CN1406139A - 用于检测β－1,3－葡聚糖的组合物,其制备方法和检测β－1,3－葡聚糖的诊断试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测极小量β－1，3－葡聚糖的组合物，其制备方法以及检测β－1，3－葡聚糖的诊断试剂盒。本发明的组合物在钙离子存在下通过β－1，3－葡聚糖显示酚氧化酶活性。使用本发明的组合物，从样本收集样品，将本发明的组合物和钙离子加入样品中，通过测定酚氧化酶而检测β－1，3－葡聚糖。

Description

用于检测β-1，3-葡聚糖的组合物，其制备方法和检测β-1，3-葡聚糖的 诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及用于检测β-1，3-葡聚糖的组合物，其制备方法以及检测β-1，3-葡聚糖的诊断试剂盒。
背景技术
在免疫受损的癌症患者、器官移植患者和艾滋病患者中，全身真菌感染或原生动物感染增加已经成为严重的医疗问题。因为此类感染而导致的死亡率正在增加。对于这些免疫受损的患者，在感染的早期通过给予抗真菌药治疗真菌感染是重要的。但是，目前早期诊断是一个困难的任务。许多艾滋病患者死于卡氏肺孢子虫感染的肺炎。最近，有报道说β-1，3-葡聚糖作为卡氏肺孢子虫的细胞壁成分存在(Kottom等，J.Biol.Chem.(2000)，275(51)，pp.40628-34)。
为了诊断免疫受损的患者的真菌感染，使用真菌学标准方法，即从患者体内取血，进行培养，以诊断真菌感染的方法。此方法的缺点是治疗不能及时进行，因为只有在2-5天之后才能获得诊断结果。最近，已经提出使用抗体或真菌代谢物的方法。但是，在后一情况中，由于代谢物经常变化，所以分析所有的代谢物有困难，并且诊断灵敏度低且准确性差。由于这些原因，已经进行了广泛研究，以找到在真菌感染早期准确识别患者血中存在的极小量的β-1，3-葡聚糖的系统。
同时，如果在龙虾、鱼或蚌的养殖过程中出现真菌感染，这可能给水产养殖业带来严重的经济损害，因为许多感染的鱼可能死去。即使在这种情况下，如果能够进行早期诊断并采取适当措施，也将能够挽救这些水生动物的生命，从而增加水产养殖的效率。
昆虫中黑素形成由存在于体内的酚类化合物氧化引起。在此过程中起作用的酚氧化酶在平时以酚氧化酶原(prophenoloxidase)形式存在于昆虫体内，酚氧化酶原通过酚氧化酶原链反应终产物的刺激转化为最终激活形式的酚氧化酶。据报道，酚氧化酶原的激活由β-1，3-葡聚糖、脂多糖、肽聚糖以及微生物的其它细胞壁成分引发。
酚氧化酶原存在于全变态昆虫体内，并且通过由β-1，3-葡聚糖或脂多糖引发的级联反应激活为酚氧化酶。反应系统由一系列级联反应步骤组成，该反应系统容易地被外来病原体或来自外界系统的其它分子，或者昆虫自身血细胞的脱粒反应诱导的固有因子激活。结果，酚氧化酶原转化为酚氧化酶，并通过使用儿茶酚胺产生黑素。因此，难以在体外条件下实施该反应系统。
在美国专利4,970,152中，Ashida及其合作者提出了一种通过使用组合物，测定肽聚糖或β-1，3-葡聚糖的方法，所述组合物包含得自蚕幼虫血浆的部分，其能够与β-1，3-葡聚糖或者肽聚糖特异性反应，但不与内毒素反应。在该专利中，能够与β-1，3-葡聚糖特异性反应的组合物通过用亲和色谱除去与肽聚糖反应的物质而获得。
在Eur.J.Biochem，188，507-515(1990)中，Ashida也报道了当存在分离自蚊幼虫的能够识别β-1，3-葡聚糖的组合物时，二价离子在酚氧化酶原的激活中起关键作用。
美国专利5,266,461披露了一种用于检测β-1，3-葡聚糖的试剂，其包含鲎变形溶胞产物。但是，使用这种方法有问题，因为在大多数国家，鲎被列为保护物种。
