ES2674079T3 - Método para la producción recombinante de la proteína del factor C de cangrejo herradura - Google Patents

Abstract

Un protozoo parásito, que se caracteriza por albergar un polinucleótido que codifica la proteína del factor C del cangrejo herradura.

Description

Método para la producción recombinante de la proteína del factor C de cangrejo herradura

5 Campo técnico de la invención

La presente invención proporciona un nuevo método para la producción recombinante de la proteína del factor C del cangrejo herradura utilizando un protozoo parásito que expresa la proteína del factor C. Por consiguiente, la presente invención proporciona una célula huésped protozoaria parásito que alberga un polinucleótido que codifica la proteína C del factor de cangrejo herradura y un método para producir el factor C que comprende cultivar dicha célula huésped protozoaria parásito en condiciones tales que las células expresan la proteína del factor C de cangrejo herradura. La presente invención proporciona proteína del factor C recombinante del cangrejo herradura recombinante que tiene un peso molecular de aproximadamente 102 kDa según se determina mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras producidas por el nuevo método y su uso en la detección y/o eliminación de

15 endotoxina.

Técnica anterior

La endotoxina, también conocida como lipopolisacárido (LPS), es un componente integral de la membrana celular de bacterias gramnegativas y es responsable de muchos, si no de todos, los efectos tóxicos que se producen durante la sepsis por bacterias gramnegativas.

El LPS de bacterias gramnegativas induce a los amebocitos de los cangrejos de herradura a agregarse y desgranularse. Presumiblemente, la cascada de coagulación inducida por LPS representa un mecanismo de defensa

25 importante utilizado por los cangrejos de herradura contra la invasión por bacterias gramnegativas. El lisado de amebocitos constituido como la prueba del lisado de amebocitos de Limulus (LAL) se ha usado durante décadas como herramienta para detectar concentraciones traza de endotoxina (LPS) en solución. El mecanismo molecular de la coagulación en el cangrejo herradura está establecido e implica una cascada de proteasas. Esta cascada se basa en 3 tipos de cimógenos de serina proteasa, factor C, factor B, enzima procoagulante y una proteína coagulable, coagulógeno. Al ser el activador inicial de la cascada de coagulación, el factor C funciona como biosensor que responde al LPS. Una vez que el factor C es "activado" por LPS, el resto activo creado tiene la capacidad de activar el factor B e hidrolizar sustratos tripéptidos sintéticos.

La actividad del factor C es la base de un ensayo muy sensible para los niveles de femtograma de endotoxina

35 usados en el control de calidad de productos farmacéuticos y similares. La importancia del factor C en la detección de endotoxinas ha conducido a la expresión del factor C recombinante (rFC) como una fuente alternativa que debería aliviar los inconvenientes reconocidos con el lisado de amebocitos convencional como la variación estacional en la sensibilidad de la detección de endotoxina.

Para ensayos específicos de endotoxina, la proteína del factor C se ha purificado y clonado. Tras la activación por LPS, el factor C recombinante actúa sobre un sustrato sintético presente en la mezcla de ensayo para generar una señal detectable, indicando de ese modo la presencia de LPS en una muestra dada. En particular, un sustrato fluorogénico produce una señal fluorescente en proporción a la concentración de endotoxina en la muestra. La proteína del factor C se ha purificado y clonado para su aplicación en ensayos específicos de endotoxina.

45 Nakamura et al. (1986, Eur. J. Biochem. 154: 511-521) describen el aislamiento y la caracterización de la proteína del factor C nativa del cangrejo herradura Tachypleus tridentatus. La secuencia de ADNc que codifica la proteína del factor C de T. tridentatus fue publicada por Muta et al. (1991, J. Biol. Chem. 266:6554-6561). La secuencia de ADNc que codifica la proteína del factor C del cangrejo herradura Carcinoscorpius rotundicauda la publicó Ding et al. (1995, Molecular Marine Biology y Biotechnology 4:90-103). La expresión recombinante del factor C de C. rotundicauda en

E. coli se describió en Roopashree et al. (1995, Biochem. Mol. Biol. Intl. 35:841-849). En el presente documento, la expresión de una proenzima de 108 kDa y las formas activadas de 78 kDa y 52 kDa se demostró mediante inmunodetección.

55 La expresión recombinante de la proteína del factor C de C. rotundicauda en la levadura Pichia pastoris se describe en Ding et al. (1996, patente de EE.UU. 5.858.706.). La expresión recombinante de la proteína del factor C de C. rotundicauda en Saccharomyces cerevisiae se describe en Roopashree et al. (1997, Biotechnology Letters 19:11471150).

La expresión recombinante de la proteína del factor C de C. rotundicauda en células de mamífero COS-1 células se describe en Roopashree et al. (1997, Biotechnology Letters 19: 357-361). En el presente documento, se expresó la proteína del factor C y se detectaron bandas de proteína con un peso molecular de 132 kDa, 130 kDa y 63 kDa. Las proteínas eran no secretadas, no solubles y no activas, sino más bien insolubles, asociadas con la fracción de desechos celulares.

65 La expresión recombinante de la proteína del factor C de C. rotundicauda en células de mamífero (células Sf9

transfectadas estables) se describe en Wang et al. (2001, Biotechnology Letters 23: 71-76). En el presente documento, la proteína del factor C se secretó en el sobrenadante con un peso molecular de 132 kDa, que indicó la glicosilación de la proteína. El Factor C obtenido fue funcionalmente activo en el sentido de que podría unirse a la endotoxina (LPS). Sin embargo, no se demostró conversión en una proteasa enzimáticamente activa. La expresión

5 recombinante de la proteína del factor C de C. rotundicauda en las células de insectos también se describe en Wang et al. (2002, J. Biol. Chem. 277:36363-736372). En el presente documento, el Factor C se clonó y transfectó en células S2 de Drosophila y se expresó como una proteína soluble glicosilada, que se secretó en el sobrenadante del cultivo. La proteína del factor C recombinante era capaz de unirse a LPS, pero no se escindió para convertirse en una proteasa enzimáticamente activa. La expresión recombinante de la proteína del factor C de C. rotundicauda en células de insecto se describe además en el documento US 6.645.724 utilizando el sistema de baculovirus para la expresión en células Sf9.

El documento WO 01/32896 y Basile et al. (2009, Molecular Biotechnology, Vol. 43(3):273-278) se refieren a la expresión de proteína recombinante en parásitos de Kinetoplastidae, en particular en Leishmania tarentolae.

15 La proteína del factor C es una proteína eucariota compleja, que requiere varias etapas de conversión y modificaciones secundarias para convertirse en una proteasa activa. La expresión recombinante en procariotas (por ejemplo, E. coli) no proporciona glicosilación, escisión en la cadena H y la cadena L y formación correcta de puentes disulfuro. La expresión citosólica en sistemas simples de expresión eucariota (por ejemplo, levaduras) proporcionó el factor C, que era capaz de unirse a LPS, pero que no se activó tras la unión de LPS, es decir, no hubo conversión de la forma de zimógeno en una proteasa activa. Cuando se usan células de levadura (Pichia o Saccharomyces) para la expresión, no fue posible obtener el Factor C recombinante como proteína secretada. La expresión en una línea celular de mamífero tampoco proporcionó proteína secretada activa. Adicionalmente, la expresión en células de insecto transformadas estables proporcionó proteína secretada, que era capaz de unirse a LPS. Sin embargo, la

25 activación por LPS no se demostró en este sistema. Finalmente, la expresión en células de insecto usando un sistema de expresión de baculovirus proporcionó proteína del factor C secretada, que era capaz de unirse a LPS, y que se convirtió en un zimógeno de serina proteasa activo tras la unión al LPS.

De toda la experiencia adquirida hasta ahora, los expertos que lograron la expresión de la proteína del factor C activa en células de insecto concluyeron que "la expresión en células de insecto en lugar de en un sistema de expresión eucariota, procariota o simple es adecuada para producir rFC con actividad biológica completa. Adicionalmente, los cangrejos de herradura y los insectos pertenecen al mismo filo, Arthropoda, por lo que las células de insecto podrían parecerse más a las células del cangrejo herradura que las células de levadura en su fisiología y bioquímica. Por lo tanto, el rFC producido en células de insecto podría parecerse más a la proteína

35 purificada del cangrejo herradura y retener la bioactividad de tener una actividad de serina proteasa activada por LPS" (véase el documento WO 99/15676 en la página 2, "Sumario de la Invención"). Asimismo, el documento WO 2012/118226 se refiere a la producción de proteína del factor C recombinante de cangrejo herradura en células de insecto.

Desde entonces, es decir, más de 13 años después de la publicación del documento WO 99/15676, no se han realizado más intentos con respecto a la producción recombinante de la proteína del factor C activa. Obviamente, a la vista de los resultados obtenidos a lo largo de los años a partir de la expresión recombinante en diversos sistemas de huéspedes y en vista de la evaluación inequívoca dada por los principales expertos en el campo en el documento WO 99/15676, el sistema de expresión de baculovirus en células huésped de insecto se consideró la referencia para

45 la producción recombinante de la proteína del factor C activa.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un nuevo método para la producción recombinante de la proteína del factor C del cangrejo herradura utilizando un protozoo parásito que expresa la proteína del factor C. En particular, la presente invención proporciona una célula huésped protozoaria parásito que alberga un polinucleótido que codifica la proteína C del factor de cangrejo herradura y un método para producir la proteína del factor C que comprende cultivar dicha célula huésped protozoaria parásito en condiciones tales que las células expresan la proteína del factor C de cangrejo herradura. Adicionalmente, la presente invención proporciona proteína del factor C recombinante del

55 cangrejo herradura que tiene un peso molecular de aproximadamente 102 kDa según se determina mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras producidas por el nuevo método y su uso en la detección y/o eliminación de endotoxina.

En particular, la presente invención proporciona:

[1] Un protozoo parásito, que se caracteriza por albergar un polinucleótido que codifica la proteína del factor C del cangrejo herradura.

[2] El protozoo parásito de [1], donde dicho polinucleótido está compuesto por una molécula de ácido nucleico,

preferentemente un vector, introducido en la célula huésped del protozoo parásito. 65 [3] El protozoo parásito de [1] o [2], donde el protozoo parásito es un miembro del orden Trypanosomatida.

[4] El protozoo parásito de uno cualquiera de [1] a [3], donde el protozoo parásito es un miembro del género

Leishmania.

[5] El protozoo parásito de uno cualquiera de [1] a [4], donde el protozoo parásito es Leishmania tarentolae.

[6] El protozoo parásito de uno cualquiera de [1] a [5], donde dicho polinucleótido codifica la proteína del factor C de Limulus polyphemus, Carcinoscorpius rotundicauda, Tachypleus tridentatus o Tachypleus gigas.

5 [7] El protozoo parásito de uno cualquiera de [1] a [6], donde dicho polinucleótido codifica la proteína del factor C que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

[8] Un método para producir proteína del factor C de cangrejo herradura que comprende las etapas de: (a) cultivar un protozoo parásito de uno cualquiera de [1] a [7] en condiciones tales que las células expresan la proteína del factor C codificada por el polinucleótido; y (b) recuperar la proteína del factor C producida en la etapa (a) del cultivo celular.

[9] El método de [8], donde dicha proteína del factor C se acumula en el medio de cultivo celular.

[10] El método de [8] o [9], donde el protozoo parásito es un miembro del género Leishmania.

[11] El método de [10], donde la proteína del factor C producida exhibe actividad de serina proteasa al unirse a la endotoxina.

15 [12] Proteína del factor C de cangrejo herradura que tiene un peso molecular de aproximadamente 102 kDa según se determina mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras obtenible mediante a) el método de [10];

o b) el método de [11].

[13] Uso de la proteína del factor C de cangrejo herradura de [12] b) en un método para la detección de endotoxinas o en un método para la eliminación de endotoxinas.

[14] Un ensayo o kit para la detección de endotoxina o la eliminación de endotoxina, que comprende la proteína del factor C del cangrejo herradura de [12] b).

[15] Un proceso de generación de una célula huésped protozoaria parásita que produce proteína del factor C de cangrejo herradura, que comprende las etapas de: (a) introducir una molécula de ácido nucleico, preferentemente un vector, que comprende un polinucleótido que codifica la proteína del factor C de cangrejo

25 herradura en un protozoo parásito, preferentemente un protozoo parásito del orden Trypanosomatida, más preferentemente un miembro del género Leishmania, de la forma más preferente Leishmania tarentolae; y (b) seleccionar una o más células huésped producidas en la etapa (a) que expresan dicha proteína del factor C de cangrejo herradura.

[16] Una célula huésped de protozoo parásito caracterizada por un polinucleótido que codifica la proteína del factor C del cangrejo herradura, donde dicho polinucleótido está compuesto por una molécula de ácido nucleico, preferentemente un vector, introducido en la célula huésped del protozoo parásito.

Breve descripción de los dibujos

35 Figura 1: muestra el gráfico de los valores de rfu medidos de muestras del factor C recombinante (rFC) activado por LPS después de 15 minutos de recambio de sustrato a 37 ºC en dependencia de la concentración de rFC. Se indica la concentración de rFC utilizada para el cálculo de la actividad específica.

Descripción detallada de la invención

El factor C de los cangrejos herradura está bien establecido para su uso en la detección y eliminación de endotoxinas. En el pasado se han realizado intentos para producir Factor C mediante expresión recombinante como una fuente alternativa al lisado de amebocitos convencional, el extracto acuoso de células sanguíneas (amebocitos) de cangrejos herradura. Muchos intentos en la técnica de la expresión recombinante del factor C fallaron debido a

45 que el factor C recombinante (rFC) producido en diversas células huésped ha demostrado que no muestra la actividad biológica requerida para su uso en los métodos de detección de endotoxina. Las células huésped aplicadas en la técnica fueron células procariotas, células eucariotas simples y células eucariotas superiores, y después de años de intensa investigación, los expertos en el campo concluyeron que la expresión en células de insectos en lugar de en un sistema de expresión procariota o eucariota simple, es adecuado para producir rFC con actividad biológica completa. En relación con esto, los expertos en el campo explicaron que los insectos y cangrejos herradura pertenecen al mismo filo, Arthropoda, por lo que las células de insecto podrían parecerse más a las células del cangrejo herradura que las células de levadura en su fisiología y bioquímica. Por lo tanto, el rFC producido en células de insecto podría parecerse más a la proteína purificada a partir del cangrejo herradura y retener la bioactividad de tener una actividad de serina proteasa activada por LPS.

55 La presente invención proporciona un nuevo método para la producción recombinante de la proteína del factor C del cangrejo herradura utilizando un protozoo parásito que expresa la proteína del factor C. En particular, la presente invención proporciona una célula huésped protozoaria parásito que alberga un polinucleótido que codifica la proteína del factor C de cangrejo herradura y un método para producir la proteína del factor C que comprende cultivar dicha célula huésped protozoaria parásito en condiciones tales que las células expresan la proteína del factor C de cangrejo herradura. Adicionalmente, la presente invención proporciona proteína del factor C recombinante del cangrejo herradura que tiene un peso molecular de aproximadamente 102 kDa según se determina mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras producidas por el nuevo método y su uso en la detección y/o eliminación de endotoxina.

65 Los protozoos son organismos eucariotas unicelulares simples. El objeto de la presente invención no era obvio para

el experto en la materia porque la técnica ha llevado a utilizar sistemas de expresión eucariotas simples para producir con éxito la proteína del factor C activa, tal como se ha explicado anteriormente en el presente documento. Adicionalmente, fue sorprendente que el sistema básico de chaperonas de protozoos proporcione un plegamiento correcto del Factor C recombinante, teniendo en cuenta que más de 20 enlaces disulfuro deben estar conectados

5 adecuadamente para obtener la proteína del factor C. No se podía esperar que las células huésped protozoarias de la presente invención proporcionen el factor C recombinante de cangrejo herradura, que permite la escisión correcta de la pre-pro-enzima y la proenzima en la proteasa activa compuesta por una cadena pesada (H) y una ligera (L). Asimismo, el uso de protozoos proporcionado por la presente invención para la expresión de la proteína del factor C recombinante de cangrejo herradura tiene las siguientes ventajas:

En primer lugar, si bien el uso de células de insecto para la producción recombinante de la proteína del factor C está asociado con altos costes debido al hecho de que se requieren medios de cultivo especiales costosos, el uso de protozoos es barato porque los medios requeridos son baratos, siendo el equipo y las condiciones de cultivo similares a la fermentación de las bacterias. Asimismo, los cultivos de protozoos crecen relativamente

15 rápido (tiempo de generación rápida) y son fáciles de aumentar. Adicionalmente, una vez clonado, el huésped de expresión recombinante es estable y no requiere la preparación continua de reservas de virus infeccioso. Se ha demostrado que la proteína del factor C recombinante producida en cultivos de protozoos de la presente invención se secreta con buen rendimiento y en forma soluble, y puede purificarse fácilmente del sobrenadante del cultivo. Específicamente, solo una forma activa del Factor C se purifica del sobrenadante sin productos de degradación. Cabe destacar que la proteína recombinante expresada es estable y no se requieren aditivos para proteger la forma de zimógeno.

