CN103789254A - 昆虫、昆虫血淋巴及其组装活性物和应用 - Google Patents
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本发明涉及生物技术领域，涉及昆虫、昆虫血淋巴及其组装活性物在激活酚氧化酶原激活系统或/和To11信号传递途径系统中的生物活性及其昆虫、昆虫血淋巴及其组装活性物在微生物及其相关分子模式检测、制备酚氧化酶原激活系统组装活性物、分离纯化抗菌肽中的应用。本发明还提供了一种昆虫血淋巴收集方法及其血淋巴储存方法与条件，在此条件下，昆虫血淋巴的稳定性更好，并能更好地发挥其作用。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，涉及昆虫血淋巴的收集和稳定保存的方法及其应用。具体地说，本发明涉及对含有酚氧化酶原激活系统或/和Toll信号传递途径(系统)组成成分的昆虫血淋巴的收集方法、针对酚氧化酶原激活系统或/和Toll信号传递途径(系统)生物活性稳定的昆虫血淋巴收集方法及其血淋巴储存方法与条件、利用昆虫及其血淋巴的酚氧化酶原激活系统的生物活性以及Toll信号传递系统的生物活性、昆虫血淋巴酚氧化酶原激活系统和Toll信号传递系统的活性成分及其重新组装的生物活性、从昆虫血淋巴获得模式识别受体、级联系统丝氨酸蛋白酶、酚氧化酶及其酶原、抗菌肽等生物活性物质及其生物活性进行微生物检测。
本发明还涉及昆虫血淋巴的生物活性、血淋巴的收集和稳定保存的方法、体外活性组装物的制备、以及昆虫血淋巴及组装活性物的应用。具体地说，本发明涉及对含有酚氧化酶原激活系统或/和Toll信号传递途径(系统)组成成分的昆虫及其血淋巴的研究、获得具有稳定生物活性的酚氧化酶原激活系统或/和Toll信号传递途径(系统)的昆虫血淋巴收集方法及其储存方法与条件、针对昆虫及其血淋巴的酚氧化酶原激活系统的生物活性以及Toll信号传递系统的生物活性研究、针对昆虫血淋巴酚氧化酶原激活系统和Toll信号传递系统的活性成分及其体外组装物的生物活性研究、针对从昆虫血淋巴获得模式识别受体/级联系统丝氨酸蛋白酶/酚氧化酶及其酶原/抗菌肽等生物活性物质及其生物活性的研究，以及上述研究在微生物检测领域的应用。
背景技术：
昆虫血淋巴是其血液和淋巴液的混合物，在昆虫的开放式循环系统中循环，是昆虫代谢的重要场所，也是代谢过程中各种物质储存和交换的场所，在其防御、抗冻、免疫、损伤应答等方面起重要作用。
昆虫血淋巴中含有酚氧化酶原激活系统(Pro-phenoloxidase activatedsystem，Pro-PO-AS)以及由酚氧化酶原激活系统相关的Toll信号传递系统。上述两种免疫系统是昆虫体内的重要的先天性识别和防御系统，在其防卫体系中起极为重要的作用，对入侵昆虫体内的微生物具有很强的识别与杀灭作用。酚氧化酶原激活系统是由各种关联性蛋白因子构成的一个复杂的酶级联反应系统，其主要成分除了酚氧化酶原(Pro-Phenoloxidase，Pro-PO)、酚氧化酶(phenoloxidase，PO)以外，同时包括关联性的各种模式识别蛋白、系列丝氨酸蛋白酶(原)及其相应的各种调节剂；Toll信号传递系统是由酚氧化酶原激活系统调控、激活的一个信号传递系统，由各种关联蛋白因子构成了一个复杂的信号传递系统，除含有与酚氧化酶原激活系统共有的各种模式识别蛋白、系列丝氨酸蛋白酶(原)及其相应的各种调节剂外，亦包含抗菌肽及其诱导合成相关蛋白因子。
酚氧化酶原激活系统(Pro-PO-AS)通过识别微生物固有成分而被激活，随后产生一系列具有生理活性的物质(包括激活Toll信号传递系统)，并通过多种方式参与宿主防御反应：包括提供调理素、促进血细胞吞噬作用、包囊作用、结节形成以及介导凝集和凝固、产生杀菌物质等。昆虫体内Pro-PO-AS的末端成分之一酚氧化酶(Phenoloxidase，PO)以无活性酶原(Pro-PO)形式存在，当昆虫受到微生物感染后，通过激活酚氧化酶原激活系统，将Pro-PO转变为有活性的PO。同时，激活的酚氧化酶原激活系统也可激活Toll信号传递系统，诱导机体产生抗菌肽等免疫活性物质。
在酚氧化酶原激活系统的上游，昆虫对病原体的识别有别于抗原与抗体的特异性结合，不是针对每一个可能的抗原，而是识别在病原体中普遍存在的高度保守的共有结构。这种识别方式被称为模式识别作用。该作用包含两种不可或缺的成分，病原体相关分子模式和昆虫所具有的模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)或称模式识别蛋白。微生物中普遍存在的高度保守的共有结构被称为病原体相关分子模式(也称微生物相关分子模式或简称相关分子模式)。已报道的病原体相关分子模式包括细菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖(Peptidoglycan，PGN)、脂磷壁酸(Lipoteichoic acids，LTA)、分枝杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖、细菌DNA中未甲基化的CpG模体、RNA病毒中的双链RNA和真菌的葡聚糖、甘露聚糖等。尽管这些病原体相关分子模式的化学结构极为不同，但它们具有下列共同特征：(1)由病原微生物产生；(2)属于微生物生存所必需的保守分子模式；(3)通常为一大组微生物所共有。目前已发现的昆虫体内模式识别蛋白，根据其与病原体相关分子模式的识别特点可分为：细菌脂多糖模式识别蛋白；肽聚糖模式识别蛋白；脂磷壁酸模式识别蛋白；真菌葡聚糖模式识别蛋白等等，上述模式识别蛋白亦可称为微生物关联性模式识别蛋白，简称关联性模式识别蛋白和关联性识别蛋白。
对于昆虫体内酚氧化酶原激活系统、Toll信号传递途径及其相关组成成分的研究始于二十世纪90年代，主要集中于果蝇、烟草天蛾、家蚕、黄粉虫等。
在中国专利1149628A中，Ashida提出一种利用家蚕幼虫血淋巴酚氧化酶原激活系统，通过对β-1，3-葡聚糖或肽聚糖含量的测定所建立的简便、快速微生物检测方法。该方法包括把试样滤过一个滤膜，把滤膜上的残留物与含有模式识别受体及酚氧化酶原激活系统相关活性成分的家蚕血液进行反应，根据由此引起的颜色变化检测试样中的微生物。在中国专利1406139A中，Lee bok Luel等人利用黄粉虫模式识别受体及酚氧化酶原激活系统检测真菌特有病原体相关分子模式β-1，3-葡聚糖，并已申报一系列有关黄粉虫模式识别受体和酚氧化酶原激活系统相关活性物质的专利。在中国专利101627052A中，Lee bok Luel等人提供了激活黄粉虫酚氧化酶原的新型蛋白及其编码基因，建立使用该蛋白检测样品中细菌感染的方法并开发相应细菌感染检测试剂盒。
血淋巴离体后极不稳定，物理、化学、生物学等各种因素以及血淋巴收集方法、储存条件等均影响并引起血淋巴内包括酚氧化酶原激活系统在内的免疫系统的激活，从而导致黑化等生物反应。此时，酚氧化酶原激活系统以及Toll信号传递系统及其组分不能被充分利用与应用。同时，如果从昆虫血淋巴中分离纯化制备的酚氧化酶原激活系统以及Toll信号传递系统的活性组分、单体等，也不能充分和更好的利用与应用。
目前，国内外未见对鳞翅目(Lepidoptera)、天(大)蚕蛾科昆虫血淋巴酚氧化酶原激活系统以及Toll信号传递系统等先天性防御机制的研究，因此现有血淋巴收集及储存方法未涉及对其生物活性稳定性的保护。本发明对酚氧化酶原激活系统以及Toll信号传递途径(系统)生物活性稳定的昆虫血淋巴收集及其储存，对激活酚氧化酶原激活系统以及Toll信号传递途径(系统)的昆虫血淋巴收集及其储存等方面，进行了详细、有效、科学的研究。
目前，国内外未见鳞翅目(Lepidoptera)、天(大)蚕蛾科昆虫血淋巴酚氧化酶原激活系统以及Toll信号传递系统组成成分及其生物学活性的研究。本发明对鳞翅目(Lepidoptera)、天(大)蚕蛾科昆虫及其血淋巴的酚氧化酶原激活系统的生物活性以及Toll信号传递系统的生物活性、血淋巴酚氧化酶原激活系统的活性成分及其体外组装的生物活性等方面进行了系统、有效的研究，其研究成果可应用于医学、药学、农学等以及医疗卫生(临床)、公共卫生、生物医药、工业、农业、水产及其养殖业、动物及其养殖业、食品及其加工业、航天航空业等领域不同来源、不同种类、不同条件下的微生物的定性、定量或半定量检测。
发明内容：
