CN114350592A - 一种天牛成虫血淋巴收集方法、装置及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生理生化及生物分子学技术领域，具体公开了一种天牛成虫血淋巴收集方法、装置及其制备方法与应用。本发明的收集方法，包括除去天牛的两根触角，整个口器及第一对足后，待其血淋巴从以上断口中的任一处外溢聚成滴状时，立即将其头向下放入血淋巴收集装置内，进行离心的步骤。血淋巴收集装置包括：收集管、尼龙网和两个缓冲区固定块；尼龙网在收集管内形成一可供天牛成虫放置的空间，缓冲区固定块位于其内，使天牛成虫在头向下放入后，头部与尼龙网的底部相距1.8‑2.2mm。采用本发明的方法，可快速、简单地进行天牛成虫血淋巴的收集，收集结果纯度高，且不影响天牛存活状态或其他组织活性，可后续继续用于其他实验操作。

Description

一种天牛成虫血淋巴收集方法、装置及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生理生化及生物分子学技术领域，具体地说，涉及一种天牛成虫血淋巴收集方法、装置及其制备方法与应用。

背景技术

天牛科(Cerambycidae)，隶属鞘翅目(Coleoptera)，目前全世界确定的有35000种。主要的林业蛀干害虫为天牛科的昆虫，其幼虫蛀食主干和根，成虫咬食嫩枝皮层，造成枝梢枯萎，树势衰弱，严重时可致整株全部枯死，对林业发展危害较大。其中，危害较为严重的天牛有墨天牛属Monochamus的松墨天牛Monochamus alternatus，它可以传播松材线虫Bursaphelenchus xylophilus从而引发松树萎蔫病，是重大的林业生物灾难；星天牛属Anoplophora的光肩星天牛Anoplophora glabripennis对防护林工程造成了非常大的危害；此外还有脊虎天牛属Xylotrechus的青杨脊虎天牛Xylotrechus rusticus Linnaeus可以危害多种阔叶树，对阔叶树造成毁灭性的伤害。因此，对于天牛类昆虫的防治极为重要，很多研究者都在从不同角度出发，对天牛类害虫防治进行研究探索。

随着分子生物学技术的不断发展，从分子层面出发对昆虫各个组织器官内的基因进行研究也逐渐成为了热门，其中，对于血淋巴的研究近年来也逐渐增多。昆虫的整个循环系统为开管式循环，包括背血管、体腔和辅搏器，昆虫的血液充满整个体腔，流动于器官间，因为昆虫的血液兼有哺乳动物的血液及淋巴液的特点，因此又称为“血淋巴”。血淋巴在昆虫体内运输养料、激素和代谢废物，帮助维持正常血压，还可以调节体温、产生免疫反应等，在昆虫的生长发育过程中起到了非常重要的作用，因此对昆虫血淋巴的收集及后续RNA的提取可以为进一步研究昆虫体内的相关分子生物学提供有效帮助。昆虫血淋巴收集与利用方面的研究越来越多，杨伟克等人研究昆虫激素对家蚕激素和体壁酚氧化酶活性及其基因表达水平的影响时采用抽提法提取了家蚕血淋巴；张越等人研究金边地鳖血淋巴活性成分及其对胃癌细胞抑制作用时，采用了挤压和多次离心的方法提取昆虫血淋巴，但耗时较长；对昆虫血淋巴的提取还有蜡盘法、撕裂法等等。天牛科昆虫幼虫的血淋巴提取较为容易，但是天牛成虫因其构造复杂、鞘翅坚硬、血淋巴含量少等特点在收集过程中会遇到较多的困难，同时，血淋巴中存在黑化和活性成分易降解的特点，因此，快速且简便的收集提取天牛成虫的血淋巴非常重要。

发明内容

针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种可快速、简便、高效收集天牛成虫的血淋巴的方法、装置与应用。