Células huésped

25 La presente invención proporciona un protozoo parásito, que se caracteriza por albergar un polinucleótido que codifica una proteína del factor C heteróloga del cangrejo herradura. El protozoo parásito proporcionado por la presente invención se usa para la producción recombinante del Factor C a partir de un cangrejo herradura. Por lo tanto, la presente invención proporciona una célula huésped de protozoo parásito para la producción recombinante de factor C de cangrejo herradura, donde la célula huésped de protozoo parásitos se caracteriza por albergar un polinucleótido que codifica una proteína de Factor C de cangrejo herradura.

La célula huésped de la presente invención para la producción recombinante de factor C de cangrejo herradura es una célula huésped de protozoo parásito. Preferentemente, la célula huésped de protozoo parásito es una célula huésped de protozoo parásita de cinetoplástido. La característica taxonómica común de estas células huésped es

35 una sola mitocondria con una masa densa de ADN extranuclear. La región de la mitocondria que contiene el ADN se denomina "cinetoplasto" y el ADN se denomina "ADN de cinetoplasto". La subunidad pequeña de ARNr y las filogenias proteicas conservadas respaldan la división de los cinetoplástidos en cinco órdenes: Prokinetoplastida, Neobodonida, Parabodonida, Eubodonida y Trypanosomatida. Por lo tanto, los protozoos parásitos cinetoplástidos preferentes de la presente invención son los parásitos Prokinetoplastida, Neobodonida, Parabodonida, Eubodonida o Trypanosomatida. Preferentemente, los protozoos parásitos cinetoplástidos de la presente invención son tripanosomátidos parásitos (es decir, Tripanosomatida parasitaria). Dado que todos los miembros de los tripanosomátidos son parásitos, simplemente el término "tripanosomátidos" se usa en el presente documento para describir tripanosomátidos parásitos (es decir, Tripanosomatida parasitaria).

45 Los tripanosomátidos consisten en LOS géneros monogenéticos tales como Crithidia, Leptomonas y Blastocrithidia, y los géneros digenéticos tales como Leishmania y Trypanosoma. En la presente invención, Los protozoos parásitos cinetoplástidos preferentes son tripanosomátidos digenéticos (es decir, miembros digenéticos del orden Trypanosomatida). Más preferentemente, la célula huésped de la presente invención es un miembro del género Leishmania. Aún más preferentemente, la célula huésped de la presente invención es Leishmania major o Leishmania tarentolae. En la presente invención, la célula huésped más preferente es Leishmania tarentolae. En diversas realizaciones, la célula huésped de la presente invención es un miembro del género Trypanosoma. En realizaciones preferidas, la célula huésped de la presente invención se selecciona de las especies Trypanosoma brucei y Trypanosoma theileri.

55 Aunque los tripanosomas son importantes causas de enfermedades humanas y animales, muchas especies no son patogénicas. Los protozoos de tripanosomátidos de la presente invención son, preferentemente, protozoos parásitos cinetoplástidos no patogénicos (Kinetoplastidae no patogénico), más preferentemente protozoos tripanosomátidos no patogénicos (Tripanosomatidae no patogénico), aún más preferentemente Leishmania no patogénico. Las especies preferentes no patogénicas de Kinetoplastidae incluyen, aunque no de forma limitativa, Leishmania tarentolae, Crithidia fasciculata, Wallaceina inconstans (antes Proteomonas inconstans), Leptomonas collos, Leptomonas sp. y Leptomonas seymouri. El protozoo no patogénico más preferente de la presente invención es Leishmania tarentolae.

En diversas realizaciones, las células huésped de protozoos parásitos de la presente invención son células huésped

65 de protozoos patogénicos atenuados, es decir, su patogenicidad ha sido atenuada, preferentemente atenuada genéticamente. Un enfoque para atenuar patógenos es la eliminación de genes dirigida. Por lo tanto, se pueden

obtener parásitos tripanosomátidos genéticamente atenuados (es decir, protozoos parásitos tripanosomátidos) mediante la eliminación de genes seleccionados (por ejemplo, genes que codifican factores de virulencia). La eliminación del gen aprovecha el hecho de que este parásito puede experimentar una recombinación homóloga entre secuencias de ADN endógenas y extrañas introducidas artificialmente en las células. Los protozoos parásitos

5 atenuados, preferentemente parásitos tripanosomátidos atenuados, usados en la presente invención tienen una virulencia atenuada, en particular una virulencia atenuada para los seres humanos.

Se entenderá que a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, el uso de términos como "Kinetoplastidae no patogénica" o "Tripanosomatidae no patogénica" se refiere no solo a organismos/huéspedes abarcados en las especies mencionadas anteriormente, sino que también incluye las especies en esquemas de clasificación alternativos, pero que poseen las mismas características o rasgos morfológicos y culturales definidos anteriormente, y pueden ser sinónimos de "Kinetoplastidae no patogénica" y "Tripanosomatidae no patogénica".

Tal como se usa en el presente documento, el término no patogénico incluye, aunque no de forma limitativa, el

15 significado no patogénico para seres humanos. En diversas realizaciones, "no patogénico" se define mediante la clasificación de los organismos en las preguntas al Nivel 1 de Bioseguridad.

En diversas realizaciones, la célula huésped protozoaria comprende un marcador seleccionable, preferentemente un gen marcador seleccionable.

Sistema de expresión

La presente invención proporciona una célula huésped protozoaria que comprende un polinucleótido que codifica una proteína del factor C heteróloga de un cangrejo herradura. Tal como se usa en el presente documento, proteína

25 heteróloga significa una proteína que no es nativa de la célula huésped. La célula huésped protozoaria de la presente invención representa un sistema de expresión para la producción recombinante de la proteína del factor C de cangrejo herradura. Por lo tanto, en el presente documento se divulga un sistema de expresión que comprende una célula huésped protozoaria y un polinucleótido que codifica una proteína del factor C heteróloga de cangrejo herradura, así como el uso del sistema de expresión para la expresión de una proteína del factor C heteróloga de un cangrejo herradura. Aunque el sistema de expresión divulgado en el presente documento puede comprender la célula huésped y el polinucleótido como un medio separado, también puede comprender una célula huésped de protozoo parásito, que ya alberga el polinucleótido que codifica la proteína del factor C heteróloga de cangrejo herradura.

35 En diversas realizaciones, el polinucleótido que codifica la proteína del factor C heteróloga del cangrejo herradura está unido operativamente a una secuencia promotora adecuada y, si es adecuado, a secuencias señal postranscripcionales, que son capaces de dirigir la expresión del polinucleótido que codifica la proteína del factor C en la célula huésped de la presente invención. Preferentemente, el promotor es un promotor de un gen transcrito de forma activa de un protozoo parásito cinetoplástido. Más preferentemente, el promotor es un promotor de un gen transcrito de forma activa de un miembro del orden Trypanosomatida, aún más preferentemente, el promotor es un promotor de un gen transcrito de forma activa de un miembro del género Leishmania, de la forma más preferente el promotor es un promotor de un gen transcrito de forma activa de Leishmania tarentolae.

En diversas realizaciones, el promotor es un promotor heterólogo fuerte de iniciación de la transcripción.

45 El polinucleótido que codifica la proteína del factor C de cangrejo herradura utilizado en la presente invención es un polinucleótido heterólogo, en particular un polinucleótido heterólogo que codifica la proteína del factor C heteróloga de cangrejo herradura. Tal como se usa en el presente documento, polinucleótido heterólogo significa un polinucleótido que no es nativo de la célula huésped. En diversas realizaciones, la transcripción del polinucleótido heterólogo utilizado en la presente invención está controlada por un elemento sensible a un represor en conexión con un gen represor incorporado y expresado.

En diversas realizaciones, al menos una copia del polinucleótido heterólogo está localizada en un grupo de genes transcritos activamente de la célula huésped protozoo de la presente invención. Preferentemente, el grupo de genes

55 transcritos activamente es un grupo de genes de ARNr.

En diversas realizaciones, el polinucleótido que codifica la proteína del factor C heteróloga está flanqueado por UTR (regiones no traducidas sin traducir) en 5' y 3' de un gen transcrito activamente de un protozoo parásito cinetoplástido. Preferentemente, el polinucleótido que codifica la proteína del factor C heteróloga está flanqueado por UTR en 5' y 3' de un gen transcrito activamente de un miembro del orden Trypanosomatida, más preferentemente por UTR en 5' y 3' de un gen transcrito activamente de un miembro del género Leishmania, y aún más preferentemente por UTR en 5' y 3' de un gen transcrito activamente de Leishmania tarentolae.

En diversas realizaciones, el polinucleótido que codifica la proteína del factor C heterólogo está flanqueado por una o

65 más secuencias señal, que proporcionan, por ejemplo, secreción eficiente, corte y empalme y/o poliadenilación de un gen transcrito activamente de un protozoo parásito cinetoplástido, es decir, la secuencia señal es una secuencia

señal de un gen transcrito activamente de un protozoo parásito cinetoplástido. Preferentemente, la proteína del factor C heteróloga está flanqueada por una o más secuencias señal de un gen transcrito activamente de un miembro de la orden Trypanosomatida, más preferentemente por una o más secuencias señal de un gen transcrito activamente de un miembro del género Leishmania, y aún más preferentemente por una o más secuencias señal de

5 un gen transcrito activamente de Leishmania tarentolae.

En diversas realizaciones, la proteína del factor C heteróloga está flanqueada por la secuencia señal derivada de la fosfatasa ácida de Leishmania mexicana (Wiese et al. 1995, EMBO J. 14:1067-1074).

En diversas realizaciones, el sistema de expresión de la presente invención está sustancialmente exento de la producción de proteasas, toxinas y grandes cantidades de otras proteínas secretadas y sintetizadas endógenamente de la célula huésped.

Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos del factor C y sus variantes

15 La proteína del factor C codificada por un polinucleótido usado en la presente invención es una proteína del factor C heteróloga. El polinucleótido usado en la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el factor C, que exhibe actividad enzimática de tipo factor C de un cangrejo herradura. El alcance de la presente invención abarca el uso de polinucleótidos que codifican el factor C con una secuencia de aminoácidos tal como se encuentra en su fuente natural, es decir, una secuencia de aminoácidos del Factor C tal como se puede obtener a partir de cangrejos herradura, así como el uso de polinucleótidos que codifican variantes de una secuencia de aminoácidos del factor C como se describe en el presente documento. El alcance de la presente invención también abarca el uso de polinucleótidos que comprenden la secuencia de aminoácidos del factor C tal como se encuentra en su fuente natural, es decir, una secuencia de ácido nucleico del Factor C tal como se puede obtener a

25 partir de cangrejos herradura, así como el uso de polinucleótidos que comprenden una variante de una secuencia de ácido nucleico del factor C como se describe en el presente documento. En cualquier caso, un polinucleótido usado en la presente invención codifica una proteína del factor C, que muestra actividad enzimática de tipo factor C al activarse con endotoxina. La definición de "actividad enzimática de tipo factor C" se proporciona en otra parte del presente documento.

En diversas realizaciones, el polinucleótido usado en la presente invención que codifica la proteína del factor C se modifica mediante la inserción, deleción, adición y/o sustitución de uno o más ácidos nucleicos, con la condición de que la proteína del factor C obtenida a partir de la expresión de dicho polinucleótido modificado en una célula huésped de protozoo parásito de acuerdo con la presente invención muestra actividad enzimática de tipo factor C al

35 activarse con endotoxina, quimotripsina (en particular a α-quimotripsina) o lípido A.

En diversas realizaciones, el polinucleótido usado en la presente invención es el polinucleótido que codifica el factor C de Tachypleus tridentatus o Tachypleus gigas. En diversas realizaciones, el polinucleótido codifica el factor C de Carcinoscorpius rotundicauda. En diversas realizaciones, el polinucleótido codifica el factor C de Limulus polyphemus. En diversas realizaciones, el polinucleótido usado en la presente invención comprende la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 del listado de secuencias.

En diversas realizaciones, el polinucleótido usado en la presente invención es idéntico al menos en un 75 % a un polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 y codifica un

45 polipéptido que exhibe actividad enzimática similar a factor C. Preferentemente, el polinucleótido presenta una identidad de al menos un 85 % o una identidad de al menos un 95 % con un polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 y codifica un polipéptido que exhibe actividad enzimática similar a factor C. Más preferentemente, el polinucleótido presenta una identidad de al menos un 96% o una identidad de al menos un 97% con un polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 y codifica un polipéptido que exhibe actividad enzimática similar a factor C. Incluso más preferentemente, el polinucleótido presenta una identidad de al menos un 98% o una identidad de al menos un 99% con un polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 y codifica un polipéptido que exhibe actividad enzimática similar a factor C.

55 En diversas realizaciones, el polinucleótido usado en la presente invención codifica un polipéptido, que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 y que exhibe actividad enzimática de tipo factor C. Preferentemente, el polinucleótido codifica un polipéptido, que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %o al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 y que exhibe actividad enzimática de tipo factor C. Más preferentemente, el polinucleótido codifica un polipéptido, que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 96 % o al menos un 97 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 y que exhibe actividad enzimática de tipo factor C. Incluso más preferentemente, el polinucleótido codifica un polipéptido, que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 98% o al menos un 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 y que exhibe actividad enzimática de tipo factor C.

65 En diversas realizaciones, el polinucleótido usado en la presente invención es un polinucleótido, que hibrida en

condiciones rigurosas con cualquiera de los polinucleótidos descritos en el presente documento, donde el polinucleótido que hibrida codifica un polipéptido, que exhibe actividad enzimática de tipo factor C.

En diversas realizaciones, el polinucleótido usado en la presente invención es al menos un 75 % idéntico a la 5 secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 y codifica un polipéptido que exhibe actividad enzimática de tipo factor C. Preferentemente, el polinucleótido usado en la presente invención es al menos un 85 %

o al menos un 95 % idéntico a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO: 3 y codifica un polipéptido que exhibe actividad enzimática de tipo factor C. Más preferentemente, el polinucleótido usado en la presente invención es al menos un 96% o al menos un 97% idéntico a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO: 3 y codifica un polipéptido que exhibe actividad enzimática de tipo factor C. Incluso más preferentemente, el polinucleótido usado en la presente invención es al menos un 98% o al menos un 99% idéntico a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO: 3 y codifica un polipéptido que exhibe actividad enzimática de tipo factor C.

15 En diversas realizaciones, el polinucleótido usado en la presente invención comprende una parte de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido que es al menos un 75 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 y que codifica un polipéptido que exhibe actividad enzimática de tipo factor C, donde dicha parte codifica un fragmento, análogo o derivado funcional del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, y donde dicho fragmento, análogo o derivado funcional del polipéptido exhibe actividad enzimática de tipo factor C. Preferentemente, el polinucleótido comprende una parte de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido que es al menos un 85 % o al menos un 95 % idéntico a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO: 3 y que codifica un polipéptido que exhibe actividad enzimática de tipo factor C, donde dicha parte codifica un fragmento, análogo o derivado funcional del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, y donde dicho fragmento, análogo o derivado funcional del

25 polipéptido exhibe actividad enzimática de tipo factor C. Más preferentemente, el polinucleótido comprende una parte de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido que es al menos un 96% o al menos un 97% idéntico a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO: 3 y que codifica un polipéptido que exhibe actividad enzimática de tipo factor C, donde dicha parte codifica un fragmento, análogo o derivado funcional del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, y donde dicho fragmento, análogo o derivado funcional del polipéptido exhibe actividad enzimática de tipo factor C. Incluso más preferentemente, el polinucleótido comprende una parte de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido que es al menos un 98% o al menos un 99% idéntico a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO: 3 y que codifica un polipéptido que exhibe actividad enzimática de tipo factor C, donde dicha parte codifica un fragmento, análogo o derivado funcional del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, y

35 donde dicho fragmento, análogo o derivado funcional del polipéptido exhibe actividad enzimática de tipo factor C.

En diversas realizaciones, el polinucleótido usado en la presente invención es el complementario de la longitud completa de cualquiera de los polinucleótidos, que se describen en el presente documento y que se pueden usar en la presente invención, donde el polinucleótido complementario codifica un polipéptido que exhibe actividad enzimática de tipo factor C.

La presente invención abarca específicamente el uso de las secuencias de ácido nucleico que codifican el Factor C del cangrejo herradura Carcinoscorpius rotundicauda como se describe en el documento WO 99/15676. En particular, la presente invención incluye por referencia el uso de las secuencias de nucleótidos representativas

45 presentadas como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 o del documento WO 99/15676. Del mismo modo, el uso de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 2 y 4 del documento WO 99/15676, que representan las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 del documento WO 99/15676, respectivamente, están incluidas explícitamente en la presente invención por referencia.

Las secuencias SEQ ID NOs: 1 a 4 del documento WO 99/15676 no corresponden a las SEQ ID NOs: 1 a 4 del listado de secuencias de la presente especificación. Cuando se hace referencia en la presente invención a cualquiera de las secuencias de SEQ ID NOs: 1 a 4, se entiende cualquiera de las secuencias de SEQ ID NOs: 1 a 4 del listado de secuencias de la presente especificación. Por el contrario, las secuencias SEQ ID NOs: 1 a 4 del documento de WO 99/15676 se abordan en el presente documento mediante referencia explícita al documento WO

55 99/15676, como se muestra en el párrafo anterior.

