WO1999011671A1

WO1999011671A1 - PREPARATION DE (1→3)-β-D-GLUCANE A PARTIR DE CHAMPIGNONS

Info

Publication number: WO1999011671A1
Application number: PCT/JP1998/003882
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Tamura; Maki Aizawa; Shigenori Tanaka
Original assignee: Seikagaku Corporation
Priority date: 1997-09-01
Filing date: 1998-08-31
Publication date: 1999-03-11
Also published as: EP1024147A1; DE69836496T2; DE69836496D1; JP4071438B2; EP1024147B1; US6284885B1; EP1024147A4

Description

明細書

真菌からの（1→3)- - D-グルカンの調製法技術分野

本発明は真菌の菌体から（1→3)- - D-グルカンを簡便な方法により効率よく調製するための方法、当該方法を用いて調製した（1→3)- ^-D-グルカン、及びその使用法に関する。詳細にはカブトガニ · ァメボサイト · ライセ一卜の G因子系および Zまたは節足動物の体液のフエノール酸化酵素前駆体カスケ一ド系を活性化する（1→3)- /3- D-グルカンを、真菌の一種であるカンジダ属の菌体の細胞壁から簡便かつ効率良く調製するための新規調製方法、それにより得られる（1→3)-/3 - D -グルカン及び、その（1→3)- 3-D-グルカンの（1→3)- /3- D-グルカン測定への使用に関する。背景技術

(1→3)-/3- D-グルカンは酵母、カビ、キノコ等の真菌類、植物などの細胞壁成分として、自然界に広く分布している糖鎖である。

(1→3)- - D-グリコシド結合を含むグルカンとしては、（1) (1→3)- 3- D-グリコシド結合のみからなる直鎖状のグルカン（力一ドラン（Curdlan)、パラミロン（ Paramylon)等）、（2) (1→6)-；5 - D-グリコシド結合と（1→3)- - D-グリコシド結合を含むグルカン、（3)(1→4)-/S- D-グリコシド結合と（1→3)- ^-D-ダリコシド結合を含むグルカン（リケナン（Lichenan)類、ォォムギ胚乳中のグルカン等）に分類され、更に（2) のグルカンは、（2-1) ジグザグ構造を有するァラメ属褐藻類由来のラミナラン（Laminaran)、 (2-2) 分枝を有するジグザグ構造からなるコンブ属褐藻類由来のラミナラン、（2-3) 多分枝樹状構造を有する大部分の菌類又は藻類の細胞壁由来のグルカン、（2-4) 短鎖分枝構造を有するスクレ口タン（Scler otan)、シゾフィラン（Schizophyllan)、レンチナン（Lentinan)等、（2- 5) 分枝反復構造を有するパン酵母やカンジダ属の細胞壁由来のグルカンなどに細かく分類することができ、多様な構造が存在する（Aketagawa, J.， Tamura, H. , and Tanak a，S.， J. Antibact. Antifung. Agents, 23, 7， 413-419(1995)) 。本明細書においては（1→3) - /3 -D-グリコシド結合を含むグルカンを「（1→3) - /3 -D-グルカン」（以下、 B Gと記載する）と称する。 B Gはマクロファージからの各種サイト力インの産生誘導等を含む網内系の活性化、補体系の活性化、抗腫瘍活性（例えばシィタケから調製されたレンチナン及びスェヒロタケから調製されたシゾフィランなどは、抗腫瘍活性を示す医薬として現在販売されている）等の多彩な生物活性を示す。

また、当該物質群がアレルギー性呼吸器疾患の原因物質の一つとして挙げられている他、 B Gがエンドトキシンと共に体内に入った場合、エンドトキシンの作用を増強するという報告もあり、異物として血中に流入することは好ましいことではなく、医薬品ならびに医療用具等への B Gの混入も医療上重大な問題になりつつある。

また、上記 B Gは真菌細胞壁に共通して存在する構成成分の一つであるため、当該物質が検出されることは、真菌由来の他の有毒な成分が混入している可能性を示すものであり、 B G測定の真菌検出あるいは真菌否定試験への適用についても検討が開始されている。さらに微生物や各種動物由来の培養細胞を用いた医薬口の製造や、マクロファージ系細胞を用いての種々のメディェ一夕一に関する研究が盛んになり、その培養時における微生物汚染はもとより、 B Gの汚染の鋭敏なチックならびにそれらの汚染による細胞への影響等を検討することが重要となっている。

一方、従来よりェンドトキシン試験法として用いられてきたカブトガニ · ァメボサイト · ライセ一ト（以下ライセ一トとも記載する）から調製されたリムルス試薬が、 B Gを認識し、 B Gにも反応することが明らかにされ、ライセート由来の BG感受性因子（G因子）系を用いた BG特異的リムルス試薬が開発されて深在性真菌症の診断薬として保険収載されている。また、カイコ等の節足動物の体液から調製されたフノール酸化酵素前駆体カスケ一ド因子含有試薬も同様に B Gを認識して B Gにも反応することが明らかにされた（以下、リムルス試薬及びフエノ一ル酸化酵素前駆体カスケ一ド因子含有試薬を併せて B G測定試薬と記載する

