CN1556195A - 海洋源枯草芽孢杆菌杀虫活性产物的培育方法及其应用 - Google Patents

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刘贤金
余向阳
刘济宁
王冬兰
张存政
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Abstract

本发明涉及一株海洋源枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)杀虫活性产物的培育方法及其应用。它以棉铃虫为指示试虫，采用浸虫法和筛选法对采自中国海域的海洋微生物进行了生物活性筛选，获得了一株高活性菌株；并接种于发酵培养基中培养，获得活性产物；该活性产物可溶解于水或缓冲液中，分子量大于8KD。该活性产物对多种农业害虫具有灭杀活性。本发明的优点在于：海洋源枯草芽孢杆菌杀虫活性产物的培育过程中所涉的原料容易获得，发酵条件简单，对设备要求低；获得的杀虫活性产物具有高效、广谱；活性产物源于微生物的次生代谢产物，对环境及非靶标生物安全，不会造成环境污染。

Description

海洋源枯草芽孢杆菌杀虫活性产物的培育方法及其应用
技术领域：
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)杀虫活性产物的培育方法及其应用，尤其是海洋源枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)杀虫活性产物的培育方法及其应用。
背景技术：
农药在人类抵抗病虫害为害，保护农作物优质、高产生产中起到重要的作用。自二十世纪中叶有机合成农药问世以来，由于其具有高效、速效、广谱等特点，曾经一度对农业生产起到巨大的促进作用。但由于高毒、高残有机合成农药的大面积使用，短短的几十年以来，所导致的负面影响也远远超出了人们的预料，如害虫抗药性，环境污染，有益生物的大量杀伤等等。对具有杀虫活性的天然产物资源进行开发，研究其毒理和应用一直是热点。陆地生物源天然产物研究已经取得了许多可喜的成果，一些结构新颖的天然化合物如毒扁豆碱、除虫菊素、烟碱、印楝素、苦皮藤、鱼藤酮、阿维菌素、多杀菌素等，通过结构改造修饰后开发出高效系列杀虫剂、或直接提取加工成农药，已广泛应用于生产当中，产生了巨大的经济效益和社会效益。但近年来，随着研究的深入以及环境恶化，可用陆地生物资源正逐渐减少，研究花费的人力、物力和才力也越来越大，而从中发现有明显杀虫活性，或是作用机制独特、结构新颖的天然产物杀虫剂速度确越来越慢。为此，人们将注意力渐渐转向其他生态系统如沙漠、极地、温泉和海洋等中的生物资源的研究。
海洋是生命之源，亦是地球上物质资源最丰富的领域。据报道地球上的物种约有80％生活在水中，其中除了我们所熟悉的鱼、虾、贝类外，仅较低等的海洋生物物种就达近20万种，海生植物也有约2万多种。海洋生物不同于陆地生物，由于其生存环境的艰难苛刻(高盐、高压、缺氧等)，为求生存及竟争生存空间，很多海洋生物在长期的进化过程中能够代谢产生一些结构独特的化学物质即次生物质。研究人员已从海洋细菌、海洋放线菌、海洋真菌中分离出众多的新化合物，有些结构类型以前从未在陆生生物中发现过，在得到的化合物中新结构物质比例远远高于陆生生物。
海洋中存在丰富微生物资源，是人们寻找和发现具有重要生物活性新物质的主要来源。本发明人经过大量的资料查询，发现已经从海洋生物中开发出了几十种具有重要药理活性的物质，其中有十余种已进入临床应用阶段。但迄今为止，作为农用的海洋生物源天然产物不多，如从海洋腔肠动物沙蚕中发现的沙蚕毒素，已开发出了系列重要的水稻杀虫剂；从海洋贝壳类生物中发现的甲壳素，作为杀菌剂、植物生长调节剂已经开始推广使用。但海洋源微生物的农用杀虫活性物质的开发到目前为止还没有见报道。
发明内容：
旨在提供一种海洋源枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)杀虫活性产物的培育方法及其应用。
本发明的目的是这样实现的：海洋源枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)杀虫活性产物的培育方法，其特征在于：以农业中重要的害虫棉铃虫为指示试虫，采用常规浸虫法和微型筛选法两种不同的筛选方法，对采自中国海域的海洋微生物进行了生物活性筛选，获得了一株高活性菌株；该细菌接种于发酵培养基中，于28℃，200r/min摇床震荡培养72-96h，可获得高产量杀虫活性产物；所述的发酵培养基中，碳源可以为可溶性淀粉或大豆粉，氮源可以为大豆粉或蛋白胨，发酵中使用的无机组分可以为碳酸钙；发酵在需氧条件下进行，发酵温度28～30℃，并调整到PH＝7.0～8.0。该菌株产生的杀虫活性产物，在培养过程中分泌于细胞外，储存于培养基中，该活性产物可溶解于水或缓冲液中，用常用的有机溶剂不能从发酵液中提取出来，该活性产物的分子量大于8KD。