本发明提供了鳞翅目(Lepidoptera)、天(大)蚕蛾科昆虫的血淋巴、血淋巴粗提物、酚氧化酶原激活系统体外组装系统、酚氧化酶原激活系统组成成分的制备方法；以及基于上述材料的微生物或其相关分子模式(包括细菌、真菌或其混合物)的检测方法。
本发明提供了一种获得稳定的酚氧化酶原激活系统以及Toll信号传递系统生物活性的昆虫血淋巴的收集方法、同时提供了血淋巴的稳定储存的方法。建立的方法能够在体外有效、充分、更好的利用昆虫血淋巴中酚氧化酶原激活系统及其生物活性或/和Toll信号传递系统及其生物活性。
本发明同时提供了一种激活血淋巴的收集方法，并由此获得抗菌肽等免疫活性物质。
本发明的目的之一，是研究可获得稳定的酚氧化酶原激活系统和Toll信号传递系统的血淋巴收集方法及其储存方法。为血淋巴的后续应用以及酚氧化酶原激活系统或/和Toll信号传递系统的研究提供可靠的原料。
本发明的目的之二，是研究并利用昆虫体内的酚氧化酶原激活系统及其生物活性和Toll信号传递系统及其生物活性的属性，由微生物及其相关分子模式激活酚氧化酶原激活系统，借助酚氧化酶原激活系统的生物活性，实现微生物的检测。
本发明的目的之三，是研究收集所获血淋巴的酚氧化酶原激活系统及其生物活性的属性，由微生物及其相关分子模式激活酚氧化酶原激活系统，通过酚氧化酶原激活系统的生物活性，实现微生物的检测。
本发明的目的之四，是研究从血淋巴中分离纯化制备酚氧化酶原激活系统的关联性蛋白因子、酶(或酶原)等活性组分或/和在体外组装具有酚氧化酶原激活系统生物活性的组装活性物，利用活性组分或/和组装活性物的生物活性，实现微生物的检测。
本发明的目的之五，是利用上述活性物质实现的微生物检测，在医学、药学、农学等以及医疗卫生(临床)、公共卫生、生物医药、工业、农业、水产及其养殖业、动物及其养殖业、食品及其加工业、航天航空业等领域的应用。
本发明的目的之六，是利用激活昆虫收集的血淋巴—激活血淋巴，分离纯化制备抗菌肽等生物活性物质。
一、本发明相关术语说明
1.本发明所指昆虫，是鳞翅目(Lepidoptera)、天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫。涉及天(大)蚕蛾科的昆虫包括：柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕等等。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本发明，本发明以柞蚕为代表描述下列内容，而选择柞蚕作为代表来描述并不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
2.本发明选择鳞翅目(Lepidoptera)天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，其特征在于，是任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。
3.本发明所指昆虫血淋巴(简称血淋巴)，是昆虫血液(或血细胞裂解物)和淋巴液的混合物或/和昆虫压榨或匀浆的体液，其特征在于，包括(1)完整、稳定的酚氧化酶原激活系统及其组分；(2)受酚氧化酶原激活系统所调控、激活的完整、稳定的Toll信号传递系统及其组分。
4.本发明所指酚氧化酶原激活系统及其生物活性，其特征在于，组成成分包括(1)酚氧化酶原；(2)针对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌的模式识别蛋白—关联性模式识别蛋白；(3)酚氧化酶原激活系统关联的系列丝氨酸蛋白酶(原)；(4)酚氧化酶原激活系统关联的调控因子。酚氧化酶原激活系统的生物活性的表现是酚氧化酶原被激活成酚氧化酶或/和激活.Toll信号传递系统。Toll信号传递系统的组分是各种关联性调控因子，其生物活性的特征是抗菌肽等生物活性物质的诱导产生。
5.本发明所指检测的微生物样品，其特征在于，包括(1)微生物(活微生物或死微生物)，(2)微生物相关分子模式，(3)样品来源于医学、药学、农学等以及医疗卫生(临床)、公共卫生、生物医药、工业、农业、水产及其养殖业、动物及其养殖业、食品及其加工业、航天航空业等领域。
6.本发明所指组装活性物，其特征在于，包括(1)通过分离纯化技术去除血淋巴中与酚氧化酶原激活系统生物活性无关的一些组分—杂质；(2)通过分离纯化技术去除血淋巴中抑制酚氧化酶原激活系统生物活性的组分；(3)酚氧化酶原激活系统相关组成成分的体外组装；(4)上述任何一类组装活性物均具有酚氧化酶原激活系统的生物活性。
7.本发明所指血淋巴的生物活性检测，是针对血淋巴的酚氧化酶原激活系统或/和Toll信号传递途径系统被激活，利用本发明所述的微生物感染(或激活)昆虫或微生物模式分子激活昆虫的激活方式、方法等激活酚氧化酶原激活系统或/和Toll信号传递途径系统。通过检测激活的酚氧化酶的活性或/和抗菌肽诱导产生量来实现。酚氧化酶的活性是通过酚氧化酶能够使酚类化合物氧化成醌化合物以及进一步氧化，使血淋巴发生黑化及其程度实现检测。检测体系的温度在10℃-60℃，优选25℃-45℃。检测体系的酸碱度在pH2-pH13，优选pH5-pH9。
8.本发明所指感染(或激活)昆虫(简称激活昆虫)，其特征在于，(1)将剂量和种类不限的微生物或其相关分子模式注入昆虫体内，从注入直至昆虫死亡的任何时间节点的昆虫；(2)昆虫体黑化乃至死亡，同时，体内有诱导的抗菌肽产生，(3)细菌或真菌可以是活菌或死菌。
9.本发明所指激活昆虫血淋巴，其特征在于，从上述激活昆虫中获得的血淋巴，血淋巴的酚氧化酶原激活系统和Toll信号传递系统的组分处于被激活状态，同时含有被诱导产生的抗菌肽等一些生物活性物质。
本发明通过如下基本程序、原则、条件、要求、方法等实现。如下陈述，是使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
二、本发明是通过如下技术方案实现的：
(一)昆虫血淋巴酚氧化酶原系统的生物活性
1.昆虫体内血淋巴酚氧化酶原激活系统对微生物感染的响应
本发明将革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌以及三类微生物的分子模式—肽聚糖、甘露聚糖、脂多糖、脂磷壁酸、β-1，3-葡聚糖分别或同时注入活的昆虫体内后，观察昆虫体表的黑化程度或及昆虫死亡状况。由于昆虫体内存在完整的酚氧化酶原激活系统，因此注入到昆虫体内的微生物可通过激活该系统最终引起酚氧化酶原的活化。有活性的酚氧化酶导致黑色素的产生，引起昆虫体表出现黑化现象。黑化程度可反映黑色素的产生量，后者反映出酚氧化酶的活性，进而反映出酚氧化酶原激活系统的激活程度，乃至微生物或其相关分子模式的剂量，大剂量微生物或其相关分子模式可以使昆虫死亡。
基于本发明可利用昆虫实现对微生物和/或微生物相关分子模式的检测。将待检样品以及空白对照、阳性对照分别注射入昆虫体内，其中，空白对照组的昆虫及其体表正常；阳性对照组则使昆虫体表黑化乃至死亡。待检样品组的昆虫体表，如果与空白对照组的一样，表明样品中不含微生物或其相关分子模式，或样品中所含微量微生物或其相关分子模式的剂量，不足引发昆虫体表黑化；待检样品组的昆虫体表发生了黑化乃至死亡，则表明样品含有微生物或其相关分子模式，通过与阳性对照组比较可进行半定量分析。
本发明中所指微生物及其相关分子模式、昆虫的特征如前所述。
2.体外血淋巴酚氧化酶原激活系统对微生物及其相关分子模式的响应
本发明将革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌以及相应的分子模式—肽聚糖、甘露聚糖、脂多糖、脂磷壁酸、β-1，3-葡聚糖分别或同时与昆虫血淋巴收集液混合，以生理盐水作空白对照。保温一定时间后，进行溶液颜色(黑化)的比较或比色分析。由于血淋巴收集液含有完整、稳定的酚氧化酶原激活系统，因此微生物或其相关分子模式可激活该系统，引起酚氧化酶原的活化。酚氧化酶的活性与微生物或其相关分子模式的含量呈正比。
