ES2738593T3 - Factor C recombinante novedoso y método para producir el mismo, y método para medir endotoxina - Google Patents

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Abstract

Un Factor C de cangrejo herradura que tiene actividad de Factor C, que contiene ácido siálico terminal unido (α-2,3) en una mayor cantidad, en comparación con un Factor C nativo y un Factor C de cangrejo herradura expresado en Sf9 como célula hospedadora, la cual se prepara utilizando células CHO DG44 como célula hospedadora y que presenta una actividad residual del 10% o superior en presencia de citrato sódico 21 mM, en donde la actividad del Factor C es una actividad en la que el Factor C se activa en presencia de endotoxina para convertir el Factor B en Factor B activado.

Description

DESCRIPCIÓN
Factor C recombinante novedoso y método para producir el mismo, y método para medir endotoxina
La presente invención se refiere a un Factor C recombinante novedoso, a un método para producir el Factor C recombinante y a un método para medir endotoxina.
La endotoxina es un lipopolisacárido que está presente en la membrana externa de las bacterias Gram negativas y es conocido como un pirógeno fuerte. Además, se sabe que incluso una cantidad muy pequeña de endotoxina provoca varios estados patológicos a través de una infección bacteriana. Tales estados incluyen no solo fiebre, sino que liberan también una citocina inflamatoria concomitante con la activación de macrófagos, inducción de shock endotóxico y similares. Por lo tanto, es esencial la detección de endotoxina en productos farmacéuticos tales como un inyectable, agua, dispositivos médicos y similares. Por otro lado, la endotoxina es considerada como una causa principal de shock implicado en una infección con bacterias Gram negativas. Por lo tanto, se puede determinar la presencia de infección y un efecto terapéutico a través de un análisis de endotoxina en sangre.
Por otra parte, se sabe que el cangrejo herradura americano (Limulus polyphemus) experimenta coagulación sanguínea cuando se le infecta con una bacteria Gram negativa. Este fenómeno se ha empleado tradicionalmente para la detección de endotoxina.
Específicamente, se conoce un método para medir endotoxina utilizando un extracto de hematocito de un cangrejo herradura (es decir, un lisado de amebocitos de un cangrejo herradura, en adelante también referido como un lisado, para simplificar) (véase, por ejemplo, el documento no de patente 1). Este método se conoce como una "prueba de limulus", que utiliza una reacción en cascada de diversas proteínas presentes en el lisado, teniendo lugar dicha reacción a través del contacto entre endotoxina y el lisado. La Fig. 1 muestra el esquema de la reacción en cascada.
Cuando la endotoxina entra en contacto con el lisado, el Factor C, que es un zimógeno de serina proteasa presente en el lisado, se activa para formar así el Factor C activado. El Factor C activado así formado activa el Factor B presente en el lisado, para formar así el Factor B activado. El Factor B activado así formado activa la enzima procoagulante presente en el lisado, para así formar una enzima de coagulación correspondiente.
La enzima de coagulación hidroliza un sitio específico de una molécula de coagulógeno presente en el lisado, de este modo se forma un gel de coagulina y así el lisado se coagula. Por lo tanto, se puede medir la endotoxina midiendo la reacción de coagulación del lisado.
Como alternativa, se puede medir endotoxina también mediante una reacción de coloración entre la enzima de coagulación y un sustrato sintético. Por ejemplo, la enzima de coagulación actúa sobre t-butoxicarbonil-leucil-glicilarginil-pNA (Boc-Leu-Gly-Arg-pNA), que es un sustrato sintético, para hidrolizar los enlaces amino del mismo y de este mode se libera pNA. Por lo tanto, cuando el sustrato sintético se ha añadido al sistema de reacción, la endotoxina se puede medir mediante la medición de la absorbancia (a 405 nm) de la sustancia colorante (pNA).
Además, se sabe que un sistema de reacción en cascada se puede reconstituir utilizando el Factor C, el Factor B y una enzima procoagulante, que se purifican a partir de un lisado del cangrejo herradura japonés (documento no de patente 2).
Sin embargo, para utilizar tal lisado, o Factor C, Factor B y enzima procoagulante purificados del lisado, se deben capturar cangrejos herradura y recoger su sangre. Por lo tanto, desde el punto de vista de la protección de los recursos biológicos, es difícil encontrar suministro de tales ingredientes de forma inagotable. En tales circunstancias, se demanda una técnica que pueda producir estos ingredientes mediante ingeniería genética, para así reconstituir un sistema de reacción en cascada.
Por ejemplo, se conoce un caso en el que se expresan Factor C, Factor B y enzima procoagulante en células de insecto como células hospedadoras, para de este modo reconstituir un sistema de reacción en cascada (documentos de patente 1 y 2). Sin embargo, se ha señalado que, dado que el sistema reconstituido contiene cloruro sódico, sulfato de magnesio o cloruro cálcico en el sistema de reacción, se suprime la reacción en cascada (documento de patente 1).
Como alternativa, se conoce un caso que utiliza células de mamífero como células hospedadoras, en donde el Factor C derivado del cangrejo herradura singapurense (Carcinoscorpius rotundicauda) se expresa en COS-1, que es una línea celular derivada de células de riñón de mono verde africano, como células hospedadoras. Sin embargo, se ha señalado que cuando se utilizaba COS-1 como hospedador, el Factor C expresado era insoluble (documentos de no patente 3 y 4). Es decir, no se conoce un caso donde el Factor C funcional se produzca utilizando células de mamífero como células hospedadoras.
En este contexto, la patente de Estados Unidos n°. 5.858.706 describe el Factor C recombinante y métodos para producirlo. Además, Nakamura et al. (Nakamura, T. et al.; Eur. J., Biochem., 154; 1986; pp. 551-521) describe el Factor C derivado de hemocitos de Limulus sp. Además, Dwarakanath et al. (Dwarakanath, R. S. et al.; Biotechnology Letters, 19(4); 1997; pp. 357-361) describe células recombinantes COS-1 que expresan el Factor C de Carcinoscorpius rotundicauda.
Documentos de patente
Documento de patente 1: WO 2008/004674, panfleto
Documento de patente 2: WO 2012/118226, panfleto
Documentos no de patente
Documento no de patente 1: Iwanaga S., Curr. Opin. Immunol. Feb; 5(1): 74-82 (1993)
Documento no de patente 2: Nakamura T,, et al., J, Biochem. Mar; 99(3): 847-57 (1986)
Documento no de patente 3: Roopashree S. Dwarakanath, et al., Biotechnology letters 19(4): 357-361 (1997) Documento no de patente 4: Jing Wang, Bow Ho y Jeak L. Ding, Biotechnology letters 23: 71-76 (2001) Un objetivo de la presente invención es proporcionar un Factor C recombinante novedoso de cangrejo herradura y un método para producir el Factor C recombinante.
Por otra parte, los inyectables a administrar in vivo generalmente contienen diversas sales (iones). En la producción de tales inyectables, es obligatoria la detección de endotoxina por la farmacopea del país correspondiente. En tales circunstancias, en un aspecto, otro objetivo de la presente invención es proporcionar un sistema de reacción en cascada reconstituido que no sea susceptible de inhibición de la reacción incluso en la presencia de una sal (ion). Los presentes inventores han encontrado que se puede producir un Factor C recombinante de cangrejo herradura utilizando células humanas o células de hámster chino como células hospedadoras y que se puede medir endotoxina utilizando el Factor C recombinante así producido mientras se mitiga la inhibición de la reacción en presencia de una sal (ion). La presente invención se ha conseguido basándose en estos hallazgos.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a los siguientes puntos:
1. Un Factor C de cangrejo herradura que tiene actividad de Factor C, que contiene ácido siálico terminal unido (a-2,3) en una mayor cantidad, en comparación con un Factor C nativo y un Factor C de cangrejo herradura expresado en Sf9 como célula hospedadora, la cual se prepara utilizando células CHO DG44 como célula hospedadora y que presenta una actividad residual del 10% o superior en presencia de citrato sódico 21 mM, en donde la actividad del Factor C es una actividad en la que el Factor C se activa en presencia de endotoxina para convertir el Factor B en Factor B activado.
2. El Factor C de acuerdo con el punto 1, que tiene un peso molecular de 115 kDa a 140 kDa o un peso molecular de 127 kDa ± 5 kDa, medido mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) en una condición no reductora.
3. El Factor C de acuerdo con el punto 1 o el punto 2, que es una proteína mostrada en la siguiente (A), (B), (C) o (D): (A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2;
(B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 pero que incluye sustitución, eliminación, inserción o adición de uno o varios restos de aminoácido y que tiene actividad de Factor C; (C) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4;
(D) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 pero que incluye sustitución, eliminación, inserción o adición de uno o varios restos de aminoácido y que tiene actividad de Factor C.
4. El Factor C de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 3, que es hidrosoluble.
5. Un método para producir un Factor C de cangrejo herradura que tiene actividad de Factor C de acuerdo con el punto 1, comprendiendo el método expresar el Factor C de cangrejo herradura en una célula CHO DG44 como célula hospedadora, en donde la actividad del Factor C es una actividad en la que el Factor C se activa en presencia de endotoxina para convertir el Factor B en Factor B activado.
6. El método de acuerdo con el punto 5, en donde el Factor C es una proteína mostrada en la siguiente (A), (B), (C) o (D): (A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2;
(B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 pero que incluye sustitución, eliminación, inserción o adición de uno o varios restos de aminoácido y que tiene actividad de Factor C; (C) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4;
(D) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 pero que incluye sustitución, eliminación, inserción o adición de uno o varios restos de aminoácido y que tiene actividad de Factor C.
7. Un agente de ensayo de endotoxina que contiene el Factor C de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 4.
8. Un kit de ensayo de endotoxina que comprende el agente de ensayo de acuerdo con el punto 7.
9. Un método para medir endotoxina en un espécimen de prueba, comprendiendo el método una etapa de mezcla del agente de ensayo de acuerdo con el punto 7 y el espécimen de prueba y una etapa de medición del progreso de una reacción en cascada.
10. El método de acuerdo con el punto 9, en donde el espécimen de prueba contiene al menos uno de:
(A) un ion;
(B) un catión;
(C) un ion metálico;
(D) un ion metálico alcalino o un ion metálico alcalinotérreo; y
(E) uno o más tipos de iones seleccionados del grupo consistente en ion de sodio, ion de potasio, ion de calcio e ion de magnesio.
11. El método de acuerdo con el punto 10, en donde la cantidad de ion que contiene el espécimen de prueba es tal cantidad que la concentración del catión derivada del espécimen de prueba se vuelve 1 mM o más elevada, como concentración final en el sistema de reacción después de mezclar el espécimen de prueba con el agente de ensayo.
12. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 9 a 11, en donde el espécimen de prueba es un inyectable. Las figuras muestran:
[Fig. 1] Un diagrama que muestra un sistema de reacción en cascada de la prueba de limulus.
[Fig. 2] Una fotografía que muestra los resultados de una transferencia de Western de cuatro tipos de Factor C (Sf9, CHO, HEK y TAL) derivados del cangrejo herradura japonés (Tachypleus tridentatus), en condiciones no reductoras.
[Fig. 3] Una fotografía (SDS-PAGE) que muestra el peso molecular de un Factor C nativo (TAL) derivado del cangrejo herradura japonés (Tachypleus tridentatus) y de un Factor C recombinante (CHO).
[Fig. 4] Un esquema de la medición de la actividad del Factor C.
[Fig. 5] Un diagrama que muestra un sistema de reacción en cascada reconstituido.
[Fig. 6] Una tabla y un gráfico que muestra la actividad de los cuatro tipos de Factor C (Sf9, CHO, HEK y TAL) derivados del cangrejo herradura japonés (Tachypleus tridentatus).
[Fig. 7] Una tabla y un gráfico que muestra la actividad de inhibición por inyectables de los cuatro tipos de Factor C (Sf9, CHO, HEK y TAL) derivados del cangrejo herradura japonés (Tachypleus tridentatus).
[Fig. 8] Alineamiento del Factor C de Tachypleus tridentatus (TtFC) y el Factor C de Carcinoscorpius rotundicauda (834CrID4) (continúa en la Fig. 9). Están subrayadas las secuencias consenso que pueden experimentar una modificación de la cadena de azúcar de tipo N (cadena de azúcar ligada a N).
[Fig. 9] Alineamiento del Factor C de Tachypleus tridentatus (TtFC) y el Factor C of Carcinoscorpius rotundicauda (834CrID4) (continúa de la Fig. 8). Están subrayadas las secuencias consenso que pueden experimentar una modificación de la cadena de azúcar de tipo N (cadena de azúcar ligada a N).
[Fig. 10] Una representación esquemática de sitios de reacción entre el Factor C y anticuerpos específicos en condiciones reductoras y no reductoras.
[Fig. 11] Una fotografía (SDS-PAGE) que muestra el peso molecular de los cuatro tipos de Factor C purificados derivados del cangrejo herradura japonés (Tachypleus tridentatus).
[Fig. 12] Una fotografía (transferencia de Western) que muestra el peso molecular de los cuatro tipos de Factor C purificado derivados del cangrejo herradura japonés (Tachypleus tridentatus).
[Fig. 13] Una fotografía (transferencia de Western) que muestra los resultados de la eliminación de la cadena de azúcar de tipo N, por glicopeptidasa F, de los cuatro tipos de Factor C purificado derivados del cangrejo herradura japonés (Tachypleus tridentatus).
[Fig. 14] (a) Una fotografía (transferencia de lectinas) que muestra los resultados de la detección de la cadena de azúcar de tipo N de los cuatro tipos de Factor C purificado derivados del cangrejo herradura japonés (Tachypleus tridentatus); (b) una tabla que muestra la especificidad de unión de la lectina; y (c) una representación esquemática de estructuras de cadena de azúcar de tipo N de un Factor C recombinante, asumidos por los resultados experimentales e informes de documentos.