为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

一种收集天牛成虫血淋巴的方法，其包括：

(1)将活体天牛成虫用生理盐水淋洗，擦干备用，或者取冷冻的天牛成虫放在冰上备用；

(2)制作展平装置

所述展平装置用于使尼龙网形成一适于待收集血淋巴的天牛成虫放置的空间；

(3)制作部分天牛成虫血淋巴收集装置

所述天牛成虫血淋巴收集装置包括：收集管(优选匹配天牛大小选择)、尼龙网(优选匹配天牛大小选择大小)和两个缓冲区固定块；通过所述展平装置使所述尼龙网在所述收集管中形成一适于待收集血淋巴的天牛成虫放置的空间，将所述尼龙网与所述收集管相互固定(可通过封口膜等将留在收集管外的尼龙网部分固定在收集管外部，之后去除管外的未进行固定的多余的尼龙网部分，以方便放入离心机中进行天牛血淋巴的收集)；

(4)从触角基部去除步骤(1)中备用的天牛成虫的两根触角，同时也去除步骤(1)中备用的天牛成虫的整个口器部分及第一对足；

(5)制作剩余天牛成虫血淋巴收集装置

安装缓冲区固定块，使两个所述缓冲区固定块位于所述空间中，并固定在所述尼龙网上，以使经步骤(4)处理后的所述待收集血淋巴的天牛成虫在头向下放入所述空间中时，两个所述缓冲区固定块位于所述天牛成虫的鞘翅最前端，所述天牛成虫的头部与所述尼龙网的底部相距1.8-2.2mm；

(6)当经步骤(4)处理后的所述待收集血淋巴的天牛成虫的血淋巴从触角、口器或前足断口处中的任意一处外溢聚成滴状时，立即将其头向下放入所述空间中，通过离心进行天牛成虫血淋巴的收集。

目前天牛血淋巴的收集方法多为针对其幼虫，因为幼虫的血淋巴可以直接用针管抽取，方便收集。但成虫因为外壳坚硬易碎，较难获得。且天牛的体型大小不一，现有收集其血淋巴的方法，如双离心管法(针对的对象多是蚊子等小型幼虫)，因离心管的规格所限，无法根据天牛成虫体型的大小随意进行适应性变化，故而没有很好的通用性。且双离心管法通过在内管中戳出供血淋巴流出的洞的方式来收集血淋巴，其洞的大小难以合理控制，导致收集到的血淋巴样品纯度差，且双离心管材质坚硬，会在离心时导致天牛成虫内部或者外部的结构完整性遭到破坏，无法继续用于其他实验操作。昆虫血淋巴的收集及后期的应用在很多分子实验中都有需要，因此，收集后昆虫的结构完整性对于后期的实验尤为重要，如何去保证在高速离心和天牛本身有少量缺口的情况下，仍使天牛结构相对完整也是一个技术难点。

而本发明通过研究设计了一种新的天牛成虫血淋巴收集方法，其可根据待收集天牛成虫个体的大小(包括大、中、小体型)，对应形成适合的放置空间，从而解决了天牛成虫体型差异对血淋巴收集所产生的局限性。且本发明方法收集到的血淋巴的污染量少。天牛成虫的体内器官多样且较为混杂，在收集的过程中很容易使体内的肠道等内容物破损，从而造成污染，而采用本发明的方法通过天牛切口处理位置和离心时机的选择以及装置的构造特点等，最大限度的保证了血淋巴的收集量，同时也可保证血淋巴的纯净性，收集到的血淋巴满足了对天牛成虫血淋巴中血浆和血细胞完整性的要求。

此外，本发明特别考虑到了天牛成虫的构造和行为特点(即大部分天牛的头部都较小且容易脆断，但是与鞘翅基部相平行的中胸腹板处较为坚硬，同时，活体天牛在被放入管中后，会有向管口处后退的本能反应)，以及离心过程中的冲击力可能导致的破损等问题，特别在特定位置设置了可以起到缓冲和固定作用的缓冲区固定块，最终可以保持收集完成后的天牛整体形态结构不遭到破坏，确保了血淋巴收集质量。

