CN1944628A - 一株具杀线虫活力的青霉属真菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株具毒杀植物寄生线虫作用的真菌的培养方法及其代谢物制备方法和应用，属于微生物农药技术领域。本发明涉及的真菌菌株Penicilliumpinophilum snf44－1，已于2006年10月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.1852。snf44－1的分类地位是半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科，青霉属，嗜松青霉。通过液体发酵培养制备，其代谢物对植物寄生线虫，特别是对根结线虫具有毒力高，杀线虫效果明显的突出特点，室内测定本菌株发酵液对北方根结线虫(Meloidogyne hapla)2龄幼虫和卵囊孵化的影响。不同稀释浓度发酵液的处理和无菌水处理有显著差异，发酵液的1倍液以上浓度与10μg/ml阿维菌素的防效相当。具良好的应用开发前景。

Description

一株具杀线虫活力的青霉属真菌及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种毒杀植物寄生线虫的真菌及其制备方法和应用。

背景技术：

植物寄生线虫在世界上许多国家和地区发生和为害，种类多种多样。在全球范围内，植物寄生线虫的发生与危害随着农林业的发展和耕作栽培制度的变化日益严重，据Esser统计，到1990年为止全世界已报道发现植物寄生线虫207属4832种(刘维志，段玉玺.2000.植物病原线虫学.北京：中国农业出版社，p1-2)。据估计，植物寄生线虫造成世界主要农作物的年损失率为12.3％，超过1000亿美元，而实际的损失远远超过估计，理由是许多线虫造成的危害因没有田间可见症状或专化性特征而未引起注意(王寿华.果树线虫学.北京：中国农业科技出版社，1994.P.1-5)，此外，世界范围内对线虫为害的新发现还在不断增加，而且一些更新的农业栽培体制使线虫问题更加突出，再者，线虫与其它生物相互作用而对植物产生的直接或间接影响还在急剧增加。从这种意义上说，线虫造成的危害较其它生物更加隐蔽！目前对植物有害的线虫约有3000多种，在我国主要有根结线虫、胞囊线虫、松材线虫、甘薯茎线虫等。根结线虫是农业上为害最大的一类线虫，病害发生后，一般减产10％左右，严重的高达75％以上，甚至绝收(A.G.Whitehead，1998.Plant Nematode Control.ISBN0851991882 CABInternational)。目前，植物寄生线虫的防治仍以化学防治为主，但近年来，化学杀线剂的应用浪费大，污染环境，选择性差，灭生性强，破坏土壤生物区系等弊端日益为人们所重视(张克勤，何世川，周薇等.1991.真菌和细菌在线虫生防中的作用及其研究进展.杀虫微生物.3：55-66)，21世纪称为环保世纪，一些有效的化学杀线剂的应用逐步受到限制，因此对植物寄生线虫的生物防治研究自然成为热点问题。本发明正是基于上述理论，以植物寄生线虫为靶标，从真菌代谢产物中寻找具有高效杀线虫活性物质，拟为研究开发新型生物杀线虫剂寻找新的资源。

发明内容：

本发明的目的是选择对根结线虫具高杀虫活性的真菌菌株，将菌株按常规液体发酵培养后，从代谢产物中提取具杀线虫活性物质的有效成分，开发杀线虫生物农药，其中，所述的根结线虫优选是北方根结线虫。

本发明筛选到的一株具有杀线虫活性的真菌菌株是Penicillium pinophilum snf44-1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.中关村；保藏日期：2006年10月27日；保藏登记入册的编号：CGMCC No.1852。P.pinophilumsnf44-1是从大量土壤真菌菌株中筛选出的一株对北方根结线虫具有良好杀线虫活性的真菌菌株。

本发明通过研究发现，土壤真菌有很多株真菌都具有较高的杀线虫活性，从这些真菌中筛选出一株性状相对最好的真菌菌株P.pinophilum snf44-1进行了进一步的研究。

本发明还涉及用于防治植物寄生线虫的真菌代谢物，其是由本发明的真菌菌株P.pinophilum snf44-1经过常规的液体发酵培养后提取制备的。

本发明的真菌菌株P.pinophilum snf44-1是通过试管种培养后，再经扩大发酵培养来制备，其具体方法如下：

1.试管种培养

培养基配方为马铃薯琼脂(PDA)培养基，即马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂17g；蒸馏水1000mL。

2.液体发酵培养

其中液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有葡萄糖2％-4％、NH₄Cl0.1％-0.2％、K₂HPO₄0.1％-0.5％、MgSO₄·7H₂O 0.05％-0.1％、KCl 0.02％-0.2％、FeSO₄0.002-0.04％，余下为蒸馏水，pH为6-7，优选pH为6.5。

