JP4071438B2 - 真菌からの（１→３）−β−Ｄ−グルカンの調製法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は真菌の菌体から（１→３）−β−Ｄ−グルカンを簡便な方法により効率よく調製するための方法、当該方法を用いて調製した（１→３）−β−Ｄ−グルカン、及びその使用法に関する。詳細にはカブトガニ・アメボサイト・ライセートのＧ因子系および／または節足動物の体液のフェノール酸化酵素前駆体カスケード系を活性化する（１→３）−β−Ｄ−グルカンを、真菌の一種であるカンジダ属の菌体の細胞壁から簡便かつ効率良く調製するための新規調製方法、それにより得られる（１→３）−β−Ｄ−グルカン及び、その（１→３）−β−Ｄ−グルカンの（１→３）−β−Ｄ−グルカン測定への使用に関する。
背景技術
（１→３）−β−Ｄ−グルカンは酵母、カビ、キノコ等の真菌類、植物などの細胞壁成分として、自然界に広く分布している糖鎖である。
（１→３）−β−Ｄ−グリコシド結合を含むグルカンとしては、（１）（１→３）−β−Ｄ−グリコシド結合のみからなる直鎖状のグルカン（カードラン（Ｃｕｒｄｌａｎ）、パラミロン（Ｐａｒａｍｙｌｏｎ）等）、（２）（１→６）−β−Ｄ−グリコシド結合と（１→３）−β−Ｄ−グリコシド結合を含むグルカン、（３）（１→４）−β−Ｄ−グリコシド結合と（１→３）−β−Ｄ−グリコシド結合を含むグルカン（リケナン（Ｌｉｃｈｅｎａｎ）類、オオムギ胚乳中のグルカン等）に分類され、更に（２）のグルカンは、（２−１）ジグザグ構造を有するアラメ属褐藻類由来のラミナラン（Ｌａｍｉｎａｒａｎ）、（２−２）分枝を有するジグザグ構造からなるコンブ属褐藻類由来のラミナラン、（２−３）多分枝樹状構造を有する大部分の菌類又は藻類の細胞壁由来のグルカン、（２−４）短鎖分枝構造を有するスクレロタン（Ｓｃｌｅｒｏｔａｎ）、シゾフィラン（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌａｎ）、レンチナン（Ｌｅｎｔｉｎａｎ）等、（２−５）分枝反復構造を有するパン酵母やカンジダ属の細胞壁由来のグルカンなどに細かく分類することができ、多様な構造が存在する（Ａｋｅｔａｇａｗａ，Ｊ．，Ｔａｍｕｒａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｔａｎａｋａ，Ｓ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂａｃｔ．Ａｎｔｉｆｕｎｇ．Ａｇｅｎｔｓ，２３，７，４１３−４１９（１９９５））。本明細書においては（１→３）−β−Ｄ−グリコシド結合を含むグルカンを「（１→３）−β−Ｄ−グルカン」（以下、ＢＧと記載する）と称する。ＢＧはマクロファージからの各種サイトカインの産生誘導等を含む網内系の活性化、補体系の活性化、抗腫瘍活性（例えばシイタケから調製されたレンチナン及びスエヒロタケから調製されたシゾフィランなどは、抗腫瘍活性を示す医薬として現在販売されている）等の多彩な生物活性を示す。
また、当該物質群がアレルギー性呼吸器疾患の原因物質の一つとして挙げられている他、ＢＧがエンドトキシンと共に体内に入った場合、エンドトキシンの作用を増強するという報告もあり、異物として血中に流入することは好ましいことではなく、医薬品ならびに医療用具等へのＢＧの混入も医療上重大な問題になりつつある。
また、上記ＢＧは真菌細胞壁に共通して存在する構成成分の一つであるため、当該物質が検出されることは、真菌由来の他の有毒な成分が混入している可能性を示すものであり、ＢＧ測定の真菌検出あるいは真菌否定試験への適用についても検討が開始されている。さらに微生物や各種動物由来の培養細胞を用いた医薬品の製造や、マクロファージ系細胞を用いての種々のメディエーターに関する研究が盛んになり、その培養時における微生物汚染はもとより、ＢＧの汚染の鋭敏なチェックならびにそれらの汚染による細胞への影響等を検討することが重要となっている。
一方、従来よりエンドトキシン試験法として用いられてきたカブトガニ・アメボサイト・ライセート（以下ライセートとも記載する）から調製されたリムルス試薬が、ＢＧを認識し、ＢＧにも反応することが明らかにされ、ライセート由来のＢＧ感受性因子（Ｇ因子）系を用いたＢＧ特異的リムルス試薬が開発されて深在性真菌症の診断薬として保険収載されている。また、カイコ等の節足動物の体液から調製されたフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬も同様にＢＧを認識してＢＧにも反応することが明らかにされた（以下、リムルス試薬及びフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬を併せてＢＧ測定試薬と記載する）。
臨床の現場における、ＢＧの測定の目的は、真菌類による汚染の有無を検証するために行われているため、このような背景からＢＧの測定のための標準物質は、適切な真菌由来の物質であることが望まれ、真菌由来の適切な標準物質の調製法の開発が強く望まれている。しかし、カンジダ属等の真菌が有するＢＧには、マンナンが大量に混入しており、またエンドトキシンに代表される発熱物質の混入が避けられず、上記測定の標準物質として充分な純度を有するＢＧであって、測定試薬への反応性が高いＢＧは得られていなかったため、ＢＧの測定のための標準物質としては従来はカードラン（ダラム陰性菌由来：真菌とは別に分類される細菌）等が使用されていた。
真菌菌体の細胞壁の構成成分であるＢＧを調製する従来の方法としては例えば▲１▼菌体をフレンチプレス等による物理的処理を行った後、プロテアーゼで消化し、タンパク質やマンナンを除去して細胞壁部分を取り出す工程、▲２▼該細胞壁を高濃度のアルカリ又は酸を用いてオートクレーブ等により高熱処理して粗ＢＧを抽出する工程、▲３▼粗ＢＧ液を中和および／または透析等による脱塩後、エタノール等の有機溶媒添加によってＢＧを析出させ、該析出物（沈殿物）を遠心分離等により得、アセトン等の有機溶媒による脱水後遠心分離等により沈殿物を得、減圧乾燥等により粉末化する方法等が用いられていた（特開平３−１１９９９５等）。
上述のように、特にＢＧをより高感度で検出するために多種の試薬及び測定方法が開発されているため、その標準物質としてリムルス試薬やフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬に安定に反応するＢＧが必要とされているにも関わらず、従来のそのようなＢＧの調製方法は非常に多くの工程を必要とし、かつ高熱下で高濃度のアルカリと酸を用いる等々、極めて繁雑かつ危険性を伴う方法であった。また、前述の方法によって得たＢＧは、マンナンなどの混入が多く、純度が低いために安定性に欠け、ＢＧの測定において標準物質として使用した際には反応性が低く安定した測定値を得る障害となっていた。そこでより純度が高く安定性が高いＢＧを、真菌の菌体から調製する方法が大いに期待されていた。
発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねることにより、簡便で効率よく、ＢＧ測定試薬に対する反応性が高く高純度のＢＧを真菌の菌体から調製する方法を見出し、当該方法で特にカンジダ属に属する菌体から調製されたＢＧが驚くべきことに、従来ＢＧへの混入の防止が困難であったマンナンやエンドトキシンをほとんど含まないことを見出すことで本発明を完成した。即ち、カンジダ等の真菌を菌体のままアルカリ条件下で酸化分解することによるため、真菌の菌体から細胞壁部分を取り出した後に精製するという煩雑な操作の必要がなく、簡便で効率の良い、かつ安全で高純度なＢＧの調製法を確立することに成功した。
また、上記方法によって真菌の菌体から得られる高純度のＢＧを標準物質として使用することで検体中のＢＧの測定において、より安定で正確に測定することが可能となることを見出した。
さらに、上述のカンジダ属等の真菌から得られる高純度のＢＧをより安定化する方法を見いだし、この方法により安定化された前記ＢＧを上記ＢＧ測定の標準物質として使用することでより安定で精度が高い測定が可能となった。
本発明は以下の構成からなる。
１． 真菌の菌体をアルカリ性条件下において酸化分解して該菌体の細胞壁からＢＧを遊離させることを特徴とするＢＧの調製法。
２． 酸化分解を次亜塩素酸塩により行うことを特徴とする前記１．に記載の調製法。
３． 酸化分解により生じる水不溶性画分を非プロトン性極性溶媒に溶解する工程を含むことを特徴とする前記１．又は２．記載の調製法。
４． 非プロトン性極性溶媒がジアルキルスルホキシドであることを特徴とする前記３．記載の調製法。
５． カンジダ属に属する微生物の菌体をアルカリ性条件下において酸化分解して該菌体の細胞壁から遊離することにより得られることを特徴とする非プロトン性極性溶媒に可溶なＢＧ。
６． 酸化分解を次亜塩素酸塩により行うことを特徴とする前記５．記載のＢＧ。
７． 非プロトン性極性溶媒がジアルキルスルホキシドであることを特徴とする前記５．又は６．記載のＢＧ。