(1) Factor C
El Factor C descrito en la presente memoria es un Factor C derivado de un cangrejo herradura. El Factor C descrito en la presente memoria es una proteína recombinante. La expresión "proteína recombinante" se refiere a una proteína obtenida mediante la introducción de un gen que codifica la proteína en una célula hospedadora y la expresión heteróloga del gen. El Factor C descrito en la presente memoria tiene actividad de Factor C.
Los ejemplos de cangrejo herradura incluyen Tachypleus tridentatus (cangrejo herradura japonés), Limulus polyphemus (cangrejo herradura americano), Carcinoscorpius rotundicauda (cangrejo herradura (singapurense) del sudeste asiático) y Tachypleus gigas (cangrejo herradura del sudeste asiático). Entre ellos, son preferibles Tachypleus tridentatus (cangrejo herradura japonés) y Carcinoscorpius rotundicauda (cangrejo herradura (singapurense) del sudeste asiático) como una fuente de Factor C. Además, entre ellos, es más preferible Tachypleus tridentatus (cangrejo herradura japonés) como fuente de Factor C. La secuencia de aminoácidos del Factor C derivado de Tachypleus tridentatus se muestra en la SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótidos de un gen que codifica el Factor C derivado de Tachypleus tridentatus se muestra en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos del Factor C derivado de Carcinoscorpius rotundicauda se muestra en la SEQ ID NO: 4. La secuencia de nucleótidos de un gen que codifica el Factor C derivado de Carcinoscorpius rotundicauda se muestra en la SEQ ID NO: 3.
El Factor C descrito en la presente memoria puede experimentar una modificación de la cadena de azúcar de tipo N (cadena de azúcar ligada a N). La expresión "cadena de azúcar de tipo N" se refiere a una cadena de azúcar que está unida a un resto de asparagina de una proteína. En el Factor C derivado de Tachypleus tridentatus y el Factor C derivado de Carcinoscorpius rotundicauda, se conservan los restos de aminoácido que pueden experimentar una modificación de la cadena de azúcar de tipo N. Las Figs. 8 y 9 muestran los alineamientos y secuencias consenso (Asn-Xaa-Ser/Thr, en donde Xaa representa cualquier resto de aminoácido) que puede experimentar una modificación de la cadena de azúcar de tipo N de ambos tipos de Factor C. Por lo tanto, en particular, se piensa que el Factor C derivado de Carcinoscorpius rotundicauda es un Factor C tan adecuado como el Factor C derivado de Tachypleus tridentatus.
El Factor C descrito en la presente memoria puede contener un ácido siálico. Los ejemplos de ácido siálico incluyen el ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y el ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc). La expresión "que contiene un ácido siálico" se refiere al estado en el que un ácido siálico está unido al Factor C descrito en la presente memoria. El ácido siálico puede estar unido a Factor C directa o indirectamente. En un caso, una cadena de azúcar que contiene un ácido siálico puede estar unida a Factor C, con lo que el ácido siálico puede estar indirectamente unido a Factor C. El ácido siálico puede ser, por ejemplo, un ácido siálico unido (a-2,3), más específicamente, un ácido siálico terminal unido (a-2,3). El término "ácido siálico unido (a-2,3)" se refiere a un ácido siálico unido a un azúcar a través de enlace glucosídico (a-2,3). El término "ácido siálico terminal unido (a-2,3)" se refiere a un ácido siálico que está unido a un azúcar a través de enlace glucosídico (a-2,3) y que se encuentra en un extremo de la cadena de azúcar. Un ejemplo de la cadena de azúcar es una cadena de azúcar de tipo N (cadena de azúcar ligada a N). Se puede añadir ácido siálico a Factor C a través de, por ejemplo, expresión de Factor C en una célula hospedadora que puede añadir una cadena de azúcar que contenga ácido siálico a una proteína a través de modificación después de traducción. Entre los ejemplos de tal célula hospedadora se incluyen células de mamífero. Se puede detectar ácido siálico a través de, por ejemplo, análisis de cadena de azúcar. El análisis de cadena de azúcar puede llevarse a cabo a través de una técnica conocida. Por ejemplo, el análisis de cadena de azúcar puede llevarse a cabo utilizando lectina o un anticuerpo que reconoce una cadena de azúcar. Específicamente, por ejemplo, un ácido siálico terminal unido (a-2,3) puede detectarse específicamente a través de transferencia de lectinas utilizando aglutinina de Maackia amurensis (MAM).
El Factor C descrito en la presente memoria puede contener ácido siálico en una cantidad mayor, en comparación con un Factor C control. La expresión "que contiene ácido siálico en una cantidad mayor, en comparación con un Factor C control" se refiere al estado en el que la cantidad de ácido siálico unido al Factor C descrito en la presente memoria es mayor que la cantidad de ácido siálico unido al Factor C control, en términos de la cantidad por mol de ácido siálico por molécula de Factor C. Por ejemplo, la cantidad de ácido siálico unido al Factor C descrito en la presente memoria puede ser 1,1 veces o mayor, 1,2 veces o mayor, 1,3 veces o mayor, 1,5 veces o mayor, 2,0 veces o mayor, 2,5 veces o mayor, o 3,0 veces o mayor que la cantidad de ácido siálico unido al Factor C control, en términos de la cantidad por mol de ácido siálico por molécula de Factor C.
Entre los ejemplos de Factor C control se incluyen un Factor C recombinante expresado en la célula de insecto Sf9 y un Factor C nativo. La expresión "Factor C expresado en Sf9 como célula hospedadora" se refiere a Factor C obtenible a través de la expresión de un gen que codifica Factor C que consiste en la misma secuencia de aminoácidos que la del Factor C descrito en la presente memoria, en Sf9 como célula hospedadora. La expresión "Factor C nativo" se refiere a Factor C aislado y purificado de un lisado de cangrejo herradura. El Factor C nativo puede ser Factor C aislado y purificado de un lisado de un cangrejo herradura del cual se deriva el Factor C descrito en la presente memoria. Es decir, específicamente, por ejemplo, cuando el Factor C descrito en la presente memoria es un Factor C recombinante de Tachypleus tridentatus o una variante del mismo, el Factor C nativo puede ser Factor C aislado y purificado de un lisado de Tachypleus tridentatus.
Si "el Factor C descrito en la presente memoria contiene ácido siálico en una cantidad mayor, en comparación con un Factor C control" o no, puede determinarse a través de la comparación entre la cantidad de ácido siálico del Factor C descrito en la presente memoria y la del Factor C control. La cantidad de ácido siálico puede determinarse mediante, por ejemplo, análisis de cadena de azúcar. El análisis de cadena de azúcar puede llevarse a cabo a través de una técnica conocida. Por ejemplo, el análisis de cadena de azúcar puede llevarse a cabo utilizando lectina o un anticuerpo que reconoce una cadena de azúcar. Específicamente, por ejemplo, un ácido siálico terminal ligado a (a-2,3) puede cuantificarse específicamente a través de transferencia de lectinas utilizando aglutinina de Maackia amurensis (MAM).
Puede confirmarse que cuanto más elevada es la reactividad en la transferencia de lectinas utilizando MAM, mayor es la cantidad de ácido siálico terminal unido (a-2,3), es decir, mayor es la cantidad de ácido siálico terminal unido (a-2,3) que contiene el Factor C. En otras palabras, el Factor C descrito en la presente memoria puede presentar reactividad más elevada, en comparación con el Factor C control, en la transferencia de lectinas utilizando MAM. La expresión "presentan reactividad más elevada, en comparación con el Factor C control, en la transferencia de lectinas utilizando MAM" se refiere a la afirmación de que, cuando la misma cantidad del Factor C descrito en la presente memoria y el Factor C control se someten a transferencia de lectinas utilizando MAM, la intensidad de detección (tal como el grado de coloración) de la mancha atribuida al Factor C descrito en la presente memoria es más elevada que la de la mancha atribuida al Factor C control.
El Factor C descrito en la presente memoria puede no tener una etiqueta His-tag añadida en el extremo C terminal.
Asimismo, el Factor C descrito en la presente memoria puede no tener una etiqueta V5-tag añadida en el extremo C terminal. Asimismo, el Factor C descrito en la presente memoria puede no tener un péptido añadido en el extremo C terminal. Asimismo, el Factor C descrito en la presente memoria puede no tener un péptido añadido en el extremo N terminal. Asimismo, el Factor C descrito en la presente memoria puede no tener un péptido añadido en ninguno de los extremos N-terminal y C-terminal,
Siempre que el Factor C descrito en la presente memoria tenga actividad de Factor C, el Factor C puede ser una variante de cualquiera de las proteínas de Factor C de los cangrejos herradura mencionados anteriormente (p. ej. una proteína que tenga una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o 4). Tal variante incluye, por ejemplo, un homólogo y un producto modificado artificialmente del Factor C anteriormente mencionado. En particular, la secuencia de aminoácidos de la variante no se encuentra necesariamente en un cangrejo herradura real. Es decir, el Factor C "de un cangrejo herradura o derivado de un cangrejo herradura" incluye una variante del Factor C encontrado en un cangrejo herradura y tiene una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en ningún cangrejo herradura.
La actividad del Factor C se refiere a una actividad tal que el Factor C se activa en presencia de endotoxina para convertir el Factor B en Factor B activado. Si "el Factor C descrito en la presente memoria tiene actividad de Factor C" puede confirmarse, por ejemplo, combinando el Factor C descrito en la presente memoria con un Factor B adecuado y una enzima procoagulante adecuada en presencia de endotoxina y detectando el progreso de la reacción en cascada. Específicamente, la proteína de la SEQ ID NO: 6 y la proteína de la SEQ ID NO: 8 pueden utilizarse como un Factor B adecuado y una enzima procoagulante adecuada, respectivamente. El progreso de la reacción en cascada puede determinarse utilizando el sustrato para detección mencionado más adelante.
Siempre que el Factor C descrito en la presente memoria tenga actividad de Factor C, el Factor C descrito en la presente memoria puede ser una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del Factor C anteriormente mencionada tal como la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o 4, pero que incluye sustitución, eliminación, inserción o adición de uno o más restos de aminoácido. Aunque el significado de la expresión "uno o varios" varía dependiendo de las posiciones de los restos de aminoácido en la estructura tridimensional de la proteína y de los tipos de los restos de aminoácido, el término se refiere específicamente a preferiblemente 1 a 20, más preferiblemente 1 a 10, todavía más preferiblemente 1 a 5, en particular preferiblemente 1 a 3. La sustitución, eliminación, inserción o adición de uno o más restos de aminoácido es una variación conservadora en donde la función de la proteína se mantiene apropiadamente. Una variación conservadora típica es la sustitución. La sustitución conservadora es una variación entre Phe, Trp y Tyr, en el caso en donde la sustitución tiene lugar en un resto de aminoácido aromático; una variación entre Leu, Ile y Val, en el caso en donde la sustitución tiene lugar en un resto de aminoácido hidrofóbico; una variación entre Gln y Asn, en el caso en donde la sustitución tiene lugar en un resto de aminoácido polar; una variación entre Lys, Arg y His, en el caso en donde la sustitución tiene lugar en un resto de aminoácido básico; una variación entre Asp y Glu, en el caso en donde la sustitución tiene lugar en un resto de aminoácido ácido; o una variación entre Ser y Thr, en el caso en donde la sustitución tiene lugar en un resto de aminoácido que tiene un grupo hidroxilo. Entre los ejemplos de la sustitución que pueden ser reconocidos como de sustitución conservadora se incluyen una sustitución de Ala por Ser o Thr; una sustitución de Arg por Gln, His o Lys; una sustitución de Asn por Glu, Gln, Lys, His o Asp; una sustitución de Asp por Asn, Glu o Gln; una sustitución de Cys por Ser o Ala; una sustitución de Gln por Asn, Glu, Lys, His, Asp o Arg; una sustitución de Gln por Gly, Asn, Gln, Lys o Asp; una sustitución de Gly por Pro; una sustitución de His por Asn, Lys, Gln, Arg o Tyr; una sustitución de Ile por Leu, Met, Val o Phe; una sustitución de Leu por Ile, Met, Val o Phe; una sustitución de Lys por Asn, Glu, Gln, His o Arg; una sustitución de Met por Ile, Leu, Val o Phe; una sustitución de Phe por Trp, Tyr, Met, Ile o Leu; una sustitución de Ser por Thr o Ala; una sustitución de Thr por Ser o Ala; una sustitución de Trp por Phe o Tyr; una sustitución de Tyr por His, Phe o Trp; y una sustitución de Val por Met, Ile o Leu. La sustitución mencionada anteriormente, eliminación, inserción, adición o similar de uno o más restos de aminoácido también incluye variaciones que suceden naturalmente tales como aquellas basadas en diferencias individuales entre cangrejos herradura y la variedad y especie de los cangrejos herradura, de los que se deriva el gen.
El Factor C descrito en la presente memoria puede también ser una proteína que tiene una homología o identidad del 80% o superior, preferiblemente del 90 % o superior, más preferiblemente del 95 % o superior, aún más preferiblemente del 97 % o superior, en particular preferiblemente del 99% o superior con respecto a la secuencia completa de aminoácidos del Factor C (p. ej., la secuencia completa de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 2 o 4) y que tiene actividad de Factor C.