而且，目前血淋巴的收集研究针对于活虫较多，但是本发明方法对于冰冻的天牛仍然可以提取到所需的血淋巴，在一定程度上扩大了应用范围。

本发明的方法中，所述展平装置包括展平棒、第一固定装置、第二固定装置、第三固定装置、第四固定装置、第一定型圈和第二定型圈；

所述第一定型圈和第二定型圈可套在所述展平棒上，并具有不同的外径；所述第一定型圈的外径可使位于所述收集管内的尼龙网形成大于待收集血淋巴的天牛成虫的虫体最宽处的空间，所述第二定型圈的外径可使位于所述收集管内的尼龙网形成大于待收集血淋巴的天牛成虫的头部宽度的空间；

所述第一固定装置、第二固定装置、第三固定装置和第四固定装置分别可使所述第一定型圈和第二定型圈的位置不在套入所述展平棒上后随意上下移动。

本发明通过特定的展平装置，可使得天牛放置的空间形态更加合理，利于保证收集效果。

本发明的方法中，所述离心的速度为4000-11000rpm，时间为30s-60s。

本发明通过对离心条件的特别设计，既能使收集完血淋巴后的天牛成虫仍然可以存活，又可最大限度的收集到大量的血淋巴，快速高效且量多。

本发明的方法中，所述尼龙网为800目；和/或，所述生理盐水的质量百分比为75％。

本发明方法中，尼龙网的形状可为圆形，其半径可为天牛体长+(1.5-5)cm，可以既节省原料，又保证其可形成足够天牛放置的空间。

作为一个具体优选实施方式，本发明的收集方法为：

收集待测天牛，活体天牛用生理盐水冲洗以减缓其行动能力(冷冻处理后的天牛则不用)，避免天牛因过分紧张而引起的一系列实验误差，擦拭干净后剪去天牛一对触角(从触角基部开始剪断)、口器及一对前足，当看到血淋巴从任意一处外溢聚成滴状时(-80℃保存的天牛在20℃下1分钟以内(30-60s)即可完成)，迅速将天牛头部朝下放入本发明的收集装置中(放入尼龙网形成的漏网内)，在离心机中进行离心处理，即可得到天牛成虫血淋巴。后续可将收集得到的血淋巴通过血细胞的分离方法，将血细胞分离出来，分离出来的血细胞经过提取可以得到质量较好的RNA，也可以将提取的血淋巴等用于别处研究。

优选，生理盐水的浓度为75％，离心机的设置为：离心速度为5000rpm，时间为30-35s，温度为4℃(提前预冷)。体积较大的天牛可适当延长离心时间至1min。

本发明还提供一种天牛成虫血淋巴收集装置，其包括：收集管、尼龙网和两个缓冲区固定块；

所述尼龙网在所述收集管中形成一适于待收集血淋巴的天牛成虫放置的空间，两个所述缓冲区固定块位于所述空间中，并固定在所述尼龙网上，以使所述天牛成虫在头向下放入所述空间中时，两个所述缓冲区固定块位于所述天牛成虫的鞘翅最前端，所述天牛成虫的头部与所述尼龙网的底部相距1.8-2.2mm；所述尼龙网与所述收集管相互固定。

本发明的天牛成虫血淋巴收集装置中，所述尼龙网为800目。

本发明另提供一种制备上述方法中使用的天牛成虫血淋巴收集装置，或上述天牛成虫血淋巴收集装置的方法，其包括：

(1)制备展平装置

所述展平装置包括展平棒、第一固定装置、第二固定装置、第三固定装置、第四固定装置、第一定型圈和第二定型圈；

所述第一定型圈和第二定型圈可套在所述展平棒上，并具有不同的外径；所述第一定型圈的外径可使位于所述收集管内的尼龙网形成大于待收集血淋巴的天牛成虫的虫体最宽处的空间，所述第二定型圈的外径可使位于所述收集管内的尼龙网形成大于待收集血淋巴的天牛成虫的头部宽度的空间；