８． マンナンの混入率が５．０％（モル比）未満であることを特徴とする前記５．〜７．いずれか一項記載のＢＧ。
９． エンドトキシン含量が０．１ｐｇ／ｍｇ未満であることを特徴とする前記５．〜８．に記載のＢＧ。
１０． ＢＧが、カブトガニ・アメボサイト・ライセートのＧ因子系および／または節足動物の体液のフェノール酸化酵素前駆体カスケード系を活性化できるＢＧであることを特徴とする前記５．〜９．いずれか一項記載のＢＧ。
１１． 前記５．〜１０．のいずれかに記載のＢＧと、カブトガニ・アメボサイト・ライセートのＧ因子系もしくは節足動物の体液のフェノール酸化酵素前駆体カスケード系を活性化しない賦形剤、および／又は水素化ホウ素アルカリ金属塩を含有するＢＧ組成物。
１２． 凍結乾燥物であることを特徴とする前記１１．記載のＢＧ組成物。
１３． 前記５．〜１０．のいずれかに記載のＢＧあるいは前記１１．又は１２．に記載のＢＧ組成物を標準物質として用い、リムルス試薬又はフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬により検体中のＢＧ量を測定する方法。
１４． リムルス試薬がＢＧ特異的リムルス試薬であることを特徴とする前記１３．記載のＢＧ量を測定する方法。
１５． フェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬が節足動物の体液から調製されたことを特徴とする前記１４．記載のＢＧ量を測定する方法。
１６． 少なくとも前記５．〜１０．のいずれかに記載のＢＧあるいは前記１１．又は１２．記載のＢＧ組成物を標準物質として含有することを特徴とするＢＧ測定用キット。
１７． 更にリムルス試薬又はフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬を含むことを特徴とする前記１６．に記載のＢＧ測定用キット。
（発明の実施の形態）
以下に本発明を実施の形態により説明する。
（１）本発明調製法
本発明調製法は、真菌の菌体をアルカリ条件下において酸化分解して該菌体の細胞壁からＢＧを遊離させることを特徴とするＢＧの調製法である。
本発明調製法においては、ＢＧ測定試薬が認識する（１−３）−β−Ｄ−グリコシド結合が多く含まれるＢＧを、その細胞壁に含有する真菌、好ましくはカンジダ属に属する微生物の菌体、最も好ましくは、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ Ａｌｂｉｃａｎｓ）を使用する。培養液等から分離された上記菌体を生菌体のまま使用しても良いが、菌体を公知の方法で脱脂、及び／又は乾燥したものを使用することも可能である。
真菌の菌体をアルカリ性水溶液（水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化マグネシウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液等：０．０１〜０．３ｍｏｌ／Ｌ）に０．１〜１００ｍｇ／ｍｌで懸濁して菌体に含まれるエンドトキシンを失活させるとともに、該水溶液を適当な酸化剤（例えば次亜塩素酸塩、過ヨウ素酸塩など）を加えて酸化分解を行うことが好ましい。酸化剤としては、特に次亜塩素酸塩（例えば次亜塩素酸リチウム、次亜塩素酸ナトリウム及び次亜塩素酸カリウムなど）が好ましく、次亜塩素酸ナトリウム（以下ＮａＣｌＯと記載する）が最も好ましいがこれに限定はされない。
例えば酸化剤としてＮａＣｌＯを用いる場合、菌体をアルカリ水溶液に懸濁し、適当量のＮａＣｌＯを懸濁液に加え、撹拌して酸化分解反応を進めることが好ましい。添加するＮａＣｌＯ濃度は、ＮａＣｌＯが水溶液中で分解することがあるためその保存状態で変化しうるが、あえて例示するのであれば、反応時に０．３〜１０％（反応時有効塩素含量）となるように調整すればよい。その際の温度と処理時間によって酸化分解の程度は異なるが、通常は０〜３７℃、好ましくは２〜８℃、例えば４℃の条件下で、１〜２４時間、好ましくは５〜１５時間程度反応させることがより好ましいが特に限定はされない。
上記のとおり、菌体の酸化分解反応をアルカリ性の条件下で行うことにより、ＢＧを含む不溶性画分中のエンドトキシンを失活させるとともに、マンナンを溶解させて不溶性画分から除くことができる。
上記酸化分解によってカンジダ属等の真菌の菌体から遊離したＢＧは該反応溶液中に不溶性であり、溶液から不溶性画分を回収することにより該反応溶液に可溶性画分（マンナン等弱アルカリ性溶液溶解性の物質及び酸化剤を含む）との分離がなされる。不溶性画分の回収は、通常の固液分離手段、例えば濾過或いは遠心分離などの公知の一般的な方法によって行うことができるが、特に遠心分離処理が好ましい。
さらに、反応溶液を透析等によって脱塩した後に上記固液分離手段により不溶性画分を回収することも可能である。
目的のＢＧを更に高度に精製するために、当該不溶性画分を、適切な方法で溶解し、その溶液から多糖類を常法により析出させて沈澱として回収すればよい。上記溶解の方法としては例えば上記不溶性画分をアセトン等の有機溶媒によって脱水処理後、非プロトン性極性溶媒に溶解する方法が例示される。非プロトン性極性溶媒としては、目的のＢＧが有するリムルス試薬などへの反応性を保持しつつ、上記ＢＧを溶解することができる水溶性の該有機溶媒であることが好ましいが、特に限定されるものではない。非プロトン性極性溶媒としては、ジアルキルスルホキシド、ジアルキルホルムアミド又はヘキサアルキルホスホルアミドが好ましく、具体的には、例えばジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド及びヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）等が挙げられるが、その中でもジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯと略記する）が最も好ましい。上記不溶性画分に非プロトン性極性溶媒を加え、ＢＧを溶解する。その際、超音波処理などを行うことにより菌体の抽出残渣を破砕し、ＢＧを十分に抽出すると共に、ＢＧを溶解することができる。当該不溶物を遠心分離等によって除去し、上清液にエタノール等の極性有機溶媒を加えてＢＧを析出せしめ、遠心分離等によって沈殿物として回収することができる。沈殿物をアセトン等の有機溶媒によって脱水、乾燥させ粉末化することによって水分含量が低く、高純度で、安定なＢＧ粉末を得ることができる。
上述の操作によって得られるＢＧの、ＢＧ測定試薬に対する反応性、即ち力価は、例えば市販のリムルス試薬や節足動物の体液から調製された市販のフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬等を用いて検定する。そして、目的に応じた力価のものを下記記載の本発明測定法において検体中のＢＧ測定のための標準物質として用いればよい。
（２）本発明ＢＧ
本発明ＢＧは、カンジダ属に属する真菌の菌体をアルカリ性条件下において酸化分解して該菌体の細胞壁から遊離させることにより得られる非プロトン性極性溶媒に可溶なＢＧである。
本発明ＢＧの純度としては、混入しているマンナンの量がＢＧの量と比較して５．０％（モル比）未満であることが好ましい。本発明調製法により、カンジダ菌体から調製されたＢＧは、混入しているマンナンの量が５％（モル比）未満に保たれている。
上記本発明ＢＧの純度の測定法としてはＴｏｒｅｌｌｏ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９８０，２０２，１９５−２０９の方法が挙げられる。すなわち本発明ＢＧ２ｍｇを２Ｎトリフルオロ酢酸で１２１℃、９０分で処理後、水素化ホウ素ナトリウムで処理してアセチル化したのちに、ＤＢ−２２５コートしたキャピラリータイプのガスクロマトグラフィー（大倉ＧＣ１０３Ｃ：分析温度：２２０℃）にて構成糖の微量分析でおこなう。
また、本発明ＢＧに混入するエンドトキシン量は０．１ｐｇ／ｍｇ未満であることが好ましい。本発明調製法により、カンジダ菌体から調製されたＢＧはエンドトキシン含量は０．１ｐｇ／ｍｇ未満であり、エンドトキシン測定用のリムルス試薬で検出不能となる。
エンドトキシン含量の測定は常法に従ってリムルス試験によって行われるが、例えば、本発明ＢＧ粉末を０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液に１．０ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、その後０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液で適宜希釈して試料とし、各々２５μＬをトキシペットプレート９６Ｆ（エンドトキシン、ＢＧフリーの９６ウェルマイクロプレート；生化学工業（株））の所定のウェルに分注し、エンドスペックＥＳテストＭＫ（エンドトキシン特異的リムルス試薬；生化学工業販売）溶液を１００μＬ添加後、ウェルリーダーＳＫ６０１（生化学工業（株））にて、３７℃、３０分間のカイネティックアッセイを行いＢＧ中に混在するエンドトキシン量を自動定量することができる。
