CN108866087B - 一种特异性检测(1-3)-β-D-葡聚糖的检测试剂及其制备方法 - Google Patents

一种特异性检测(1-3)-β-D-葡聚糖的检测试剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种特异性检测(1‑3)‑β‑D‑葡聚糖的检测试剂及其制备方法。本发明分别得到了鲎G因子酶原α亚基、β亚基和凝血酶原基因的核苷酸优化序列，如SEQ ID NO：1～3所示；还得到了共同表达上述3种关键因子的核苷酸序列，如SEQ ID NO：4所示；并成功构建了单独表达或共同表达3种关键因子的真核表达载体，最后成功获得了类似天然鲎试剂的人工鲎试剂，可用于检测(1‑3)‑β‑D‑葡聚糖，而且灵敏度高，特异性强，可降低假阳性，制备工艺简单，无需提取纯化蛋白，生产成本低，同时大大减少对野生鲎资源的需求，具有广阔的市场应用前景。

Description

一种特异性检测(1-3)-β-D-葡聚糖的检测试剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物检测和医疗技术领域，具体地，涉及一种特异性检测(1-3)-β-D-葡聚糖的检测试剂及其制备方法。
背景技术
深部真菌感染发病率逐年上升，因缺少有效的早期诊断手段，其病死率居高不下。目前，检测真菌感染的方法有血培养、组织活检、PCR技术和免疫学方法。其中，血培养和组织活检因培养方法耗时长和检出阳性率低，不宜作早期诊断；PCR只能检测已知致病真菌感染，不适合早期诊断罕见的条件致病真菌感染；而免疫学方法要做多种真菌抗原筛查，易漏诊，且费时又不经济。
鲎的血细胞溶解物可被微量的细菌内毒素或微量的真菌细胞壁成分(1-3)-β-D-葡聚糖激活产生一系列的酶促反应最终形成凝胶，该反应的机理如图1所示。深部真菌感染的严重程度常与血浆(1-3)-beta-D-葡聚糖(即(1-3)-β-D-葡聚糖)的升高水平一致，而(1-3)-β-D-葡聚糖可特异性激活自鲎血细胞的G因子，此过程称为G试验。G试验在深部真菌感染的早期诊断中具有较高敏感性和特异性，所以临床检验已收录G试验作为真菌感染的早期诊断方法。
鲎试剂主要成分包括C因子、B因子、G因子、凝固酶原、凝固蛋白原(或显色基质)、二价阳离子和缓冲盐等。但是，因鲎凝血过程有两条不同的激活途径，一条是内毒素介导的C因子途径：C因子(FC)结合内毒素而被激活，然后激活B因子，活化的B因子将凝固酶原(Proclotting enzyme)转化为凝固酶(clotting enzyme)，凝固酶将凝固蛋白原转化为凝固蛋白，凝固蛋白相互交联脱水而形成凝胶；另一条是由1,3-β-D-葡聚糖介导的G因子(FG)途径，同样可以引起相似的凝集反应，产生假阳性结果，因此，自然来源的鲎试剂不能直接用于检测真菌感染。
目前，尽管有在鲎试剂中通过添加抗脂多糖物质来增加检测特异性的方法，但其并不能完全阻断内毒素对G试验的干扰，容易产生假阳性结果。另外，鲎试剂只能通过收集鲎血淋巴生产，制备鲎试剂严重依赖鲎资源，随着生物制品、医药如：注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器械(如一次性注射器，植入性生物材料)等生产单位迅速增长，真菌感染检测试剂的需求越来越大，使得海洋中鲎的数量逐渐减少。因此，开发不依靠使用鲎血淋巴的，用于诊断真菌感染的鲎血G因子变得越来越重要。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术的缺陷，提供一种特异性检测(1-3)-β-D-葡聚糖的检测试剂。该检测试剂可作为天然鲎试剂的替代品，排除了C因子旁路干扰，从而有效地避免了内毒素产生假阳性的可能性，灵敏度高、特异性强，并且解决了鲎数量有限、鲎试剂各批次不稳定性的缺点，可作为新型(1-3)-β-D-葡聚糖检测试剂，可通用于现有的各种采用(1-3)-β-D-葡聚糖检测诊断技术检测真菌感染的试剂盒。
本发明的第一个目的在于提供一种表达鲎G因子酶原α亚基和β亚基的重组基因。
本发明的第二个目的在于提供一种表达鲎凝血酶原的重组基因。
本发明的第三个目的在于提供一种共表达鲎G因子酶原α亚基、β亚基和凝血酶原的重组基因。
本发明的第四个目的在于提供一种含有上述任一所述的重组基因的真核表达载体。
本发明的第五个目的在于提供一种含有上述真核表达载体的宿主细胞。
本发明的第六个目的在于提供上述重组基因或真核表达载体或宿主细胞在制备人工鲎试剂中的应用
本发明的第七个目的在于提供上述重组基因或真核表达载体或宿主细胞在制备(1-3)-β-D-葡聚糖检测试剂中的应用。
本发明的第八个目的在于提供上述重组基因或真核表达载体或宿主细胞在制备真菌感染检测试剂中的应用。
本发明的第九个目的在于提供一种人工鲎试剂或(1-3)-β-D-葡聚糖检测试剂的制备方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种表达鲎G因子酶原α亚基和β亚基的重组基因，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO：1所示和SEQ ID NO：2所示。
一种表达鲎凝血酶原的重组基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
一种共表达鲎G因子酶原α亚基、β亚基和凝血酶原的重组基因，其所述重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明首先对(1-3)-β-D-葡聚糖激发途径的3个关键因子(G因子酶原的α亚基和β亚基，凝血酶原)的基因序列进行了优化，成功构建了单独表达或共同表达上述三种密码子优化后的酶原基因的真核表达载体，再将上述真核表达载体分别转化进不同的工程细胞中进行真核表达，成功获得了类似天然鲎试剂的重组鲎试剂，可用于检测(1-3)-β-D-葡聚糖，具有灵敏度高、特异性强的优点。
本发明还请求保护一种真核表达载体，含有上述的重组基因。