El gen que codifica el Factor C descrito en la presente memoria no está especialmente limitado, siempre que el gen codifique el Factor C mencionado anteriormente. El gen que codifica el Factor C descrito en la presente memoria puede ser un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de Factor C, en donde el fragmento de ADN está hibridado con una sonda preparada a partir de una secuencia génica conocida, p. ej., con la secuencia complementaria a la totalidad o a una parte de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o 3, en condiciones restrictivas. Como se emplea en esta memoria, la expresión "condiciones restrictivas" generalmente se refiere a las condiciones bajo las cuales se forma un híbrido específico, pero no se forma un híbrido no específico. Un ejemplo de tales condiciones son las condiciones en las que ADN que tienen una elevada homología, p. ej., una homología del 80 % o más elevada, preferiblemente del 90 % o superior, más preferiblemente del 95 % o superior, aún más preferiblemente del 97 % o superior, en particular preferiblemente del 99 % o más elevada, se hibridan entre sí y ADN que tienen una homología inferior que el nivel anterior no se hibridan entre sí. Otro ejemplo de las condiciones son las condiciones empleadas generalmente en el lavado de la hibridación Southern; es decir, lavado una vez, preferiblemente de 2 a 3 veces, a temperatura y concentración salina correspondientes a 60 °C, SSC 1*, SDS 0,1 %, preferiblemente 60 °C, SSC 0,1*, SDS 0,1 %, más preferiblemente 68 °C, SSC 0,1*, SDS 0,1 %.
En el gen que codifica el Factor C descrito en la presente memoria, se puede sustituir cualquier codón por su codón equivalente. Por ejemplo, la combinación de codones del gen que codifica el Factor C descrito en la presente memoria se puede modificar de tal manera que la combinación de codones se optimice para expresión en una célula de mamífero. La optimización puede realizarse mediante el empleo de, por ejemplo, un servicio de contrato convencional. En particular, el gen que codifica el Factor C descrito en la presente memoria puede ser una variante de un ADN en el que la combinación de codones esté optimizada para expresión en una célula de mamífero.
Las descripciones mencionadas acerca de las variantes de genes y proteínas pueden aplicarse también con los cambios debidos al Factor B, la enzima procoagulante y el gen que la codifica.
El Factor C descrito en la presente memoria puede tener un peso molecular de 115 kDa a 140 kDa, de 115 kDa a 130 kDa, de 120 kDa a 130 kDa o de 120 kDa a 128 kDa, medido mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) en una condición no reductora. Asimismo, el Factor C descrito en la presente memoria puede tener un peso molecular de 127 kDa ± 5 kDa, 128 kDa ± 2 kDa, 127 kDa ± 2 kDa, 126 kDa ± 2 kDa o 127 kDa ± 1 kDa, medido mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) en una condición no reductora. Asimismo, el Factor C descrito en la presente memoria puede tener un peso molecular de 128 kDa o 126 kDa, medido mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) en una condición no reductora.
El Factor C descrito en la presente memoria puede tener baja susceptibilidad a la inhibición de actividad por un ion. La expresión "baja susceptibilidad a inhibición de actividad por un ion" se refiere a la afirmación de que el Factor C descrito en la presente memoria presenta una elevada actividad residual en la presencia de un ion, en comparación con un Factor C control. Entre los ejemplos de Factor C control se incluyen un Factor C recombinante expresado en la célula de insecto Sf9 y un Factor C nativo. El significado de la expresión "que presenta una elevada actividad residual" no está especialmente limitado, siempre que la actividad residual del Factor C descrito en la presente memoria sea más elevada que la del Factor C control. La expresión "que presenta una elevada actividad residual" puede referirse, por ejemplo, a la afirmación de que la actividad residual del Factor C descrito en la presente memoria es 1,1 veces o más, 1,2 veces o más, 1,3 veces o más, 1,5 veces o más, 2,0 veces o más, 2,5 veces o más o 3,0 veces o más veces mayor que la actividad residual del Factor C control. Entre los ejemplos específicos de "baja susceptibilidad a inhibición de actividad por un ion" se incluye la propiedad de que el Factor C descrito en la presente memoria presenta una actividad residual más elevada en presencia de citrato sódico 21 mM, en comparación con el Factor C control; la propiedad de que el Factor C descrito en la presente memoria presenta una actividad residual más elevada en presencia de hidrogenocarbonato de sodio 52 mM, en comparación con el Factor C control; la propiedad de que el Factor C descrito en la presente memoria presenta una actividad residual más elevada en presencia de cloruro sódico 214 mM, en comparación con el Factor C control; la propiedad de que el Factor C descrito en la presente memoria muestra una actividad residual más elevada en presencia de sulfato de magnesio 16 mM, en comparación con el Factor C control; la propiedad de que el Factor C descrito en la presente memoria presenta una actividad residual más elevada en presencia de cloruro cálcico 2.5 mM, en comparación con el Factor C control. Entre los ejemplos específicos de "baja susceptibilidad a inhibición de actividad por un ion" adicionalmente se incluye la propiedad de que el Factor C descrito en la presente memoria presenta una actividad residual del 10 % o más elevada o del 20 % o más elevada en presencia de citrato sódico 21 mM, en comparación con el Factor C control; la propiedad de que el Factor C descrito en la presente memoria presenta una actividad residual del 25 % o más elevada o del 35 % o más elevada en presencia de hidrogenocarbonato de sodio 52 mM, en comparación con el Factor C control; la propiedad de que el Factor C descrito en la presente memoria presenta una actividad residual del 25 % o más elevada o del 35 % o más elevada en presencia de cloruro sódico 214 mM, en comparación con el Factor C control; la propiedad de que el Factor C descrito en la presente memoria presenta una actividad residual del 15 % o más elevada o del 25 % o más elevada en presencia de sulfato de magnesio 16 mM, en comparación con el Factor C control; la propiedad de que el Factor C descrito en la presente memoria presenta una actividad residual del 35 % o más elevada o del 45 % o más elevada en presencia de cloruro cálcico 2,5 mM, en comparación con el Factor C control. El Factor C descrito en la presente memoria puede tener una cualquiera de las propiedades anteriores por separado o dos o más de las propiedades anteriores combinadas. La "actividad residual" se define como una reactividad relativa (%) observada para un espécimen de medición (concentración de endotoxina: 0,05 EU/ml) preparado añadiendo endotoxina a un espécimen de prueba que contiene iones, con respecto a la reactividad observada para otro espécimen de medición (concentración de endotoxina: 0,05 EU/ml) preparado añadiendo endotoxina a agua inyectable como 100 %, en el sistema de ensayo mostrado en la Fig. 4.
El Factor C descrito en la presente memoria puede ser soluble en agua. Como se emplea en esta memoria, la expresión "soluble en agua" se refiere a la afirmación de que, cuando el Factor C descrito en la presente memoria se expresa en una célula hospedadora adecuada, el Factor C así expresado se detecta en una fracción soluble. La expresión "detectado en una fracción soluble" puede referirse a la afirmación de que el 20 %, el 50 % o más, el 80 % o más, el 90 % o más, o el 95 % o más del Factor C expresado se detecta en una fracción soluble.
(2) Método para producir Factor C
El Factor C descrito en la presente memoria puede producirse mediante, por ejemplo, expresión en una célula de mamífero como un hospedador. Es decir, en la presente memoria se describe un método para producir un Factor C de cangrejo herradura, comprendiendo el método expresar el Factor C de cangrejo herradura en una célula de mamífero como célula hospedadora. El Factor C producible mediante el método de producción descrito en la presente memoria es una realización del Factor C descrito en la presente memoria.
La célula de mamífero no está especialmente limitada, siempre que la célula pueda expresar funcionalmente un Factor C de cangrejo herradura. El término "expresión funcional" se refiere a la afirmación de que el Factor C expresado presenta actividad de Factor C. Específicamente, la célula de mamífero puede ser una célula distinta de una célula COS-1. La célula de mamífero es preferiblemente una célula de un mamífero seleccionada del grupo consistente en un roedor y un primate. Entre los ejemplos de roedor se incluyen, pero no se limitan necesariamente a hámster chino, hámster, ratón, rata y conejillo de Indias. De estos, es preferible el hámster chino. Entre los ejemplos de célula de hámster chino se incluye la línea celular de ovario de hámster chino (CHO). Entre los ejemplos de CHO se incluyen CHO DG44 y CHO K1. Entre los ejemplos de primate se incluyen, pero no se limitan necesariamente a ser humano, mono y chimpancé. El primate puede ser un primate distinto del mono. De estos, es preferible el ser humano. Entre los ejemplos de célula humana se incluye la línea celular de riñón humano embrionario (HEK). Entre los ejemplos de HEK se incluye HEK293.
Cuando la célula de mamífero retiene un gen que codifica el Factor C, la célula puede expresar Factor C. El gen que codifica el Factor C puede estar retenido en la célula de mamífero, de tal manera que puede expresarse bajo el control de un promotor que funciona en la célula. En la célula de mamífero, el gen que codifica el Factor C, por ejemplo, puede estar presente en un vector tal como un plásmido que experimenta replicación autónoma fuera de un cromosoma o puede introducirse en un cromosoma. La técnica de introducción del gen que codifica el Factor C en una célula de mamífero no está especialmente limitada. Entre los ejemplos del vector que experimenta replicación autónoma fuera de un cromosoma se incluye el pCA7 (Makoto Takeda, et al., J., Viol. 79(22): 14346-54 (2005) 5. Como alternativa, el gen que codifica el Factor C puede introducirse en un cromosoma de una célula de mamífero utilizando el vector pCI-Neo (producto de Promega). La célula de mamífero puede retener una copia, o dos o más copias, del gen que codifica el Factor C.
Las condiciones de cultivo en las que se cultiva una célula de mamífero no están especialmente limitadas, siempre que la célula de mamífero pueda proliferar. Se pueden utilizar condiciones generalmente empleadas en el cultivo de células de mamífero, después de haberse realizado modificaciones apropiadas, si fuera necesario. Un medio de cultivo que generalmente se utiliza en cultivo de células de mamífero puede emplearse como medio de cultivo en la presente memoria. Específicamente, puede utilizarse un medio RPMI 1640 (producto de Sigma) o un medio DMEM (producto de Sigma). El cultivo puede realizarse, por ejemplo, como un cultivo estático de 36 °C a 38 °C con alimentación de 5 % CO2.
Si se ha expresado funcionalmente o no el Factor C puede confirmarse midiendo actividad del Factor C. La expresión del Factor C puede también confirmarse midiendo la cantidad de ARNm formado a través de la transcripción de un gen que codifica el Factor C o detectando Factor C a través de transferencia de Western usando un anticuerpo.
El Factor C expresado puede recuperarse como una solución que contiene Factor C y puede utilizarse como un componente del agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria. La solución que contiene Factor C puede ser, por ejemplo, un caldo de cultivo, un sobrenadante de cultivo, un extracto celular alterado, una mezcla de los mismos o similar. El Factor C puede utilizarse después de purificarse hasta un punto deseado o puede utilizarse sin ninguna purificación. Como se describe en la presente memoria, incluso cuando un sobrenadante de cultivo celular que contiene el Factor C expresado se utiliza tal cual sin ninguna purificación, puede alcanzarse un rendimiento de ensayo de endotoxina satisfactorio. La purificación de Factor C puede realizarse a través de, por ejemplo, una técnica de purificación de proteínas conocida. Entre los ejemplos de tales técnicas se incluyen la precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxiapatita y demás. En el caso donde se añade una etiqueta tal como His-tag al Factor C, el Factor C puede se purificar a través de cromatografía de afinidad basada en la afinidad por la etiqueta. Una solución que contiene Factor C puede utilizarse después de haberse filtrado mediante un filtro. Por ejemplo, puede utilizarse como filtro un filtro de 0,22-pm.
(3) Agente de ensayo de endotoxina
El Factor C descrito en la presente memoria puede utilizarse en ensayos de endotoxina. Es decir, En la presente memoria se describe un agente de ensayo de endotoxina que contiene el Factor C descrito en la presente memoria. El agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria puede contener adicionalmente un factor o factores aparte del Factor C, dependiendo de la modalidad de ensayo de endotoxina.
Por ejemplo, el Factor C descrito en la presente memoria puede utilizarse en combinación con Factor B y enzima procoagulante, para ensayo de endotoxina. En otras palabras, una realización del agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria es un agente de ensayo de endotoxina que contiene el Factor C descrito en la presente memoria, Factor B y enzima procoagulante. En este caso, puede medirse endotoxina detectando enzima de coagulación, que es el producto final de la reacción en cascada.
Como alternativa, puede medirse endotoxina detectando una etapa intermedia de la reacción en cascada. En este caso, es suficiente con que el agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria contenga un factor o factores implicados desde el principio de la reacción en cascada hasta la etapa intermedia relevante. Específicamente, por ejemplo, cuando la endotoxina se mide mediante la detección del Factor C activado, que es un intermedio de la reacción en cascada, es suficiente con que el agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria contenga Factor C.
El Factor B descrito en la presente memoria es un Factor B derivado de un cangrejo herradura. La enzima procoagulante descrita en la presente memoria es una enzima procoagulante derivada de un cangrejo herradura. Los ejemplos de cangrejo herradura incluyen Tachypleus tridentatus (cangrejo herradura japonés), Limulus polyphemus (cangrejo herradura americano), Carcinoscorpius rotundicauda (cangrejo herradura (singapurense) del sudeste asiático) y Tachypleus gigas (cangrejo herradura del sudeste asiático). Entre ellos, se prefiere el Tachypleus tridentatus (cangrejo herradura japonés) como fuente de Factor B y de enzima procoagulante.
La secuencia de aminoácidos del Factor B de Tachypleus tridentatus y la de la enzima procoagulante de Tachypleus tridentatus se muestran en la SEQ ID NO: 6 y 8, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de un gen que codifica el Factor B de Tachypleus tridentatus y la de un gen que codifica la enzima procoagulante de Tachypleus tridentatus se muestran en la SEQ ID NO: 5 y 7, respectivamente.