发明内容
本发明涉及用于检测β-1，3-葡聚糖的组合物。
本发明进一步涉及用于检测β-1，3-葡聚糖的组合物的制备方法。
本发明还涉及检测β-1，3-葡聚糖的方法。
本发明进一步涉及用于检测β-1，3-葡聚糖的诊断试剂盒。
具体实施方式
本发明涉及用于检测实验样品中β-1，3-葡聚糖的组合物，其制备方法以及用于检测β-1，3-葡聚糖的诊断试剂盒。
本文所用的术语“酚氧化酶系统”指在昆虫体内由β-1，3-葡聚糖激活为酚氧化酶的系统。
本文所用的术语“酚氧化酶组合物”指包含酚氧化酶系统的所有或一些成分的组合物，其在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性。
本发明涉及在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的组合物。例如，本发明的酚氧化酶组合物包括昆虫中的酚氧化酶系统的所有或一些成分且包括酚氧化酶原。
本发明还涉及用于检测β-1，3-葡聚糖的组合物，优选地检测最小低至20pg/ml的β-1，3-葡聚糖。
本发明的用于检测β-1，3-葡聚糖的组合物可以用于诊断真菌如念珠菌属和/或原生动物如卡氏肺孢子虫的感染。
本文所用的术语“昆虫”指体内具有酚氧化酶系统的昆虫，优选是全变态昆虫。昆虫的实例包括属于甲壳动物的昆虫如龙虾和小虾，以及鞘翅目，并且更更优选鞘翅目的拟步行虫科(Tenebrionidae)和金龟子科(Scarabaeidae)。
本发明还涉及在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的组合物的制备方法。根据本发明的方法，由β-1，3-葡聚糖激活的酚氧化酶组合物通过将血浆和血细胞溶胞产物混合物用作样品，并且在分离过程中抑制钙离子的生理活性而分离获得。
因此，本发明的方法包括以下步骤：从昆虫获得包括血浆和血细胞溶胞产物混合物的样品，通过用含有足以螯合存在于样品中和存在于本分离方法中的钙离子的量的螯合剂的溶剂或缓冲液处理样品而获得若干部分，以及选择在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的部分。
本发明的方法的其它实例包括以下步骤：从昆虫获得血浆，用含有足以螯合存在于血浆中和存在于本分离方法中的钙离子的量的螯合剂的溶剂或缓冲液处理血浆以获得若干部分，将血细胞溶胞产物或部分纯化的血细胞溶胞产物加入所述若干部分中，以及选择在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的部分。
如有需要，可以将完全或部分纯化的血细胞溶胞产物加入在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的部分中，以提高该部分的灵敏度。
根据本发明，已经证明存在于昆虫中的酚氧化酶系统由钙离子和β-1，3-葡聚糖激活。因此，为了从昆虫分离酚氧化酶系统，需要通过钙离子和β-1，3-葡聚糖抑制酚氧化酶系统或酚氧化酶组合物的激活。基于这些发现，本发明提供从昆虫的血淋巴或血浆和血细胞溶胞产物制备在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的组合物的方法。
根据本发明的制备酚氧化酶组合物的方法包括，在足以螯合可能存在于样品中和存在于为获得酚氧化酶组合物的分离方法中的钙离子的量的螯合剂的存在下，获得包含血淋巴或血浆和血细胞溶胞产物混合物的样品，通过用含有足以螯合存在于上述样品中和在分离方法中存在的钙离子的量的螯合剂的溶剂或缓冲液处理样品而获得若干部分，以及在获得的若干部分中选择在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的部分。