) α

臨床の現場における、 B Gの測定の目的は、真菌類による汚染の有無を検証するために行われているため、このような背景から B Gの測定のための標準物質は、適切な真菌由来の物質であることが望まれ、真菌由来の適切な標準物質の調製法の開発が強く望まれている。しかし、カンジダ属等の真菌が有する B Gには、マンナンが大量に混入しており、またェンドトキシンに代表される発熱物質の混入が避けられず、上記測定の標準物質として充分な純度を有する B Gであって、測定試薬への反応性が高レ、 B Gは得られていなかったため、 B Gの測定のための標準物質としては従来は力一ドラン（グラム陰性菌由来：真菌とは別に分類される細菌）等が使用されていた。

真菌菌体の細胞壁の構成成分である B Gを調製する従来の方法としては例えば ①菌体をフレンチプレス等による物理的処理を行った後、プロテアーゼで消化し

、タンパク質やマンナンを除去して細胞壁部分を取り出す工程、 ②該細胞壁を高濃度のアル力リ又は酸を用いてォ一トクレーブ等により高熱処理して粗 BGを抽出する工程、 ③粗 BG液を中和および Zまたは透析等による脱塩後、エタノール等の有機溶媒添加によって BGを析出させ、該析出物（沈殿物）を遠心分離等により得、アセトン等の有機溶媒による脱水後遠心分離等により沈殿物を得、減圧乾燥等により粉末化する方法等が用いられていた（特開平 3- 1 19995等）。

上述のように、特に B Gをより高感度で検出するために多種の試薬及び測定方法が開発されているため、その標準物質としてリムルス試薬ゃフヱノ一ル酸化酵素前駆体カスケ一ド因子含有試薬に安定に反応する B Gが必要とされているにも関わらず、従来のそのような B Gの調製方法は非常に多くの工程を必要とし、かつ高熱下で高濃度のアル力リと酸を用いる等々、極めて繁雑かつ危険性を伴う方法であった。また、前述の方法によって得た B Gは、マンナンなどの混入が多く、純度が低いために安定性に欠け、 B Gの測定において標準物質として使用した際には反応性が低く安定した測定値を得る障害となっていた。そこでより純度が高く安定性が高い B Gを、真菌の菌体から調製する方法が大いに期待されていた

発明の開示

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねることにより、簡便で効率よく、 B G測定試薬に対する反応性が高く高純度の B Gを真菌の菌体から調製する方法を見出し、当該方法で特にカンジダ属に属する菌体から調製された B G が驚くべきことに、従来 B Gへの混入の防止が困難であったマンナンゃェンドトキシンをほとんど含まないことを見出すことで本発明を完成した。即ち、カンジダ等の真菌を菌体のままアル力リ条件下で酸化分解することによるため、真菌の菌体から細胞壁部分を取り出した後に精製するという煩雑な操作の必要がなく、簡便で効率の良い、かつ安全で高純度な B Gの調製法を確立することに成功した o

また、上記方法によって真菌の菌体から得られる高純度の B Gを標準物質として使用することで検体中の B Gの測定において、より安定で正確に測定することが可能となることを見出した。

さらに、上述のカンジダ属等の真菌から得られる高純度の B Gをより安定化する方法を見いだし、この方法により安定化された前記 B Gを上記 B G測定の標準物質として使用することでより安定で精度が高い測定が可能となった。

本発明は以下の構成からなる。

1 . 真菌の菌体をアル力リ性条件下において酸化分解して該菌体の細胞壁から B Gを遊離させることを特徴とする B Gの調製法。

2 . 酸化分解を次亜塩素酸塩により行うことを特徴とする前記 1 . に記載の調製法。

3 . 酸化分解により生じる水不溶性画分を非プロトン性極性溶媒に溶解する工程を含むことを特徴とする前記 1 . 又は 2 . 記載の調製法。

4 . 非プロトン性極性溶媒がジアルキルスルホキシドであることを特徴とする前記 3 . 記載の調製法。

5 . カンジダ属に属する微生物の菌体をアル力リ性条件下において酸化分解して該菌体の細胞壁から遊離することにより得られることを特徴とする非プロトン性極性溶媒に可溶な B G。

