胞中表达时，在可溶性组分中检测出所表达的因子C。“在可溶性组分中检测出”可以为，在可溶性组分中检测出所表达的因子C的20％以上、50％以上、80％以上、90％以上、或95％以上。
(2)本发明的因子C的制造方法
本发明的因子C例如可以通过将哺乳类细胞用作宿主细胞进行表达而制造。即，本发明提供一种制造鲎的因子C的方法，其包括将哺乳类细胞用作宿主细胞而表达鲎的因子C。将该方法也称为“本发明的制造方法”。可通过本发明的制造方法制造的因子C为本发明的因子C的一个方式。
哺乳类细胞只要能够功能性地(functionally)表达鲎的因子C就没有特别限制。“功能性地表达”是指，所表达的因子C显示出因子C的活性。具体而言，哺乳类细胞可以为COS-1细胞以外的哺乳类细胞。哺乳类细胞优选为选自由啮齿类和灵长类组成的组中的哺乳动物的细胞。作为啮齿类，没有特别限制，可以举出中国仓鼠、仓鼠、小鼠、大鼠、豚鼠。这些之中，优选中国仓鼠。作为中国仓鼠的细胞，例如可以举出中国仓鼠卵巣来源的细胞株(CHO)。作为CHO，可以举出CHO DG44、CHO K1。作为灵长类，没有特别限制，可以举出人、猴、黑猩猩。灵长类可以为猴以外的灵长类。这些之中，优选人。作为人的细胞，可以举出人胚肾细胞来源的细胞株(HEK)。作为HEK，可以举出HEK293。
哺乳类细胞通过保持编码因子C的基因，从而可以表达因子C。哺乳类细胞中，编码因子C的基因只要能够在于该细胞中发挥功能的启动子的控制下进行表达即可。在哺乳类细胞中，编码因子C的基因例如可以存在于如质粒那样在染色体外自主复制的载体上，也可以导入染色体上。对将编码因子C的基因导入哺乳类细胞的方法没有特别限制。作为在染色体外自主复制的载体，例如可以举出pCA7(Makoto Takeda,et al.,J.Viol.79(22)：14346-54(2005))。此外，例如可以使用pCI-neo载体(Promega公司)将编码因子C的基因导入哺乳类细胞的染色体上。哺乳类细胞可以仅具有1个拷贝的编码因子C的基因，也可以具有2个拷贝或其以上。
培养哺乳类细胞时的培养条件只要是哺乳类细胞能够增殖就没有特别限制，可以根据需要对通常用于哺乳类细胞培养的条件进行适当修正而使用。作为培养基，例如可以使用通常用于哺乳类细胞的培养的培养基。具体而言，例如可以使用RPMI1640培养基(Sigma公司)、DMEM培养基(Sigma公司)。培养例如可以在36℃～38℃、5％CO2供给下通过静置培养来进行。
功能性的因子C得到表达可以通过测定因子C的活性来确认。此外，因子C得到表达也可以通过测定由编码因子C的基因转录的mRNA的量、或使用抗体通过蛋白质印迹检测因子C来确认。
对于所表达的因子C，以含有因子C的溶液的形式进行回收，可以用作本发明的内毒素测定剂的成分。含有因子C的溶液例如可以为培养液、培养上清、细胞破碎提取物、或它们的混合物等。因子C可以纯化为所期望的程度后使用，也可以不纯化而使用。本发明中，即使不纯化因子C而直接使用含有所表达的因子C的细胞培养上清液，也可以得到充分的内毒素测定能力。因子C的纯化可以通过例如用于蛋白质的纯化的公知方法来进行。作为这种方法，可以举出硫酸铵沉淀、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱等。此外，在对因子C附加His标签等标签的情况下，也可以通过利用了对于该标签的亲和性的亲和色谱对因子C进行纯化。此外，含有因子C的溶液例如也可以进行过滤器过滤后使用。作为过滤器，例如可以使用0.22μm的过滤器。
(3)本发明的内毒素测定剂
本发明的因子C可以用于内毒素的测定。即，本发明提供包含本发明的因子C的内毒素测定剂。将该内毒素测定剂也称为“本发明的内毒素测定剂”。本发明的内毒素测定剂也可以根据内毒素的测定方式进一步包含因子C以外的因子。
例如，本发明的因子C可以与因子B和凝固酶原组合而用于内毒素的测定。即，本发明的内毒素测定剂的一个方式为包含本发明的因子C、因子B及凝固酶原的内毒素测定剂。该情况下，通过检测作为级联反应的最终产物的凝固酶，可以测定内毒素。将本发明的内毒素测定剂的一个方式中包含的因子B和凝固酶原也分别称为本发明的因子B和本发明的凝固酶原。
另一方面，通过检测级联反应的中间阶段，也可以测定内毒素。该情况下，本发明的内毒素测定剂只要包含在该中间阶段之前参与的因子即可。具体而言，例如，在通过检测作为级联反应的中间产物的活化型因子C来测定内毒素的情况下，本发明的内毒素测定剂只要包含因子C即可。
本发明的因子B是鲎来源的因子B。此外，本发明的凝固酶原是鲎来源的凝固酶原。作为鲎，可以举出作为日本产鲎的东方鲎(Tachypleus tridentatus)、作为美国产鲎的美洲鲎(Limulus polyphemus)、作为东南亚产(新加坡产)鲎的圆尾鲎(Carcinoscorpiusrotundicauda)、作为东南亚产鲎的南方鲎(Tachypleus gigas)。这些之中，优选作为日本产鲎的东方鲎来源的鲎。
将东方鲎的因子B、凝固酶原的氨基酸序列分别示于序列号6、8。此外，将编码东方鲎的因子B、凝固酶原的基因的碱基序列分别示于序列号5、7。
本发明的因子B只要具有因子B的活性，则也可以为上述各种鲎的因子B、例如具有序列号6所示的氨基酸序列的蛋白质的变体。变体例如包括上述因子B的同系物或人工变异体。此外，编码本发明的因子B的基因只要编码上述本发明的因子B就没有特别限制。关于因子B及编码其的基因的变体，可以适用与上述的因子C及编码其的基因的变体有关的记载。
因子B的活性是指，在活化型因子C的存在下成为活化型、使凝固酶原变化为作为活化型的凝固酶的活性。“具有因子B的活性”例如可以如下确认：在将本发明的因子B与适当的因子C及适当的凝固酶原组合时，在内毒素的存在下检测级联反应的进行，从而可以确认。具体而言，可以使用序列号2的蛋白质作为适当的因子C，使用序列号8的蛋白质作为适当的凝固酶原。级联反应的进行可以利用后述的检测用底物进行测定。
本发明的凝固酶原只要具有凝固酶原的活性，则也可以为上述各种鲎的凝固酶原、例如具有序列号8所示的氨基酸序列的蛋白质的变体。变体例如包括上述凝固酶原的同系物或人工变异体。此外，编码本发明的凝固酶原的基因只要编码上述本发明的凝固酶原就没有特别限制。关于凝固酶原或编码其的基因的变体，可以适用与上述的因子C及编码其的基因的变体有关的记载。
凝固酶原的活性是指，在活化型因子B的存在下成为作为活化型的凝固酶、并与后述的检测用底物发生反应的活性。与检测用底物发生反应的活性是指，例如，与凝固蛋白原发生反应而引起凝固的活性；与后述的通式X-Y-Z(式中，X为保护基，Y为肽，Z为与Y形成酰胺键的色素)表示的底物发生反应而使色素Z游离的活性(例如，与Boc-Leu-Gly-Arg-pNA发生反应而使pNA游离的活性)。“具有凝固酶原的活性”例如可以如下确认：在将本发明的凝固酶原与适当的因子C及适当的因子B组合时，在内毒素的存在下检测级联反应的进行，从而可以确认。具体而言，可以使用序列号2的蛋白质作为适当的因子C，使用序列号6的蛋白质作为适当的因子B。级联反应的进行可以利用后述的检测用底物进行测定。
本发明的因子B和/或本发明的凝固酶原只要分别具有因子B的活性、凝固酶原的活性，则可以附加有任意的肽等。作为这样的肽，可以举出His标签、V5标签等标签序列。此外，本发明的因子B和/或本发明的凝固酶原也可以与本发明的因子C同样地未在C末端附加有His标签、未在C末端附加有V5标签、未在C末端附加任何肽、未在N末端附加任何肽、或未在两末端附加任何肽。
此外，对于编码本发明的因子B的基因和/或编码本发明的凝固酶原的基因来说，可以将任意的密码子置换为与其等价的密码子。例如，编码本发明的因子B的基因和/或编码本发明的凝固酶原的基因可以按照对宿主细胞中的表达最优化的方式来变更密码子的组合。作为编码序列号6的因子B、且密码子的组合对昆虫细胞中的表达进行了最优化的DNA，可以举出序列号9的DNA。需要说明的是，编码本发明的因子B的基因和/或编码本发明的凝固酶原的基因也可以是密码子的组合对宿主细胞中的表达进行了最优化的DNA的变体。
本发明的因子B和本发明的凝固酶原分别可以是天然得到的物质，也可以是重组蛋白。
天然的因子B和天然的凝固酶原分别可以从上述各种鲎的血细胞提取液中取得。这些因子可以纯化为所期望的程度后使用。纯化例如可以通过公知的方法(Nakamura T.etal.,J Biochem.1986Mar；99(3)：847-57.)进行。
此外，重组因子B及重组凝固酶原分别可以通过在宿主细胞中表达而取得。宿主细胞只要能够表达各因子就没有特别限制。作为宿主细胞，例如可以利用通常用于异种蛋白的表达的宿主细胞。作为宿主细胞，例如可以举出昆虫细胞、动物细胞、植物细胞、酵母细胞、细菌细胞。这些之中，从翻译后修饰的方面出发，优选真核细胞，具体而言，更优选昆虫细胞或动物细胞。
作为动物细胞，例如可以举出哺乳类细胞。在使用哺乳类细胞等动物细胞的情况下，也可以将上述关于本发明的因子C的制造的记载适用于因子B和凝固酶原的制造。
作为昆虫细胞，例如可以举出Sf9、Sf21、SF+、High-Five。作为昆虫细胞，优选Sf9。
将昆虫细胞用作宿主细胞而表达各因子的方法只要能够表达各因子就没有特别限制，可以适当使用通常用于异种蛋白的表达的方法。例如，通过使插入有编码各因子的基因的病毒感染昆虫细胞，可以表达各因子(也称为“病毒法”)。此外，通过将插入有编码各因子的基因的载体导入昆虫细胞，并在宿主细胞的染色体上插入该基因，从而可以表达各因子(也称为“稳定表达细胞株法”)。
<病毒法>
用于病毒法的病毒只要能够感染昆虫细胞并表达各因子就没有特别限制，可以适当使用通常用于昆虫细胞中的蛋白表达的病毒。作为这样的病毒，可以举出杆状病毒(Baculovirus)。作为杆状病毒，优选核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus；NPV)。作为NPV，可以举出AcNPV(Autographa californica NPV，苜蓿银纹夜蛾NPV)、BmNPV(Bombyxmori NPV，家蚕NPV)。作为NPV，优选AcNPV。
病毒中的核酸导入可以通过常规方法进行，例如，可以通过使用转移载体的同源重组来进行。作为转移载体，可以举出pPSC8(Protein Sciences公司)、pFastBac(Lifetechnologies corporation)、pVL1393(Pharmingen公司)。作为转移载体，优选pPSC8。
通过用常规方法使插入有编码各因子的基因的病毒感染昆虫细胞，可得到携带该病毒并表达各因子的昆虫细胞。
<稳定表达细胞株法>
通过将编码各因子的基因插入昆虫细胞的染色体上，从而可得到稳定表达各因子的稳定表达细胞株。对稳定表达细胞株的构建方法没有特别限制，可以通过常规方法进行。例如，可以使用pIZ-V5(Life Technologies Corporation)，根据手册构建稳定表达细胞株。
培养昆虫细胞时的培养条件只要昆虫细胞能够增殖就没有特别限制，可以根据需要对通常用于昆虫细胞的培养的条件进行适当修正而使用。例如，作为培养基，可以使用通常用于昆虫细胞的培养的培养基。作为这样的培养基，例如可以举出市售的昆虫细胞用的无血清培养基。具体而言，可以适当使用Sf900III无血清培养基(Life TechnologiesCorporation)等。培养例如可以在27℃～28℃通过振荡培养来进行。
各因子是否得到表达可以通过测定各因子的活性来确认。此外，各因子是否得到表达也可以通过测定由编码各因子的基因转录的mRNA的量、或使用抗体通过蛋白质印迹检测各因子来确认。
对于所表达的各因子，以含有该各因子的溶液的形式进行回收，可以用作本发明的内毒素测定剂的成分。含有各因子的溶液例如可以为培养液、培养上清、细胞破碎提取物、或它们的混合物等。各因子可以纯化为所期望的程度后使用，也可以不纯化而使用。本发明中，即使不纯化各因子而直接使用含有所表达的各因子的细胞培养上清液，也可以得到充分的内毒素测定能力。在纯化各因子的情况下，各因子的纯化可以通过例如用于蛋白质的纯化的公知方法来进行。作为这种方法，可以举出硫酸铵沉淀、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱等。此外，在对各因子附加His标签等标签的情况下，也可以通过利用了对于该标签的亲和性的亲和色谱对各因子进行纯化。此外，含有各因子的溶液例如也可以进行过滤器过滤后使用。作为过滤器，例如可以使用0.22μm的过滤器。
需要说明的是，在利用病毒法制造各因子的情况下，优选进行病毒的除去。对除去病毒的方法没有特别限制，可以通过常规方法进行。例如，可以利用孔径为500kDa的中空纤维过滤膜来除去病毒。
本发明中，本发明的因子C、本发明的因子B及本发明的凝固酶原可以针对每种因子构建表达细胞而分别表达。
本发明的内毒素测定剂例如可以仅含有本发明的因子C，也可以仅含有本发明的因子C、本发明的因子B及本发明的凝固酶原。
本发明的内毒素测定剂可以含有用于检测级联反应的进行的底物。本发明中，有时将这种底物称为检测用底物。
作为检测用底物，可以举出凝固蛋白原。凝固蛋白原是作为级联反应的最终产物的凝固酶的检测底物。通过凝固蛋白原与凝固酶发生接触，作为凝固素而凝固。凝固反应的进行可以通过测定反应液的浊度而测定。凝固蛋白原可以由鲎血细胞提取液(溶解物)进行回收。此外，编码凝固蛋白原的基因的碱基序列已明确(宫田等人、蛋白质核酸酶(蛋白質核酸酵素)增刊No.29；P30-43；1986)，可以根据常规方法以基因工程学的方式进行生产。
此外，作为检测用底物，可以使用合成底物。合成底物只要具有适合于级联反应的检测的性质就没有特别限制。作为“适合于级联反应的检测的性质”，可以举出用于检测凝固酶的存在的性质、用于检测级联反应的中间阶段的性质。作为“用于检测凝固酶的存在的性质”，可以举出通过凝固酶的催化反应而显色的性质、通过凝固酶的催化反应而发出荧光的性质。作为“用于检测级联反应的中间阶段的性质”，可以举出通过活化型因子C等级联反应的中间产物的催化反应而显色的性质、通过活化型因子C等级联反应的中间产物的催化反应而发出荧光的性质。作为合成底物，例如可以举出通式X-Y-Z(式中，X为保护基，Y为肽，Z为与Y形成了酰胺键的色素)所表示的底物。反应体系中存在内毒素的情况下，通过作为级联反应的结果所产生的凝固酶或中间产物的催化反应，Y-Z间的酰胺键被切断，色素Z游离而显色，或者发出荧光。作为保护基X，没有特别限制，可以适当地使用肽的公知的保护基。作为这种保护基，可以举出叔丁氧羰基、苯甲酰基。对色素Z没有特别限制，例如，可以为在可见光下被检测出的色素，也可以为荧光色素。作为色素Z，可以举出pNA(对硝基苯胺)、MCA(7-甲氧香豆素-4-乙酸)、DNP(2,4-二硝基苯胺)、Dansyl(丹磺酰)系色素。作为肽Y，可以举出Leu-Gly-Arg(LGR)、Ile-Glu-Gly-Arg(IEGR)(序列号10)、Val-Pro-Arg(VPR)、Asp-Pro-Arg(DPR)。作为合成底物，可以根据内毒素的测定方式适当选择利用与凝固酶或中间产物发生反应的物质。例如，从底物特异性的方面出发，包含LGR作为肽Y的底物可以适合用于凝固酶的检测，包含VPR或DPR作为肽Y的底物适合用于活化型因子C的检测。游离的色素Z通过与色素的性质相符的方法进行测定即可。
此外，本发明的内毒素测定剂只要能够用于内毒素的测定，则也可以含有各因子及检测用底物以外的成分。这种成分只要考虑保存性、操作容易性、各因子及检测用底物的稳定性等来选择即可，没有特别限定。
此外，本发明的内毒素测定剂可以以固体状、液体状、凝胶状等任意的形态进行制剂化。在制剂化时，可以使用通常用作制剂载体的赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味矫臭剂、稀释剂、或溶剂等添加剂等。本发明的内毒素测定剂可以直接用于内毒素的测定，或者利用水、生理盐水或缓冲液等稀释、分散或溶解后用于内毒素的测定。在如此稀释、分散或溶解等的情况下，当然也包含于本发明的内毒素测定剂的范围内。
本发明的内毒素测定剂中，各因子及其它成分可以混合存在，也可以分别个别地存在。例如，各因子可以以任意的比例混合而制剂化，也可以分别个别地制剂化。
对本发明的内毒素测定剂中的各因子及其它成分的浓度没有特别限制，在测定内毒素时，优选调整为在后述优选的浓度范围内。本发明的内毒素测定剂(与待测试样接触前制成溶液的物质)中的各因子的浓度例如可以为5～200μg/mL、优选为20～100μg/mL、更优选为40～80μg/mL、特别优选为约60μg/mL。此外，可以根据各因子的制造方法来设定本发明的内毒素测定剂中的各因子的浓度。例如，本发明的内毒素测定剂(与待测试样接触前制成溶液的物质)中的、将啮齿类的细胞用作宿主细胞所制造的因子C的浓度例如可以为5～200μg/mL、10～50μg/mL、或15～40μg/mL。此外，例如，本发明的内毒素测定剂(与待测试样接触前制成溶液的物质)中的、将灵长类的细胞用作宿主细胞所制造的因子C的浓度例如可以为5～200μg/mL、50～150μg/mL、或80～120μg/mL。需要说明的是，上述例示的浓度例如可以如下算出：对利用上述例示的方法表达各因子所得到的培养上清进行过滤器过滤，假定所得到的滤液中的蛋白质全部为目标因子，从而算出。
本发明的内毒素测定剂可以作为内毒素测定用试剂盒来提供。内毒素测定用试剂盒只要包含本发明的内毒素测定剂就没有特别限制。内毒素测定用试剂盒例如可以包含选自内毒素样品、反应用容器(例如，管或微孔板)、手册等中的1种或1种以上的构成要素。
(4)本发明的内毒素测定法
通过将本发明的内毒素测定剂与待测试样混合，在待测试样中包含内毒素的情况下，级联反应进行。通过测定级联反应的进行，可以测定待测试样中的内毒素。即，本发明提供一种测定待测试样中的内毒素的方法，其包括将本发明的内毒素测定剂与待测试样混合的工序；及测定级联反应的进行的工序。将该方法也称为“本发明的内毒素测定法”。
本发明的内毒素测定法的一个方式(下文中也称为“第1方式”)中，全部因子与待测试样混合。第1方式中，包含于本发明的内毒素测定剂中的各因子可以从将本发明的内毒素测定剂与待测试样混合的工序的最初就包含于反应体系中，也可以逐次添加至反应体系中。
例如，将本发明的内毒素测定剂与待测试样混合的工序可以包括以下的工序(A)～(C)。
(A)将本发明的因子C添加至反应体系的工序。
(B)将本发明的因子B添加至反应体系的工序。
(C)将本发明的凝固酶原添加至反应体系的工序。
工序(A)～(C)可以分别进行，也可以一部分同时进行，还可以全部同时进行。工序(A)～(C)可以按照任意的顺序进行。例如，可以在工序(A)之后进行工序(B)，在工序(B)之后进行工序(C)。
第1方式中，级联反应的进行可以通过将检测用底物添加至反应体系中并测定该底物的反应(显色或凝固等)来测定。检测用底物可以从将本发明的内毒素测定剂与待测试样混合的工序的最初就包含于反应体系中，也可以在该工序的进行中或完成后添加至反应体系中。作为本发明的内毒素测定剂，使用预先含有检测用底物的物质的情况当然也包含于第1方式中。
需要说明的是，在本发明的内毒素测定法中，只要在待测试样中包含内毒素的情况下级联反应进行，则本发明的因子B和凝固酶原自身也可以不与待测试样接触。即，本发明的内毒素测定法的另一方式(下文中也称为第2方式)为待测试样中的内毒素测定法，其包括以下的工序(A)～(D)。
