CN110095600A - 一种细菌内毒素的检测试纸及试剂盒 - Google Patents

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CN110095600A CN201910405394.1A CN201910405394A CN110095600A CN 110095600 A CN110095600 A CN 110095600A CN 201910405394 A CN201910405394 A CN 201910405394A CN 110095600 A CN110095600 A CN 110095600A
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王春新
徐新平
赵静
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Nanjing Sitong Biotechnology Co Ltd
Wuxi Peoples Hospital
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Nanjing Sitong Biotechnology Co Ltd
Wuxi Peoples Hospital
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody

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Abstract

本发明提供一种细菌内毒素检测试纸，试纸包括纤维素膜和结合垫，抗细菌内毒素抗体附着在纤维素膜上，基因工程重组的鲎C因子多肽包被在结合垫上，所述的细菌内毒素抗体、基因工程重组的鲎C因子多肽与细菌内毒素特异性地结合，形成夹心结构。本发明公开的细菌内毒素检测试纸和试剂盒无需依赖天然的动物血清，不受原料的限制，并可以降低成本，且该检测试纸和试剂盒的检测过程的自动化程度高，适用于大规模生产。

Description

一种细菌内毒素的检测试纸及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种内毒素的快速检测试纸及检测试剂盒。
背景技术
细菌内毒素由革兰氏阴性菌产生，是其细胞壁的最外层结构的一部分脂多糖(LPS)，它由多糖O抗原、核心多糖和脂质A三部分组成，其中脂质A是内毒素多种生物活性或毒性反应的主要基团。细菌内毒素在细菌死亡、解体或者人工破坏细菌结构的情况下才会释放出来，对机体可产生致病作用。人体对内毒素极为敏感，极微量(1-5ng/kg体重)的内毒素即可使机体体温升高，产生低血压并发休克，播散性血管内凝血，供血不足缺氧导致代谢性等症状，严重威胁人群健康。且内毒素广泛存在空气、土壤和水等与人类生活密切相关的环境中，因此，监测内毒素含量对保障人类健康具有重要意义。
细菌内毒素的检测方法有凝胶法、浊度法、显色基质法、免疫学法。药典已收载的两种方法为凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
目前,内毒素检测方法多基于鲎试剂(limμLus amebocyte lysate test,LAL)测定。鲎试剂是根据鲎血提取液能被pg水平的内毒素凝胶化的原理,通过检测凝胶的形成来检测内毒素。
鲎试剂由鲎血细胞裂解而成，鲎血细胞是仅有一种参与循环的血细胞,称变形细胞(amebocyte)。鲎血细胞内充满了胞浆颗粒,颗粒中含有能被微量细菌内毒素激活的凝固酶原(proclotting enzyme)、凝固蛋白原(coagμLogen)、B因子、C因子等。内毒素激活C因子,活化的C因子又激活B因子(C因子系统),或由(1-3)β-D-葡聚糖激活G因子(G因子系统),接着激活的B因子或G因子,再去激活凝固酶原,使其转化为活化的凝固酶,该酶切断凝固蛋白原中特定的精氨肽链,形成凝固蛋白,产生凝胶；除此之外,凝固酶还对鲎三肽有酰氨酶活性,使硝基苯胺(PNA)游离,而发生成色反应。