El alcance de la presente invención abarca la producción recombinante de un polipéptido del factor C codificado por cualquiera de los polinucleótidos y moléculas de ácido nucleico descritos en el presente documento. Por supuesto, el alcance de la presente invención también abarca el polipéptido del factor C recombinante obtenido a partir de cualquier proceso de producción de este tipo.

En diversas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la proteína del factor C de la presente invención se modifica mediante la inserción, deleción, adición y/o sustitución de uno o más restos de aminoácidos, con la condición de que la proteína del factor C que tiene dicha secuencia de aminoácidos modificada después de la

65 expresión recombinante en una célula huésped de protozoo parásito de acuerdo con la presente invención muestre actividad enzimática de tipo factor C al activarse con endotoxina, quimotripsina o lípido A.

El significado del término "uno o más restos de aminoácidos" en la oración anterior varía dependiendo de las posiciones de los restos de aminoácidos en la estructura tridimensional de la proteína del factor C y los tipos de restos de aminoácidos. Más particularmente, dicho término significa, preferentemente, de 1 a 20 restos de aminoácidos, más preferentemente de 1 a 10 restos de aminoácidos, aún más preferentemente de 1 a 5 5 aminoácidos e incluso más preferentemente de 1 a 3 restos de aminoácidos. En diversas realizaciones, la inserción, deleción, adición y/o sustitución descritas anteriormente de uno o más aminoácidos es una mutación conservadora que mantiene la actividad enzimática de la proteína del factor C tras la activación de la forma zimógena por endotoxina, quimotripsina o lípido. A. Una mutación conservadora de ejemplo es una sustitución conservadora. La sustitución conservadora es, por ejemplo, una mutación donde la sustitución tiene lugar mutuamente entre Phe, Trp y Tyr, si el sitio de sustitución es un aminoácido aromático; entre Leu, Ile y Val, si el sitio de sustitución es un aminoácido hidrófobo; entre Gln y Asn, si el sitio de sustitución es un aminoácido polar; entre Lys, Arg e His, si el sitio de sustitución es un aminoácido básico; entre Asp y Glu, si el sitio de sustitución es un aminoácido ácido; y entre Ser y Thr, si el sitio de sustitución es un aminoácido que tiene un grupo hidroxilo. Ejemplos de sustituciones consideradas como sustituciones conservadoras incluyen en particular la sustitución de Ser o Thr por Ala, la 15 sustitución de Gln, His, o Lys por Arg, la sustitución de Glu, Gln, Lys, His, o Asp por Asn, la sustitución de Asn, Glu,

o Gln por Asp, la sustitución de Ser o Ala por Cys, la sustitución de Asn, Glu, Lys, His, Asp, o Arg por Gin, la sustitución de Gly, Asn, Gln, Lys, o Asp por Glu, la sustitución de Pro por Gly, la sustitución de Asn, Lys, Gln, Arg, o Tyr por His, la sustitución de Leu, Met, Val, o Phe por Ile, la sustitución de Ile, Met, Val, o Phe por Leu, la sustitución de Asn, Glu, Gln, His, o Arg por Lys, la sustitución de Ile, Leu, Val, o Phe por Met, la sustitución de Trp, Tyr, Met, Ile,

o Leu por Phe, la sustitución de Thr o Ala por Ser, la sustitución de Ser o Ala por Thr, la sustitución de Phe o Tyr por Trp, la sustitución de His, Phe, o Trp por Tyr, y la sustitución de Met, Ile, o Leu por Val.

La presente invención abarca cualquiera de las inserciones, deleciones, adiciones y/o sustituciones descritas anteriormente en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 4.

25 Las inserciones, deleciones, adiciones y/o sustituciones descritas anteriormente también abarcan una mutación de origen natural debida a la diferencia en la cepa o especie individual entre los cangrejos herradura de los que deriva el gen del factor C. Adicionalmente, las inserciones, deleciones, adiciones y/o sustituciones descritas anteriormente también abarcan una mutación de origen natural en el curso de la expresión recombinante de la proteína del factor C en la célula huésped individual.

En diversas realizaciones, la proteína del factor C producida mediante un método de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos del factor C de Tachypleus tridentatus o Tachypleus gigas. En diversas realizaciones, la proteína del factor C producida mediante un método de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos del

35 factor C de Carcinoscorpius rotundicauda. En diversas realizaciones, la proteína del factor C producida mediante un método de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos del factor C de Limulus polyphemus. En diversas realizaciones, la proteína del factor C producida por un método de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

En diversas realizaciones, el polinucleótido usado en la presente invención codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o un fragmento, análogo o derivado funcional del mismo, donde dicho fragmento, análogo o derivado funcional del polipéptido exhibe actividad enzimática de tipo factor C. La presente invención abarca fragmentos, análogos y/o derivados funcionales de cualquiera de los polipéptidos del factor C descritos en el presente documento, siempre que dichos fragmentos, análogos y/o derivados funcionales muestren

45 actividad enzimática de tipo factor C tras la activación con endotoxina, quimotripsina o lípido A.

Para la producción recombinante del factor C de cangrejo herradura según la presente invención, el protozoo parásito comprende un polinucleótido que codifica la proteína del factor C recombinante de un cangrejo herradura. Por lo tanto, el polinucleótido que codifica la proteína del factor C de cangrejo herradura utilizado en la presente invención es un polinucleótido heterólogo, más específicamente un polinucleótido heterólogo que codifica una proteína del factor C heteróloga de un cangrejo herradura.

En aras de la claridad, cualquier variante de una proteína del factor C de cangrejo herradura descrita en el presente documento todavía se considera una proteína del factor C de cangrejo herradura, al menos en vista del hecho de

55 que cualquier variante descrita en el presente documento se define que exhibe actividad enzimática de tipo factor C de cangrejo herradura.

Actividad enzimática de tipo factor C

Los zimógenos (o proenzimas) son precursores de enzimas. Aunque los zimógenos a veces se denominan precursores inactivos de enzimas, el zimógeno no es "inactivo" en el sentido de que ha perdido su actividad (debido a diferentes factores), sino que es una molécula que necesita ser activada para convertirse en una enzima activa.

El factor C de los cangrejos herradura sigue siendo un zimógeno hasta que encuentra niveles traza de endotoxina.

65 Tras la activación por endotoxina (o quimotripsina o lípido A), el factor C de cangrejo herradura muestra inequívocamente la actividad enzimática completa, lo que indica la presencia de endotoxina (por ejemplo, en una

muestra para analizar la endotoxina) hidrolizando un sustrato sintético del factor C, que forma un producto medible/detectable. El factor C recombinante (rFC) de la presente invención se produce como un factor C de tipo zimógeno a partir de su fuente natural. Adicionalmente, el rFC de la presente invención también sigue siendo un zimógeno hasta que encuentra niveles traza de endotoxina. Tras la activación por endotoxina (o quimotripsina o

5 lípido A), el rFC de la presente invención muestra inequívocamente actividad enzimática completa como el factor C de cangrejo herradura de su fuente natural.

En vista de lo anterior y solo por el bien de la claridad, se observa que la "actividad enzimática de tipo factor C" significa la actividad enzimática del factor C de un cangrejo herradura medida para la forma activada. En otras palabras, "actividad enzimática de tipo factor C" significa actividad enzimática del factor C de cangrejo herradura activado por endotoxina, quimotripsina o lípido A. Por tanto, si la proteína de factor C recombinante producida por un método de la presente invención se describe en el presente documento que tiene o exhibe actividad enzimática de tipo factor C, está claro que se quiere decir la actividad enzimática del zimógeno activado. En otras palabras, "actividad enzimática del factor C de un cangrejo herradura" como se usa en el presente documento significa

15 "actividad enzimática de factor C activado de un cangrejo herradura" o "actividad enzimática de zimógeno de factor C activado de un cangrejo herradura".

En diversas realizaciones, los términos "Factor C (recombinante) de la presente invención" y "Factor C zimógeno (recombinante) de la presente invención" pueden usarse indistintamente. Aunque el rFC obtenido directamente de un método de la presente invención es un precursor de la enzima del Factor C, el zimógeno rFC de la presente invención no es "inactivo" en el sentido de que ha perdido su actividad (debido a diferentes factores). Más bien, el zimógeno de rFC de la presente invención es una molécula que necesita ser activada para convertirse en una enzima activa.

25 La actividad enzimática del factor C de un cangrejo herradura es específicamente actividad hidrolítica, más específicamente, la actividad proteolítica, y aún más específicamente la actividad de la serina proteasa. Por lo tanto, la actividad enzimática de tipo factor C como se describe en el presente documento significa específicamente actividad hidrolítica de tipo factor C de cangrejo herradura, más específicamente, actividad proteolítica de tipo factor C de cangrejo herradura, y aún más específicamente actividad de serina proteasa de tipo factor C de cangrejo herradura.

La actividad enzimática de una proteína del factor C de cangrejo herradura se puede medir mediante, por ejemplo, un ensayo cromogénico o fluorométrico. En particular, la actividad enzimática de un factor C de cangrejo herradura puede ser verificada por, por ejemplo, una señal cromogénica o fluorogénica detectable, que se produce debido a la

35 escisión/hidrólisis de un sustrato del Factor C por el Factor C activado. Los ensayos adecuados para detectar la actividad del Factor C se describen en la técnica y el experto en la materia no tendrá ningún problema en realizar un ensayo para detectar/medir la actividad enzimática de una proteína del factor C dada. Los sustratos para el factor C también se describen y están disponibles en la técnica. El alcance de la presente invención abarca el uso de sustratos de factor C cromogénicos y fluorogénicos, que incluyen, aunque no de forma limitativa, sustratos de peptidil-pNA cromogénicos y sustratos de peptidil-AMC, peptidil-AFC y peptidil-MCA fluorogénicos. Los sustratos del factor C a modo de ejemplo incluyen, aunque no de forma limitativa, N-t-Boc-DPR-AMC, N-t-Boc-VPR-MCA, N-t-Boc-VPR-AMC, Mu-VPR-AFC y Boc-VPR-pNA.

En diversas realizaciones, el rFC proporcionado por la presente invención muestra la actividad enzimática del factor

45 C de cangrejo herradura que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, más específicamente, la actividad hidrolítica del factor C de cangrejo herradura que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, aún más específicamente la actividad proteolítica del factor C de cangrejo herradura que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 e incluso más específicamente la actividad serina proteasa del factor C de cangrejo herradura que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

Forma zimógeno de dos cadenas del Factor C

Se sabe que el factor C de un cangrejo herradura en su forma de zimógeno comprende una cadena pesada (H) y una cadena ligera (L) (también llamada forma bicatenaria). El factor C recombinante de la presente invención

55 también se produce en la forma de zimógeno de dos cadenas. Específicamente, el factor C zimógeno obtenido mediante los métodos proporcionados por la presente invención también comprende una cadena H y una cadena L. Por lo tanto, los términos "Factor C de la presente invención" y "Factor C zimógeno de la presente invención" pueden usarse indistintamente, tal como se ha mencionado anteriormente en el presente documento. Como alternativa, el "factor C zimógeno (recombinante) de la presente invención" se puede designar como "factor C proenzima (recombinante) de la presente invención". En cualquier caso, el factor C recombinante obtenido directamente de un método de la presente invención se caracteriza por la forma de zimógeno de dos cadenas que comprende una cadena pesada (H) y una cadena ligera (L).

El peso molecular de la proteína del factor C de la SEQ ID NO: 4 calculado sobre la base de la secuencia de

65 aminoácidos primaria es de 110 kDa (109,7 kDa). El alcance de la presente invención abarca realizaciones, en las que el factor C recombinante de la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos primaria modificada, por

ejemplo, un truncamiento en el extremo N o C. En tales casos, se cambia el peso molecular calculado sobre la base de la secuencia primaria. Por lo tanto, calculado sobre la base de la secuencia de aminoácidos primaria, el alcance de la presente invención abarca proteínas recombinantes del factor C que tienen cualquier peso molecular en el intervalo entre 90 y 130 kDa, preferentemente cualquier peso molecular en el intervalo entre 95 y 125 kDa, más

5 preferentemente cualquier peso molecular en el intervalo entre 100 y 120 kDa, y aún más preferentemente cualquier peso molecular en el intervalo entre 105 y 115 kDa. Incluso más preferentemente, la proteína del factor C recombinante de la presente invención tiene un peso molecular en el intervalo de 108 a 112 kDa, calculado sobre la base de la secuencia de aminoácidos primaria.

De manera sorprendente, el peso molecular de la forma de zimógeno del Factor C determinado por SDS-PAGE resultó ser inferior al peso molecular calculado sobre la base de la secuencia de aminoácidos primaria. En particular, la forma de zimógeno del factor C producido por un método de acuerdo con la presente invención tiene un peso molecular de 102 kDa según se determina por SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Adicionalmente, la forma de zimógeno del factor C producido por un método de acuerdo con la presente invención tiene un peso molecular de

15 106 kDa (incluyendo glicosilación) según se determina por SDS-PAGE en condiciones no reductoras, resultante de un peso molecular de 69 kDa determinado para la cadena H y un peso molecular de 37 kDa para la cadena L. Por lo tanto, la presente invención abarca proteínas del factor C recombinantes que tienen un peso molecular de aproximadamente 102 kDa según se determina por SDS-PAGE en condiciones no reductoras y proteínas del factor C recombinantes que tienen un peso molecular de aproximadamente 106 kDa (incluyendo glicosilación) según lo determinado por SDS-PAGE en condiciones reductoras.

Tras la activación del factor C en presencia de endotoxina, quimotripsina o lípido A (conversión autocatalítica del factor C en la forma activada), se produce una escisión en la cadena L, lo que da lugar a la aparición de dos nuevos fragmentos, una cadena B y una cadena A. Por lo tanto, el factor C recombinante de la presente invención se

25 caracteriza además porque la activación de la forma de zimógeno obtenida directamente de un método de la presente invención por endotoxina, quimotripsina o lípido A (conversión autocatalítica del factor C en la forma activada) da como resultado factor C activado que comprende una cadena B y una cadena A debido a la escisión de la cadena L del factor C zimógeno.

Vectores y plásmidos

En diversas realizaciones, el polinucleótido que codifica la proteína del factor C heteróloga de cangrejo herradura utilizada en la presente invención está compuesto por una molécula de ácido nucleico, preferentemente un vector, que se introduce en la célula huésped de protozoo parásito. En otras palabras, en diversas realizaciones, el

35 polinucleótido que codifica una proteína del factor C heteróloga de cangrejo herradura de acuerdo con la presente invención se incorpora en un vector o un plásmido. En diversas realizaciones, se usan dos o más de tales vectores o plásmidos. En diversas realizaciones, el vector o plásmido es un vector lineal o un plásmido lineal. En diversas realizaciones adicionales, el vector o plásmido puede ser un vector circular o un plásmido circular.

En el presente documento se divulga un vector o plásmido que comprende un polinucleótido heterólogo utilizado en la presente invención, es decir, un polinucleótido heterólogo que codifica una proteína del factor C heteróloga de un cangrejo herradura. El polinucleótido heterólogo puede estar flanqueado por UTR (regiones no traducidas sin traducir) en 5' y 3' de un gen transcrito activamente de un protozoo parásito cinetoplástido. Específicamente, el polinucleótido heterólogo que codifica la proteína del factor C heteróloga puede estar flanqueado por UTR en 5' y 3'

45 de un gen transcrito activamente de un miembro del orden Trypanosomatida, más específicamente por UTR en 5' y 3' de un gen transcrito activamente de un miembro del género Leishmania, y aún más específicamente por UTR en 5' y 3' de un gen transcrito activamente de Leishmania tarentolae.

En diversas realizaciones, el vector o plásmido comprende un promotor, que está localizado corriente arriba del polinucleótido heterólogo.

En diversas realizaciones, el vector o plásmido comprende un promotor, que está localizado corriente arriba del polinucleótido heterólogo, además de las UTR en 3' y 5'.

55 En diversas realizaciones, el vector o plásmido comprende una o más secuencias señal para una secreción, un empalme y/o una poliadenilación eficaces de la proteína del factor C heteróloga que resulta de la expresión del polinucleótido heterólogo en la célula huésped del protozoo. En diversas realizaciones, la secuencia señal deriva de un protozoo parásito cinetoplástido. Preferentemente, la secuencia señal deriva de un miembro de la orden Trypanosomatida, más preferentemente de un miembro del géneroLeishmania, y aún más preferentemente de Leishmania tarentolae.

Lo más preferentemente, la secuencia señal tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. También se divulgan en el presente documento variantes como fragmentos y/o derivados funcionales de dichas secuencias señal, en particular de la secuencia señal de la SEQ ID NO: 5.

65 En diversas realizaciones, el vector o plásmido comprende uno o más genes marcadores seleccionables.

En el presente documento se divulga el uso del vector o plásmido para la liberación de un polinucleótido heterólogo que codifica una proteína del factor C heteróloga de un cangrejo herradura en una célula huésped protozoo de la presente invención. La administración puede ser la transfección de la célula huésped protozoo.