(A)将本发明的因子C与待测试样混合的工序。
(B)将本发明的因子B与工序A的混合后的因子C混合的工序。
(C)将本发明的凝固酶原与工序B的混合后的因子B混合的工序。
(D)测定级联反应的进行的工序。
第2方式中，工序(A)～(D)可以分别进行，也可以一部分同时进行，还可以全部同时进行。例如，开始工序A，在该工序的进行中或完成后将因子B或凝固酶原添加至反应体系中。此外，开始工序B，在该工序的进行中或完成后将凝固酶原添加至反应体系中。此外，可以从工序A的最初使3种因子全部包含于反应体系中。此外，例如，可以回收工序A的接触后的因子C并用于工序B中，也可以回收工序B的接触后的因子B并用于工序C中。
第2方式中，级联反应的进行可以通过将检测用底物添加至反应体系中并测定该底物的反应(显色或凝固等)来测定。检测用底物可以从工序A的最初就包含于反应体系中，也可以在各工序的进行中或完成后添加至反应体系中。
此外，通过检测级联反应的中间阶段，也可以测定内毒素。具体而言，例如，通过检测作为级联反应的中间产物的活化型因子C，从而可以测定内毒素。即，本发明的内毒素测定法的其它方式(下文中也称为第3方式)例如可以为待测试样中的内毒素测定法，其包括将本发明的因子C与待测试样混合的工序；及检测活化型因子C的工序。第3方式中，活化型因子C的检测可以通过将检测用底物添加至反应体系中并测定该底物的反应(显色等)来进行。检测用底物可以从将本发明的因子C与待测试样混合的工序的最初就包含于反应体系中，也可以在该工序的进行中或完成后添加至反应体系中。
本发明的内毒素测定法只要在待测试样中包含内毒素的情况下级联反应进行，则也可以包括其它任意的工序。例如，本发明的内毒素测定法也可以包括：向反应体系中添加检测用底物的工序、或者将通过级联反应生成的凝固酶或中间产物与检测用底物混合的工序。此外，例如，本发明的内毒素测定法也可以包括基于检测用底物的反应来计算出待测试样中的内毒素量的工序。
本发明的内毒素测定法中，反应优选在水或缓冲液等水性溶剂中进行。
本发明的内毒素测定法中，只要待测试样中包含内毒素的情况下级联反应进行，则反应液中的各因子的浓度就没有特别限定，可以根据各因子的性质等适当设定。例如，各因子的浓度以终浓度计例如可以为2.5～100μg/mL、优选为10～50μg/mL、更优选为20～40μg/mL、特别优选为约30μg/mL。此外，也可以根据各因子的制造方法来设定反应液中的各因子的浓度。例如，将啮齿类的细胞用作宿主细胞所制造的因子C的浓度以终浓度计例如可以为2.5～100μg/mL、5～25μg/mL、或7.5～20μg/mL。此外，例如，将灵长类的细胞用作宿主细胞所制造的因子C的浓度以终浓度计例如可以为2.5～100μg/mL、25～75μg/mL、或40～60μg/mL。需要说明的是，上述例示的浓度例如可以如下算出：对利用上述例示的方法表达各因子所得到的培养上清进行过滤器过滤，假定所得到的滤液中的蛋白质全部为目标因子，从而算出。
本发明的内毒素测定法中，只要待测试样中包含内毒素的情况下级联反应进行，则反应液中的检测用底物的浓度就没有特别限定，可以根据检测用底物的性质等适当设定。例如，在检测用底物为合成底物的情况下，检测用底物的浓度以终浓度计例如通常为0.001mM～100mM、优选为0.01mM～10mM。
在任一种方式中，只要待测试样中包含内毒素的情况下级联反应进行，则反应体系中除了各因子、检测用底物及待测试样以外也可以包含任意的成分。
只要待测试样中包含内毒素的情况下级联反应进行，则反应液的pH就没有特别限定，可以根据各因子的性质适当设定。反应液的pH例如通常为pH5～10、优选为7～8.5。
只要待测试样中包含内毒素的情况下级联反应进行，则反应温度就没有特别限定，可以根据各因子的性质适当设定。反应温度例如通常为10℃～80℃、优选为20℃～50℃。例如，反应温度可以为37℃。
对反应时间没有特别限定，可以根据各因子的性质或反应温度等各种条件适当设定。反应时间例如通常为5分钟～2小时、优选为15分钟～90分钟。例如，反应时间可以为30分钟～40分钟。
在任一种方式中，在反应过程中，均可以向反应体系中单独或以任意的组合额外地添加待测试样、各因子、及其它成分。这些成分可以一次或多次添加，也可以连续地添加。此外，从反应开始至反应结束可以采用恒定条件，也可以在反应过程中改变条件。
通过测定检测用底物的反应(显色或凝固等)，可以测定由内毒素的存在引起的级联反应的进行，可以测定待测试样中的内毒素。检测用底物的反应(显色或凝固等)只要通过与所使用的检测用底物相符的方法进行测定即可。
在定量进行内毒素的测定时，只要使用已知浓度的内毒素标准试样取得内毒素量与检测用底物的反应程度(显色或凝固等的程度)之间的相关数据，并基于该相关数据对待测试样中存在的内毒素进行定量即可。相关数据例如为标准曲线。定量可以通过动力学方法进行，也可以通过终点法进行。
作为能够进行内毒素的测定的待测试样，没有特别限制，可以举出医疗用水、医药产品、输液、血液制剂、医疗设备、医疗器具、化妆品、饮料食品、环境试样(例如，空气、河川、土壤)、生物体成分(例如，血液、体液、组织)、天然的蛋白质、重组蛋白、核酸、糖质等。待测试样例如可以为注射剂。注射剂是指可通过注射给药至生物体内的物质。注射剂不需要在市场流通时为液体，也可以为冷冻干燥物。关于待测试样，将其自身或者其提取物或清洗液混合、分散或溶解于反应体系中，从而可以供内毒素的测定。
此外，如上所述，本发明的因子C可以具有难以受到离子所导致的活性抑制的性质。由此，在本发明的一个方式中，可以适当地进行含有离子的待测试样中的内毒素的测定。
即，待测试样可以为含有离子的待测试样。“含有离子”是指，待测试样含有在内毒素的测定时以离子的形式存在的物质。即，此处所说的“离子”可以为原本就以离子化的状态含有于待测试样中的物质，也可以为原本以盐的状态含有于待测试样中、但在内毒素的测定时发生离子化的物质。对离子的种类没有特别限制。作为离子，例如可以举出阳离子。作为阳离子，例如可以举出金属离子。作为金属离子，例如可以举出碱金属离子及碱土金属离子。作为碱金属离子及碱土金属离子，具体而言，例如可以举出钠离子、钾离子、钙离子、镁离子。待测试样中的离子的含量例如可以是来自待测试样的阳离子的浓度以将待测试样与内毒素测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到1mM以上、2mM以上、5mM以上、10mM以上、20mM以上、50mM以上、或100mM以上的量。作为盐，具体而言，例如可以举出氯化钠、硫酸镁、碳酸氢钠、柠檬酸钠、氯化钙、氯化钾、碘他拉酸钠、依地酸二钠钙、磷酸二氢钠。待测试样中的盐的含量例如可以是来自待测试样的盐的浓度以将待测试样与内毒素测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到1mM以上、2mM以上、5mM以上、10mM以上、20mM以上、50mM以上、或100mM以上的量。待测试样可以含有1种离子(或盐)，也可以含有2种或2种以上的离子(或盐)。
实施例
下面，通过实施例来具体说明本发明，但这些为本发明的例示，本发明的范围并不限定于此。
1.因子C蛋白质的制备
(1)利用昆虫细胞(Sf9)的因子C的表达
本项中，将昆虫细胞Sf9用作宿主细胞，通过以下的步骤制备因子C。
将编码日本产鲎东方鲎的因子C的DNA插入昆虫细胞用的表达载体pIZ-V5(LifeTechnologies Corporation)的EcoRV与MluI识别部位之间，制作因子C表达质粒。将该DNA的碱基序列示于序列号1，将被该DNA所编码的因子C的氨基酸序列示于序列号2(以下，在本实施例中相同)。
通过使用了Cellfectin试剂(Life Technologies Corporation)的转染，将因子C表达质粒导入Sf9培养细胞中。将Sf9在包含300-600μg/mL的Zeocin(Life TechnologiesCorporation)的Sf900III无血清培养基(Life Technologies Corporation)中、于28℃静置培养，选择在基因组上导入有表达质粒的Sf9。
利用克隆柱法分离稳定表达因子C基因的Sf9的候补，将多个Sf9细胞株克隆化。分别培养所得到的克隆，得到培养上清。通过使用了抗因子C抗体(2C12抗体；Yoshiki Miura,et al.,J.Biochem.112：476-481(1992))的蛋白质印迹法确认了培养上清中的重组因子C蛋白质的分泌。此外，通过使用了合成底物Boc-LGR-pNA的活性测定确认了培养上清的因子C活性(基于内毒素的活化能力)。需要说明的是，活性测定的步骤如后述“4.活性测定”中所示(以下，在本实施例中相同)。基于蛋白质印迹及活性测定的结果，选择因子C高表达Sf9细胞株。
对于因子C高表达Sf9细胞株，在含有1x青霉素/链霉素(Life TechnologiesCorporation)和50μg/mL Zeocin的Sf900III培养基中悬浮培养(28℃)至对数生长期后半部分(6-8x10^6细胞/mL)，通过离心分离(3,000xg、30分钟、4℃)得到培养上清。利用0.22μm的过滤器过滤培养上清，将所得到的组分(滤液)作为重组因子C(Sf9)。
(2)利用哺乳类细胞(CHO DG44)的因子C的表达
本项中，将中国仓鼠卵巣来源的细胞株CHO DG44用作宿主细胞，通过以下的步骤制备因子C。
将编码日本产鲎东方鲎的因子C的DNA插入哺乳类细胞用的表达载体pCI-neo(Promega)的EcoRI与XbaI识别部位之间，制作因子C表达质粒。此时，在因子C的起始密码子跟前附加了kozak序列(GCCACC)。
通过使用了脂质体转染试剂(Lipofectamine LTX)(Life TechnologiesCorporation)的共转染将因子C表达质粒和dhfr表达质粒导入CHO DG44培养细胞。将CHODG44在加入了1mg/mL遗传霉素(Life Technologies Corporation)的RPMI1640培养基(包含5％透析血清、1x青霉素/链霉素)(Sigma)中、在37℃、5％CO2供给下进行静置培养，选择在基因组上导入有表达质粒的CHO DG44。
共转染15天后，向培养基中添加MTX(甲氨蝶呤)(和光纯药工业)，用3个月从50nM至5,000nM阶段性地提高MTX浓度，以多克隆取得因子C高表达CHO DG44细胞株。关于所导入的因子C基因通过MTX的效果而扩增的情况，通过使用2C12抗体的蛋白质印迹法来检测培养上清中的因子C、以及利用实时PCR进行因子C的mRNA转录量的定量，由此可以确认。
利用培养基将多克隆的因子C高表达CHO DG44细胞群稀释成0.5细胞/孔，接种至96孔板。接种后10-20天左右起，将所形成的细胞菌落依次扩大培养，进行因子C高表达CHODG44细胞株的克隆化。利用实时PCR确认因子C的mRNA转录量，利用使用了2C12抗体的蛋白质印迹法确认因子C蛋白质在培养基中的分泌量，利用使用了合成底物Boc-LGR-pNA的活性测定确认培养上清的因子C活性(基于内毒素的活化能力)，选择单克隆的因子C高表达CHODG44细胞株。
对于因子C高表达CHO DG44细胞株(单克隆)，经过在包含5μM MTX的无血清完全合成培养基中的驯化，使其悬浮。使该株在37℃、5％CO2供给下生长至对数生长后期，对悬浮培养液进行离心分离(3,000xg、30分种、4℃)，得到培养上清。用0.22μm的过滤器过滤培养上清，将所得到的组分(滤液)作为重组因子C(CHO)。
(3)利用哺乳类细胞(HEK293)的因子C的表达
本项中，将人胚肾细胞来源的细胞株HEK293用作宿主细胞，通过以下的步骤制备因子C。
将编码日本产鲎东方鲎的因子C的DNA插入哺乳类细胞用的表达载体pCA7(MakotoTakeda,et al.,J.Viol.79(22)：14346-54(2005))的EcoRI与XhoI识别部位，得到因子C表达质粒。此时，在因子C的起始密码子的跟前附加了kozak序列(GCCACC)。
通过使用了聚乙烯亚胺(Sigma)的转染法(桥口等人，基于使用了人培养细胞的重组蛋白的表达-293系统细胞的标准方案-,蛋白质科学会档案,1,e017(2008),http：//www.pssj.jp/archives/Protocol/Expression/293_01/293_01_01.html)，将因子C表达质粒导入HEK293培养细胞中。对于HEK293，利用DMEM培养基(包含10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺)(Sigma)，不更换培养基而在37℃、5％CO2供给下静置培养。转染后4天后，回收培养液，通过离心分离(3,300xg、30分钟、4℃)得到培养上清。用0.22μm的过滤器过滤培养上清，将所得到的组分(滤液)作为重组因子C(HEK)。
(4)天然因子C(东方鲎血细胞来源)的制备
通过利用硫酸葡聚糖树脂的柱色谱法(Takanori Nakamura,et al.,Eur.J.Biochem.154：511-521(1986))，从日本产鲎东方鲎的血细胞提取液得到包含因子B和因子C的组分。利用填充了Sepharose CL6B凝胶(GE healthcare)的柱(
Figure GDA0002727719900000441
cmx 97cm)，将该组分5mL供凝胶过滤。凝胶过滤在与公知的方法(Jeak Ling Ding and Bow Ho,US5,712,144；Jeak L.Ding,et al.,Biochem.Biophys.Acta 1202：149-156)基本上相同的条件下进行。流速设为15mL/小时，溶剂使用包含154mM NaCl、1mM EDTA、5％DMSO的50mM Tris缓冲液(pH8.0)。
将凝胶过滤的洗脱组分(3.7mL/根、150根)供至SDS-PAGE和CBB染色、使用了2C12抗体的蛋白质印迹法、及使用了合成底物Boc-LGR-pNA的活性测定，鉴定了包含因子C蛋白质的组分。将包含该纯化因子C蛋白质的组分作为天然因子C(TAL)。
2.重组因子B和重组凝固酶原的制备
将编码日本产鲎东方鲎的因子B的DNA插入昆虫细胞用的表达载体pIZ-V5(LifeTechnologies Corporation)的EcoRV和MluI识别部位之间，制作因子B表达质粒。将该DNA的碱基序列示于序列号9，将被该DNA所编码的因子B的氨基酸序列示于序列号6。需要说明的是，序列号9所示的碱基序列是对昆虫细胞中的表达进行了最优化的碱基序列。
将编码日本产鲎东方鲎的凝固酶原的DNA插入昆虫细胞用的表达载体pIZ-V5(Life Technologies Corporation)的EcoRV和MluI识别部位之间，制作凝固酶原表达质粒。将该DNA的碱基序列示于序列号7，将被该DNA所编码的凝固酶原的氨基酸序列示于序列号8。
利用与因子C的情况同样的方法，将表达质粒分别导入Sf9细胞中，选择高表达克隆，制备培养上清。用0.22μm的过滤器过滤各培养上清，将所得到的组分(滤液)分别作为重组因子B及重组凝固酶原。得到各因子的情况可以通过使用了对各因子的特异性抗体的蛋白质印迹法和活性测定分别确认。
3.因子C蛋白质的分子量的比较(1)
对于上述制备的4种因子C蛋白质，通过SDS-PAGE及蛋白质印迹法比较了分子量。
首先，分别将图2所示的量的因子C供至使用了5-20％梯度凝胶的非还原SDS-PAGE。图中，Sf9、CHO、HEK分别指使Sf9、CHO DG44、HEK293表达的因子C，TAL是指天然因子C(以下相同)。需要说明的是，因子C在还原条件下被切断和分离为H链和L链。本实施例中，为了比较完整(intact)的因子C的分子量，在非还原条件下进行SDS-PAGE。
SDS-PAGE之后，利用半干转印系统将蛋白质转印至PVDF膜(Bio RAD)。回收PVDF膜，用5％脱脂奶封闭后，按照一次抗体(2C12抗体)、二次抗体(HRP-标记抗小鼠-山羊抗体)(Dako)的顺序进行处理。接着，利用检测试剂SuperSignal West Dura(ThermoScientific)使因子C的条带发光，用CCD照相机进行记录。
4种因子C的分子量分别不同，按照CHO、TAL、HEK、Sf9的顺序增大(图2)。
关于新加坡产鲎(圆尾鲎)，据报道：将由血细胞提取液纯化的天然因子C蛋白质、作为昆虫细胞的Sf9、S2、及作为非洲绿猴肾细胞来源的细胞株的COS-1分别用作宿主细胞所制作的重组因子C蛋白质的分子量均为132kDa(关于天然因子C蛋白质，见Jeak LingDing and Bow Ho,US5,712,144；Jeak L.Ding,et al.,Biochem.Biophys.Acta 1202：149-156(1993)；关于Sf9和S2，见Jing Wang,et al.,J.Biol.Chem.277(39)：36363-72(2002)；关于COS-1，见Roopashree S.Dwarakanath,et al.,Biotechnology letters 19(4)：357-361(1997))。
于是，在上述制备的4种因子C中，对于CHO和TAL进行了分子量的正确测定。首先，利用与天然因子C(TAL)相同的方法纯化重组因子C(CHO)。接着，在与公知的方法(JeakLing Ding and Bow Ho,US5,712,144；Jeak L.Ding,et al.,Biochem.Biophys.Acta1202：149-156)相同的条件下进行电泳(15％凝胶、LMW Marker kit(GE healthcare))，利用Ferguson作图法确定各因子C的分子量。其结果，重组因子C(CHO)的分子量为126kDa，天然因子C(TAL)的分子量为123kDa(图3)。即，可知：日本产鲎东方鲎来源的天然因子C(TAL)及重组因子C(CHO)的分子量均小于新加坡产鲎圆尾鲎来源的因子C的分子量(132kDa)。
需要说明的是，可认为上述制备的4种因子C的分子量的差异是由与宿主细胞的种类对应的翻译后修饰(糖链修饰)之差导致的。例如，已知的是：在哺乳类细胞中唾液酸与翻译后的N型糖链结合，因此在哺乳类细胞中制作的重组蛋白的大小大于在昆虫细胞中制作的重组蛋白的大小(Robert L.Harrison and Donald L.Jarvis,Methods in MolecularBiology 338：341-356(2007))，这与本实施例的结果(图2)一致。
4.活性测定
将上述制备的4种因子C分别与其它因子组合，按照以下的步骤进行活性测定。将活性测定的方案示于图4。
如图4所示，将因子C以外的共通材料(重组因子B、重组凝固酶原、合成底物Boc-LGR-pNA、Tris缓冲液)混合，制备共通混合液。在共通混合液中分别加入图6所示的量的因子C，使其为50μL，与待测物50μL(包含美国药典标准内毒素(USP-RSE)(生化学工业)的水)混合，在37℃加热30分钟。该检测体系中，因子C被内毒素活化，生成活化型因子C，因子B被活化型因子C活化，生成活化型因子B，凝固酶原被活化型因子B活化，生成凝固酶，凝固酶将合成底物Boc-LGR-pNA切断，对硝基苯胺发生游离(图5)。经时地测定由对硝基苯胺的生成引起的吸光度(A405nm)变化，作为每单位时间的吸光度变化率(mAbs/min)而计算出因子C活性。测定以n＝3进行。