6 . 酸化分解を次亜塩素酸塩により行うことを特徴とする前記 5 . 記載の B G。

7 . 非プロトン性極性溶媒がジアルキルスルホキシドであることを特徴とする前記 5. 又は 6. 記載の BG。

8. マンナンの混入率が 5. 0 % (モル比）未満であることを特徴とする前記 5. 〜7. いずれか一項記載の BG。

9. エンドトキシン含量が O.lpg/mg未満であることを特徴とする前記 5. 〜 8. に記載の BG。

1 0. BG力く、カブトガニ ·ァメボサイト · ライセ一卜の G因子系および/ または節足動物の体液のフノール酸化酵素前駆体カスケ一ド系を活性化できる BGであることを特徴とする前記 5. 〜9. いずれか一項記載の BG。

1 1. 前記 5. 〜1 0. のいずれかに記載の B Gと、カブトガニ ·ァメボサイト .ライセー卜の G因子系もしくは節足動物の体液のフエノール酸化酵素前駆体カスケ一ド系を活性化しない賦形剤、および Z又は水素化ホウ素アル力リ金属塩を含有する BG組成物。

1 2. 凍結乾燥物であることを特徴とする前記 1 1. 記載の BG組成物。

1 3. 前記 5. 〜1 0. のいずれかに記載の B Gあるいは前記 1 1. 又は 1 2. に記載の BG組成物を標準物質として用い、リムルス試薬又はフヱノール酸化酵素前駆体カスケ一ド因子含有試薬により検体中の BG量を測定する方法。

1 4. リムルス試薬が BG特異的リムルス試薬であることを特徴とする前記 1 3. 記載の BG量を測定する方法。

1 5. フニノール酸化酵素前駆体カスケ一ド因子含有試薬が節足動物の体液から調製されたことを特徴とする前記 1 4. 記載の BG量を測定する方法。

1 6. 少なくとも前記 5. - 1 0. のいずれかに記載の BGあるいは前記 1 1. 又は 1 2. 記載の BG組成物を標準物質として含有することを特徴とする B G測定用キット。

1 7. 更にリムルス試薬又はフヱノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬を含むことを特徴とする前記 1 6. に記載の BG測定用キット。

(発明の実施の形態）

以下に本発明を実施の形態により説明する。

( 1 ) 本発明調製法本発明調製法は、真菌の菌体をアル力リ条件下において酸化分解して該菌体の細胞壁から B Gを遊離させることを特徴とする B Gの調製法である。

本発明調製法においては、 B G測定試薬が認識する（1-3) - D-グリコシド結合が多く含まれる B Gを、その細胞壁に含有する真菌、好ましくはカンジダ属に属する微生物の菌体、最も好ましくは、カンジダアルビカンス（Candi da Albi cans) を使用する。培養液等から分離された上記菌体を生菌体のまま使用しても良いが、菌体を公知の方法で脱脂、及び Z又は乾燥したものを使用することも可能でめる。

真菌の菌体をアル力リ性水溶液（水酸化ナ卜リウム水溶液、水酸化力リウム水溶液、水酸化マグネシウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液等： 0. 01〜0. 3mol/L ) に 0 . 1〜 1 0 0 m g Zm 1で懸濁して菌体に含まれるェンドトキシンを失活させるとともに、該水溶液を適当な酸化剤（例えば次亜塩素酸塩、過ヨウ素酸塩など）を加えて酸化分解を行うことが好ましい。酸化剤としては、特に次亜塩素酸塩（例えば次亜塩素酸リチウム、次亜塩素酸ナトリゥム及び次亜塩素酸力リゥムなど）が好ましく、次亜塩素酸ナトリウム（以下 NaCIOと記載する）が最も好ましいがこれに限定はされない。

例えば酸化剤として NaCIOを用いる場合、菌体をアルカリ水溶液に懸濁し、適当量の NaCIOを懸濁液に加え、撹拌して酸化分解反応を進めることが好ましい。添加する NaCIO濃度は、 NaCIOが水溶液中で分解することがあるためその保存状態で変化しうるが、あえて例示するのであれば、反応時に 0. 3 〜10% (反応時有効塩素含量）となるように調整すればよい。その際の温度と処理時間によって酸化分解の程度は異なるが、通常は 0〜37°C、好ましくは 2〜8°C、例えば 4°Cの条件下で、 1〜24時間、好ましくは 5〜15時間程度反応させることがより好ましいが特に限定はされない。

上記のとおり、菌体の酸化分解反応をァルカリ性の条件下で行うことにより、 B Gを含む不溶性画分中のェンドトキシンを失活させるとともに、マンナンを溶解させて不溶性画分から除くことができる。

上記酸化分解によって力ンジダ属等の真菌の菌体から遊離した B Gは該反応溶液中に不溶性であり、溶液から不溶性画分を回収することにより該反応溶液に可溶性画分（マンナン等弱アルカリ性溶液溶解性の物質及び酸化剤を含む）との分離がなされる。不溶性画分の回収は、通常の固液分離手段、例えば濾過或いは遠心分離などの公知の一般的な方法によって行うことができるが、特に遠心分離処理が好ましい。

さらに、反応溶液を透析等によって脱塩した後に上記固液分離手段により不溶性画分を回収することも可能である。

目的の B Gを更に高度に精製するために、当該不溶性画分を、適切な方法で溶解し、その溶液から多糖類を常法により析出させて沈澱として回収すればよい。上記溶解の方法としては例えば上記不溶性画分をァセトン等の有機溶媒によって脱水処理後、非プロトン性極性溶媒に溶解する方法が例示される。非プロトン性極性溶媒としては、目的の B Gが有するリムルス試薬などへの反応性を保持しつつ、上記 B Gを溶解することができる水溶性の該有機溶媒であることが好ましい力^ 特に限定されるものではない。非プロトン性極性溶媒としては、ジアルキルスルホキシド、ジアルキルホルムアミド又はへキサアルキルホスホルアミドが好ましく、具体的には、例えばジメチルスルホキシド、ジェチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド及びへキサメチルホスホルアミド（HMPA) 等が挙げられるが、その中でもジメチルスルホキシド（以下 DMS0と略記する）が最も好ましい。上記不溶性画分に非プロトン性極性溶媒を加え、 B Gを溶解する。その際、超音波処理などを行うことにより菌体の抽出残渣を破砕し、 B Gを十分に抽出すると共に、 B Gを溶解することができる。当該不溶物を遠心分離等によって除去し、上清液にエタノール等の極性有機溶媒を加えて B Gを析出せしめ、遠心分離等によつて沈殿物として回収することができる。沈殿物をァセトン等の有機溶媒によつて脱水、乾燥させ粉末化することによって水分含量が低く、高純度で、安定な B G粉末を得ることができる。

上述の操作によって得られる B Gの、 B G測定試薬に対する反応性、即ち力価は、例えば市販のリムルス試薬や節足動物の体液から調製された市販のフエノ一ル酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬等を用いて検定する。そして、目的に応じた力価のものを下記記載の本発明測定法において検体中の B G測定のための標準物質として用いればよい。 ( 2 ) 本発明 B G

本発明 B Gは、カンジダ属に属する真菌の菌体をアル力リ性条件下において酸化分解して該菌体の細胞壁から遊離させることにより得られる非プロトン性極性溶媒に可溶な B Gである。

本発明 B Gの純度としては、混入しているマンナンの量が B Gの量と比較して 5. 0% (モル比）未満であることが好ましい。本発明調製法により、カンジダ菌体から調製された B Gは、混入しているマンナンの量が 5% (モル比）未満に保たれている。

上記本発明 B Gの純度の測定法としては Tore l l o LA e t al.， J. Chromatograp hy， 1980, 202, 195- 209の方法が挙げられる。すなわち本発明 B G 2mgを 2Nトリフルォロ酢酸で 121°C、 90分で処理後、水素化ホウ素ナトリウムで処理してァセチル化したのちに、 DB-225コートしたキヤビラリータイプのガスクロマトグラフィ一（大倉 GC103C : 分析温度： 220°C) にて構成糖の微量分析でおこなう。

また、本発明 B Gに混入するェンドトキシン量は 0. lpg/mg未満であることが好ましい。本発明調製法により、カンジダ菌体から調製された B Gはエンドトキシン含量は 0. lpg/mg未満であり、ェンドトキシン測定用のリムルス試薬で検出不能となる。

エンドトキシン含量の測定は常法に従ってリムルス試験によって行われるが、例えば、本発明 B G粉末を 0. 3mo l/L NaOH 水溶液に 1. 0mg/mLになるように溶解し、その後 0. 01mol/L NaOH水溶液で適宜希釈して試料とし、各々 25 z Lをトキシぺットプレート 96F (エンドトキシン、 B Gフリ一の 96ウェルマィクロプレート；生化学工業（株））の所定のゥヱルに分注し、ェンドスぺック E Sテスト MK ( エンドトキシン特異的リムルス試薬；生化学工業販売）溶液を 100 / L添加後、ゥヱルリーダ一 SK601 (生化学工業（株））にて、 37°C、 30分間の力イネティックアツセィを行い B G中に混在するェンドトキシン量を自動定量することができる o

カンジダ属の菌体から本発明方法によって得られる本発明 B Gは、 B G測定試薬への反応性が高く、後述の B G検出試薬による B Gの測定時に標準物質として使用すると安定な測定値が得られる。リムルス試薬を用いる合成基質法による B G測定法において、本発明 B Gは、 1 8 /111 1ぁたり 0 . 2 m A b s Z分以上の光吸度変化率を示すことが好ましいが、特に限定はされない。

本発明 B Gは、カンジダ菌体を、アルカリ性条件下において酸化分解した後、遊離した B Gを非プロトン性有機溶媒で抽出する本発明調製法により製造することができる。上記酸化分解は、本発明調製法において記載したとおり、公知の一般的な酸化剤を使用することが可能であり特に限定はされないが、その中でも次亜塩素酸ナトリウムが好ましい。また、非プロトン性極性溶媒としては、アルキルスルホキシド、ジアルキルホルムアミド又はへキサアルキルホスホルアミドが好ましく、例えばジメチルスルホキシド、ジェチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド及びへキサメチルホスホルアミド（HMPA) 等が挙げられるが、その中でも特にジメチルスルホキシドがより好ましい。

( 3 ) 本発明 B G組成物

本発明 B G組成物は上述の本発明 B Gと、カブトガニ ·ァメボサイト . ライセ一卜の G因子系もしくは節足動物の体液のフエノール酸化酵素前駆体カスケ一ド系を活性化しない賦形剤及び Z又は水素化ホウ素アル力リ金属塩を含有する液体又は粉末の B G組成物である。

上記賦形剤は、医薬品やその他薬剤等に使用される公知の賦形剤であれば特に限定はされない。このような物質としては例えばデキストラン、ショ糖、フィコール、マンニトール又はグリセリン等のような（l→3)- /3 -D-グリコシド結合を有さない物質であれば使用することができる。その中でも、特に本発明 B Gの安定性を向上させる効果を有するデキストランが好ましい。例えば、デキストランを本発明 B Gに添加する場合は、 0. 1〜2 W/V)、好ましくは0. 3〜0. 7；¾(¾^)となるように添加する。

また、上記水素化ホウ素アルカリ金属塩としては水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素ナトリウム及び水素化ホウ素力リウムなどが挙げられ、特に限定はされないが、水素化ホウ素ナトリウムが好ましい。水素化ホウ素ナトリウムの場合、組成物中 lmM〜100mM、好ましくは 5mM〜20mMとなるように添加することにより本発明 B Gを安定化することができる。本発明 B G組成物溶液をそのまま保存し B G測定の標準物質として使用することが可能であるが、凍結乾燥等の乾燥手段で粉末とすることにより保存時における安定性がさらに向上するためより好ましい

( 4 ) 本発明測定法

本発明測定法は、上記本発明 B Gあるいは上記本発明 B G組成物を標準物質として用い、リムルス試薬又はフェノ一ル酸化酵素前駆体カスケ一ド含有試薬により検体中の B G量を測定する方法である。

本発明測定法に使用されるリムルス試薬としては、カブトガ二のァメボサイト (血球細胞）から抽出されたライセ一トを原料として得られた G因子系反応因子を含む試薬であれば、いずれも使用できる。このようなリムルス試薬としては具体的には、リムルス ' ポリフエムス、タキプレウス · トリデン夕ッス、タキプレウス . ギガス、タキプレウス（カルシノスコルピウス） · 口ッンディ力ウダ等のカブトガ二の血リンパ液から、公知の方法（例えば、 J. B i ochem.， 80， 101 1 - 1021 ( 1976)で調製した通常のライセート、エンドトキシン感受性因子（C因子）を除去又は不活性化した BG特異的ライセ一ト、及びさらにこれらのライセー卜に合成基質を加えて調製した BG特異的試薬（特開平 4- 285859等）などの合成基質法リムルス試薬などが挙げられる。

また、本発明測定法に用いられるリムルス試薬は、通常のライセ一トまたは C 因子を除去又は不活化した BG特異的ライセートを主成分とするゲル化法リムルス試薬やゲル化反応を応用した比濁法リムルス試薬であってもよい。

本発明測定法に使用されるフエノール酸化酵素前駆体カスケ一ド因子含有試薬としては、節足動物等の体液を原料として得られた BG系反応因子を含む試薬であれば、特に限定はされないが、カイコの体液から調製されたペプチドグリカンと B Gに反応する市販の試薬（例えば、 SLP試薬（和光純薬工業（株）製）も使用することができる。上記試薬による反応の検出方法は、公知の方法、すなわち、発現するベンゾィルアルギニンェチルエステル加水分解酵素（BAEEase) 、プロフヱノールォキシダーゼ活性化酵素（PPAE) 、フヱノールォキシダ一ゼ（P0) 等の酵素活性を測定するかあるいはこれらの酵素活性の発現時間を測定する方法等を用いればよい。例えば、特開平 1 - 142466号公報および特公平 7- 114707号公報に記載された如く、 P0の活性化度の測定（生成するキノリン色素を測定する方法、 L - ^ -（3， 4-ジヒドロキシフヱニル）ァラニン（D0PA) の酸化によって生成するメラニン色素を測定する方法等）、 BAEEase活性の測定ならびに特開平 7- 184690号公報に記載された如く、 PPAE活性を測定する方法等を用いればよい。

なお、上記のようなリムルス試薬及びフェノール酸化酵素前駆体カスケ一ド因子含有試薬は、液体、粉末、固形物等のいずれの形態であってもよい。

本発明方法を用いることにより、血清、血漿、組織液など体液の他、水、試薬、医薬品及び医薬品製造工程などにおけるサンプリングによる検体中の B Gを測定することが可能である。

( 5 ) 本発明キット

本発明キットは、少なくとも本発明 B Gあるいは本発明 B G組成物を標準物質として含有することを特徴とする B G測定用キットである。

本発明キットは、上記本発明測定法を実施するためのキットであり、標準物質として利用するための上記本発明 B Gあるいはそれを安定化した本発明 B G組成物をキット中に含むことを特徴とする。本発明キッ卜には、さらに本発明測定法を実施するための測定試薬であるリムルス試薬又はフェノ一ル酸化酵素前駆体力スケード因子含有試薬を含むことが好ましい。また、その他キット中には例えば B Gの混入のない（B Gフリー）蒸留水、 B Gの付着のない（B Gフリー） 96ゥエルマイクロプレートなどを包含しても良い。図面の簡単な説明

図 1は各酸化度の本発明 B Gの力価を示す図である。

図 2は実施例 5における、対照（アセトン処理菌体）と本発明により処理した菌体の各々のフローサイトメトリ一によるマンナン抗原の定量分析の結果を示す図である。

図 3は、本発明 B Gの^{1 3} C - NMR スぺクトルを示す。発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例 1

菌体の培養

カンジダ 'アルビカンス（Candida albicans IF01385) を 5Lの C- 1 irdting med ium (炭素源として sucroseを含む）にて 27° Cで 48〜72時間液体培養し（ジャーファメンター使用；攪拌速度： 400rpm) 、アセトン処理、脱脂した後、乾燥菌体 17 .9gを得た。

実施例 2

BGの調製

脱脂乾燥菌体 lgに 0. lmol/L NaOH 水溶液 200mL を加えて懸濁し、 NaCIO (ァンチホノレミン、 Sodium Hypochlorite, antiformin; Available chlorine: min 5 .0%、和光純薬工業株式会社製）をそれぞれ 25、 50、 100、 200mL添加して、 4°Cで一夜撹拌し酸化分解した。酸化物を 3，000rpm、 10分間遠心分離し沈殿物を得、 BG を含まない蒸留水 200mLを加え、撹拌後遠心分離（3，000rpm、 10分）し、その沈殿物にアセトン 200mLを加え脱水沈殿物を得た。該沈殿物に DMS0 30mLを加え、 1 時間超音波をかけて溶解させた。 3，000rpm、 10分間遠心分離し、上清を得、該上清に 2倍量のエタノールを撹拌しながら加え BGを析出させた後、該析出物を 3， 0 OOrpm, 10分間遠心分離し、沈殿物を得た。該沈殿物にアセトンを lOOmL加え撹拌し、 3，000rpm、 10分間遠心分離して脱水した沈殿物を得、減圧乾燥して BGの粉末を得た。

また、同様の方法により、シィタケ（Lentinus edodes) から BG (レンチナン ) の精製粉末を得た。

実施例 3

[力価測定]

実施例 2記載の各 NaCIO量の使用により得られた本発明 B Gの粉末を 0.3mol/L NaOH 水溶液に 1.0mg/mLになるように溶解し、その後 0.01mol/L NaOH水溶液で適宜希釈した希釈液を調製し試料とした。該試料、ブランク液（BGフリー蒸留水 ) 各々 25 / Lをトキシぺットプレート 96F (エンドトキシン、 BGフリーの 96ゥェルマイクロプレート；生化学工業（株））の所定のゥヱルに分注し、ファンギテック Gテスト MK (BG特異的リムルス試薬；生化学工業（株））溶液を 100 zL添加後、蓋を被せてゥエルリ一グー SK601 (恒温槽と解析プログラム内蔵のマイク口プレートリーダー；生化学工業（株））にセットし、 37。C、 30分間のカイネテイツクアツセィを行い試料の力価を測定した。その結果を図 1に示した。本発明 B Gは、従来法によってシィタケから調製した B Gであるレンチナンと比して高い力価を有することが明らかとなつた。実施例 4

[ェンドトキシン含量の測定]

実施例 2記載の本発明 B G粉末を 0. 3mo l/L NaOH 水溶液に 1. Omg/mLになるように溶解し、その後 0. 01mo l/L NaOH水溶液で適宜希釈して試料とした。実施例 3 と同様に、各々 25 Lをトキシぺットプレート 96F (ェンドトキシン、 B Gフリーの 96ゥヱルマイクロプレート；生化学工業販売）の所定のゥヱルに分注し、ェンドスぺック E Sテスト MK (ェンドトキシン特異的リムルス試薬；生化学工業販売 ) 溶液を 100 し添加後、ゥヱルリーダー SK601にて、 37°C、 30分間の力イネティックアツセィを行い試料中のエンドトキシン含量を測定した。その結果（表 1) 、すべての検体において、エンドトキシンの混入は認められなかった。

表 1

エンドトキシン含 j (E. co l i 0111 : B4換算； g/mg) レンチナン 0. 1

NAC 10 200ml 0. 0

NAC 10 100ml 0. 0

NaClO 50ml 0. 1

NaClO 25ml 0. 1 実施例 5

[純度測定]

( 1 ) フローサイトメトリ一によるマンナン混在量の定量分析

実施例 1に記載のアセトン処理乾燥カンジダ菌体（対照）と本発明における 25ml の NaC lOで処理した菌体（処理）の PBS懸濁液に抗マンナン抗体 [抗カンジダ type 1血清（RM302-1); カンジダ同定用因子抗体キット（Candida check 、 RM302-K2 5)使用； Iatron Laboratories, Inc. , Tokyo, Lot. S678) と FITC標識抗ゥサギ I gG (H+L) 抗体 [Anti Rabbit IgG(H+L) (Goat), F(AB，）、

FITC conjugated(011- 12621)、 Wako] を添加し、フローサイトメトリ一 [FACS C aribur TMおよび解析ソフト Cell Quest TM (Becton-Dickinson, CA) によるマンナン抗原の定量分析を行った（図 2) 。この結果より、処理菌体は対照に比べ、蛍光強度の顕著な低下が見られ、明らかにマンナン抗原の消失が認められた。

( 2 ) 糖組成の分析

実施例 2に記載の方法を用いてカンジダ属の菌体から製造した本発明 B G2mg を、常法 (Torello LA et al. , J. Chromatography, 1980, 202, 195-209) に準じて 2Nトリフルォロ酢酸で 121°C、 90分処理し、水素化ホウ素ナトリウムで処理してァセチル化したのちに、 DB- 225コ一トしたキヤビラリ一タイプのガスクロマトグラフィ一（大倉 GC103C) にて構成糖の微量分析（分析温度： 220°C) をおこなった（表 2) 。その結果、 BGとマンナンの比は 1:0.05以下となり、本発明 B G中に混入したマンナン量はきわめて微量であることが明らかとなった。

表 2

C. a : C. albicans C. p : C. parapsilosis

4-3 ¹³ C- NMRおよび ¹ H- NMRによる多糖の構造解析

実施例 2に記載の本発明による B G (NaC1025ml使用）を DMS0- d6 (Merk、 F. R. Germany) に溶解し、 ¹³Cおよび 'Hによる高分解能 NMR (DRX500および解析ソフト X WIN-NMR, Bruker, Germany) に供した (分析温度： 70°C) 。それぞれの化学シフト（表 3 ) より、該 B Gは直鎖の /5- 1， 3-と直鎖の /3- 1， 6結合を含むことが判明し、 '³C化学シフトから分枝型 1，3-結合はほとんど含まれないことが推定された。なお、 1,3結合に対する 1，6結合の割合は、菌種ゃ処理条件によっても異なるが、実施例 2において得られた本発明 B Gでは、 1:0.438という分析値が得られた。

表 3

(図 3参照）実施例 6

生理活性測定

( 1 ) 抗腫瘍活性の測定

5 X10⁶個のマウス固形癌細胞 S- 180をマウスに皮下投与し、実施例 2で調製したカンジダ由来の B G (本発明 B G) 、シィタケ由来の市販のレンチナン、及び対照としての生理食塩水を 100 /gずつ 7, 9， 11日後に腹腔内投与し、その 35日後にマウスから癌組織を摘出して重量を測定した（表 4 ) 。

表 4

( 2 ) ヒト末梢血のインタ一ロイキン（Iい- 8産生能

健常人の末梢血から採取した好中球に、実施例 2で調製したカンジダ由来の B G (本発明 B G ) 、シィタケ由来の市販のレンチナン、及び対照としての生理食塩水を添加して培養後、 24時間後に培養上清中の I L-8量を EU SA法により測定した (表 5) o

表 5

実施例 7

B Gの安定性試験

実施例 2で得られた本発明 B Gを 500pg/mL含有する 0. 01M NaOH水溶液を調製し、デキストラン（分子量 40， 000) を 0. 4 W/V)で添加した試料（検体 1 ) 、上記本発明 B G溶液に水素化ホウ素ナトリウムを 10mMとなるよう添加した試料（検体

2 ) 及び検体 1に水素化ホウ素ナトリウムを 10mMとなるよう添加した試料（検体

3 ) の安定性を実施例 2の方法により測定した（表 6) 。対照として上記本発明 B Gを含む NaOH水溶液を用い。検体 1〜 3全ての検体で安定性の向上が見られたが、水素化ホウ素ナトリウムをデキストランと併用することにより、それぞれ単独で用いた場合と比して更に本発明 B Gの安定性が増した。

表 6

日数

検体 0 3 7 14 対照 100 66 41 13

検体 1 100 100 98 85

検体 2 100 100 99 95

検体 3 100 100 100 99 表中数字は初日（0日）の活性を 100%としたときの相対活性（で示した実施例 8

B G測定用キット

(1)安定化 B G (実施例 2で作成した本発明 B G 500pg/mLを含有する 0. 01M NaO H水溶液 lmLに 4mgのデキストラン及び 4mgの水素化ホウ素ナトリゥムを溶解後、凍結乾燥した粉末）

(2) BG特異的リムルス試薬

(3) 96ゥヱルマイクロプレート（B Gフリー） 1枚

(4)蒸留水（B Gフリー） lOmL

測定

実施例 2の方法によりシィタケから得られたレンチナンの粉末を用い実施例 2 の方法において本発明キッ卜によって測定を行った。その結果、ばらつきのない安定した測定値が得られた。産業上の利用可能性

本発明により、カンジダ属等の真菌の菌体より、種々の生物活性を有する B G を大量に可溶化、精製することが可能となり、高純度の B Gの入手が容易になつた。また、上記調製方法を用いてカンジダ属の菌体より B Gを単離し、当該 B G の活性を安定に保持する方法を提供し、更に前記 B Gあるいは安定化された上記 B Gを標準物質として使用することにより、正確で再現性の高い B G測定方法が提供される。

Claims

請求の範囲

I . 真菌の菌体をアル力リ性条件下において酸化分解して該菌体の細胞壁から (1→3)- /3- D-グルカンを遊離させることを特徴とする（1→3)- yS- D-グルカンの調製法。

2. 酸化分解を次亜塩素酸塩により行うことを特徴とする請求項 1に記載の調製法。

3. 酸化分解により生じる水不溶性画分を非プロトン性極性溶媒に溶解するェ程を含むことを特徴とする請求項 1又は 2記載の調製法。

4. 非プロトン性極性溶媒がジアルキルスルホキシドであることを特徴とする請求項 3記載の調製法。

5. カンジダ属に属する微生物の菌体をアル力リ性条件下において酸化分解して該菌体の細胞壁から遊離することにより得られることを特徴とする非プロトン性極性溶媒に可溶な（1→3)-/3- D-グルカン。

6. 酸化分解を次亜塩素酸塩により行うことを特徴とする請求項 5記載の（1— 3) - /3- D-グルカン。

7. 非プロトン性極性溶媒がジアルキルスルホキンドであることを特徴とする請求項 5又は 6記載の（1→3)- ;5- D-グルカン。

8. マンナンの混入率が 5. 0 % (モル比）未満であることを特徴とする請求項 5〜 7いずれか一項記載の（1→3)-/3- D グルカン。

9. ェンドトキシン含量が 0. lpg/mg未満であることを特徴とする請求項 5〜8 に記載の（1—3) - -D グルカン。

1 0. グルカンが、力ブトガニ ' ァメボサイト · ライセ一卜の G因子系および Zまたは節足動物の体液のフエノ一ル酸化酵素前駆体力スケ一ド系を活性化できるグルカンであることを特徴とする請求項 5〜 9いずれか一項記載の（1—3) -/3- D -グルカン。

I I . 請求項 5〜1 0のいずれかに記載の（1→3)- - D-グルカンと、カブトガ二 · ァメボサイ卜 · ライセ一卜の G因子系もしくは節足動物の体液のフヱノール酸化酵素前駆体カスケ一ド系を活性化しない賦形剤、および/又は水素化ホウ素アル力リ金属塩を含有する（1→3)- グルカン組成物。

1 2. 凍結乾燥物であることを特徴とする請求項 1 1記載の（1→3)- - D-グルカン組成物。

1 3. 請求項 5. 〜 1 0. のいずれかに記載の（1—3)- /3-D-グルカンあるいは請求項 1 1又は 1 2記載の（1→3)- /3-D-グルカン組成物を標準物質として用い、リムルス試薬又はフエノール酸化酵素前駆体カスケ一ド因子含有試薬により検体中の（1→3)- /3- D-グルカン量を測定する方法。

1 4. リムルス試薬が（1→3)- S-D-グルカン特異的リムルス試薬であることを特徴とする請求項 1 3記載の（1→3)- yS- D-グルカン量を測定する方法。

1 5. フノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬が節足動物の体液から調製されたことを特徴とする請求項 1 4記載の（l→3)- S- D-グルカン量を測定する方法。

1 6. 少なくとも請求項 5〜 1 0のいずれかに記載のグルカンあるいは請求項 1 i又は 1 2記載のグルカン組成物を標準物質として含有することを特徴とする (1→3)- 3- D-グルカン測定用キット。

1 7. 更にリムルス試薬又はフエノール酸化酵素前駆体カスケード因子含有試薬を含むことを特徴とする請求項 1 6に記載の（1—3) - /3 -D-グルカン測定用キッ