5 El alcance de la presente divulgación abarca el uso del vector o plásmido divulgado en el presente documento en cualquier sistema de expresión descrito en el presente documento.

La transfección de la especie de la célula huésped puede realizarse usando cantidades de ADN que oscilan entre 1100 μg. La selección se puede realizar con técnicas de siembra y condiciones adecuadas para la selección de antibióticos, o mediante el uso de cualquier técnica de dilución. La eficacia de la transfección varía ampliamente según la especie elegida, siendo la más alta para especies de Leishmania.

En diversas realizaciones, una sola célula puede contener y/o mantener varias construcciones de expresión. Preferentemente, todas las diversas construcciones de expresión llevan diferentes marcadores de selección. Los

15 niveles de expresión varían significativamente dependiendo del huésped y la construcción elegida, con los plásmidos episomales en el extremo inferior de la escala, pero capaces de generar proteína recombinante hasta en un 1 % de la proteína celular total.

Los resultados experimentales proporcionados en el presente documento muestran claramente que una célula huésped de tripanosoma cinetoplastídico es capaz de expresar una proteína del factor C del cangrejo herradura heteróloga y recombinante, que puede activarse por endotoxina, quimotripsina o lípido A para convertirse en una enzima activa. Se entiende que esta capacidad no se limita a miembros del orden Trypanosomatida (tripanosomas cinetoplástidos), sino que es una característica del protozoo parásito cinetoplástido en su conjunto. Los expertos en la materia reconocerán que el tripanosoma cinetoplástido distinto de los miembros del género Leishmania también

25 se puede usar para la expresión recombinante del factor C heterólogo.

En diversas realizaciones, el vector o plásmido comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una o más proteínas para fusionarse con la proteína del factor C producida por un método de la presente invención. Estas realizaciones proporcionan la producción de proteínas de fusión o proteínas quiméricas de la proteína del factor C mediante los métodos de la presente invención.

El alcance de la presente invención abarca vectores y plásmidos, que comprenden una o más secuencias de ácido nucleico, que codifican una o más proteínas del factor C recombinantes de cangrejo herradura.

35 Métodos para producir el factor C

La presente invención proporciona un método para producir el factor C a partir de un cangrejo herradura, comprendiendo el método las etapas de (a) cultivar células de un protozoo parásito de la presente invención en condiciones tales que las células del protozoo parásito expresan el factor C codificado por el polinucleótido y (b) recuperar el factor C producido en l etapa (a) del cultivo celular. Las células usadas en los métodos para producir el factor C de cangrejo herradura de acuerdo con la presente invención son células huésped como se describe en el presente documento. Por lo tanto, está claro que las células huésped usadas en los métodos para producir factor C de cangrejo herradura de acuerdo con la presente invención comprenden un polinucleótido que codifica factor C de cangrejo herradura como se describe en el presente documento.

45 En diversas realizaciones, el método para producir factor C de cangrejo herradura de acuerdo con la presente invención comprende una etapa de transfección de una célula huésped de protozoo parásito con un vector o plásmido de la presente invención. Obviamente, dicha etapa precede a la etapa de cultivo de la célula huésped en condiciones tales que se expresa el factor C recombinante. Preferentemente, la célula huésped de protozoo parásito es una célula huésped de protozoo parásita de cinetoplástido. Más preferentemente, la célula huésped de protozoo parásito cinetoplástido es un tripanosomátido digenético (es decir, un miembro digenético del orden Trypanosomatida). Aún más preferentemente, la célula huésped de protozoo parásito es una célula del orden Trypanosomatida. Incluso más preferentemente, la célula huésped de protozoo parásito es una célula del género Leishmania. Lo más preferentemente, la célula huésped de protozoo parásito es Leishmania tarentolae.

55 En diversas realizaciones, el método para producir proteína del factor C de cangrejo herradura en una célula huésped o sistema de expresión de acuerdo con la presente invención comprende cultivar una célula huésped transfectada estable de la presente en un medio de selección para la expresión constitutiva del gen heterólogo, donde la célula huésped transfectada estable comprende (a) una secuencia de ADN que codifica un gen de un marcador seleccionable y (b) una secuencia de ADN heterólogo que codifica la proteína del factor C de cangrejo herradura operativamente unida e integrada en el gen transcrito activamente.

En diversas realizaciones, el método para producir proteína del factor C de cangrejo herradura en una célula huésped o sistema de expresión de acuerdo con la presente invención comprende cultivar una célula huésped

65 transfectada estable de la presente en un medio de selección para la expresión constitutiva del gen heterólogo, donde la célula huésped transfectada estable comprende (A) una secuencia de ADN que codifica un gen de un

marcador seleccionable y (b) una secuencia de ADN heterólogo que codifica la proteína del factor C de cangrejo herradura operativamente unida a un ADN plasmídico mantenido episómicamente con un promotor activo.

En diversas realizaciones, el método para producir proteína del factor C de cangrejo herradura en una célula

5 huésped o sistema de expresión de acuerdo con la presente invención comprende cultivar una célula huésped transfectada estable del presente documento, donde la célula huésped transfectada estable comprende: (a) una secuencia de ADN que codifica una ARN polimerasa heteróloga, integrada en un grupo de genes transcritos activamente, (b) (una secuencia de ADN que codifica un marcador seleccionable integrado en un grupo de genes transcritos activamente, (c) una secuencia de ADN que codifica un gen represor de la transcripción integrado en un grupo de genes transcritos de forma activa y (d) una secuencia de ADN heteróloga que codifica la proteína del factor C de cangrejo herradura precedida por el promotor de la ARN polimerasa heteróloga y un elemento sensible al represor, y donde la célula huésped transfectada estable se cultiva con un marcador seleccionable y la expresión del gen heterólogo se induce con un inhibidor del represor heterólogo.

15 El alcance de la presente invención abarca realizaciones del método para producir el factor C según la presente invención, donde el factor C recombinante de cangrejo herradura se acumula dentro de la célula huésped. El alcance de la presente invención también abarca realizaciones del método para producir el factor C según la presente invención, donde el factor C recombinante de cangrejo herradura se acumula en el medio de cultivo celular debido a la secreción de la proteína expresada. Por lo tanto, en diversas realizaciones, la etapa de recuperar el factor C producido en la etapa (a) del cultivo celular significa recuperar el factor C de las células huésped, donde la proteína del factor C expresado se acumula. La recuperación del factor C de las células huésped, en las que se acumula la proteína del factor C, incluye, aunque no de forma limitativa, una etapa de lisis de las células huésped. Las técnicas de ejemplo para la lisis celular incluyen, aunque no de forma limitativa, ultrasonidos, prensa francesa y lisis enzimática. La recuperación del factor C de las células huésped, en las que se acumula la proteína del factor C,

25 puede incluir una etapa separada de extracción de la proteína del factor C expresada después de la lisis de la célula huésped.

En varias otras realizaciones, la etapa de recuperar el factor C producido en la etapa (a) del cultivo celular significa recuperar el factor C del medio de cultivo celular, donde el factor C se acumula en el medio de cultivo celular debido a la secreción de la proteína expresada. La recuperación del factor C del medio de cultivo celular, donde la proteína del factor C se acumula debido a la secreción de la proteína expresada, puede incluir además una etapa separada de extracción de la proteína del factor C expresada después del medio de cultivo celular.

En diversas realizaciones, la etapa de recuperar el factor C producido en la etapa (a) del cultivo celular significa

35 recuperar el factor C de las células huésped y el medio de cultivo celular al mismo tiempo. En el presente documento, la etapa de recuperar el factor C incluye, aunque no de forma limitativa, una etapa de lisis de las células huésped.

En diversas realizaciones, la etapa de recuperar la proteína del factor C descrita anteriormente se puede considerar como una etapa de aislamiento de la proteína del factor C del cultivo celular, en particular de las células huésped y el medio de cultivo celular, respectivamente.

En diversas realizaciones, el factor C obtenido directamente a partir de un método de acuerdo con la presente invención se puede considerar como factor C purificado, que es directamente aplicable para la detección de

45 endotoxinas y/o la eliminación de endotoxinas. Sin embargo, en diversas realizaciones, el método para producir el factor C de acuerdo con la presente invención puede comprender una etapa separada de purificación del factor C obtenido directamente del proceso de producción. Preferentemente, el método para producir el factor C de acuerdo con la presente invención puede comprender una etapa de purificación del factor C por medios cromatográficos. Los ejemplos de medios cromatográficos incluyen, aunque no de forma limitativa, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía en fase inversa y cromatografía de afinidad. Claramente, dicha etapa separada de purificación de la proteína del factor C por medios cromatográficos sigue cualquier etapa de recuperación/aislamiento de la proteína del factor C como se ha descrito anteriormente.

En diversas realizaciones, el método para producir el factor C de acuerdo con la presente invención puede

55 comprender una etapa de concentración y/o estabilización de la proteína del factor C obtenida después de la recuperación de la proteína del factor C. En diversas realizaciones, el método para producir el factor C de acuerdo con la presente invención puede comprender una etapa de concentración y/o estabilización de la proteína del factor C obtenida después de la purificación de la proteína del factor C por medios cromatográficos. La etapa de estabilización de la proteína del factor C puede incluir el uso de un agente estabilizante de proteínas. Entre los ejemplos de agentes estabilizantes de proteínas se incluyen, aunque no de forma limitativa, agentes reductores, concentraciones altas de sales monovalentes o bivalentes, aditivos hidrófobos, aditivos anfifílicos y glicerol. En diversas realizaciones, la etapa de concentrar la proteína del factor C incluye la concentración del sobrenadante del cultivo resultante del proceso de producción, es decir, la etapa de concentración se realiza antes de la etapa de recuperación/aislamiento como se ha descrito anteriormente. En varias otras realizaciones, la etapa de concentrar la

65 proteína del factor C incluye la concentración de la solución de la proteína del factor C, que se obtiene después de realizar la etapa de recuperación/aislamiento de la proteína del factor C como se ha descrito en el presente

documento anteriormente, es decir, la etapa de concentración se realiza DESPUÉS de la etapa de recuperación/aislamiento como se ha descrito anteriormente. Los medios y métodos para concentrar la proteína del factor C incluyen, aunque no de forma limitativa, filtración, captura cromatográfica y elución, y liofilización.

5 Se ha demostrado que la proteína del factor C de cangrejo herradura producida por un método de la presente invención es enzimáticamente activa tras la unión a endotoxina o quimotripsina, tal como se describe en el ejemplo

4. El hecho de que el factor C así producido retenga la bioactividad de tener la actividad enzimática de tipo factor C es un rasgo técnico característico del factor C recombinante proporcionado por la presente invención debido a que muchos intentos en la técnica de producir factor C enzimáticamente activo en varias células huésped han fallado, como se ha tratado anteriormente en el presente documento. Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que la producción recombinante de factor C de cangrejos herradura en una célula huésped protozoo proporciona una proteína del factor C, que es enzimáticamente activa tras la activación por endotoxina (o quimotripsina o lípido A). Esto no podría haberse esperado de las enseñanzas de la técnica anterior, según las cuales la producción de la proteína del factor C enzimáticamente activa en procariotas y eucariotas inferiores no

15 proporcionó un Factor enzimáticamente activo, y según el cual se deberían usar sistemas de expresión eucariotas superiores para producir rFC con actividad biológica completa en lugar de un sistema de expresión procariota o eucariota simple como levadura. Como se describe en la sección Antecedentes, el uso exitoso de células de insecto ha llevado a esta enseñanza, en relación con el conocimiento de que las células de insecto se parecen más a las células del cangrejo herradura que las células de levadura en su fisiología y bioquímica. Por lo tanto, se consideró en la técnica que el factor C recombinante se debe producir en las células, que se asemejan más a la proteína purificada de su fuente natural, es decir, cangrejos de herradura, y retienen la bioactividad de tener actividad de serina proteasa después de ser activados por endotoxina.

El alcance de la presente invención abarca la producción de factor C recombinante de cangrejo herradura en cultivos

25 en fermentador basándose en los medios y métodos para producir factor C recombinante descritos en el presente documento. El alcance de la presente invención también abarca una producción de fermentación del factor C recombinante de cangrejo herradura a escala industrial basada en los medios y métodos para producir el factor C recombinante descrito en el presente documento. El alcance de la presente invención abarca el uso de cualquier tipo de fermentador, incluyendo fermentadores a escala de laboratorio y fermentadores a escala industrial. En la producción de fermentación de acuerdo con la presente invención, la concentración de, entre otros, la (s) fuente (s) de carbono se controlan preferentemente durante el cultivo hasta una concentración tal que sustancialmente no se producen efectos adversos sobre la productividad de la proteína del factor C recombinante.

Factor C producido mediante métodos de la presente invención

35 El factor C producido por un método de la presente invención abarca la proteína del factor C que tiene la secuencia de aminoácidos del factor C tal como se encuentra en su fuente natural, es decir, como se puede obtener a partir de cangrejos herradura, así como a sus variantes como se describe en el presente documento. De manera similar, el factor C producido por un método de la presente invención abarca la proteína del factor C codificada por una secuencia de ácido nucleico, que es idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica el Factor C tal como se encuentra en su fuente natural, es decir, como se puede obtener a partir de cangrejos herradura, así como a sus variantes como se describe en el presente documento. En cualquier caso, la proteína del factor C producida mediante un método de la presente invención muestra actividad enzimática de tipo factor C al activarse con endotoxina (o quimotripsina o lípido A).

45 En la presente invención, la expresión "Factor C producido por un método de la presente invención" abarca "Factor C obtenido (u obtenible) a partir de un método de la presente invención". Dichos términos pueden usarse indistintamente.

La producción del factor C de cangrejo herradura en una célula huésped protozoo, en particular en una célula huésped tripanosomátido (es decir, una célula huésped del orden Trypanosomatida) ilustrada por las células del género Leishmania, proporciona una glucosilación específica del factor C, que es diferente del patrón de glicosilación proporcionado por la expresión del factor C en organismos procariotas, levaduras y sistemas de expresión de eucariotas superiores, como células de insecto. Por lo tanto, el factor C obtenido a partir del método de la presente

55 invención es estructuralmente diferente de la proteína del factor C obtenida a partir de los métodos descritos en la técnica. Por lo tanto, el método para producir el factor C proporcionado por la presente invención proporciona un producto, es decir, factor C recombinante, que, como tal, es nuevo sobre el factor C descrito en la técnica anterior. La presente invención proporciona, por tanto, una nueva proteína del factor C, que tiene un peso molecular de aproximadamente 102 kDa según se determina mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras y que se puede obtener mediante un método para producir el Factor C de cangrejo herradura según la presente invención.

Tal como se usa en el presente documento, una expresión equivalente para "obtenible" se representa mediante los términos "obtenido" u "obtenido directamente".

65 Preferentemente, el factor C producido mediante un método de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos del Factor C de Tachypleus tridentatus,

más preferentemente, el Factor C producido por un método de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. La producción recombinante de factor C de Tachypleus tridentatus no se ha descrito anteriormente. En particular, la producción del factor C de achypleus tridentatus en un huésped protozoo parásito, específicamente en una célula huésped tripanosomátido (es decir, una célula huésped del orden Trypanosomatida)

5 ilustrada por las células del género Leishmania, no se ha descrito anteriormente.

La proteína del factor C recombinante de la presente invención se puede aislar y purificar a partir de una célula huésped protozoo de la presente invención que contiene o expresa la proteína del factor C recombinante mediante técnicas conocidas en la materia, que incluyen, aunque no de forma limitativa, lisis, cromatografía, filtración y centrifugación. Lo mismo se aplica con respecto al aislamiento y la purificación del factor C recombinante de la presente invención a partir del medio de cultivo celular en caso de que la proteína expresada se secrete y se acumule en el medio de cultivo celular. Tal como se ha explicado anteriormente en el presente documento, en diversas realizaciones, el factor C obtenido directamente a partir de un método de la presente invención se puede considerar como factor C purificado, es decir, sin la aplicación de purificación específica del Factor C por medios 15 cromatográficos. En particular, para ciertas aplicaciones del factor C, la proteína puede aislarse de la célula huésped (en caso de que la proteína del factor C se acumule intracelularmente) o del medio de cultivo celular (en caso de que la proteína del factor C se secrete en el medio de cultivo celular) sin realizar una etapa de purificación separada que implica medios cromatográficos. En diversas realizaciones, incluso el medio de cultivo celular que contiene la proteína del factor C secretada y acumulada puede usarse para ciertas aplicaciones de detección de endotoxinas o eliminación de endotoxinas. El alcance de la presente invención abarca el uso del medio de cultivo celular que contiene el Factor C, donde el medio de cultivo celular se ha concentrado y/o la proteína del factor C en el medio de cultivo celular se ha estabilizado antes de la aplicación del medio de cultivo celular. Los medios y métodos para concentrar el medio de cultivo celular incluyen, aunque no de forma limitativa, filtración, captura cromatográfica y elución, y liofilización. Adicionalmente, la proteína del factor C contenida en el medio de cultivo celular puede incluir

25 el uso de un agente estabilizante de proteínas. Entre los ejemplos de agentes estabilizantes de proteínas se incluyen, aunque no de forma limitativa, agentes reductores, concentraciones altas de sales monovalentes y bivalentes, aditivos hidrófobos, aditivos anfifílicos y glicerol.