基于鲎试剂检测内毒素的方法法具有快速、简便、灵敏度高和易推广等优点，一直是国际上检测内毒素的标准方法，但仍然有以下缺点：(1)特异性较差。从鲎试剂反应机理可知(1-3)β-D-葡聚糖激活G因子，活化的G因子激活凝固酶造成假阳性。凝血酶、凝血酶原激酶及某些合成的多核苷酸均可造成鲎试剂的假阳性；革兰氏阳性菌肽聚糖、A族链球菌外毒素、简单的多糖及二硫酚亦可激活鲎试剂而引起假阳性的结果。另外血清中的某些某种凝血因子、多数中药成分、生化药品、抗生素、可使蛋白质变性的物质、高糖溶液、络合物等会干扰凝胶形成导致假阴性结果。(2)待检样品和标本制备问题。LAL含有许多凝固酶,故pH值和温度对整个反应影响很大；还有很多中药成分、生化药品、抗生素也有影响,此外,螯合剂EDTA可阻止内毒素诱导的LAL凝固反应,因而二价阳离子在反应中起重要作用。所以,待检样品的有些成分可能干扰级联反应的某一步骤而影响最终测定结果。此外内毒素的脂类成分在水溶液中聚集时可能隐藏在单位内部,而不能与LAL充分接触而影响测定结果。(3)制备鲎试剂需要捕杀大量的受保护动物鲎。如日本的鲎已近灭绝,美国的鲎数量也锐减,中国鲎由于近年来的狂捕滥杀,也面临灭绝之灾。
为了解决上述问题，建立应用基因工程技术生产重组鲎C因子(rFC)代替天然LAL对内毒素进行检测的试纸。鲎C因子是鲎血细胞中一种对内毒素敏感的丝氨酸蛋白酶原,能以高亲和力结合LPS的脂质A，从而激活启动整个鲎血细胞的血凝级联系统。因此，重组的鲎C因子可代替鲎试剂用于内毒素检测。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种细菌内毒素检测试纸，试纸包括纤维素膜和结合垫，抗细菌内毒素抗体附着在纤维素膜上，基因工程重组的鲎C因子多肽包被在结合垫上，所述的细菌内毒素抗体、基因工程重组的鲎C因子多肽与细菌内毒素特异性地结合，形成夹心结构。
较优地，所述的鲎C因子多肽用标记物标记。
较优地，抗细菌内毒素抗体用标记物标记。
较优地，所述的鲎C因子多肽，其序列是来自于圆尾鲎(东南亚鲎，Carcinoscorpius Rotundicauda)、中华鲎(Tachypleus tridentatus)或者美洲鲎(Limulus Polyphemus)的C因子编码序列，应至少含有以下两组氨基酸序列：
SEQ ID NO.1：GFKLKGMARISCLPNGQWSNFPPKCIRECAMVSS
以及：
SEQ ID NO.2：HAEHKVKIGVEQKYGQFPQGTEVTYTCSGNYFLM
其中，两组氨基酸单独串联或重复串联。
其中，序列SEQ ID NO.1还可以表示为：Gly-Phe-Lys-Leu-Lys-Gly-Met-Ala-Arg-Ile-Ser-Cys-Leu-Pro-Asn-Gly-Gln-Trp-Ser-Asn-Phe-Pro-Pro-Lys-Cys-Ile-Arg-Glu-Cys-Ala-Met-Val-Ser-Ser；
序列SEQ ID NO.2还可以表示为：
His-Ala-Glu-His-Lys-Val-Lys-Ile-Gly-Val-Glu-Gln-Lys-Tyr-Gly-Gln-Phe-Pro-Gln-Gly-Thr-Glu-Val-Thr-Tyr-Thr-Cys-Ser-Gly-Asn-Tyr-Phe-Leu-Met。
较优地，所述的鲎C因子多肽可用至少一种以下的标记物标记：胶乳颗粒、胶体金、荧光、地高辛、生物素、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、吖啶酯、吖啶酯衍生物、鲁米诺、鲁米诺衍生物或三联吡啶钌。