カンジダ属の菌体から本発明方法によって得られる本発明ＢＧは、ＢＧ測定試薬への反応性が高く、後述のＢＧ検出試薬によるＢＧの測定時に標準物質として使用すると安定な測定値が得られる。リムルス試薬を用いる合成基質法によるＢＧ測定法において、本発明ＢＧは、１ｐｇ／ｍｌあたり０．２ｍＡｂｓ／分以上の光吸度変化率を示すことが好ましいが、特に限定はされない。
本発明ＢＧは、カンジダ菌体を、アルカリ性条件下において酸化分解した後、遊離したＢＧを非プロトン性有機溶媒で抽出する本発明調製法により製造することができる。上記酸化分解は、本発明調製法において記載したとおり、公知の一般的な酸化剤を使用することが可能であり特に限定はされないが、その中でも次亜塩素酸ナトリウムが好ましい。また、非プロトン性極性溶媒としては、アルキルスルホキシド、ジアルキルホルムアミド又はヘキサアルキルホスホルアミドが好ましく、例えばジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド及びヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）等が挙げられるが、その中でも特にジメチルスルホキシドがより好ましい。
（３）本発明ＢＧ組成物
本発明ＢＧ組成物は上述の本発明ＢＧと、カブトガニ・アメボサイト・ライセートのＧ因子系もしくは節足動物の体液のフェノール酸化酵素前駆体カスケード系を活性化しない賦形剤及び／又は水素化ホウ素アルカリ金属塩を含有する液体又は粉末のＢＧ組成物である。
上記賦形剤は、医薬品やその他薬剤等に使用される公知の賦形剤であれば特に限定はされない。このような物質としては例えばデキストラン、ショ糖、フィコール、マンニトール又はグリセリン等のような（１→３）−β−Ｄ−グリコシド結合を有さない物質であれば使用することができる。その中でも、特に本発明ＢＧの安定性を向上させる効果を有するデキストランが好ましい。例えば、デキストランを本発明ＢＧに添加する場合は、０．１〜２％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．３〜０．７％（Ｗ／Ｖ）となるように添加する。
また、上記水素化ホウ素アルカリ金属塩としては水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素ナトリウム及び水素化ホウ素カリウムなどが挙げられ、特に限定はされないが、水素化ホウ素ナトリウムが好ましい。水素化ホウ素ナトリウムの場合、組成物中１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜２０ｍＭとなるように添加することにより本発明ＢＧを安定化することができる。本発明ＢＧ組成物溶液をそのまま保存しＢＧ測定の標準物質として使用することが可能であるが、凍結乾燥等の乾燥手段で粉末とすることにより保存時における安定性がさらに向上するためより好ましい。
（４）本発明測定法
本発明測定法は、上記本発明ＢＧあるいは上記本発明ＢＧ組成物を標準物質として用い、リムルス試薬又はフェノール酸化酵素前駆体カスケード含有試薬により検体中のＢＧ量を測定する方法である。
本発明測定法に使用されるリムルス試薬としては、カブトガニのアメボサイト（血球細胞）から抽出されたライセートを原料として得られたＧ因子系反応因子を含む試薬であれば、いずれも使用できる。このようなリムルス試薬としては具体的には、リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・トリデンタツス、タキプレウス・ギガス、タキプレウス（カルシノスコルピウス）・ロツンディカウダ等のカブトガニの血リンパ液から、公知の方法（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８０，１０１１−１０２１（１９７６）で調製した通常のライセート、エンドトキシン感受性因子（Ｃ因子）を除去又は不活性化したＢＧ特異的ライセート、及びさらにこれらのライセートに合成基質を加えて調製したＢＧ特異的試薬（特開平４−２８５８５９等）などの合成基質法リムルス試薬などが挙げられる。
また、本発明測定法に用いられるリムルス試薬は、通常のライセートまたはＣ因子を除去又は不活化したＢＧ特異的ライセートを主成分とするゲル化法リムルス試薬やゲル化反応を応用した比濁法リムルス試薬であってもよい。
本発明測定法に使用されるフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬としては、節足動物等の体液を原料として得られたＢＧ系反応因子を含む試薬であれば、特に限定はされないが、カイコの体液から調製されたペプチドグリカンとＢＧに反応する市販の試薬（例えば、ＳＬＰ試薬（和光純薬工業（株）製）も使用することができる。上記試薬による反応の検出方法は、公知の方法、すなわち、発現するベンゾイルアルギニンエチルエステル加水分解酵素（ＢＡＥＥａｓｅ）、プロフェノールオキシダーゼ活性化酵素（ＰＰＡＥ）、フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）等の酵素活性を測定するかあるいはこれらの酵素活性の発現時間を測定する方法等を用いればよい。例えば、特開平１−１４２４６６号公報および特公平７−１１４７０７号公報に記載された如く、ＰＯの活性化度の測定（生成するキノリン色素を測定する方法、Ｌ−β−（３，４−ジヒドロキジフェニル）アラニン（ＤＯＰＡ）の酸化によって生成するメラニン色素を測定する方法等）、ＢＡＥＥａｓｅ活性の測定ならびに特開平７−１８４６９０号公報に記載された如く、ＰＰＡＥ活性を測定する方法等を用いればよい。
なお、上記のようなリムルス試薬及びフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬は、液体、粉末、固形物等のいずれの形態であってもよい。
本発明方法を用いることにより、血清、血漿、組織液など体液の他、水、試薬、医薬品及び医薬品製造工程などにおけるサンプリングによる検体中のＢＧを測定することが可能である。
（５）本発明キット
本発明キットは、少なくとも本発明ＢＧあるいは本発明ＢＧ組成物を標準物質として含有することを特徴とするＢＧ測定用キットである。
本発明キットは、上記本発明測定法を実施するためのキットであり、標準物質として利用するための上記本発明ＢＧあるいはそれを安定化した本発明ＢＧ組成物をキット中に含むことを特徴とする。本発明キットには、さらに本発明測定法を実施するための測定試薬であるリムルス試薬又はフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬を含むことが好ましい。また、その他キット中には例えばＢＧの混入のない（ＢＧフリー）蒸留水、ＢＧの付着のない（ＢＧフリー）９６ウェルマイクロプレートなどを包含しても良い。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
菌体の培養
カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＩＦＯ１３８５）を５ＬのＣ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（炭素源としてｓｕｃｒｏｓｅを含む）にて２７°Ｃで４８〜７２時間液体培養し（ジャーファメンター使用；攪拌速度：４００ｒｐｍ）、アセトン処理、脱脂した後、乾燥菌体１７．９ｇを得た。
実施例２
ＢＧの調製
脱脂乾燥菌体１ｇに０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液２００ｍＬを加えて懸濁し、ＮａＣｌＯ（アンチホルミン、Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅ，ａｎｔｉｆｏｒｍｉｎ；Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｃｈｌｏｒｉｎｅ：ｍｉｎ ５．０％、和光純薬工業株式会社製）をそれぞれ２５、５０、１００、２００ｍＬ添加して、４℃で一夜撹拌し酸化分解した。酸化物を３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し沈殿物を得、ＢＧを含まない蒸留水２００ｍＬを加え、撹拌後遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分）し、その沈殿物にアセトン２００ｍＬを加え脱水沈殿物を得た。該沈殿物にＤＭＳＯ ３０ｍＬを加え、１時間超音波をかけて溶解させた。３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を得、該上清に２倍量のエタノールを撹拌しながら加えＢＧを析出させた後、該析出物を３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、沈殿物を得た。該沈殿物にアセトンを１００ｍＬ加え撹拌し、３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して脱水した沈殿物を得、減圧乾燥してＢＧの粉末を得た。