需要说明的是，上述检测体系中的各因子的终浓度如下所示。重组因子B：30μg/mL、重组凝固酶原：30μg/mL、重组因子C(Sf9)：11.3μg/mL、重组因子C(CHO)：12μg/mL、重组因子C(HEK)：51.5μg/mL、因子C(TAL)：0.25μg/mL。需要说明的是，上述浓度(TAL以外)是假定使各因子表达所制备的样品(滤液)中的蛋白质全部为目标因子所计算出的。此外，因子C(TAL)浓度是纯化后的因子C(TAL)的浓度。
可以构建对上述制备的4种因子C分别显示出同等的活性的重构体系(图6)。此外，任一种重构体系均随着待测物中包含的内毒素浓度(0.05和0.1EU/mL)的增大而活性增大。
据报道，在哺乳类细胞COS-1中制作的圆尾鲎来源的重组因子C(132kDa)被回收至不溶性组分中(Roopashree S.Dwarakanath,et al.,Biotechnology letters 19(4)：357-361(1997)；Jing Wang,Bow Ho and Jeak L.Ding,Biotechnology letters 23：71-76(2001))。此外，据报道，在昆虫细胞S2中制作的圆尾鲎来源的重组因子C(132kDa)不显示依赖于内毒素的蛋白酶的活性(Jing Wang,et al.,J.Biol.Chem.277(39)：36363-72(2002))。关于后者(在S2中制作的因子C)，可以推测：由于与凝集素的反应性的差异，糖链结构与圆尾鲎来源的天然因子C或在昆虫细胞Sf9中制作的重组因子C不同，因而不具有活性。
另一方面，由本实施例的结果可知：东方鲎来源的重组因子C(Sf9、CHO、HEK)即便分子量与天然的因子C(TAL)不同，即糖链结构与天然的因子C(TAL)不同，但也显示出依赖于内毒素的活性。
5.注射剂导致的活性抑制
内毒素是强烈的免疫反应诱发物质，因此在将被内毒素污染的注射剂注入体内时，会产生严重的副作用。因此，在注射剂的制造中，进行使用了鲎变形细胞溶解物试剂的内毒素试验，各国药典赋予了确认无内毒素污染的义务。
于是，对于上述制备的4种因子C，比较了与各种注射剂中的内毒素的反应性。
作为对照试样，使用了在注射用水中添加了内毒素的物质(内毒素浓度0.05EU/mL)。作为测定试样，使用了在10w/v％氯化钠注射液(10％氯化钠注射液：大塚制药株式会社)的4倍稀释液、0.5M硫酸镁注射液(硫酸Mg修正液1mEq/mL：大塚制药株式会社)的16倍稀释液、生理盐液(OTSUKA NORMAL SALINE：大塚制药株式会社)的原液、7w/v％碳酸氢钠注射液(Meylon静脉注射7％：大塚制药株式会社)的8倍稀释液、10w/v％柠檬酸钠注射液(输液用柠檬酸钠静注液：扶桑药品工业株式会社)的8倍稀释液、0.5M氯化钙注射液(氯化Ca修正液1mEq/mL：大塚制药株式会社)的100倍稀释液、林格氏溶液(林格氏溶液“Fuso”：扶桑药品工业株式会社)的原液、及碘他拉酸钠注射液(CONRAY 400INJECTION：第一三共株式会社)的16倍稀释液中添加了内毒素的物质(内毒素浓度0.05EU/mL)。需要说明的是，在将10w/v％柠檬酸钠注射液的8倍稀释液作为测定试样时，柠檬酸钠的终浓度为约21mM。在将7w/v％碳酸氢钠注射液的8倍稀释液作为测定试样时，碳酸氢钠的终浓度为约52mM。在将10w/v％氯化钠注射液的4倍稀释液作为测定试样时，氯化钠的终浓度为约214mM。在将生理食盐液的原液作为测定试样时，氯化钠的终浓度为约77mM。在将0.5M硫酸镁注射液的16倍稀释液作为测定试样时，硫酸镁的终浓度为约16mM。在将0.5M氯化钙注射液的100倍稀释液作为测定试样时，氯化钙的终浓度为约2.5mM。按照图4所示的步骤进行因子C的活性测定，将对于对照试样中的内毒素的反应性作为100％，将对于各种注射剂中的内毒素的反应性的相对值(％)作为残留活性。测定以n＝4进行。
将结果示于图7。在将代表性的注射剂作为测定试样时，与使用注射用水的情况相比，抑制了与内毒素的反应性。此外，反应抑制的程度因注射剂的种类和表达因子C的宿主细胞的种类而不同。重组因子C(CHO)和重组因子C(HEK)与天然因子C(TAL)相比，对于所有的注射剂显示出难以受到反应抑制的倾向。特别是，重组因子C(CHO)在许多情况下显示出最高的残留活性。另一方面，重组因子C(Sf9)对于许多注射剂(样品No.6以外的7种)最容易受到反应抑制。
由这些结果可以认为，在哺乳类细胞中表达的因子C可具有难以受到离子导致的活性抑制的性质。这种性质对于注射剂的制造中的内毒素污染的检测特别有用。
6.L链特异性的因子C蛋白质抗体的制作
已知的是，因子C蛋白质在非还原状态下以单链(Full)存在，在还原状态下分解成H链和L链这两条链。据报道，抗因子C单克隆抗体(2C12抗体)识别Full和H链(YoshikiMiura,et al.,J.Biochem.112：476-481(1992))。于是，制作在L链中存在的肽抗原，根据常规方法对兔免疫，制造识别L链和Full的多克隆抗体(FCL抗体)(图10)。
7.重组因子C蛋白质的纯化
根据上述“1.因子C蛋白质的制备”的“(4)天然因子C(东方鲎)的制备”中记载的方法，从哺乳类细胞(CHO DG44、HEK293)和昆虫细胞(Sf9)的培养上清纯化3种重组因子C蛋白质。作为方法的概要，将培养上清(100～300mL)加样至利用硫酸葡聚糖树脂的柱色谱，进一步利用凝胶过滤分离包含重组因子C的洗脱组分。各重组因子C蛋白质被纯化的情况可通过SDS-PAGE和CBB染色、使用了2C12抗体的蛋白质印迹法、及活性测定进行确认。
8.因子C蛋白质的分子量的比较(2)
对于4种纯化因子C蛋白质，利用SDS-PAGE及蛋白质印迹法重新比较了分子量。
将天然鲎来源(TAL)、CHO DG44的培养上清来源(CHO)、HEK293的培养上清来源(HEK)、Sf9的培养上清来源(Sf9)的4种纯化因子C蛋白质在同一凝胶(15％凝胶)上进行SDS-PAGE，并进行CBB染色(图11)。4种纯化因子C蛋白质均在非还原状态下为单链(Full)，在还原状态下分解成H链和L链这两条链。此外，转印至PVDF膜后，利用2C12抗体和FCL抗体进行蛋白质印迹(图12)。与抗体的识别部位(图10)对应，2C12抗体特异性识别Full和H链，FCL抗体特异性识别Full和L链。由此，可以确认在图11中发现的CBB的条带是来自因子C的条带。此外，在因子C的分子量方面，关于非还原状态下的Full、还原状态下的H链及L链，均确认到CHO最大，TAL和HEK几乎相同，Sf9最小。
更详细而言，为了比较4种纯化因子C的分子量，在与公知的方法(Jeak Ling Dingand Bow Ho,US5,712,144；Jeak L.Ding,et al.,Biochem.Biophys.Acta 1202：149-156)相同的条件下进行电泳(15％凝胶、LMW标记物(GE healthcare))，CBB染色后，利用Ferguson作图法确定了分子量。
将结果示于表1。在非还原条件下，TAL为124kDa，为与文献报道的123kDa相似的结果。另一方面，CHO为更大的128kDa，HEK与TAL相同，为124kDa。另一方面，Sf9为109kDa，为小于TAL的分子量。由以上的结果可知，在昆虫细胞(Sf9)中表达的情况下，生成分子量比天然的因子C(TAL)小的重组因子C蛋白质，在哺乳类细胞(CHO、HEK)中表达的情况下，生成了分子量比天然的因子C(TAL)大或同等的重组因子C蛋白质。该倾向在还原条件下的H链和L链中也相同。
据报道：新加坡产鲎圆尾鲎来源的天然因子C和使其基因在昆虫细胞中表达而得到的重组因子C在非还原条件下的分子量均为132kDa，但可知本实施例中得到的日本产鲎东方鲎来源的4种纯化因子C的分子量均比其更小(表1)。
[表1]
表1
Figure GDA0002727719900000511
9.N型糖链修饰的确认
本实施例中表达重组因子C时使用的基因全部为东方鲎来源的序列，按照在末端未附加标签的方式设计了表达质粒。因此，认为本实施例中得到的4种因子C的翻译氨基酸序列相同。另外，确定了重组因子C(HEK、Sf9)的N末端氨基酸的部分序列，结果确认到与文献报道中的东方鲎的天然因子C的序列相同(未示出数据)。
一般来说，翻译后修饰对蛋白质的分子量会产生较大影响。另外，据报道：在昆虫细胞与哺乳类细胞之间，通过翻译后修饰附加至蛋白质的N型糖链的结构存在差异。为了确认在本实施例中观察到的纯化因子C的分子量之差是否来源于N型糖链的差异，用糖肽酶F对因子C蛋白质进行了处理。已知本酶可切断除去与蛋白质结合的N型糖链。由此，若通过本酶处理使纯化因子C达到均匀的分子量，则暗示N型糖链是因子C间的分子量之差的原因。
根据所附的说明书，在SDS和还原剂存在的变性条件下，用1mU的糖肽酶F(TaKaRa)对纯化因子C蛋白质1μg进行了处理。利用SDS-PAGE分离处理后的样品后，用蛋白质印迹法进行解析。结果示于图13。关于H链，4种均确认到通过糖肽酶处理而使分子量减少，其分子量达到均匀。另一方面，关于L链，4种均是通过糖肽酶处理而使分子量减少，但达到均匀的分子量的仅为CHO、HEK、TAL这3种。即，可知：在4种L链中，Sf9来源的因子C的L链在糖肽酶处理后的分子量比其它3种更大。由此认为，在Sf9来源的因子C的L链中，除了N型糖链修饰以外还进行了某种翻译后修饰。
由以上解析表明，翻译后的N型糖链修饰之差是因子C的分子量之差的主要原因。
10.因子C的N型糖链的解析
蛋白质的N型糖链修饰中，在哺乳类细胞中，蛋白质的天冬酰胺残基上被阶段性地附加糖，最终生成末端包含唾液酸的“复杂(COMPLEX)型”的糖链。另一方面，在昆虫细胞中，许多情况下未添加唾液酸，生成末端为甘露糖的“稀少甘露糖(PAUCIMANNOSE)型”的糖链(Robert L.Harrison and Donald L.Jarvis,Methods in Molecular Biology 338：341-356(2007))。为了确认4种纯化因子C蛋白质的N型糖链之差，利用末端唾液酸特异性凝集素(怀槐凝集素(MAM)、无梗接骨木凝集素(Sambucus sieboldiana Agglutinin)(SSA))等各种凝集素进行了凝集素印迹。
将4种纯化因子C和阳性对照的胎牛蛋白质的稀释系列(100、25、6ng)斑点杂交至硝酸纤维素膜上后，用3％BSA进行封闭。依次使生物素标记的凝集素(J-OIL MILLS,Inc.)、链霉亲和素标记的HRP(Thermo Scientific)发生反应，检测HRP底物(Thermo Scientific)的分解所产生的发光。作为对照，代替凝集素而使用2C12抗因子C抗体，确认到4种因子C被以相同量印迹。
将凝集素印迹的结果示于图14的(a)，将所使用的凝集素的结合特异性示于图14的(b)。作为岩藻糖特异性凝集素的小扁豆凝集素(Lens culinaris Agglutinin)(LCA)与双天线型、高甘露糖型、及复杂型的糖链特异性凝集素洋刀豆凝集素(Canavaliaensiformis Agglutinin)(ConA)与4种因子C和Fetuin的全部样品均结合。另一方面，在使用(α-2,3)键的末端唾液酸特异性凝集素MAM的情况下，按照CHO、HEK的顺序强烈地反应，在TAL和Fetuin中观察到相同程度的弱反应，但在Sf9中未观察到反应。在使用(α-2,6)键的末端唾液酸特异性凝集素SSA的情况下，在HEK、TAL、Fetuin中观察到了反应，但在CHO和Sf9中未观察到反应。
以上的结果暗示，对于重组因子C的N型糖链来说，在哺乳类细胞(CHO、HEK)中表达的情况下包含(α-2,3)键的末端唾液酸，与此相对，在昆虫细胞(Sf9)中表达的情况下不包含(α-2,3)键的末端唾液酸。由本实验结果和文献报道预测的重组因子C的N型糖链的结构示意图示于图14的(c)。本实验结果也支持翻译后的N型糖链修饰之差为因子C的分子量之差的主要原因。
产业上的可利用性
根据本发明，可以高效地制造鲎的重组因子C。此外，在本发明的一个方式中，可以降低反应抑制而测定含有离子的待测试样中的内毒素。
序列表说明
序列号1：日本产鲎的因子C基因的DNA序列
序列号2：日本产鲎的因子C的氨基酸序列
序列号3：东南亚产(新加坡产)鲎的因子C基因的DNA序列
序列号4：东南亚产(新加坡产)鲎的因子C的氨基酸序列
序列号5：日本产鲎的因子B基因的DNA序列
序列号6：日本产鲎的因子B的氨基酸序列
序列号7：日本产鲎的凝固酶原基因的DNA序列
序列号8：日本产鲎的凝固酶原的氨基酸序列
序列号9：在昆虫细胞中的表达中将密码子最优化的日本产鲎的因子B基因的DNA序列
序列号10：肽序列
序列表
<110> 生化学工业株式会社（SEIKAGAKU CORPORATION）
<120> 新重组因子C、其制造方法、及内毒素的测定法
<130> 2069-1503045D1
<150> JP2012-269840
<151> 2012-12-10
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3060
<212> DNA
<213> 东方鲎（Tachypleus tridentatus）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3060)
<400> 1
atg gtc tta gcg tcg ttt ttg gtg tct ggt tta gtt cta ggg ata cta 48
Met Val Leu Ala Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Gly Ile Leu
1 5 10 15
gcc caa caa atg cgt cca gtt cag tcc aga gga gta gat ctg ggc ttg 96
Ala Gln Gln Met Arg Pro Val Gln Ser Arg Gly Val Asp Leu Gly Leu
20 25 30
tgt gat gaa acg agg ttc gag tgt aag tgt gga gat cca ggc tat gtg 144
Cys Asp Glu Thr Arg Phe Glu Cys Lys Cys Gly Asp Pro Gly Tyr Val
35 40 45
ttc aac gtc cct atg aaa caa tgc acg tac ttc tat cga tgg agg cct 192
Phe Asn Val Pro Met Lys Gln Cys Thr Tyr Phe Tyr Arg Trp Arg Pro
50 55 60
tat tgt aaa cca tgt gat gac ctg gag gct aag gac att tgt cca aag 240
Tyr Cys Lys Pro Cys Asp Asp Leu Glu Ala Lys Asp Ile Cys Pro Lys
65 70 75 80
tac aaa cga tgt caa gag tgt aag gct ggt ctt gat agt tgt gtt act 288
Tyr Lys Arg Cys Gln Glu Cys Lys Ala Gly Leu Asp Ser Cys Val Thr
85 90 95
tgt cca cct aac aaa tat ggt act tgg tgt agc ggt gaa tgt caa tgt 336
Cys Pro Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Trp Cys Ser Gly Glu Cys Gln Cys
100 105 110
aag aat gga ggt atc tgt gac cag agg aca gga gct tgt acc tgt cgt 384
Lys Asn Gly Gly Ile Cys Asp Gln Arg Thr Gly Ala Cys Thr Cys Arg
115 120 125
gac aga tat gaa gga gcg cac tgt gaa att ctc aaa ggt tgt cct ctt 432
Asp Arg Tyr Glu Gly Ala His Cys Glu Ile Leu Lys Gly Cys Pro Leu
130 135 140
ctt cca tcg gat tct caa gtt cag gaa gtc aga aac cca cca gat aat 480
Leu Pro Ser Asp Ser Gln Val Gln Glu Val Arg Asn Pro Pro Asp Asn
145 150 155 160
ccc caa act att gac tac agc tgt tca cca ggg ttc aag ctt aaa ggc 528
Pro Gln Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Ser Pro Gly Phe Lys Leu Lys Gly
165 170 175
gtg gca cga att agc tgt ctc cca aat gga cag tgg agt agc ttt cca 576
Val Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn Gly Gln Trp Ser Ser Phe Pro
180 185 190
ccc aaa tgt att cga gaa tgt gcc aag gtt tca tct cca gaa cac ggg 624
Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Lys Val Ser Ser Pro Glu His Gly
195 200 205
aaa gtg aat gct cct agt ggc aat atg ata gaa ggg gct act tta cgg 672
Lys Val Asn Ala Pro Ser Gly Asn Met Ile Glu Gly Ala Thr Leu Arg
210 215 220
ttc tca tgt gat agt ccc tac tac ttg att ggt caa gaa aca tta acc 720
Phe Ser Cys Asp Ser Pro Tyr Tyr Leu Ile Gly Gln Glu Thr Leu Thr
225 230 235 240
tgc cag ggt aat ggt cag tgg agt gga caa ata cca caa tgt aag aag 768
Cys Gln Gly Asn Gly Gln Trp Ser Gly Gln Ile Pro Gln Cys Lys Lys
245 250 255
ttg gtc ttc tgt cct gac ctt gat cct gta aac cat gct gaa cac cag 816