在本发明的方法中，当从昆虫收集样品时，优选使用防止血淋巴凝集的抗凝缓冲液。抗凝缓冲液包括任何能够防止昆虫血淋巴凝集的缓冲液，更优选是柠檬酸盐缓冲液。
根据本发明，已证明可以通过使用昆虫血浆和血细胞混合物获得在钙离子存在下特异性地通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的组合物。本发明的组合物能够检测昆虫血浆和血细胞混合物中浓度低达20pg/ml的β-1，3-葡聚糖。昆虫血浆和血细胞混合物可以通过收集昆虫血淋巴、分离血细胞和血浆、溶解所分离的血细胞以及将血细胞溶胞产物与血浆混合而获得。另一获得昆虫血浆和血细胞混合物的实例是将血细胞溶胞产物或部分纯化的血细胞溶胞产物加入部分纯化的血浆中而获得所述混合物。在另一方法中，昆虫血浆和血细胞混合物可以通过溶解部分或全部血细胞而不分离血细胞和血淋巴而从血淋巴获得。例如，血淋巴或者分离的血细胞可以通过超声或高速离心而溶解。
在本发明的方法中，通过用含有螯合剂的溶剂或缓冲液处理样品获得若干部分的过程可以通过例如柱色谱进行。
本发明的方法中，作为在从昆虫收集血浆和血细胞溶胞产物混合物以及在获得酚氧化酶组合物的分离过程中使用的螯合剂，可以没有限制地使用任何本领域已知的螯合剂，其可以是，例如EDTA、EGTA或柠檬酸。螯合剂的量可以根据分离方法的条件如样品、柱子的种类及溶剂的种类而不同，并且需要足以螯合昆虫样品中和分离方法中的钙离子。因此，本领域普通技术人员将能够不进行过度试验而容易地确定螯合剂的量。
在根据本发明的制备方法中，溶剂或缓冲液没有限制，但是优选不超过pH6.5。在pH高于6.5的情况下，丝氨酸蛋白酶，在酚氧化酶连锁反应的涉及的成分可以被激活，并引起酚氧化酶原激活成酚氧化酶。这导致难以获得本发明的组合物。
用含有螯合剂的溶剂或缓冲液处理昆虫样品的实例之一是通过柱色谱。用树脂填充的柱可以负载昆虫样品，并且用含有螯合剂的溶剂或缓冲液洗脱以获得若干部分。在本发明中，能够特异性地检测低至20pg/ml的β-1，3-葡聚糖的组合物可以通过柱色谱纯化而不需任何其它特定的分离方法，如亲和色谱。
在本发明中能够用于柱色谱的树脂优选是将葡聚糖或乙烯基用作原材料的树脂。例如，可以使用Sephadex或Toyopearl。
本发明的组合物可以用于诊断具有β-1，3-葡聚糖的微生物的感染，因为它能够特异性地检测β-1，3-葡聚糖。
因此，本发明涉及诊断具有β-1，3-葡聚糖的微生物的感染的方法。本发明的方法包括以下步骤：从样本中收集样品，将钙离子和在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的组合物加入样品中，以及测定样品中的酚氧化酶活性。例如，本发明的在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的组合物可以如下制备：从若干部分中选择能够在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖激活酚氧化酶的部分，所述若干部分通过用含有足以螯合样品中或在分离方法中含有的钙离子的量的螯合剂的溶剂处理样品，昆虫血浆和血细胞溶胞产物而获得。上述昆虫血浆和血细胞溶胞产物可以用足以螯合样品中或在分离方法中含有的钙离子的量的螯合剂制备。
在本发明的β-1，3-葡聚糖检测方法中，检测的样本可以是包括人的动物或者任何环境。例如，可以通过从标本收集血液来诊断真菌感染。在另一实例中，在养殖工业中，从环境收集水，并可以检测具有β-1，3-葡聚糖作为细胞壁成分的微生物，如真菌的感染。