所述第一固定装置、第二固定装置、第三固定装置和第四固定转置分别可使所述第一定型圈和第二定型圈的位置不在套入所述展平棒上后随意上下移动；

制备时，将待收集血淋巴的经生理盐水淋洗后的活体天牛成虫或冷冻的天牛成虫与所述展平棒平行放置，使天牛成虫的头部端点与所述展平棒自底端点起往上1.8mm-2.2mm处齐平，在所述展平棒上标记出待收集血淋巴的天牛成虫的头部最前端位置和鞘翅最前端位置，然后先将所述第二固定装置固定在所述展平棒上标记的所述头部最前端位置，再将所述第二定型圈套入所述展平棒，使其紧邻所述第二固定装置并对应位于所述待收集血淋巴的天牛成虫的头部前端位置，然后将第四固定装置固定在所述展平棒上，使其紧邻所述第二定型圈，之后将所述第一固定装置固定在所述展平棒上标记的所述鞘翅最前端位置的下方，再将所述第一定型圈套入所述展平棒，使其紧邻所述第一固定装置并对应位于所述鞘翅最前端位置，最后将第三固定装置固定在所述展平棒上，使其紧邻所述第一定型圈；

(2)将所述尼龙网置于所述收集管中，通过从所述收集管的管口插入所述展平装置，使所述尼龙网在所述收集管中形成适于待收集血淋巴的天牛成虫放置的空间；或者，通过所述展平装置将平放于所述收集管的管口的所述尼龙网，贴合所述收集管的内边缘塞入所述收集管内，形成适于待收集血淋巴的天牛成虫放置的空间；

(3)拿出所述展平装置，将所述尼龙网与所述收集管固定；

(4)确定缓冲区固定块的位置并安装：

将待收集血淋巴的经生理盐水淋洗后的活体天牛成虫或冷冻的天牛成虫的两根触角、整个口器部分及第一对足去除后，头向下放入所述收集管中的所述尼龙网形成的所述空间内，待所述天牛成虫的头部最前端距离所述尼龙网的底部1.8-2.2mm的位置时，记录此时其鞘翅最前端在所述尼龙网中的位置，作为缓冲区固定块放置的位置，随后保持目前所述天牛成虫的上下位置不变，将其与所述收集装置一同调整为水平放置，并调整所述天牛成虫距离所述尼龙网左右两侧的位置，使其位于中间，测量此时所述天牛成虫的两个鞘翅顶部到左右两侧尼龙网的距离，计为d；

制作两个缓冲区固定块，每个所述缓冲区固定块的长度为d+(1.8-2.2)mm，高度为2-10mm，宽度为2-10mm；将制作好的两个所述缓冲区固定块分别通过由所述缓冲区固定块的高度和宽度组成的截面，固定在所述尼龙网中上述确定的缓冲区固定块放置的位置。

本发明的方法中，缓冲区固定块的高度和宽度可根据待收集血淋巴的天牛成虫的体积进行对应调整，以保证天牛可在收集管内被稳定固定为宜。如，对于体型在1-1.5厘米的天牛，缓冲区固定块的高度和宽度可为3mm，对于体型大于1.5厘米至2.5厘米之间的天牛，缓冲区固定块的高度和宽度可为5mm，对于体型大于2.5厘米至3.5厘米之间的天牛，缓冲区固定块的高度和宽度可为7mm。高度和宽度也可不同。

缓冲区固定块的材质可为泡沫等轻质材料。

本发明的方法中，将所述尼龙网与所述收集管固定的方法为：将未装入所述收集管中的尼龙网部分与所述收集管的外部进行固定，优选去除收集管外，未与收集管进行固定的多余尼龙网。

