CN1618869A - 牛樟芝担子菌类的多糖体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛樟芝担子菌类的多糖体及其用途,该多糖体是由牛樟芝的CCRC35396、CCRC35398、B71、B85、B86菌株所获得,经糖分析仪显示,上述担子菌类的各菌株的子实体含有中分子量化合物,以及有几个高分子量化合物吸收峰;经过试验分析上述所述的多糖体具有抗B型肝炎病毒的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种牛樟芝担子菌类的多糖体及其医疗用途。
背景技术
牛樟芝(Antrodia camphorata)是台湾特有的真菌,生长在台湾特有的牛樟树(Cinnamomum kanehirae)。牛樟芝是担子菌亚门,菌蕈纲,无折菌目,多孔菌科,Antrodia属的新种。
由于真菌拥有产生次级代谢物的能力,且产生多样化的次数代谢物,基于真菌此能力容易被诱导而产生,而且不受区域地理、季节环境的影响。因此像冬虫夏草、灵芝、茯苓等菌类,可藉发酵方式大量生产,进而开发新药。
牛樟芝在台湾已被用来治疗肿瘤疾病的民间用药,其化学组成包括配糖体(glycoside)、类固醇(steroids)及三帖类(triterpene)。Chen,C.H.与Yang,S.W.于1995年J.Nat.Products第58卷第1655页至1661页报道三帖类有抗胆碱和抗血清素激活的活性。在活的有机体中,多糖(polysaccharides)是普遍的结构和贮存的聚合物。
在活性测试方面,陈劲初等人于2001年Fung.Sci.第16卷第7页至第22页报导以牛樟芝菌丝体的甲醇提取物,在低剂量下,对肝肿瘤细胞株Hep G2有很强的细胞毒杀作用。以C57BL/6和BALB/c小鼠进行试验,显示小鼠血中TNF-α、INF-γ及IL-2有明显增加。虽然在台湾民间,长期以来普遍使用牛樟芝治疗肝病及癌症,尤其是病毒性的肝炎,然而至目前为止极少有关于牛樟芝菌种确立,基因研究,培养条件,品质管制的论文报告。
发明内容
本发明的目的是提供牛樟芝担子菌类的多糖体及其医疗用途。
本发明的牛樟芝担子菌类的多糖体,其担子菌类子实体含有中分子量化合物及有几个高分子量化合物吸收峰。
上述牛樟芝担子菌类的多糖体是由牛樟芝的CCRC35396、CCRC35398、B71、B85、B86菌株所获得。
其中,B85、B86、CCRC35396、B71、CCRC35398菌株的多糖体,由糖分析仪分析显示其担子菌类子实体含有中分子量化合物,以及有几个高分子量化合物吸收峰。
本发明之牛樟芝担子菌类的多糖体具有抗B型肝炎病毒的效果。
附图说明
图1为五种牛樟芝的生长曲线。生长速率以第n天的菌丝干重相对于第0天的菌丝干重的比例表示。
1.B71菌株
2.B85菌株
3.B86菌株
4.CCRC35396菌株
5.CCRC35398菌株
图2为牛樟芝子实体多糖体的高速液态层析(HPLC)图谱。
图3为牛樟芝B71菌株多糖体的高速液态层析(HPLC)图谱。
图4为牛樟芝B85菌株多糖体的高速液态层析(HPLC)图谱。
图5为牛樟芝B86菌株多糖体的高速液态层析(HPLC)图谱。
图6为牛樟芝CCRC35396菌株多糖体的高速液态层析(HPLC)图谱。
图7为牛樟芝CCRC35398菌株多糖体的高速液态层析(HPLC)图谱。
图8为牛樟芝多糖体的抗B型肝炎表面抗原能力与α-干扰素抗B型肝炎表面抗原能力的比较。
1. 1,000units/ml α-干扰素
2. 250units/ml α-干扰素
3. 100units/ml α-干扰素
4. 50μg/ml B71菌株
5. 50μg/ml B85菌株
6. 50μg/ml B86菌株
7. 50μg/ml CCRC35396菌株
8. 50μg/ml CCRC35398菌株
图9为牛樟芝多糖体的抗B型肝炎e抗原(HBeAg)能力与α-干扰素抗B型肝炎e抗原能力的比较。
1. 1,000units/ml α-干扰素
2. 250units/ml α-干扰素
3. 100units/ml α-干扰素
4. 50μg/ml B71菌株
5. 50μg/ml B85菌株
6. 50μg/ml B86菌株
7. 50μg/ml CCRC35396菌株
8. 50μg/ml CCRC35398菌株
具体实施方式