Leu Val Phe Cys Pro Asp Leu Asp Pro Val Asn His Ala Glu His Gln
260 265 270
gtt aaa att ggt gtg gaa caa aaa tat ggt cag ttt cct caa ggc act 864
Val Lys Ile Gly Val Glu Gln Lys Tyr Gly Gln Phe Pro Gln Gly Thr
275 280 285
gaa gtg acc tat acg tgt tcg ggt aac tac ttc ttg atg ggt ttt aac 912
Glu Val Thr Tyr Thr Cys Ser Gly Asn Tyr Phe Leu Met Gly Phe Asn
290 295 300
acc tta aaa tgt aac cct gat ggg tcc tgg tca gga tca cag cca tcc 960
Thr Leu Lys Cys Asn Pro Asp Gly Ser Trp Ser Gly Ser Gln Pro Ser
305 310 315 320
tgt gtt aaa gtg gca gac aga gag gtc gac tgt gac agt aaa gct gta 1008
Cys Val Lys Val Ala Asp Arg Glu Val Asp Cys Asp Ser Lys Ala Val
325 330 335
gac ttc ttg gat gat gtt ggt gaa cct gtc agg atc cac tgt cct gct 1056
Asp Phe Leu Asp Asp Val Gly Glu Pro Val Arg Ile His Cys Pro Ala
340 345 350
ggc tgt tct ttg aca gct ggt act gtg tgg ggt aca gcc ata tac cac 1104
Gly Cys Ser Leu Thr Ala Gly Thr Val Trp Gly Thr Ala Ile Tyr His
355 360 365
gaa ctt tcc tca gtg tgt cgt gca gcc atc cat gct ggc aag ctt cca 1152
Glu Leu Ser Ser Val Cys Arg Ala Ala Ile His Ala Gly Lys Leu Pro
370 375 380
aac tct gga ggg gcg gtg cat gta gtg aac aat ggc ccc tac tcg gac 1200
Asn Ser Gly Gly Ala Val His Val Val Asn Asn Gly Pro Tyr Ser Asp
385 390 395 400
ttt ctg ggt agt gac ctg aat ggg ata aaa tcg gaa gag ttg aag tct 1248
Phe Leu Gly Ser Asp Leu Asn Gly Ile Lys Ser Glu Glu Leu Lys Ser
405 410 415
ctt gcc cgc agt ttt cga ttt gat tat gtc agt tca tcc aca gca ggt 1296
Leu Ala Arg Ser Phe Arg Phe Asp Tyr Val Ser Ser Ser Thr Ala Gly
420 425 430
aga tca gga tgt cct gat gga tgg ttt gag gta gaa gag aac tgt gtg 1344
Arg Ser Gly Cys Pro Asp Gly Trp Phe Glu Val Glu Glu Asn Cys Val
435 440 445
tac gtt aca tca aaa cag aga gcc tgg gaa aga gct caa ggt gtg tgt 1392
Tyr Val Thr Ser Lys Gln Arg Ala Trp Glu Arg Ala Gln Gly Val Cys
450 455 460
acc aat atg gct gct cgt ctt gct gtg cta gac aaa gat cta att ccg 1440
Thr Asn Met Ala Ala Arg Leu Ala Val Leu Asp Lys Asp Leu Ile Pro
465 470 475 480
agt tcc ttg act gag act cta cga ggg aaa ggg tta aca acc aca tgg 1488
Ser Ser Leu Thr Glu Thr Leu Arg Gly Lys Gly Leu Thr Thr Thr Trp
485 490 495
ata gga ttg cac aga cta gat gct gag aag ccc ttt gtt tgg gag cta 1536
Ile Gly Leu His Arg Leu Asp Ala Glu Lys Pro Phe Val Trp Glu Leu
500 505 510
atg gat cgt agt aat gtg gtt ctg aat gat aac cta aca ttc tgg gcc 1584
Met Asp Arg Ser Asn Val Val Leu Asn Asp Asn Leu Thr Phe Trp Ala
515 520 525
tct ggc gaa cct gga aat gaa act aac tgt gta tat ctg gac atc cga 1632
Ser Gly Glu Pro Gly Asn Glu Thr Asn Cys Val Tyr Leu Asp Ile Arg
530 535 540
gat cag ctg cag cct gtg tgg aaa acc aag tca tgt ttt cag ccc tca 1680
Asp Gln Leu Gln Pro Val Trp Lys Thr Lys Ser Cys Phe Gln Pro Ser
545 550 555 560
agc ttt gct tgc atg atg gat ttg tca gac aga aat aaa gcc aaa tgc 1728
Ser Phe Ala Cys Met Met Asp Leu Ser Asp Arg Asn Lys Ala Lys Cys
565 570 575
gat gac cct gga cca ctg gaa aat gga cac gcc aca ctt cat gga caa 1776
Asp Asp Pro Gly Pro Leu Glu Asn Gly His Ala Thr Leu His Gly Gln
580 585 590
agt att gat ggg ttc tat gct ggt tct tct ata agg tac agc tgt gag 1824
Ser Ile Asp Gly Phe Tyr Ala Gly Ser Ser Ile Arg Tyr Ser Cys Glu
595 600 605
gtt ctc cac tac ctc agt gga act gag acc gta act tgt aca aca aat 1872
Val Leu His Tyr Leu Ser Gly Thr Glu Thr Val Thr Cys Thr Thr Asn
610 615 620
ggc aca tgg agt gct cct aaa cct cga tgt atc aaa gtc atc acc tgc 1920
Gly Thr Trp Ser Ala Pro Lys Pro Arg Cys Ile Lys Val Ile Thr Cys
625 630 635 640
caa aac cct cct gta cca tca tat ggt tct gtg gaa atc aaa ccc cca 1968
Gln Asn Pro Pro Val Pro Ser Tyr Gly Ser Val Glu Ile Lys Pro Pro
645 650 655
agt cgg aca aac tcg atc agt cgt gtt ggg tca cct ttc ttg agg ttg 2016
Ser Arg Thr Asn Ser Ile Ser Arg Val Gly Ser Pro Phe Leu Arg Leu
660 665 670
cca cgg tta ccc ctc cca tta gcc aga gca gcc aaa cct cct cca aaa 2064
Pro Arg Leu Pro Leu Pro Leu Ala Arg Ala Ala Lys Pro Pro Pro Lys
675 680 685
cct aga tcc tca caa ccc tct act gtg gac ttg gct tct aaa gtt aaa 2112
Pro Arg Ser Ser Gln Pro Ser Thr Val Asp Leu Ala Ser Lys Val Lys
690 695 700
cta cct gaa ggt cat tac cgg gta ggg tct cga gcc att tac acg tgc 2160
Leu Pro Glu Gly His Tyr Arg Val Gly Ser Arg Ala Ile Tyr Thr Cys
705 710 715 720
gag tcg aga tac tac gaa cta ctt gga tct caa ggc aga aga tgt gac 2208
Glu Ser Arg Tyr Tyr Glu Leu Leu Gly Ser Gln Gly Arg Arg Cys Asp
725 730 735
tct aat gga aac tgg agt ggt cgg ccc gct agc tgt att cca gtt tgt 2256
Ser Asn Gly Asn Trp Ser Gly Arg Pro Ala Ser Cys Ile Pro Val Cys
740 745 750
gga cgg tca gac tct cct cgt tct cct ttc atc tgg aat ggg aat tct 2304
Gly Arg Ser Asp Ser Pro Arg Ser Pro Phe Ile Trp Asn Gly Asn Ser
755 760 765
aca gaa ata ggt cag tgg ccg tgg cag gca gga atc tct cga tgg ctt 2352
Thr Glu Ile Gly Gln Trp Pro Trp Gln Ala Gly Ile Ser Arg Trp Leu
770 775 780
gca gac cac aat atg tgg ttt ctc cag tgt gga gga tcc cta ttg aat 2400
Ala Asp His Asn Met Trp Phe Leu Gln Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn
785 790 795 800
gag aaa tgg atc gtc act gct gcc cac tgt gtc acc tac tct gct act 2448
Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Thr Tyr Ser Ala Thr
805 810 815
gct gag ata att gat ccc agt cag ttt aaa atc tat ctg ggc aag tac 2496
Ala Glu Ile Ile Asp Pro Ser Gln Phe Lys Ile Tyr Leu Gly Lys Tyr
820 825 830
tac cgt gat gac agt aga gac gat gac tac gta caa gta aga gag gct 2544
Tyr Arg Asp Asp Ser Arg Asp Asp Asp Tyr Val Gln Val Arg Glu Ala
835 840 845
ctc gag atc cac gta aat cct aac tac gac ccc ggc aat ctc aac ttt 2592
Leu Glu Ile His Val Asn Pro Asn Tyr Asp Pro Gly Asn Leu Asn Phe
850 855 860
gac ata gcc cta att caa ctg aaa act cct gtt act ttg aca aca cga 2640
Asp Ile Ala Leu Ile Gln Leu Lys Thr Pro Val Thr Leu Thr Thr Arg
865 870 875 880
gtc caa cca atc tgt ctg cct act gac atc aca aca aga gaa cac ttg 2688
Val Gln Pro Ile Cys Leu Pro Thr Asp Ile Thr Thr Arg Glu His Leu
885 890 895
aag gag gga aca tta gca gtg gtg aca ggt tgg ggt ttg aat gaa aac 2736
Lys Glu Gly Thr Leu Ala Val Val Thr Gly Trp Gly Leu Asn Glu Asn
900 905 910
aac aca tat tca gag atg att caa caa gct gtg cta cct gtt gtt gca 2784
Asn Thr Tyr Ser Glu Met Ile Gln Gln Ala Val Leu Pro Val Val Ala
915 920 925
gca agc acc tgt gaa gag ggg tac aag gaa gca gac tta cca ctg aca 2832
Ala Ser Thr Cys Glu Glu Gly Tyr Lys Glu Ala Asp Leu Pro Leu Thr
930 935 940
gta aca gag aac atg ttc tgt gca ggt tac aag aag gga cgt tat gat 2880
Val Thr Glu Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Lys Gly Arg Tyr Asp
945 950 955 960
gcc tgc agt ggg gac agt gga gga cca tta gtg ttt gct gat gat tcc 2928
Ala Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Phe Ala Asp Asp Ser
965 970 975
cgt acc gaa agg cgg tgg gtc ttg gaa ggg att gtc agc tgg ggc agt 2976
Arg Thr Glu Arg Arg Trp Val Leu Glu Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser
980 985 990
ccc agt gga tgt ggc aag gct aac cag tat ggg ggc ttc act aaa gtt 3024
Pro Ser Gly Cys Gly Lys Ala Asn Gln Tyr Gly Gly Phe Thr Lys Val
995 1000 1005
aac gtt ttt cta tca tgg att agg cag ttc att tga 3060
Asn Val Phe Leu Ser Trp Ile Arg Gln Phe Ile
1010 1015
<210> 2
<211> 1019
<212> PRT
<213> 东方鲎（Tachypleus tridentatus）
<400> 2
Met Val Leu Ala Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Gly Ile Leu
1 5 10 15
Ala Gln Gln Met Arg Pro Val Gln Ser Arg Gly Val Asp Leu Gly Leu
20 25 30
Cys Asp Glu Thr Arg Phe Glu Cys Lys Cys Gly Asp Pro Gly Tyr Val
35 40 45
Phe Asn Val Pro Met Lys Gln Cys Thr Tyr Phe Tyr Arg Trp Arg Pro
50 55 60
Tyr Cys Lys Pro Cys Asp Asp Leu Glu Ala Lys Asp Ile Cys Pro Lys
65 70 75 80
Tyr Lys Arg Cys Gln Glu Cys Lys Ala Gly Leu Asp Ser Cys Val Thr
85 90 95
Cys Pro Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Trp Cys Ser Gly Glu Cys Gln Cys
100 105 110
Lys Asn Gly Gly Ile Cys Asp Gln Arg Thr Gly Ala Cys Thr Cys Arg
115 120 125
Asp Arg Tyr Glu Gly Ala His Cys Glu Ile Leu Lys Gly Cys Pro Leu
130 135 140
Leu Pro Ser Asp Ser Gln Val Gln Glu Val Arg Asn Pro Pro Asp Asn
145 150 155 160
Pro Gln Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Ser Pro Gly Phe Lys Leu Lys Gly
165 170 175
Val Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn Gly Gln Trp Ser Ser Phe Pro
180 185 190
Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Lys Val Ser Ser Pro Glu His Gly
195 200 205
Lys Val Asn Ala Pro Ser Gly Asn Met Ile Glu Gly Ala Thr Leu Arg
210 215 220
Phe Ser Cys Asp Ser Pro Tyr Tyr Leu Ile Gly Gln Glu Thr Leu Thr
225 230 235 240