其中，共表达3个关键因子的真核表达载体的制备方法，包括如下步骤：将包含有2A肽(F2A和E2A)开放读码框序列和G因子α亚基和β亚基基因，凝血酶原基因开放读码框连接，排列顺序如：5'-NheⅠ-G因子α亚基基因flag-F2A基因-G因子β亚基基因flag-E2A基因-凝血酶原基因flag-TGA-XhoⅠ-3'；插入到pcDNA3.1质粒多克隆位点NheⅠ～XhoIⅠ之间。
本发明还请求保护一种宿主细胞，含有上述真核表达载体。
所述宿主细胞的制备方法，包括如下步骤：将上述的重组基因装载入真核表达载体中，再将真核表达载体导入动物细胞中，筛选，得到分别稳定表达G因子酶原的α亚基、β亚基和凝血酶原的细胞，或者得到稳定共表达3个关键因子的细胞，即得。
优选地，所述真核表达载体转入动物细胞的方法包括转染或病毒感染法。
优选地，所述真核表达载体为哺乳类表达载体或昆虫表达载体。
更优选地，所述真核表达载体为含有CMV启动子的pcDNA3.1载体。
优选地，所述动物细胞为COS细胞系、CHO细胞系或其他能利用CMV启动子的细胞系。
所述筛选的方法为：根据载体所携带的抗性基因使用抗生素筛选稳定表达上述3个关键因子(G因子酶原的α亚基和β亚基，凝血酶原)的细胞
优选地，所述抗生素包括但不限于新霉素。
本发明还请求保护上述重组基因或真核表达载体或宿主细胞在制备人工鲎试剂中的应用。
本发明还请求保护上述重组基因或真核表达载体或宿主细胞在制备(1-3)-β-D-葡聚糖检测试剂中的应用。
本发明还请求保护上述重组基因或真核表达载体或宿主细胞在制备真菌感染检测试剂中的应用。
本发明还提供了特异性检测(1-3)-β-D-葡聚糖的试剂的2种不同制备方法。
第一种制备方法，包括以下步骤：
S1.先分别单独构建含有SEQ ID NO：1～3所示核苷酸序列的真核表达载体，然后将其分别导入动物细胞中，得到稳定表达G因子酶原的α亚基、β亚基和凝血酶原的3种细胞；
S2.按比例混合3种细胞，1000～2000转/分钟离心8～12min(优选10min)，收集细胞，将液体部分丢弃；加入无(1-3)-β-D-葡聚糖水，充分裂解细胞；4000～5000转/分钟离心13～17min(优选15min)，收集上清液，将不溶物丢弃；
S3.按上清液与氯仿的比例为1：0.6～2加入氯仿，在3～10℃下振摇10～30min，静置8～12min(优选10min)后5000g，2～6℃，离心5～10min，收集上清液，得到制备试剂的原液；
S4.加入氯化钠、CaCl2、MgCl2和右旋糖酐，混匀，得到人工鲎试剂，即为所述特异性检测(1-3)-β-D-葡聚糖的试剂。
第二种制备方法，包括以下步骤：
S11.先构建含有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的真核表达载体，然后导入动物细胞中，得到共表达鲎G因子酶原α亚基、β亚基和凝血酶原的细胞；
S12.扩增培养后，收集细胞，1000～2000转/分钟离心8～12min(优选10min)，收集细胞，将液体部分丢弃；加入无(1-3)-β-D-葡聚糖水，充分裂解细胞；4000～5000转/分钟离心13～17min(优选15min)，收集上清液，将不溶物丢弃；
S13.按上清液与氯仿的比例为1：0.6～2加入氯仿，在3～10℃下振摇10～30min；静置8～12min(优选10min)后5000g，2～6℃，离心5～10min，收集上清液，得到制备试剂的原液；
S14.加入氯化钠、CaCl2、MgCl2和右旋糖酐，混匀，得到人工鲎试剂，即为所述特异性检测(1-3)-β-D-葡聚糖的试剂。
优选地，步骤S2或步骤S12中，当细胞扩增到汇合度在85％～95％(优选90％)时，进行收集细胞。
优选地，步骤S2或步骤S12中，裂解前，用无(1-3)-β-D-葡聚糖的生理盐水或其他常用的缓冲液进行漂洗。
更优选地，所述缓冲液包括但不限于tis-HCl缓冲液。
更优选地，漂洗的次数为2～4次。
优选地，步骤S2中，按比例表达G因子酶原的α亚基、β亚基和凝血酶原细胞的＝1：1：15～35将3种细胞混合。
更优选地，步骤S2中，按比例表达G因子酶原的α亚基、β亚基和凝血酶原细胞的＝1：1：25将3种细胞混合。
优选地，所述振摇的速度为每分钟150～200次(优选180次)。
优选地，步骤S2或步骤S12中，加入终浓度为0.06％～0.2％氯化钠、终浓度为0.15～0.6M的CaCl2、终浓度为0.2～0.5M的MgCl2、以及终浓度为5％～10％右旋糖酐。
采用化学显色法验证所述人工鲎试剂对(1-3)-β-D-葡聚糖的检测结果：将显色基质鲎三肽：BOC-Leu-Gly-Arg pNA.HCl底物溶于无(1-3)-β-D-葡聚糖水中，于-20℃避光保存，储存液浓度为1mM。将上述制备的人工鲎G试剂用0.1～1mL无热原水复溶解，加入鲎三肽显色剂(终浓度为10μM)混匀，然后分别加入不同度的(1-3)-β-D-葡聚糖，混匀，放入37℃水浴30min后，12.5％乙酸0.1mL终止反应。用酶标仪测量405nm的OD值。
本发明还请求保护上述采用上述制备方法所制得的人工鲎试剂或(1-3)-β-D-葡聚糖检测试剂。
所述人工鲎试剂或(1-3)-β-D-葡聚糖检测试剂含有SEQ ID NO：1～3所示重组基因的表达产物或含有SEQ ID NO：4所示重组基因的表达产物。
经实验证实，本发明制备得到的基因工程鲎血G因子可用于检测(1-3)-β-D-葡聚糖含量，也用于临床诊断深部真菌感染。而且使用条件无特殊要求，可在室温条件下使用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所提供的特异性检测(1-3)-β-D-葡聚糖的试剂灵敏度高，线性范围在2.5～640pg/mL；只对(1-3)-β-D-葡聚糖敏感，而对内毒素不敏感，特异性强，排除了C因子旁路干扰，从而有效地避免了内毒素产生假阳性的可能性，可降低假阳性；且制备工艺简单，无需分别提取纯化表达的蛋白，提高了生产效率，减少污染，生产成本低，同时大大减少对野生鲎资源的需求，可作为天然鲎试剂的替代品，具有广阔的市场应用前景。
附图说明
图1为鲎的血细胞溶解物被细菌内毒素或真菌细胞壁成分(1-3)-β-D-葡聚糖激活后产生的酶促反应机理图。