本发明之牛樟芝多糖体是由牛樟芝获得的CCRC35396、CCRC35398、B71、B85、B86菌株,如图1所示五种牛樟芝的生长曲线,生长速率以生长第n天的菌丝干重相对于第0天的菌丝干重的比例表示。经培养后CCRC35396与CCRC35398两菌株生长速度较其他菌株快,培养18天即可达生长对数期(log hpase),在糖分析仪图的图2显示子实体含有很多中分子量化合物,以及有几个高分子量化合物吸收峰,但是,浓度均很低。牛樟芝多糖体是在室温下,90分钟内醋酸钠(NaOAc)由100~700mM梯度,90mM氢氧化钠的条件下分析。图4、图5、图6分别显示B85、B86、CCRC35396菌株有很多分子量较小的化合物,但在高分子量处均有2至3个多糖体的吸收峰出现,图3、图7显示B71菌株及CCRC35398菌株尤其含有大量吸收峰。上述小分子量化合物是指分布在延滞时间30分钟以前的吸收峰,中分子量化合物是指分布在延滞时间30~65分钟的吸收峰,高分子量化合物是指分布在延滞时间66~90分钟的吸收峰。
自第26天的液态培养菌丝,经由水萃取粗多糖体,并进行粗多糖体的水解反应。牛樟芝的子实体和菌丝所含的多糖体成份不同,各单糖组成以μmol g-1为单位,如表一所示B71菌株的多糖体成份为分别含有117.49μmolg-1半乳糖(galactose),146.74μmol g-1葡萄糖(glucose),69.15μmol g-1甘露糖(mannose),10.5μmol g-1半乳糖胺(galactosamine)。B85菌株分别含有283.76μmol g-1半乳糖,35.6μmol g-1葡萄糖,19.21μmol g-1甘露糖,4.41μmol g-1半乳糖胺。B86菌株分别含有381.22μmol g-1半乳糖,63.9μmol g-1葡萄糖,43.05μmol g-1甘露糖,5.72μmol g-1半乳糖胺。CCRC35396菌株分别含有104μmol g-1半乳糖,137.32μmol g-1葡萄糖,63.6μmol g-1甘露糖,9.33μmol g-1半乳糖胺。CCRC35398菌株分别含有109.35μmol g-1半乳糖,209.56μmol g-1葡萄糖,70.82μmol g-1甘露糖,2.1μmolg-1半乳糖胺。
依照Blumberg,B.S.,及Alter,H.J.及Visnich,S.于1965年J.A.M.A.第191卷第541~546页报导,表面抗原早期称澳洲抗原(Australia Antigen),其是Blumberg,B.S.于1965年在澳洲土著的血液中所发现,表面抗原构成B型肝炎病毒的外套,含有主要抗原决定基a和亚型决定基(subtype)d、y、w及r,且d、y与w、r在各个亚型中互不重叠,故可将B型肝炎病毒分成adw、adr、ayw和ayr四种亚型,而Ono,T.H.等人于1983年Nucleic AcidsRes.第11卷第1747~1757页报导,在DNA序列与DNA长度上,不同亚型间亦有些许的差异。全球B型肝炎病毒有三种主要血清型adw、adr、ayw,依地域的不同而有不同的分布,根据Sung,J.-L.与Chen,D.S.于1977年Gastroenterol.Jpn,第12卷第58~63页研究显示,中国长江以北的血清型为adr,长江以南则是adw。B型肝炎e抗原(HBeAg)为Pre-C基因和基因C所译制的两个次单位p17所组成,是由第一个AUG开始译制,先形成25Kd前核心抗原(precore antign)。前核心抗原N端的29个氨基酸,经过氨基酸序列分析,Garcia,P.D.等人于1988年J.Cell Biol.第106卷第1093~1104页报导此段氨基酸具有分泌性蛋白质的斥水性讯息(于核心抗原类鱼精蛋白氨基酸序列处)然后分泌到细胞外,而成为17k的e抗原(HBeAg)。由于台湾民间长期以来普遍使用牛樟芝治疗肝病及癌症,尤其是病毒性的肝炎,然而至目前为止尚无相关论文报告。通常B型肝炎表面抗原(HBsAg)对于未曾感染B型肝炎的患者、刚感染B型肝炎空窗期的患者、感染B型肝炎已痊愈的患者均可呈现阴性反应,因此在许多时候以B型肝炎表面抗原进行测试外,也采取B型肝炎e抗原(HBeAg)的测试。本发明的牛樟芝多糖体经MS-G2细胞株进行五种牛樟芝多糖体的抗病毒能力评估,而牛樟芝多糖体的抗B型肝炎表面抗原能力与抗B型肝炎e抗原能力,是与α-干扰素抗B型肝炎表面抗原的比较,其计算公式如下:
抑制百分比=(对照组OD值-样品OD值)/对照组OD值
如图8所示,全部菌丝的多糖体呈现抗B型肝炎病毒(anti-hepatitis Bvirus)的活性。B86菌株的多糖体在50μg/ml的剂量下显示了最高的表面抗原反应,比使用α-干扰素(α-interferon)1,000units/ml还佳。如图9所示,只有B86和CCRC35398菌株有B型肝炎e抗原(HbeAg,substainanti-hepatitis B e antivities)活性。所有的多糖体都无细胞毒性。