Cys Gln Gly Asn Gly Gln Trp Ser Gly Gln Ile Pro Gln Cys Lys Lys
245 250 255
Leu Val Phe Cys Pro Asp Leu Asp Pro Val Asn His Ala Glu His Gln
260 265 270
Val Lys Ile Gly Val Glu Gln Lys Tyr Gly Gln Phe Pro Gln Gly Thr
275 280 285
Glu Val Thr Tyr Thr Cys Ser Gly Asn Tyr Phe Leu Met Gly Phe Asn
290 295 300
Thr Leu Lys Cys Asn Pro Asp Gly Ser Trp Ser Gly Ser Gln Pro Ser
305 310 315 320
Cys Val Lys Val Ala Asp Arg Glu Val Asp Cys Asp Ser Lys Ala Val
325 330 335
Asp Phe Leu Asp Asp Val Gly Glu Pro Val Arg Ile His Cys Pro Ala
340 345 350
Gly Cys Ser Leu Thr Ala Gly Thr Val Trp Gly Thr Ala Ile Tyr His
355 360 365
Glu Leu Ser Ser Val Cys Arg Ala Ala Ile His Ala Gly Lys Leu Pro
370 375 380
Asn Ser Gly Gly Ala Val His Val Val Asn Asn Gly Pro Tyr Ser Asp
385 390 395 400
Phe Leu Gly Ser Asp Leu Asn Gly Ile Lys Ser Glu Glu Leu Lys Ser
405 410 415
Leu Ala Arg Ser Phe Arg Phe Asp Tyr Val Ser Ser Ser Thr Ala Gly
420 425 430
Arg Ser Gly Cys Pro Asp Gly Trp Phe Glu Val Glu Glu Asn Cys Val
435 440 445
Tyr Val Thr Ser Lys Gln Arg Ala Trp Glu Arg Ala Gln Gly Val Cys
450 455 460
Thr Asn Met Ala Ala Arg Leu Ala Val Leu Asp Lys Asp Leu Ile Pro
465 470 475 480
Ser Ser Leu Thr Glu Thr Leu Arg Gly Lys Gly Leu Thr Thr Thr Trp
485 490 495
Ile Gly Leu His Arg Leu Asp Ala Glu Lys Pro Phe Val Trp Glu Leu
500 505 510
Met Asp Arg Ser Asn Val Val Leu Asn Asp Asn Leu Thr Phe Trp Ala
515 520 525
Ser Gly Glu Pro Gly Asn Glu Thr Asn Cys Val Tyr Leu Asp Ile Arg
530 535 540
Asp Gln Leu Gln Pro Val Trp Lys Thr Lys Ser Cys Phe Gln Pro Ser
545 550 555 560
Ser Phe Ala Cys Met Met Asp Leu Ser Asp Arg Asn Lys Ala Lys Cys
565 570 575
Asp Asp Pro Gly Pro Leu Glu Asn Gly His Ala Thr Leu His Gly Gln
580 585 590
Ser Ile Asp Gly Phe Tyr Ala Gly Ser Ser Ile Arg Tyr Ser Cys Glu
595 600 605
Val Leu His Tyr Leu Ser Gly Thr Glu Thr Val Thr Cys Thr Thr Asn
610 615 620
Gly Thr Trp Ser Ala Pro Lys Pro Arg Cys Ile Lys Val Ile Thr Cys
625 630 635 640
Gln Asn Pro Pro Val Pro Ser Tyr Gly Ser Val Glu Ile Lys Pro Pro
645 650 655
Ser Arg Thr Asn Ser Ile Ser Arg Val Gly Ser Pro Phe Leu Arg Leu
660 665 670
Pro Arg Leu Pro Leu Pro Leu Ala Arg Ala Ala Lys Pro Pro Pro Lys
675 680 685
Pro Arg Ser Ser Gln Pro Ser Thr Val Asp Leu Ala Ser Lys Val Lys
690 695 700
Leu Pro Glu Gly His Tyr Arg Val Gly Ser Arg Ala Ile Tyr Thr Cys
705 710 715 720
Glu Ser Arg Tyr Tyr Glu Leu Leu Gly Ser Gln Gly Arg Arg Cys Asp
725 730 735
Ser Asn Gly Asn Trp Ser Gly Arg Pro Ala Ser Cys Ile Pro Val Cys
740 745 750
Gly Arg Ser Asp Ser Pro Arg Ser Pro Phe Ile Trp Asn Gly Asn Ser
755 760 765
Thr Glu Ile Gly Gln Trp Pro Trp Gln Ala Gly Ile Ser Arg Trp Leu
770 775 780
Ala Asp His Asn Met Trp Phe Leu Gln Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn
785 790 795 800
Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Thr Tyr Ser Ala Thr
805 810 815
Ala Glu Ile Ile Asp Pro Ser Gln Phe Lys Ile Tyr Leu Gly Lys Tyr
820 825 830
Tyr Arg Asp Asp Ser Arg Asp Asp Asp Tyr Val Gln Val Arg Glu Ala
835 840 845
Leu Glu Ile His Val Asn Pro Asn Tyr Asp Pro Gly Asn Leu Asn Phe
850 855 860
Asp Ile Ala Leu Ile Gln Leu Lys Thr Pro Val Thr Leu Thr Thr Arg
865 870 875 880
Val Gln Pro Ile Cys Leu Pro Thr Asp Ile Thr Thr Arg Glu His Leu
885 890 895
Lys Glu Gly Thr Leu Ala Val Val Thr Gly Trp Gly Leu Asn Glu Asn
900 905 910
Asn Thr Tyr Ser Glu Met Ile Gln Gln Ala Val Leu Pro Val Val Ala
915 920 925
Ala Ser Thr Cys Glu Glu Gly Tyr Lys Glu Ala Asp Leu Pro Leu Thr
930 935 940
Val Thr Glu Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Lys Gly Arg Tyr Asp
945 950 955 960
Ala Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Phe Ala Asp Asp Ser
965 970 975
Arg Thr Glu Arg Arg Trp Val Leu Glu Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser
980 985 990
Pro Ser Gly Cys Gly Lys Ala Asn Gln Tyr Gly Gly Phe Thr Lys Val
995 1000 1005
Asn Val Phe Leu Ser Trp Ile Arg Gln Phe Ile
1010 1015
<210> 3
<211> 3060
<212> DNA
<213> 圆尾鲎（Carcinoscorpius rotundicauda）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3060)
<400> 3
atg gtc tta gcg tcg ttt ttg gtg tct ggt tta gtt cta ggg cta cta 48
Met Val Leu Ala Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu
1 5 10 15
gcc caa aaa atg cgc cca gtt cag tcc aaa gga gta gat cta ggc ttg 96
Ala Gln Lys Met Arg Pro Val Gln Ser Lys Gly Val Asp Leu Gly Leu
20 25 30
tgt gat gaa acg agg ttc gag tgt aag tgt ggc gat cca ggc tat gtg 144
Cys Asp Glu Thr Arg Phe Glu Cys Lys Cys Gly Asp Pro Gly Tyr Val
35 40 45
ttc aac att cca gtg aaa caa tgt aca tac ttt tat cga tgg agg ccg 192
Phe Asn Ile Pro Val Lys Gln Cys Thr Tyr Phe Tyr Arg Trp Arg Pro
50 55 60
tat tgt aaa cca tgt gat gac ctg gag gct aag gat att tgt cca aag 240
Tyr Cys Lys Pro Cys Asp Asp Leu Glu Ala Lys Asp Ile Cys Pro Lys
65 70 75 80
tac aaa cga tgt caa gag tgt aag gct ggt ctt gat agt tgt gtt act 288
Tyr Lys Arg Cys Gln Glu Cys Lys Ala Gly Leu Asp Ser Cys Val Thr
85 90 95
tgt cca cct aac aaa tat ggt act tgg tgt agc ggt gaa tgt cag tgt 336
Cys Pro Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Trp Cys Ser Gly Glu Cys Gln Cys
100 105 110
aag aat gga ggt atc tgt gac cag agg aca gga gct tgt gca tgt cgt 384
Lys Asn Gly Gly Ile Cys Asp Gln Arg Thr Gly Ala Cys Ala Cys Arg
115 120 125
gac aga tat gaa ggg gtg cac tgt gaa att ctc aaa ggt tgt cct ctt 432
Asp Arg Tyr Glu Gly Val His Cys Glu Ile Leu Lys Gly Cys Pro Leu
130 135 140
ctt cca tcg gat tct cag gtt cag gaa gtc aga aat cca cca gat aat 480
Leu Pro Ser Asp Ser Gln Val Gln Glu Val Arg Asn Pro Pro Asp Asn
145 150 155 160
ccc caa act att gac tac agc tgt tca cca ggg ttc aag ctt aag ggt 528
Pro Gln Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Ser Pro Gly Phe Lys Leu Lys Gly
165 170 175
atg gca cga att agc tgt ctc cca aat gga cag tgg agt aac ttt cca 576
Met Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn Gly Gln Trp Ser Asn Phe Pro
180 185 190
ccc aaa tgt att cga gaa tgt gcc atg gtt tca tct cca gaa cat ggg 624
Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Met Val Ser Ser Pro Glu His Gly
195 200 205
aaa gtg aat gct ctt agt ggt gat atg ata gaa ggg gct act tta cgg 672
Lys Val Asn Ala Leu Ser Gly Asp Met Ile Glu Gly Ala Thr Leu Arg
210 215 220
ttc tca tgt gat agt ccc tac tac ttg att ggt caa gaa aca tta acc 720
Phe Ser Cys Asp Ser Pro Tyr Tyr Leu Ile Gly Gln Glu Thr Leu Thr
225 230 235 240
tgt cag ggt aat ggt cag tgg aat gga cag ata cca caa tgt aag aac 768
Cys Gln Gly Asn Gly Gln Trp Asn Gly Gln Ile Pro Gln Cys Lys Asn
245 250 255
ttg gtc ttc tgt cct gac ctg gat cct gta aac cat gct gaa cac aag 816
Leu Val Phe Cys Pro Asp Leu Asp Pro Val Asn His Ala Glu His Lys
260 265 270
gtt aaa att ggt gtg gaa caa aaa tat ggt cag ttt cct caa ggc act 864
Val Lys Ile Gly Val Glu Gln Lys Tyr Gly Gln Phe Pro Gln Gly Thr
275 280 285
gaa gtg acc tat acg tgt tcg ggt aac tac ttc ttg atg ggt ttt gac 912
Glu Val Thr Tyr Thr Cys Ser Gly Asn Tyr Phe Leu Met Gly Phe Asp
290 295 300
acc tta aaa tgt aac cct gat ggg tct tgg tca gga tca cag cca tcc 960
Thr Leu Lys Cys Asn Pro Asp Gly Ser Trp Ser Gly Ser Gln Pro Ser
305 310 315 320
tgt gtt aaa gtg gca gac aga gag gtc gac tgt gac agt aaa gct gta 1008
Cys Val Lys Val Ala Asp Arg Glu Val Asp Cys Asp Ser Lys Ala Val
325 330 335
gac ttc ttg gat gat gtt ggt gaa cct gtc agg atc cac tgt cct gct 1056
Asp Phe Leu Asp Asp Val Gly Glu Pro Val Arg Ile His Cys Pro Ala
340 345 350
ggc tgt tct ttg aca gct ggt act gtg tgg ggt aca gcc ata tac cat 1104
Gly Cys Ser Leu Thr Ala Gly Thr Val Trp Gly Thr Ala Ile Tyr His
355 360 365
gaa ctt tcc tca gtg tgt cgt gca gcc atc cat gct ggc aag ctt cca 1152
Glu Leu Ser Ser Val Cys Arg Ala Ala Ile His Ala Gly Lys Leu Pro
370 375 380
aac tct gga gga gcg gtg cat gtt gtg aac aat ggc ccc tac tcg gac 1200
Asn Ser Gly Gly Ala Val His Val Val Asn Asn Gly Pro Tyr Ser Asp
385 390 395 400
ttt ctg ggt agt gac ctg aat ggg ata aaa tcg gaa gag ttg aag tct 1248
Phe Leu Gly Ser Asp Leu Asn Gly Ile Lys Ser Glu Glu Leu Lys Ser
405 410 415
ctt gcc cgg agt ttc cga ttc gat tat gtc cgt tcc tcc aca gca ggt 1296
Leu Ala Arg Ser Phe Arg Phe Asp Tyr Val Arg Ser Ser Thr Ala Gly
420 425 430
aaa tca gga tgt cct gat gga tgg ttt gag gta gac gag aac tgt gtg 1344
Lys Ser Gly Cys Pro Asp Gly Trp Phe Glu Val Asp Glu Asn Cys Val
435 440 445
tac gtt aca tca aaa cag aga gcc tgg gaa aga gct caa ggt gtg tgt 1392
Tyr Val Thr Ser Lys Gln Arg Ala Trp Glu Arg Ala Gln Gly Val Cys
450 455 460
acc aat atg gct gct cgt ctt gct gtg ctg gac aaa gat gta att cca 1440