为了提高诊断具有β-1，3-葡聚糖作为细胞壁成分的微生物的感染的特异性，如有需要，可以进行预处理以消除可能存在于样本样品中的脂多糖。例如，可以通过用能够与脂多糖特异性结合或者沉淀脂多糖的物质如多粘菌素处理样本样品来消除脂多糖的影响。
本领域已知的任何测定酚氧化酶活性的方法都可以以其目前条件或经某些改变而用作本发明中测定酚氧化酶活性的方法，该方法可以用作真菌感染的诊断方法。例如，可以通过测定4-甲基儿茶酚/4-羟基脯氨酸乙酯(4-MC/4-HP)的颜色的吸光度或者使用多巴胺的黑素形成反应的吸光度，而在真菌感染的早期容易地确定酚氧化酶活性。
本发明还涉及用于检测β-1，3-葡聚糖的诊断试剂盒。用于检测β-1，3-葡聚糖的诊断试剂盒含有在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的组合物。例如，在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的组合物是可以如下制备的组合物：从昆虫收集包含血浆或血浆和血细胞溶胞产物混合物的样品；用含有足以螯合存在于样品中和存在于分离方法中的钙离子的量的螯合剂的溶剂或缓冲液处理所述样品，以从其获得若干部分；并且从所获得的若干部分中选择在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的部分。
在本发明中使用的缓冲液和测定酚氧化酶活性的方法如下。
抗凝缓冲液(pH5.5)：NaCl 15mM，柠檬酸三钠136mM，柠檬酸26mM，EDTA20mM
β-1，3-葡聚糖溶液：通过混合990μl 20mM Tris缓冲液(pH8.0)和10μl如下制备的溶液而制备：将10mgβ-1，3-葡聚糖(凝胶多糖，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，日本)混合在1ml 0.1N NaOH中。4-MC/4-HP颜色反应
向10μl稀释至预定浓度的β-1，3-葡聚糖溶液中加入30μl酚氧化酶组合物，并在30℃预反应5分钟。向此混合物中加入437.5μl 20mM Tris缓冲液(pH7.5)、5μl 1M CaCl2、2μl 250mM 4-甲基儿茶酚(MC)和16μl 62.5mM 4-羟基脯氨酸乙酯(HP)，使总体积为500μl，并在30℃反应30分钟。向此反应混合物中加入500μl 20％乙酸以中止反应。在520nm测定吸光度。黑素形成反应
向10μl稀β-1，3-葡聚糖溶液中加入30μl酚氧化酶组合物，并在30℃预反应10分钟。加入405μl 20mM Tris缓冲液(pH8.0)、5μl 1M CaCl2和50μl 10mM多巴胺溶液之后，混合物在30℃反应60分钟。通过在400nm测定吸光度制定标准曲线。将通过离心收集自样本的血液而获得的血浆用作样品，并且用与上述相同的过程处理，测定400nm的吸光度。可以从标准曲线确定样品中β-1，3-葡聚糖的量。
附图说明
图1表示在钙离子和β-1，3-葡聚糖存在下，从黄粉虫(Tenebriomolitor)的血淋巴分离的酚氧化酶组合物的酚氧化酶活性对反应时间的图；
图2是从黄粉虫的血淋巴分离的酚氧化酶组合物的酚氧化酶活性对β-1，3-葡聚糖浓度的标准曲线；
图3是检查相对于从黄粉虫的血淋巴分离的酚氧化酶组合物的脂多糖的检测特异性的图；
图4是检查相对于从黄粉虫的血淋巴分离的酚氧化酶组合物的肽聚糖的检测特异性的图；
图5是比较得自黄粉虫的血浆、血细胞溶胞产物和血淋巴的各组合物中由β-1，3-葡聚糖诱导的酚氧化酶活性的图；
图6是从黄粉虫的血浆分离的酚氧化酶组合物的酚氧化酶活性对β-1，3-葡聚糖浓度的图；