El Factor B descrito en la presente memoria puede ser una variante de cualquiera de las proteínas de Factor B de cangrejo herradura mencionadas anteriormente (p. ej. una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6), siempre que la variante tenga actividad de Factor B. Tal variante incluye, por ejemplo, un homólogo y un producto modificado artificialmente del Factor B mencionado anteriormente. El gen que codifica el Factor B descrito en la presente memoria no está especialmente limitado, siempre que el gen codifique el Factor B mencionado anteriormente. Las descripciones mencionadas anteriormente sobre las variantes de Factor C y el gen que codifica el Factor C pueden también aplicarse con los cambios debidos a las variantes de Factor B y el gen que codifica el Factor B.
La actividad de Factor B se refiere a una actividad tal que el Factor B se activa en presencia del Factor C activado para convertir la enzima procoagulante en la forma activada de la misma, es decir, la correspondiente enzima de coagulación. Si "el Factor B descrito en la presente memoria tiene actividad de Factor B" se puede confirmar, por ejemplo, combinando el Factor B descrito en la presente memoria con un Factor C adecuado y una enzima procoagulante adecuada en presencia de endotoxina y detectando el progreso de la reacción en cascada. Específicamente, la proteína de la SEQ ID NO: 2 y la proteína de la SEQ ID NO: 8 pueden utilizarse como un Factor C adecuado y una enzima procoagulante adecuada, respectivamente. El progreso de la reacción en cascada puede determinarse utilizando el sustrato para detección mencionado más adelante.
La enzima procoagulante descrita en la presente memoria puede ser una variante de cualquiera de las enzimas procoagulantes de cangrejo herradura mencionadas anteriormente (p. ej. una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8), siempre que la variante tenga actividad de enzima procoagulante. Tal variante incluye, por ejemplo, un producto homólogo y modificado artificialmente de la enzima procoagulante mencionada anteriormente. El gen que codifica la enzima procoagulante descrita en la presente memoria no está especialmente limitado, siempre que el gen codifique la enzima procoagulante mencionada anteriormente. Las descripciones mencionadas anteriormente sobre las variantes de Factor C y el gen que codifica el Factor C pueden también aplicarse con los cambios debidos a las variantes de la enzima procoagulante y el gen que codifica enzima procoagulante.
La actividad de la enzima procoagulante es tal que la enzima procoagulante se convierte en la forma activada de la misma, es decir, la correspondiente enzima de coagulación, en presencia de Factor B activado, para reaccionar con el sustrato para detección mencionado más adelante. La actividad de reacción con el sustrato de detección se refiere a, por ejemplo, una actividad de reacción con un coagulógeno para inducir coagulación o una actividad de reacción con el sustrato descrito más adelante representado por X-Y-Z (en donde X representa un grupo de protección, Y representa un péptido y Z representa un colorante unido a Y a través de un enlace amida), para así liberar el colorante Z (p. ej. una actividad de reacción con Boc-Leu-Gly-Arg-pNA, para así liberar pNA). Si "la enzima procoagulante descrita en la presente memoria tiene la actividad de enzima procoagulante" se puede confirmar, por ejemplo, combinando la enzima procoagulante descrita en la presente memoria con un Factor C adecuado y un Factor B adecuado en presencia de endotoxina y detectando el progreso de la reacción en cascada. Específicamente, la proteína de la SEQ ID NO: 2 y la proteína de la SEQ ID NO: 6 pueden utilizarse como un Factor C adecuado y un Factor B adecuado, respectivamente. El progreso de la reacción en cascada puede medirse utilizando el sustrato para detección mencionado más adelante.
Siempre que el Factor B descrito en la presente memoria y la enzima procoagulante descrita en la presente memoria tenga actividad de Factor B y actividad de enzima procoagulante, respectivamente, el Factor B descrito en la presente memoria y/o la enzima procoagulante descritos en la presente memoria pueden tener cualquier péptido o similar añadido al mismo. Entre los ejemplos de tales péptidos se incluyen secuencias de etiquetas tales como His-tag y V5-tag. De forma similar al Factor C descrito en la presente memoria, el Factor B descrito en la presente memoria y/o la enzima procoagulante descrita en la presente memoria pueden no tener etiqueta His-tag añadida al extremo C terminal; pueden no tener una etiqueta V5-tag añadida en el extremo C terminal; pueden no tener un péptido añadido en el extremo C terminal; pueden no tener un péptido añadido en el extremo N terminal; o pueden no tener un péptido añadido en ninguno de los extremos N-terminal y C-terminal.
En el gen que codifica el Factor B descrito en la presente memoria y/o el gen que codifica la enzima procoagulante descrito en la presente memoria, se puede sustituir cualquier codón por su codón equivalente. Por ejemplo, la combinación de codones del gen que codifica el Factor B descrito en la presente memoria y/o el gen que codifica la enzima procoagulante descrita en la presente memoria puede modificarse de tal manera que la combinación de codones se optimice para expresión en una célula hospedadora. Un ejemplo de ADN que codifica el Factor B de SEQ ID NO: 6 y cuya combinación de codones está optimizada para expresión en una célula de insecto es un ADN de SEQ ID NO: 9. En particular, el gen que codifica el Factor B descrito en la presente memoria y/o el gen que codifica la enzima procoagulante descrita en la presente memoria pueden ser una variante de un ADN en la que la combinación de codones esté optimizada para expresión en una célula hospedadora.
El Factor B descrito en la presente memoria y la enzima procoagulante descrita en la presente memoria pueden, cada uno, ser una proteína nativa o una proteína recombinante.
Un Factor B nativo y una enzima procoagulante nativa pueden, cada uno, obtenerse del extracto de hematocito de los diferentes cangrejos herradura mencionados anteriormente. Estos factores se pueden utilizar después de purificarse hasta un punto deseado. La purificación puede realizarse a través de, por ejemplo, una técnica conocida (Nakamura T. et al., J. Biochem. 1986 Mar; 99(3): 847-57).
El Factor B recombinante y la enzima procoagulante recombinante pueden, cada uno, obtenerse a través de expresión en una célula hospedadora. La célula hospedadora no está especialmente limitada, siempre que pueda expresarse un factor de interés. Por ejemplo, puede emplearse una célula hospedadora utilizada generalmente para expresión heteróloga de proteínas. Entre los ejemplos de la célula hospedadora se incluyen células de insecto, células animales, células de plantas, levaduras y bacterias. Entre ellos, una célula eucariota es preferible desde el punto de vista de la modificación después de la traducción. Específicamente, son más preferibles una célula de insecto y una célula animal.
Entre los ejemplos de células animales se incluyen células de mamífero. En el caso en donde se utiliza una célula animal tal como una célula de mamífero, las descripciones anteriores acerca de la producción de Factor C descritas en la presente memoria pueden también aplicarse con los cambios debidos a la producción del Factor B y la enzima procoagulante.
Entre los ejemplos de células de insecto se incluyen Sf9, Sf21, SF+ y High-Five. De estos, es preferible Sf9 como célula de insecto.
La técnica para expresar un factor de interés en una célula de insecto como un hospedador no está especialmente limitada, siempre que pueda expresarse el factor de interés. Por ejemplo, pueden utilizarse adecuadamente técnicas generalmente empleadas para expresión heteróloga de proteínas. Por ejemplo, un factor de interés se puede expresar infectando una célula de insecto con un virus en el cual se ha incorporado un gen que codifica el factor (denominándose la técnica un "método de virus"). Asimismo, por ejemplo, un factor de interés se puede expresar incorporando en una célula de insecto un vector en el cual se ha incorporado un gen que codifica el factor, para incorporar, de este modo, el gen en un cromosoma de la célula hospedadora (la técnica se denomina un "método que expresa una línea celular establemente").
<Método de virus>
El virus empleado en el método de virus no es especialmente limitado, siempre que una línea celular de insecto pueda infectarse con el virus, para así expresar un factor de interés. Puede utilizarse adecuadamente un virus generalmente empleado para expresión de proteínas en células de insecto. Entre los ejemplos de tales virus se incluyen los baculovirus. De los baculovirus son preferibles los nucleopolihedrovirus (NPV). Entre los ejemplos de NPV se incluyen Autographa californica NPV (AcNPV) y Bombyx mori NpV (BmNPV). De los NpV es preferible el AcNPV.
La incorporación de un ácido nucleico en un virus puede realizarse a través de un método convencional. Por ejemplo, la incorporación de un ácido nucleico en un virus puede realizarse a través de recombinación homóloga mediante el uso de un vector de transferencia. Entre los ejemplos de vectores de transferencia se incluye pPSC8 (producto de Protein Sciences), pFastBac (producto de Life Technologies Corporation) y pVL1393 (producto de Pharmingen). Entre ellos, pPSCS es un vector de transferencia preferido.
Una célula de insecto puede infectarse, mediante una técnica convencional, con el virus en el que se ha incorporado el gen que codifica un factor de interés, para obtener, de este modo, la célula de insecto que retiene el virus y expresa el factor.
<Método que expresa una línea celular establemente>
A través de la incorporación de un gen que codifica un factor de interés en un cromosoma de una célula de insecto, puede establecerse una línea celular que se expresa establemente que exprese establemente el factor. El método de establecimiento de la línea celular que se expresa establemente no es especialmente limitado y se puede emplear una técnica convencional. Por ejemplo, puede establecerse una línea celular que se expresa establemente utilizando plZ-V5 (producto de Life Technologies Corporation), de acuerdo con unas instrucciones para el usuario adjuntas al respecto.
Las condiciones en las que se cultiva una célula de insecto no son especialmente limitadas, siempre que la célula de insecto pueda proliferar. Pueden utilizarse condiciones generalmente empleadas en el cultivo de células de insecto, después de haberse realizado modificaciones apropiadas, si fuera necesario. Un medio de cultivo que generalmente se utiliza en cultivo de células de insecto puede ser empleado como el medio de cultivo en la presente memoria. Entre los ejemplos de tal medio de cultivo se incluye un medio libre de suero para cultivar células de insecto. Específicamente, podría utilizarse adecuadamente un medio libre de suero Sf900III (producto de Life Technologies Corporation) o similar. El cultivo puede realizarse, por ejemplo, como cultivo agitado de 27 °C a 28 °C.
Si el factor de interés se ha expresado o no, puede confirmarse midiendo la actividad del factor. La expresión de un factor de interés puede también confirmarse midiendo la cantidad de ARNm formado a través de la transcripción de un gen que codifica el factor o detectando el factor a través de transferencia de Western usando un anticuerpo.
El factor expresado puede recuperarse como una solución que contiene el factor y puede utilizarse como un componente del agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria. La solución que contiene el factor puede ser, por ejemplo, un caldo de cultivo, un sobrenadante de cultivo, un extracto celular alterado, una mezcla de los mismos o similar. El factor puede utilizarse después de purificarlo hasta un punto deseado o puede utilizarse sin ninguna purificación. Como se describe en la presente memoria, incluso cuando un cultivo celular sobrenadante que contiene el factor expresado se utiliza tal cual sin ninguna purificación, puede alcanzarse un rendimiento de ensayo de endotoxina satisfactorio. La purificación del factor puede realizarse a través de, por ejemplo, una técnica de purificación de proteínas conocida. Entre los ejemplos de tales técnicas se incluyen la precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxiapatita y demás. En el caso donde se añade una etiqueta tal como His-tag al factor, el factor puede se puede purificar a través de cromatografía de afinidad basada en la afinidad por la etiqueta. Una solución que contiene el factor puede utilizarse después de haberse filtrado mediante un filtro. Por ejemplo, puede utilizarse como filtro un filtro de 0,22-pm.
En el caso de se produzca cada factor mediante el método de virus, preferiblemente se elimina el virus. El método de eliminación del virus no es especialmente limitado y puede emplearse una técnica convencional. Por ejemplo, el virus puede eliminarse mediante una membrana de filtrado de fibra hueca que tiene un tamaño de poro de 500 kDa.
Como se describe en la presente memoria, el Factor C descrito en la presente memoria, el Factor B descrito en la presente memoria y la enzima procoagulante descrita en la presente memoria pueden expresarse separadamente en células de expresión establecidas individualmente.
El agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria puede contener, por ejemplo, solo el Factor C descrito en la presente memoria. Como alternativa, el agente puede contener, por ejemplo, solo el Factor C descrito en la presente memoria, el Factor B descrito en la presente memoria y la enzima procoagulante descrita en la presente memoria.
El agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria puede contener adicionalmente un sustrato para detectar el progreso de la reacción en cascada. Como se emplea en esta memoria, se puede aludir a tal sustrato como un sustrato de detección.
Entre los ejemplos de sustrato de detección se incluye el coagulógeno. El coagulógeno es un sustrato de detección con respecto a la enzima de coagulación, que es el producto final de la reacción en cascada. Cuando el coagulógeno entra en contacto con la enzima de coagulación, se forma la coagulina, un producto coagulado. Se puede determinar el progreso de la reacción de coagulación midiendo la turbidez de la mezcla de la reacción. Se puede recuperar coagulógeno de un extracto de hematocito de un cangrejo herradura (es decir, lisado). Dado que se ha determinado la secuencia de nucleótidos de un gen que codifica coagulógeno (Miyata et al, Protein Nucleic acid Enzyme, extra issue, n.°29; p. 30-43; 1986), se puede producir también coagulógeno genéticamente de acuerdo con una técnica convencional.