Thr Asn Met Ala Ala Arg Leu Ala Val Leu Asp Lys Asp Val Ile Pro
465 470 475 480
aat tcg ttg act gag act cta cga ggg aaa ggg tta aca acc acg tgg 1488
Asn Ser Leu Thr Glu Thr Leu Arg Gly Lys Gly Leu Thr Thr Thr Trp
485 490 495
ata gga ttg cac aga cta gat gct gag aag ccc ttt att tgg gag tta 1536
Ile Gly Leu His Arg Leu Asp Ala Glu Lys Pro Phe Ile Trp Glu Leu
500 505 510
atg gat cgt agt aat gtg gtt ctg aat gat aac cta aca ttc tgg gcc 1584
Met Asp Arg Ser Asn Val Val Leu Asn Asp Asn Leu Thr Phe Trp Ala
515 520 525
tct ggc gaa cct gga aat gaa act aac tgt gta tat atg gac atc caa 1632
Ser Gly Glu Pro Gly Asn Glu Thr Asn Cys Val Tyr Met Asp Ile Gln
530 535 540
gat cag ttg cag tct gtg tgg aaa acc aag tca tgt ttt cag ccc tca 1680
Asp Gln Leu Gln Ser Val Trp Lys Thr Lys Ser Cys Phe Gln Pro Ser
545 550 555 560
agt ttt gct tgc atg atg gat ctg tca gac aga aat aaa gcc aaa tgc 1728
Ser Phe Ala Cys Met Met Asp Leu Ser Asp Arg Asn Lys Ala Lys Cys
565 570 575
gat gat cct gga tca ctg gaa aat gga cac gcc aca ctt cat gga caa 1776
Asp Asp Pro Gly Ser Leu Glu Asn Gly His Ala Thr Leu His Gly Gln
580 585 590
agt att gat ggg ttc tat gct ggt tct tct ata agg tac agc tgt gag 1824
Ser Ile Asp Gly Phe Tyr Ala Gly Ser Ser Ile Arg Tyr Ser Cys Glu
595 600 605
gtt ctc cac tac ctc agt gga act gaa acc gta act tgt aca aca aat 1872
Val Leu His Tyr Leu Ser Gly Thr Glu Thr Val Thr Cys Thr Thr Asn
610 615 620
ggc aca tgg agt gct cct aaa cct cga tgt atc aaa gtc atc acc tgc 1920
Gly Thr Trp Ser Ala Pro Lys Pro Arg Cys Ile Lys Val Ile Thr Cys
625 630 635 640
caa aac ccc cct gta cca tca tat ggt tct gtg gaa atc aaa ccc cca 1968
Gln Asn Pro Pro Val Pro Ser Tyr Gly Ser Val Glu Ile Lys Pro Pro
645 650 655
agt cgg aca aac tcg ata agt cgt gtt ggg tca cct ttc ttg agg ttg 2016
Ser Arg Thr Asn Ser Ile Ser Arg Val Gly Ser Pro Phe Leu Arg Leu
660 665 670
cca cgg tta ccc ctc cca tta gct aga gca gcc aaa cct cct cca aaa 2064
Pro Arg Leu Pro Leu Pro Leu Ala Arg Ala Ala Lys Pro Pro Pro Lys
675 680 685
cct aga tcc tca caa ccc tct act gtg gac ttg gct tct aaa gtt aaa 2112
Pro Arg Ser Ser Gln Pro Ser Thr Val Asp Leu Ala Ser Lys Val Lys
690 695 700
cta cct gaa ggt cat tac cgg gta ggg tct cga gcc atc tac acg tgc 2160
Leu Pro Glu Gly His Tyr Arg Val Gly Ser Arg Ala Ile Tyr Thr Cys
705 710 715 720
gag tcg aga tac tac gaa cta ctt gga tct caa ggc aga aga tgt gac 2208
Glu Ser Arg Tyr Tyr Glu Leu Leu Gly Ser Gln Gly Arg Arg Cys Asp
725 730 735
tct aat gga aac tgg agt ggt cgg cca gcg agc tgt att cca gtt tgt 2256
Ser Asn Gly Asn Trp Ser Gly Arg Pro Ala Ser Cys Ile Pro Val Cys
740 745 750
gga cgg tca gac tct cct cgt tct cct ttt atc tgg aat ggg aat tct 2304
Gly Arg Ser Asp Ser Pro Arg Ser Pro Phe Ile Trp Asn Gly Asn Ser
755 760 765
aca gaa ata ggt cag tgg ccg tgg cag gca gga atc tct aga tgg ctt 2352
Thr Glu Ile Gly Gln Trp Pro Trp Gln Ala Gly Ile Ser Arg Trp Leu
770 775 780
gca gac cac aat atg tgg ttt ctc cag tgt gga gga tct cta ttg aat 2400
Ala Asp His Asn Met Trp Phe Leu Gln Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn
785 790 795 800
gag aaa tgg atc gtc act gct gcc cac tgt gtc acc tac tct gct act 2448
Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Thr Tyr Ser Ala Thr
805 810 815
gct gag att att gac ccc aat cag ttt aaa atg tat ctg ggc aag tac 2496
Ala Glu Ile Ile Asp Pro Asn Gln Phe Lys Met Tyr Leu Gly Lys Tyr
820 825 830
tac cgt gat gac agt aga gac gat gac tat gta caa gta aga gag gct 2544
Tyr Arg Asp Asp Ser Arg Asp Asp Asp Tyr Val Gln Val Arg Glu Ala
835 840 845
ctt gag atc cac gtg aat cct aac tac gac ccc ggc aat ctc aac ttt 2592
Leu Glu Ile His Val Asn Pro Asn Tyr Asp Pro Gly Asn Leu Asn Phe
850 855 860
gac ata gcc cta att caa ctg aaa act cct gtt act ttg aca aca cga 2640
Asp Ile Ala Leu Ile Gln Leu Lys Thr Pro Val Thr Leu Thr Thr Arg
865 870 875 880
gtc caa cca atc tgt ctg cct act gac atc aca aca aga gaa cac ttg 2688
Val Gln Pro Ile Cys Leu Pro Thr Asp Ile Thr Thr Arg Glu His Leu
885 890 895
aag gag gga aca tta gca gtg gtg aca ggt tgg ggt ttg aat gaa aac 2736
Lys Glu Gly Thr Leu Ala Val Val Thr Gly Trp Gly Leu Asn Glu Asn
900 905 910
aac acc tat tca gag acg att caa caa gct gtg cta cct gtt gtt gca 2784
Asn Thr Tyr Ser Glu Thr Ile Gln Gln Ala Val Leu Pro Val Val Ala
915 920 925
gcc agc acc tgt gaa gag ggg tac aag gaa gca gac tta cca ctg aca 2832
Ala Ser Thr Cys Glu Glu Gly Tyr Lys Glu Ala Asp Leu Pro Leu Thr
930 935 940
gta aca gag aac atg ttc tgt gca ggt tac aag aag gga cgt tat gat 2880
Val Thr Glu Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Lys Gly Arg Tyr Asp
945 950 955 960
gcc tgc agt ggg gac agt gga gga cct tta gtg ttt gct gat gat tcc 2928
Ala Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Phe Ala Asp Asp Ser
965 970 975
cgt acc gaa agg cgg tgg gtc ttg gaa ggg att gtc agc tgg ggc agt 2976
Arg Thr Glu Arg Arg Trp Val Leu Glu Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser
980 985 990
ccc agt gga tgt ggc aag gcg aac cag tac ggg ggc ttc act aaa gtt 3024
Pro Ser Gly Cys Gly Lys Ala Asn Gln Tyr Gly Gly Phe Thr Lys Val
995 1000 1005
aac gtt ttc ctg tca tgg att agg cag ttc att tga 3060
Asn Val Phe Leu Ser Trp Ile Arg Gln Phe Ile
1010 1015
<210> 4
<211> 1019
<212> PRT
<213> 圆尾鲎（Carcinoscorpius rotundicauda）
<400> 4
Met Val Leu Ala Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu
1 5 10 15
Ala Gln Lys Met Arg Pro Val Gln Ser Lys Gly Val Asp Leu Gly Leu
20 25 30
Cys Asp Glu Thr Arg Phe Glu Cys Lys Cys Gly Asp Pro Gly Tyr Val
35 40 45
Phe Asn Ile Pro Val Lys Gln Cys Thr Tyr Phe Tyr Arg Trp Arg Pro
50 55 60
Tyr Cys Lys Pro Cys Asp Asp Leu Glu Ala Lys Asp Ile Cys Pro Lys
65 70 75 80
Tyr Lys Arg Cys Gln Glu Cys Lys Ala Gly Leu Asp Ser Cys Val Thr
85 90 95
Cys Pro Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Trp Cys Ser Gly Glu Cys Gln Cys
100 105 110
Lys Asn Gly Gly Ile Cys Asp Gln Arg Thr Gly Ala Cys Ala Cys Arg
115 120 125
Asp Arg Tyr Glu Gly Val His Cys Glu Ile Leu Lys Gly Cys Pro Leu
130 135 140
Leu Pro Ser Asp Ser Gln Val Gln Glu Val Arg Asn Pro Pro Asp Asn
145 150 155 160
Pro Gln Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Ser Pro Gly Phe Lys Leu Lys Gly
165 170 175
Met Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn Gly Gln Trp Ser Asn Phe Pro
180 185 190
Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Met Val Ser Ser Pro Glu His Gly
195 200 205
Lys Val Asn Ala Leu Ser Gly Asp Met Ile Glu Gly Ala Thr Leu Arg
210 215 220
Phe Ser Cys Asp Ser Pro Tyr Tyr Leu Ile Gly Gln Glu Thr Leu Thr
225 230 235 240
Cys Gln Gly Asn Gly Gln Trp Asn Gly Gln Ile Pro Gln Cys Lys Asn
245 250 255
Leu Val Phe Cys Pro Asp Leu Asp Pro Val Asn His Ala Glu His Lys
260 265 270
Val Lys Ile Gly Val Glu Gln Lys Tyr Gly Gln Phe Pro Gln Gly Thr
275 280 285
Glu Val Thr Tyr Thr Cys Ser Gly Asn Tyr Phe Leu Met Gly Phe Asp
290 295 300
Thr Leu Lys Cys Asn Pro Asp Gly Ser Trp Ser Gly Ser Gln Pro Ser
305 310 315 320
Cys Val Lys Val Ala Asp Arg Glu Val Asp Cys Asp Ser Lys Ala Val
325 330 335
Asp Phe Leu Asp Asp Val Gly Glu Pro Val Arg Ile His Cys Pro Ala
340 345 350
Gly Cys Ser Leu Thr Ala Gly Thr Val Trp Gly Thr Ala Ile Tyr His
355 360 365
Glu Leu Ser Ser Val Cys Arg Ala Ala Ile His Ala Gly Lys Leu Pro
370 375 380
Asn Ser Gly Gly Ala Val His Val Val Asn Asn Gly Pro Tyr Ser Asp
385 390 395 400
Phe Leu Gly Ser Asp Leu Asn Gly Ile Lys Ser Glu Glu Leu Lys Ser
405 410 415
Leu Ala Arg Ser Phe Arg Phe Asp Tyr Val Arg Ser Ser Thr Ala Gly
420 425 430
Lys Ser Gly Cys Pro Asp Gly Trp Phe Glu Val Asp Glu Asn Cys Val
435 440 445
Tyr Val Thr Ser Lys Gln Arg Ala Trp Glu Arg Ala Gln Gly Val Cys
450 455 460
Thr Asn Met Ala Ala Arg Leu Ala Val Leu Asp Lys Asp Val Ile Pro
465 470 475 480
Asn Ser Leu Thr Glu Thr Leu Arg Gly Lys Gly Leu Thr Thr Thr Trp
485 490 495
Ile Gly Leu His Arg Leu Asp Ala Glu Lys Pro Phe Ile Trp Glu Leu
500 505 510
Met Asp Arg Ser Asn Val Val Leu Asn Asp Asn Leu Thr Phe Trp Ala
515 520 525
Ser Gly Glu Pro Gly Asn Glu Thr Asn Cys Val Tyr Met Asp Ile Gln
530 535 540
Asp Gln Leu Gln Ser Val Trp Lys Thr Lys Ser Cys Phe Gln Pro Ser
545 550 555 560
Ser Phe Ala Cys Met Met Asp Leu Ser Asp Arg Asn Lys Ala Lys Cys
565 570 575
Asp Asp Pro Gly Ser Leu Glu Asn Gly His Ala Thr Leu His Gly Gln
580 585 590
Ser Ile Asp Gly Phe Tyr Ala Gly Ser Ser Ile Arg Tyr Ser Cys Glu
595 600 605
Val Leu His Tyr Leu Ser Gly Thr Glu Thr Val Thr Cys Thr Thr Asn
610 615 620
Gly Thr Trp Ser Ala Pro Lys Pro Arg Cys Ile Lys Val Ile Thr Cys