また、同様の方法により、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓ）からＢＧ（レンチナン）の精製粉末を得た。
実施例３
［力価測定］
実施例２記載の各ＮａＣｌＯ量の使用により得られた本発明ＢＧの粉末を０．３ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ水溶液に１．０ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、その後０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液で適宜希釈した希釈液を調製し試料とした。該試料、ブランク液（ＢＧフリー蒸留水）各々２５μＬをトキシペットプレート９６Ｆ（エンドトキシン、ＢＧフリーの９６ウェルマイクロプレート；生化学工業（株））の所定のウェルに分注し、ファンギテックＧテストＭＫ（ＢＧ特異的リムルス試薬；生化学工業（株））溶液を１００μＬ添加後、蓋を被せてウェルリーダーＳＫ６０１（恒温槽と解析プログラム内蔵のマイクロプレートリーダー；生化学工業（株））にセットし、３７℃、３０分間のカイネティックアッセイを行い試料の力価を測定した。その結果を図１に示した。本発明ＢＧは、従来法によってシイタケから調製したＢＧであるレンチナンと比して高い力価を有することが明らかとなった。
実施例４
［エンドトキシン含量の測定］
実施例２記載の本発明ＢＧ粉末を０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液に１．０ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、その後０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液で適宜希釈して試料とした。実施例３と同様に、各々２５μＬをトキシペットプレート９６Ｆ（エンドトキシン、ＢＧフリーの９６ウェルマイクロプレート；生化学工業販売）の所定のウェルに分注し、エンドスペックＥＳテストＭＫ（エンドトキシン特異的リムルス試薬；生化学工業販売）溶液を１００μＬ添加後、ウェルリーダーＳＫ６０１にて、３７℃、３０分間のカイネティックアッセイを行い試料中のエンドトキシン含量を測定した。その結果（表１）、すべての検体において、エンドトキシンの混入は認められなかった。
実施例５
［純度測定］
（１）フローサイトメトリーによるマンナン混在量の定量分析
実施例１に記載のアセトン処理乾燥カンジダ菌体（対照）と本発明における２５ｍｌのＮａＣｌＯで処理した菌体（処理）のＰＢＳ懸濁液に抗マンナン抗体［抗カンジダｔｙｐｅｌ血清（ＲＭ３０２−１）；カンジダ同定用因子抗体キット（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｈｅｃｋ、ＲＭ３０２−Ｋ２５）使用；Ｉａｔｒｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｌｏｔ．Ｓ６７８）とＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体［Ａｎｔｉ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｇｏａｔ），Ｆ（ＡＢ’）、ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（０１１−１２６２１）、Ｗａｋｏ］を添加し、フローサイトメトリー［ＦＡＣＳ Ｃａｒｉｂｕｒ ＴＭおよび解析ソフトＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ ＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＣＡ）によるマンナン抗原の定量分析を行った（図２）。この結果より、処理菌体は対照に比べ、蛍光強度の顕著な低下が見られ、明らかにマンナン抗原の消失が認められた。
（２）糖組成の分析
実施例２に記載の方法を用いてカンジダ属の菌体から製造した本発明ＢＧ２ｍｇを、常法（Ｔｏｒｅｌｌｏ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９８０，２０２，１９５−２０９）に準じて２Ｎトリフルオロ酢酸で１２１℃、９０分処理し、水素化ホウ素ナトリウムで処理してアセチル化したのちに、ＤＢ−２２５コートしたキャピラリータイプのガスクロマトグラフィー（大倉ＧＣ１０３Ｃ）にて構成糖の微量分析（分析温度：２２０℃）をおこなった（表２）。その結果、ＢＧとマンナンの比は１：０．０５以下となり、本発明ＢＧ中に混入したマンナン量はきわめて微量であることが明らかとなった。
４−３ １３Ｃ−ＮＭＲおよび１Ｈ−ＮＭＲによる多糖の構造解析
実施例２に記載の本発明によるＢＧ（ＮａＣｌＯ２５ｍｌ使用）をＤＭＳＯ−ｄ６（Ｍｅｒｋ、Ｆ．Ｒ．Ｇｅｒｍａｎｙ）に溶解し、１３Ｃおよび１Ｈによる高分解能ＮＭＲ（ＤＲＸ５００および解析ソフトＸＷＩＮ−ＮＭＲ、Ｂｒｕｋｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に供した（分析温度：７０℃）。
それぞれの化学シフト（表３）より、該ＢＧは直鎖のβ−１，３−と直鎖のβ−１，６結合を含むことが判明し、１３Ｃ化学シフトから分枝型１，３−結合はほとんど含まれないことが推定された。なお、１，３結合に対する１，６結合の割合は、菌種や処理条件によっても異なるが、実施例２において得られた本発明ＢＧでは、１：０．４３８という分析値が得られた。
実施例６
生理活性測定
（１）抗腫瘍活性の測定
５×１０６個のマウス固形癌細胞Ｓ−１８０をマウスに皮下投与し、実施例２で調製したカンジダ由来のＢＧ（本発明ＢＧ）、シイタケ由来の市販のレンチナン、及び対照としての生理食塩水を１００μｇずつ７，９，１１日後に腹腔内投与し、その３５日後にマウスから癌組織を摘出して重量を測定した（表４）。
（２）ヒト末梢血のインターロイキン（ＩＬ）−８産生能
健常人の末梢血から採取した好中球に、実施例２で調製したカンジダ由来のＢＧ（本発明ＢＧ）、シイタケ由来の市販のレンチナン、及び対照としての生理食塩水を添加して培養後、２４時間後に培養上清中のＩＬ−８量をＥＬＩＳＡ法により測定した（表５）。
実施例７
ＢＧの安定性試験
実施例２で得られた本発明ＢＧを５００ｐｇ／ｍＬ含有する０．０１Ｍ ＮａＯＨ水溶液を調製し、デキストラン（分子量４０，０００）を０．４％（Ｗ／Ｖ）で添加した試料（検体１）、上記本発明ＢＧ溶液に水素化ホウ素ナトリウムを１０ｍＭとなるよう添加した試料（検体２）及び検体１に水素化ホウ素ナトリウムを１０ｍＭとなるよう添加した試料（検体３）の安定性を実施例２の方法により測定した（表６）。対照として上記本発明ＢＧを含むＮａＯＨ水溶液を用いた。検体１〜３全ての検体で安定性の向上が見られたが、水素化ホウ素ナトリウムをデキストランと併用することにより、それぞれ単独で用いた場合と比して更に本発明ＢＧの安定性が増した。
表中数字は初日（０日）の活性を１００％としたときの相対活性（％）で示した
実施例８
ＢＧ測定用キット
（１）安定化ＢＧ（実施例２で作成した本発明ＢＧ５００ｐｇ／ｍＬを含有する０．０１Ｍ ＮａＯＨ水溶液１ｍＬに４ｍｇのデキストラン及び４ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを溶解後、凍結乾燥した粉末）
（２）ＢＧ特異的リムルス試薬
（３）９６ウェルマイクロプレート（ＢＧフリー） １枚
（４）蒸留水（ＢＧフリー） １０ｍＬ
測定
実施例２の方法によりシイタケから得られたレンチナンの粉末を用い実施例２の方法において本発明キットによって測定を行った。その結果、ばらつきのない安定した測定値が得られた。
産業上の利用可能性
本発明により、カンジダ属等の真菌の菌体より、種々の生物活性を有するＢＧを大量に可溶化、精製することが可能となり、高純度のＢＧの入手が容易になった。また、上記調製方法を用いてカンジダ属の菌体よりＢＧを単離し、当該ＢＧの活性を安定に保持する方法を提供し、更に前記ＢＧあるいは安定化された上記ＢＧを標準物質として使用することにより、正確で再現性の高いＢＧ測定方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は各酸化度の本発明ＢＧの力価を示す図である。
図２は実施例５における、対照（アセトン処理菌体）と本発明により処理した菌体の各々のフローサイトメトリーによるマンナン抗原の定量分析の結果を示す図である。
図３は、本発明ＢＧの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