En diversas realizaciones, la proteína del factor C recombinante aislada y/o purificada producida por la presente invención está marcada. Preferentemente, el marcador se selecciona del grupo que consiste en un marcador enzimático, un radioisótopo, un marcador fluorescente y biotina.

También está abarcado por la presente invención el factor C recombinante producido por un método de la presente invención, que se combina con parte o partes del dominio constante de una inmunoglobulina (IgG), dando como

35 resultado un Factor C quimérico proporcionado por la presente invención. Estas proteínas de fusión pueden facilitar el aislamiento y/o la purificación del Factor C proporcionado según los métodos de la presente invención.

El alcance de la presente invención abarca proteínas de fusión del factor C recombinante, que se puede producir mediante métodos para producir proteína del factor C de la presente invención.

La presente invención proporciona adicionalmente proteínas quiméricas que comprenden el factor C producido de acuerdo con un método de la presente invención y una o más proteínas heterólogas.

Como se ha descrito anteriormente en el presente documento, el Factor C recombinante de la presente invención se

45 produce como un zimógeno (o proenzima), que es inducible por la presencia de niveles traza de endotoxina. Específicamente, el Factor C obtenido mediante un método de la presente invención se convierte (auto)catalíticamente en su forma activa en presencia de endotoxina. El factor C producido mediante un método de la presente invención se puede proteger de la activación por endotoxina y escisión autocatalítica de la cadena L al poner en contacto el factor C producido con un agente estabilizante similar, por ejemplo, DMSO, 2-propanol, o inhibidores de proteasa y, opcionalmente, un agente quelante. Si la proteína del factor C tras la expresión se acumula intracelularmente dentro de una célula huésped protozoo de acuerdo con la presente invención, dicho contacto puede realizarse lisando las células huésped en presencia de DMSO y, opcionalmente, un agente quelante. Si la proteína del factor C de la presente invención se secreta en el medio de cultivo celular, dicho contacto puede realizarse añadiendo DMSO y, opcionalmente, un agente quelante, al medio de cultivo celular antes de aislar y/o

55 purificar adicionalmente la proteína del factor C. Por supuesto, en diversas realizaciones, dicho contacto puede realizarse añadiendo DMSO y, opcionalmente, un agente quelante, al medio de cultivo celular después de aislar y/o purificar adicionalmente la proteína del factor C. Básicamente, se puede agregar DMSO a las soluciones que se utilizan durante el proceso de aislamiento y/o purificación. Incluso una mayor protección del factor C producido mediante un método de acuerdo con la presente invención se consigue añadiendo también a la solución de aislamiento/purificación un agente eficaz para quelar los iones metálicos divalentes.

En diversas realizaciones, la proteína del factor C de la presente invención se acumula intracelularmente dentro de una célula huésped protozoo de acuerdo con la presente invención. En varias otras realizaciones, la proteína del factor C de la presente invención se acumula en el medio de cultivo celular del cultivo de células huésped protozoo 65 de acuerdo con la presente invención. La acumulación de la proteína del factor C en el medio de cultivo celular normalmente se debe a la secreción de la proteína expresada. Sin embargo, el alcance de la presente invención

abarca también realizaciones, en las que la acumulación de la proteína del factor C en el medio de cultivo celular normalmente se debe a la lisis de las células huésped, donde la proteína del factor C se acumuló primero intracelularmente. Las técnicas de ejemplo para la lisis celular realizadas después de la expresión y la acumulación intracelular de la proteína del factor C incluyen, aunque no de forma limitativa, ultrasonidos, prensa francesa y lisis

5 enzimática.

Los marcadores de afinidad se fijan a las proteínas para que puedan purificarse de su fuente biológica en bruto usando una técnica de afinidad. El alcance de la presente invención abarca el Factor C producido mediante un método de la presente invención, donde el Factor C producido comprende un marcador de afinidad para la purificación. Dichos marcadores de purificación incluyen, aunque no de forma limitativa, marcadores de aminoácidos y peptídicos HIS, CBP, CYD (péptido NorpD covalente aunque disociable), Strep II, FLAG, y HPC (cadena pesada de la proteína C, así como los sistemas marcadores de fusión proteica GST y MBP.

La presente invención también comprende la proteína del factor C producida por la presente invención que lleva un

15 marcador químico. Un ejemplo de marcador químico es la biotina, que proporciona la purificación mediante unión estrecha a estreptavidina-agarosa o estreptavidina-perlas. La biotinilación del factor C de la presente invención también incluye el factor C biotinilado para la inmovilización del factor C sobre las superficies. El marcador biotina puede usarse en cromatografía de afinidad con una columna que tiene avidina (también estreptavidina o neutravidina) unida a ella. El marcador biotina también se puede usar para la detección de factor C a través de anticuerpos anti-biotina o estrategias de detección marcadas con avidina/estreptavidina, tales como los indicadores de enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina) o sondas fluorescentes. Esto puede ser útil en métodos inmunoanalíticos que incluyen, aunque no de forma limitativa, ensayos ELISA.

Factor C purificado

25 Como se describe en el presente documento, la presente invención proporciona el factor C que tiene un peso molecular de aproximadamente 102 kDa según se determina mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras producidas por un método de acuerdo con la presente invención. El Factor C obtenido a partir de un método según la presente invención se puede aplicar directamente a métodos para la detección de endotoxinas o la eliminación de endotoxinas sin ninguna purificación por separado por medios cromatográficos. Por lo tanto, como se describe en el presente documento ya en otra parte, el factor C obtenido directamente a partir de un método de acuerdo con la presente invención se puede considerar, por tanto, factor C purificado. La presente invención también abarca el Factor C, que se purifica adicionalmente mediante medios cromatográficos, es decir, el Factor C producido por un método según la presente invención u obtenido directamente a partir de un método de acuerdo con la presente

35 invención se purifica adicionalmente por medios cromatográficos. La aplicación de medios cromatográficos incluye, aunque no de forma limitativa, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía en fase inversa y cromatografía de afinidad.

En diversas realizaciones, el factor C purificado de acuerdo con la presente invención incluye, aunque no de forma limitativa, el factor C aislado, concentrado y/o estabilizado. El Factor C aislado incluye, aunque no de forma limitativa, el Factor C aislado a partir del cultivo celular o del medio de cultivo celular obtenido del cultivo de una célula huésped protozoo para producir el factor C de acuerdo con la presente invención. El Factor C concentrado incluye, aunque no de forma limitativa, el factor C concentrado a partir del cultivo celular o del medio de cultivo celular obtenido del cultivo de una célula huésped protozoo para producir el factor C de acuerdo con la presente

45 invención. Los medios y métodos para concentrar el Factor en consecuencia incluyen, aunque no de forma limitativa, filtración, captura cromatográfica y elución, y liofilización. El Factor C estabilizado incluye, aunque no de forma limitativa, el factor C estabilizado por un agente estabilizante de proteína. Entre los ejemplos de agentes estabilizantes de proteínas se incluyen, aunque no de forma limitativa, agentes reductores, concentraciones altas de sales monovalentes y bivalentes, aditivos hidrófobos, aditivos anfifílicos y glicerol.

En diversas realizaciones, el factor C purificado de acuerdo con la presente invención incluye, aunque no de forma limitativa, el factor C purificado de manera intermedia, que significa Factor C, que se purifica a partir de la mayoría de las impurezas en masa, tales como otras proteínas y ácidos nucleicos.

55 En diversas realizaciones, el factor C purificado de acuerdo con la presente invención incluye, aunque no de forma limitativa, factor C de alta pureza, que significa factor C purificado a partir de cualquier resto de impurezas traza o sustancias estrechamente relacionadas.

En diversas realizaciones, el factor C proporcionado por la presente invención, o producido por un método de la presente invención, tiene una pureza de al menos el 75 % o al menos el 80 %, es decir, el factor C constituye al menos el 75 % o al menos el 80 % de la proteína total. En diversas realizaciones, el factor C proporcionado por la presente invención, o producido por un método de la presente invención, tiene una pureza de al menos el 85% o al menos el 90%, es decir, el factor C constituye al menos el 85 % o al menos el 90 % de la proteína total. En diversas realizaciones, el factor C proporcionado por la presente invención, o producido por un método de la presente 65 invención, tiene una pureza de al menos el 95% o al menos el 96%, es decir, el factor C constituye al menos el 95%

o al menos el 96% de la proteína total. En diversas realizaciones, el factor C proporcionado por la presente

invención, o producido por un método de la presente invención, tiene una pureza de al menos el 97% o al menos el 98%, es decir, el factor C constituye al menos el 97% o al menos el 98% de la proteína total. En diversas realizaciones, el factor C proporcionado por la presente invención, o producido por un método de la presente invención, tiene una pureza de al menos el 99% o incluso el 100%, es decir, el factor C constituye al menos el 99 %

5 o al menos el 100 % de la proteína total.

Anticuerpos

También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a una proteína del factor C de cangrejo herradura o fragmento de la misma proporcionada por la presente invención u obtenida de un método de la presente invención. El anticuerpo se puede unir específicamente al factor C de cangrejo herradura de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo quimérico, un fragmento

15 Fab, un fragmento F(ab’)2 o un fragmento scFv. El anticuerpo divulgado en el presente documento puede marcarse. El marcador puede ser un marcador enzimático, un radioisótopo, un marcador fluorescente o biotina. La proteína del factor C de cangrejo herradura de la presente invención se puede usar para producir anticuerpos policlonales y monoclonales. Los anticuerpos se pueden preparar mediante cualquiera de una variedad de métodos disponibles en la técnica y conocidos por los expertos en la técnica. Los fragmentos de anticuerpos divulgados en el presente documento, ya sea unidos a otras secuencias o no, también pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones u otras modificaciones seleccionadas de regiones particulares o restos de aminoácidos específicos, con la condición de que la actividad del fragmento de anticuerpo no se altere o deteriore significativamente. comparado con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo no modificado. Estas modificaciones pueden proporcionar alguna propiedad adicional, tal como eliminar/agregar aminoácidos capaces de formar puentes disulfuro. En cualquier caso, los

25 fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la presente invención deben poseer una propiedad bioactiva, tal como unión específica a su antígeno afín.

Las regiones funcionales o activas de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento pueden identificarse por mutagénesis de una región específica de la proteína, seguido de expresión y prueba del polipéptido expresado. Dichos métodos son fácilmente evidentes para un experto en la técnica y pueden incluir mutagénesis específica de sitio del ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

Composiciones y soluciones

35 En el presente documento se divulgan composiciones que comprenden proteína del factor C recombinante de cangrejo herradura producida de acuerdo con un método de la presente invención. En el presente documento también se divulga una composición que comprende un polinucleótido o molécula de ácido nucleico como se divulga en el presente documento. En el presente documento también se divulga una composición que comprende un vector

o plásmido como se divulga en el presente documento. En el presente documento se divulga adicionalmente una composición que comprende una célula huésped de protozoo parásito de acuerdo con la presente invención. En el presente documento se divulga adicionalmente una composición que comprende una proteína de fusión o una proteína quimérica de acuerdo con la presente invención.

Una composición de acuerdo con la presente divulgación puede ser una composición de diagnóstico.

45 Una composición de acuerdo con la presente divulgación puede ser una composición para detectar endotoxina, específicamente para detectar endotoxina en una muestra. En varios aspectos, la muestra es una muestra ambiental. En varios aspectos, la muestra es una muestra biológica. En diversas realizaciones, la muestra es una muestra de prueba, específicamente una muestra de prueba biológica o ambiental. Específicamente, la muestra biológica o la muestra de prueba biológica es una muestra biológica o muestra de prueba biológica obtenida de un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano. El alcance de la presente invención abarca la detección de endotoxinas en una muestra obtenida de animales que incluyen, aunque no de forma limitativa, perros, gatos, cerdos, caballos, aves y reptiles.

55 En el presente documento se divulgan soluciones, específicamente soluciones de diagnóstico, que comprenden la proteína del factor C recombinante de la presente invención. En el presente documento también se divulgan soluciones para eliminar la endotoxina que comprende el factor C recombinante producido de acuerdo con un método de la presente invención.

En diversas realizaciones, el factor C de cangrejo herradura producido mediante un método de acuerdo con la presente invención u obtenido de un método de la presente invención se puede designar como un agente para medir/detectar endotoxina (agente de detección/medición de endotoxina). En diversas realizaciones, el Factor C de cangrejo herradura producido mediante un método de acuerdo con la presente invención u obtenido de un método de la presente invención se puede designar como un agente para eliminar endotoxina (agente eliminador de

65 endotoxina).

Las composiciones y soluciones divulgadas en el presente documento, que comprenden el factor C de cangrejo herradura de la presente invención, pueden comprender además un componente distinto del Factor C recombinante producido por un método de la presente invención. En particular, el agente puede comprender además un sustrato de Factor C para la detección, siempre que el agente pueda usarse para la medición/detección de endotoxina.

5 Las composiciones y soluciones que contienen factor C divulgadas en el presente documento también pueden comprender, por ejemplo, un agente tampón del pH y/o una sal, preferentemente una sal quelante. Los ejemplos de agentes tamponadores de pH incluyen, aunque no de forma limitativa, tampón HEPES, tampón MES y tampón Tris. Los disolventes orgánicos tales como alcoholes, ésteres, cetonas y amidas también pueden estar comprendidas en las composiciones y soluciones divulgadas en el presente documento.

El agente de detección/medición de endotoxina y/o el agente de eliminación de endotoxina de la presente divulgación se pueden formular en una forma arbitraria que incluye, aunque no de forma limitativa, una forma sólida, una forma líquida y una forma de gel. Se pueden usar aditivos como vehículos de formulación, incluyendo, aunque

15 no de forma limitativa, vehículos, aglutinantes, disgregantes, lubricantes, estabilizantes, correctores y diluyentes y disolventes.

En varios aspectos, las composiciones y soluciones de la presente divulgación, que comprenden el factor C de cangrejo herradura recombinante de la presente invención, pueden comprender además un tensioactivo. Por lo tanto, en el presente documento se divulga un reactivo para detectar endotoxina, que comprende una proteína del factor C de cangrejo herradura producida de acuerdo con un método de la presente invención u obtenida de un método de la presente invención, y un agente tensioactivo. En varios aspectos, el tensioactivo es un tensioactivo anfótero. En varios otros aspectos, el tensioactivo es un tensioactivo aniónico o un tensioactivo catiónico. En varios otros aspectos, el tensioactivo es un tensioactivo no iónico. Especialmente, el tensioactivo se selecciona del grupo

25 que consiste en ZWITTERGENT 3-14, Triton X-100, Triton X-114, octil-beta-D-tioglucósido, Genapol C-100, Tween 20 y Tween 80. Específicamente, el tensioactivo está presente en una composición o solución divulgada en el presente documento a una concentración de 0,001 a 0,5 %, más específicamente a una concentración de 0,001 a 0,025 %, aún más específicamente a una concentración de 0,001 a 0,01 %. En varios aspectos, el tensioactivo está presente en una composición o solución divulgada en el presente documento a una concentración de 0,004 a 0,006 %.

La proteína de Factor C de cangrejo herradura de la presente invención puede usarse para medir/detectar endotoxina como tal o puede usarse después de diluir, dispersar o disolver en agua, solución salina fisiológica, tampón o similares. "Proteína del factor C como tal" abarca cualquier forma de proteína del factor C obtenida

35 directamente de un método de la presente invención, incluyendo factor C aislado, concentrado y/o purificado obtenido de un método de la presente invención. El alcance de la presente invención también abarca "proteína del factor C como tal" obtenida después de purificarse por medios cromatográficos. Tales realizaciones están dentro del alcance de la presente invención.

Métodos para la detección de endotoxina

El factor C recombinante proporcionado por la presente invención forma la base de un ensayo de diagnóstico de endotoxina para cribados de alto rendimiento de endotoxina. El factor C zimógeno recombinante activado por endotoxina hidroliza catalíticamente los sustratos sintéticos para formar productos medibles, cuantificando así la

45 endotoxina.

La presente invención proporciona el uso de proteína del factor C de cangrejo herradura producida mediante métodos para producir el factor C de acuerdocon la presente invención en un método para la detección de endotoxina, donde la proteína del factor C producida exhibe actividad de serina proteasa al unirse a la endotoxina. En diversas realizaciones, el factor C de cangrejo herradura de la presente invención se usa en un método para detección de endotoxina que comprende poner en contacto una muestra, preferentemente una muestra de prueba, para analizar la presencia de endotoxina (LPS) o lípido A con factor C de herradura de herradura recombinante. según la invención, y medir la actividad enzimática (es decir, actividad de serina proteasa) del factor C recombinante. La actividad enzimática delfactor C recombinante refleja su activación debido a la unión de endotoxina o lípido A, o

55 de otra endotoxina conocida en la técnica para unirse al factor C de un cangrejo herradura. La actividad enzimática del factor C (en particular la actividad de serina proteasa) se mide convenientemente por cualquier método conocido en la técnica, pero se mide preferentemente mediante un método cromogénico o fluorogénico. Tales métodos comprenden medir la formación de un producto, que resulta de la escisión de un sustrato del factor C por la actividad proteasa del Factor C recombinante. La medición se basa en un cambio de color (en el caso de un sustrato cromogénico) o emisión de fluorescencia ( en el caso de un sustrato fluorogénico) resultante de la escisión del sustrato. El alcance de la presente invención abarca el uso de sustratos de factor C cromogénicos y fluorogénicos, que incluyen, aunque no de forma limitativa, sustratos de peptidil-pNA cromogénicos y sustratos de peptidil-AMC, peptidil-AFC y peptidil-MCA fluorogénicos. Los sustratos preferentes para dicho ensayo cromogénico o fluorogénico son N-t-Boc-VPR-MCA, N-t-Boc-VPR-AMC, Mu-VPR-AFC y Boc-VPR-pNA.