El sustrato de detección puede ser un sustrato sintético. El sustrato sintético no es especialmente limitado, siempre que tenga una propiedad adecuada para la detección de la reacción en cascada. Entre los ejemplos de "propiedad adecuada para la detección de la reacción en cascada" se incluyen una propiedad para detectar la presencia de enzima de coagulación y una propiedad para detectar una etapa intermedia de la reacción en cascada. Entre los ejemplos de la "propiedad para detectar la presencia de enzima de coagulación" se incluyen una propiedad de colorear por reacción catalítica con la enzima de coagulación y una propiedad de generar fluorescencia por reacción catalítica con la enzima de coagulación. Entre los ejemplos de la "propiedad para detectar una etapa intermedia de la reacción en cascada" se incluyen una propiedad de colorear por reacción catalítica de un intermediario de reacción en cascada tal como un Factor C activado y una propiedad de generar fluorescencia por reacción catalítica de un intermediario de reacción en cascada tal como es un Factor C activado. Entre los ejemplos de sustrato sintético se incluye un sustrato representado por la fórmula X-Y-Z (en donde X representa un grupo de protección, Y representa un péptido y Z representa un colorante unido a Y a través de un enlace amida). Cuando hay endotoxina en el sistema de reacción, se escinde un enlace amida Y-Z por la reacción catalítica de la enzima de coagulación o un intermediario, que se produce en la reacción en cascada, para liberar el colorante Z, por lo cual se genera coloración o fluorescencia. El grupo de protección X no es especialmente limitado y puede utilizarse adecuadamente un grupo de protección para péptido conocido. Entre los ejemplos de un grupo de protección se incluyen un grupo t-butoxicarbonil y un grupo benzoilo. El colorante Z no es especialmente limitado y puede ser un colorante detectable bajo luz visible o puede ser un colorante fluorescente. Entre los ejemplos de colorante Z se incluyen p-nitroanilina (pNA), 7-metoxicumarina-4-ácido acético (MCA), 2,4-dinitroanilina (DNP) y colorantes de dansilo. Entre los ejemplos de péptido Y se incluyen Leu-Gly-Arg (LGR), Ile-Glu-Gly-Arg (IEGR) (SEQ ID NO: 10), Val-Pro-Arg (VPR) y Asp-Pro-Arg (DPR). Puede seleccionarse apropiadamente un sustrato sintético que reacciona con la enzima de coagulación o el intermediario como el sustrato sintético según la modalidad de ensayo de endotoxina. Por ejemplo, desde el punto de vista de especificidad de sustrato, un sustrato que comprende LGR como péptido Y puede utilizarse adecuadamente para detectar la enzima de coagulación y un sustrato que comprende VPR o DPR como péptido Y puede ser utilizado adecuadamente para detectar Factor C activado. El colorante Z liberado puede determinarse mediante una técnica según la propiedad del colorante diana.
El agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria puede adicionalmente contener un componente adicional aparte de los factores relevantes y un sustrato de detección, siempre que el agente de ensayo pueda emplearse para ensayo de endotoxina. El componente adicional no es especialmente limitado y puede seleccionarse considerando la estabilidad durante el almacenamiento, facilidad de manejo, estabilidad de los factores y sustrato de detección y demás.
El agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria puede formularse en cualquier preparación como un sólido, líquido o gel. En el proceso de formulación, pueden utilizarse aditivos como un excipiente, un aglutinante, un disgregante, un lubricante, un corrector de sabor, un diluyente y un solvente, los cuales se utilizan, generalmente, en formulación. El agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria puede utilizarse como es para ensayo de endotoxina. Como alternativa, el agente de ensayo puede utilizarse para ensayo de endotoxina después de diluirlo con o dispersado o disuelto en agua, suero fisiológico, tampón, etc. Obviamente, el agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria también incluye tal forma del agente diluida, dispersada, disuelta o proceso similar.
En el agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria, los factores y otros componentes pueden estar presentes como una mezcla o presentes por separado. Por ejemplo, los factores pueden mezclarse en cualquier proporción en la formulación o pueden formularse factores individuales separadamente.
Las concentraciones de los factores y otros componentes contenidos en el agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria no son especialmente limitados. Sin embargo, preferiblemente cada concentración se ajusta para caer dentro del intervalo de concentraciones adecuadas para ensayar endotoxina mencionadas más adelante. La concentración de cada factor en el agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria (como una solución preparada antes del contacto con un espécimen de prueba) puede ser, por ejemplo, 5 a 200 pg/ml y preferiblemente es 20 a 100 |jg/ml, más preferiblemente 40 a 80 |jg/ml, en particular preferiblemente 60 |jg/ml aproximadamente. Asimismo, la concentración de cada factor en el agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria puede ajustarse según el método de producción del factor. Cuando se produce Factor C con una célula de roedor como una hospedadora, la concentración de Factor C en el agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria (como una solución preparada antes del contacto con un espécimen de prueba) puede ser también, por ejemplo, 5 a 200 jig/ml, 10 a 50 jig/ml, o 15 a 40 jig/ml. Cuando se produce Factor C con una célula de primate como una hospedadora, la concentración de Factor C en el agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria (como una solución preparada antes del contacto con un espécimen de prueba) puede ser también, por ejemplo, 5 a 200 jig/ml, 50 a 150 jig/ml, u 80 a 120 jig/ml. Las concentraciones anteriormente ejemplificadas pueden calcularse, por ejemplo, asumiendo que toda la especie proteica presente en el filtrado de un sobrenadante de cultivo que se ha obtenido mediante expresión de un factor de interés a través de la técnica anteriormente ejemplificada consiste en el factor de interés.
El agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria puede proporcionarse como un kit de ensayo de endotoxina. El kit de ensayo de endotoxina no es especialmente limitado, siempre que el kit comprenda el agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria. El kit de ensayo de endotoxina puede comprender adicionalmente, por ejemplo, uno o más elementos seleccionados de una endotoxina estándar, un envase de reacción (p. ej. un tubo o una microplaca), una instrucción y similares.
(4) Método de ensayo de endotoxina
Cuando un espécimen de prueba contiene endotoxina, la reacción en cascada transcurre mezclando el agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria con el espécimen de prueba. A través de la medición del progreso de la reacción en cascada, puede medirse la endotoxina que contiene el espécimen de prueba. Es decir, se describe en la presente memoria un método para medir endotoxina en un espécimen de prueba, el método que comprende un paso de mezcla del agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria y el espécimen de prueba y un paso de medición del progreso de una reacción en cascada.
En una realización del método de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria (al que se puede aludir, en adelante, como la "primera realización"), todos los factores se mezclan con el espécimen de prueba. En la primera realización, los factores que contenían el agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria podían estar contenidos en el sistema de reacción desde el comienzo del paso de mezcla del agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria con el espécimen de prueba o podían añadirse sucesivamente en el sistema de reacción.
Por ejemplo, el paso de mezclar el agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria con el espécimen de prueba puede comprender los siguientes pasos (A) a (C):
(A) un paso de adición del Factor C descrito en la presente memoria al sistema de reacción;
(B) un paso de adición del Factor B descrito en la presente memoria al sistema de reacción; y
(C) un paso de adición de la enzima procoagulante al sistema de reacción.
Los pasos (A) a (C) pueden realizarse separadamente, parcialmente de forma simultánea o totalmente de forma simultánea. Los pasos (A) a (C) pueden realizarse en cualquier orden. Por ejemplo, el paso (B) puede realizarse después del paso (A) y el paso (C) puede realizarse después del paso (B).
En la primera realización, el progreso de la reacción en cascada puede medirse añadiendo un sustrato de detección al sistema de reacción y midiendo la respuesta (coloración, coagulación, etc.) del sustrato. El sustrato de detección puede estar presente en el sistema de reacción desde el principio del paso de mezcla del agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria con el espécimen de prueba o puede añadirse al sistema de reacción durante el progreso del paso o después de completar el paso. Obviamente, la primera realización también incluye un método de ensayo de endotoxina que emplea el agente de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria el cual contiene un sustrato de detección de antemano.
En el método de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria, siempre que la reacción en cascada transcurra cuando el espécimen de prueba contenga endotoxina, el Factor B y la enzima procoagulante descritos en la presente memoria en sí no necesitan estar en contacto con el espécimen de prueba. Es decir, otra realización del método de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria (al que se puede aludir, en adelante, como una "segunda realización") es un método para medir endotoxina presente en un espécimen de prueba, el método que comprende los siguientes pasos (A) a (D):
(A) un paso de mezcla del Factor C descrito en la presente memoria con el espécimen de prueba;
(B) un paso de mezcla del Factor B descrito en la presente memoria con el Factor C después de mezclarse con el paso (A);
(C) un paso de mezcla de la enzima procoagulante descrito en la presente memoria con el Factor B después de mezclarse con el paso (B); y
(D) un paso de medida del progreso de una reacción en cascada.
En la segunda realización, los pasos (A) a (D) pueden realizarse separadamente, parcialmente de forma simultánea o totalmente de forma simultánea. Por ejemplo, el paso A puede estar iniciado y entonces pueden añadirse el Factor B y la enzima procoagulante al sistema de reacción durante el progreso del paso A o después de finalizar el paso A. Asimismo, el paso B puede estar iniciado y entonces puede añadirse la enzima procoagulante al sistema de reacción durante el progreso del paso B o después de finalizar el paso B. Como alternativa, los tres factores pueden incorporarse al sistema de reacción desde el comienzo del paso A. Todavía de manera alternativa, se puede recuperar el Factor C después del contacto del paso A y usarse en el paso B o recuperar el Factor B después del contacto del paso B y usarse en el paso C.
En la segunda realización, el progreso de la cascada puede medirse añadiendo un sustrato de detección al sistema de reacción y midiendo la respuesta (coloración, coagulación, etc.) del sustrato. El sustrato de detección puede estar presente en el sistema de reacción desde el principio del paso A o puede añadirse al sistema de reacción durante el progreso del paso o después de completar el paso.
Como alternativa, puede medirse endotoxina detectando una etapa intermedia de la reacción en cascada. Específicamente, puede medirse endotoxina detectando Factor C activado, que es un intermediario de la reacción en cascada. Es decir, todavía puede ser otra realización del método de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria (al que se puede aludir, en adelante, como una "tercera realización") un método para medir endotoxina presente en un espécimen de prueba, el método que comprende un paso de mezcla del Factor C descrito en la presente memoria con el espécimen de prueba y un paso de detección del Factor C activado. En la tercera realización, el Factor C activado puede detectarse añadiendo un sustrato de detección al sistema de reacción y midiendo la respuesta (coloración, etc.) del sustrato. El sustrato de detección puede estar presente en el sistema de reacción desde el principio del paso de mezcla del Factor C descrito en la presente memoria con el espécimen de prueba o puede añadirse al sistema de reacción durante el progreso del paso o después de completar el paso.
El método de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria, siempre que la reacción en cascada transcurra cuando el espécimen de prueba contenga endotoxina, puede comprender adicionalmente cualquier otro paso arbitrario. Por ejemplo, el método de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria puede comprender un paso de adición de un sustrato de detección al sistema de reacción o un paso de mezcla de enzima de coagulación o un intermediario, que se produjo por la reacción en cascada, con el sustrato de detección. Asimismo, por ejemplo, el método de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria puede comprender un paso de cálculo del nivel de endotoxina del espécimen de prueba basándose en la reacción del sustrato de detección.
En el método de ensayo de endotoxina descrito en la presente memoria, la reacción se lleva a cabo preferiblemente en un medio acuoso tal como agua o un tampón.
En el método de ensayo descrito en la presente memoria, la concentración de cada factor en la mezcla de reacción no es especialmente limitada, siempre que la reacción en cascada transcurra cuando el espécimen de prueba contenga endotoxina. La concentración de cada factor puede ajustarse adecuadamente según las propiedades del factor y demás. Por ejemplo, la concentración de cada factor, como una concentración final, puede ser, por ejemplo, 2,5 a 100 |jg/ml y preferiblemente es 10 a 50 jg/ml, más preferiblemente 20 a 40 jg/ml, en particular preferiblemente 30 jg/m l aproximadamente. Asimismo, la concentración de cada factor en la mezcla de reacción puede ajustarse según el método de producción del factor. Cuando se produce Factor C con una célula de roedor como una hospedadora, la concentración de Factor C in la mezcla de reacción, como una concentración final, puede ser también, por ejemplo, 2,5 a 100 jg/ml, 5 a 25 jg/ml, o 7,5 a 20 jg/ml. Cuando se produce Factor C con una célula de primate como una hospedadora, la concentración de Factor C in la mezcla de reacción, como una concentración final, puede ser también, por ejemplo, 2,5 a 100 jg/ml, 25 a 75 jg/ml, o 40 a 60 jg/ml. Las concentraciones anteriormente ejemplificadas pueden calcularse, por ejemplo, asumiendo que toda la especie proteica presente en el filtrado de un sobrenadante de cultivo que se ha obtenido mediante expresión de un factor de interés a través de la técnica anteriormente ejemplificada consiste en el factor de interés.
En el método de ensayo descrito en la presente memoria, la concentración del sustrato de reacción en la mezcla de reacción no es especialmente limitada, siempre que la reacción en cascada transcurra cuando el espécimen de prueba contenga endotoxina. La concentración del sustrato de reacción puede ajustarse adecuadamente según las propiedades del factor y demás. En el caso de que el sustrato de detección sea un sustrato sintético, la concentración del sustrato de detección es, por ejemplo, generalmente 0,001 mM a 100 mM, preferiblemente 0,01 mM a 10 mM, como una concentración final.
En cualquier realización, siempre que la reacción en cascada transcurra cuando el espécimen de prueba contenga endotoxina, el sistema de reacción puede contener adicionalmente cualquier otro componente arbitrario, además de los factores, el sustrato de detección y el espécimen de prueba.
El pH de la mezcla de reacción no es especialmente limitado, siempre que la reacción en cascada transcurra cuando el espécimen de prueba contenga endotoxina. El pH de la mezcla de reacción puede ajustarse adecuadamente según las propiedades de los factores. El pH de la mezcla de reacción es, por ejemplo, generalmente 5 a 10, preferiblemente 7 a 8,5.