本発明は真菌の菌体から（１→３）−β−Ｄ−グルカンを簡便な方法により効率よく調製するための方法、当該方法を用いて調製した（１→３）−β−Ｄ−グルカン、及びその使用法に関する。詳細にはカブトガニ・アメボサイト・ライセートのＧ因子系および／または節足動物の体液のフェノール酸化酵素前駆体カスケード系を活性化する（１→３）−β−Ｄ−グルカンを、真菌の一種であるカンジダ属の菌体の細胞壁から簡便かつ効率良く調製するための新規調製方法、それにより得られる（１→３）−β−Ｄ−グルカン及び、その（１→３）−β−Ｄ−グルカンの（１→３）−β−Ｄ−グルカン測定への使用に関する。
背景技術
（１→３）−β−Ｄ−グルカンは酵母、カビ、キノコ等の真菌類、植物などの細胞壁成分として、自然界に広く分布している糖鎖である。
（１→３）−β−Ｄ−グリコシド結合を含むグルカンとしては、（１）（１→３）−β−Ｄ−グリコシド結合のみからなる直鎖状のグルカン（カードラン（Ｃｕｒｄｌａｎ）、パラミロン（Ｐａｒａｍｙｌｏｎ）等）、（２）（１→６）−β−Ｄ−グリコシド結合と（１→３）−β−Ｄ−グリコシド結合を含むグルカン、（３）（１→４）−β−Ｄ−グリコシド結合と（１→３）−β−Ｄ−グリコシド結合を含むグルカン（リケナン（Ｌｉｃｈｅｎａｎ）類、オオムギ胚乳中のグルカン等）に分類され、更に（２）のグルカンは、（２−１）ジグザグ構造を有するアラメ属褐藻類由来のラミナラン（Ｌａｍｉｎａｒａｎ）、（２−２）分枝を有するジグザグ構造からなるコンブ属褐藻類由来のラミナラン、（２−３）多分枝樹状構造を有する大部分の菌類又は藻類の細胞壁由来のグルカン、（２−４）短鎖分枝構造を有するスクレロタン（Ｓｃｌｅｒｏｔａｎ）、シゾフィラン（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌａｎ）、レンチナン（Ｌｅｎｔｉｎａｎ）等、（２−５）分枝反復構造を有するパン酵母やカンジダ属の細胞壁由来のグルカンなどに細かく分類することができ、多様な構造が存在する（Ａｋｅｔａｇａｗａ，Ｊ．，Ｔａｍｕｒａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｔａｎａｋａ，Ｓ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂａｃｔ．Ａｎｔｉｆｕｎｇ．Ａｇｅｎｔｓ，２３，７，４１３−４１９（１９９５））。本明細書においては（１→３）−β−Ｄ−グリコシド結合を含むグルカンを「（１→３）−β−Ｄ−グルカン」（以下、ＢＧと記載する）と称する。ＢＧはマクロファージからの各種サイトカインの産生誘導等を含む網内系の活性化、補体系の活性化、抗腫瘍活性（例えばシイタケから調製されたレンチナン及びスエヒロタケから調製されたシゾフィランなどは、抗腫瘍活性を示す医薬として現在販売されている）等の多彩な生物活性を示す。
また、当該物質群がアレルギー性呼吸器疾患の原因物質の一つとして挙げられている他、ＢＧがエンドトキシンと共に体内に入った場合、エンドトキシンの作用を増強するという報告もあり、異物として血中に流入することは好ましいことではなく、医薬品ならびに医療用具等へのＢＧの混入も医療上重大な問題になりつつある。
また、上記ＢＧは真菌細胞壁に共通して存在する構成成分の一つであるため、当該物質が検出されることは、真菌由来の他の有毒な成分が混入している可能性を示すものであり、ＢＧ測定の真菌検出あるいは真菌否定試験への適用についても検討が開始されている。さらに微生物や各種動物由来の培養細胞を用いた医薬品の製造や、マクロファージ系細胞を用いての種々のメディエーターに関する研究が盛んになり、その培養時における微生物汚染はもとより、ＢＧの汚染の鋭敏なチェックならびにそれらの汚染による細胞への影響等を検討することが重要となっている。
一方、従来よりエンドトキシン試験法として用いられてきたカブトガニ・アメボサイト・ライセート（以下ライセートとも記載する）から調製されたリムルス試薬が、ＢＧを認識し、ＢＧにも反応することが明らかにされ、ライセート由来のＢＧ感受性因子（Ｇ因子）系を用いたＢＧ特異的リムルス試薬が開発されて深在性真菌症の診断薬として保険収載されている。また、カイコ等の節足動物の体液から調製されたフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬も同様にＢＧを認識してＢＧにも反応することが明らかにされた（以下、リムルス試薬及びフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬を併せてＢＧ測定試薬と記載する）。
臨床の現場における、ＢＧの測定の目的は、真菌類による汚染の有無を検証するために行われているため、このような背景からＢＧの測定のための標準物質は、適切な真菌由来の物質であることが望まれ、真菌由来の適切な標準物質の調製法の開発が強く望まれている。しかし、カンジダ属等の真菌が有するＢＧには、マンナンが大量に混入しており、またエンドトキシンに代表される発熱物質の混入が避けられず、上記測定の標準物質として充分な純度を有するＢＧであって、測定試薬への反応性が高いＢＧは得られていなかったため、ＢＧの測定のための標準物質としては従来はカードラン（ダラム陰性菌由来：真菌とは別に分類される細菌）等が使用されていた。
真菌菌体の細胞壁の構成成分であるＢＧを調製する従来の方法としては例えば▲１▼菌体をフレンチプレス等による物理的処理を行った後、プロテアーゼで消化し、タンパク質やマンナンを除去して細胞壁部分を取り出す工程、▲２▼該細胞壁を高濃度のアルカリ又は酸を用いてオートクレーブ等により高熱処理して粗ＢＧを抽出する工程、▲３▼粗ＢＧ液を中和および／または透析等による脱塩後、エタノール等の有機溶媒添加によってＢＧを析出させ、該析出物（沈殿物）を遠心分離等により得、アセトン等の有機溶媒による脱水後遠心分離等により沈殿物を得、減圧乾燥等により粉末化する方法等が用いられていた（特開平３−１１９９９５等）。
上述のように、特にＢＧをより高感度で検出するために多種の試薬及び測定方法が開発されているため、その標準物質としてリムルス試薬やフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬に安定に反応するＢＧが必要とされているにも関わらず、従来のそのようなＢＧの調製方法は非常に多くの工程を必要とし、かつ高熱下で高濃度のアルカリと酸を用いる等々、極めて繁雑かつ危険性を伴う方法であった。また、前述の方法によって得たＢＧは、マンナンなどの混入が多く、純度が低いために安定性に欠け、ＢＧの測定において標準物質として使用した際には反応性が低く安定した測定値を得る障害となっていた。そこでより純度が高く安定性が高いＢＧを、真菌の菌体から調製する方法が大いに期待されていた。
発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねることにより、簡便で効率よく、ＢＧ測定試薬に対する反応性が高く高純度のＢＧを真菌の菌体から調製する方法を見出し、当該方法で特にカンジダ属に属する菌体から調製されたＢＧが驚くべきことに、従来ＢＧへの混入の防止が困難であったマンナンやエンドトキシンをほとんど含まないことを見出すことで本発明を完成した。即ち、カンジダ等の真菌を菌体のままアルカリ条件下で酸化分解することによるため、真菌の菌体から細胞壁部分を取り出した後に精製するという煩雑な操作の必要がなく、簡便で効率の良い、かつ安全で高純度なＢＧの調製法を確立することに成功した。
また、上記方法によって真菌の菌体から得られる高純度のＢＧを標準物質として使用することで検体中のＢＧの測定において、より安定で正確に測定することが可能となることを見出した。
さらに、上述のカンジダ属等の真菌から得られる高純度のＢＧをより安定化する方法を見いだし、この方法により安定化された前記ＢＧを上記ＢＧ測定の標準物質として使用することでより安定で精度が高い測定が可能となった。
本発明は以下の構成からなる。
１． 真菌の菌体をアルカリ性条件下において酸化分解して該菌体の細胞壁からＢＧを遊離させることを特徴とするＢＧの調製法。
２． 酸化分解を次亜塩素酸塩により行うことを特徴とする前記１．に記載の調製法。
３． 酸化分解により生じる水不溶性画分を非プロトン性極性溶媒に溶解する工程を含むことを特徴とする前記１．又は２．記載の調製法。
４． 非プロトン性極性溶媒がジアルキルスルホキシドであることを特徴とする前記３．記載の調製法。
５． カンジダ属に属する微生物の菌体をアルカリ性条件下において酸化分解して該菌体の細胞壁から遊離することにより得られることを特徴とする非プロトン性極性溶媒に可溶なＢＧ。
６． 酸化分解を次亜塩素酸塩により行うことを特徴とする前記５．記載のＢＧ。
７． 非プロトン性極性溶媒がジアルキルスルホキシドであることを特徴とする前記５．又は６．記載のＢＧ。
８． マンナンの混入率が５．０％（モル比）未満であることを特徴とする前記５．〜７．いずれか一項記載のＢＧ。
９． エンドトキシン含量が０．１ｐｇ／ｍｇ未満であることを特徴とする前記５．〜８．に記載のＢＧ。
１０． ＢＧが、カブトガニ・アメボサイト・ライセートのＧ因子系および／または節足動物の体液のフェノール酸化酵素前駆体カスケード系を活性化できるＢＧであることを特徴とする前記５．〜９．いずれか一項記載のＢＧ。