一种海洋源枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)杀虫活性产物的应用，其特征在于：杀虫活性产物对农业害虫具有灭杀活性。
本发明的优点在于：本发明的具杀虫活性海洋微生物为首次报道。而且海洋源枯草芽孢杆菌杀虫活性产物的培育过程中所涉的原料容易获得，发酵条件简单，对设备要求低；获得的杀虫活性产物具有高效、广谱，经大量室内生物测定表明，它对棉铃虫、粘虫、菜青虫和蚜虫均有非常好的防治效果；由于杀虫活性产物源于微生物的次生代谢产物，对环境及非靶标生物安全，不会造成环境污染。
附图表说明：
图1是发酵时间与活性的关系曲线；
图2是活性菌株碳源实验结果；
图3是活性菌株氮源实验结果。
具体实施方式：
为了更清楚的理解本发明以及本发明产品的作用，以下通过发明人给出的依本发明技术方案所完成的具体的实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1：一株海洋源杀虫微生物的筛选方法
1、供测海洋微生物培养条件：培养基组成：在陈海水占75％，蒸馏水占25％的混合液中加入：可溶性淀粉2.0％，黄豆粉1.5％，酵母膏0.5％，蛋白胨0.2％，碳酸钙0.2％，葡萄糖0.5％，并调整到PH7.5～8.0；接种量：相当于培养基总量的1％的种子液，于28℃，200r/min摇床震荡培养120h。发酵液离心，取上清液供测杀虫活性。
2、常规浸虫筛选法：取室内连续饲养多代的3龄棉铃虫幼虫，于发酵液原液中浸30s，置于装有饲料的指形管中(每管1头)，空白对照分别浸清水、浸发酵培养基，每处理20头3龄幼虫。处理后置于温度25±0.5℃、光周期L∶D＝14∶10、相对湿度75％～85％的培养箱中饲养。48h、72h、120h检查幼虫死亡率，如对照有死亡，用Abbort公式校正死亡率。
3、微型化板上筛选法：取24孔板，每孔内加0.5g混有发酵液的棉铃虫饲料，接1头初孵棉铃虫幼虫，每处理24头幼虫。空白对照分别加清水、发酵培养基。处理后培养和检查同常规浸虫筛选法。
4、经常规浸虫法筛选和微型化板上从2360株海洋源微生物中筛选获得一株海洋微生物，其发酵发酵液原液对棉铃虫初孵幼虫的校正致死率为：24h为45.5％；48h为67.3％；72h为73.5％。对3龄棉铃虫幼虫的校正杀虫致死率为：24h为23.9％；48h为43.5％；72h为65.8％。发酵液经冷冻干燥浓缩10倍后对棉铃虫的校正致死率可达90％以上。
5、经中国科学院微生物研究所对所筛选出的杀虫海洋微生物进行菌种鉴定其特征在于细胞杆状，革兰氏阳性，大小为0.7×3.0μm，产生中生的柱状芽孢，孢囊不膨大。细胞内不产生聚-β-羟基丁酸盐(PBH)颗粒。产生乙酰甲基甲醇(VP反应阳性)。接触酶阳性，卵磷脂酶阴性，还原硝酸盐。在7％NaCl和pH5.7中生长，在厌氧培养基中不生长，营严格好氧生活。水解可溶性淀粉和明胶。从葡萄糖产酸、木糖和甘露糖产酸，但阿拉伯糖不产酸。石蕊牛奶呈还原反应。表1中列出了该菌的具体生理生化特性。
                      表1.Bacillus subtilis的菌落形态和生理特征
  革兰氏染色            +   芽孢     株状，不膨大
  细胞形态和排列   杆状，单生、双生、短链   荚膜
  PHB 无   细胞大小   0.7×3.0 鞭毛
  菌落形态 灰白色圆形菌落，凸起，表面皱缩，24小时形成直径3-4cm菌落，产褐色色素
             生理生化特征              糖醇代谢
  VP     + 底物     产酸     利用
  5％NaCl生长     + 葡萄糖     +
  7％NaCl生长     + 果糖
  PH5.7生长     + 半乳糖
  氧化酶 甘露糖
  接触酶     + 木糖     +
  卵磷脂酶     - 阿拉伯糖     -
  苯丙胺酸脱胺酶 乳糖
  鸟胺酸脱羧酶 蔗糖
  赖氨酸脱羧酶 麦芽糖
  精胺酸脱羧酶 海藻糖