较优地，所述的抗细菌内毒素的抗体可用至少一种以下的标记物标记：胶乳颗粒、胶体金、荧光、地高辛、生物素、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、吖啶酯、吖啶酯衍生物、鲁米诺、鲁米诺衍生物或三联吡啶钌。
本发明还提供利用上述的细菌内毒素检测试纸来检测细菌内毒素的试剂盒，所述鲎C因子多肽或抗细菌内毒素抗体可结合于固相载体上，加入待测样本后，捕获细菌内毒素，再加入对应的标记物标记的抗细菌内毒素抗体或鲎C因子多肽，形成夹心结构，通过免疫检测方法检测样品中的细菌内毒素。
较优地，所述的固相载体为乳胶颗粒、硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏氟乙烯膜、微孔板或磁性颗粒中的一种或几种。
应当说明的是：此方法中，可以用标记物标记鲎C因子多肽，而将抗细菌内毒素抗体结合到固相载体上，然后将待检样品加入到固相载体上，再加入已做标记的鲎C因子多肽，通过检测标记物方法来检测待检样品中是否存在内毒素；同样地，也可以用标记物标记抗细菌内毒素抗体，而将鲎C因子多肽结合到固相载体上，然后将待检样品加入到固相载体上，再加入已做标记的抗细菌内毒素抗体，通过检测标记物方法来检测待检样品中是否存在内毒素。
本领域的普通技术人员应当知道，所述的字母分别代表相应的氨基酸，字母与氨基酸的对应关系为：
丙氨酸(alanine)-A，精氨酸(arginine)-R，天冬酰胺(asparagine)-N，天冬氨酸(aspartic acid)-D，亮氨酸(leucine)-L，赖氨酸(lysine)-K，甲硫氨酸(methionine)-M，苯丙氨酸(phenylalanine)-F，半胱氨酸(cysteine)-C，脯氨酸(proline)-P，谷氨酰胺(glutanine)-Q，丝胺酸(serine)-S，谷氨酸(glutamic acid)-E，苏氨酸(threonine)-T，甘氨酸(Glicine)-G，色氨酸(tryptophan)-W，组氨酸(histidine)-H，酪氨酸(tyrosine)-Y，异亮氨酸(isoleucine)-I，颉氨酸(valine)-V，等。
本发明的有益效果主要有：
(1)本发明的检测试纸中的鲎C因子多肽可采用基因工程表达或者化学合成获得，无需依赖天然的动物血清，不受原料的限制；另外，生产工艺更易标准化；
(2)成本可进一步降低；传统技术依赖鲎血清，鲎是国家二级保护动物，种群规模逐年降低，并且已经严禁滥捕滥杀，鲎血清的价格逐年升高；本发明采用基因工程技术或化学合成获得原料，成本较低；
(3)检测更方便：传统的鲎试剂检测结果易受样品本身的颜色和浊度影响，缺乏特异性；而本发明采用夹心免疫技术，将内毒素的检测可采用生物检测最常用的免疫层析、免疫比浊、ELISA或化学发光等，自动化程度高，操作简便，检测成本低。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明专利的技术内容，特举以下实施例详细说明。
本发明专利的内毒素检测的方法的检测试纸条的制备过程简述如下，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆技术实验室操作手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press，2005)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 多肽的合成
按照以下氨基酸序列，化学合成鲎C因子多肽，其氨基酸序列如下：
GFKLKGMARISCLPNGQWSNFPPKCIRECAMVSSHAEHKVKIGVEQKYGQFPQGTEVTYTCSGNYFLM。