625 630 635 640
Gln Asn Pro Pro Val Pro Ser Tyr Gly Ser Val Glu Ile Lys Pro Pro
645 650 655
Ser Arg Thr Asn Ser Ile Ser Arg Val Gly Ser Pro Phe Leu Arg Leu
660 665 670
Pro Arg Leu Pro Leu Pro Leu Ala Arg Ala Ala Lys Pro Pro Pro Lys
675 680 685
Pro Arg Ser Ser Gln Pro Ser Thr Val Asp Leu Ala Ser Lys Val Lys
690 695 700
Leu Pro Glu Gly His Tyr Arg Val Gly Ser Arg Ala Ile Tyr Thr Cys
705 710 715 720
Glu Ser Arg Tyr Tyr Glu Leu Leu Gly Ser Gln Gly Arg Arg Cys Asp
725 730 735
Ser Asn Gly Asn Trp Ser Gly Arg Pro Ala Ser Cys Ile Pro Val Cys
740 745 750
Gly Arg Ser Asp Ser Pro Arg Ser Pro Phe Ile Trp Asn Gly Asn Ser
755 760 765
Thr Glu Ile Gly Gln Trp Pro Trp Gln Ala Gly Ile Ser Arg Trp Leu
770 775 780
Ala Asp His Asn Met Trp Phe Leu Gln Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn
785 790 795 800
Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Thr Tyr Ser Ala Thr
805 810 815
Ala Glu Ile Ile Asp Pro Asn Gln Phe Lys Met Tyr Leu Gly Lys Tyr
820 825 830
Tyr Arg Asp Asp Ser Arg Asp Asp Asp Tyr Val Gln Val Arg Glu Ala
835 840 845
Leu Glu Ile His Val Asn Pro Asn Tyr Asp Pro Gly Asn Leu Asn Phe
850 855 860
Asp Ile Ala Leu Ile Gln Leu Lys Thr Pro Val Thr Leu Thr Thr Arg
865 870 875 880
Val Gln Pro Ile Cys Leu Pro Thr Asp Ile Thr Thr Arg Glu His Leu
885 890 895
Lys Glu Gly Thr Leu Ala Val Val Thr Gly Trp Gly Leu Asn Glu Asn
900 905 910
Asn Thr Tyr Ser Glu Thr Ile Gln Gln Ala Val Leu Pro Val Val Ala
915 920 925
Ala Ser Thr Cys Glu Glu Gly Tyr Lys Glu Ala Asp Leu Pro Leu Thr
930 935 940
Val Thr Glu Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Lys Gly Arg Tyr Asp
945 950 955 960
Ala Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Phe Ala Asp Asp Ser
965 970 975
Arg Thr Glu Arg Arg Trp Val Leu Glu Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser
980 985 990
Pro Ser Gly Cys Gly Lys Ala Asn Gln Tyr Gly Gly Phe Thr Lys Val
995 1000 1005
Asn Val Phe Leu Ser Trp Ile Arg Gln Phe Ile
1010 1015
<210> 5
<211> 1203
<212> DNA
<213> 东方鲎（Tachypleus tridentatus）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1203)
<400> 5
atg acg tgg ata tgt gtg ata acg ttg ttt gct ctg gct tct gct acg 48
Met Thr Trp Ile Cys Val Ile Thr Leu Phe Ala Leu Ala Ser Ala Thr
1 5 10 15
ttg ggt aac aaa gtt agt aga gtg ggg gtc ctc ttc ccc aag aca cgg 96
Leu Gly Asn Lys Val Ser Arg Val Gly Val Leu Phe Pro Lys Thr Arg
20 25 30
aac gac aat gag tgt aca gca aga ggg gga ttg aaa gga tcc tgc aaa 144
Asn Asp Asn Glu Cys Thr Ala Arg Gly Gly Leu Lys Gly Ser Cys Lys
35 40 45
tcc ctc ata gac tgt cct agt gtc ttg gct acg ttg aag gac agt ttt 192
Ser Leu Ile Asp Cys Pro Ser Val Leu Ala Thr Leu Lys Asp Ser Phe
50 55 60
cct gtc gtt tgc tct tgg aat ggt cga ttt cag cct att gtc tgc tgt 240
Pro Val Val Cys Ser Trp Asn Gly Arg Phe Gln Pro Ile Val Cys Cys
65 70 75 80
cct gat gca ata gca cca cca cct gta acc aca aca gct gta act gta 288
Pro Asp Ala Ile Ala Pro Pro Pro Val Thr Thr Thr Ala Val Thr Val
85 90 95
ata tct aca aaa gaa cca aag ctt cca aga tta cat ata tca ggt tgt 336
Ile Ser Thr Lys Glu Pro Lys Leu Pro Arg Leu His Ile Ser Gly Cys
100 105 110
gga aaa aga aaa gtc aaa ata gat att aca act gtt gga cgc tct gga 384
Gly Lys Arg Lys Val Lys Ile Asp Ile Thr Thr Val Gly Arg Ser Gly
115 120 125
tca cca ata ctt cct ccg ata tct act cct caa aat tca aca ggt ggg 432
Ser Pro Ile Leu Pro Pro Ile Ser Thr Pro Gln Asn Ser Thr Gly Gly
130 135 140
aga gga att att gct gga ggc gta gaa gcc aaa att ggc gcg tgg cct 480
Arg Gly Ile Ile Ala Gly Gly Val Glu Ala Lys Ile Gly Ala Trp Pro
145 150 155 160
tgg atg gca gct gtt ttt gtg aaa aac ttt ggc att ggc aga ttc cac 528
Trp Met Ala Ala Val Phe Val Lys Asn Phe Gly Ile Gly Arg Phe His
165 170 175
tgt gct ggt agc ata atc agt aac aag tac att ttg tca gct gcc cac 576
Cys Ala Gly Ser Ile Ile Ser Asn Lys Tyr Ile Leu Ser Ala Ala His
180 185 190
gcc ttc ctt atc gga ggt cga aag ttg acc cca act cgc tta gct gtc 624
Ala Phe Leu Ile Gly Gly Arg Lys Leu Thr Pro Thr Arg Leu Ala Val
195 200 205
cgt gtg gga ggc cac tac ata aag agg ggt caa gag tat cca gtg aaa 672
Arg Val Gly Gly His Tyr Ile Lys Arg Gly Gln Glu Tyr Pro Val Lys
210 215 220
gac gtg att atc cat cct cat tat gta gaa aag gag aac tac aat gat 720
Asp Val Ile Ile His Pro His Tyr Val Glu Lys Glu Asn Tyr Asn Asp
225 230 235 240
ata gcc ata atc gag tta aaa gag gaa ctg aac ttt acg gac ttg gtc 768
Ile Ala Ile Ile Glu Leu Lys Glu Glu Leu Asn Phe Thr Asp Leu Val
245 250 255
aat cct ata tgt ctc cct gat cca gag aca gta acg gat cca tta aaa 816
Asn Pro Ile Cys Leu Pro Asp Pro Glu Thr Val Thr Asp Pro Leu Lys
260 265 270
gac aga att gtg act gca gcg gga tgg ggc gat ctg gat ttc tcc ggt 864
Asp Arg Ile Val Thr Ala Ala Gly Trp Gly Asp Leu Asp Phe Ser Gly
275 280 285
cca cgg agc caa gtt cta cgt gag gta agc atc cca gtt gtt cca gtt 912
Pro Arg Ser Gln Val Leu Arg Glu Val Ser Ile Pro Val Val Pro Val
290 295 300
gat aaa tgt gat caa gcc tat gag aaa ctc aac acc cct tca cta aaa 960
Asp Lys Cys Asp Gln Ala Tyr Glu Lys Leu Asn Thr Pro Ser Leu Lys
305 310 315 320
aat ggg ata acg aat aac ttc ctt tgc gct gga ttg gaa gaa gga ggg 1008
Asn Gly Ile Thr Asn Asn Phe Leu Cys Ala Gly Leu Glu Glu Gly Gly
325 330 335
aaa gac gct tgc caa ggc gat tct ggt gga ccg ttg atg cta gtg aac 1056
Lys Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Leu Val Asn
340 345 350
aac act agg tgg ata gta gta gga gtt gtg tcg ttc ggg cac aag tgt 1104
Asn Thr Arg Trp Ile Val Val Gly Val Val Ser Phe Gly His Lys Cys
355 360 365
gcc gag gaa gga tat cct ggt gtg tac tcg cgc gta gcg agt tac cta 1152
Ala Glu Glu Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Ala Ser Tyr Leu
370 375 380
gac tgg atc gcg aaa gtt acg aac tcg tta gat cat gcc gtc act aac 1200
Asp Trp Ile Ala Lys Val Thr Asn Ser Leu Asp His Ala Val Thr Asn
385 390 395 400
taa 1203
<210> 6
<211> 400
<212> PRT
<213> 东方鲎（Tachypleus tridentatus）
<400> 6
Met Thr Trp Ile Cys Val Ile Thr Leu Phe Ala Leu Ala Ser Ala Thr
1 5 10 15
Leu Gly Asn Lys Val Ser Arg Val Gly Val Leu Phe Pro Lys Thr Arg
20 25 30
Asn Asp Asn Glu Cys Thr Ala Arg Gly Gly Leu Lys Gly Ser Cys Lys
35 40 45
Ser Leu Ile Asp Cys Pro Ser Val Leu Ala Thr Leu Lys Asp Ser Phe
50 55 60
Pro Val Val Cys Ser Trp Asn Gly Arg Phe Gln Pro Ile Val Cys Cys
65 70 75 80
Pro Asp Ala Ile Ala Pro Pro Pro Val Thr Thr Thr Ala Val Thr Val
85 90 95
Ile Ser Thr Lys Glu Pro Lys Leu Pro Arg Leu His Ile Ser Gly Cys
100 105 110
Gly Lys Arg Lys Val Lys Ile Asp Ile Thr Thr Val Gly Arg Ser Gly
115 120 125
Ser Pro Ile Leu Pro Pro Ile Ser Thr Pro Gln Asn Ser Thr Gly Gly
130 135 140
Arg Gly Ile Ile Ala Gly Gly Val Glu Ala Lys Ile Gly Ala Trp Pro
145 150 155 160
Trp Met Ala Ala Val Phe Val Lys Asn Phe Gly Ile Gly Arg Phe His
165 170 175
Cys Ala Gly Ser Ile Ile Ser Asn Lys Tyr Ile Leu Ser Ala Ala His
180 185 190
Ala Phe Leu Ile Gly Gly Arg Lys Leu Thr Pro Thr Arg Leu Ala Val
195 200 205
Arg Val Gly Gly His Tyr Ile Lys Arg Gly Gln Glu Tyr Pro Val Lys
210 215 220
Asp Val Ile Ile His Pro His Tyr Val Glu Lys Glu Asn Tyr Asn Asp
225 230 235 240
Ile Ala Ile Ile Glu Leu Lys Glu Glu Leu Asn Phe Thr Asp Leu Val
245 250 255
Asn Pro Ile Cys Leu Pro Asp Pro Glu Thr Val Thr Asp Pro Leu Lys
260 265 270
Asp Arg Ile Val Thr Ala Ala Gly Trp Gly Asp Leu Asp Phe Ser Gly
275 280 285
Pro Arg Ser Gln Val Leu Arg Glu Val Ser Ile Pro Val Val Pro Val
290 295 300
Asp Lys Cys Asp Gln Ala Tyr Glu Lys Leu Asn Thr Pro Ser Leu Lys
305 310 315 320
Asn Gly Ile Thr Asn Asn Phe Leu Cys Ala Gly Leu Glu Glu Gly Gly
325 330 335
Lys Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Leu Val Asn
340 345 350
Asn Thr Arg Trp Ile Val Val Gly Val Val Ser Phe Gly His Lys Cys
355 360 365
Ala Glu Glu Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Ala Ser Tyr Leu
370 375 380
Asp Trp Ile Ala Lys Val Thr Asn Ser Leu Asp His Ala Val Thr Asn
385 390 395 400
<210> 7
<211> 1128
<212> DNA
<213> 东方鲎（Tachypleus tridentatus）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1128)
<400> 7
atg ttg gtg aat aac gtg ttt tca cta ctg tgt ttc cca ctc ttg atg 48
Met Leu Val Asn Asn Val Phe Ser Leu Leu Cys Phe Pro Leu Leu Met
1 5 10 15
tct gtg gtt aga tgc agt act ctc agc aga cag cgt aga cag ttt gtt 96
Ser Val Val Arg Cys Ser Thr Leu Ser Arg Gln Arg Arg Gln Phe Val
20 25 30
ttc cct gac gag gaa gaa ctt tgc tca aac cga ttt act gaa gaa gga 144
Phe Pro Asp Glu Glu Glu Leu Cys Ser Asn Arg Phe Thr Glu Glu Gly
35 40 45
aca tgc aaa aat gtc ttg gat tgt aga ata ctt tta caa aaa aat gat 192