La temperatura de reacción no es especialmente limitada, siempre que la reacción en cascada transcurra cuando el espécimen de prueba contenga endotoxina. La temperatura de reacción puede ajustarse adecuadamente según las propiedades de los factores. La temperatura de reacción es, por ejemplo, generalmente 10 °C a 80 °C, preferiblemente 20 °C a 50 °C. Por ejemplo, la temperatura de reacción puede ser 37 °C.
El tiempo de reacción no es especialmente limitado. El tiempo de reacción puede ajustarse adecuadamente según diferentes condiciones tales como las propiedades de los factores y temperatura de reacción. El tiempo de reacción es, por ejemplo, generalmente de 5 minutos a 2 horas, preferiblemente de 15 minutos a 90 minutos. El tiempo de reacción puede ser, por ejemplo, 30 minutos a 40 minutos.
En cualquier realización, el espécimen de prueba, los factores y otros componentes pueden añadirse por separado o en cualquier combinación al sistema de reacción durante el transcurso de la reacción. Estos componentes pueden añadirse una vez o una pluralidad de veces o de una forma continua. Las condiciones de reacción pueden ser constantes desde el comienzo hasta el final o pueden variar durante el transcurso de la reacción.
El progreso de la reacción en cascada atribuible a la presencia de endotoxina puede medirse midiendo la respuesta (coloración, coagulación, etc.) del sustrato de detección, en donde puede medirse endotoxina en el espécimen de prueba. La respuesta (coloración, coagulación, etc.) del sustrato de detección puede medirse mediante una técnica de acuerdo con la propiedad del sustrato de detección empleado.
En el caso de medir cuantitativamente endotoxina, los datos de correlación entre el nivel de endotoxina y el alcance de la respuesta (coloración, coagulación, etc.) del sustrato de detección se obtienen utilizando una muestra de endotoxina estándar de concentración conocida y entonces la cantidad de endotoxina presente en la muestra se puede determinar cuantitativamente basándose en los datos de correlación obtenidos. El dato de correlación es, por ejemplo, una curva de calibrado. La cuantificación puede llevarse a cabo mediante un método cinético o un método de punto final.
El espécimen de prueba que puede someterse al ensayo de endotoxina no es especialmente limitado. Entre los ejemplos de espécimen se incluyen el agua para uso médico, productos farmacéuticos, soluciones de infusión, productos sanguíneos, equipos médicos, instrumentos médicos, cosméticos, comidas y bebidas, muestras ambientales (p. ej. aire, agua de río y suelo), muestras biológicas (p. ej. sangre, fluidos corporales y tejido), proteínas nativas, proteínas recombinantes, ácidos nucleicos y sacáridos. El espécimen de prueba puede ser, por ejemplo, un inyectable. Un inyectable se refiere a un agente que puede ser administrado al cuerpo biológico a través de inyección. Tal inyectable no es necesariamente fluido durante la distribución comercial y puede ser un producto liofilizado. El espécimen de prueba en sí o un extracto o líquido de lavado del mismo se puede mezclar, dispersar o disolver en el sistema de reacción, para así someterse al ensayo de endotoxina.
Como se ha descrito anteriormente, el Factor C descrito en la presente memoria puede tener baja susceptibilidad a la inhibición de actividad por un ion. Por lo tanto, en una realización descrita en la presente memoria, se puede medir adecuadamente endotoxina presente en un espécimen de prueba que contiene un ion.
En otras palabras, el espécimen de prueba descrita en la presente memoria puede ser un espécimen de prueba que contenga un ion. La expresión "que contenga un ion" se refiere al estado en el que el espécimen de prueba contiene una sustancia que está presente en forma de un ion durante el ensayo de endotoxina. Es decir, "ion" en la presente memoria puede referirse a especies que están presentes intrínsecamente en una forma ionizada en el espécimen de prueba o pueden ser especies que están presentes intrínsecamente en una forma de sal en el espécimen de prueba pero que están ionizadas durante el ensayo de endotoxina. El tipo de iones no es especialmente limitado. Un ejemplo de ion es un catión y un ejemplo de catión es un ion metálico. Entre los ejemplos de ion metálico se incluyen un ion metálico alcalino y un ion metálico alcalinotérreo. Entre los ejemplos específicos del ion metálico alcalino y del ion metálico alcalinotérreo se incluyen ion de sodio, ion de potasio, ion de calcio e ion de magnesio. La cantidad de ion contenida en el espécimen de prueba puede ser tal cantidad que, por ejemplo, la concentración del catión derivada del espécimen de prueba se convierta en 1 mM o superior, 2 mM o superior, 5 mM o superior, 10 mM o superior, 20 mM o superior, 50 mM o superior, o 100 mM o superior, como una concentración final en el sistema de reacción después de mezclar el espécimen de prueba con el agente de ensayo de endotoxina. Entre los ejemplos de sal se incluyen cloruro sódico, sulfato de magnesio, hidrogenocarbonato de sodio, citrato sódico, cloruro cálcico, cloruro potásico, iotalamato sódico, edetato disódico de calcio y fosfato dihidrogenado de sodio. La cantidad de sal contenida en el espécimen de prueba puede ser tal cantidad que, por ejemplo, la concentración de sal derivada del espécimen de prueba se convierta en 1 mM o superior, 2 mM o superior, 5 mM o superior, 10 mM o superior, 20 mM o superior, 50 mM o superior, o 100 mM o superior, como una concentración final en el sistema de reacción después de mezclar el espécimen de prueba con el agente de ensayo de endotoxina. El espécimen de prueba puede contener un tipo de ion (o sal) o dos o más tipos de iones (o sales).
Ejemplos
La presente invención se describirá a continuación más concretamente por medio de ejemplos. Sin embargo, estos son ejemplos meramente de la presente invención y el alcance de la presente invención no se limita a estos.
1. Preparación de proteínas de Factor C
(1) Expresión de Factor C en células de insecto (Sf9)
En esta sección, se preparó Factor C utilizando una célula de insecto Sf9 como una hospedadora de la siguiente manera.
Un ADN que codifica Factor C de cangrejo herradura japonés, Tachypleus tridentatus, se implantó entre el sitio de reconocimiento EcoRV y el sitio de reconocimiento MluI de pIZ-V5 (producto de Life Technologies Corporation), que es un vector para expresión en células de insecto, para así construir un plásmido de expresión de Factor C. La secuencia de nucleótidos de ADN se muestra en la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de Factor C codificado por el ADN se muestra en la SEQ ID NO: 2 (lo mismo se aplica a lo largo del ejemplo).
El plásmido de expresión de Factor C se introdujo en células Sf9 cultivadas mediante transfección utilizando el reactivo Celfectin (producto de Life Technologies Corporation). Las células Sf9 estuvieron en cultivo estático a 28 °C en un medio libre de suero Sf900 III (producto de Life Technologies Corporation) que contenía 300 a 600 pg/ml de Zeocin (producto de Life Technologies Corporation), en donde se seleccionaron cepas Sf9 en las que el plásmido de expresión se había incorporado al genoma.
Se aislaron candidatos para Sf9 en los que el gen del Factor C se había expresado establemente a través de la técnica del cilindro de clonación y se clonó una pluralidad de líneas celulares de Sf9. Los clones así obtenidos se cultivaron individualmente, para obtener de este modo sobrenadantes de cultivo. Se confirmó la secreción de proteína de Factor C recombinante en cada sobrenadante de cultivo a través de transferencia de Western mediante el uso de un anticuerpo antifactor C (anticuerpo 2C12; Yoshiki Miura, et al., J., Biochem. 112: 476-481 (1992)). Asimismo, se confirmó la actividad de Factor C (propiedad de activarse por endotoxina) en el sobrenadante de cultivo a través de la medición de actividad mediante el uso de un sustrato sintético Boc-LGR-pNA. En particular, el procedimiento de medición de actividad se describe en "4. Medición de actividad" más adelante (lo mismo se aplica a lo largo del ejemplo). Basados en los resultados del transferencia de Western y la medición de actividad, se seleccionó una línea celular Sf9 con elevada expresión de Factor C.
La línea celular Sf9 con elevada expresión de Factor C fue cultivada en suspensión (28 °C) en un medio Sf900 que contenía 1x penicilina/estreptomicina (producto de Life Technologies Corporation) y 50 pg/ml de Zeocin para una fase posterior de la fase de crecimiento logarítmico (6 a 8*10® células/ml). Así, se centrifugó el cultivo (3.000*g, 30 minutos, 4 °C), para de este modo recuperar un sobrenadante de cultivo. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22-pm y la facción así recuperada (es decir, filtrada) se utilizó como un Factor C recombinante (Sf9).
(2) Expresión de Factor C en células de mamífero (CHO DG44)
En esta sección, el Factor C se preparó utilizando CHO DG44, que es una línea celular de ovario de hámster chino, como una hospedadora a través del siguiente procedimiento.
Un ADN que codifica Factor C de cangrejo herradura japonés, Tachypleus tridentatus, se implantó entre el sitio de reconocimiento EcoRI y el sitio de reconocimiento Xba de pCI-neo (producto de Promega), que es un vector para expresión en células de mamífero, para así construir un plásmido de expresión de Factor C. Se añadió una secuencia Kozak (GCCACC) justo antes del inicio del codón de iniciación del Factor C.
Se incorporaron el plásmido de expresión de Factor C y un plásmido de expresión de dhfr a células CHO DG44 cultivadas mediante transfección simultánea utilizando un reactivo de lipofección (Lipofectamine LTX) (producto de Life Technologies Corporation). Las células CHO DG44 estuvieron en cultivo estático a 37 °C en alimentación de 5% CO2 en un medio RPMI 1640 (5% suero dializado, que contiene 1x penicilina/estreptomicina) (producto de Sigma) adicionado con 1 mg/ml de Geneticin (producto de Life Technologies Corporation), en donde se seleccionaron cepas CHO DG44 en las que el plásmido de expresión se habían incorporado al genoma.
Quince días después de la transfección simultánea, se añadió MTX (metotrexato) (producto de Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) al medio de cultivo. Se elevó la concentración de MTX escalonadamente de 50 nM a 5.000 nM durante tres meses y se seleccionaron líneas celulares CHO DG44 con elevada expresión de Factor C como policlones. La amplificación eficaz del gen del Factor C incorporado en virtud del MTX se confirmó por detección de Factor C en un sobrenadante de cultivo mediante transferencia de Western utilizando un anticuerpo 2C12 y cuantificando la cantidad de ARNm transcripcional de Factor C mediante PCR en tiempo real.
El grupo de líneas celulares CHO DG44 con elevada expresión de Factor C se diluyó por el medio para obtener una concentración celular de 0,5 células/pocillo y la dilución se inoculó en una placa de 96 pocillos. Desde aproximadamente 10 a 20 días después de la inoculación, las colonias de células formadas se sometieron sucesivamente a cultivos de expansión, en donde se clonaron líneas celulares de CHO DG44 con elevada expresión de Factor C. La cantidad de ARNm transcripcional de Factor C se confirmó mediante PCR en tiempo real. La cantidad de proteína de Factor C secretada al medio se confirmó mediante transferencia de Western utilizando un anticuerpo 2C12. Se confirmo la actividad de Factor C (propiedad de activarse por endotoxina) en el sobrenadante de cultivo a través de la medición de actividad utilizando un sustrato sintético Boc-LGR-pNA. Basándose en estos resultados, se seleccionó una línea celular de CHO DG44 con elevada expresión de Factor C monoclonal.
La línea celular de CHO DG44 con elevada expresión de Factor C (monoclonal) estaba condicionada en un medio completo sintético libre de suero que contenía 5 pM MTX y por consiguiente flotaba. La línea celular se cultivó a 37 °C en alimentación de 5 % CO2 para una fase posterior de la fase de crecimiento logarítmico. El cultivo en flotación así obtenido se centrifugó (3.000*g, 30 minutos, 4 °C), para de este modo recuperar un sobrenadante de cultivo. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22-pm y la facción así recuperada (es decir, filtrada) se utilizó como un Factor C recombinante (CHO).
(3) Expresión de Factor C en células de mamífero (HEK293)
En esta sección, el Factor C se preparó utilizando HEK293, que es una línea celular de riñón humano embrionario, como una hospedadora a través del siguiente procedimiento.
Un ADN que codifica Factor C de cangrejo herradura japonés, Tachypleus tridentatus, se implantó entre el sitio de reconocimiento EcoRI y el sitio de reconocimiento XhoI de pCA7 (Makoto Takeda, et al., J. Viol. 79 (22): 14346-54 (2005)), que es un vector para expresión en células de mamífero, para así construir un plásmido de expresión de Factor C. Se añadió una secuencia Kozak (GCCACC) justo antes del inicio del codón de iniciación del Factor C.
Se incorporó el plásmido de expresión de Factor C en células HEK293 cultivadas mediante transfección utilizando polietilenimina (producto Sigma) (Hashiguti et al., Expression of Recombinant Protein Using Cultured Human Cells -Standard Protocol by 293-type cells-, PSSJ Archives, 1, e017 (2008), http://www.pssj.jp/archives/Protocol/Expression/293_01/293_01_01.html). Las células HEK293 estuvieron en cultivo estático en un medio DMEM (que contenía 10 % suero bovino fetal y 2 mM L-glutamina) (producto de Sigma) a 37 °C en alimentación de 5 % CO2 sin reemplazo del medio. Cuatro días después de la transfección, el caldo de cultivo se recuperó y se centrifugó (3.300*g, 30 minutos, 4 °C), para de este modo recuperar un sobrenadante de cultivo. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22-pm y la facción así recuperada (es decir, filtrado) se utilizó como Factor C recombinante (HEK).