委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成；纯度＞90％。
实施例2 荧光标记鲎C因子多肽
清洗：取荧光微球(购自Bangs Lab，货号：11233)至离心管中，加0.1M MES(2-吗啉代乙磺酸)(pH 5.0)缓冲液混匀，并以13000rpm，15min，4℃条件离心，弃上清，用0.1M MES(pH 5.0)缓冲液重悬待用。活化并清洗：将活化剂EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和荧光微球按照质量比比2:1.5:2的量进行活化，具体操作如下：
称取EDC、NHS加入0.1M MES(pH 5.0)缓冲液中溶解，迅速取适量至清洗完毕的荧光微球中，用封口膜封好放置在200rpm摇床上室温摇匀30min，取出后13000rpm，30min，4℃离心除去上清，用等量0.1M MES(pH 6.5)缓冲液重悬超声混匀并清洗，重复一次以上操作即清洗两次。离心完成后弃掉上清待用。
标记：将活化后的胶乳重悬至0.1M MES(pH 6.5)缓冲液中，迅速分别加入鲎C因子多肽(多肽的氨基酸序列如实施例1所示)，混匀，放置室温，200rpm摇床上摇匀4小时。
封闭：取上述标记好的微球于13000rpm，30min，4℃离心除去上清，立即向微球中加入等量封闭液，超声重悬后再放置室温，200rpm摇床上摇匀1小时。反应完成后13000rpm，20min，4℃离心，取上清待检。
检测内容 质量标准 检测方法
包被量 包被量≥10μg多肽/mg微球 BCA蛋白浓度测定法
清洗&重悬：加入重悬液，超声吹打重悬，用高速冷冻离心机13000rpm，20min，4℃离心，弃掉上清；加入重悬液，超声吹打重悬。
重悬好的微球溶液做好标记，备用。
实施例3 荧光标记抗细菌内毒素抗体
清洗：取荧光微球(购自Bangs Lab，货号：11233)至离心管中，加0.1M MES(pH5.0)缓冲液混匀，并以13000rpm，15min，4℃条件离心，弃上清，用0.1M MES(pH 5.0)缓冲液重悬待用。活化并清洗：将活化剂EDC、NHS和荧光微球按照质量比比2:1.2:2的量进行活化，具体操作如下：
称取EDC、NHS加入0.1M MES(pH 5.0)缓冲液中溶解，迅速取适量至清洗完毕的荧光微球中，用封口膜封好放置在200rpm摇床上室温摇匀30min，取出后13000rpm，30min，4℃离心除去上清，用等量0.1M MES(pH 6.5)缓冲液重悬超声混匀并清洗，重复一次以上操作即清洗两次。离心完成后弃掉上清待用。
标记：将活化后的胶乳重悬至0.1M MES(pH 6.5)缓冲液中，迅速分别加入抗细菌内毒素抗体(鼠单抗，Clone：GNE11-270.3.1(B40/23)，货号：4120-5004，购自Bio-Rad)，混匀，放置室温，200rpm摇床上摇匀4小时。
封闭：取上述标记好的微球于10000rpm，30min，4℃离心除去上清，立即向微球中加入等量封闭液，超声重悬后再放置室温，200rpm摇床上摇匀1小时。反应完成后10000rpm，20min，4℃离心，取上清待检。
检测内容 质量标准 检测方法
包被量 包被量≥150μg抗体/mg微球 BCA蛋白浓度测定法
清洗&重悬：加入重悬液，超声吹打重悬，用高速冷冻离心机10000rpm，20min，4℃离心，弃掉上清；加入重悬液，超声吹打重悬。
重悬好的微球溶液做好标记，备用。
实施例4 荧光标记羊抗兔IgG
清洗：取荧光微球(购自Bangs Lab，货号：11233)至离心管中，加0.1M MES(pH5.0)缓冲液混匀，并以13000rpm，15min，4℃条件离心，弃上清，用0.1M MES(pH 5.0)缓冲液重悬待用。活化并清洗：将活化剂EDC、NHS和荧光微球按照质量比比2:1:2的量进行活化，具体操作如下：