图2为本发明采用的pcDNA3.1质粒图谱。
图3为实施例2中G因子酶原的α亚基、β亚基和凝血酶原在不同细胞中的表达情况。
图4为实施例3中在细胞中共表达G因子酶原的α亚基、β亚基和凝血酶原的情况。
图5为实施例2中以lg((1-3)-β-D-葡聚糖浓度)为横坐标，-ln(OD405nm)为纵坐标建立的标准曲线。
图6为实施例3中以lg((1-3)-β-D-葡聚糖浓度)为横坐标，-ln(OD405nm)为纵坐标建立的标准曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1鲎G因子酶原的α亚基基因和β亚基基因、凝血酶原基因的优化
本实施例通过大量分析比对以及实验研究，创造性得到：
优化后的表达鲎G因子酶原的α亚基的重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
优化后的表达鲎G因子酶原的β亚基的重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
优化后的表达鲎凝血酶原的重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
实施例2人工鲎试剂的制备方法和(1-3)-β-D-葡聚糖的检测方法
1、一种人工鲎试剂或(1-3)-β-D-葡聚糖检测试剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别将SEQ ID NO：1～3所示的3个关键因子(G因子酶原的α亚基、β亚基和凝血酶原)的基因序列装载入含有CMV启动子的真核表达载体pcDNA3.1质粒中，然后采用转染法分别导入动物细胞中，并根据载体所携带的抗性基因使用新霉素筛选分别稳定表达上述3个关键因子的COS细胞；
(2)将步骤1所得细胞进行细胞扩增，当细胞扩增到汇合度达90％时，分别收集3种细胞，用无(1-3)-β-D-葡聚糖的生理盐水漂洗3次，计数；然后将3种细胞按照以下数量比例混合，即表达G因子酶原α亚基的细胞数目：表达G因子酶原β亚基的细胞数目：表达凝血酶原的细胞数目＝1：1：25；
(3)用无(1-3)-β-D-葡聚糖水进行裂解细胞混合液，于10000g、4℃下离心5～10min，收集上清液，将不溶物丢弃；按体积比(上清液：氯仿＝1：0.6～2)加入相应体积的氯仿，于3～10℃下剧烈振摇10～30min，于5000g、4℃下离心5～10min，收集上清液，上清液即人工制备的特异检测(1-3)-β-D-葡聚糖的试剂原液；
(4)加入氯化钠使之终浓度为0.06％～0.2％，CaCl2终浓度为0.15～0.6M，MgCl2终浓度为0.2～0.5M，再加入右旋糖酐为赋形剂，右旋糖酐的终浓度为5％～10％，混匀，分装0.1～1mL/支安培瓶，冷冻干燥，即为制备的人工鲎试剂，可用于(1-3)-β-D-葡聚糖的检测。
2、一种(1-3)-β-D-葡聚糖的检测方法，包括如下步骤：
采用化学显色法验证上述人工鲎试剂对(1-3)-β-D-葡聚糖的检测结果，步骤如下：
(1)将显色基质鲎三肽(BOC-Leu-Gly-Arg pNA.HCl)底物溶于无人工鲎试剂的水中，于-20℃避光保存，储存液浓度为1mM；
(2)将上述制备的人工鲎试剂用0.1～1mL无(1-3)-β-D-葡聚糖的水复溶解，加入鲎三肽显色剂(终浓度为10μM)混匀，然后分别加入不同浓度的(1-3)-β-D-葡聚糖或100EU/mL内毒素，混匀，于37℃水浴30min后，加入0.1mL 12.5％乙酸终止反应；
(3)用酶标仪测量405nm的OD值。
3、结果分析
(1)3种因子在细胞中表达分析
步骤3中，将各组细胞裂解后，收集蛋白溶液，用免疫印迹分析检测蛋白表达情况。结果如图3所示，结果表明，转染G因子α亚基、β亚基和凝血酶原基因的细胞均成功表达3种蛋白质。
(2)(1-3)-β-D-葡聚糖检测结果如表1和图5所示。随着(1-3)-β-D-葡聚糖浓度增加显色基质释放越多，OD405nm值越大，提示酶被激活越多。人工鲎试剂对(1-3)-β-D-葡聚糖检测的线性范围在2.5～640pg/m L，拟合直线：y＝-0.9861x+2.8335，R2＝0.9838。同时表1中的结果还表明，100EU/mL的内毒素不能激活本试剂，提示本发明制备的人工鲎试剂只对(1-3)-β-D-葡聚糖敏感，而对内毒素不敏感，特异性强。
表1(1-3)-β-D-葡聚糖检测结果
Figure BDA0001740033310000071
实施例3人工鲎试剂的制备方法和(1-3)-β-D-葡聚糖的检测方法
1、人工鲎试剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将SEQ ID NO：1～3所示的3个关键因子(G因子酶原的α亚基、β亚基和凝血酶原)的基因序列同时装载入含有CMV启动子的真核表达载体pcDNA3.1质粒中，然后采用病毒感染导入动物细胞中，并根据载体所携带的抗性基因使用抗生素筛选，得到稳定、共表达上述3个关键因子的细胞；
其中，共表达3种因子的真核表达载体pcDNA3.1质粒图谱如图2所示；
将3种优化后基因装载入含有CMV启动子的pcDNA3.1载体的具体操作为：将包含有2A肽(F2A和E2A)开放读码框序列和G因子α亚基基因、G因子β亚基基因、凝血酶原基因开放读码框连接，排列顺序如：5’-NheI-G因子α亚基基因flag-F2A基因-G因子β亚基基因flag-E2A基因-凝血酶原基因flag-TGA-XhoI-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，然后插入到pcDNA3.1质粒多克隆位点NheI～XhoI之间；
(2)将步骤1所得细胞进行细胞扩增，当细胞扩增到汇合度达90％时，收集细胞，用无(1-3)-β-D-葡聚糖的生理盐水漂洗3次，计数；
(3)用无(1-3)-β-D-葡聚糖水进行裂解细胞混合液，于10000g、4℃下离心5～10min，收集上清液，将不溶物丢弃；按体积比(上清液：氯仿＝1：0.6～2)加入相应体积的氯仿，于3～10℃下剧烈振摇10～30min，于5000g、4℃下离心5～10min，收集上清液，上清液即人工制备的特异检测(1-3)-β-D-葡聚糖的试剂原液；