本发明的方法中，所述展平棒为玻璃棒，所述第一固定装置、第二固定装置、第三固定装置、第四固定装置为卡扣，所述第一定型圈和第二定型圈为表面光滑的橡胶圈。

各部件具体材料不限，只要可实现本发明部件所发挥的目的即可。

本发明再提供一种上述方法，或上述天牛成虫血淋巴收集装置，或上述方法制备得到的天牛成虫血淋巴收集装置在提取天牛成虫RNA中的应用，所述RNA位于血淋巴的血细胞中。

本发明的应用中，在通过上述天牛成虫血淋巴收集装置，或上述方法制备得到的天牛成虫血淋巴收集装置，或上述收集天牛成虫血淋巴的方法获得天牛成虫血淋巴后，还包括以EDTA与所述天牛成虫血淋巴混合的步骤，所述EDTA与所述天牛成虫血淋巴的体积比为1:10。

本发明对EDTA的用量比例进行了特别研究，采用本发明方法可高效快速提取到大量的血细胞，以用于RNA提取等一系列分子实验中。

作为一个具体优选实施方式，本发明的将血淋巴细胞分离及总RNA提取的方法如下：

(1)将EDTA与所得的天牛血淋巴液体混合(冰上操作)。

(2)将混合后的液体8000rpm，4℃，离心20min，分离血细胞。

(3)弃上清，保留白色沉淀，即为血细胞。

(4)收集到的血细胞活性较好，经trizol等裂解液裂解后使用试剂盒提取RNA(试剂盒的型号为：Rneasy plus强化提取试剂盒QIAGEN，货号：74134)，之后进行nanodrop8000检测结果。

本发明的有益效果至少在于：

(1)本发明的血淋巴收集装置适于应用在外壳坚硬、结构复杂的各体型天牛成虫血淋巴收集中，过滤效果好，成本低，可塑性高。该收集装置可以过滤掉天牛体内的肠道等影响血淋巴纯度的成分，且装置的主要成分为尼龙网和收集管，成本较低，同时可以根据天牛的大小制作合适的装置，要求较低。

(2)本发明相较于一般的血淋巴收集技术耗时短，与其它血淋巴收集技术相比简单、高效；

(3)本发明所述血淋巴包括淋巴液、血清及血细胞，一头天牛成虫收集到的血淋巴量根据天牛大小从几十到几百微升不等，大约可以收集到一头天牛体内80％以上血淋巴含量(1cm左右长的天牛可收集到20-60ul左右的血淋巴，2cm左右长的天牛的可收集到120-180ul左右，3cm左右长的天牛可以收集到150-250ul左右的血淋巴)，能最大程度的收集到天牛成虫血淋巴用量；

(4)本发明不损害天牛体内其它组织器官的完整性与活性：在收集血淋巴的过程中，可以保持天牛体内其它组织器官的活性，对于活体天牛，收集血淋巴后天牛仍然可以存活，对于后续的其他实验操作没有过多影响；

(5)本发明对于天牛成虫的状态要求不高：活体天牛成虫和-80℃冰冻处理后的天牛均可用于血淋巴的收集和后续RNA提取；

(6)本发明的方法可保持血淋巴的活性，再分离血细胞用于后续RNA的提取或者其他的分子生物学相关实验操作。在后续的RNA提取过程中，成功率高，时间快，收集到的血细胞通过RNA提取技术可以提出较为完整、有效的RNA，可以为天牛成虫血淋巴相关实验的研究提供有力的基础。

附图说明

图1为本发明的血淋巴收集装置示意图。

图2为本发明的展平装置示意图。

图3为本发明实施例1收集的天牛成虫血淋巴提取后的RNA nanodrop质量检测图。

图4为本发明实施例2收集的天牛成虫血淋巴提取后的RNA nanodrop质量检测图。

图5为本发明实施例2天牛成虫在收集完血淋巴后鞘翅提取的RNA nanodrop质量检测图。

图6为本发明实施例3收集的天牛成虫血淋巴提取后的RNA nanodrop质量检测图。

图7为本发明对比例1中收集装置在离心前后的对比图。

图8为本发明对比例2收集的天牛成虫血淋巴提取后的RNA nanodrop质量检测图。

图9为本发明对比例4离心收集后的结果图。

图10为本发明对比例5离心收集后的结果图。

其中，1：收集管，2：尼龙网，3：缓冲区固定块，4：天牛，5：封口膜，6：展平棒，7：第一定型圈，8：第一固定装置，9：第二定型圈，10：第二固定装置，11：第三固定装置，12：第四固定装置。