65 Otros aspectos de la presente divulgación incluyen métodos inmunológicos para analizar la presencia de endotoxina

o lípido A en una muestra, preferentemente una muestra de prueba. Estos métodos se basan en la unión específica de un anticuerpo al factor C recombinante, seguido de la detección y/o cuantificación del complejo del factor Canticuerpo. La muestra que se va a analizar se puede poner en contacto con un anticuerpo inmovilizado que se une específicamente a la endotoxina o al lípido A. El ligando inmovilizado (es decir, la endotoxina o el lípido A

5 inmovilizado) se pone luego en contacto con el factor C recombinante de acuerdo con la presente invención, dando como resultado un factor C recombinante (rFC) inmovilizado. A continuación, el rFC inmovilizado se pone en contacto con un segundo anticuerpo que se une específicamente al rFC inmovilizado. La presencia y/o la cantidad del complejo inmovilizado, que comprende el rFC unido al segundo anticuerpo, se puede determinar mediante cualquier técnica conocida en la materia, por ejemplo, mediante la aplicación de un tercer anticuerpo que se une específicamente al segundo anticuerpo, por ejemplo, a través de la porción Fc del anticuerpo. En una realización alternativa, en lugar de aplicar el segundo anticuerpo, se mide la actividad enzimática del rFC inmovilizado.

En otro aspecto de la presente divulgación, la unión específica de endotoxina o lípido A a rFC de la presente invención se emplea en ensayos disponibles en el mercado, por ejemplo, el ensayo BIACORE™ (Pharmacia

15 Biotech). Inmovilizando el rFC en la placa de sustrato de tales aparatos, puede detectarse la presencia de endotoxina o lípido A en una muestra. El experto en la materia es capaz de optimizar la cantidad de rFC a inmovilizar para una carga dada de endotoxina en una muestra.

En varios aspectos, el método para detectar endotoxina se realiza en una muestra de prueba, específicamente una muestra de prueba obtenida de un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano. El alcance de la presente divulgación también abarca la detección de endotoxinas en una muestra obtenida de animales, que incluyen, aunque no de forma limitativa, perros, gatos, cerdos, caballos, aves y reptiles.

En varios aspectos, el método para la detección de endotoxina comprende el uso de un soporte sólido pre-recubierto

25 selectivo para endotoxina. En particular, la captura selectiva de endotoxina (LPS) se logra usando una proteína receptora derivada de fago que está dirigida a la parte central interna (es decir, el oligosacárido central interno) o la parte de lípido A del LPS. La estructura central interna del LPS, junto con la parte de lípido A, es una estructura altamente conservada. La estructura central externa es ligeramente variable y el O-antígeno es altamente heterogéneo. La proteína receptora derivada de fago que se utilizará puede exhibir alta afinidad y alta especificidad para las regiones conservadas de la endotoxina. Las regiones altamente conservadas de la endotoxina unidas por dicha proteína receptora derivada de fago abarcan tanto la región central como el lípido A. Por lo tanto, dicha proteína receptora derivada de fago se une a la región central interna (es decir, el oligosacárido central interno) y/o el lípido A. En varios aspectos, dicha proteína receptora derivada de fago es una proteína de la cola del bacteriófago, una proteína de la cabeza del bacteriófago de un bacteriófago con cola, o una proteína de la cubierta del

35 bacteriófago de un bacteriófago sin cola. Específicamente, dicha proteína receptora derivada de fago puede ser una proteína de la cola del bacteriófago. Específicamente, la proteína de la cola del bacteriófago puede ser una proteína de la fibra de la cola del bacteriófago corto. En varios aspectos, la fibra de la cola del bacteriófago corto se selecciona de K3, T2, T4, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 y RB69. En varios aspectos, la proteína de la cola del bacteriófago se modifica para la detección de endotoxina de acuerdo con la presente invención. En diversas realizaciones, la proteína de la cola del bacteriófago puede acoplarse a una proteína activa.

Después de la unión de la endotoxina de muestra (LPS) al soporte sólido prerrecubierto con dicha proteína receptora derivada de fago, la matriz de muestra original se elimina por lavado, eliminando así los componentes que potencialmente interfieren con la reacción de detección. Posteriormente, la endotoxina se detecta mediante el factor

45 C de cangrejo herradura de la presente invención en un proceso, que incluye la reacción del factor C con un sustrato del factor C. En varios aspectos, el sustrato es un sustrato cromogénico o fluorogénico.

En varios aspectos, el soporte sólido que se va recubrir previamente con la proteína receptora derivada de fago es una placa de microtitulación, una perla (por ejemplo, perla de sílice o una perla de polímero orgánico), una lámina o una membrana. Por lo tanto, el método para la detección de endotoxina que incluye el uso de un soporte sólido prerecubierto selectivo para endotoxina comprende tres etapas: la primera etapa comprende la unión de la endotoxina de muestra (es decir, endotoxina contenida en una muestra) a un soporte sólido, que se recubre previamente con una proteína receptora derivada de fago que exhibe alta afinidad y alta especificidad para la región central conservada de LPS. La primera etapa proporciona la inmovilización de la endotoxina de muestra. La segunda etapa 55 es una etapa de lavado para eliminar por lavado la matriz de la muestra original. La tercera etapa comprende la detección de la endotoxina inmovilizada por una proteína del factor C de cangrejo herradura de la presente invención. La tercera etapa incluye la reacción del factor C con un sustrato para el factor C, que da como resultado una señal detectable. En varios aspectos, el sustrato del factor C de cangrejo herradura se agrega después de que la endotoxina inmovilizada se ha puesto en contacto con la proteína del factor C. En varios aspectos, el sustrato del factor C de cangrejo herradura ya está presente en el ensayo antes de que se agregue la proteína del factor C. El efecto técnico específico de este formato de ensayo de tres etapas es que tiene un intervalo de detección de 0,05 UE/ml hasta 500 UE/ml. Adicionalmente, este formato de ensayo presenta claras ventajas sobre los métodos de detección homogéneos establecidos, que incluyen: menos resultados falsos positivos inducidos por, por ejemplo, βglucano, proteasas o fosfolípidos, menos resultados falsos negativos causados por constituyentes inhibidores de la

65 muestra, menos resultados no válidos que requieren repetir las pruebas, menos interferencia en muestras complejas y, por lo tanto, mayor sensibilidad y amplio rango dinámico.

El formato de ensayo de tres etapas es particularmente útil en la detección de endotoxina en fluidos corporales humanos, tales como sangre, suero y plasma. Específicamente, el ensayo de tres etapas descrito anteriormente es para analizar muestras biológicas clínicas. El ensayo no se aplica directamente en un paciente, sino que en su lugar se aplica en una muestra de prueba obtenida de un paciente.

5 En el presente documento se divulga un método para detectar endotoxina en una muestra, que comprende las etapas de (i) poner en contacto una muestra para analizar con un agente de detección de endotoxina de la presente invención para formar una mezcla de la muestra de prueba y el agente de detección de endotoxina, (ii) añadir un sustrato de factor C a dicha mezcla, donde la escisión del sustrato del factor C genera una señal detectable y (iii) analizar dicha mezcla en cuanto a la presencia o ausencia de la señal detectable, donde una cantidad de la señal detectable que es el aumento con respecto a una muestra de control que no contiene endotoxina indica la presencia de endotoxina en la muestra de prueba.

En los ensayos de endotoxina proporcionados por la presente invención, el sustrato del Factor C preferentemente es

15 un sustrato de Factor C cromogénico o fluorogénico. En diversas realizaciones, el sustrato del factor C es un sustrato peptidil-pNA cromogénico. En varias otras realizaciones, el sustrato del factor C es un sustrato de peptidil-AMC, peptidil-AFC o peptidil-MCA fluorogénico. Otros sustratos del factor C a modo de ejemplo incluyen, aunque no de forma limitativa, N-t-Boc-DPR-AMC, N-t-Boc-VPR-AMC, Mu-VPR-AFC y Boc-VPR-pNA. En el presente documento se divulga un método para detectar endotoxina en una muestra, que comprende las etapas de (i) poner en contacto una muestra para analizar con un agente de detección de endotoxina de la presente invención y un sustrato de factor C para formar una mezcla de la muestra de prueba, el agente de detección de endotoxina y el sustrato del Factor C, donde la escisión del sustrato del factor C genera una señal detectable y (ii) analizar dicha mezcla en cuanto a la presencia o ausencia de la señal detectable, donde una cantidad de la señal detectable que es el aumento con respecto a una muestra de control que no contiene endotoxina indica la presencia de endotoxina

25 en la muestra de prueba.

En el presente documento también se divulga un ensayo para endotoxina que comprende: (i) poner en contacto una muestra para analizar con un anticuerpo inmovilizado que se une específicamente a endotoxina (LPS) o que se une específicamente al lípido A, para formar un complejo entre dicho anticuerpo y endotoxina en dicho muestra, (ii) poner en contacto dicho complejo con el factor C recombinante producido por un método de la presente invención para formar un complejo inmovilizado que comprende dicho anticuerpo, endotoxina y factor C recombinante, (iii) poner en contacto dicho complejo inmovilizado de (ii) con un anticuerpo que se une específicamente a dicho Factor C recombinante y (iv) cuantificar la cantidad de dicho anticuerpo unido específicamente a dicho factor C recombinante.

35 En la presente divulgación, los términos como "método para la detección de endotoxina" o "método para detectar endotoxina" se pueden usar indistintamente con el término "ensayo para endotoxina".

Métodos para eliminar la endotoxina

La presente invención proporciona el uso de proteína del factor C de cangrejo herradura producida por un método de acuerdo con la presente invención en un método para eliminar endotoxina, donde la proteína del factor C producida exhibe actividad de serina proteasa al unirse a la endotoxina. El uso del factor C de la presente invención en dichos métodos incluye, aunque no de forma limitativa, la eliminación de endotoxina del agua, tampones y medios de cultivo celular. Otras diversas realizaciones relacionadas con el uso del factor C de la presente invención en un método

45 para eliminar la endotoxina incluyen, aunque no de forma limitativa, eliminación de la endotoxina de preparaciones biológicas y no biológicas, preferentemente preparaciones biológicas, más preferentemente preparaciones biológicas para estudios en animales, cultivo celular, transplante, tecnologías de células madre, clasificación de células y otros tratamientos con células de mamíferos. Otras diversas realizaciones relacionadas con el uso del factor C de la presente invención en un método para eliminar la endotoxina incluyen, aunque no de forma limitativa, eliminación de endotoxina de equipos médicos, aparatos médicos, cosméticos, alimentos y bebidas.

El Factor C de la presente invención se puede usar para producir preparaciones libres de endotoxinas, en particular preparaciones biológicas y no biológicas libres de endotoxinas. La presente invención proporciona el uso de Factor C en un método para eliminar la endotoxina (LPS) de preparaciones biológicas de, por ejemplo, proteínas,

55 anticuerpos, vacunas, ácidos nucleicos, tampones y/o varias otras sustancias. Preferentemente, una preparación biológica de acuerdo con la presente invención es una preparación biológica líquida, más preferentemente una preparación biológica acuosa. Una preparación biológica acuosa o líquida se puede considerar como una solución biológica líquida o acuosa, o como una composición biológica líquida o acuosa.

En diversas realizaciones de la presente invención, los términos "preparación biológica", "solución biológica" y "composición biológica" pueden usarse indistintamente.

En varios aspectos, el método para eliminar la endotoxina divulgado en el presente documento comprende el uso del Factor C de la presente invención inmovilizado en un soporte sólido. Específicamente, el soporte sólido puede ser

65 una resina de cromatografía. El método para eliminar la endotoxina puede emplearse en modo columna o en modo discontinuo, mediante flujo por gravedad o en sistemas de cromatografía líquida totalmente automatizados.

La eliminación de endotoxinas de preparaciones biológicas es de particular importancia cuando se considera el hecho de que los productos biológicos para uso farmacéutico deben estar suficientemente libres de endotoxina para permitir la administración a seres humanos. Por lo tanto, la presente invención proporciona el uso del Factor C de la presente invención en un método para producir preparaciones libres de endotoxinas, en particular preparaciones

5 libres de endotoxinas para uso farmacéutico. Una preparación que comprende un producto biológico para uso farmacéutico puede ser el resultado directo de un proceso farmacéutico, es decir, la preparación es una preparación de proceso farmacéutico. Por lo tanto, en diversas realizaciones, la presente invención proporciona un método para eliminar la endotoxina de preparaciones de procesos farmacéuticos que comprende tratar la preparación del proceso farmacéutico con un factor C recombinante de la presente invención. Tales preparaciones de proceso farmacéutico pueden contener un fármaco o una sustancia de vacuna. En diversas realizaciones, el fármaco o sustancia de vacuna comprende un polipéptido, preferentemente una glicoproteína. En diversas realizaciones, el fármaco o la sustancia de vacuna es un antígeno de vacuna.

Específicamente, una preparación de proceso farmacéutico de acuerdo con la presente divulgación es una

15 preparación de proceso farmacéutico líquido, más específicamente una preparación acuosa de proceso farmacéutico. En diversos aspectos de la presente divulgación, los términos "preparación de proceso farmacéutico" y "composición de proceso farmacéutico" pueden usarse indistintamente.

El alcance de la presente divulgación también abarca la realización del método para eliminar la endotoxina de acuerdo con la presente invención sobre cualquier tipo de muestra. En particular, en el presente documento se divulga un método para eliminar la endotoxina o lípido A de una muestra que comprende: (i) poner en contacto el Factor C recombinante inmovilizado producido por u obtenido a partir de un método de la presente invención con dicha muestra, de manera que la endotoxina o el lípido A en dicha muestra se une a dicho factor C recombinante inmovilizado, y (ii) separar dicho factor C recombinante inmovilizado, que tiene dicha endotoxina o lípido A unida al

25 mismo, de dicha muestra.

Muestras

En aplicaciones que comprenden la medición cuantitativa de endotoxina, se puede usar una muestra estándar de endotoxina con una concentración conocida para generar datos que correlacionen el nivel de endotoxina y el grado de reacción del sustrato para la detección (por ejemplo, el grado de coloración, emisión de fluorescencia, y similares). Esto permite la cuantificación de la endotoxina presente en una muestra a analizar de acuerdo con la presente invención en base a los datos de correlación obtenidos.

35 La muestra que se va a someter a la detección y/o eliminación de endotoxina de acuerdo con la presente invención no está particularmente limitada y los ejemplos de la misma incluyen muestras de agua, muestras de tampón y muestras de medios de cultivo celular. En diversas realizaciones, la muestra es una muestra de prueba. En diversas realizaciones, la muestra es una muestra de prueba de una preparación biológica descrita en el presente documento en otra parte. En diversas realizaciones, la muestra incluye, aunque no de forma limitativa, una muestra de prueba de un equipo médico, un aparato médico, cosméticos, alimentos y bebidas descritos en el presente documento en otra parte.

En diversas realizaciones, la muestra que se va a someter a la detección y/o eliminación de endotoxina de acuerdo con la presente invención es una muestra de ensayo obtenida de un mamífero. Preferentemente, la muestra de

45 prueba obtenida de un mamífero incluye, aunque no de forma limitativa, una muestras de sangre, una muestra de suero o una muestra de saliva. Preferentemente, el mamífero es un ser humano. En diversas realizaciones, la muestra de prueba es, por lo tanto, una muestra de sangre humana, una muestra de suero humano, o una muestra de saliva humana, preferentemente una muestra de sangre humana.

En diversas realizaciones, las muestras de prueba que se someterán a la detección y/o eliminación de endotoxina incluyen, aunque no de forma limitativa, muestras de prueba obtenidas de cualquiera de los siguientes: agua medicinal, un producto farmacéutico, una solución para infusión, una preparación de sangre. Preferentemente, la preparación de sangre se obtiene de un mamífero, más preferentemente de un humano. En diversas realizaciones, la muestra de prueba es una muestra ambiental.

55 En diversas realizaciones, la muestra que se va a someter a la detección y/o eliminación de endotoxina de acuerdo con la presente invención incluye, aunque no de forma limitativa, una muestra de una preparación biológica de, por ejemplo, proteínas, anticuerpos, vacunas, ácidos nucleicos, tampones y/o varias otras sustancias. En varias otras realizaciones, la muestra que se va a someter a la detección y/o eliminación de endotoxina de acuerdo con la presente invención incluye, aunque no de forma limitativa, una muestra de una preparación de proceso farmacéutico descrita en otra parte en el presente documento.