称取EDC、NHS加入0.1M MES(pH 5.0)缓冲液中溶解，迅速取适量至清洗完毕的荧光微球中，用封口膜封好放置在200rpm摇床上室温摇匀30min，取出后13000rpm，30min，4℃离心除去上清，用等量0.1M MES(pH 6.5)缓冲液重悬超声混匀并清洗，重复一次以上操作即清洗两次。离心完成后弃掉上清待用。
标记：将活化后的胶乳重悬至0.1M MES(pH 6.5)缓冲液中，迅速分别加入羊抗兔IgG(购自成都双龙生化，货号：J0711-6，1mg)，混匀，放置室温，200rpm摇床上摇匀4小时。
封闭：取上述标记好的微球于10000rpm，30min，4℃离心除去上清，立即向微球中加入等量封闭液，超声重悬后再放置室温，200rpm摇床上摇匀1小时。反应完成后10000rpm，20min，4℃离心，取上清待检。
检测内容 质量标准 检测方法
包被量 包被量≥200μg抗体/mg微球 BCA蛋白浓度测定法
清洗&重悬：加入重悬液，超声吹打重悬，用高速冷冻离心机10000rpm，20min，4℃离心，弃掉上清；加入重悬液，超声吹打重悬。
重悬好的微球溶液做好标记，备用。
实施例5 结合垫的喷点
鲎C因子多肽结合垫的喷点方法如下：荧光标记溶液稀释：用荧光标记重悬液将上述制备的荧光标记鲎C因子多肽结合物(来自实施例2)以及荧光标记羊抗兔IgG结合物(来自实施例4)混合后稀释8倍；设定点膜仪，开启点膜仪的电源，设定喷点程序，喷点量为8μL/cm；1号管道为喷点通道；点膜仪初始化：将1号管道置于荧光标记重悬溶液中，选择初始化程序，初始化6个循环；喷点：将结合垫按固定位置平放在点膜仪上，按控制面板上“GO”键开始喷点，点完后取下，检查喷点好的结合垫，喷点的荧光标记鲎C因子多肽条带均匀、连续和贯通整个结合垫的直线为合格喷点品，两条直线中出现断点为不合格喷点品；每放一片结合垫，按一次控制面板上的“GO”键为喷点一次(一片)；喷点结束，将喷点的结合垫置于室温中自然干燥1小时，膜上应看不到喷点痕迹。
实施例6 结合垫的喷点
抗细菌内毒素抗体结合垫的喷点方法如下：荧光标记溶液稀释：用荧光标记重悬液将上述制备的荧光标记抗体结合物(来自实施例3)稀释6倍；设定点膜仪，开启点膜仪的电源，设定喷点程序，喷点量为8μL/cm；1号管道为喷点通道；点膜仪初始化：将1号管道置于荧光标记重悬溶液中，选择初始化程序，初始化6个循环；喷点：将结合垫按固定位置平放在点膜仪上，按控制面板上“GO”键开始喷点，点完后取下，检查喷点好的结合垫，喷点的荧光标记鲎C因子多肽条带均匀、连续和贯通整个结合垫的直线为合格喷点品，两条直线中出现断点为不合格喷点品；每放一片结合垫，按一次控制面板上的“GO”键为喷点一次(一片)；喷点结束，将喷点的结合垫置于室温中自然干燥1小时，膜上应看不到喷点痕迹。
实施例7 硝酸纤维素膜的制备(抗细菌内毒素抗体)
抗细菌内毒素抗体(鼠单抗，Clone：GNE11-270.3.1(B40/23)，货号：4120-5004，购自Bio-Rad)硝酸纤维素膜制备方法如下：取羊抗细菌内毒素的多克隆抗体180ug，加到5mL刻度离心管中，抗体稀释液至1mL，容器标记T标志。取鼠抗羊IgG抗体(购自Santa Cruz，货号：sc-53799，规格：0.4mg/mL)25μL，加到5mL刻度离心管中，抗体稀释液至1mL，容器标记C标志。设定点膜仪，开启点膜仪的电源，设定喷点程序，喷点量为1μL/cm；1号管道为检测带喷点通道，2号管道为对照带喷点通道；点膜仪初始化：将1号管道置于检测带溶液中，将2号管道置于对照带溶液中，选择初始化程序，初始化6个循环；喷点：将硝酸纤维素膜按固定位置平放在点膜仪上，按控制面板上“GO”键开始喷点，点完后取下，检查喷点好的硝酸纤维素膜，检测带和对照带为两条均匀、连续和贯通整个硝酸纤维素膜的直线为合格喷点品，两条直线中出现断点为不合格喷点品；每放一片硝酸纤维素膜，按一次控制面板上的“GO”键为喷点一次(一片)；喷点结束，将喷点的硝酸纤维素膜置于室温中自然干燥1小时，膜上应看不到喷点痕迹。