RNA nanodrop质量检测图中的横坐标为波长，纵坐标为吸光度。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明中所用EDTA为索莱宝2K抗凝剂(10X)，稀释10倍所用的水为灭菌后的RNAfreeH₂O。

实施例1松皮天牛(采自辽宁抚顺大伙房林场，经传统分类学研究鉴定)血淋巴的收集及血细胞分离及血淋巴样品总RNA提取

本实施例提供一种本发明的天牛成虫血淋巴收集装置、收集方法及收集物RNA提取方法。

具体如下：

(1)将活体松皮天牛(去除触角后体长1.2厘米)用75％生理盐水淋洗，再用无菌棉将其擦干。

(2)制备展平装置(示意图参见图2)

展平装置由展平棒6、第一固定装置8、第二固定装置10、第三固定装置11、第四固定装置12和外直径不同的可拆卸的第一定型圈7、第二定型圈9组成。本实施例中展平棒6为玻璃棒，第一定型圈7、第二定型圈9为表面光滑的橡胶圈，其可套在玻璃棒上。第一固定装置8、第二固定装置10为分别可使第一定型圈7、第二定型圈9的位置不在玻璃棒上随意向下移动的卡扣，第三固定装置11、第四固定装置12为分别可使第一定型圈7、第二定型圈9的位置不在玻璃棒上随意向上移动的卡扣，第一定型圈7、第二定型圈9的外径分别为8mm和6mm。

制备时，将步骤(1)的松皮天牛成虫与展平棒6平行放置，使天牛成虫的头部端点与展平棒6自底端点起往上2mm处齐平，在展平棒6上标记出天牛成虫的虫体头部最前端位置和鞘翅最前端位置。将第一个卡扣(第二固定装置10)安装在距玻璃棒下端点2mm的位置，然后套入外径较小的橡胶圈(第二定型圈9)，使其紧邻第一个卡扣(第二固定装置10)上方并对应位于松皮天牛头部前端处，之后套入第二个卡扣(第四固定装置12)，使其紧邻第二定型圈9。第一个卡扣(第二固定装置10)可限制住该橡胶圈(第二定型圈9)向玻璃棒下端点的移动，第二个卡扣(第四固定装置12)可限制住该橡胶圈(第二定型圈9)向玻璃棒上端点的移动，两者共同使第二定型圈9的位置可以固定在玻璃棒上。之后在距玻璃棒下端点0.6cm厘米的位置(步骤(1)松皮天牛头部端点与玻璃棒自下端点往上2mm处(第二固定装置10固定处)对齐，平行放置后确定的松皮天牛鞘翅最前端位置下方)安装第三个卡扣(第一固定装置8)，然后套入外径较大的橡胶圈(第一定型圈7)，使其紧邻第三个卡扣(第一固定装置8)上方并位于虫体鞘翅最前端位置，之后在玻璃棒上安装第四个卡扣(第三固定装置11)，使其紧邻第一定型圈7。第三个卡扣(第一固定装置8)可限制住该橡胶圈(第一定型圈7)向玻璃棒下端点的移动，第四个卡扣(第三固定装置11)可限制住该橡胶圈(第一定型圈7)向玻璃棒上端点的移动，两者共同使第一定型圈7的位置可以固定在玻璃棒上，进而将展平装置制作完成。

