CN1209462C - 一种抗结核分枝杆菌的黑蛋巢菌代谢产物及其制备方法 - Google Patents

一种抗结核分枝杆菌的黑蛋巢菌代谢产物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗结核分枝杆菌的黑蛋巢菌代谢产物及其制备方法，属微生物药物筛选技术领域。本发明所用生产菌株中间型黑蛋巢菌Cyathusintermedius CYI菌株已于2003年5月26日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：中国.北京.中关村；保藏号：CGMCC No.0934。本发明制备方法为将中间型黑蛋巢菌CYI菌株进行液体或固体发酵培养后，从代谢产物中提取抗结核分枝杆菌的活性物质，该活性物质对结核分枝杆菌具有明显的抑菌作用。本项发明通过人工培养技术实现生产控制，具有良好的应用前景。

Description

一种抗结核分枝杆菌的黑蛋巢菌代谢产物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物药物筛选技术领域，具体是一种抗结核分枝杆菌的黑蛋巢菌代谢产物及其制备方法。
背景技术：
在全球范围内，不管是工业发达国家还是发展中国家都出现结核病流行的大回升。全球结核病仍然是传染病的首位杀手。目前，全球有1/3的人(约20亿)感染了结核病。现有结核病人约2000万，每年新发生约900万病例，每年死亡人数高达300万。世界卫生组织于1993年4月23日宣布“全球结核病紧急状态宣言”，这也是世界卫生组织首次做出紧急宣言，号召全球紧急动员，加强结核病控制工作。各国政府和各非政府组织都采取新步骤加强对结核病的控制措施和经费投入。针对这种情况，美国NIH也加大了抗结核菌药物的研究投入。我国约有活动性结核病人600万，传染源150万人，每年约有23万人死于结核病。
现在，结核分枝杆菌对大部分现有抗菌素已具有耐药性，因此筛选新的抗结核菌新药已迫在眉睫。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种抗结核分枝杆菌的中间型黑蛋巢菌代谢产物，为开发抗结核菌新药奠定基础。
本发明使用的真菌是中间型黑蛋巢菌Cyathus intermedius CYI，CYI菌株已于2003年5月26日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：中国.北京.中关村；保藏号：CGMCC No.0934。
黑蛋巢菌属担子菌，主要形态特征是担子果钟形至漏斗形，由一狭窄的基部固定，包被3层，顶部盖有一白色薄盖膜，成熟时一般消失。小包双凸镜形，通常灰黑色至黑色，有时覆有透明而薄的外膜，下部中央有小脐，与绳状体相接于包被壁上。孢子光滑，无色，非淀粉质，一般壁厚。地生、腐木生、粪生或生于枯枝落叶层上。菌丝无色，具明显锁状联合。
本发明是这样实现的：将中间型黑蛋巢菌Cyathus.intermedius CYI通过固体或液体培养，提取有抗结核分枝杆菌的代谢产物，制备成抗结核分枝杆菌的制剂。
本发明真菌中间型黑蛋巢菌CYI培养方法(以下为重量百分比)：
液体培养基配方为：3.0～4.0％葡萄糖，0.1～0.15％酵母浸膏，0.5～0.8％蛋白胨，0.01～0.05％硫酸铵，0.15-0.2％Na2HPO4.12H2O，0.02-0.03％NaH2PO4.2H2O，蒸馏水定容至1升，pH为自然。
固体培养基配方为：0.5-1.0％碳酸钙；8-10％玉米粉；0.5-1.0％硫酸铵；1.0-2.0％过磷酸钙；麸皮86-90％。
将CYI菌株用上述配方发酵生产抗结核分枝杆菌的代谢产物有液体和固体发酵两种方法。
液体发酵生产方法：
1、将CYI的菌丝体接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，15-32℃下培养5-15天，或25-29℃下培养6-8天，获得试管种；
2、将试管种接种到250ml三角瓶中(每瓶装50ml)液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，20-30℃下摇床培养(转速为150-220rpm)8-15天。
3、将含菌丝的发酵液真空抽滤后得清亮溶液，将清亮溶液在60-70℃减压浓缩或喷雾至干，得抗结核杆菌的活性物质。
固体发酵生产方法：
1、试管种与前述液体发酵生产方法相同。
2、采用前述固体培养基配方，装入1000ml的三角瓶中，每瓶装300g，120℃灭菌40分钟后，接入试管种，于23-30℃下静置培养15-20天，直到菌丝长满。
3、将菌丝体挖出，冷冻干燥；用氯仿和甲醇按1∶1体积比配制成溶剂，室温浸提菌丝体2天，减压浓缩，蒸干溶剂后即得活性物质。
本发明与现有技术相比，采用了新的菌种，利用其自身独特的代谢体系生产具有抗结核杆菌活性的代谢物质。并通过人工培养技术实现生产控制。
本发明产品对结核分枝杆菌的药效试验
药效试验1：液体发酵制备中间型黑蛋巢菌代谢产物的药效试验
1、制备试验用药剂：按前述液体发酵生产方法制备抗结核分枝杆菌活性物质；对照按前述液体发酵生产方法，但液体培养基中不接入菌种。