将试管种接种到250mL三角瓶(每瓶装100mL)液体培养基中，25℃～28℃下，摇床转速以150r·min^-1～200r·min^-1、发酵240h。

本发明还涉及一种杀线虫制剂，其包含有效量的本发明所述的真菌菌株P.pinophilumsnf44-1本身或其代谢物作为有效活性成分。

本发明的真菌菌株P.pinophilum snf44-1或其代谢物具有杀线虫活性物质，可用于植物寄生线虫的生物防治，特别是根结线虫(Meloidogyne spp.)。

具体实施方式：

为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。

首先对P.pinophilum snf44-1菌株进行发酵培养，然后对发酵培养后的代谢产物进行杀线虫活性试验，确定其对线虫的作用。

实施例1：菌株P.pinophilum snf44-1的培养

将P.pinophilumsnf44-1的菌丝体接种到试管琼脂培养基上，培养基配方为PDA培养基，即马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂17g；蒸馏水1000mL。25℃培养10d，获得试管种。

再将试管种接种到250mL三角瓶(每瓶装100mL)液体培养基中，培养基配方为(重量百分比)：葡萄糖(2.83％)、NH₄Cl(0.15％)、K₂HPO₄(0.12％)、MgSO₄·7H₂O(0.08％)、KCl(0.02％)、FeSO₄(0.02％)，余下为蒸馏水，pH 6.5。25℃～28℃下，摇床转速以150r·min^-1～200r·min^-1、发酵240h。将发酵液配成不同的倍数进行杀线虫药效试验。

实施例2：菌株P.pinophilum snf44-1的培养

基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为：

液体培养基配方为：葡萄糖(2％)、NH₄Cl(0.1％)、K₂HPO₄(0.08％)、MgSO₄·7H₂O(0.04％)、KCl(0.02％)、FeSO₄(0.002％)，pH 7。

实施例3：菌株P.pinophilum snf44-1的培养

基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为：

液体培养基配方为：葡萄糖(3％)、NH₄Cl(0.15％)、K₂HPO₄(2％)、MgSO₄·7H₂O(0.1％)、KCl(0.2％)、FeSO₄(0.004％)，pH 6。

实施例4：菌株P.pinophilum snf44-1的培养

基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为：

液体培养基配方为：葡萄糖(4％)、NH₄Cl(2％)、K₂HPO₄(1.5％)、MgSO₄·7H₂O(0.08％)、KCl(0.15％)、FeSO₄(0.01％)，pH 6.5。

实施例5：菌株P.pinophilum snf44-1的杀线虫活性：

将发酵液浓缩10倍液的基础上依次稀释为-5×(浓缩5倍液)、1×、5×、10×，分别处理北方根结线虫2龄幼虫。

1.制备试验用制剂

按前述液体发酵培养方法制备的真菌菌株P.pinophilum snf44-1，用不同倍数的发酵液进行杀线虫活性试验。

2.制备试验用线虫

(1)制备北方根结线虫卵囊及2龄幼虫

在温室中盆栽感病的番茄品种L402上繁殖北方根结线虫。将番茄种子播种在育苗床中，待番茄

苗长到20cm左右，稍显粗壮时移为盆栽。接种北方根结线虫，大约一个月后，根部会产生大量卵囊。将根取出并洗去泥土，用镊子挑取卵囊置于培养皿中，用0.5％的次氯酸钠处理3min，再用无菌水冲洗三次，置于25℃培养箱中进行孵化。3天左右就会孵化出很多二龄幼虫，吸到灭菌的三角瓶中，置于4℃的冰箱中备用。

3.试验方法：

3.1 P.pinophilum snf44-1代谢物对线虫的作用：在经灭菌的冠状小皿内中加入不同浓度的试验用发酵液各100μL，以加100μL无菌水作为对照，然后分别向处理和对照中各加入100μL线虫悬浮液(约含线虫48.11.±10.66条)，放入25℃培养箱中，48h后记录线虫死亡率，计算校正死亡率即为杀线虫药效。每处理重复3次。

3.2 P.pinophilum snf44-1代谢物对北方根结线虫卵囊孵化的作用：

在每个经高温灭菌的冠状小皿中放入1个表面消毒的发育较一致的卵囊，分别加入100μL不同浓度的试验用发酵液，以加入100μL无菌水作为对照。试验在25℃下进行，将各处理培养皿用封口膜封严，以减少污染以及液体蒸发。分别在2d和4d后镜检各处理卵囊孵化情况。计算卵囊孵化线虫数和卵囊孵化的相对抑制率。每处理重复3次。