(4) Preparación de Factor C nativo (derivado de amebocito de Tachypleus tridentatus)
Se recuperó una fracción que contenía Factor B y Factor C de un extracto de amebocito de cangrejo herradura japonés, Tachypleus tridentatus, mediante cromatografía en columna a través de resina de sulfato de dextrano (Takanori Nakamura, et al., Eur. J. Biochem. 154: 511-521 (1986)). La fracción (5 ml) estuvo sujeta a filtrado de gel a través de una columna ($ 2.2 cm x 97 cm) rellena con gel de Sepharose CL6B (producto de GE Healthcare). El filtrado de gel se realizó bajo casi las mismas condiciones que las empleadas en una técnica conocida (Jeak Ling Ding y Bow Ho, US 5,712,144; Jeak L. Ding, et al., Biochem. Biophys. Acta 1202: 149-156). El flujo se ajustó a 15 ml/h y a 50 mM de tampón Tris (pH 8.0) que contenía 154 mM NaCl, 1 mM EDTA y se empleó como solvente DMSO 5 %.
Las fracciones eluídas de filtrado de gel (3,7 ml/tubo, 150 tubos) se sometieron a SDS-PAGE seguidas de tinción CBB y transferencia de Western usando un anticuerpo 2C12 y medición de actividad usando un sustrato sintético Boc-LGR-pNA, en donde se identificaron las fracciones que contenían proteína de Factor C. Estas fracciones que contenían la proteína de Factor C purificada se emplearon como Factor C nativo (TAL).
2. Preparación de Factor B recombinante y enzima procoagulante recombinante
Se implantó un ADN que codifica Factor B de cangrejo herradura japonés, Tachypleus tridentatus, se implantó entre el sitio de reconocimiento EcoRV y el sitio de reconocimiento MluI de pIZ-V5 (producto de Life Technologies Corporation), que es un vector para expresión en células de insecto, para así construir un plásmido de expresión de Factor B. La secuencia de nucleótidos de ADN se muestra en la SEQ ID NO: 9 y la secuencia de aminoácidos de Factor B codificado por el ADN se muestra en la SEQ ID NO: 6. En particular, la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 9 es una secuencia de nucleótidos optimizada para expresión en células de insecto.
Se implantó un ADN que codifica la enzima procoagulante de cangrejo herradura japonés, Tachypleus tridentatus, se implantó entre el sitio de reconocimiento EcoRV y el sitio de reconocimiento I de pIZ-V5 (producto de Life Technologies Corporation), que es un vector para expresión en células de insecto, para así construir un plásmido de expresión de enzima procoagulante. La secuencia de nucleótidos de ADN se muestra en la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de enzima procoagulante codificada por el ADN se muestra en la SEQ ID NO: 8.
A través del mismo método que se empleó en el caso del Factor C, los plásmidos de expresión se incorporaron cada uno en células Sf9, se seleccionaron clones de elevada expresión y se prepararon sobrenadantes de cultivo de los mismos. Los sobrenadantes de cultivo se filtraron individualmente a través de un filtro de 0,22-pm y las fracciones obtenidas (es decir, filtrados) se emplearon como un Factor B recombinante y una enzima procoagulante recombinante. La recuperación de factores se confirmó a través de transferencia de Western empleando un anticuerpo específico para cada factor y medición de actividad.
3. Comparación de pesos moleculares de proteínas de Factor C (1)
Los pesos moleculares de los cuatro tipos de proteínas de Factor C preparados anteriormente se compararon entre sí a través de SDS-PAGE y transferencia de Western.
Primeramente, cada Factor C en una cantidad mostrada en la Fig. 2 fue sometido a SDS-PAGE en una condición no reductora empleando un gel de gradiente 5 a 20 %. En la Fig. 2, Sf9, CHO y HEK indican el Factor C expresado en células Sf9, células CHO DG44 y células HEK293, respectivamente y TAL se refiere al Factor C nativo (en adelante sucede lo mismo). En particular, el Factor C se escinde en una cadena H y una cadena L en condiciones reductoras. En el presente ejemplo, el SDS-PAGE se llevó a cabo bajo una condición no reductora con el fin de comparar los pesos moleculares del Factor C en un estado intacto.
Después de la SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a una membrana PVDF (producto de Bio RAD) por medio de un secante semi-seco. La membrana de PVDF se recuperó y bloqueó con 5 % de leche desnatada y se trató entonces de forma secuencial con un anticuerpo primario (anticuerpo 2C12) y un anticuerpo secundario (HRP etiquetado anticuerpo anti-ratón cabra) (producto de Dako). Se hizo que las bandas atribuidas a Factor C emitieran luz con un reactivo de detección, SuperSignal West Dura (producto de Thermo Scientific) y la emisión de luz se grabó con una cámara CCD.
Se halló que los cuatro tipos de Factor C tenían diferentes pesos moleculares y que el peso molecular mayor fue en el caso de CHO, seguido de TAL, HEK y Sf9 en orden descendiente (Fig. 2).
Con respecto al cangrejo herradura singapurense, Carcinoscorpius rotundicauda, se ha señalado que toda la proteína de Factor C nativo purificada de un extracto de amebocito y las proteínas de Factor C recombinante producidas en células de insecto Sf9 y S2 y en una línea celular COS-1 de riñón de mono verde africano como célula hospedadora, tienen el mismo peso molecular de 132 kDa (Jeak Ling Ding y Bow Ho, US 5,712,144 y Jeak L. Ding, et al., Biochem. Biophys. Acta 1202: 149-156 (1993) (para proteína de Factor C nativo); Jing Wang, et al., J., Biol. Chem. 277(39): 36363-72 (2002) (para Sf9 y S2); y Roopashree S. Dwarakanath, et al., Biotechnology letters 19(4): 357-361 (1997) (para COS-1)).
Por lo tanto, entre los cuatro tipos de proteínas de Factor C preparados anteriormente, se midió correctamente el peso molecular de cada CHO y TAL. Primeramente, el Factor C recombinante (CHO) se purificó de un modo similar al empleado en el caso del Factor C nativo (TAL). Así, se realizó una electroforesis (gel 15 %) (producto de GE Healthcare)) en las mismas condiciones que las empleadas en una técnica conocida (Jeak Ling Ding y Bow Ho, US 5,712,144; y Jeak L. Ding, et al., Biochem. Biophys. Acta 1202: 149-156) y el peso molecular de cada Factor C se determinó entonces mediante el gráfico de Ferguson. Como resultado, se encontró Factor C recombinante (CHO) con un peso molecular de 126 kDa y Factor C nativo (TAL) con un peso molecular de 123 kDa (Fig. 3). Por lo tanto, se encontró Factor C nativo (TAL) y Factor C recombinante (CHO) derivado de cangrejo herradura japonés, Tachypleus tridentatus, con un peso molecular más pequeño que el del Factor C derivado del cangrejo herradura singapurense, Carcinoscorpius rotundicauda (132 kDa).
La diferencia en el peso molecular entre los cuatro tipos de Factor C preparados anteriormente puede concebirse como atribuible a la diferencia en la modificación post-traduccional (modificación de cadena de azúcar) que depende del tipo de células hospedadoras empleado. Por ejemplo, se sabe que el ácido siálico está unido a la cadena de azúcar de tipo N después de la traducción en células de mamífero, en donde una proteína recombinante producida en células de mamífero tiene mayores dimensiones que aquellas de proteína recombinante producida en células de insecto (Robert L. Harrison y Donald L. Jarvis, Methods in Molecular Biology 338: 341-356 (2007)). Esto apoya los resultados del presente ejemplo (Fig. 2).
4. Medición de actividad
Cada uno de los cuatro tipos de Factor C preparados anteriormente se combinó con otros factores y se llevó a cabo la medición de actividad mediante el siguiente procedimiento. La Fig. 4 muestra el esquema de la medición de actividad.
Como se muestra en la Fig. 4, se mezclaron materiales comunes aparte del Factor C (un Factor B recombinante, una enzima procoagulante recombinante, un sustrato sintético Boc-LGR-pNA y un tampón Tris), para así preparar una mezcla líquida común. Para la mezcla líquida común, se añadió Factor C en una cantidad especificada en la Fig. 6 y el volumen total se ajustó a 50 pl. La mezcla así obtenida se mezcló con 50 pl de una muestra (agua que contenía endotoxina estándar de farmacopea de Estados Unidos de América (USP-RSE) (producto de Seikagaku Corporation)) y la mezcla resultante se calentó a 37 °C durante 30 minutos. En este sistema de ensayo, se activa Factor C por endotoxina, para formar así el Factor C activado; se activa Factor B por el Factor C activado, para formar así el Factor B activado; se activó enzima procoagulante por el Factor B activado, para así formar una enzima de coagulación correspondiente; y la enzima de coagulación escinde un sustrato sintético Boc-LGR-pNA, en donde se libera pnitroanilina (Fig. 5). El cambio en absorbancia (A 405 nm) atribuido a la formación de p-nitroanilina se midió de una forma dependiente del tiempo y se calculó la tasa de cambio de la absorbancia por unidad de tiempo (mAbs/min) y se utilizó como actividad de Factor C. La medición se realizó tres veces para cada muestra.
En el sistema de ensayo anterior, la concentración final de cada factor fue como sigue: Factor B recombinante 30 |jg/ml, enzima procoagulante recombinante 30 jg/ml, Factor C recombinante (Sf9) 11,3 jg/ml, Factor C recombinante (CHO) 12 jg/ml, Factor C recombinante (HER) 51.5 jg/m l y Factor C (TAL) 0,25 jg/ml. Las concentraciones del ejemplo anterior (excepto para el caso de TAL) se calcularon asumiendo que toda la especie proteica presente en la muestra (es decir, filtrado) preparada mediante expresión de un factor de interés consistió en el factor de interés. Se midió la concentración del Factor C (TAL) después de la purificación del Factor C (TAL).
Como resultado, se constituyeron con éxito sistemas reconstituidos presentando cada uno casi actividad equivalente para los cuatro tipos de Factor C (Fig. 6). En cada sistema reconstituido, la actividad se incrementó con un incremento de concentración de endotoxina (0,05 y 0,1 EU/ml) de un espécimen.
Se señaló que el Factor C recombinante derivado de Carcinoscorpius rotundicauda y producido en una célula de mamífero COS-1 (132 kDa) se recupera en una fracción insoluble (Roopashree S. Dwarakanath, et al., Biotechnology letters 19(4): 357-361 (1997); y Jing Wang, Bow Ho y Jeak L. Ding, Biotechnology letters 23: 71-76 (2001)). Asimismo, se señala que el Factor C recombinante derivado de Carcinoscorpius rotundicauda y producido en célula de insecto S2 (132 kDa) no presenta actividad de proteasa en respuesta a endotoxina (Jing Wang, et al., J., Biol. Chem. 277 (39): 36363-72 (2002)). Se piensa que la falta de actividad del último Factor C (producido en S2) es atribuible a la diferencia en la estructura de cadena de azúcar del Factor C nativo derivado de Carcinoscorpius rotundicauda y el Factor C recombinante producido en célula de insecto Sf9, debido a diferente reactividad a lectina.
Por otra parte, en el presente ejemplo, se encontró que el Factor C recombinante derivado de Tachypleus tridentatus (Sf9, CHO y HER) presentó una actividad dependiente de endotoxina, incluso a pesar de que el peso molecular del mismo difiere de aquel del Factor C nativo (TAL); es decir, incluso a pesar de que la estructura de la cadena de azúcar del mismo difiere de aquel del Factor C nativo (TAL).
5. Inhibición de actividad por inyección
La endotoxina es una sustancia inductora de una fuerte reacción inmune. Por lo tanto, cuando un inyectable contaminado con endotoxina se administra en el cuerpo, se produce un efecto adverso grave. Por lo tanto, en la producción de inyectables, es obligatoria la detección de endotoxina por medio de un reactivo de lisado de amebocito de limulus por la farmacopea del país correspondiente, para confirmar así la no contaminación por endotoxina.
Por lo tanto, se compararon los cuatro tipos de Factor C preparados anteriormente en términos de reactividad a endotoxina en varios inyectables.
Como espécimen control, se usó agua de inyección que contenía endotoxina (concentración de endotoxina: 0,05 EU/ml). Los especímenes de medición utilizados fueron como sigue: dilución 4 veces del inyectable de cloruro sódico 10 p/v% (inyectable de cloruro sódico 10%, producto de Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.); dilución 16 veces del inyectable de sulfato de magnesio 0,5 M (inyectable corrector sulfato de magnesio 1 mEq/ml, producto de Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd.); solución sin diluir de suero fisiológico (solución isotónica de cloruro sódico Otsuka, producto de Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.); dilución 8 veces del inyectable de hidrogenocarbonato de sodio 7 p/v% (inyectable Meylon 7 %, producto de Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.); dilución 8 veces del inyectable de citrato sódico 10 p/v% (inyectable de citrato sódico para transfusión, producto de Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.); dilución 100 veces del inyectable de cloruro cálcico 0,5 M (inyectable corrector de cloruro cálcico 1 mEq/ml, producto de Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.); solución sin diluir de solución de Ringer (solución de Ringer "Fuso", producto de Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.); y dilución 16 veces del inyectable de iotalamato sódico (inyectable Conray 400, producto de Daiichi Sankyo Co., Ltd.), cada uno enriquecido con endotoxina (concentración de endotoxina: 0,05 EU/ml). Cuando el espécimen de medición fue 8 veces la dilución del inyectable de citrato sódico 10 w/v%, la concentración final de citrato sódico fue aproximadamente 21 mM. Cuando el espécimen de medición fue 8 veces la dilución del inyectable de hidrogenocarbonato de sodio 7 w/v%, la concentración final de hidrogenocarbonato de sodio fue aproximadamente 52 mM. Cuando el espécimen de medición fue 4 veces la dilución del inyectable de cloruro sódico 10 w/v%, la concentración final de cloruro sódico fue aproximadamente 214 mM. Cuando el espécimen de medición fue suero fisiológico sin diluir, la concentración final de cloruro sódico fue aproximadamente 77 mM. Cuando el espécimen de medición fue 16 veces la dilución del inyectable de sulfato de magnesio 0,5 M, la concentración final de sulfato de magnesio fue aproximadamente 16 mM. Cuando el espécimen de medición fue 100 veces la dilución del inyectable de cloruro cálcico 0,5 M, la concentración final de cloruro sódico fue aproximadamente 2,5 mM. Se midió la actividad de Factor C mediante el procedimiento mostrado en la Fig. 4. Se definió una actividad residual como una reactividad relativa (%) para endotoxina en un espécimen inyectable, con respecto a la reactividad para endotoxina en la correspondiente muestra control como 100 %. La medición se llevó a cabo cuatro veces para cada espécimen inyectable.