用含B型肝炎病毒基因组的B型肝炎细胞株(MS-G2),抗B型肝炎病毒的程度来评估五种牛樟芝多糖体的抗病毒能力,发现B86菌株最有效,抗B型肝炎表面抗原(Anti-HBsAg)的抑制率比1,000units/ml的α-干扰素高,而B71、B85、CCRC35396、CCRC35398菌株皆比250units/ml的α-干扰素有效,只有B86、CCRC35398菌株有抗B型肝炎表面抗原(Anti-HBsAg)的活性,其有效性比1,000units/ml的α-干扰素低,但比250units/ml的α-干扰素高。多糖体通常以天门冬酸转移酶的试剂(Kodat,AST Kit)进行细胞损伤的测定,若天门冬酸转移酶(AST)值高于25IU/L,表示对细胞有毒害。五种牛樟芝多糖体经进行细胞损伤的测定,发现天门冬酸转移酶(AST)值均小于25IU/L,显示从牛樟芝所获得的多糖体均无细胞毒性。
本发明的多糖体(PS)是由牛樟芝(Antrodia camphorata)的野生子实体及实验室培养的五种菌丝萃取得到的。五种菌丝的多糖用阴离子交换原理的高压液相层析仪(high-performance anion-exchange chromatography)分析,显示多样化的产生及单糖的组成。
实施例1
液态培养
将牛樟芝菌株置于斜面马铃薯泥洋菜培养基(PDA,potato dextrose agarslant)中,三星期更换一次,菌种接种在灭菌过的25ml马铃薯泥洋菜培养基(PDA)培养皿的中央,于28℃下培养19天,将培养成功的菌丝切成1×1cm,再置于25ml的马铃薯泥洋菜培养基(PDA),加入20g/L的葡萄糖(glucose),装入pH=5.6,250ml的瓶子中,黑暗下培养26天之后以250mM的氯化钠(NaCI)清洗细胞,离心3000转洗去细胞外的多糖体及培养液,经冷冻干燥后,储存于4℃的冰箱中。
实施例2
多糖体组成分析
将牛樟芝(Antrodia camphorata)菌种(CCRC35396、CCRC35398、B71、B85、B86)置于斜面马铃薯泥洋菜培养基(PDA,potato dextrose agarslant,购自美国Sigma公司,含马铃薯萃取物、葡萄糖及洋菜)培养,保存该菌丝于马铃薯泥液态培养基(PDB)培养液避光放置26天。经清洗、离心,冷冻干燥菌丝体。以1∶100(w/w)80℃的水抽取后,加入4倍体积的95%酒精,于4℃的冰箱中沉淀过夜,再离心取沉淀物,并冷冻干燥,获得了粗多糖体。将粗多糖体置于阴离子交换树脂,在室温下由醋酸钠(NaOAc)与90mM氢氧化钠的混合溶媒分析,最后以PRIMEDAK软件收集数据,结果如图1至图7所示。以盐酸进行水解,然后冷却,经离心抽真空机(Speed-Vac)抽去酸,再置于去离子水,经过过滤膜(0.2μm,nylon),进行碳水化合物浓度、蛋白质浓度、光学旋光性分析与单糖的鉴定。
利用阴离子交换原理的高压液相层析仪(HPAEC)分析多糖体
将200mg的粗多糖体置于梯度泵(Gradient pump)、金电极的瞬间电流加压原理的侦测电极(Pulsed Amperometric Detector,Dionex)、阴离子交换层析(PA-100,Dionex),使用200ul容量的样品注射器(sample loop)的自动取样机(auto-sampler),多糖体在室温时,90分钟内醋酸钠(NaOAc)由100~700mM梯度,90mM氢氧化钠(NaOH)的条件下分析,最后应用软件(PRIME DAK system)收集及积分。
多糖体的水解
6N盐酸在80℃是最佳水解的酸浓度,所以将1mg的多糖体置于6N盐酸,80℃下维持6~8小时,然后冷却,蒸发,将酸去除,再置于去离子水,通过一耐龙材质的过滤膜(Millipore-Gx),进行分析。
一般的分析方法
以酚硫酸(phenol-sulfuric acid)法测定碳水化合物的浓度,以Bradford于1976年Analytical Biochemistry第72卷第248~254页报导测定蛋白质浓度,以自动旋光仪(polarimeter)于589nm,测定特定的光学旋光性。
多糖体的组成测定
多糖体完全水解后,以上述的阴离子交换管柱(Carbopac PA-10 4.6×25mm,Dionex)的阴离子交换原理的高压液相层析仪(HPAEC)测定,单糖均在18mM氢氧化钠,于室温下进行分析。
抗B型肝炎病毒试验