Thr Cys Lys Asn Val Leu Asp Cys Arg Ile Leu Leu Gln Lys Asn Asp
50 55 60
tat aat tta ctc aaa gaa tca ata tgc ggc ttt gaa ggc ata aca ccc 240
Tyr Asn Leu Leu Lys Glu Ser Ile Cys Gly Phe Glu Gly Ile Thr Pro
65 70 75 80
aaa gtt tgt tgt ccg aaa tca agc cat gta att tca agt aca cag gca 288
Lys Val Cys Cys Pro Lys Ser Ser His Val Ile Ser Ser Thr Gln Ala
85 90 95
cct cca gaa acc act acg act gaa cgc cca cca aaa cag ata cca ccc 336
Pro Pro Glu Thr Thr Thr Thr Glu Arg Pro Pro Lys Gln Ile Pro Pro
100 105 110
aat ctt cat gaa gtg tgt gga att cac aat act aca act acc agg att 384
Asn Leu His Glu Val Cys Gly Ile His Asn Thr Thr Thr Thr Arg Ile
115 120 125
att gga ggt cgg gaa gca cct att gga gcc tgg ccg tgg atg act gct 432
Ile Gly Gly Arg Glu Ala Pro Ile Gly Ala Trp Pro Trp Met Thr Ala
130 135 140
gtc tac ata aaa caa gga gga atc aga agt gtt cag tgt ggt ggc gca 480
Val Tyr Ile Lys Gln Gly Gly Ile Arg Ser Val Gln Cys Gly Gly Ala
145 150 155 160
ctt gtc act aac agg cac gtg att aca gct tcg cac tgt gtt gta aac 528
Leu Val Thr Asn Arg His Val Ile Thr Ala Ser His Cys Val Val Asn
165 170 175
agt gca gga aca gat gtg atg cca gct gat gta ttc tcg gtt cgt ctg 576
Ser Ala Gly Thr Asp Val Met Pro Ala Asp Val Phe Ser Val Arg Leu
180 185 190
ggt gaa cac aat tta tac agt acc gat gac gat tcg aat cca ata gat 624
Gly Glu His Asn Leu Tyr Ser Thr Asp Asp Asp Ser Asn Pro Ile Asp
195 200 205
ttt gca gtt acg tcg gtg aaa cat cac gaa cac ttt gta ctc gcg acg 672
Phe Ala Val Thr Ser Val Lys His His Glu His Phe Val Leu Ala Thr
210 215 220
tat ttg aat gac atc gca att cta acg tta aat gac aca gtt acg ttt 720
Tyr Leu Asn Asp Ile Ala Ile Leu Thr Leu Asn Asp Thr Val Thr Phe
225 230 235 240
aca gac aga att cga ccc att tgt cta cct tat cgt aag ttg aga tac 768
Thr Asp Arg Ile Arg Pro Ile Cys Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Arg Tyr
245 250 255
gat gat cta gca atg aga aaa ccg ttt atc act gga tgg gga aca aca 816
Asp Asp Leu Ala Met Arg Lys Pro Phe Ile Thr Gly Trp Gly Thr Thr
260 265 270
gca ttt aac ggc cca tct agt gca gtg ttg aga gaa gta cag tta cca 864
Ala Phe Asn Gly Pro Ser Ser Ala Val Leu Arg Glu Val Gln Leu Pro
275 280 285
ata tgg gaa cac gag gcc tgt aga cag gcc tac gag aag gat tta aat 912
Ile Trp Glu His Glu Ala Cys Arg Gln Ala Tyr Glu Lys Asp Leu Asn
290 295 300
att aca aac gtg tat atg tgt gct ggc ttt gca gat ggc ggg aag gat 960
Ile Thr Asn Val Tyr Met Cys Ala Gly Phe Ala Asp Gly Gly Lys Asp
305 310 315 320
gct tgc cag ggt gat tct gga ggt cca atg atg ttg cct gtt aaa acc 1008
Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Met Leu Pro Val Lys Thr
325 330 335
gga gag ttt tat ctc att gga att gtg tct ttc gga aag aaa tgc gca 1056
Gly Glu Phe Tyr Leu Ile Gly Ile Val Ser Phe Gly Lys Lys Cys Ala
340 345 350
ttg cct gga ttt cct ggg gtt tac aca aaa gtg aca gag ttt tta gat 1104
Leu Pro Gly Phe Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Glu Phe Leu Asp
355 360 365
tgg att gca gaa cat atg gtg tag 1128
Trp Ile Ala Glu His Met Val
370 375
<210> 8
<211> 375
<212> PRT
<213> 东方鲎（Tachypleus tridentatus）
<400> 8
Met Leu Val Asn Asn Val Phe Ser Leu Leu Cys Phe Pro Leu Leu Met
1 5 10 15
Ser Val Val Arg Cys Ser Thr Leu Ser Arg Gln Arg Arg Gln Phe Val
20 25 30
Phe Pro Asp Glu Glu Glu Leu Cys Ser Asn Arg Phe Thr Glu Glu Gly
35 40 45
Thr Cys Lys Asn Val Leu Asp Cys Arg Ile Leu Leu Gln Lys Asn Asp
50 55 60
Tyr Asn Leu Leu Lys Glu Ser Ile Cys Gly Phe Glu Gly Ile Thr Pro
65 70 75 80
Lys Val Cys Cys Pro Lys Ser Ser His Val Ile Ser Ser Thr Gln Ala
85 90 95
Pro Pro Glu Thr Thr Thr Thr Glu Arg Pro Pro Lys Gln Ile Pro Pro
100 105 110
Asn Leu His Glu Val Cys Gly Ile His Asn Thr Thr Thr Thr Arg Ile
115 120 125
Ile Gly Gly Arg Glu Ala Pro Ile Gly Ala Trp Pro Trp Met Thr Ala
130 135 140
Val Tyr Ile Lys Gln Gly Gly Ile Arg Ser Val Gln Cys Gly Gly Ala
145 150 155 160
Leu Val Thr Asn Arg His Val Ile Thr Ala Ser His Cys Val Val Asn
165 170 175
Ser Ala Gly Thr Asp Val Met Pro Ala Asp Val Phe Ser Val Arg Leu
180 185 190
Gly Glu His Asn Leu Tyr Ser Thr Asp Asp Asp Ser Asn Pro Ile Asp
195 200 205
Phe Ala Val Thr Ser Val Lys His His Glu His Phe Val Leu Ala Thr
210 215 220
Tyr Leu Asn Asp Ile Ala Ile Leu Thr Leu Asn Asp Thr Val Thr Phe
225 230 235 240
Thr Asp Arg Ile Arg Pro Ile Cys Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Arg Tyr
245 250 255
Asp Asp Leu Ala Met Arg Lys Pro Phe Ile Thr Gly Trp Gly Thr Thr
260 265 270
Ala Phe Asn Gly Pro Ser Ser Ala Val Leu Arg Glu Val Gln Leu Pro
275 280 285
Ile Trp Glu His Glu Ala Cys Arg Gln Ala Tyr Glu Lys Asp Leu Asn
290 295 300
Ile Thr Asn Val Tyr Met Cys Ala Gly Phe Ala Asp Gly Gly Lys Asp
305 310 315 320
Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Met Leu Pro Val Lys Thr
325 330 335
Gly Glu Phe Tyr Leu Ile Gly Ile Val Ser Phe Gly Lys Lys Cys Ala
340 345 350
Leu Pro Gly Phe Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Glu Phe Leu Asp
355 360 365
Trp Ile Ala Glu His Met Val
370 375
<210> 9
<211> 1203
<212> DNA
<213> 东方鲎（Tachypleus tridentatus）
<400> 9
atgacctgga tctgcgtgat caccctgttc gctctggctt ccgctaccct gggcaacaag 60
gtgtcccgtg tgggtgtcct gttccccaag acccgtaacg acaacgagtg caccgctcgt 120
ggtggtctga agggctcctg caagtccctg atcgactgcc cctccgtgct ggctaccctg 180
aaggactcct tccccgtcgt gtgctcctgg aacggtcgtt tccagcccat cgtgtgctgc 240
cccgacgcta tcgctccccc ccctgtgacc accaccgctg tgaccgtgat ctccaccaag 300
gagcccaagc tgccccgtct gcacatctcc ggttgcggca agcgcaaggt caagatcgac 360
atcaccaccg tgggccgttc cggttccccc atcctgcccc ccatctccac cccccagaac 420
tccactggtg gtcgtggtat catcgctggc ggtgtcgagg ctaagatcgg tgcttggccc 480
tggatggctg ctgtgttcgt gaagaacttc ggtatcggtc gcttccactg cgctggttcc 540
atcatctcca acaagtacat cctgtccgct gctcacgctt tcctcatcgg tggtcgcaag 600
ctgaccccca cccgtctggc tgtgcgtgtg ggtggtcact acatcaagcg tggccaggag 660
taccccgtca aggacgtgat catccacccc cactacgtgg agaaggagaa ctacaacgac 720
atcgccatca tcgagctgaa ggaggagctg aacttcaccg acctggtcaa ccccatctgc 780
ctgcccgacc ccgagactgt gaccgaccct ctgaaggacc gtatcgtgac cgctgctggc 840
tggggcgacc tggacttctc cggtccccgt tcccaggtgc tgcgtgaggt gtccatcccc 900
gtggtgcccg tggacaagtg cgaccaggct tacgagaagc tgaacacccc ctccctgaag 960
aacggtatta ccaacaactt cctctgcgcc ggactcgagg agggtggcaa ggacgcttgc 1020
cagggcgact ccggtggtcc cctgatgctg gtcaacaaca cccgttggat cgtcgtgggt 1080
gtcgtgtcct tcggtcacaa gtgcgctgag gagggttacc ccggcgtcta ctcccgtgtg 1140
gcttcctacc tggactggat cgctaaggtc accaactccc tggaccacgc tgtcaccaac 1200
taa 1203
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(4)
<223> 肽
<400> 10
Ile Glu Gly Arg
1

Claims (13)

1.一种测定待测试样中的内毒素的方法，所述方法包括：
将包括鲎的因子C蛋白的测定剂与待测试样混合的工序，所述鲎的因子C蛋白，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C蛋白相比，具有较多的(α-2,3)键的末端唾液酸；及
测定级联反应的进行的工序，
其中，所述待测试样含有钠离子，和
所述待测试样中的钠离子的含量是来自该待测试样的钠离子的浓度以将该待测试样与所述测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到20mM以上的量；
其中，鲎的因子C蛋白在中国仓鼠的细胞或人的细胞中被表达；和
其中所述中国仓鼠的细胞为CHO，所述人的细胞为HEK293。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述待测试样中的钠离子的含量是来自该待测试样的钠离子的浓度以将该待测试样与所述测定剂混合后的反应体系中的终浓度计达到50mM以上的量。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，该待测试样与所述测定剂混合后的反应体系中的氯化钠终浓度为77mM以上。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在中国仓鼠的细胞或人的细胞中被表达的所述鲎的因子C蛋白在用怀槐凝集素进行凝集素印迹时，与天然因子C蛋白和/或将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C蛋白相比显示出较高的反应性。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在中国仓鼠的细胞或人的细胞中被表达的所述鲎的因子C蛋白在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为115kDa～140kDa。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，在中国仓鼠的细胞或人的细胞中被表达的所述鲎的因子C蛋白在非还原SDS-PAGE中测定的分子量为127kDa±5kDa。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在中国仓鼠的细胞或人的细胞中被表达的所述鲎的因子C蛋白为下述(A)、(B)、(C)、或(D)所示的蛋白质：
(A)包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质；
(B)相对于序列号2具有90％以上的同源性或同一性、且具有因子C蛋白的活性的蛋白质；
(C)包含序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质；
(D)包含相对于序列号4具有90％以上的同源性或同一性、且具有因子C蛋白的活性的蛋白质。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在中国仓鼠的细胞或人的细胞中被表达的所述鲎的因子C蛋白为水溶性。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述中国仓鼠的细胞为CHO DG44。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述待测试样为注射剂。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括将用于检测级联反应的进行的底物添加至反应体系的工序。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括计算出待测试样中的内毒素量的工序。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其中在中国仓鼠的细胞或人的细胞中被表达的所述鲎的因子C蛋白与天然因子C蛋白相比具有较多的(α-2,3)键的末端唾液酸。
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