  精胺酸双水解酶 甘露醇     +
  明胶水解     + 肌醇
  酪素水解     - 蜜二糖
  石蕊牛奶     产碱，还原 棉子糖
  硝酸盐还原     + 柠檬酸盐     +
  厌氧硝酸盐 丙二酸盐     -
  H2S产生 50℃     +
  厌氧生长     - H&LO/F
  可溶性淀粉水解     +
  吲哚产生     -
实施例2：一株海洋源杀虫微生物的发酵培养方法
1、发酵时间的确定：培养基中接种1％的种子液，分别发酵1d，2d，3d，4d，测发酵液的活性，确定发酵时间和活性的关系(见图1)。
2、碳源实验：分别用玉米粉3.5％，可溶性淀粉3.5％，麦芽糖3.5％，蔗糖3.5％，葡萄糖3.5％，乳糖3.5％代替培养基中的可溶性淀粉和葡萄糖，发酵3d，棉铃虫测活(见图2)。
3、氮源实验：分别用黄豆粉1.7％，蛋白胨1.7％，牛肉膏1.7％，酵母提取物(进口)1.7％，浓缩酵母粉(国产)1.7％为氮源分别取代培养基中的黄豆粉酵母提取物，发酵3d，棉铃虫测活(见图3)。
4、正交实验：经发酵时间、碳源、氮源实验后设计正交实验见(表2，表3)
经正交实验后确定该菌株的最佳发酵条件为：按1％接种量接种于发酵培养基(在陈海水占75％，蒸馏水占25％的混合液中含有可溶性可溶性淀粉3.5％，蛋白胨2.5％，碳酸钙0.2％，并调整到PH7.0-8.0)中，于28℃，200r/min摇床震荡培养72h，即可获得高产量活性产物。
                 表2活性菌株正交试验因子水平表
因子        碳源(％)        氮源(％)     碳酸钙(％)      pH
水平1       3.5             2            0.1             7.5
水平2       4               2.5          0.2             8
水平3       4.5             3            0.3             8.5
             表3活性菌株正交实验活性测定结果
                      列号
                                             死亡率(％)
             1       2       3       4
     1       1       1       3       1          44.85
     2       2       1       1       3          52.79
     3       3       1       2       1          44.85
试
     4       1       2       2       3          87.28
验
     5       2       2       3       2          44.85
处
     6       3       2       1       1          79.32
理
     7       1       3       1       3          80.25
     8       2       3       2       2          36.42
     9       3       3       3       1          28.46
实施例3：一株海洋源杀虫微生物发酵产物杀虫谱测定(具体结果见表3)
1、浸虫法将室内连续饲养的棉铃虫、菜青虫、小菜哦、粘虫的3龄幼虫放入JAAS01发酵液浓缩液中浸渍30s，然后分别接入装有新鲜棉花、甘蓝、小青菜、甘蓝、玉米叶片的培养皿中(叶柄用含0.2％NaNO3，0.1％K2HPO4的营养液浸棉球保湿)，每皿接3龄幼虫20头，每处理重复3次，处理后置于温度25±0.5℃、光周期L∶D＝14∶10、相对湿度75％～85％的培养箱中饲养。48h检查幼虫死亡率。
2、浸叶法  将有菜缢管蚜的甘蓝叶片剪成小块，放入JAAS01发酵液浓缩液中浸渍10s，用吸水纸吸去多余水分，除去死蚜及过大过小的蚜虫，只留个体一致的中等活蚜，计数。放入培养皿中的新鲜甘蓝叶片上。用含0.2％NaNO3，0.1％K2HPO4的营养液浸棉球，裹于叶柄基部，保持叶面新鲜。空白对照分别浸清水、发酵培养基。重复3次，每重复30头蚜虫。处理后培养和检查同浸虫法。