Ensayos y kits

65 Como se ha descrito anteriormente en el presente documento, los términos como "método para la detección de endotoxina" o "método para detectar endotoxina" se pueden usar indistintamente con el término "ensayo para

endotoxina". Por lo tanto, la presente invención proporciona un ensayo para endotoxina que comprende la aplicación de factor C recombinante producido por un método de la presente invención de acuerdo con los métodos para detección de endotoxina descritos en el presente documento en otra parte, donde la proteína del factor C producida exhibe actividad de serina proteasa al unirse a la endotoxina. Básicamente, un ensayo para endotoxina de acuerdo

5 con la presente invención comprende las mismas etapas del método que un método para la detección de endotoxinas según la presente invención.

Adicionalmente, en el presente documento se divulga un kit para la detección de endotoxina que comprende un factor C recombinante de la presente invención, es decir, un factor C producido por un método de acuerdo con la presente invención. El kit puede comprender además instrucciones para un método para la detección de endotoxinas

o un ensayo para la endotoxina de la presente invención. Específicamente, las instrucciones pueden estar en la forma de un manual.

En varios aspectos, el kit comprende además un tensioactivo, que aumenta la sensibilidad de la detección de 15 endotoxina. El tensioactivo y la proteína del factor C pueden estar presentes en el kit en recipientes separados.

En varios aspectos, el kit comprende un único recipiente con una composición o solución de la presente invención que comprende el factor C recombinante de la presente invención y un tensioactivo como se describe en el presente documento en otra parte.

En varios aspectos, el tensioactivo contenido en el kit es un tensioactivo anfótero. En varios otros aspectos, el tensioactivo es un tensioactivo aniónico o un tensioactivo catiónico. En varios otros aspectos, el tensioactivo es un tensioactivo no iónico. Específicamente, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en ZWITTERGENT 314, Triton X-100, Triton X-114, octil-beta-D-tioglucósido, Genapol C-100, Tween 20 y Tween 80. Específicamente, el

25 tensioactivo está presente en el kit a una concentración de 0,001 a 0,5 %, más específicamente a una concentración de 0,001 a 0,025 %, aún más específicamente a una concentración de 0,001 a 0,01 %. En varios aspectos, el tensioactivo está presente en el kit a una concentración de 0,004 a 0,006 %. Esto incluye la presencia del tensioactivo en un recipiente separado o en una composición o solución de la presente invención, que comprende tanto el Factor C recombinante de la presente invención como el tensioactivo.

En varios aspectos, el recipiente que comprende el tensioactivo es un recipiente que comprende un tampón, que comprende además el tensioactivo.

En varios aspectos, el kit comprende además un sustrato del factor C. Específicamente, la escisión del sustrato del

35 factor C por la actividad hidrolítica del factor C activado (es decir, activación autocatalítica en presencia de endotoxina o lípido A como se describe en el presente documento en otro lugar) genera una señal detectable. Específicamente, el kit puede comprender un sustrato de factor C cromogénico y/o fluorogénico. En varios aspectos, el sustrato del factor C es un sustrato peptidil-pNA cromogénico. En varios otros aspectos, el sustrato del factor C es un sustrato de peptidil-AMC, peptidil-AFC o peptidil-MCA fluorogénico. Otros sustratos del factor C a modo de ejemplo incluyen, aunque no de forma limitativa, N-t-Boc-DPR-AMC, N-t-Boc-VPR-AMC, N-t-Boc-VPR-MCA, Mu-VPR-AFC y Boc-VPR-pNA.

Proceso de generación de una célula huésped de protozoo parásito que produce factor C recombinante

45 La presente invención proporciona un proceso para generar una célula huésped de protozoo parásito que produce proteína del factor C recombinante, que comprende las etapas de: (a) introducir una molécula de ácido nucleico, preferentemente un vector o un plásmido, que comprende un polinucleótido que codifica el factor C heterólogo de cangrejo herradura en una célula huésped de protozoo parásito y (b) seleccionar una o más células huésped producidas en la etapa (a) que expresan dicha proteína del factor C. Preferentemente, un vector o un plásmido de acuerdo con la presente invención se introduce en la célula huésped de protozoo parásito, es decir, un vector o plásmido que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína del factor C de cangrejo herradura heteróloga. Adicionalmente, la célula huésped de protozoo parásito es una célula huésped de protozoo parásito cinetoplástido. Más preferentemente, la célula huésped de protozoo parásito cinetoplástido es un tripanosomátido digenético (es decir, un miembro digenético del orden Trypanosomatida). Aún más preferentemente, la célula

55 huésped de protozoo parásito es una célula del orden Trypanosomatida. Incluso más preferentemente, la célula huésped de protozoo parásito es una célula del género Leishmania. Lo más preferentemente, la célula huésped de protozoo parásito es Leishmania tarentolae.

La presente invención también proporciona una célula huésped de protozoo parásito, donde la célula huésped de protozoo parásito se caracteriza por un polinucleótido que codifica el factor C heterólogo de cangrejo herradura, donde dicho polinucleótido está compuesto por una molécula de ácido nucleico, preferentemente un vector o un plásmido, introducido en la célula huésped del protozoo parásito. Preferentemente, la célula huésped de protozoo parásito comprende un vector o un plásmido de acuerdo con la presente invención, es decir, un vector o plásmido que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína del factor C de cangrejo herradura 65 heteróloga. Adicionalmente, la célula huésped de protozoo parásito es una célula huésped de protozoo parásito cinetoplástido. Más preferentemente, la célula huésped de protozoo parásito cinetoplástido es un tripanosomátido

digenético (es decir, un miembro digenético del orden Trypanosomatida). Aún más preferentemente, la célula huésped de protozoo parásito es una célula del orden Trypanosomatida. Incluso más preferentemente, la célula huésped de protozoo parásito es una célula del género Leishmania. Lo más preferentemente, la célula huésped de protozoo parásito es Leishmania tarentolae.

Líneas celulares

En el presente documento también se divulgan líneas celulares transfectadas de forma estable que pueden obtenerse mediante los vectores y/o plásmidos divulgados. Específicamente, las líneas celulares transfectadas pueden ser líneas celulares obtenidas de la transfección estable de células de protozoos parásitos de cinetoplástidos. Más específicamente, las líneas celulares transfectadas pueden ser líneas celulares obtenidas de la transfección estable de células del orden Trypanosomatida. Más específicamente, las líneas celulares transfectadas pueden ser líneas celulares obtenidas de la transfección estable de células del género Leishmania. Aún más específicamente, las líneas celulares transfectadas son líneas celulares obtenidas de la transfección estable de

15 células de la especie Leishmania tarentolae.

Otras definiciones generales

En general, siempre que en el presente documento se haga referencia al factor C producido de acuerdo con un método de la presente invención, o al "Factor C obtenido de acuerdo con un método de la presente invención", o simplemente al "Factor C de la presente invención", tal referencia incluye cualquier fragmento, análogo o derivado funcional de dicho factor C de la presente invención que tenga actividad enzimática de tipo factor C, es decir, actividad enzimática de tipo factor C de un cangrejo herradura como se describe en el presente documento en otra parte.

25 En la presente invención, el "porcentaje (%) de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación, donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que la base del ácido nucleico o resto de aminoácido idéntico se produce en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a

35 dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o una región designada medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineamiento manual e inspección visual. Por tanto, se dice que dichas secuencias son "sustancialmente idénticas”. Esta definición también se refiere a la complementaria de una secuencia problema. Opcionalmente, la identidad existe en una región que tiene al menos aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o más preferentemente en una región que tiene 75-100 aminoácidos o nucleótidos de longitud.

Para comparar secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se

45 comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, en caso necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Se pueden usar los parámetros por defecto del programa o parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias problema con respecto a la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa. Los términos molécula de ácido nucleico y secuencia de ácido nucleico pueden usarse aquí de forma intercambiable.

Como se trata en el presente documento, existen numerosas variantes de las proteínas y polipéptidos de la presente invención. Los expertos en la técnica comprenden bien las variantes y derivados de proteínas, y pueden implicar 55 modificaciones de la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, las modificaciones de la secuencia de aminoácidos típicamente entran dentro en una o más de tres clases: variantes de sustitución, inserción o deleción. Las inserciones incluyen fusiones en los extremos amino y/o carboxilo, así como inserciones intrasecuencia de uno o varios restos de aminoácidos. Las deleciones se caracterizan por la eliminación de uno o más restos de aminoácidos de la secuencia de proteínas. Típicamente, no se delecionan más de aproximadamente 2 a 6 restos en cualquier sitio dentro de las moléculas de proteína de acuerdo con la presente invención. Estas variantes se preparan habitualmente mediante mutagénesis específica de sitio de nucleótidos en el ADN del polinucleótido que codifica la proteína, produciendo de ese modo ADN que codifica la variante, y, a continuación, expresando el ADN en cultivo celular recombinante de acuerdo con la presente invención. Las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN que tienen una secuencia conocida son bien conocidas por los expertos en la 65 materia. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de restos individuales, pero pueden producirse en varios lugares diferentes a la vez; las inserciones habitualmente serán del orden de aproximadamente 1 a 10 restos de

aminoácidos; y las deleciones variarán de aproximadamente 1 a 30 restos. Las deleciones o inserciones preferentemente se hacen en pares adyacentes, es decir, una deleción de 2 restos o una inserción de 2 restos. Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas se pueden combinar para llegar a una construcción final. Las mutaciones no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y, preferentemente, no

5 crearán regiones complementarias que podrían producir una estructura secundaria de ARNm. Las variantes de sustitución son aquellas en las que se ha eliminado al menos un resto de aminoácido y se ha insertado un resto de aminoácido diferente en su lugar de modo que se obtiene una sustitución conservadora. El significado de una sustitución conservadora es bien conocido por los expertos en la técnica.

Ciertas modificaciones postraduccionales son el resultado de la acción de las células huésped recombinantes de la presente invención sobre el polipéptido expresado. Los restos de glutaminilo y asparaginilo se desaminan a menudo postraduccionalmente y se convierten en los restos correspondientes de glutamilo y asparilo. Como alternativa, estos restos se desamidan en condiciones ácidas suaves. Otras modificaciones postraduccionales incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de los grupos hidroxilo de los restos serilo o treonilo, metilación de los grupos α

15 amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina, acetilación del amino N-terminal y, en algunos casos, amidación del carboxilo C-terminal. Dichas modificaciones postraduccionales también están contempladas por la presente invención.

Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente en la presente invención. Los términos "proteína(s) del factor C" y "polipéptido(s) del factor C" se pueden usar en consecuencia en el presente documento indistintamente.

Cuando en el presente documento se describen realizaciones particulares de la invención, los párrafos/pasajes de texto correspondientes de la descripción hacen referencia, invariablemente, a los medios y/o métodos descritos en 25 otra parte en la descripción. En este contexto, se usan términos como "de acuerdo con la presente invención", "de la presente invención" y "proporcionado por la presente invención". Esto significa que cuando se describe una realización particular de la invención en un determinado párrafo o pasaje de texto, se hace referencia a los medios y/o métodos "de acuerdo con la presente invención" o "de la presente invención", que se describen en otra parte en la presente descripción. Para una realización particular descrita, se pretende que tales referencias se incorporen para la realización particular de todos los medios y/o métodos, que se describen en otra parte de la presente descripción, y que son proporcionados por la presente invención y, por lo tanto, forman parte del alcance de la invención. Por ejemplo, si la descripción de una realización particular se refiere a "Factor C de acuerdo con la presente invención" o "Factor C de la presente invención", o "Factor C producido por u obtenido de un método de la presente invención", se pretende que todas las proteínas del Factor C, que se describen en otra parte de la

35 descripción y que son proporcionadas por la presente invención y, por lo tanto, forman parte del alcance de la invención, son aplicables a esa realización particular. Esto se aplica particularmente, por ejemplo, a fragmentos y variantes de proteínas del Factor C de acuerdo con la presente invención, que se definen en la presente invención y que son aplicables a las diversas realizaciones descritas a lo largo del texto de la solicitud.

El principio anterior se aplica a todas las realizaciones que hacen uso de términos como "de acuerdo con la presente invención", "de la presente invención" y/o "proporcionados por la presente invención". Ni que decir tiene que no cada realización descrita en el presente documento puede mencionar específicamente todos los medios y/o métodos de la invención, que ya están definidos en otra parte de la descripción, y que son aplicables a las diversas realizaciones descritas en el texto de la solicitud. Por otra parte, cada solicitud de patente comprendería varios cientos de páginas

45 de descripción.

Adicionalmente, términos como "en diversas realizaciones" y "en otras diversas/otras realizaciones" significan obviamente "en diversas realizaciones de la presente invención" y "en diversas/otras realizaciones adicionales de la presente invención".

La invención se ejemplifica mediante los siguientes ejemplos, que son de naturaleza ilustrativa solamente y no deben interpretarse como limitativos del alcance de la presente invención de ninguna manera o ninguna extensión.

Ejemplos Ejemplo 1: Clonación del gen del factor C en el vector de expresión y transformación de E. coli DH5α

El punto de partida para la clonación del gen del factor C en un vector de expresión fue la secuencia del factor C de Tachypleus tridentatus (Número de acceso NCBI P28175.1; referencia 1 en el mismo: Muta et al. 1991, J. Biol. Chem. 266(10):6554-6561). La secuencia de aminoácidos de la proteína del factor C de tipo silvestre de T. tridentatus como se muestra con el número de acceso P28175.1 tiene una longitud de 1.019 restos de aminoácidos. La secuencia líder, que se escinde después de la expresión y secreción de la proteína, tiene una longitud de 25 restos de aminoácidos (restos 1-25 de la secuencia de aminoácidos mostrada con el número de acceso P28175.1). La secuencia de aminoácidos de la proteína del factor C de tipo silvestre de T. tridentatus sin la secuencia líder se

65 muestra en la SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótidos que codifica la proteína del factor C de tipo silvestre de T. tridentatus como se muestra en la SEQ ID NO: 2 se proporciona en la SEQ ID NO: 1.

La secuencia de T. tridentatus de la SEQ ID NO: 1 se optimizó por codones para la expresión en Leishmania. La secuencia optimizada de codones generada se muestra en la SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos optimizada por codones de la SEQ ID NO: 3 se muestra en la SEQ ID NO: 4. La optimización de codones no dio como resultado un cambio de la secuencia de aminoácidos de la

5 secuencia de aminoácidos de la proteína del factor C de tipo silvestre original. Por lo tanto, la secuencia de aminoácidos de la de SEQ ID NO:4 es idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2.

La secuencia optimizada por codones de la SEQ ID NO: 3 se clonó en un vector de expresión y el plásmido resultante se transformó posteriormente en E. coli DH5α.

Ejemplo 2: Transfección de Leishmania y selección de clones

Preparación de vectores de expresión para transfección

15 Se preparó un vector de expresión específico de la célula huésped Leishmania, que comprende la secuencia optimizada de codones de SEQ ID NO: 3 y una secuencia de péptido señal para la expresión secretora de la proteína diana en células huésped de Leishmania. La secuencia de aminoácidos de la secuencia del péptido señal secretora de Leishmania tarentolae se muestra en la SEQ ID NO: 5. La secuencia líder de Leishmania se escinde después de la expresión y secreción de la proteína.

Transfección de células de Leishmania

La transfección de ADN estable de una amplia gama de tripanosomátidos, incluida la transfección de Leishmania por electroporación, se ha descrito en la materia (Beverly y Clayton 1993, Methods Mol. Biol. 21:333-348; Coburn et al. 25 1991, Mol. Biochem. Parasitol. 46: 169-179). En el presente documento, el cultivo y la transfección de células de Leishmania se realizaron aplicando un protocolo de alto voltaje para la transfección (Jena Bioscience GmbH, Jena, Alemania). En particular, las células de Leishmania (Leishmania tarentolae) obtenidas de un precultivo se cultivaron hasta alcanzar una densidad celular de aproximadamente 6 x 107 células/ml (DO 1,4). Mediante microscopia se aseguró que las células fueran vitales y de forma similar a una gota. Las células previamente enfriadas se añadieron a un tubo con 0,1 -5 μg de ADN transformante (en hielo), se mezclaron y se transfirieron a una cubeta de electroporación (en hielo). Se realizaron pulsos 2 veces 1.500 V, 25 µF con 10 segundos entre pulsos (tiempo del pulso aproximadamente 0,3 ms) usando un generador de impulsos con un controlador de impulsos. La cubeta se volvió a colocar sobre hielo durante 10 minutos, y, a continuación, se transfirieron las células sometidas a electroporación a un matraz de cultivo tisular ventilado, seguido de incubación durante la noche a 26 ºC como cultivo

35 de suspensión estática (aproximadamente 20 horas, D.O. 0,3-0,4).

Selección de clones

La selección de clones se realizó mediante siembra en placas en medios sólidos suplementados con antibióticos selectivos. A continuación, los clones individuales se expandieron en medios selectivos. Con este fin, se cultivaron hasta 10 clones en 10 ml cada uno en matraces de cultivo. Estos cultivos se utilizaron para la evaluación.

Se aisló el ADN genómico y se confirmó la inserción del gen del factor C recombinante mediante PCR usando oligonucleótidos específicos para el gen del factor C recombinante. La expresión génica se analizó diluyendo los

45 cultivos 1:10 en medio recién preparado que contenía 10 μg/ml de tetraciclina para la inducción de la expresión. Los cultivos se cultivaron a 26 ºC en la oscuridad durante 3-4 días. Las células se cosecharon (3.000 x gramo, 4 ºC, 10 minutos). Las proteínas en los sobrenadantes se concentraron mediante precipitación con ácido tricloroacético (TCA) y se analizaron mediante SDS-PAGE.

Ejemplo 3: Expresión y purificación de la proteína del factor C recombinante

La expresión de proteína recombinante en protozoos tripanosomátidos, in particular in Leishmania, se describe en la técnica (Breitling et al. 2002, Protein Expression y Purification 25:209-218; Basile y Peticca 2009, Mol. Biotechnol. 43:273-278). En el presente documento, el cultivo y la ingeniería de Leishmania para la expresión y purificación de la

55 proteína del factor C se realizó usando un kit de expresión génica proporcionado por Jena Bioscience GmbH, Jena, Alemania.

3.1 Mantenimiento de las cepas de producción

Las cepas de producción se cultivaron en un volumen de 10 ml en matraces de cultivo a 26 ºC en la oscuridad. Las cepas se diluyen en serie a 1:20 o 1:50 cada 2 -3 días en medio de cultivo fresco que contiene todos los aditivos y antibióticos para la selección de los genes insertados.

Tras 3 meses, se descartaron las cepas cultivadas y se inició un nuevo cultivo a partir de un caldo de glicerol nuevo. 65

3.2 Expresión

Se preparó un precultivo diluyendo la cepa de producción a 1:50 en medio nuevo y se incubó en matraces de cultivo a 26 ºC en oscuridad durante 2-3 días.

Se inocularon 1,5 ml de medio de cultivo que contenía tetraciclina para la inducción de la expresión en un matraz

5 Erlenmeyer con 30 ml del precultivo. La expresión tiene lugar a 23 ºC en la oscuridad y agitando a 105 rpm durante 68 -72 horas. Cuando la concentración de glucosa en el medio disminuyó por debajo de 650 mg/l, se añadieron hemina y glucosa y el cultivo se incubó durante 86 -72 horas adicionales.

Se cosecharon las células (4000 x gramo, 4 ºC, 30 minutos). El sobrenadante se congeló a -20 ºC o se usó directamente para la purificación del factor C recombinante.

3.3 Purificación

3.3.1 Cromatografía de intercambio catiónico

15 El sobrenadante de la expresión se usó directamente o se descongeló suavemente. Después de añadir EDTA 2 mM, el sobrenadante se diluyó con acetato de potasio 20 mM, EDTA 2 mM, pH 5 hasta un pH de 5,0 -5,5 y se alcanzó una conductividad de <5,5 mS/cm.

La purificación se realizó usando cromatografía de intercambio catiónico. Se usó una columna SP650M con acetato de potasio 25 mM, EDTA 2 mM a pH 5 como tampón de equilibrado y acetato potásico 25 mM, EDTA 2 mM, cloruro potásico 1M, pH 5 como tampón de elución.

Después de la carga del sobrenadante, la columna se lavó primero con tampón de equilibrado, luego con 10 % de 25 tampón de elución. La elución tiene lugar a 50 % de tampón de elución.

3.3.2 Análisis de proteínas

Las fracciones que contenían proteína se analizaron mediante filtración en gel y SDS PAGE con respecto a la concentración y la pureza.

Para la filtración en gel, se cargaron 50 µl de cada fracción en una columna TSK3000 PW con 0,75 ml/min. La absorción se siguió a 220 nm. El rFC eluye en un pico máximo con un tiempo de retención de 7,4 +/-0,4 minutos.

35 Solo las fracciones que cumplían los siguientes criterios se agruparon:

1) El área del pico del pico con un tiempo de retención de 6,4 +/-0,4 minutos no debe exceder el 10 % del área del pico de rFC. 2) El área de pico del pico con un tiempo de retención de 10,3 +/-0,5 minutos no debe exceder el 350% del área del pico de rFC. 3) El mínimo entre el pico de rFC y el pico con un tiempo de retención de 10,3 +/-0,5 minutos tiene que estar entre 9 y 10 minutos, y el valor de absorción del mínimo no debe exceder el 30 % del valor máximo de absorción del pico de rFC.

45 La concentración de rFC en cada fracción se determinó mediante el área del pico con la ayuda de una curva patrón de rFC. La concentración del conjunto final debe ser de al menos 50 μg/ml de rFC.

3.3.3 Diálisis

Se añadió PMSF 1mM al conjunto de rFC y se incubó durante 4 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadió Pluronic® F-127 al 0,1 % y la solución se dializó contra 5 litros de acetato potásico 5 mM, cloruro potásico 100 mM, Pluronic® F-127 al 0,1 %, EDTA 0,05 mM a pH 5 a 4°C. La diálisis se realizó 3 veces durante 12 horas cada vez.

55 Tras la tercera diálisis, la solución rFC se centrifugó (4.000 x g, 4 °C, 1 hora) y de nuevo se dializó el sobrenadante contra 5 litros de acetato potásico 5 mM, cloruro potásico 100 mM, 0,1 % Pluronic® F-127, EDTA 0,05 mM, pH 5 at 4 °C durante al menos 12 horas.

3.3.4 Almacenamiento

La solución de rFC dializada se filtró en condiciones estériles, y la concentración se determinó mediante filtración en gel y pureza mediante SDS Gel. La solución se almacenó a 4 ° C.

Ejemplo 4: Determinación de la actividad específica de la proteína del factor C producida en Leishmania

65 La actividad específica del Factor C se determinó de acuerdo con el ensayo descrito en Ding et al. 1993 (Biochimica

et Biophysica Acta 1202:149-156). Este documento se ha citado en la patente de Estados Unidos US 5.712.144 por el ensayo, que se usó para determinar la actividad específica de la proteína del factor C aislada del cangrejo herradura C. rotundicauda.

5 En particular, primero se realizó una serie de diluciones diluyendo la proteína del factor C producida en Leishmania en tampón de reacción más LPS. El tampón de reacción comprende Tris 50 mM, NaCl 100 mM y MgCl2 50 mM. y se preparó usando agua ultrapura exenta de endotoxina. Se añadió LPS al tampón de reacción a partir de una solución madre de LPS (LPS en disolución en agua ultrapura libre de endotoxinas).

10 Se cargó una placa de microtitulación y se incubó durante 1 hora a 37 ºC. Posteriormente, se añadió un sustrato para la proteína C del factor C, seguido de incubación de la placa de microtitulación durante 15 minutos a 37 ºC. El sustrato usado fue boc-Val-Pro-Arg-AMC, que es un sustrato fluorogénico para la proteína del factor C. Boc-VPR-AMC se disolvió en agua ultrapura libre de endotoxinas para preparar una solución de sustrato, que se usó para preparar diluciones de la solución de sustrato, que se aplicaron al ensayo. Después de detener la reacción mediante

15 la adición de ácido acético glacial, se midió la fluorescencia (UFR). Los valores de UFR medidos después de 15 minutos de recambio de sustrato a 37 ºC se resumen en la siguiente Tabla 1.

Tabla 1: Valores de UFR medidos después de 15 minutos de recambio de sustrato a 37 °ºC

concentración de rFC (μg/ml)

factor de dilución de rFC rFC + LPS (UFR)

5,3

1 19999

2,65

0,5 17571

1,325

0,25 12446

0,6625

0,125 8174

0,33125

0,0625 4360

0,165625

0,03125 1903

0,0828125

0,015625 669

0,04140625

0,0078125 148

20 La Tabla 1 muestra los valores de UFR de las muestras de rFC activadas por LPS con señales mayores que el fondo después de la resta de los valores de URF de fondo. La Figura 1 muestra el gráfico de los valores de UFR medidos después de 15 minutos de recambio de sustrato a 37 ºC en dependencia de la concentración de rFC. La fluorescencia específica del fluoróforo (AMC) se determinó como

25 6,667 UFR/nmol en las condiciones experimentales descritas.

Para el cálculo de la actividad específica de rFC, se utilizó la concentración de rFC de 0,331 μg/ml. Esto corresponde a 0,0662 μg de rFC por pocillo en la placa de microtitulación. De acuerdo con esto, se midieron 4.360 UFR/( 15 min x 0,0662 µg de rFC). Esto corresponde a 290,67 UFR/(min x 0,0662 μg de rFC). Esto a su vez

30 corresponde a 4.390.735 UFR/(min x mg de rFC). Esto además corresponde a 658 nmol/(min x mg de rFC), que a su vez corresponde a 0,658 µmol/(min x mg de rFC).

De acuerdo con Ding et al. (1993), una unidad se define como 1 μmol de AMC hidrolizado por min a 37 ºC. De acuerdo con esta definición y el cálculo anterior, el factor C recombinante tiene una actividad específica de 0,658 35 unidades/mg de proteína en las condiciones de ensayo descritas. La misma actividad específica también se encontró cuando se usó quimotripsina para la activación de la proteína del factor C (datos no mostrados).

Como queda claro a partir de la configuración del ensayo, la actividad específica se determinó usando la proteína del factor C activada por LPS. Por lo tanto, este experimento muestra que el Factor C producido en Leishmania puede 40 ser activado por LPS y que la proteína del factor C activada es enzimáticamente activa, es decir, exhibe actividad hidrolítica.

Ejemplo 5: Determinación del peso molecular de la proteína del factor C en condiciones no reductoras y reductoras en SDS-PAGE

45 El peso molecular de la proteína del factor C producida en Leishmania se ha determinado en condiciones no reductoras y reductoras (SDS-PAGE). Se cargaron 50 µl de muestra de rFC reducida y no reducida así como 20 µl de patrón del peso molecular en un VarioGel de 10 pistas (4 -12 %). Después de llevar a cabo la electroforesis en una cámara de electroforesis en gel vertical, el gel se tiñó con solución de tinción proteica PageBlue™ lista para usar

50 (Fermentas) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Los valores de Rf se calcularon mediante división de la distancia de migración (en cm) de las bandas de proteína y la distancia de migración total desde el frente del gel (en cm). Los valores de Rf de las proteínas marcadoras se representaron frente al peso molecular de las proteínas marcadoras. La curva resultante se ajustó mediante un 55 algoritmo de ajuste logarítmico. El peso molecular de la proteína del factor C purificado en condiciones no reductoras y reductoras, respectivamente, se calculó basándose en la ecuación de ajuste de la curva patrón generada. De

acuerdo con la ecuación, se calcularon los siguientes pesos moleculares para el Factor C:

Tabla 2: Valores de Rf del factor C purificado en condiciones de funcionamiento de SDS PAGE no reductoras y reductoras

distancia de migración [cm]

Valores de Rf Peso molecular calculado [kDa]

rFC ox

7,1 0,33 102

distancia de migración [cm]

Valores de Rf Peso molecular calculado [kDa]

rFC rojo 1

8,9 0,41 69

rFC rojo 2

12,6 0,58 37

La forma bicatenaria de la proteína del factor C tiene un peso molecular de 102 kDa según se determina por SDS-PAGE en condiciones no reductoras (rFC ox). En condiciones reductoras, se ha determinado un peso molecular de 69 kDa para la cadena H (rFC rojo 1) y un peso molecular de 37 kDa para la cadena L (rFC rojo 2).

10 El peso molecular de la cadena H y la cadena L en condiciones reductoras (rFC rojo 1 + rFC rojo 2) se combina con 106 kDa (incluida la glucosilación).

LISTADO DE SECUENCIAS

15 SEQ ID NO: 1: La secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína de factor C de tipo salvaje de Tachypleus tridentatus sin secuencia líder, longitud: 2.982 nucleótidos.

SEQ ID NO 2: La secuencia de aminoácidos de la proteína de Factor C natural de Tachypleus tridentatus sin secuencia líder, longitud: 994 restos de aminoácidos.

SEQ ID NO 3: La secuencia de nucleótidos del Factor C de T. tridentatus sin secuencia líder, optimizado por codones para la expresión en Leishmania, longitud: 2.982 nucleótidos.

SEQ ID NO 4: La secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos optimizada por codones de la proteína del factor C de Tachypleus tridentatus sin secuencia líder como se muestra en LA SEQ ID NO: 3, longitud: 994 restos de aminoácidos.

SEQ ID NO: 5: La secuencia de aminoácidos de la secuencia del péptido señal secretora de Leishmania tarentolae, 10 longitud: 23 restos de aminoácidos.

MASRLVRVLAAAMLVAAAVSVDA

LISTADO DE SECUENCIAS 15

<110> MicroCoat Biotechnologie GmbH

<120> Nuevo método para la producción recombinante de proteína del factor C del cangrejo herradura 20 <130> PCT82127FZ210pau

<140> aún no asignado

<141> adjunto 25 <150> US 61/734.002

<151> 06/12/2012

<150> EP12195742.7

<151> 05/12/2012 30

<160> 5

<170> PatentIn versión 3.5 35 <210> 1

<211> 2982

<212> ADN

<213> Tachypleus tridentatus

<400> 1

<210> 2

<211> 994

<212> PRT

<213> Tachypleus tridentatus

<400> 2

<210> 3

<211> 2982 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos del gen sintético del factor C (secuencia de nucleótidos del factor C de 10 Tachypleus tridentatus optimizada por codones para la expresión en Leishmania)

<400> 3

<210> 4

<211> 994

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de la proteína sintética del Factor C (secuencia de aminoácidos codificada por

la secuencia de nucleótidos optimizada por codones de SEQ ID NO: 3)

<400> 4

<210> 5

<211> 23

<212> PRT

<213> Leishmania tarentolae

<400> 5

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un protozoo parásito, que se caracteriza por albergar un polinucleótido que codifica la proteína del factor C del

   cangrejo herradura. 5
2. 2. El protozoo parásito de la reivindicación 1, donde dicho polinucleótido está compuesto por una molécula de ácido nucleico, preferentemente un vector, introducido en la célula huésped del protozoo parásito.
3. 3. El protozoo parásito de la reivindicación 1 o 2, donde el protozoo parásito es un miembro del orden 10 Trypanosomatida.
4. 4. El protozoo parásito de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el protozoo parásito es un miembro del género Leishmania.

   15 5. El protozoo parásito de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el protozoo parásito es Leishmania tarentolae.
5. 6. El protozoo parásito de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho polinucleótido codifica la

   proteína del factor C de Limulus polyphemus, Carcinoscorpius rotundicauda, Tachypleus tridentatus o Tachypleus 20 gigas.
6. 7. El protozoo parásito de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho polinucleótido codifica la proteína del factor C que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

   25 8. Un método para producir proteína del factor C de cangrejo herradura, que comprende las etapas de:

   (a) cultivar un protozoo parásito de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en condiciones tales que las células expresan la proteína del factor C codificada por el polinucleótido; y

   (b)

   recuperar la proteína del factor C producida en la etapa (a) del cultivo celular. 30

7. 9.

   El método de la reivindicación 8, donde dicha proteína del factor C se acumula en el medio de cultivo celular.

8. 10.

   El método de la reivindicación 8 o 9, donde el protozoo parásito es un miembro del género Leishmania.

   35 11. El método de la reivindicación 10, donde la proteína del factor C producida exhibe actividad de serina proteasa al unirse a la endotoxina.
9. 12. La proteína del factor C de cangrejo herradura que tiene un peso molecular de aproximadamente 102 kDa según se determina por SDS-PAGE en condiciones no reductoras obtenible por

   40 a) el método de la reivindicación 10; o b) el método de la reivindicación 11.
10. 13. Uso de la proteína del factor C de cangrejo herradura de la reivindicación 12b) en un método para la detección 45 de endotoxina o en un método para la eliminación de endotoxina.
11. 14. Un ensayo o kit para la detección de endotoxina o la eliminación de endotoxina, que comprende la proteína del factor C de cangrejo herradura de la reivindicación 12b).

    50 15. Un proceso de generación de una célula huésped de protozoo parásito que produce proteína del factor C de cangrejo herradura, que comprende las etapas de:

    (a) introducir una molécula de ácido nucleico, preferentemente un vector, que comprende un polinucleótido que codifica la proteína del factor C de cangrejo herradura en un protozoo parásito, preferentemente un protozoo

    55 parásito del orden Trypanosomatida, más preferentemente un miembro del género Leishmania, de la forma más preferente Leishmania tarentolae; y

    (b) seleccionar una o más células huésped producidas en la etapa (a) que expresan dicha proteína del factor C de cangrejo herradura.

    60 16. Una célula huésped de protozoo parásito caracterizada por un polinucleótido que codifica la proteína del factor C de cangrejo herradura, donde dicho polinucleótido está compuesto por una molécula de ácido nucleico, preferentemente un vector, introducido en la célula huésped del protozoo parásito.