实施例8 硝酸纤维素膜的制备(鲎C因子多肽)
鲎C因子多肽硝酸纤维素膜制备方法如下：取鲎C因子多肽30ug(实施例1中的小肽)，加到5mL刻度离心管中，稀释至1mL，容器标记T标志。取鼠抗羊IgG抗体(购自SantaCruz，货号：sc-53799，规格：0.4mg/mL)25μL，加到5mL刻度离心管中，抗体稀释液至1mL，容器标记C标志。设定点膜仪，开启点膜仪的电源，设定喷点程序，喷点量为1μL/cm；1号管道为检测带喷点通道，2号管道为对照带喷点通道；点膜仪初始化：将1号管道置于检测带溶液中，将2号管道置于对照带溶液中，选择初始化程序，初始化6个循环；喷点：将硝酸纤维素膜按固定位置平放在点膜仪上，按控制面板上“GO”键开始喷点，点完后取下，检查喷点好的硝酸纤维素膜，检测带和对照带为两条均匀、连续和贯通整个硝酸纤维素膜的直线为合格喷点品，两条直线中出现断点为不合格喷点品；每放一片硝酸纤维素膜，按一次控制面板上的“GO”键为喷点一次(一片)；喷点结束，将喷点的硝酸纤维素膜置于室温中自然干燥1小时，膜上应看不到喷点痕迹。
实施例9 组装
将底板上较宽部分的保护纸除去，沿上面保护纸的下边缘，将划好线的硝酸纤维素膜(来自实施例7)，以C线在上方的方式贴到底板板上；将结合垫(来自实施例5)贴在T线下方，与NC膜少许接触；将样品垫贴在结合垫下方，与结合垫少许接触；接着除去上方保护纸，将吸水纸贴在NC膜的上方，与NC膜少许接触；将保护纸及指示带纸逐一贴在组装好的试纸条外面，组装成大卡。
实施例10 组装
将底板上较宽部分的保护纸除去，沿上面保护纸的下边缘，将划好线的硝酸纤维素膜(来自实施例8)，以C线在上方的方式贴到底板板上；将结合垫(来自实施例6)贴在T线下方，与NC膜少许接触；将样品垫贴在结合垫下方，与结合垫少许接触；接着除去上方保护纸，将吸水纸贴在NC膜的上方，与NC膜少许接触；将保护纸及指示带纸逐一贴在组装好的试纸条外面，组装成大卡。
实施例11 切条
接通切割机电源，设定切膜程序，设定切割宽度为4mm；将大卡(来自实施例9或实施例10)平放入切割机平台轨道中，正面朝上，按操作面板上“GO”键，开始切割；每放一片大卡合格品，按操作面板上“GO”键一次，直至切割完所有大卡合格品；切割完成后，将试纸条并列黏贴于底板上，组成检测试纸条。
实施例12 试剂盒组装
将上述的试纸条(来自实施例11)装入卡盒中，形成检测卡。
取铝箔袋和干燥剂；打开热封机，预热；将待装袋的检测卡、1袋干燥剂装入铝箔袋中；按照规定的长度切断装有检测卡和干燥剂的铝箔袋；用热封机封好铝箔袋；贴上标签。
实施例13 HRP标记抗细菌内毒素抗体
将5mg HRP(购自罗氏，货号：1464325，规格：25mg/瓶)溶于0.5mL 0.1M NaHCO3溶液中；加0.5mL 10mM NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时；加0.75mL 0.1MNa2CO3混匀；加入0.13mL抗细菌内毒素抗体(鼠单抗，Clone：GNE11-270.3.1(B40/23)，货号：4120-5004，购自Bio-Rad)，混匀。
HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融。
实施例14 HRP标记鲎C因子多肽
将5mg HRP(购自罗氏，货号：1464325，规格：25mg/瓶)溶于0.5mL 0.1M NaHCO3溶液中；加0.5mL 10mM NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时；加0.75mL 0.1MNa2CO3混匀；加入0.1ng特异性鲎C因子多肽(来自实施例1)，混匀。
HRP标记多肽结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融。
实施例15 抗细菌内毒素抗体包被
采用0.01M，pH 10的CBS(碳酸盐缓冲液)将抗细菌内毒素抗体(鼠单抗，Clone：GNE11-270.3.1(B40/23)，货号：4120-5004，购自Bio-Rad)稀释至0.8μg/mL；取96孔微孔板，每孔加入100μL上述包被抗体；37℃温育1h；甩掉包被液，加入200μL的封闭缓冲液(2％牛血清白蛋白，pH7.4)，37℃温育1h，甩掉封闭液；于室温自然干燥12h，放入干燥剂，封入铝箔袋，2～8℃备用。
实施例16 多肽包被
采用0.01M，pH 10的CBS(碳酸盐缓冲液)将鲎C因子多肽(来自实施例1)稀释至0.06μg/mL；取96孔微孔板，每孔加入100μL上述包被多肽；37℃温育1h；甩掉包被液，加入200μL的封闭缓冲液(2％牛血清白蛋白，pH7.4)，37℃温育1h，甩掉封闭液；于室温自然干燥12h，放入干燥剂，封入铝箔袋，2～8℃备用。
实施例17 ELISA试剂盒组装
将HRP标记抗体(来自实施例13)与鲎C因子多肽包被板(来自实施例16)，组装成内毒素检测的ELISA试剂盒。
实施例18 ELISA试剂盒组装
将HRP标记鲎C因子多肽(来自实施例14)与抗体包被板(来自实施例16)，组装成内毒素检测的ELISA试剂盒。
实施例19 试剂盒检测内毒素
将上述的检测卡(来自实施例12)，用待测样本进行验证。
将待测样本(包括多种待检的药品抽样品，包括：注射用奥扎格雷钠、注射液果糖氯化钠、注射用头孢西丁钠)滴加到检测卡的样本孔中，然后置于荧光检测仪中进行读数。
检测结果与内毒素检测的金标准：内毒素检测鲎试剂盒(动态浊度法，采购自：厦门市鲎试剂实验厂有限公司)如下：
鲎试剂阳性 鲎试剂阴性 合计
检测卡检测阳性 98 0 98
检测卡检测阴性 0 61 61
合计 98 61 159
根据上表可得：
该试纸条的检测灵敏度为：98/(98+0)×100％＝100％；
该试纸条的检测特异性为：61/(61+0)＝100％。
实施例20 试剂盒检测内毒素
将上述的检测卡(来自实施例17)，用待测样本进行验证。
将待测样本(包括多种待检的药品抽样品，包括：注射用奥扎格雷钠、注射液果糖氯化钠、注射用头孢西丁钠)滴加到检测卡的样本孔中，然后置于荧光检测仪中进行读数。
检测结果与内毒素检测的金标准(鲎试剂)如下：
鲎试剂阳性 鲎试剂阴性 合计
检测卡检测阳性 98 0 98
检测卡检测阴性 0 61 61
合计 98 61 159
根据上表可得：
该试纸条的检测灵敏度为：98/(98+0)×100％＝100％；
该试纸条的检测特异性为：61/(61+0)＝100％。
实施例21 试剂盒检测内毒素
将上述的包被板(来自实施例18)，用待测样本进行验证。
将待测样本(包括多种待检的药品抽样品，包括：注射用奥扎格雷钠、注射液果糖氯化钠、注射用头孢西丁钠)滴加到包被板的样本孔中，然后置于酶标仪中进行读数。
检测结果与内毒素检测的金标准(鲎试剂)如下：
鲎试剂阳性 鲎试剂阴性 合计
包被板检测阳性 97 0 98
包被板检测阴性 1 61 61
合计 98 61 159
根据上表可得：
该包被板的检测灵敏度为：97/(97+1)×100％＝98.98％；
该包被板的检测特异性为：61/(61+0)＝100％。
上述实施例结果表明，本检测试剂盒检测内毒素的准确率非常高，能够满足实际应用的要求。
应当说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明的范围，凡在本发明的精神和原则之内所作出的任何修改、等同的替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 无锡市人民医院