图7是比较得自大黑金龟子(Holotrichia diomphalia)的幼虫的血浆、血细胞溶胞产物和它们的混合物的各酚氧化酶组合物中由β-1，3-葡聚糖诱导的酚氧化酶活性的图；
图8表示在钙离子和β-1，3-葡聚糖存在下，从大黑金龟子的幼虫的血浆和血细胞溶胞产物分离的酚氧化酶组合物的混合物的酚氧化酶活性对反应时间的图；
图9是表示使用酚氧化酶组合物检测癌症患者血液中β-1，3-葡聚糖的结果的图；
图10是表示使用酚氧化酶组合物检测肿瘤和炎症疾病患者血液中β-1，3-葡聚糖的结果的图；
图11是表示使用酚氧化酶组合物检测念珠菌病患者血液中β-1，3-葡聚糖的结果的图。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明，但本发明并不局限于此。
实施例1
将黄粉虫的幼虫在冰上麻醉。通过将与含有抗凝缓冲液的5ml灭菌注射器相连的25G针从头部插入第一节而从各幼虫收集三滴血淋巴。将60ml收集的血淋巴在203006g，4℃离心4小时之后，通过过滤(0.45μm)上清液除去杂质，获得55ml样品。通过超滤(截至：10000)将样品浓缩至3ml。将Toyopearl HW-55S树脂填充进1×50cm的柱子中后，用足量抗凝缓冲液冲洗柱子。将浓样品负载于柱子后，加入抗凝缓冲液并以0.18ml/min的流速洗脱。收集每份3.8ml洗脱液，并在280nm测定吸光度，以检查蛋白质浓度。通过用β-1，3-葡聚糖进行4-MC/4-HP颜色反应，收集在β-1，3-葡聚糖存在下形成颜色的部分，获得3.8ml最初纯化的酚氧化酶组合物。在Ca2+存在或不存在下，使用最初纯化的酚氧化酶组合物来鉴别β-1，3-葡聚糖的检测活性。
将3.8ml最初纯化的酚氧化酶组合物负载于与上述相同的柱子之后，加入抗凝缓冲液并以0.16ml/min的流速洗脱。收集每份3ml洗脱液，并在280nm测定吸光度，以检查蛋白质浓度。通过用β-1，3-葡聚糖进行4-MC/4-HP颜色反应，收集在β-1，3-葡聚糖存在下发生颜色的部分，作为再次纯化的酚氧化酶组合物，并且将它认为是最终的组合物。通过将最终Ca2+浓度设定为0mM或5mM，通过使用10μl 100ng/ml β-1，3-葡聚糖溶液和酚氧化酶组合物，进行4-MC/4-HP颜色反应。获得的结果以反应时间的函数表示在图1中(-◆-：缓冲液，-■-：酚氧化酶组合物，-▲-：酚氧化酶组合物+Ca2+，-×-：酚氧化酶组合物+Ca2++β-1，3-葡聚糖)。从图中可以看出，在β-1，3-葡聚糖存在下，酚氧化酶组合物显示酚氧化酶活性。
通过以β-1，3-葡聚糖浓度的函数测量酚氧化酶组合物的酚氧化酶活性而获得标准曲线。通过在0至200pg/ml β-1，3-葡聚糖的浓度范围内，在30℃反应1小时后，用上述颜色反应在520nm测定吸光度。结果如图2所示。从图中明显看出，可以检测到极小量的β-1，3-葡聚糖，因为浓度和活性之间的相关系数是0.9862。
实施例2
为了检查实施例1中的酚氧化酶组合物是否对β-1，3-葡聚糖具有特异性，通过使用脂多糖和肽聚糖来测定酚氧化酶活性。将脂多糖(Sigma Chemical Company)和肽聚糖(Sigma)各自悬浮在50mM Tris缓冲液(pH7.0)中。作为底物，将肽聚糖悬浮液直接使用而脂多糖悬浮液在超声2-3分钟后使用。通过使用浓度为200pg/ml、20ng/ml、20μg/ml的脂多糖作为底物，在5mM Ca2+下用酚氧化酶组合物进行与4-MC/4-MP溶液的颜色反应。将颜色与用20ng/ml β-1，3-葡聚糖作为底物的试验比较。结果如图3所示(：有酚氧化酶组合物和Ca2+(下文中称为A)的阴性对照， ：A+200pg/ml脂多糖， ：A+20ng/ml脂多糖，