           表4  活性菌株发酵液杀虫谱测定结果
        试虫                               死亡率(％)
experimental insect                        mortality
棉铃虫Heliothis armigera Hubner            88.12
粘虫Leucania separata Walker               94.36
菜青虫Pierisrapae Linnaeus                 89.57
小菜蛾Plutella xylostella(Linnaeus)        16.67
菜缢管蚜Rhopalosiphum pseudobrassicae      40.63
实施例4：一株海洋源杀虫微生物发酵产物的分子量范围确定
透析膜50％乙醇慢慢煮沸一小时，再分别用50％乙醇、0.01mol/L碳酸氢钠溶液、0.01mol/L的EDTA溶液依次洗涤，最后用蒸馏水浸洗三次。将毒素原液的10浓缩液小心地装入透析膜，但不能装满以防膜外溶剂大量透入膜内时将膜胀裂，或因透析膜胀，而引起膜地孔径大小改变。装好后，既匝紧膜口，将透析膜置于装有蒸馏水地大磁盘中进行透析，8h换一次透析外液，共换6次。将透析得到地膜外溶液和膜内溶液分别冷冻干燥浓缩至透析原体积，用蒸馏水恢复至毒素原液地浓度进行生测。用发酵培养基同样做以上处理为对照。
36、45、75三种透析膜拦截的分子量范围分别为8000～10000Da、8000～12000Da、10000～14000Da。由表5试验结果可知，36、45透析膜膜外都没有活性，75透析膜膜内外都有活性，且膜外的活性较低，由此可知JAAS01D菌株产生的毒素为一类分子量大于8KD的物质。
                表5.透析膜内外液的毒性
         The effect of dialvsis to the toxin distribution
                   36                  45                  75
透析膜型号
            膜内液    膜外液    膜内液    膜内液    膜内液    膜外液
死亡率(％)  75.6      0         78.9      0         56.32     15.6

Claims (5)

1、海洋源枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)杀虫活性产物的培育方法，其特征在于：
a)以农业中重要的害虫棉铃虫为指示试虫，采用常规浸虫法和微型筛选法两种不同的筛选方法，对采自中国海域的海洋微生物进行了生物活性筛选，获得了一株高活性菌株；
b)该细菌接种于发酵培养基中，于28℃，200r/min摇床震荡培养72-96h，可获得高产量杀虫活性产物；
c)所述的发酵培养基中，碳源可以为可溶性淀粉或大豆粉，氮源可以为大豆粉或蛋白胨，发酵中使用的无机组分可以为碳酸钙；
d)发酵在需氧条件下进行，发酵温度28～30℃，并调整到PH＝7.0～8.0。
e)该菌株产生的杀虫活性产物，在培养过程中分泌于细胞外，储存于培养基中，该活性产物可溶解于水或缓冲液中，用常用的有机溶剂不能从发酵液中提取出来，该活性产物的分子量大于8KD。
2、根据权利要求1所述的海洋源枯草芽孢杆菌杀虫活性产物的培育方法，其特征在于：其最佳发酵培养基为：在陈海水占75％，蒸馏水占25％的混合液中含有可溶性淀粉3.5％，蛋白胨2.5％，碳酸钙0.2％。
3、根据权利要求1所述的海洋源枯草芽孢杆菌杀虫活性产物的培育方法，其特征在于：发酵培养基中的接种量为培养基总量的1～5％的种子液(107～108细胞/ml)。
4、一种权项1所述海洋源枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)杀虫活性产物的应用，其特征在于：杀虫活性产物对多种农业害虫具有灭杀活性。
5、根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)杀虫活性产物的应用，其特征在于：所述的农业害虫包括棉铃虫、菜青虫、小菜蛾、粘虫、菜缢管蚜及其同属害虫。
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