试验3.1和3.2的操作均在无菌环境下进行，尽量避免环境和人为因素对试验结果的影响。

4.试验结果

(1)P.pinophilum snf44-1代谢物对北方根结线虫2龄幼虫的杀线虫效果

表1青霉菌44-1发酵液不同稀释倍数对北方根结线虫2龄幼虫的影响

稀释倍数dilution	2龄幼虫的平均死亡率％average mortality of J2	校正死亡率％revised mortality
			-5×1×5×10×CK1CK2	97.22a89.98b75.15c61.83d92.83ab3.21e	97.1389.6574.3360.5692.59------

注：“-5×”：浓缩五倍液；CK1：10μg/ml阿维菌素处理；CK2：无菌水处理；

结果表明，各稀释浓度的发酵液和无菌水对照之间差异显著，1倍液和10μg/ml阿维菌素对线虫的相对致死率在90％左右，两者之间差异不显著。

(2)P.pinophilum snf44-1代谢物对北方根结线虫卵囊孵化的作用

表2青霉菌44-1发酵液不同稀释倍数对北方根结线虫卵囊孵化的影响

稀释倍数dilution	卵囊平均孵化线虫数(条)average numbers of egg masses hatching	相对抑制率％relative inhibition rate
			1×5×10×CK1CK2	8c43bc63.33b13c188a	95.7477.1366.3193.09------

结果表明，各稀释浓度的发酵液和无菌水对照处理的卵囊之间，对线虫孵化影响差异显著，特别是1倍液几乎不能孵化，与10μg/ml阿维菌素的抑制率相当，其相对抑制率在95％左右。

通过以上两种对线虫活力和卵囊孵化的抑制作用试验结果表明，P.pinophilum snf44-1是一株极具有应用价值的真菌，特别是对北方根结线虫的杀线虫作用和对其卵囊孵化的抑制作用，显示出其良好的应用开发前景。

实施例6：菌株P.pinophilum snf44-1的田间杀线虫活性

采用液体发酵获得的发酵液经真空减压浓缩20倍保存6个月后，在田间防治番茄根结线虫(Meloidogyne hapla)，效果如下：

供试材料和方法：

番茄：品种为L402

线虫：北方根结线虫Meloidogyne hapla

每株番茄定植后第5天接种根结线虫5000粒卵，接种后第7天用发酵液进行灌根处理，每株灌药液200ml。正常田间管理，8周后调查根结指数。灌注清水为对照CK。

结果如下表：

稀释倍数	根结指数	防治效果(％)
			50×100×200×500×1000×CK	5d13c28b42b87a-	9587725813--

结果表明，该发酵液在没有任何助剂填加的条件下，200×至500×稀释液防治根结线虫的效果可以达到60％-70％，该稀释浓度已经达到产业化开发利用的浓度要求。

Claims (7)

1、一株具有杀线虫活性的真菌，其特征在于：该菌株为Penicillium pinophilum，已于2006年10月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.1852。

2、一株防治植物寄生线虫的真菌代谢物，其特征在于，是由权利要求1所述的真菌经过液体发酵提取制备的，液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有葡萄糖2％-4％、NH₄Cl0.1％-0.2％、K₂HPO₄ 0.1％-0.5％、MgSO₄·7H₂O 0.05％-0.1％、KCl 0.02％-0.2％、FeSO₄0.002-0.04％，余下为蒸馏水，pH为6-7。

3、根据权利要求2所述的真菌代谢物，其特征在于，pH为6.5。

4、权利要求1所述的具有杀线虫活性的真菌的制备方法，包括生产菌株经过常规的液体发酵后制备杀线虫制剂，其特征在于：该真菌的液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有葡萄糖2％-4％、NH₄Cl 0.1％-0.2％、K₂HPO₄ 0.1％-0.5％、MgSO₄·7H₂O 0.05％-0.1％、KCl 0.02％-0.2％、FeSO₄ 0.002-0.04％，余下为蒸馏水，pH为6-7。根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，pH为6.5。

5、一种杀线虫制剂，其特征在于，包含有效量的权利要求1所述的真菌或权利要求2所述的真菌代谢物作为活性成分。

6、权利要求1所述的真菌或权利要求2所述的真菌代谢物或权利要求6所述的杀线虫制剂在植物寄生线虫生物防治中的应用。

7、根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的植物寄生线虫为根结线虫(Meloidogynespp.)。