Figure A0180398300143
：A+20μg/ml脂多糖，■：A+20ng/ml β-1，3-葡聚糖(阳性对照))。
在与上述相同的试验条件下，也用肽聚糖测定酚氧化酶的活性。结果如图4所示(：有酚氧化酶组合物和Ca2+(下文中称为A)的阴性对照， ：A+200pg/ml肽聚糖，
Figure A0180398300152
：A+20ng/ml肽聚糖， A+20μg/ml肽聚糖，■：A+20ng/ml β-1，3-葡聚糖(阳性对照))。
如上所述，即使反应时间增加，在20μg/ml脂多糖和肽聚糖的高浓度下也没有出现酚氧化酶活性。因此，本发明的酚氧化酶组合物可以特异性地检测β-1，3-葡聚糖。比较例1
将黄粉虫的幼虫在冰上麻醉。通过将与含有抗凝缓冲液的5ml灭菌注射器相连的25G针从头部插入第一节而从各幼虫收集三滴血淋巴。将85ml收集的血淋巴在372g，4℃离心5分钟之后，分别获得血浆上清液和血细胞沉淀。将60ml收集的血浆在203006g，4℃离心4小时，并过滤(0.45μm)上清液除去杂质，获得58ml上清液。通过超滤(截止：10000)将样品浓缩至3ml。将Toyopearl HW-55S树脂填充进1×50cm的柱子中后，用抗凝缓冲液冲洗柱子。将浓样品负载于柱子后，加入抗凝缓冲液并以0.18ml/min的流速洗脱。收集每份3.8ml洗脱液，并在280nm测定吸光度，以检查蛋白质浓度。通过用β-1，3-葡聚糖进行4-MC/4-HP颜色反应，收集在β-1，3-葡聚糖存在下形成颜色的部分，获得3.8ml最初纯化的血浆的酚氧化酶组合物。
同时，将上述沉淀的血细胞用抗凝缓冲液洗涤，并离心除去血浆部分。重复此过程3次。为了使血细胞完全破碎，将细胞超声并在372g，4℃离心5分钟，获得3ml上清液血细胞溶胞产物。
在Ca2+离子存在下，通过使用相同量(400μg)的蛋白质比较实施例1的部分纯化的血浆、血细胞溶胞产物的酚氧化酶组合物与最初纯化的血淋巴的酚氧化酶组合物检测β-1，3-葡聚糖(浓度为2ng/ml)的能力。结果如图5所示。从图中可以看出，得自血淋巴的酚氧化酶组合物能够检测β-1，3-葡聚糖。
在另一方面，上述源自血浆的酚氧化酶组合物以β-1，3-葡聚糖浓度的函数用以检查其检测β-1，3-葡聚糖的能力。如图6所示，当使用只源自血浆的酚氧化酶组合物时，β-1，3-葡聚糖浓度与酚氧化酶活性之间没有相关性。
实施例3
为了检查酚氧化酶组合物是否对β-1，3-葡聚糖具有特异性，根据上述方法，使用不同的糖进行黑素形成反应。在400nm测定吸光度以确定所产生的黑素的量的结果表明，只有在β-1，3-葡聚糖存在下才明显地观察到黑素产生。结果总结于表1中。
                        表1
糖 键的类型  吸光度(400nm)
D(+)葡萄糖  0.211
纤维素 β-1，4  0.240
麦芽糖 α-1，4  0.237
葡聚糖 α-1，6  0.290
海带多糖 β-1，3，β-1，6  0.292
酵母聚糖 β-1，3  3.616
凝胶多糖 β-1，3  3.352
20mM Tris(pH8.0)  0.208
实施例4
将50ml从Holotrichia diopmhalia幼虫收集到的血淋巴在420g，4℃离心20分钟后，分别获得血浆上清液和血细胞沉淀。首先，在加入5ml 50mM Tris缓冲液/1mM EDTA(pH6.5)后，将血细胞沉淀(5ml)超声，然后在22000g，4℃离心20分钟，获得血细胞溶胞产物上清液。