１１． 前記５．〜１０．のいずれかに記載のＢＧと、カブトガニ・アメボサイト・ライセートのＧ因子系もしくは節足動物の体液のフェノール酸化酵素前駆体カスケード系を活性化しない賦形剤、および／又は水素化ホウ素アルカリ金属塩を含有するＢＧ組成物。
１２． 凍結乾燥物であることを特徴とする前記１１．記載のＢＧ組成物。
１３． 前記５．〜１０．のいずれかに記載のＢＧあるいは前記１１．又は１２．に記載のＢＧ組成物を標準物質として用い、リムルス試薬又はフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬により検体中のＢＧ量を測定する方法。
１４． リムルス試薬がＢＧ特異的リムルス試薬であることを特徴とする前記１３．記載のＢＧ量を測定する方法。
１５． フェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬が節足動物の体液から調製されたことを特徴とする前記１４．記載のＢＧ量を測定する方法。
１６． 少なくとも前記５．〜１０．のいずれかに記載のＢＧあるいは前記１１．又は１２．記載のＢＧ組成物を標準物質として含有することを特徴とするＢＧ測定用キット。
１７． 更にリムルス試薬又はフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬を含むことを特徴とする前記１６．に記載のＢＧ測定用キット。
（発明の実施の形態）
以下に本発明を実施の形態により説明する。
（１）本発明調製法
本発明調製法は、真菌の菌体をアルカリ条件下において酸化分解して該菌体の細胞壁からＢＧを遊離させることを特徴とするＢＧの調製法である。
本発明調製法においては、ＢＧ測定試薬が認識する（１−３）−β−Ｄ−グリコシド結合が多く含まれるＢＧを、その細胞壁に含有する真菌、好ましくはカンジダ属に属する微生物の菌体、最も好ましくは、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ Ａｌｂｉｃａｎｓ）を使用する。培養液等から分離された上記菌体を生菌体のまま使用しても良いが、菌体を公知の方法で脱脂、及び／又は乾燥したものを使用することも可能である。
真菌の菌体をアルカリ性水溶液（水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化マグネシウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液等：０．０１〜０．３ｍｏｌ／Ｌ）に０．１〜１００ｍｇ／ｍｌで懸濁して菌体に含まれるエンドトキシンを失活させるとともに、該水溶液を適当な酸化剤（例えば次亜塩素酸塩、過ヨウ素酸塩など）を加えて酸化分解を行うことが好ましい。酸化剤としては、特に次亜塩素酸塩（例えば次亜塩素酸リチウム、次亜塩素酸ナトリウム及び次亜塩素酸カリウムなど）が好ましく、次亜塩素酸ナトリウム（以下ＮａＣｌＯと記載する）が最も好ましいがこれに限定はされない。
例えば酸化剤としてＮａＣｌＯを用いる場合、菌体をアルカリ水溶液に懸濁し、適当量のＮａＣｌＯを懸濁液に加え、撹拌して酸化分解反応を進めることが好ましい。添加するＮａＣｌＯ濃度は、ＮａＣｌＯが水溶液中で分解することがあるためその保存状態で変化しうるが、あえて例示するのであれば、反応時に０．３〜１０％（反応時有効塩素含量）となるように調整すればよい。その際の温度と処理時間によって酸化分解の程度は異なるが、通常は０〜３７℃、好ましくは２〜８℃、例えば４℃の条件下で、１〜２４時間、好ましくは５〜１５時間程度反応させることがより好ましいが特に限定はされない。
上記のとおり、菌体の酸化分解反応をアルカリ性の条件下で行うことにより、ＢＧを含む不溶性画分中のエンドトキシンを失活させるとともに、マンナンを溶解させて不溶性画分から除くことができる。
上記酸化分解によってカンジダ属等の真菌の菌体から遊離したＢＧは該反応溶液中に不溶性であり、溶液から不溶性画分を回収することにより該反応溶液に可溶性画分（マンナン等弱アルカリ性溶液溶解性の物質及び酸化剤を含む）との分離がなされる。不溶性画分の回収は、通常の固液分離手段、例えば濾過或いは遠心分離などの公知の一般的な方法によって行うことができるが、特に遠心分離処理が好ましい。
さらに、反応溶液を透析等によって脱塩した後に上記固液分離手段により不溶性画分を回収することも可能である。
目的のＢＧを更に高度に精製するために、当該不溶性画分を、適切な方法で溶解し、その溶液から多糖類を常法により析出させて沈澱として回収すればよい。上記溶解の方法としては例えば上記不溶性画分をアセトン等の有機溶媒によって脱水処理後、非プロトン性極性溶媒に溶解する方法が例示される。非プロトン性極性溶媒としては、目的のＢＧが有するリムルス試薬などへの反応性を保持しつつ、上記ＢＧを溶解することができる水溶性の該有機溶媒であることが好ましいが、特に限定されるものではない。非プロトン性極性溶媒としては、ジアルキルスルホキシド、ジアルキルホルムアミド又はヘキサアルキルホスホルアミドが好ましく、具体的には、例えばジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド及びヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）等が挙げられるが、その中でもジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯと略記する）が最も好ましい。上記不溶性画分に非プロトン性極性溶媒を加え、ＢＧを溶解する。その際、超音波処理などを行うことにより菌体の抽出残渣を破砕し、ＢＧを十分に抽出すると共に、ＢＧを溶解することができる。当該不溶物を遠心分離等によって除去し、上清液にエタノール等の極性有機溶媒を加えてＢＧを析出せしめ、遠心分離等によって沈殿物として回収することができる。沈殿物をアセトン等の有機溶媒によって脱水、乾燥させ粉末化することによって水分含量が低く、高純度で、安定なＢＧ粉末を得ることができる。
上述の操作によって得られるＢＧの、ＢＧ測定試薬に対する反応性、即ち力価は、例えば市販のリムルス試薬や節足動物の体液から調製された市販のフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬等を用いて検定する。そして、目的に応じた力価のものを下記記載の本発明測定法において検体中のＢＧ測定のための標準物質として用いればよい。
（２）本発明ＢＧ
本発明ＢＧは、カンジダ属に属する真菌の菌体をアルカリ性条件下において酸化分解して該菌体の細胞壁から遊離させることにより得られる非プロトン性極性溶媒に可溶なＢＧである。
本発明ＢＧの純度としては、混入しているマンナンの量がＢＧの量と比較して５．０％（モル比）未満であることが好ましい。本発明調製法により、カンジダ菌体から調製されたＢＧは、混入しているマンナンの量が５％（モル比）未満に保たれている。
上記本発明ＢＧの純度の測定法としてはＴｏｒｅｌｌｏ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９８０，２０２，１９５−２０９の方法が挙げられる。すなわち本発明ＢＧ２ｍｇを２Ｎトリフルオロ酢酸で１２１℃、９０分で処理後、水素化ホウ素ナトリウムで処理してアセチル化したのちに、ＤＢ−２２５コートしたキャピラリータイプのガスクロマトグラフィー（大倉ＧＣ１０３Ｃ：分析温度：２２０℃）にて構成糖の微量分析でおこなう。
また、本発明ＢＧに混入するエンドトキシン量は０．１ｐｇ／ｍｇ未満であることが好ましい。本発明調製法により、カンジダ菌体から調製されたＢＧはエンドトキシン含量は０．１ｐｇ／ｍｇ未満であり、エンドトキシン測定用のリムルス試薬で検出不能となる。
エンドトキシン含量の測定は常法に従ってリムルス試験によって行われるが、例えば、本発明ＢＧ粉末を０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液に１．０ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、その後０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液で適宜希釈して試料とし、各々２５μＬをトキシペットプレート９６Ｆ（エンドトキシン、ＢＧフリーの９６ウェルマイクロプレート；生化学工業（株））の所定のウェルに分注し、エンドスペックＥＳテストＭＫ（エンドトキシン特異的リムルス試薬；生化学工業販売）溶液を１００μＬ添加後、ウェルリーダーＳＫ６０１（生化学工業（株））にて、３７℃、３０分間のカイネティックアッセイを行いＢＧ中に混在するエンドトキシン量を自動定量することができる。
カンジダ属の菌体から本発明方法によって得られる本発明ＢＧは、ＢＧ測定試薬への反応性が高く、後述のＢＧ検出試薬によるＢＧの測定時に標準物質として使用すると安定な測定値が得られる。リムルス試薬を用いる合成基質法によるＢＧ測定法において、本発明ＢＧは、１ｐｇ／ｍｌあたり０．２ｍＡｂｓ／分以上の光吸度変化率を示すことが好ましいが、特に限定はされない。