La Fig. 7 muestra los resultados. Cuando una inyección típica se empleó como un espécimen de medición, se inhibió la reacción con endotoxina, en comparación con el caso en el que se usó una inyección de agua. El grado de inhibición varió de acuerdo con el tipo de inyección y el tipo de hospedador para expresar Factor C. El Factor C recombinante (CHO) y el Factor C recombinante (HEK) mostraron una tendencia a tener baja susceptibilidad a la inhibición de la reacción para todos los inyectables probados, en comparación con el Factor C nativo (TAL). En particular, el Factor C recombinante (CHO) presentó la actividad residual más elevada en muchos casos. Por el contrario, el Factor C recombinante (Sf9) fue más susceptible a la inhibición de la reacción en muchos inyectables (7 inyectables, excepto la muestra n°. 6).
Los resultados de las pruebas indican que el Factor C expresado en células de mamífero pueden tener baja susceptibilidad a la inhibición de actividad por iones. Tal propiedad es particularmente ventajosa para detectar contaminación de endotoxina en la producción de inyectables.
6. Se sabe que la preparación de proteína de Factor C de anticuerpo A de proteína de Factor C específico de cadena L está presente como una cadena simple (cadena completa) en condiciones no reductoras y que se escinde en dos cadenas (cadena H y cadena L) en condiciones reductoras. Se ha señalado que el anticuerpo antifactor C monoclonal (anticuerpo 2C12) reconoce la cadena completa y la cadena H (Yoshiki Miura, et al., J. Biochem. 112: 476-481(1992)). Por lo tanto, se produjo un antígeno de péptido presente en la cadena L. Se inmunizó un conejo con el antígeno de péptido a través de un método convencional, en donde se produjo un anticuerpo policlonal que pudiera reconocer la cadena L y la cadena completa (anticuerpo FCL) (Fig. 10).
7. Purificación de proteínas de Factor C recombinantes
De acuerdo con el método empleado en "(4) Preparación de Factor C nativo (derivado de Tachypleus tridentatus)" de "1. Preparación de proteínas de Factor C", se purificaron tres tipos de proteínas de Factor C recombinante desde sobrenadantes de cultivo de células de mamífero (CHO DG44 y HEK293) y células de insecto (Sf9). En resumen, se sometió cada sobrenadante (100 a 300 ml) a cromatografía en columna a través de resina de sulfato de dextrano y se aislaron las fracciones eluidas que contenían el Factor C recombinante correspondiente mediante filtración en gel. Se confirmó la purificación de las proteínas de Factor C recombinante a través de SDS-PAGE y tinción CBB, transferencia de Western empleando el anticuerpo 2C12 y medición de actividad.
8. Comparación de pesos moleculares de proteínas de Factor C (2)
Se compararon de nuevo los pesos moleculares de los cuatro tipos de proteínas de Factor C entre sí a través de SDS-PAGE y transferencia de Western.
Los cuatro tipos de proteínas de Factor C purificadas, derivadas de un cangrejo herradura nativo (TAL), un sobrenadante de cultivo de CHO DG44 (CHO), un sobrenadante de cultivo de HEK293 (HEK) y un sobrenadante de cultivo de Sf9 (Sf9) se aplicaron a un solo gel (gel 15 %) para SDS-PAGE y se sometieron a tinción CBB (Fig. 11). Cada una de los cuatro tipos de proteínas de Factor C purificadas se presentó como una cadena sencilla (cadena completa) en condiciones no reductoras y se escindió en dos cadenas (cadena H y cadena L) en condiciones reductoras. Después de la transferencia a la membrana PVDF, se realizó un transferencia de Western utilizando el anticuerpo 2C12 y el anticuerpo FCL (Fig. 12). En relación con los sitios de reconocimiento de anticuerpo (Fig. 10), el anticuerpo 2C12 específicamente reconoció la cadena completa y la cadena H y el anticuerpo FCl específicamente reconoció la cadena completa y la cadena L. Las bandas de la tinción CBB mostradas en la Fig. 11 se identificaron como bandas derivadas de Factor C. Respecto al peso molecular de Factor C, CHO tuvo el peso molecular más grande; TAL y HEK tuvieron casi el mismo peso molecular; y Sf9 tuvo el peso molecular más pequeño, en todos los casos de la cadena completa en condiciones no reductoras y de las cadenas H y L en condiciones reductoras.
Para comparar con más precisión los pesos moleculares de los cuatro tipos de Factor C purificados, se realizó una electroforesis (gel 15 %, marcador LMW (producto de GE Healthcare)) en las mismas condiciones que las empleadas en una técnica conocida (Jeak Ling Ding y Bow Ho, US 5,712,144; y Jeak L. Ding, et al., Biochem. Biophys. Acta 1202: 149-156), seguido de tinción CBB y los pesos moleculares fueron entonces determinados mediante el gráfico de Ferguson.
La tabla 1 muestra los resultados. En condiciones no reductoras, TAL tuvo un peso molecular de 124 kDa, que es casi análogo a los 123 kDa señalado por la referencia. El peso molecular de CHO fue más elevado, 128 kDa y el de HEK fue 124 kDa, que es análogo al de TAL. El peso molecular de Sf9 109 kDa, que es más pequeño que el de TAL. Como resultado, cuando el Factor C recombinante se expresó en células de insecto (Sf9), se encontró que el peso molecular del mismo era más pequeño que el del Factor C nativo (TAL), si bien el Factor C recombinante se expresó en células de mamífero (CHO, h Ek ), el peso molecular del mismo se encontró que era análogo o mayor que el del Factor C nativo (TAL). Esta tendencia fue también confirmada en el caso de la cadena H o de la cadena L en condiciones reductoras.
El peso molecular del Factor C nativo derivado de Carcinoscorpius rotundicauda (cangrejo herradura singapurense) y del Factor C recombinante obtenido del mismo a través de expresión genética en células de insecto se ha señalado que tiene el mismo valor, 132 kDa, en condiciones no reductoras. Los cuatro tipos de Factor C purificado derivado de Tachypleus tridentatus (cangrejo herradura japonés) y obtenidos en el presente ejemplo presente tuvieron un peso molecular inferior a 132 kDa (Tabla 1).
[Tabla 1]
Figure imgf000021_0001
9. Confirmación de la modificación de la cadena de azúcar de tipo N
Los genes empleados en el presente ejemplo para expresar el Factor C recombinante fueron secuencias todas derivadas de Tachypleus tridentatus y los plásmidos de expresión se diseñaron de modo que no se añadió ninguna etiqueta a ningún extremo de ninguna secuencia. Por lo tanto, se piensa que las secuencias traducidas de aminoácidos de los cuatro tipos de Factor C obtenidos en el presente ejemplo son la misma. Además, se determinaron las secuencias parciales de los restos de aminoácido N-terminal del Factor C recombinante (HEK, Sf9). Estas secuencias de aminoácidos son idénticas a la secuencia del Factor C nativo de Tachypleus tridentatus, señalada por la referencia (datos no mostrados).
En general, se piensa que el peso molecular de una proteína varía considerablemente por modificación postraduccional. Además, se ha señalado también que la estructura de una cadena de azúcar de tipo N añadida a la proteína a través de modificación postraduccional difiere entre el caso de células de insecto y el caso de células de mamífero. Por lo tanto, para confirmar si la diferencia anteriormente observada en el peso molecular entre las proteínas de Factor C purificadas es atribuible a la diferencia en la estructura de la cadena de azúcar de tipo N, se trató cada una de las proteínas de Factor C con glicopeptidasa F. Se conoce que esta enzima escinde y elimina una cadena de azúcar de tipo N añadida a la proteína. Por lo tanto, cuando las proteínas de Factor C purificadas tienen el mismo peso molecular después del tratamiento con la enzima, es concebible que la cadena de azúcar de tipo N induce la diferencia en peso molecular entre las proteínas de Factor C.
De acuerdo con una instrucción adjunta, se trató cada proteína de Factor C purificada (1 |jg) con 1 mU de glycopeptidasa F (producto de Takara) en condiciones de modificación en presencia de SDS y un agente reductor. Las muestras así tratadas se separaron a través de SDS-PAGE y se analizaron después mediante transferencia de Western. La Fig. 13 muestra los resultados. En todos los casos de los cuatro tipos de Factor C, el peso molecular de la cadena H decreció por el tratamiento de glicopeptidasa y se convirtió en el mismo valor. Por el contrario, aunque el peso molecular de la cadena L decreció después del tratamiento de glicopeptidasa en todos los casos de los cuatro tipos de Factor C, el peso molecular se convirtió en el mismo valor solo en los casos de CHO, HEK y TAL. Específicamente, entre cuatro tipos de cadena L, se encontró que la cadena L del Factor C derivada de Sf9 tenía un peso molecular mayor que el de los otros tres casos, después del tratamiento de glicopeptidasa. Por lo tanto, en la cadena L del Factor C derivado de Sf9, es concebible que ocurra una cierta modificación aparte de la modificación de la cadena de azúcar de tipo N, después de la traducción.
Por lo tanto, el análisis mencionado anteriormente indica que la diferencia en la modalidad de cadena de azúcar de tipo N después de la traducción juega un papel principal en proporcionar la diferencia en peso molecular del Factor C.
10. Análisis de la cadena de azúcar de tipo N de Factor C
En la modificación de la cadena de azúcar de tipo N de una proteína en células de mamífero, se añaden moléculas de azúcar escalonadamente a un residuo de asparagina de la proteína y finalmente, se forma una cadena de azúcar que contiene un ácido siálico terminal (es decir, tipo complejo). Por el contrario, en células de insecto, generalmente no se añade ácido siálico y se forma una cadena de azúcar que tiene una manosa terminal (es decir, tipo paucimanosa) (Robert L. Harrison y Donald L. Jarvis, Methods in Molecular Biology 338: 341-356 (2007)). Para confirmar la diferencia

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un Factor C de cangrejo herradura que tiene actividad de Factor C, que contiene ácido siálico terminal unido (a-2,3) en una mayor cantidad, en comparación con un Factor C nativo y un Factor C de cangrejo herradura expresado en Sf9 como célula hospedadora, la cual se prepara utilizando células CHO DG44 como célula hospedadora y que presenta una actividad residual del 10% o superior en presencia de citrato sódico 21 mM, en donde la actividad del Factor C es una actividad en la que el Factor C se activa en presencia de endotoxina para convertir el Factor B en Factor B activado.
2. El Factor C según la reivindicación 1, que tiene un peso molecular de 115 kDa a 140 kDa o un peso molecular de 127 kDa ± 5 kDa, medido mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) en una condición no reductora.
3. El Factor C según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que es una proteína mostrada en la siguiente (A), (B), (C) o (D):
(A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2;
(B) una proteína que tiene identidad de 90 % o más con respecto a la secuencia completa de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 2 y que tiene actividad de Factor C;
(C) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4;
(D) una proteína que tiene identidad de 90 % o más con respecto a la secuencia completa de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 4 y que tiene actividad de Factor C.
4. El Factor C de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es hidrosoluble.
5. Un método para producir un Factor C de cangrejo herradura que tiene actividad de Factor C según la reivindicación 1, comprendiendo el método expresar el Factor C de cangrejo herradura en una célula CHO DG44 como célula hospedadora, en donde la actividad del Factor C es una actividad en la que el Factor C se activa en presencia de endotoxina para convertir el Factor B en Factor B activado.
6. El método según la reivindicación 5, en donde el Factor C es una proteína mostrada en la siguiente (A), (B), (C) o (D):
(A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2;
(B) una proteína que tiene identidad de 90 % o más con respecto a la secuencia completa de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 2 y que tiene actividad de Factor C;
(C) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4;
(D) una proteína que tiene identidad de 90 % o más con respecto a la secuencia completa de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 4 y que tiene actividad de Factor C.
7. Un agente de ensayo de endotoxina que contiene el Factor C de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
8. Un kit de ensayo de endotoxina que comprende el agente de ensayo según la reivindicación 7.
9. Un método para medir endotoxina en un espécimen de prueba, el método que comprende un paso de mezcla del agente de ensayo según la reivindicación 7 y el espécimen de prueba y un paso de medición del progreso de una reacción en cascada.
10. El método según la reivindicación 9, en donde el espécimen de prueba contiene al menos uno de:
(A) un ion;
(B) un catión;
(C) un ion metálico;
(D) un ion metálico alcalino o un ion metálico alcalinotérreo; y
(E) uno o más tipos de iones seleccionados del grupo consistente en ion de sodio, ion de potasio, ion de calcio e ion de magnesio.
11. El método según la reivindicación 10, en donde la cantidad de ion que contiene el espécimen de prueba es tal cantidad que la concentración del catión derivada del espécimen de prueba se vuelve 1 mM o más elevada, como concentración final en el sistema de reacción después de mezclar el espécimen de prueba con el agente de ensayo.
12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde el espécimen de prueba es un inyectable.
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