同时，将50ml收集的血浆在203006g，4℃离心4小时后，通过超滤(截止：10000)将上清液浓缩至3ml。将Toyopearl HW-55S树脂填充进1×50cm的柱子中后，用50mM Tris缓冲液/20mMEDTA(pH6.5)平衡柱子。将浓样品负载于柱子后，加入50mM Tris缓冲液/20mM EDTA(pH6.5)并以0.16ml/min的流速洗脱。收集每份3.2ml洗脱液，并在280nm测定吸光度，以检查蛋白质浓度，并且收集在5mM Ca2+存在下与4-MC/4-HP形成颜色的部分。在这些部分中，收集在以上血细胞溶胞产物和β-1，3-葡聚糖存在下具有酚氧化酶活性的部分，作为部分纯化的血浆溶液(3.2ml)。
测定部分纯化的血浆溶液(蛋白质含量：25μg)、上述血细胞溶胞产物(蛋白质含量：175μg)以及通过混合这两种(蛋白质含量比：25μg∶175μg)制得的酚氧化酶组合物的检测β-1，3-葡聚糖的能力。结果如图7所示。通过将最终Ca2+浓度设定为5mM和使用10μl 0.1μg/mlβ-1，3-葡聚糖，进行4-MC/4-HP颜色反应30分钟。在β-1，3-葡聚糖存在下，部分纯化的血浆溶液和血细胞溶胞产物混合物显示酚氧化酶活性。
同样，图8显示在与上述同样的试验条件下，使用上述酚氧化酶组合物检测β-1，3-葡聚糖的能力对反应时间的函数(●-●：最终钙离子浓度5mM+β-1，3-葡聚糖2μg/ml，-：最终钙离子浓度5mM，O-O：20mM Tris缓冲液，▲-▲：β-1，3-葡聚糖2μg/ml)。对于钙离子和对于β-1，3-葡聚糖，在钙离子存在下观察到了酚氧化酶活性。
实施例5
从11位健康成年男性和女性以及50位住院癌症患者收集血液。在用肝素处理所收集的血液后，离心血液，获得血浆作为检测β-1，3-葡聚糖的样品。
向10μl得自患者的血浆中加入10μl如实施例1制备的部分纯化的酚氧化酶组合物，以进行4-MC/4-HP颜色反应。在520nm测定吸光度，并从标准曲线计算样品中的β-1，3-葡聚糖的量。收集自健康男性和女性受试者(11位)的血浆中的β-1，3-葡聚糖的量可以忽略。在实体肿瘤和血源性肿瘤患者中，由于这些患者正在进行抗癌治疗而是免疫受损的，他们的β-1，3-葡聚糖浓度明显高于炎症患者的(在图9中，括号中的数字是试验的重复次数，并且β-1，3-葡聚糖的浓度以μg/ml血清表示，并以平均值±SEM表示)。在图9中归类于“其它”的患者是那些具有炎症而没有肿瘤的患者。如图10所示，在炎症患者中仅检测出可以忽略量的β-1，3-葡聚糖，但是在既有肿瘤又有炎症的患者中β-1，3-葡聚糖的量大得多(括号中的数字是重复次数，并且β-1，3-葡聚糖的浓度是平均值±SEM)。在后者中，推测对于既有肿瘤又有炎症的患者来说感染真菌的发病率比只有肿瘤的患者大，因为这样的患者的免疫系统不正确起作用。
对于已被证实患有念珠菌病的患者，其β-1，3-葡聚糖的浓度高得多，但正在进行抗真菌治疗的患者具有较低浓度的β-1，3-葡聚糖(在图11中，括号中的数字是试验的重复次数，并且β-1，3-葡聚糖的浓度是平均值±SEM)。因此，通过使用本发明的组合物测定样品中β-1，3-葡聚糖的浓度，可能诊断真菌感染。
工业实用性
根据本发明，具有β-1，3-葡聚糖作为细胞壁成分的微生物感染可以在感染早期获得诊断。对于免疫受损的患者，通过给予适当的抗生素或抗真菌药，能够降低死亡率，因为可能在感染早期通过具有β-1，3-葡聚糖的微生物诊断感染。在真菌感染后在早期，通过采取适当措施，也可以降低在养殖工业中的损害。

Claims (21)

1.在钙离子存在下，通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性而检测β-1，3-葡聚糖的组合物。
2.根据权利要求1的组合物，其中组合物检测的β-1，3-葡聚糖最小低至20pg/ml。