本发明通过颜色反应测定酚氧化酶的活性，所采用的底物为多巴或多巴胺或4-羟基脯氨酸乙酯盐与4-甲基儿茶酚混合物。酚氧化酶可将多巴或多巴胺转变为黑色素(如图1(A)所示)，肉眼可见颜色变化，且其颜色深浅与酚氧化酶活力呈正比，检测波长为490nm±50nm(优选490nm±10nm)。酚氧化酶可将4-羟基脯氨酸乙酯盐与4-甲基儿茶酚混合物转变为有色产物(如图1(B)所示)，肉眼可见颜色变化，且其颜色深浅与酚氧化酶活力呈正比，检测波长是520nm+50nm(优选520nm±10nm)。因此，通过建立已知剂量的微生物或其相关分子模式与颜色深浅之间的标准曲线，可实现对待检样品组的微生物或其相关分子模式的定性或半定量或定量分析。
本发明所使用的昆虫血淋巴收集液，是按发明所述方法、技术、条件等获得昆虫血淋巴收集液。本发明中所指微生物及其相关分子模式特征如前所述。
(二)酚氧化酶原激活系统组装活性物的制备及其生物活性
本发明所指组装活性物，其特征在于，包括(1)通过分离纯化技术去除血淋巴中与酚氧化酶原激活系统生物活性无关的一些组分—杂质；(2)通过分离纯化技术去除血淋巴中抑制酚氧化酶原激活系统生物活性的组分；(3)酚氧化酶原激活系统相关组成成分的体外组装；(4)上述任何一类组装活性物均具有酚氧化酶原激活系统的生物活性。
本发明所指从昆虫血淋巴收集液中分离纯化酚氧化酶原激活系统活性组分的条件特征包括：(1)操作温度在0℃-45℃，优选0℃-10℃；(2)溶液的酸碱度在pH2-pH12，优选pH4-pH10；(3)调节溶液酸碱度的化学试剂是常规、通用的酸或碱及其溶液，酸及其溶液优选HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸，碱及其溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂；(4)缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液，优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对、上述各缓冲离子的组合；5.溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L-0.5mol/L，优选0.01mol/L-0.1mol/L。上述条件不影响酚氧化酶原激活系统活性组分的生物活性。
从昆虫血淋巴收集液分离纯化酚氧化酶原激活系统活性组分的技术特征，是采用盐析或离子交换层析或疏水作用层析或凝胶过滤或不同技术方法的组合。
(三)昆虫血淋巴的收集及储存方法
本发明可采用常规方法，如蜡盘法、离心法、背血管取血法、灌注法、压榨、匀浆法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪开法、穿刺法等，在10℃至-5℃条件下收集昆虫血淋巴。
为确保获得具有酚氧化酶原激活系统以及Toll信号传递系统生物活性的稳定的昆虫血淋巴，其收集及储存过程需要同时满足如下条件：(1)收集过程使用的器械、溶液、容器等均处无菌状态，且不含有微生物相关分子模式；(2)收集后的血淋巴需放置于中性盐溶液、或含有酚氧化酶原激活系统抑制剂的溶液、或含抗凝剂的溶液、或直接收集至液氮或干冰，以及上述条件的任何组合。
上述说明所指中性盐选自硫酸铵、硫酸钠或氯化钠；中性盐溶液的饱和度在10％-90％；温度在15℃至零下5℃，优选0℃-4℃。
上述说明所指收集所用溶液，选自蒸馏水、无离子水、生理盐水(常规、通用生理盐水)、昆虫生理盐水(常规、通用昆虫生理盐水)、缓冲液(常规、通用缓冲离子对所组成的缓冲液)。所述缓冲液的缓冲离子对优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对以及上述各缓冲离子的组合；缓冲液的离子强度在0.001mol/L-1mol/L，优选0.01mol/L-0.5mol/L。
在收集用溶液中还可加入二价金属离子螯合剂，优选EDTA或TDTA等，二价金属离子螯合剂的优选浓度在0.01mmol/L-100mmol/L。
在收集用溶液中还可加入酚氧化酶原激活系统抑制剂，优选苯甲脒或PMSF(苯甲基磺酸氟化物)或蔗糖或DFP(二异丙基氟磷酸)或苯甲脒、苯甲基磺酸氟化物、二异丙基氟磷酸、蔗糖的任何组合，抑制剂浓度优选0.1mmol/L-30mmol/L。
收集用溶液酸碱度在pH2-pH13，优选pH4-pH9。
收集用的溶液是无菌并且不含任何微生物相关分子模式。
上述说明所指抗凝剂，至少包含下列抗凝成分中的一种或其任何组合：(1)肝素，浓度为0.01mg/ml-10mg/ml，优选0.05mg/ml-1mg/ml；(2)水溶性柠檬酸盐，浓度为0.001mol/L-0.5mol/L，优选0.01mol/L-0.5mol/L；(3)水溶性草酸盐，浓度为0.01mg/ml-10mg/ml，优选0.05mg/ml-1mg/ml。
本发明获得的血淋巴以及建立的血淋巴收集和储存方法可以在生物医药业、工业、农业、水产及其养殖业、航天航空业、食品加工业等领域广泛应用。
(四)激活昆虫血淋巴的制备及活性物质的获得
1.激活血淋巴的制备与储存
取鳞翅目、天蚕蛾科昆虫幼虫，按照微生物感染(或激活)昆虫的方法及其特征等要求激活。激活方法的特征在于，(1)将剂量不限的革兰阳性菌或革兰阴性菌或真菌注入昆虫体内，从注入直至昆虫死亡的任何时间节点的昆虫，(2)将剂量与比例不限的革兰阳性菌与革兰阴性菌混合物或革兰阳性菌与真菌混合物或革兰阳性菌与真菌混合物注入昆虫体内，从注入直至昆虫死亡的任何时间节点的昆虫，(3)将剂量与比例不限的革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌混合物注入昆虫体内，从注入直至昆虫死亡的任何时间节点的昆虫，(4)昆虫体黑化乃至死亡，同时，体内有诱导的抗菌肽产生，(5)革兰阳性菌或革兰阴性菌或真菌可以是活菌或死菌。
取鳞翅目、天蚕蛾科昆虫，按照微生物相关模式分子激活昆虫的方法及其特征等要求激活。激活方法的特征在于，(1)将剂量不限的革兰阳性菌模式分子或革兰阴性菌模式分子或真菌模式分子注入昆虫体内，从注入直至昆虫死亡的任何时间节点的昆虫，(2)将剂量与比例不限的革兰阳性菌模式分子与革兰阴性菌模式分子混合物或革兰阳性菌模式分子与真菌模式分子混合物或革兰阳性菌模式分子与真菌模式分子混合物注入昆虫体内，从注入直至昆虫死亡的任何时间节点的昆虫，(3)将剂量与比例不限的革兰阳性菌模式分子、革兰阴性菌模式分子和真菌模式分子混合物混合物注入昆虫体内，从注入直至昆虫死亡的任何时间节点的昆虫，(4)昆虫体黑化乃至死亡，同时，体内有诱导的抗菌肽产生。
2.抗菌肽等生物活性物质的分离与纯化
从激活昆虫血淋巴收集液分离纯化抗菌肽等生物活性物质的条件特征：1.操作温度在0℃-100℃；2.溶液的酸碱度在pH2-pH12，优选pH4-pH10；3.调节溶液酸碱度的化学试剂是常规、通用的酸或碱及其溶液，酸及其溶液优选HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸，碱及其溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂；4.缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液，优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对、上述各缓冲离子的组合；5.溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L-0.5mol/L，优选0.01mol/L-0.1mol/L。
从激活昆虫血淋巴收集液分离纯化抗菌肽的技术特征，是将血淋巴经加热、沉淀去除部分杂蛋白后，采用盐析或离子交换层析或疏水作用层析或凝胶过滤或上述技术的任何组合。
(1)离子交换层析分离纯化抗菌肽等生物活性物质
取激活昆虫血淋巴收集液，加热、沉淀去除部分杂蛋白后按激活昆虫血淋巴收集液分离纯化抗菌肽等生物活性物质的条件特征要求，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围下。将处理好的样品上样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。沉脱方式，可以采用盐浓度阶段方式，分别用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L盐溶液进行阶段洗脱；也可以采用盐浓度梯度方式，梯度从0.00mol/L-3mol/L。利用常规、通用的抗菌生物活性实验检测跟踪抗菌肽等生物活性组分，或利用抗菌肽抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有抗菌肽等生物活性组分的洗脱液合并储存备用。如果需要，可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐，或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