B型肝炎病毒产生的MS-G2细胞株,置于3×105cells/ml的24well的组织培养皿中,经一夜的培养,确定其细胞完全附着,吸去培养液,再重新加入1ml培养液并含有参试的多糖体。多糖体先以少量去离子水溶解,施加多糖体的剂量为25μg/ml,50μg/ml,同时用α-2a干扰素作比较,且以等量的去离子水为对照组,第三天后进行抗病毒分析。采用Elisa试剂于492mM下测得B型肝炎表面抗原(HBsAg)及B型肝炎e抗原(HBeAg)值,并与对照组抑制病毒的百分率比较,来评估抗病毒的活性,三组的结果用SDM统计,并以天门冬酸转移酶的试剂(Kodat,AST Kit)进行细胞操作的测定,其天门冬酸转移酶(AST)值高于25IU/L,表示对细胞有毒害。
表一牛樟芝多糖体的定性分析
菌株 | B71 | B85 | B86 | CCRC35396 | CCRC35398 |
产率(%) | 3.08 | 2.805 | 4.52 | 2.57 | 2.48 |
糖类总量(mg g-1) | 252 | 432 | 420 | 2.76 | 330 |
蛋白质(%) | 49.8 | 33 | 44.4 | 42.6 | 45 |
中性糖(μmol g-1) | |||||
肌六醇 | 4.2 | 14.03 | 14.27 | 4.56 | 27.46 |
山梨糖醇 | 0.68 | 4.66 | 5.1 | 1.08 | 10.47 |
果糖 | 3.24 | 4.69 | 7.57 | 3.2 | 4.62 |
半乳糖胺 | 10.5 | 4.41 | 5.72 | 9.33 | 2.1 |
葡萄糖胺 | 26.64 | 0 | 0 | 21.23 | 28.545 |
半乳糖 | 117.49 | 283.76 | 381.22 | 104 | 109.35 |
葡萄糖 | 146.74 | 35.6 | 63.9 | 137.32 | 209.56 |
甘露糖 | 69.15 | 19.21 | 43.05 | 63.6 | 70.82 |
[α]D(°) | 30 | 151.8 | 67 | 29.2 | 19.2 |
A 26-day-old macelium culture was harvested and used directly for polysaccharide extraction.The crude polysaccharidefractions were used for neutral sugar analysis.The amount of each neutral sugar is shown asμmol g-1.
Claims (9)
1、一种牛樟芝担子菌类的多糖体,其特征在于:以糖分析仪图显示该担子菌类子实体含有中分子量化合物,以及有几个高分子量化合物吸收峰。
2、根据权利要求1所述的一种牛樟芝担子菌类的多糖体,其特征在于:所述的多糖体是由牛樟芝的CCRC35396、CCRC35398、B71、B85、B86菌株所获得。
3、根据权利要求2所述的一种牛樟芝担子菌类的多糖体,其特征在于:所述的担子菌类B85菌株的多糖体,其以糖分析仪图显示该担子菌类子实体含有中分子量化合物,以及有几个高分子量化合物吸收峰。
4、根据权利要求2所述的一种牛樟芝担子菌类的多糖体,其特征在于:所述的担子菌类B86菌株的多糖体,其以糖分析仪图显示该担子菌类子实体含有中分子量化合物,以及有几个高分子量化合物吸收峰。
5、根据权利要求2所述的一种牛樟芝担子菌类的多糖体,其特征在于:所述的担子菌类CCRC35396菌株的多糖体,其以糖分析仪图显示该担子菌类子实体含有中分子量化合物,以及有几个高分子量化合物吸收峰。
6、根据权利要求2所述的一种牛樟芝担子菌类的多糖体,其特征在于:所述的担子菌类B71菌株的多糖体,其以糖分析仪图显示该担子菌类子实体含有中分子量化合物,以及有几个高分子量化合物吸收峰。
7、根据权利要求2所述的一种牛樟芝担子菌类的多糖体,其特征在于:所述的担子菌类CCRC35398菌株的多糖体,其以糖分析仪图显示该担子菌类子实体含有中分子量化合物,以及有几个高分子量化合物吸收峰。
8、一种抗B型肝炎病毒牛樟芝担子菌类的多糖体,其以糖分析仪图显示该担子菌类子实体含有中分子量化合物,以及有几个高分子量化合物吸收峰。
9、按照权利要求8所述的一种抗B型肝炎病毒牛樟芝担子菌类的多糖体,其特征在于:所述的多糖体是由牛樟芝的CCRC35396、CCRC35398、B71、B85、B86菌株所获得。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |