CN100342001C - 一种具有杀线虫活性的真菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具毒杀植物寄生线虫作用的真菌代谢物及其制备方法和应用，属于微生物农药技术领域。本发明的真菌菌株Beauveria bassiana snf0907，已于2005年4月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.1340。snf0907通过常规液体发酵培养制备，其代谢物对根结线虫和甘薯茎线虫具有毒力高，杀线虫效果明显的突出特点，具良好的应用开发前景。

Description

一种具有杀线虫活性的真菌及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种毒杀植物寄生线虫的真菌及其制备方法和应用。

背景技术：

植物寄生线虫在世界上许多国家和地区发生和为害，种类多种多样。在全球范围内，植物寄生线虫的发生与危害随着农林业的发展和耕作栽培制度的变化日益严重，据Esser统计，到1990年为止全世界已报道发现植物寄生线虫207属4832种(刘维志，段玉玺.2000.植物病原线虫学.北京：中国农业出版社，p1-2)。据估计，植物寄生线虫造成世界主要农作物的年损失率为12.3％，超过1000亿美元，而实际的损失远远超过估计，理由是许多线虫造成的危害因没有田间可见症状或专化性特征而未引起注意(王寿华.果树线虫学.北京：中国农业科技出版社，1994.P.1-5)，此外，世界范围内对线虫为害的新发现还在不断增加，而且一些更新的农业栽培体制使线虫问题更加突出，再者，线虫与其它生物相互作用而对植物产生的直接或间接影响还在急剧增加。从这种意义上说，线虫造成的危害较其它生物更加隐蔽！目前对植物有害的线虫约有3000多种，在我国主要有根结线虫、胞囊线虫、松材线虫、甘薯茎线虫等。根结线虫是农业上为害最大的一类线虫，病害发生后，一般减产10％左右，严重的高达75％以上，甚至绝收(A.G.Whitehead，1998.Plant Nematode Control.ISBN0851991882 CABInternational)。甘薯茎线虫病是一种严重影响甘薯产量和品质的线虫病害，近几年，该病在很多地区呈蔓延趋势，危害程度加深，轻者减产20～30％，重则减产50～60％，甚至绝产。植物寄生线虫病害使我国各种作物年平均产量损失达10～15％。

目前，植物寄生线虫的防治仍以化学防治为主，但近年来，化学杀线剂的应用浪费大，污染环境，选择性差，灭生性强，破坏土壤生物区系等弊端日益为人们所重视(张克勤，何世川，周薇等.1991.真菌和细菌在线虫生防中的作用及其研究进展.杀虫微生物.3：55-66)，21世纪称为环保世纪，一些有效的化学杀线剂的应用逐步受到限制，因此对植物寄生线虫的生物防治研究自然成为热点问题。本发明正是基于上述理论，以植物寄生线虫为靶标，从真菌代谢产物中寻找具有高效杀线虫活性物质，拟为研究开发新型生物杀线虫剂寻找新的资源。

发明内容：

本发明的目的是选择对植物寄生线虫，如根结线虫和茎线虫具高杀虫活性的真菌菌株，将菌株按常规液体发酵培养后，从代谢产物中提取具杀线虫活性物质的有效成分，开发杀线虫生物农药，其中，所述的根结线虫优选是北方根结线虫，所述的茎线虫优选是甘薯茎线虫。

本发明筛选到的一株具有杀线虫活性的真菌菌株是Beauveria bassiana snf907，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮编100080；保藏日期：2005年4月1日；保藏登记入册的编号：CGMCC No.1340。B.bassiana snf907是从大量土壤真菌菌株中筛选出的一株对北方根结线虫和甘薯茎线虫具有良好杀线虫活性的真菌菌株。

本发明通过研究发现，土壤真菌中和植物寄生线虫寄生真菌中有很多株真菌都具有较高的杀线虫活性，从这些真菌中筛选出一株性状相对最好的真菌菌株B.bassiana snf907进行了进一步的研究。

本发明还涉及用于防治植物寄生线虫的真菌代谢物，其是由本发明的真菌菌株B.bassiana snf907经过常规的液体发酵培养后提取制备的。

本发明的真菌菌株B.bassiana snf907是通过试管种培养后，再经扩大发酵培养来制备，

其具体方法如下：

1.试管种培养

培养基配方为马铃薯琼脂(PDA)培养基，即马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂17g；水1000mL。

2.液体发酵培养

其中液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有蔗糖2％-6％、硫酸铵1％-7％、K₂HPO₄0.01％-2.00％、MgSO₄·7H₂O 0.1％-0.5％、KCl 0.01％-5.2％、FeSO₄ 0.002-0.04％，余下为水，pH为6-7，优选pH为6.5。

将试管种接种到250mL三角瓶(每瓶装50mL)液体培养基中，25℃～28℃下，摇床转速以150r·min^-1～200r·min^-1、发酵120h。

本发明还涉及一种杀线虫制剂，其包含有效量的本发明所述的真菌菌株B.bassianasnf907或其代谢物作为有效活性成分。

本发明的真菌菌株B.bassiana snf907或其代谢物具有杀线虫活性物质，可用于植物寄生线虫的生物防治，特别是根据线虫(Meloidogyne spp.)和甘薯茎线虫(Ditylenchusdestructor)的防治。

具体实施方式：

为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。

首先对Beauveria bassiana snf907菌株进行发酵培养，然后对发酵培养后的代谢产物

首先对Beauveria bassiana snf0907菌株进行发酵培养，然后对发酵培养后的代谢产物进行杀线虫活性试验，确定其对线虫的作用。

实施例1：菌株Beauveria bassiana snf0907的培养

将B.bassiana snf0907的菌丝体接种到试管琼脂培养基上，培养基配方为PDA培养基，即马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂17g；水1000mL。25℃培养10d，获得试管种。

再将试管种接种到250mL三角瓶(每瓶装50mL)液体培养基中，培养基配方为(重量百分比)：蔗糖(2.83％)、硫酸铵(1.367％)、K₂HPO₄(0.064％)、MgSO₄·7H₂O(0.182％)、KCl(0.996％)、FeSO₄(0.02％)，余下为水，pH 6.5。将试管种接种到250mL三角瓶(每瓶装50mL)液体培养基中，25℃～28℃下，摇床转速以150r·min^-1～200r·min^-1、发酵120h。将发酵液配成不同的倍数进行杀线虫药效试验。

实施例2：菌株Beauveria bassiana snf0907的培养

基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为：

液体培养基配方为：蔗糖(3％)、硫酸铵(5％)、K₂HPO₄(0.08％)、MgSO₄·7H₂O(0.4％)、KCl(2.0％)、FeSO₄(0.002％)，pH 7。

实施例3；菌株Beauveria bassiana snf0907的培养

基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为：

液体培养基配方为：蔗糖(6％)、硫酸铵(3％)、K₂HPO₄(2％)、MgSO₄·7H₂O(0.5％)、KCl(5.2％)、FeSO₄(0.04％)，pH 6。

实施例4：菌株Beauveria bassiana snf0907的培养

基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为：

液体培养基配方为：蔗糖(5％)、硫酸铵(7％)、K₂HPO₄(1.5％)、MgSO₄·7H₂O(0.3％)、KCl(4.5％)、FeSO₄(0.01％)，pH 6.8。

实施例5：菌株Beauveria bassiana snf0907的杀线虫活性：

将发酵液浓缩5倍液的基础上依次稀释为5×、10×、20×、50×，分别对北方根结线虫2龄幼虫、甘薯茎线虫进行杀线虫活性试验。

1.制备试验用制剂

按前述液体发酵培养方法制备的真菌菌株snf0907，用不同倍数的发酵液进行杀线虫活性试验。

2.制备试验用线虫

(1)制备北方根结线虫卵囊、卵及2龄幼虫

根结线虫在温室中用番茄(品种：新L-402番茄，购自黑龙江省富拉尔基农业科研所)繁殖，待病株产生大量卵囊时，将病根取出洗净。于解剖镜下挑取卵囊，放入直径9cm的培养皿内，用0.5％NaOCl表面消毒3min，无菌水洗3次后备用。将经消毒后的卵囊放入垫有2层擦镜纸的线虫分离器中，在室温下孵化3d～4d，便可得到大量纯2龄幼虫。将病根洗净，剪成0.5cm～1cm的小段，放入500mL三角瓶中，加1％NaOCl 200mL剧烈震荡5min，用200目及500目网筛反复冲洗收集，在500目筛子中可收集到纯净的线虫卵。

(2)制备甘薯茎线虫

甘薯茎线虫采自瓦房店市病薯，将薯块切成0.5cm×1.0cm大小的块，采用贝曼漏斗法分离。

3.试验方法：

3.1 snf0907代谢物对线虫的作用：在经灭菌的特制的贝氏小皿内中加入不同浓度的试验用发酵液各1mL，以加1mL无菌水作为对照，然后分别向处理和对照中各加入100μL线虫悬浮液(约含线虫100条)，放入25℃培养箱中，24h后记录线虫死亡率，计算校正死亡率即为杀线虫药效。每处理重复3次。