离子交换层析分离纯化的特征：1.层析介质选择阳离子交换层析添料，如CM-离子交换层析添料或SP-离子交换层析添料或S-离子交换层析添料等阳离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在pH2-pH7；2.层析介质选择阴离子交换层析添料，如Q-离子交换层析添料或DEAE-离子交换层析添料或QAE-离子交换层析添料等离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在pH7-pH12；3.洗脱的盐溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加中性盐到需要的浓度；4.中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl，优选NaCl。
(2)疏水层析分离纯化抗菌肽等生物活性物质
取激活昆虫血淋巴收集液，加热、沉淀去除部分杂蛋白后按激活昆虫血淋巴收集液分离纯化抗菌肽等生物活性物质的条件特征要求，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围下。加中性盐至2mol/L浓度，上样于预先用2mol/L中性盐-缓冲液溶液平衡的疏水层析柱，先用2mol/L中性盐-缓冲液溶液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用中性盐浓度梯度(2.0mol/L～0.0mol/L)方式洗脱；也可以采用盐浓度阶段洗脱方式，分别采用15mol/L、1.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2中性盐溶液进行阶段方式洗脱。利用常规、通用的抗菌生物活性实验检测跟踪抗菌肽等生物活性组分，或利用抗菌肽抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有抗菌肽等生物活性组分的洗脱液合并储存备用。如果需要，可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐，或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
疏水层析分离纯化的特征：1.疏水层析介质选择苯基-疏水层析添料或正辛烷-疏水层析添料-或己烷-疏水层析添料-或丁烷-疏水层析添料；2.中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl；3.分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按从激活昆虫血淋巴收集液分离纯化抗菌肽等生物活性物质的条件特征所描述的特征。
(3)凝胶层析分离纯化抗菌肽等生物活性物质
取激活昆虫血淋巴收集液，加热、沉淀去除部分杂蛋白后按激活昆虫血淋巴收集液分离纯化抗菌肽等生物活性物质的条件特征要求，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围下。样品液上样于预先用缓冲液平衡好的凝胶过滤层析柱并进行分离纯化洗脱，利用常规、通用的抗菌生物活性实验检测跟踪抗菌肽等生物活性组分，或利用抗菌肽抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有抗菌肽等生物活性组分的洗脱液合并储存备用。如果需要，可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐，或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
凝胶层析分离纯化的特征：1.层析介质可以选择Sephacryl S-100 HR或Sephacryl S-200 HR或Sephadex G-50或Sephadex G-75或Sephadex G-100或Sephadex G-150或Superose 12 prep grade或Superose 6 prep grade或Superdex30 prep grade或Superdex 75 prep grade或Superose 12 HR或Superose 6 HR或Superdex Peptide HR或Superdex 75 HR或Superdex Peptide PE等凝胶层析添料；2.分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按从激活昆虫血淋巴收集液分离纯化抗菌肽等生物活性物质的条件特征所描述的特征，此外洗脱液的浓度，优选在离子浓度大于0.15M及以上。
(4)盐析分离纯化抗菌肽等生物活性物质
取激活昆虫血淋巴收集液，加热、沉淀去除部分杂蛋白后按激活昆虫血淋巴收集液分离纯化抗菌肽等生物活性物质的条件特征要求，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围下。在样品溶液中加入蛋白质盐析常规、通用的中性盐，至浓度达到抗菌肽仍处于溶解状态，而一些杂蛋白处于沉淀。离心取其上清溶液继续加入盐析常规、通用的中性盐至浓度达到抗菌肽沉淀状态。离心弃上清，沉淀溶于从激活昆虫血淋巴收集液分离纯化抗菌肽等生物活性物质的条件特征的溶液或缓冲液储存备用；沉淀的溶解液，也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去其中的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
盐析分离纯化的特征：1.分离纯化的缓冲液、酸碱度选择，是按从激活昆虫血淋巴收集液分离纯化抗菌肽等生物活性物质的条件特征所描述的特征；2.分离纯化操作温度在0℃-45℃，优选0℃；3.盐析使用的中性盐，选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl，优选(NH4)2SO4或Na2SO4；4.在使抗菌肽等生物活性物质处于溶解状态，选择中性盐在15％-65％，优选30％-50％；5.在使抗菌肽等生物活性物质处于盐析沉淀状态，选择中性盐在60％-90％，优选70％-85％。
上述方法获得制备的抗菌肽等生物活性物质，依其生物活性应用于医学、药学、农学等以及医疗卫生(临床)、公共卫生、生物医药、工业、农业、水产及其养殖业、动物及其养殖业、食品及其加工业、航天航空业等领域。
为有效获得高纯度抗菌肽，可进一步将上述四种分离纯化方法(离子交换柱层析、疏水柱层析、凝胶过滤柱层析、盐析)，进行两种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或三种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或四种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合。
上述方法获得制备的高纯度抗菌肽等生物活性物质，依其生物活性应用于医学、药学、农学等以及医疗卫生(临床)、公共卫生、生物医药工业、农业、水产及其养殖业、动物及其养殖业、食品及其加工业、航天航空业等领域。如，获得电泳纯或HPLC纯的抗菌肽，可以利用蛋白质活性、分子生物学等技术、方法，解析抗菌肽的结构并可从昆虫获得抗菌肽基因，利用基因工程技术表达抗菌肽。此抗菌肽可以进一步研究开发生物技术药物，或作为抗菌活性物质而应用于各个领域。
附图说明：
图1为昆虫血淋巴样品激活后的颜色反应；
图2为血淋巴收集及储存方法的稳定性；
图3为微生物及相关分子模式—肽聚糖使柞蚕幼虫体表发生黑化，
A.柞蚕幼虫；B.大肠杆菌致黑化；C.金黄色葡萄球菌致黑化；D白色念珠菌致黑化；E肽聚糖致黑化；F：β-1，3-葡聚糖致黑化；G：脂多糖致黑化；H：脂磷壁酸致黑化
图4为微生物相关分子模式体外对血淋巴的激活作用，
1：阴性对照；2：脂多糖；3：肽聚糖；4：脂磷壁酸；5：β-1，3-葡聚糖；6：甘露聚糖；7：脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸的混合物；8：β-1，3-葡聚糖与甘露聚糖的混合物；9：脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖与β-1，3-葡聚糖的混合物；
图5为微生物体外对血淋巴的激活作用，
1：大肠杆菌混悬液；2：金黄色葡萄球菌混悬液；3：弗氏志贺氏菌混悬液；4：粘质沙雷氏菌混悬液；5：枯草芽孢杆菌混悬液；6：白色念珠菌混悬液；7：酵母菌混悬液；8：黑曲霉混悬液；9：白地霉混悬液；
图6中性盐分级盐析制备酚氧化酶原激活系统活性组合物，
1：阳性对照2：40％、60％及80％的混合物；3：20％样品；4：40％样品；5：60％样品；6：80％样品；
图7为离子交换层析法制备酚氧化酶原激活系统活性组合物，
A：离子交换层析图谱；B：组合物活性检测结果
1：组分1；2：组分2；3：组分3；4：组分1，2混合物；5：组分2，3混合物；6：组分1，3混合物；7：组分1，2，3混合物；
图8疏水层析分离纯化制备酚氧化酶原激活系统活性组合物，
A：疏水层析图谱；B：组合物活性检测结果
1.组分1，3，4，5混合物；2：组分1；3：组分2；4：组分3；5：组分4；6：组分5；
图9凝胶层析分离纯化制备酚氧化酶原激活系统活性组合物，
A：凝胶层析图谱；B：组合物活性检测结果
1.组分1，2，3混合物；2：组分1；3：组分2；4：组分3；
图10蛋白免疫印迹法检测血淋巴中抗菌肽生成量，
A昆虫抗菌肽样品；B.未激活的昆虫血淋巴样品；C激活的昆虫血淋巴样品。
具体实施方式：
实施例1
血淋巴的收集与储存方法
本实施例使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
用无菌水(蒸馏水或去离子水)，采用淋洗的方法反复清洗昆虫3-4次；清洗后晾干体表液体后采用75％酒精进行体表消毒。将昆虫置于冰浴中麻醉直至反应迟钝。按下列不同条件分别收集并储存血淋巴：
(1)采用灌注法，将抗凝缓冲溶液(15mmol.L-1NaCl；136mmol.L-1柠檬酸钠；26mmol.L-1柠檬酸；20mmol.L-1EDTA，pH4.0)预先注射进昆虫幼虫的体腔，移除昆虫的后足或撕开昆虫腹部收集血淋巴。混匀后-80℃储存待用。
(2)采用撕裂法，既用灭菌后的剪子使昆虫幼虫形成开放性伤口，将昆虫伤口朝下置于离心管管口，将血淋巴直接挤压至离心管内。离心管内预先放置抗凝缓冲溶液(15mmol.L-1NaCl；136mmol.L-1柠檬酸钠；26mmol.L-1柠檬酸；20mmol.L-1EDTA，pH5.0)，收集血淋巴，混匀后离心收集上清液(血浆)，干冰储存待用。
(3)采用匀浆法，将昆虫成虫放入预先灭菌的组织匀浆器内，加入含有5mmol/L苯甲脒的昆虫生理盐水(130mmol.L-1NaCl；5mmol.L-1KCl；1mmol.L-1CaCl2，pH6.5)，匀浆后离心取上清液，无菌条件下冷冻干燥，-80℃储存待用。
(4)采用压榨法，将昆虫蛹放入离心管内，压碎昆虫，再通过微孔滤膜过滤除菌，将收集所获血淋巴中加入固体硫酸铵至饱和度80％，混匀后-20℃储存待用。
(5)采用撕裂法，既用灭菌后的剪子使昆虫幼虫形成开放性伤口，将昆虫伤口朝下置于含液氮的样品管管口，将血淋巴挤压至样品管内。放置于液氮中保存待用。
(6)采用灌注法，用注射器将含有5mmol/L苯甲脒的抗凝缓冲溶液(15mmol.L-1NaCl；136mmol.L-1柠檬酸钠；26mmol.L-1柠檬酸；20mmol.L-1EDTA，pH6.0)，注射进昆虫幼虫的体腔，移除昆虫的后足或撕开昆虫腹部收集血淋巴。混匀后放于干冰中储存待用。
考察上述方法收集所获血淋巴中酚氧化酶的活力，结果如图2-A所示，比较加入真菌分子模式—β-1，3-葡聚糖前(—)后(+)血淋巴酚氧化酶的活性。试验结果显示，在含有β-1，3-葡聚糖的条件下，采用上述六种方法获得的血淋巴显示了很高的酚氧化酶活性(1-6号样品)，反之，则酚氧化酶的活性很低。采用常规方法收集的血淋巴(7号样品)在加入β-1，3-葡聚糖前(—)后(+)则无明显差别，酚氧化酶均显示出较高活性，说明常规方法收集的血淋巴不稳定，已被部分或完全激活。1-6号血淋巴在放置12个月后，再次测定其酚氧化酶活力。试验结果如图2-B所示，酚氧化酶原激活系统的稳定性无明显变化。上述试验说明，本实施例所描述的六种血淋巴收集及储存方法均可保证血淋巴中酚氧化酶原激活系统的生物活性及其稳定性，满足本发明对血淋巴收集及储存的要求。
实施例2
昆虫体内血淋巴酚氧化酶原激活系统对微生物感染的响应
利用昆虫检测微生物的基本程序、原则、条件、要求、方法等及其特征，以鳞翅目(Lepidoptera)昆虫的代表—柞蚕为原料进行试验。
取八组柞蚕幼虫，每组10只。将大肠杆菌(革兰阴性菌)混悬液、金黄色葡萄球菌(革兰阳性菌)混悬液、白色念珠菌(真菌)混悬液、肽聚糖溶液、β-1，3-葡聚糖溶液、脂多糖溶液、脂磷壁酸溶液分别注入柞蚕幼虫体内，以生理盐水作空白对照，观察柞蚕幼虫体表的颜色变化状况。
结果如图3所示，样品组均使柞蚕幼虫体表发生黑化以及死亡；而空白对照的柞蚕幼虫体表没有发生黑化与死亡。表明微生物及其相关分子模式能够激活柞蚕体内的酚氧化酶原激活系统的生物活性，并使柞蚕发生黑化以及死亡。
上述试验表明，利用昆虫，针对微生物或及相关分子模式，能够检测样品是否还有微生物或被微生物感染(污染)。这种模式应用于医学、药学、农学等以及医疗卫生(临床)、公共卫生、生物医药、工业、农业、水产及其养殖业、动物及其养殖业、食品及其加工业、航天航空业等领域和上述领域的环境微生物检测、监控等。
实施例3
微生物相关分子模式体外对血淋巴酚氧化酶原的激活作用
利用昆虫淋巴收集液检测微生物相关分子模式的基本程序、原则、条件、要求、方法等及其特征，以鳞翅目(Lepidoptera)昆虫的代表—柞蚕作为原料进行试验。
分别或同时将微生物相关分子模式—脂多糖、肽聚糖、甘露聚糖、脂磷壁酸和β-1，3-葡聚糖与昆虫血淋巴收集液混合，生理盐水作空白对照。25℃、pH5条件下保温后，以多巴为检测底物，测定490nm吸收值，考察微生物相关分子模式对血淋巴收集液中酚氧化酶活力的影响。
实验结果如图4所示，实验组(柱状图2-9)中的昆虫血淋巴收集液发生黑化作用；而空白对照(柱状图1)则没有发生黑化作用。表明不同类型的微生物相关分子模式及其组合均能够激活昆虫血淋巴收集液的酚氧化酶原激活系统的生物活性，并使昆虫血淋巴收集液发生黑化作用。据此检测样品是否含有微生物或被微生物感染(污染)。
实施例4
微生物体外对血淋巴酚氧化酶原的激活作用
利用昆虫淋巴收集液检测微生物的基本程序、原则、条件、要求、方法等及其特征，以鳞翅目(Lepidoptera)昆虫的代表—柞蚕作为原料进行试验。
本发明将不同类型的革兰阴性菌、革兰阳性菌、真菌既大肠杆菌混悬液、金黄色葡萄球菌混悬液、弗氏志贺氏菌混悬液、粘质沙雷氏菌混悬液、枯草芽孢杆菌混悬液、白色念珠菌混悬液、酵母菌混悬液、黑曲霉混悬液、白地霉混悬液分别与昆虫血淋巴收集液混合，以微生物混悬液的溶剂—生理盐水作空白对照。30℃、pH8.0保温后，以4-羟基脯氨酸乙酯盐与4-甲基儿茶酚混合物为底物，检测520nm吸收值，考察微生物对血淋巴收集液中酚氧化酶活力的影响。
实验结果如图5所示，实验组(柱状图2-9)使昆虫血淋巴收集液中的酚氧化酶原被激活；而空白对照(柱状图1)则没有发生变化。表明不同类型的微生物均能够激活昆虫血淋巴收集液的酚氧化酶原激活系统的生物活性，并使昆虫血淋巴收集液呈现出较高的酚氧化酶活性。据此检测样品是否含有微生物或被微生物感染(污染)。
实施例5
血淋巴对不同微生物的检测灵敏度
利用昆虫淋巴收集液检测微生物的基本程序、原则、条件、要求、方法等及其特征，以鳞翅目(Lepidoptera)昆虫的代表—柞蚕为原料进行试验。
本实施例采用实施例1中方法1-6分别收集获得的血淋巴对包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、弗氏志贺氏菌、粘质沙雷氏菌、枯草芽孢杆菌在内的两种革兰阳性菌和四种革兰阴性菌进行检测，检测结果以4-羟基脯氨酸乙酯盐与4-甲基儿茶酚混合物的呈色现象表示，每组实验重复30次。实验结果如表1所示，六种不同收集方法所获得的血淋巴对上述六种细菌均可检出。
表1 血淋巴对细菌的检测
本实施例采用实施例1中方法1-6所获血淋巴收集液对包括白色念珠菌、黑曲霉等在内的九种真菌进行检测，检测结果以多巴胺的呈色现象表示，每组实验重复30次。实验结果如表2所示，采用方法1-6所获血淋巴收集液对白色念珠菌、酵母菌、黑曲霉、白地霉、青霉、镰刀菌、少根根霉、蓝色犁头霉、刺囊毛霉等九种真菌均可检出。
表2 血淋巴对真菌的检测
实施例6
酚氧化酶原激活系统组装活性物的制备及其生物活性
1.利用中性盐分级盐析分离纯化制备酚氧化酶原激活系统的活性组分以及组装活性物
(1)活性组分分离纯化
将昆虫血淋巴收集液，按从昆虫血淋巴收集液分离纯化酚氧化酶原激活系统活性组分技术的特征要求，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围内并置于特征要求的温度，优选0℃-10℃。
采用实施例1-(2)方法获得的血淋巴溶液中加入中性盐(NH4)2SO4至饱和度20％，中性盐完全溶解后放置一段时间。低温离心后，分别收集沉淀和上清液。沉淀保存备用，上清液继续加入(NH4)2SO4至饱和度40％，中性盐完全溶解后放置一段时间。低温离心后，分别收集沉淀和上清液。沉淀保存备用，上清液继续加入(NH4)2SO4至饱和度60％，中性盐完全溶解后放置一段时间。低温离心后，分别收集沉淀和上清液。沉淀保存备用，上清液继续加入(NH4)2SO4至饱和度80％，中性盐完全溶解后放置一段时间。低温离心后，分别收集沉淀和上清液。沉淀保存备用，上清液继续加入(NH4)2SO4至饱和度100％，中性盐完全溶解后放置一段时间。低温离心后，分别收集沉淀保存备用。
(2)组装活性物的制备—活性组分体外组装获得酚氧化酶原激活系统生物活性
本实施例根据酚氧化酶原激活系统生物活性检测的基本程序、原则、条件、要求、方法等及其特征进行试验，使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
以4-羟基脯氨酸乙酯盐与4-甲基儿茶酚混合物作为酚氧化酶的底物，进行酚氧化酶活性的检测。活性检测过程：样品溶液、脂多糖溶液、酚氧化酶底物—4-羟基脯氨酸乙酯盐与4-甲基儿茶酚混合物溶液混合，生理盐水作空白对照；25℃，pH7.0反应一定时间后，在520nm±50nm(优选520nm±10nm)进行比色分析。
将上述中性盐分级盐析沉淀的组分，用不含微生物及其相关分子模式的蒸馏水或缓冲液复溶。利用常通用的透析和超滤技术，分别去除复溶溶液中的中性盐并定容。
将上述五个样品分别进行自由组合，对每个重新组装的样品，定量分析酚氧化酶的活性。对于能够表现酚氧化酶原激活系统生物活性的样品即为组装活性物。如图6所示，其中40％、60％及80％三个样品的混合物具有脂多糖依赖的酚氧化酶原激活系统的生物活性(图中(+)表示样品中加入脂多糖，(一)表示样品中未加入脂多糖)。
2.利用离子交换层析分离纯化制备酚氧化酶原激活系统的活性组分以及组装活性物
(1)活性组分分离纯化
将昆虫血淋巴收集液，按从昆虫血淋巴收集液分离纯化酚氧化酶原激活系统活性组分技术的特征要求，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围内并置于特征要求的温度，优选0℃-10℃。
将样品溶液上样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用盐浓度阶段方式，分别用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L盐溶液进行阶段洗脱；也可以采用盐浓度梯度方式，梯度从0.00mol/L-3mol/L。利用紫外检测仪在线检测洗脱液的蛋白含量—洗脱曲线，将每个蛋白洗脱峰分别合并定容备用。如果收集的洗脱液盐浓度较高，可以利用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合液的盐。
离子交换层析分离纯化的特征：1.层析介质选择阳离子交换层析添料，如CM-离子交换层析添料或SP-离子交换层析添料或S-离子交换层析添料等阳离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在pH2-pH7；2.层析介质选择阴离子交换层析添料，如Q-离子交换层析添料或DEAE-离子交换层析添料或QAE-离子交换层析添料等离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在pH7-pH12；3.缓冲液及其浓度选择，按上述β-1，3-葡聚糖识别蛋白提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；4.洗脱的盐溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加中性盐到需要的浓度；5.中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl，优选NaCl。
例如，将采用实施例1-(1)方法获得的血淋巴收集液上样于预先用缓冲液平衡好的sp-sepharose离子交换层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，采用盐浓度和pH阶段方式，分别用0-1mol/LNaCl的pH4.5抗凝缓冲溶液或0-1mol/LNaCl的pH8.0缓冲溶液梯度洗脱。利用紫外检测仪在线检测洗脱液的蛋白含量—洗脱曲线，将每个蛋白洗脱峰分别合并定容备用。如果收集的洗脱液盐浓度较高，可以利用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐。
(2)组装活性物的制备—活性组分体外组装具有酚氧化酶原激活系统生物活性
酚氧化酶原激活系统生物活性检测的基本程序、原则、条件、要求、方法等及其特征，均在本发明专利的背景技术、发明内容中描述，在本实施例中并没有全面、一一陈述、描述、要求。本实施例使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
酚氧化酶原激活系统生物活性—酚氧化酶活性活性检测过程：样品溶液、β-1，3-葡聚糖溶液、酚氧化酶底物溶液混合，生理盐水作空白对照；40℃、pH9.0反应一定时间后，在520nm±50nm(优选520nm±10nm)进行比色分析。
将离子交换层析分离纯化的每个蛋白洗脱峰样品分别进行自由组合，组合原则同本实施例中的1-(2)的组装原则。对每个重新组装的样品，定量分析酚氧化酶的活性。对于能够表现酚氧化酶原激活系统生物活性的样品即为组装活性物。
试验结果如图7所示，血淋巴收集液经SP-sepharose离子交换层析分成三个组分(A)，经酚氧化酶活性测定结果(B)可知，三个组分的混合物具有酚氧化酶原激活系统的生物活性。(图中(+)表示样品中加入β-1，3-葡聚糖溶液，(一)表示未加入β-1，3-葡聚糖溶液)。
3.利用疏水层析分离纯化制备酚氧化酶原激活系统的活性组分以及组装活性物
(1)活性组分分离纯化
将昆虫血淋巴收集液，按从昆虫血淋巴收集液分离纯化酚氧化酶原激活系统活性组分技术的特征要求，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围内并置于特征要求的温度，优选0℃-10℃。
样品溶液中加中性盐至3mol/L浓度，上样于预先用3mol/L中性盐-缓冲液溶液平衡的疏水层析柱，先用3mol/L中性盐-缓冲液溶液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用中性盐浓度梯度(3.0mol/L～0.0mol/L)方式洗脱；也可以采用盐浓度阶段洗脱方式，分别采用2.5mol/L、2.0mol/L、1.5mol/L、1.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L、0.0mol/L中性盐溶液进行阶段方式洗脱。利用紫外检测仪在线检测洗脱液的蛋白含量—洗脱曲线，将每个蛋白洗脱峰分别合并定容备用。如果收集的洗脱液盐浓度较高，可以利用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱液的盐，或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
疏水层析分离纯化的特征：1.疏水层析介质选择苯基-疏水层析添料或正辛烷-疏水层析添料-或己烷-疏水层析添料-或丁烷-疏水层析添料；2.中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl；3.分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按利用激活昆虫血淋巴收集液分离纯化抗菌肽等生物活性物质的条件特征所描述的特征。
例如，将采用实施例1-(3)方法获得的血淋巴收集液中加入(NH4)2SO4至3mol/L浓度，上样于预先平衡好的苯基疏水柱，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式采用含3mol/L-0mol/L(NH4)2SO4的昆虫生理盐水(130mmol.L-1NaCl；5mmol.L-1KCl；1mmol.L-1CaCl2，pH6.5)梯度洗脱。利用紫外检测仪在线检测洗脱液的蛋白含量—洗脱曲线，将每个蛋白洗脱峰分别合并定容备用。如果收集的洗脱液盐浓度较高，可以利用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐。
(2)组装活性物的制备—活性组分体外组装具有酚氧化酶原激活系统生物活性
酚氧化酶原激活系统生物活性检测的基本程序、原则、条件、要求、方法等及其特征，均在本发明专利的背景技术、发明内容中描述，在本实施例中并没有全面、一一陈述、描述、要求等。本实施例使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
酚氧化酶原激活系统生物活性—酚氧化酶活性活性检测过程：样品溶液、肽聚糖溶液、酚氧化酶底物溶液混合，生理盐水作空白对照；40℃、pH9.0反应一定时间后，在520nm±50nm(优选520nm±10nm)进行比色分析。
将疏水层析分离纯化的每个蛋白洗脱峰样品全部重新混合后，定量分析酚氧化酶的活性，以该样品作为对照。
将疏水层析分离纯化的每个蛋白洗脱峰样品分别进行自由组合，组合原则同本实施例中的1-(2)的组装原则。对每个重新组装的样品，定量分析酚氧化酶的活性。对于能够表现酚氧化酶原激活系统生物活性的样品即为组装活性物。
试验结果如图8所示，血淋巴收集液经苯基疏水层析分成五个组分(图8-A)，经酚氧化酶活性测定结果(图8-B)可知，组分1、3、4、5的混合物既具有酚氧化酶原激活系统的生物活性。(图中(+)表示样品中加入肽聚糖溶液，(一)表示未加入肽聚糖溶液)。
4.利用凝胶层析分离纯化制备酚氧化酶原激活系统的活性组分以及组装活性物的制备
(1)活性组分分离纯化
将昆虫血淋巴收集液，按从昆虫血淋巴收集液分离纯化酚氧化酶原激活系统活性组分技术的特征要求，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围内并置于特征要求的温度，优选0℃-10℃。
样品液上样于预先用缓冲液平衡好的凝胶过滤层析柱并进行分离纯化洗脱，利用紫外检测仪在线检测洗脱液的蛋白含量—洗脱曲线，将每个蛋白洗脱峰分别合并定容备用。
凝胶层析分离纯化的特征：1.层析介质可以选择Sephacryl S-100 HR或Sephacryl S-200 HR或Sephadex G-50或Sephadex G-75或Sephadex G-100或Sephadex G-150或Superose12prep grade或Superose 6 prep grade或Superdex30 prep grade或Superdex 75 prep grade或Superose 12 HR或Superose 6 HR或Superdex Peptide HR或Superdex 75 HR或Superdex Peptide PE等凝胶层析添料；2.分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按从激活昆虫血淋巴收集液分离纯化抗菌肽等生物活性物质的条件特征所描述的特征，此外洗脱液的浓度，优选在离子浓度大于0.15M及以上。
例如，将采用实施例1-(6)方法获得的血淋巴收集液上样于预先平衡好的Sephadex G-100凝胶层析柱，采用含有5mmol/L苯甲脒的抗凝缓冲溶液(15mmol.L-1NaCl；136mmol.L-1柠檬酸钠；26mmol.L-1柠檬酸；20mmol.L-1EDTA，pH6.0)缓慢洗脱。利用紫外检测仪在线检测洗脱液的蛋白含量—洗脱曲线，将每个蛋白洗脱峰分别合并定容备用。如果收集的洗脱液盐浓度较高，可以利用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐。
(2)组装活性物的制备—活性组分体外组装具有酚氧化酶原激活系统生物活性
酚氧化酶原激活系统生物活性检测的基本程序、原则、条件、要求、方法等及其特征，均在本发明专利的背景技术、发明内容中描述，在本实施例中并没有全面、一一陈述、描述、要求。本实施例使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
酚氧化酶原激活系统生物活性一酚氧化酶活性活性检测过程：样品溶液、脂磷壁酸溶液、酚氧化酶底物溶液混合，生理盐水作空白对照；40℃、pH9.0反应一定时间后，在520nm±50nm(优选520nm±10nm)进行比色分析。
将凝胶层析分离纯化的每个蛋白洗脱峰样品分别进行自由组合，组合原则同本实施例中的1-(2)的组装原则。对每个重新组装的样品，定量分析酚氧化酶的活性。对于能够表现酚氧化酶原激活系统生物活性的样品即为组装活性物。
试验结果如图9所示，血淋巴收集液经Sephadex G-100凝胶层析分成三个组分(图9-A)，经酚氧化酶活性测定结果(图9-B)可知，三个组分的混合物具有酚氧化酶原激活系统的生物活性。(图中(+)表示样品中加入脂磷壁酸溶液，(一)表示未加入脂磷壁酸溶液)。
综合上述实验结果表明：利用组装活性物，针对微生物或及相关分子模式，能够检测样品是否含有微生物或被微生物感染(污染)。这种模式应用于医学、药学、农学等以及医疗卫生(临床)、公共卫生、生物医药、工业、农业、水产及其养殖业、动物及其养殖业、食品及其加工业、航天航空业等领域和上述领域的环境微生物检测、监控等。
实施例7
从激活昆虫幼虫获得血淋巴、保存与储存
根据激活昆虫幼虫获得激活血淋巴的基本程序、原则、条件、要求、方法等及其特征以及所指昆虫、血淋巴、收集用溶液、收集过程的温度、器械与容器等、微生物感染(或激活)昆虫的方法、微生物模式分子激活昆虫、血淋巴收集方法、血淋巴保存、血淋巴储存等及其特征进行试验。
取激活的昆虫幼虫进行虫体外表的清洗、麻醉处理。
按照血淋巴收集方法或及收集用溶液收集昆虫幼虫的激活血淋巴。
获得的幼虫激活血淋巴，按照血淋巴保存及其特征要求，进行激活血淋巴的保存。
按照血淋巴储存及其特征要求，进行激活血淋巴的储存。
实施例8：昆虫血淋巴Toll信号传递系统生物活性检测—诱导抗菌肽
分别以实施例7所获得的激活昆虫血淋巴为样品，以实施例1所获得的昆虫血淋巴作为空白对照样品，以本发明专利所述的昆虫抗菌肽作为阳性对照样品。按照发明内容中昆虫血淋巴生物活性检测的方法及其特征，通过常规、通用的免疫检测技术、方法，利用本发明专利所述的昆虫抗菌肽的抗体作为检测试剂进行昆虫抗菌肽的免疫检测，如对流免疫电泳，酶联免疫吸附法(ELISA)，蛋白免疫印迹法(Western)检测昆虫抗菌肽的诱导生成量。
实验结果表明：激活的昆虫血淋巴样品均有诱导抗菌肽的生成，且生成的诱导抗菌肽量比较未激活的血淋巴样品(空白对照样品)中抗菌肽的量具有显著差异(如图10所示)。
Claims (12)
1.昆虫、昆虫血淋巴及其组装活性物在激活酚氧化酶原激活系统或/和Toll信号传递途径系统中的生物活性。
2.昆虫、昆虫血淋巴及其组装活性物在微生物及其相关分子模式检测中的应用。
3.昆虫血淋巴在制备酚氧化酶原激活系统组装活性物中的应用。
4.昆虫血淋巴在分离纯化抗菌肽中的应用。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的应用，其特征在于，所述的昆虫血淋巴含有酚氧化酶原激活系统组分，酚氧化酶原激活系统组分包括针对革兰阳性菌或革兰阴性菌或真菌的模式识别蛋白一关联性模式识别蛋白、系列关联性丝氨酸蛋白酶(原)、相应的各种关联性调节剂、酚氧化酶原，酚氧化酶原激活系统通过识别微生物或相关分子模式，激活下游丝氨酸蛋白酶级联系统，最终导致酚氧化酶原被激活成酚氧化酶或/和激活Toll信号传递系统，从而诱导产生抗菌肽。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，制备酚氧化酶原激活系统组装活性物采用中性盐分级盐析方法、离子交换层析方法、疏水层析方法、凝胶过滤层析方法制备。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
中性盐分级盐析方法的步骤如下：
将昆虫血淋巴收集液，按从昆虫血淋巴收集液分离纯化酚氧化酶原激活系统活性组分技术的特征要求，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围内并置于特征要求的温度，优选0℃-10℃；在样品溶液中加入中性盐至饱和度20％，中性盐完全溶解后放置一段时间，低温离心后，分别收集沉淀和上清液，沉淀保存备用，上清液继续加入中性盐至饱和度40％，中性盐完全溶解后放置一段时间，低温离心后，分别收集沉淀和上清液，沉淀保存备用，上清液继续加入中性盐至饱和度60％，中性盐完全溶解后放置一段时间，低温离心后，分别收集沉淀和上清液，沉淀保存备用，上清液继续加入中性盐至饱和度80％，中性盐完全溶解后放置一段时间，低温离心后，分别收集沉淀和上清液，沉淀保存备用，上清液继续加入中性盐至饱和度100％，中性盐完全溶解后放置一段时间，低温离心后，分别收集沉淀保存备用；
离子交换层析方法的步骤如下：
将昆虫血淋巴收集液，按从昆虫血淋巴收集液分离纯化酚氧化酶原激活系统活性组分技术的特征要求，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围内并置于特征要求的温度，优选0℃-10℃；将样品溶液上样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白，洗脱方式，采用盐浓度阶段方式，分别用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L盐溶液进行阶段洗脱；也可以采用盐浓度梯度方式，梯度从0.00mol/L-3mol/L；离子交换层析分离纯化中：(1)层析介质选择阳离子交换层析添料，选自CM-离子交换层析添料或SP-离子交换层析添料或S-离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在pH2-pH7；(2)层析介质选择阴离子交换层析添料，选自Q-离子交换层析添料或DEAE-离子交换层析添料或QAE-离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在pH7-pH12；(3)洗脱的盐溶液可以选择规定浓度的缓冲液或在缓冲液中加中性盐到需要的浓度；(4)中性盐选择(NH4)2SO4Na2SO4或NaCl或KCl，优选NaCl；
疏水层析方法的步骤如下：
将昆虫血淋巴收集液，按从昆虫血淋巴收集液分离纯化酚氧化酶原激活系统活性组分技术的特征要求，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围内并置于特征要求的温度，优选0℃-10℃；样品溶液中加入中性盐至3mol/L浓度，上样于预先用缓冲液平衡好的疏水层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白，洗脱方式，采用盐浓度阶段方式，分别采用2.5mol/L、2.0mol/L、1.5mol/L、1.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L、0.0mol/L中性盐溶液进行阶段洗脱；也可以采用盐浓度梯度方式，梯度从3mol/L-0.0mol/L；疏水层析分离纯化中：(1)疏水层析介质选择苯基-疏水层析添料、正辛烷-疏水层析添料、己烷-疏水层析添料、丁烷-疏水层析添料；(2)中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl，优选(NH4)2SO4；(3)洗脱的盐溶液可以选择规定浓度的缓冲液或在缓冲液中加中性盐到需要的浓度；
凝胶过滤层析方法的步骤如下：
将昆虫血淋巴收集液，按从昆虫血淋巴收集液分离纯化酚氧化酶原激活系统活性组分技术的特征要求，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围内并置于特征要求的温度，优选0℃-10℃；样品液上样于预先用缓冲液平衡好的凝胶过滤层析柱并进行分离纯化洗脱，；洗脱方式，采用与上样缓冲溶液相同的溶液进行洗脱；凝胶层析分离纯化中：(1)层析介质可以选择Sephacryl S-100 HR、Sephacryl S-200 HR、Sephadex G-50、Sephadex G-75、Sephadex G-100、SephadexG-150或Superose 12 prep grade、Superose 6 prep grade、Superdex 30 prep grade、Superdex 75 prep grade、Superose 12 HR、Superose 6 HR、Superdex Peptide、或Superdex 75 HR、Superdex Peptide PE等凝胶层析添料；(2)洗脱液的离子浓度为0-1.5M，优选0.15M-0.8M。
8.根据权利要求1或2或3或4或5或6所述的应用，其特征在于，所述的昆虫血淋巴通过收集和储存过程获得，所述的收集过程使用的器械、溶液、容器均处无菌状态，且不含有微生物相关分子模式；收集后的血淋巴放置于中性盐溶液、含有酚氧化酶原激活系统抑制剂的溶液、含抗凝剂的溶液、或直接收集至液氮或干冰中，或上述条件的任何组合。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的昆虫为鳞翅目(Lepidoptera)、天(大)蚕蛾科(Satumiidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕，所述的昆虫为任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述中性盐选自硫酸铵、硫酸钠或氯化钠，饱和度为10％-90％；所述的溶液选自蒸馏水、无离子水、生理盐水、昆虫生理盐水、缓冲液；所述的抗凝剂至少包含下列抗凝成分中的一种或其组合：1)肝素，浓度为0.01mg/m1-10mg/ml，优选0.05mg/ml-lmg/ml；2)水溶性柠檬酸盐，柠檬酸根浓度为0.001mol/L-0.5mol/L，优选0.01mol/L-0.5mol/L；3)水溶性草酸盐，草酸根浓度为0.01mg/ml-10mg/ml，优选0.05mg/ml-1mg/ml；所述的抑制剂优选苯甲脒、苯甲基磺酸氟化物，蔗糖，二异丙基氟磷酸或苯甲脒、苯甲基磺酸氟化物、二异丙基氟磷酸、蔗糖的任何组合，抑制剂浓度优选1mmol/L-30mmol/L；收集用溶液酸碱度在pH2-pH13，优选pH4-pH9。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的缓冲液为缓冲离子对所组成的缓冲液，缓冲离子对选自柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对以及上述各缓冲离子的组合；所述缓冲液的离子强度在0.001mol/L-1mol/L，优选0.01mol/L-0.5mol/L。
12.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在收集用溶液中加入二价金属离子螯合剂，优选EDTA或TDTA，二价金属离子螯合剂的优选浓度在0.01mmol/L-100mmol/L。
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