本発明ＢＧは、カンジダ菌体を、アルカリ性条件下において酸化分解した後、遊離したＢＧを非プロトン性有機溶媒で抽出する本発明調製法により製造することができる。上記酸化分解は、本発明調製法において記載したとおり、公知の一般的な酸化剤を使用することが可能であり特に限定はされないが、その中でも次亜塩素酸ナトリウムが好ましい。また、非プロトン性極性溶媒としては、アルキルスルホキシド、ジアルキルホルムアミド又はヘキサアルキルホスホルアミドが好ましく、例えばジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド及びヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）等が挙げられるが、その中でも特にジメチルスルホキシドがより好ましい。
（３）本発明ＢＧ組成物
本発明ＢＧ組成物は上述の本発明ＢＧと、カブトガニ・アメボサイト・ライセートのＧ因子系もしくは節足動物の体液のフェノール酸化酵素前駆体カスケード系を活性化しない賦形剤及び／又は水素化ホウ素アルカリ金属塩を含有する液体又は粉末のＢＧ組成物である。
上記賦形剤は、医薬品やその他薬剤等に使用される公知の賦形剤であれば特に限定はされない。このような物質としては例えばデキストラン、ショ糖、フィコール、マンニトール又はグリセリン等のような（１→３）−β−Ｄ−グリコシド結合を有さない物質であれば使用することができる。その中でも、特に本発明ＢＧの安定性を向上させる効果を有するデキストランが好ましい。例えば、デキストランを本発明ＢＧに添加する場合は、０．１〜２％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．３〜０．７％（Ｗ／Ｖ）となるように添加する。
また、上記水素化ホウ素アルカリ金属塩としては水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素ナトリウム及び水素化ホウ素カリウムなどが挙げられ、特に限定はされないが、水素化ホウ素ナトリウムが好ましい。水素化ホウ素ナトリウムの場合、組成物中１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜２０ｍＭとなるように添加することにより本発明ＢＧを安定化することができる。本発明ＢＧ組成物溶液をそのまま保存しＢＧ測定の標準物質として使用することが可能であるが、凍結乾燥等の乾燥手段で粉末とすることにより保存時における安定性がさらに向上するためより好ましい。
（４）本発明測定法
本発明測定法は、上記本発明ＢＧあるいは上記本発明ＢＧ組成物を標準物質として用い、リムルス試薬又はフェノール酸化酵素前駆体カスケード含有試薬により検体中のＢＧ量を測定する方法である。
本発明測定法に使用されるリムルス試薬としては、カブトガニのアメボサイト（血球細胞）から抽出されたライセートを原料として得られたＧ因子系反応因子を含む試薬であれば、いずれも使用できる。このようなリムルス試薬としては具体的には、リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・トリデンタツス、タキプレウス・ギガス、タキプレウス（カルシノスコルピウス）・ロツンディカウダ等のカブトガニの血リンパ液から、公知の方法（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８０，１０１１−１０２１（１９７６）で調製した通常のライセート、エンドトキシン感受性因子（Ｃ因子）を除去又は不活性化したＢＧ特異的ライセート、及びさらにこれらのライセートに合成基質を加えて調製したＢＧ特異的試薬（特開平４−２８５８５９等）などの合成基質法リムルス試薬などが挙げられる。
また、本発明測定法に用いられるリムルス試薬は、通常のライセートまたはＣ因子を除去又は不活化したＢＧ特異的ライセートを主成分とするゲル化法リムルス試薬やゲル化反応を応用した比濁法リムルス試薬であってもよい。
本発明測定法に使用されるフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬としては、節足動物等の体液を原料として得られたＢＧ系反応因子を含む試薬であれば、特に限定はされないが、カイコの体液から調製されたペプチドグリカンとＢＧに反応する市販の試薬（例えば、ＳＬＰ試薬（和光純薬工業（株）製）も使用することができる。上記試薬による反応の検出方法は、公知の方法、すなわち、発現するベンゾイルアルギニンエチルエステル加水分解酵素（ＢＡＥＥａｓｅ）、プロフェノールオキシダーゼ活性化酵素（ＰＰＡＥ）、フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）等の酵素活性を測定するかあるいはこれらの酵素活性の発現時間を測定する方法等を用いればよい。例えば、特開平１−１４２４６６号公報および特公平７−１１４７０７号公報に記載された如く、ＰＯの活性化度の測定（生成するキノリン色素を測定する方法、Ｌ−β−（３，４−ジヒドロキジフェニル）アラニン（ＤＯＰＡ）の酸化によって生成するメラニン色素を測定する方法等）、ＢＡＥＥａｓｅ活性の測定ならびに特開平７−１８４６９０号公報に記載された如く、ＰＰＡＥ活性を測定する方法等を用いればよい。
なお、上記のようなリムルス試薬及びフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬は、液体、粉末、固形物等のいずれの形態であってもよい。
本発明方法を用いることにより、血清、血漿、組織液など体液の他、水、試薬、医薬品及び医薬品製造工程などにおけるサンプリングによる検体中のＢＧを測定することが可能である。
（５）本発明キット
本発明キットは、少なくとも本発明ＢＧあるいは本発明ＢＧ組成物を標準物質として含有することを特徴とするＢＧ測定用キットである。
本発明キットは、上記本発明測定法を実施するためのキットであり、標準物質として利用するための上記本発明ＢＧあるいはそれを安定化した本発明ＢＧ組成物をキット中に含むことを特徴とする。本発明キットには、さらに本発明測定法を実施するための測定試薬であるリムルス試薬又はフェノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬を含むことが好ましい。また、その他キット中には例えばＢＧの混入のない（ＢＧフリー）蒸留水、ＢＧの付着のない（ＢＧフリー）９６ウェルマイクロプレートなどを包含しても良い。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
菌体の培養
カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＩＦＯ１３８５）を５ＬのＣ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（炭素源としてｓｕｃｒｏｓｅを含む）にて２７°Ｃで４８〜７２時間液体培養し（ジャーファメンター使用；攪拌速度：４００ｒｐｍ）、アセトン処理、脱脂した後、乾燥菌体１７．９ｇを得た。
実施例２
ＢＧの調製
脱脂乾燥菌体１ｇに０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液２００ｍＬを加えて懸濁し、ＮａＣｌＯ（アンチホルミン、Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅ，ａｎｔｉｆｏｒｍｉｎ；Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｃｈｌｏｒｉｎｅ：ｍｉｎ ５．０％、和光純薬工業株式会社製）をそれぞれ２５、５０、１００、２００ｍＬ添加して、４℃で一夜撹拌し酸化分解した。酸化物を３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し沈殿物を得、ＢＧを含まない蒸留水２００ｍＬを加え、撹拌後遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分）し、その沈殿物にアセトン２００ｍＬを加え脱水沈殿物を得た。該沈殿物にＤＭＳＯ ３０ｍＬを加え、１時間超音波をかけて溶解させた。３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を得、該上清に２倍量のエタノールを撹拌しながら加えＢＧを析出させた後、該析出物を３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、沈殿物を得た。該沈殿物にアセトンを１００ｍＬ加え撹拌し、３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して脱水した沈殿物を得、減圧乾燥してＢＧの粉末を得た。
また、同様の方法により、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓ）からＢＧ（レンチナン）の精製粉末を得た。
実施例３
［力価測定］
実施例２記載の各ＮａＣｌＯ量の使用により得られた本発明ＢＧの粉末を０．３ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ水溶液に１．０ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、その後０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液で適宜希釈した希釈液を調製し試料とした。該試料、ブランク液（ＢＧフリー蒸留水）各々２５μＬをトキシペットプレート９６Ｆ（エンドトキシン、ＢＧフリーの９６ウェルマイクロプレート；生化学工業（株））の所定のウェルに分注し、ファンギテックＧテストＭＫ（ＢＧ特異的リムルス試薬；生化学工業（株））溶液を１００μＬ添加後、蓋を被せてウェルリーダーＳＫ６０１（恒温槽と解析プログラム内蔵のマイクロプレートリーダー；生化学工業（株））にセットし、３７℃、３０分間のカイネティックアッセイを行い試料の力価を測定した。その結果を図１に示した。本発明ＢＧは、従来法によってシイタケから調製したＢＧであるレンチナンと比して高い力価を有することが明らかとなった。
実施例４
［エンドトキシン含量の測定］
実施例２記載の本発明ＢＧ粉末を０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液に１．０ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、その後０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液で適宜希釈して試料とした。実施例３と同様に、各々２５μＬをトキシペットプレート９６Ｆ（エンドトキシン、ＢＧフリーの９６ウェルマイクロプレート；生化学工業販売）の所定のウェルに分注し、エンドスペックＥＳテストＭＫ（エンドトキシン特異的リムルス試薬；生化学工業販売）溶液を１００μＬ添加後、ウェルリーダーＳＫ６０１にて、３７℃、３０分間のカイネティックアッセイを行い試料中のエンドトキシン含量を測定した。その結果（表１）、すべての検体において、エンドトキシンの混入は認められなかった。
［純度測定］
（１）フローサイトメトリーによるマンナン混在量の定量分析
実施例１に記載のアセトン処理乾燥カンジダ菌体（対照）と本発明における２５ｍｌのＮａＣｌＯで処理した菌体（処理）のＰＢＳ懸濁液に抗マンナン抗体［抗カンジダｔｙｐｅｌ血清（ＲＭ３０２−１）；カンジダ同定用因子抗体キット（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｈｅｃｋ、ＲＭ３０２−Ｋ２５）使用；Ｉａｔｒｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｌｏｔ．Ｓ６７８）とＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体［Ａｎｔｉ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｇｏａｔ），Ｆ（ＡＢ’）、ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（０１１−１２６２１）、Ｗａｋｏ］を添加し、フローサイトメトリー［ＦＡＣＳ Ｃａｒｉｂｕｒ ＴＭおよび解析ソフトＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ ＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＣＡ）によるマンナン抗原の定量分析を行った（図２）。この結果より、処理菌体は対照に比べ、蛍光強度の顕著な低下が見られ、明らかにマンナン抗原の消失が認められた。
（２）糖組成の分析
実施例２に記載の方法を用いてカンジダ属の菌体から製造した本発明ＢＧ２ｍｇを、常法（Ｔｏｒｅｌｌｏ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９８０，２０２，１９５−２０９）に準じて２Ｎトリフルオロ酢酸で１２１℃、９０分処理し、水素化ホウ素ナトリウムで処理してアセチル化したのちに、ＤＢ−２２５コートしたキャピラリータイプのガスクロマトグラフィー（大倉ＧＣ１０３Ｃ）にて構成糖の微量分析（分析温度：２２０℃）をおこなった（表２）。その結果、ＢＧとマンナンの比は１：０．０５以下となり、本発明ＢＧ中に混入したマンナン量はきわめて微量であることが明らかとなった。
実施例２に記載の本発明によるＢＧ（ＮａＣｌＯ２５ｍｌ使用）をＤＭＳＯ−ｄ６（Ｍｅｒｋ、Ｆ．Ｒ．Ｇｅｒｍａｎｙ）に溶解し、１３Ｃおよび１Ｈによる高分解能ＮＭＲ（ＤＲＸ５００および解析ソフトＸＷＩＮ−ＮＭＲ、Ｂｒｕｋｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に供した（分析温度：７０℃）。
それぞれの化学シフト（表３）より、該ＢＧは直鎖のβ−１，３−と直鎖のβ−１，６結合を含むことが判明し、１３Ｃ化学シフトから分枝型１，３−結合はほとんど含まれないことが推定された。なお、１，３結合に対する１，６結合の割合は、菌種や処理条件によっても異なるが、実施例２において得られた本発明ＢＧでは、１：０．４３８という分析値が得られた。
生理活性測定
（１）抗腫瘍活性の測定
５×１０６個のマウス固形癌細胞Ｓ−１８０をマウスに皮下投与し、実施例２で調製したカンジダ由来のＢＧ（本発明ＢＧ）、シイタケ由来の市販のレンチナン、及び対照としての生理食塩水を１００μｇずつ７，９，１１日後に腹腔内投与し、その３５日後にマウスから癌組織を摘出して重量を測定した（表４）。
健常人の末梢血から採取した好中球に、実施例２で調製したカンジダ由来のＢＧ（本発明ＢＧ）、シイタケ由来の市販のレンチナン、及び対照としての生理食塩水を添加して培養後、２４時間後に培養上清中のＩＬ−８量をＥＬＩＳＡ法により測定した（表５）。
ＢＧの安定性試験
実施例２で得られた本発明ＢＧを５００ｐｇ／ｍＬ含有する０．０１Ｍ ＮａＯＨ水溶液を調製し、デキストラン（分子量４０，０００）を０．４％（Ｗ／Ｖ）で添加した試料（検体１）、上記本発明ＢＧ溶液に水素化ホウ素ナトリウムを１０ｍＭとなるよう添加した試料（検体２）及び検体１に水素化ホウ素ナトリウムを１０ｍＭとなるよう添加した試料（検体３）の安定性を実施例２の方法により測定した（表６）。対照として上記本発明ＢＧを含むＮａＯＨ水溶液を用いた。検体１〜３全ての検体で安定性の向上が見られたが、水素化ホウ素ナトリウムをデキストランと併用することにより、それぞれ単独で用いた場合と比して更に本発明ＢＧの安定性が増した。
実施例８
ＢＧ測定用キット
（１）安定化ＢＧ（実施例２で作成した本発明ＢＧ５００ｐｇ／ｍＬを含有する０．０１Ｍ ＮａＯＨ水溶液１ｍＬに４ｍｇのデキストラン及び４ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを溶解後、凍結乾燥した粉末）
（２）ＢＧ特異的リムルス試薬
（３）９６ウェルマイクロプレート（ＢＧフリー） １枚
（４）蒸留水（ＢＧフリー） １０ｍＬ
測定
実施例２の方法によりシイタケから得られたレンチナンの粉末を用い実施例２の方法において本発明キットによって測定を行った。その結果、ばらつきのない安定した測定値が得られた。
産業上の利用可能性
本発明により、カンジダ属等の真菌の菌体より、種々の生物活性を有するＢＧを大量に可溶化、精製することが可能となり、高純度のＢＧの入手が容易になった。また、上記調製方法を用いてカンジダ属の菌体よりＢＧを単離し、当該ＢＧの活性を安定に保持する方法を提供し、更に前記ＢＧあるいは安定化された上記ＢＧを標準物質として使用することにより、正確で再現性の高いＢＧ測定方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は各酸化度の本発明ＢＧの力価を示す図である。
図２は実施例５における、対照（アセトン処理菌体）と本発明により処理した菌体の各々のフローサイトメトリーによるマンナン抗原の定量分析の結果を示す図である。
図３は、本発明ＢＧの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
Claims (5)
- 真菌の菌体をアルカリ性条件下において酸化分解して該菌体の細胞壁から（１→３）−β−Ｄ−グルカンを遊離させることを特徴とする（１→３）−β−Ｄ−グルカンの調製法。
- 酸化分解を次亜塩素酸塩により行うことを特徴とする請求項１に記載の調製法。
- 酸化分解により生じる水不溶性画分を非プロトン性極性溶媒に溶解する工程を含むことを特徴とする請求項１又は２記載の調製法。
- 非プロトン性極性溶媒がジアルキルスルホキシドであることを特徴とする請求項３記載の調製法。
- 真菌が、カンジダ属に属する微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の調製法。
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