2、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)培养：培养基配方为常规牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.5)，将结核分枝杆菌菌种接种到250ml三角瓶中(每瓶装50ml)，37℃下摇床(转速为220rpm)培养24小时，结核分枝杆菌含量大于1×1010/ml。
制备混菌平板：将直径9cm培养皿灭菌后，倒入20ml 45℃的前述常规牛肉膏培养基和0.1ml结核分枝杆菌发酵菌液，充分混匀，制成混菌平板。
3、试验方法：将制备的中间型黑蛋巢菌代谢产物用5％甲醇水溶液溶解，配制为0.1mg/ml的浓度。用牛津杯法做抑菌实验，即在混菌平板上放上牛津杯，在每一牛津杯内加入0.1ml的中间型黑蛋巢菌代谢产物，于37℃下培养12小时。测量抑菌圈直径(扣除牛津杯直径)，重复三个样品。
4、试验结果：
表1液体发酵中间型黑蛋巢菌代谢产物对结核分枝杆菌的抑菌作用
抑菌圈直径cm                  结核杆菌
    1     2     3     平均
    对照中间型黑蛋巢菌代谢产物     01.6     01.2     01.5     01.43
结果表明，本发明产品对结核分枝杆菌的生长具有明显的抑制作用，培养12小时后，对照未出现抑菌圈，而采用本发明制剂的3个处理均出现明显的抑菌圈，其中最大直径为1.6cm，最小也有1.2cm，平均达1.43cm，显示了其抗结核分枝杆菌良好抗性。
药效试验2：固体发酵制备中间型黑蛋巢菌代谢产物的药效试验
1、制备试验用药剂：按前述固体发酵生产方法制备抗结核分枝杆菌活性物质；按前述固体发酵生产方法，但固体培养基中不接入试管种，作为对照。
2、结核分枝杆菌的培养和试验方法与药效试验1相同。
3、试验结果
表2  固体发酵中间型黑蛋巢菌代谢产物对结核分枝杆菌的抑菌作用
抑菌圈直径cm                  结核杆菌
    1     2     3     平均
    对照中间型黑蛋巢菌代谢产物     01.4     01.5     01.7     01.53
结果表明，本发明产品对结核分枝杆菌的生长具有明显的抑制作用。培养12小时后，对照未出现抑菌圈，而采用本发明制剂的3个处理均出现明显的抑菌圈，其中最大直径为1.7cm，最小也有1.4cm，平均达1.53cm，显示了其抗结核杆菌良好抗性。
具体实施方式：
下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一
将中间型黑蛋巢菌Cyathus intermedius CYI的菌丝体接种到PDA试管琼脂培养基斜面上，25℃下培养7天，获得试管种；再将试管种接种到250ml三角瓶中(每瓶装50ml)液体培养基中，培养基配方为4.0％葡萄糖，0.1％酵母浸膏，0.8％蛋白胨，0.01％硫酸铵，0.15％Na2HPO4.12H2O，0.02％NaH2PO4.2H2O，蒸馏水定容至1升，pH为自然。置于26℃下摇床培养，转速为200rpm，培养时间12天；将培养好的发酵物真空抽滤后得清亮溶液，将清亮溶液在65℃减压浓缩至干，即得抗结核分枝杆菌活性物质，用5％甲醇水溶液溶解即为活性制剂。
实施例二
实施例2方法同实施例1，不同之处是培养基配方，其配方为：3.0％葡萄糖，0.15％酵母浸膏，0.5％蛋白胨，0.05％硫酸铵，0.2％Na2HPO4.12H2O，0.03％NaH2PO4.2H2O，蒸馏水定容至1升，pH为自然。
实施例三
试管种培养方法与实施例1相同；将试管种接种到固体培养基上，培养基配方为0.5％碳酸钙；8％玉米粉；0.5％硫酸氨；1.0％过磷酸钙；麸皮90％。将固体培养基装入250ml三角瓶中，每瓶装50g。120℃灭菌40分钟后，取出冷却后接入试管种，28℃下静置培养15天。将长满菌丝的固体培养物挖出，冷冻干燥，用氯仿和甲醇，按1∶1体积比配制成溶剂，室温浸提2天，减压浓缩，蒸干溶剂，即得抗结核分枝杆菌活性物质，用5％甲醇水溶液溶解即为活性制剂。
实施例四
实施例4方法同实施例3，不同之处是培养基配方，其配方为：1.0％碳酸钙；10％玉米粉；1.0％硫酸铵；2.0％过磷酸钙；麸皮86％。

Claims (2)

1.一种抗结核分枝杆菌的黑蛋巢菌代谢产物的制备方法，其特征在于：所用的菌株为中间型黑蛋巢菌CGMCC No.0934，采用固体发酵生产方法制备，固体发酵生产方法中百分含量为重量百分含量，其生产方法为：
将中间型黑蛋巢菌CGMCC No.0934的菌丝体接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，15-32℃下培养5-15天，或25-29℃下培养6-8天，获得试管种；
将配方为0.5-1.0％碳酸钙、8-10％玉米粉、0.5-1.0％硫酸铵、1.0-2.0％过磷酸钙、麸皮86-90％的固体培养基，装入1000ml的三角瓶中，每瓶装300g，在120℃温度下灭菌40分钟后，接入试管种，于23-30℃下静置培养15-20天，直到菌丝长满；
将菌丝体挖出，冷冻干燥；用氯仿和甲醇按1∶1体积比配制成溶剂，室温浸提菌丝体2天，减压浓缩，并蒸干溶剂。
2.一种由权利要求1所述的制备方法制得的抗结核分枝杆菌的中间型黑蛋巢菌代谢产物。
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