(4)加入氯化钠使之终浓度为0.06％～0.2％，CaCl2终浓度为0.15～0.6M，MgCl2终浓度为0.2～0.5M，再加入右旋糖酐为赋形剂，右旋糖酐的终浓度为5％～10％，混匀，分装0.1～1mL/支安培瓶，冷冻干燥，即为制备的人工鲎试剂，可用于(1-3)-β-D-葡聚糖的检测。
2、将本实施例得到的人工鲎试剂，用于(1-3)-β-D-葡聚糖的检测，其检测方法同实施例2。
3、结果
(1)3种因子在细胞中表达分析
将各组细胞裂解后，收集蛋白溶液，用免疫印迹分析检测蛋白表达情况。
结果如图4所示，表明转染5'-NheⅠ-G因子α亚基基因flag-F2A基因-G因子β亚基基因flag-E2A基因-凝血酶原基因flag-TGA-XhoⅠ-3'序列的细胞成功共表达3种蛋白质。
(2)检测结果如表2和图6所示。随着(1-3)-β-D-葡聚糖浓度增加显色基质释放越多，OD405nm值越大，提示酶被激活越多。人工鲎试剂对(1-3)-β-D-葡聚糖检测的线性范围在2.5～640pg/mL，拟合直线：y＝-1.1546x+3.1105，R2＝0.9916。同时表2中的结果还表明，100EU/mL的内毒素不能激活本试剂，提示本发明制备的人工鲎试剂只对(1-3)-β-D-葡聚糖敏感，而对内毒素不敏感，特异性强。
表2(1-3)-β-D-葡聚糖的检测结果
Figure BDA0001740033310000091
实施例4人工鲎试剂用于真菌感染的检测
将实施例2、实施例3制备得到的人工鲎试剂和显色基质、(1-3)-β-D-葡聚糖溶液(阳性对照物)和单纯的水样品(阴性对照物)分别用于健康人血样本、真菌感染者血样本的检测。
结果发现，健康人血样品的光吸收值显著低于真菌感染者血样品的光吸收值，(1-3)-β-D-葡聚糖溶液(阳性对照物)的光吸收值增强，而单纯的水样品(阴性对照物)光吸收值很低，说明本发明的人工鲎试剂可用于真菌感染的检测。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 广东医科大学
<120> 一种特异性检测(1-3)-β-D-葡聚糖的检测试剂及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 2022
<212> DNA
<213> 鲎试剂(Tachypiens Amebocyte Lysate)
<400> 2
atgctggttc tgctgtgctg cgttgttctg cacgttggtg ttgctcgtat ctgctgctct 60
cacgaaccga aatggcagct ggtttggtct gacgaattca ccaacggtat ctcttctgac 120
tgggaattcg aaatgggtaa cggtctgaac ggttggggta acaacgaact gcagtactac 180
cgtcgtgaaa acgctcaggt tgaaggtggt aaactggtta tcaccgctaa acgtgaagac 240
tacgacggtt tcaaatacac ctctgctcgt ctgaaaaccc agttcgacaa atcttggaaa 300
tacggtaaaa tcgaagctaa aatggctatc ccgtctttcc gtggtgtttg ggttatgttc 360
tggatgtctg gtgacaacac caactacgtt cgttggccgt cttctggtga aatcgacttc 420
atcgaacacc gtaacaccaa caacgaaaaa gttcgtggta ccatccactg gtctaccccg 480
gacggtgctc acgctcacca caaccgtgaa tctaacacca acggtatcga ctaccacatc 540
tactctgttg aatggaactc ttctatcgtt aaatggttcg ttaacggtaa ccagtacttc 600
gaagttaaaa tccagggtgg tgttaacggt aaatctgctt tccgtaacaa agttttcgtt 660
atcctgaaca tggctatcgg tggtaactgg ccgggtttcg acgttgctga cgaagctttc 720
ccggctaaaa tgtacatcga ctacgttcgt gtttaccagg acgcttctac ctcttctccg 780
gttggtgaca cctctctgga cggttactac ttcgttcaga accgtcactc tgaactgtac 840
ctggacgtta ccgacgcttc taacgaagac ggtgctttcc tgcagcagtg gtcttactct 900
ggtaacgaaa accagcagtt cgacttcgaa cacctggaaa acaacgttta caaaatcacc 960
aacaaaaaat ctggtaaatc tctggacgtt tacaacttcg gtaccgaaaa cggtgttcgt 1020
atccagcagt ggtcttacgg tggtgctcgt aaccagcagt tcaccgttca gtctgttggt 1080
gacggttact acaaaatcat cccgcgtggt tctggtaaac tggttgaagt tgctgacttc 1140
tctaaagacg ctggtggtaa aatccagcag tggtctgaca acaaccagct gtctggtcag 1200
tggaaactga tcaaatctaa atcttactct aaactgatcc aggctgaatc ttacttcgac 1260
tcttctaaag ttcagctgga agacacctct gacgttggtg gtggtaaaaa cgttaaatgc 1320
gacaacgaag gtgcttggat ggcttacaaa gacatcgact tcccgtcttc tggtaactac 1380
cgtatcgaat accgtgttgc ttctgaacgt gctggtggta aactgtctct ggacctgaac 1440
gctggttcta tcgttctggg tatgctggac gttccgtcta ccggtggttg gcagaaatgg 1500
accaccatct ctcacaccgt taacgttgac tctggtacct acaacctggg tatctacgtt 1560
cagcgtgctt cttggaacat caactggatc aaaatcacca aaatcccgga acagtctaac 1620
ctgaaccagg gtcgtcgtaa ctctaaactg atccaggctg aatcttactt ctcttactct 1680
gaagttcagc tggaagacac cctggacgtt ggtggtggta aaaacgttaa atgcgacaaa 1740
gaaggtgctt ggatggctta caaagacatc gacttcccgt cttctggttc ttaccgtgtt 1800
gaataccgtg ttgcttctga acgtgctggt ggtaaactgt ctctggacct gaacgctggt 1860
tctatcgttc tgggtatgct ggacatcccg tctaccggtg gtctgcagaa atggaccacc 1920
atctctcaca tcgttaacgt tgacctgggt acctacaacc tgggtatcta cgttcagaaa 1980
gcttcttgga acatcaactg gatccgtatc accaaagttt ga 2022
<210> 2
<211> 930
<212> DNA
<213> 鲎试剂(Tachypiens Amebocyte Lysate)
<400> 2
atggacatct ctttcctggt tttcatcacc ctgtctatgg ctctgttctc ttctaacgtt 60
accggtacct ctgttacctc tcgtgttcgt cgtggtatca acgaaaaaca ctgcggtttc 120
cgtccggtta tcacccgtat catcggtggt ggtatcgcta ccccgcactc ttggccgtgg 180
atggttggta tcttcaaagt taacccgcac cgtttcctgt gcggtggttc tatcatcaac 240
aaagtttctg ttgttaccgc tgctcactgc ctggttaccc agttcggtaa ccgtcagaac 300
tactctatct tcgttcgtgt tggtgctcac gacatcgaca actctggtac caactaccag 360
gttgacaaag ttatcgttca ccagggttac aaacaccact ctcactacta cgacatcggt 420
ctgatcctgc tgtctaaacc ggttgaatac aacgacaaaa tccagccggt ttgcatcccg 480
gaattcaaca aaccgcacgt taacctgaac aacatcaaag ttgttatcac cggttggggt 540
gttaccggta aagctaccga aaaacgtaac gttctgcgtg aactggaact gccggttgtt 600
accaacgaac agtgcaacaa atcttaccag accctgccgt tctctaaact gaaccgtggt 660
atcaccaacg acatgatctg cgctggtttc ccggaaggtg gtaaagacgc ttgccagggt 720
gactctggtg gtccgctgat gtaccagaac ccgaccaccg gtcgtgttaa aatcgttggt 780
gttgtttctt tcggtttcga atgcgctcgt ccgaacttcc cgggtgttta cacccgtctg 840
tcttcttacg ttaactggct gcaggaaatc accttcggtc agtctctggc ttctctgttc 900
gaagttgttc cgatcttcat cccggaatga 930
<210> 3
<211> 1158
<212> DNA
<213> 鲎试剂(Tachypiens Amebocyte Lysate)
<400> 3
atgttggtga ataacgtgtt ttcactactg tgtttcccac tcttgatgtc tgtggttaga 60
tgcagtactc tcagcagaca gcgtagacag tttgttttcc ctgacgagga agaactttgc 120
tcaaaccgat ttactgaaga aggaacatgc aaaaatgtct tggattgtag aatactttta 180
caaaaaaatg attataattt actcaaagaa tcaatatgcg gctttgaagg cataacaccc 240
aaagtttgtt gtccgaaatc aagccatgta atttcaagta cacaggcacc tccagaaacc 300
actacgactg aacgcccacc aaaacagata ccacccaatc ttcctgaagt gtgtggaatt 360
cacaatacta caactaccag gattattgga ggtcgggaag cacctattgg agcctggccg 420
tggatgactg ctgtctacat aaaacaagga ggaatcagaa gtgttcagtg tggtggcgca 480
cttgtcacta acaggcacgt gattacagct tcgcactgtg ttgtaaacag tgcaggaaca 540
gatgtgatgc cagctgatgt attctcggtt cgtctgggtg aacacaattt atacagtacc 600
gatgacgatt cgaatccaat agattttgca gttacgtcgg tgaaacatca cgaacacttt 660
gtactcgcga cgtatttgaa tgacatcgca attctaacgt taaatgacac agttacgttt 720
acagacagaa ttcgacccat ttgtctacct tatcgtaagt tgagatacga tgatctagca 780
atgagaaaac cgtttatcac tggatgggga acaacagcat ttaacggccc atctagtgca 840
gtgttgagag aagtacagtt accaatatgg gaacacgagg cctgtagaca ggcctacgag 900
aaggatttaa atattacaaa cgtgtatatg tgtgctggct ttgcagatgg cgggaaggat 960
gcttgccagg gtgattctgg aggtccaatg atgttgcctg ttaaaaccgg agagttttat 1020
ctcattggaa ttgtgtcttt cggaaagaaa tgcgcattgc ctggatttcc tggggtttac 1080
acaaaagtga cagagttttt agattggatt gcagaacata tggtgttaat ggactacaaa 1140
gacgatgacg acaagtag 1158
<210> 4
<211> 4308
<212> DNA
<213> 鲎试剂(Tachypiens Amebocyte Lysate)
<400> 4
ctagctagca tgctggttct gctgtgctgc gttgttctgc acgttggtgt tgctcgtatc 60
tgctgctctc acgaaccgaa atggcagctg gtttggtctg acgaattcac caacggtatc 120
tcttctgact gggaattcga aatgggtaac ggtctgaacg gttggggtaa caacgaactg 180
cagtactacc gtcgtgaaaa cgctcaggtt gaaggtggta aactggttat caccgctaaa 240
cgtgaagact acgacggttt caaatacacc tctgctcgtc tgaaaaccca gttcgacaaa 300
tcttggaaat acggtaaaat cgaagctaaa atggctatcc cgtctttccg tggtgtttgg 360
gttatgttct ggatgtctgg tgacaacacc aactacgttc gttggccgtc ttctggtgaa 420
atcgacttca tcgaacaccg taacaccaac aacgaaaaag ttcgtggtac catccactgg 480
tctaccccgg acggtgctca cgctcaccac aaccgtgaat ctaacaccaa cggtatcgac 540
taccacatct actctgttga atggaactct tctatcgtta aatggttcgt taacggtaac 600
cagtacttcg aagttaaaat ccagggtggt gttaacggta aatctgcttt ccgtaacaaa 660
gttttcgtta tcctgaacat ggctatcggt ggtaactggc cgggtttcga cgttgctgac 720
gaagctttcc cggctaaaat gtacatcgac tacgttcgtg tttaccagga cgcttctacc 780
tcttctccgg ttggtgacac ctctctggac ggttactact tcgttcagaa ccgtcactct 840
gaactgtacc tggacgttac cgacgcttct aacgaagacg gtgctttcct gcagcagtgg 900
tcttactctg gtaacgaaaa ccagcagttc gacttcgaac acctggaaaa caacgtttac 960
aaaatcacca acaaaaaatc tggtaaatct ctggacgttt acaacttcgg taccgaaaac 1020
ggtgttcgta tccagcagtg gtcttacggt ggtgctcgta accagcagtt caccgttcag 1080
tctgttggtg acggttacta caaaatcatc ccgcgtggtt ctggtaaact ggttgaagtt 1140
gctgacttct ctaaagacgc tggtggtaaa atccagcagt ggtctgacaa caaccagctg 1200
tctggtcagt ggaaactgat caaatctaaa tcttactcta aactgatcca ggctgaatct 1260
tacttcgact cttctaaagt tcagctggaa gacacctctg acgttggtgg tggtaaaaac 1320
gttaaatgcg acaacgaagg tgcttggatg gcttacaaag acatcgactt cccgtcttct 1380
ggtaactacc gtatcgaata ccgtgttgct tctgaacgtg ctggtggtaa actgtctctg 1440
gacctgaacg ctggttctat cgttctgggt atgctggacg ttccgtctac cggtggttgg 1500
cagaaatgga ccaccatctc tcacaccgtt aacgttgact ctggtaccta caacctgggt 1560
atctacgttc agcgtgcttc ttggaacatc aactggatca aaatcaccaa aatcccggaa 1620
cagtctaacc tgaaccaggg tcgtcgtaac tctaaactga tccaggctga atcttacttc 1680
tcttactctg aagttcagct ggaagacacc ctggacgttg gtggtggtaa aaacgttaaa 1740
tgcgacaaag aaggtgcttg gatggcttac aaagacatcg acttcccgtc ttctggttct 1800
taccgtgttg aataccgtgt tgcttctgaa cgtgctggtg gtaaactgtc tctggacctg 1860
aacgctggtt ctatcgttct gggtatgctg gacatcccgt ctaccggtgg tctgcagaaa 1920
tggaccacca tctctcacat cgttaacgtt gacctgggta cctacaacct gggtatctac 1980
gttcagaaag cttcttggaa catcaactgg atccgtatca ccaaagtttt aatggactac 2040
aaagacgatg acgacaaggc acctgcaaaa caacttttga actttgattt gctcaagttg 2100
gcaggagacg ttgagtccaa ccccgggccc atggacatct ctttcctggt tttcatcacc 2160
ctgtctatgg ctctgttctc ttctaacgtt accggtacct ctgttacctc tcgtgttcgt 2220
cgtggtatca acgaaaaaca ctgcggtttc cgtccggtta tcacccgtat catcggtggt 2280
ggtatcgcta ccccgcactc ttggccgtgg atggttggta tcttcaaagt taacccgcac 2340
cgtttcctgt gcggtggttc tatcatcaac aaagtttctg ttgttaccgc tgctcactgc 2400
ctggttaccc agttcggtaa ccgtcagaac tactctatct tcgttcgtgt tggtgctcac 2460
gacatcgaca actctggtac caactaccag gttgacaaag ttatcgttca ccagggttac 2520
aaacaccact ctcactacta cgacatcggt ctgatcctgc tgtctaaacc ggttgaatac 2580
aacgacaaaa tccagccggt ttgcatcccg gaattcaaca aaccgcacgt taacctgaac 2640
aacatcaaag ttgttatcac cggttggggt gttaccggta aagctaccga aaaacgtaac 2700
gttctgcgtg aactggaact gccggttgtt accaacgaac agtgcaacaa atcttaccag 2760
accctgccgt tctctaaact gaaccgtggt atcaccaacg acatgatctg cgctggtttc 2820
ccggaaggtg gtaaagacgc ttgccagggt gactctggtg gtccgctgat gtaccagaac 2880
ccgaccaccg gtcgtgttaa aatcgttggt gttgtttctt tcggtttcga atgcgctcgt 2940
ccgaacttcc cgggtgttta cacccgtctg tcttcttacg ttaactggct gcaggaaatc 3000
accttcggtc agtctctggc ttctctgttc gaagttgttc cgatcttcat cccggaatta 3060
atggactaca aagacgatga cgacaagact aattatgcac ttttgaaatt ggccggagat 3120
gttgagtcca accccgggcc catgttggtg aataacgtgt tttcactact gtgtttccca 3180
ctcttgatgt ctgtggttag atgcagtact ctcagcagac agcgtagaca gtttgttttc 3240
cctgacgagg aagaactttg ctcaaaccga tttactgaag aaggaacatg caaaaatgtc 3300
ttggattgta gaatactttt acaaaaaaat gattataatt tactcaaaga atcaatatgc 3360
ggctttgaag gcataacacc caaagtttgt tgtccgaaat caagccatgt aatttcaagt 3420
acacaggcac ctccagaaac cactacgact gaacgcccac caaaacagat accacccaat 3480
cttcctgaag tgtgtggaat tcacaatact acaactacca ggattattgg aggtcgggaa 3540
gcacctattg gagcctggcc gtggatgact gctgtctaca taaaacaagg aggaatcaga 3600
agtgttcagt gtggtggcgc acttgtcact aacaggcacg tgattacagc ttcgcactgt 3660
gttgtaaaca gtgcaggaac agatgtgatg ccagctgatg tattctcggt tcgtctgggt 3720
gaacacaatt tatacagtac cgatgacgat tcgaatccaa tagattttgc agttacgtcg 3780
gtgaaacatc acgaacactt tgtactcgcg acgtatttga atgacatcgc aattctaacg 3840
ttaaatgaca cagttacgtt tacagacaga attcgaccca tttgtctacc ttatcgtaag 3900
ttgagatacg atgatctagc aatgagaaaa ccgtttatca ctggatgggg aacaacagca 3960
tttaacggcc catctagtgc agtgttgaga gaagtacagt taccaatatg ggaacacgag 4020
gcctgtagac aggcctacga gaaggattta aatattacaa acgtgtatat gtgtgctggc 4080
tttgcagatg gcgggaagga tgcttgccag ggtgattctg gaggtccaat gatgttgcct 4140
gttaaaaccg gagagtttta tctcattgga attgtgtctt tcggaaagaa atgcgcattg 4200
cctggatttc ctggggttta cacaaaagtg acagagtttt tagattggat tgcagaacat 4260
atggtgttaa tggactacaa agacgatgac gacaagtagc tcgagcgg 4308

Claims (7)

1.一种共表达鲎G因子酶原α亚基、β亚基和凝血酶原的重组基因，其特征在于，所述重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.一种真核表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的重组基因。
3.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的真核表达载体。
4.权利要求1所述重组基因或权利要求2所述真核表达载体或权利要求3所述宿主细胞在制备人工鲎试剂中的应用。
5.权利要求1所述重组基因或权利要求2所述真核表达载体或权利要求3所述宿主细胞在制备(1-3)-β-D-葡聚糖检测试剂中的应用。
6.权利要求1所述重组基因或权利要求2所述真核表达载体或权利要求3所述宿主细胞在制备真菌感染检测试剂中的应用。
7.一种特异性检测(1-3)-β-D-葡聚糖的试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S11.先构建含有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的真核表达载体，然后导入动物细胞中，得到共表达鲎G因子酶原α亚基、β亚基和凝血酶原的细胞；
S12.扩增培养后，裂解、离心，收集上清液，得到人工鲎试剂，即为所述特异性检测(1-3)-β-D-葡聚糖的试剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116640710A (zh) * 2022-10-08 2023-08-25 科赫生物科技（北京）有限公司 生产鲎凝血因子FGβ＇的菌株、制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101454448A (zh) * 2006-07-07 2009-06-10 生化学工业株式会社 凝固酶原以及使用所述酶检测内毒素或(1→3)-β-D-葡聚糖的方法
US20140356886A1 (en) * 2009-03-17 2014-12-04 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Method for measuring beta-glucan, and beta-glucan-binding protein for use in the method
CN104884616A (zh) * 2012-12-05 2015-09-02 冲压润滑设备生物技术有限责任公司 在原生动物中重组制备鲎c因子蛋白的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101454448A (zh) * 2006-07-07 2009-06-10 生化学工业株式会社 凝固酶原以及使用所述酶检测内毒素或(1→3)-β-D-葡聚糖的方法
US20140356886A1 (en) * 2009-03-17 2014-12-04 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Method for measuring beta-glucan, and beta-glucan-binding protein for use in the method
CN104884616A (zh) * 2012-12-05 2015-09-02 冲压润滑设备生物技术有限责任公司 在原生动物中重组制备鲎c因子蛋白的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
（1,3）-β-D葡聚糖的检测方法学研究;田振华;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20170315(第03期);E060-182 *
基于碳点标记的（1-3）-β-D葡聚糖的荧光检测方法;葛宇新等;《长春理工大学学报（自然科学版）》;20170831;第40卷(第4期);第133-137页 *
鲎血G因子的原核表达;吴尚等;《中国生物制品学杂志》;20190930;第32卷(第9期);第996-1000页 *

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