3.在钙离子存在下由β-1，3-葡聚糖激活的酚氧化酶组合物的制备方法，所述方法包括：
从昆虫收集包含血浆和血细胞溶胞产物混合物的样品；
用含有足以螯合存在于所述样品中和存在于本分离方法中的钙离子的量的螯合剂的溶剂或缓冲液处理所述样品，以从其获得若干部分；以及
从所得的若干部分中选择在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的部分。
4.根据权利要求3的方法，其中所述昆虫属于鞘翅目。
5.根据权利要求3的方法，其中所述昆虫属于拟步行虫科或金龟子科。
6.根据权利要求3的方法，其中所述若干部分通过柱色谱获得。
7.根据权利要求6的方法，其中用于所述柱色谱的柱子用包括葡聚糖或乙烯基的树脂填充。
8.根据权利要求3的方法，其中将完全或部分纯化的血细胞溶胞产物进一步加入在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的部分中。
9.在钙离子存在下由β-1，3-葡聚糖激活的酚氧化酶组合物的制备方法，所述方法包括：
用含有足以螯合存在于昆虫血浆中和存在于本分离方法中的钙离子的量的螯合剂的溶剂或缓冲液处理昆虫血浆，以从其获得若干部分；
将血细胞溶胞产物或部分纯化的血细胞溶胞产物加入所述若干部分中；以及
选择在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的部分。
10.根据权利要求9的方法，其中所述昆虫属于鞘翅目。
11.根据权利要求9的方法，其中所述昆虫属于拟步行虫科或金龟子科。
12.根据权利要求9的方法，其中所述若干部分通过柱色谱获得。
13.根据权利要求12的方法，其中用于所述柱色谱的柱子用包括葡聚糖或乙烯基的树脂填充。
14.根据权利要求9的方法，其中将完全或部分纯化的血细胞溶胞产物进一步加入在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的部分中。
15.检测β-1，3-葡聚糖的方法，所述方法包括：
从样本收集样品；
将在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的组合物和钙离子加入样品中；以及
测定样品的酚氧化酶活性。
16.用于检测β-1，3-葡聚糖的诊断试剂盒，所述试剂盒含有在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的组合物。
17.根据权利要求16的诊断试剂盒，其中所述组合物检测的β-1，3-葡聚糖最小低至20pg/ml。
18.根据权利要求16的诊断试剂盒，其中所述组合物由以下步骤制备：
从昆虫收集包含血浆和血细胞溶胞产物混合物的样品；
用含有足以螯合存在于样品中和存在于本分离方法中的钙离子的量的螯合剂的溶剂或缓冲液处理所述样品，以获得若干部分；以及
从所得的若干部分中选择在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的部分。
19.根据权利要求18的诊断试剂盒，其中所述昆虫属于鞘翅目。
20.根据权利要求16的诊断试剂盒，其中所述组合物通过以下方法制备：
用含有足以螯合存在于样品中和在分离方法过程中存在的钙离子的量的螯合剂的溶剂或缓冲液处理昆虫血浆，以获得若干部分；
将血细胞溶胞产物或部分纯化的血细胞溶胞产物加入上述获得的若干部分中；以及
选择在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性的部分。
21.根据权利要求20的诊断试剂盒，其中昆虫属于鞘翅目。
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