3.2 snf0907代谢物对北方根结线虫卵囊孵化的作用：

在每个经高温灭菌的培养皿(直径6cm)中放入2个表面消毒的发育较一致的卵囊，分别加入3mL不同浓度的试验用发酵液，以加入3mL无菌水作为对照。试验在25℃下进行，将各处理培养皿用封口膜封严，以减少污染以及液体蒸发。7d后镜检各处理卵囊孵化情况。计算卵囊孵化线虫数和卵囊孵化的相对抑制率。每处理重复3次。

4.试验结果

(1)snf0907代谢物对甘薯茎线虫的杀线虫效果

    表1 snf0907发酵液不同稀释倍数对甘薯茎线虫的杀线虫效果

处理	死亡率(％)				药效(％)
						重复I	重复II	重复III	平均
	1×5×10×20×50×CK	86.6776.7841.8925.7616.586.67	86.6780.1446.2329.3119.474.35	90.2482.3944.1829.1718.613.70						87.8679.7744.1028.0818.224.91	87.2378.7341.2124.3714.00

结果表明，snf0907代谢物对甘薯茎线虫具有良好的杀线虫活性，其5×液处理24h后，线虫的死亡率达79.77％，其1×液处理24h后，线虫的死亡率高达87.86％。

(2)snf0907代谢物对北方根结线虫的杀线虫效果

    表2 snf0907发酵液不同稀释倍数对北方根结线虫的杀线虫效果

处理	死亡率(％)				药效(％)
						重复I	重复II	重复III	平均
	1×5×10×20×50×CK	97.7590.1127.9217.4713.814.56	96.1588.6129.7014.3712.555.24	95.8387.3429.1421.248.185.80						96.5888.9828.9217.6911.515.20	96.3988.3825.0213.166.67

结果表明，snf0907代谢物对北方根结线虫2龄幼虫具有很强的杀线虫活性，其5×液处理24h后，线虫的死亡率达88.98％，其1×液处理24h后，线虫的死亡率高达96.59％。

(3)snf0907代谢物对北方根结线虫卵囊孵化的作用

    表3 snf0907发酵液不同稀释倍数对北方根结线虫卵囊孵化的作用

处理	孵化出的线虫数(条)				药效(％)
						重复I	重复II	重复III	平均
	1×5×10×20×50×CK	027.0038.0057.00114.00317.00	1.0017.0043.0073.00113.00312.00	023.0044.0060.00108.00308.00						0.3322.3341.6762.33111.67312.33	99.8992.8585.6679.7264.25

结果表明，snf0907代谢物对北方根结线虫卵囊孵化具有强烈的抑制作用，其20×液对卵囊的孵化抑制作用达79.72％，5×液对卵囊的孵化抑制作用达90％以上，1×液对卵囊的孵化抑制作用高达99.89％。

通过对两种线虫杀线虫和对卵囊孵化的抑制作用试验结果表明，snf0907是一株极具有应用价值的真菌，特别是对北方根结线虫的杀线虫作用和对其卵囊孵化的抑制作用，显示出其良好的应用开发前景。

Claims (10)

1、一种具有杀线虫活性的真菌，其特征在于：该菌株为Beauveria bassiana snf0907，已于2005年4月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.1340。

2、一种防治植物寄生线虫的真菌代谢物，其特征在于，是由权利要求1所述的真菌经过常规的液体发酵提取制备的，液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有蔗糖2％-6％、硫酸铵1％-7％、K₂HPO₄ 0.01％-2.00％、MgSO₄·7H₂O 0.1％-0.5％、KCl 0.01％-5.2％、FeSO₄ 0.002-0.04％，pH为6-7。

3、根据权利要求2所述的真菌代谢物，其特征在于，pH为6.5。

4、权利要求1所述的具有杀线虫活性的真菌的制备方法，包括生产菌株经过常规的液体发酵后制备杀线虫制剂，其特征在于：该真菌的液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有蔗糖2％-6％、硫酸铵1％-7％、K₂HPO₄ 0.01％-2.00％、MgSO₄·7H₂O 0.1％-0.5％、KCl 0.01％-5.2％、FeSO₄ 0.002-0.04％，pH为6-7。

5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，pH为6.5。

6、一种杀线虫制剂，其特征在于，包含有效量的权利要求1所述的真菌或权利要求2所述的真菌代谢物作为活性成分。

7、权利要求1所述的真菌或权利要求2所述的真菌代谢物或权利要求6所述的杀线虫制剂在植物寄生线虫生物防治中的应用。

8、根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的植物寄生线虫为茎线虫或根结线虫。

9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的茎线虫为甘薯茎线虫。

10、根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的根结线虫为北方根结线虫。