南京思同生物科技有限公司
<120> 一种细菌内毒素的检测试纸及试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> PRT
<213> Carcinoscorpius rotundicauda
<400> 1
Gly Phe Lys Leu Lys Gly Met Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn Gly
1 5 10 15
Gln Trp Ser Asn Phe Pro Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Met Val
20 25 30
Ser Ser
<210> 2
<211> 34
<212> PRT
<213> Limulus polyphemus
<400> 2
His Ala Glu His Lys Val Lys Ile Gly Val Glu Gln Lys Tyr Gly Gln
1 5 10 15
Phe Pro Gln Gly Thr Glu Val Thr Tyr Thr Cys Ser Gly Asn Tyr Phe
20 25 30
Leu Met

Claims (8)

1.一种细菌内毒素检测试纸，试纸包括纤维素膜和结合垫，其特征在于，抗细菌内毒素抗体附着在纤维素膜上，基因工程重组的鲎C因子多肽包被在结合垫上，所述的细菌内毒素抗体、基因工程重组的鲎C因子多肽与细菌内毒素特异性地结合，形成夹心结构。
2.根据权利要求1所述的细菌内毒素检测试纸，其特征在于，所述的鲎C因子多肽用标记物标记。
3.根据权利要求1所述的细菌内毒素检测试纸，其特征在于，所述的方法，抗细菌内毒素抗体用标记物标记。
4.根据权利要求1所述的细菌内毒素检测试纸，其特征在于，所述的鲎C因子多肽，其序列是来自于中华鲎或者美洲鲎的C因子编码序列，应至少含有以下两组氨基酸序列：
SEQ ID NO.1：GFKLKGMARISCLPNGQWSNFPPKCIRECAMVSS
以及，
SEQ ID NO.2：HAEHKVKIGVEQKYGQFPQGTEVTYTCSGNYFLM
其中，两组氨基酸单独串联或重复串联。
5.根据权利要求2所述的细菌内毒素检测试纸，其特征在于，所述的鲎C因子多肽可用至少一种以下的标记物标记：胶乳颗粒、胶体金、荧光、地高辛、生物素、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、吖啶酯、吖啶酯衍生物、鲁米诺、鲁米诺衍生物或三联吡啶钌。
6.根据权利要求3所述的细菌内毒素检测方法，其特征在于，所述的抗细菌内毒素的抗体可用至少一种以下的标记物标记：胶乳颗粒、胶体金、荧光、地高辛、生物素、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、吖啶酯、吖啶酯衍生物、鲁米诺、鲁米诺衍生物或三联吡啶钌。
7.利用权利要求1-6中任一所述的细菌内毒素检测试纸来检测细菌内毒素的试剂盒，其特征在于，所述鲎C因子多肽或抗细菌内毒素抗体可结合于固相载体上，加入待测样本后，捕获细菌内毒素，再加入对应的标记物标记的抗细菌内毒素抗体或鲎C因子多肽，形成夹心结构，通过免疫检测方法检测样品中的细菌内毒素。
8.根据权利要求7所述的检测细菌内毒素试剂盒，其特征在于，所述的固相载体为乳胶颗粒、硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏氟乙烯膜、微孔板或磁性颗粒中的一种或几种。
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