将800目的尼龙网2裁剪成直径为6cm左右的圆形，经酒精浸泡灭菌消毒。

(3)制作部分血淋巴收集装置(示意图参见图1)，使用步骤(2)制得的配套的展平装置将已放在1.5ml无盖离心管(收集管1)管口的上述尼龙网2贴合离心管内边缘塞入其中，用封口膜5将尼龙网2固定在1.5ml离心管上(固定位置位于管口外侧)，剪去1.5ml离心管管口下方多余部分。

(4)将步骤(1)处理后的松皮天牛的两根触角(从触角基部开始剪断)、整个口器部分及第一对足剪去，备用。

(5)制作完成血淋巴收集装置，用镊子将步骤(4)处理后的松皮天牛4头部朝下，放入离心管中的尼龙网2内，待松皮天牛4的头部最前端距离尼龙网2底部约2mm的位置时(留出空隙以便血淋巴液体收集过程中起到缓冲作用)，记录此时其鞘翅最前端在尼龙网2中的位置，作为缓冲区固定块3放置的位置，随后保持目前松皮天牛4的上下位置不变，将其与收集装置一同调整为水平放置，并调整松皮天牛4距离尼龙网2左右两侧的位置，使其位于中间，测量此时松皮天牛4的两个鞘翅顶部到左右两侧尼龙网的距离，计为d，本实施例中为4mm。

选取干净的泡沫块，用其切割出两个缓冲区固定块3。每个缓冲区固定块3的长度为d+2mm，高度为3mm，宽度为3mm。之后用强力胶将两个缓冲区固定块3分别通过由缓冲区固定块3的高度和宽度组成的截面，固定在尼龙网2中上述确定的缓冲区固定块放置位置，完成收集装置的制作。

(6)当观察到第一颗水滴状血淋巴外溢时，立刻将步骤(4)处理后的松皮天牛头4朝下放入制作好的血淋巴收集装置中。

(7)迅速放入离心机中进行短暂的离心处理，设置离心速度为4000rpm，时间为32s，温度为4℃(提前预冷)。

(8)离心结束可收集到较为纯净的血淋巴20ul。收集血淋巴后的松皮天牛仍可自主爬行。

(9)将血淋巴细胞分离并提取总RNA：

①取EDTA10ul加入90ul的无菌水与其混合，配置成为稀释10倍的EDTA，将收集到的血淋巴与EDTA等体积混合(即20ul的血淋巴加入20ul稀释过后的EDTA)放入离心机中4℃，8000rpm，20min分离血细胞。

②将离心过后的血淋巴细胞保留，弃去上层液体，往管中加入1000ul trizolreagent。

③室温放置15min(可延长25min)。

④4℃，12000rpm离心，10min，取上清800ul置于离心管中。

⑤用26g注射器抽打3次，剪切gDNA和裂解残留细胞。

⑥加入200ul氯仿预冷，剧烈振荡15s，室温放置3分钟。

⑦4℃，12000rpm离心，20min,.之后配合Rneasy plus强化提取试剂盒QIAGEN使用说明进行RNA提取即可。

RNA提取结果见图3：松皮天牛RNA浓度：322.3ng/ul，260/280:2.15，260/230:1.85。

本实施例进一步将提取得到的血淋巴RNA进行凝胶电泳测试，结果可出现28s,18s,5s三条较为清晰的条带，进一步说明提取后的RNA没有降解，可用于后续研究。

可进一步将收集到的血淋巴迅速放入-80℃冰箱中用于后续的实验操作。

实施例2云杉花墨天牛(采自辽宁抚顺大伙房林场，经传统分类学研究鉴定)血淋巴的收集及血细胞分离及血淋巴样品总RNA提取

本实施例提供一种本发明的天牛成虫血淋巴收集装置、收集方法及收集物RNA提取方法。

具体如下：

(1)拿出-80℃冷冻的云杉花墨天牛放在冰上备用(去除触角后体长1.8厘米)。

(2)制备展平装置，方法参见实施例1。区别仅在于，第一固定装置8安装在距玻璃棒下端点0.8cm的位置。

将800目的尼龙网2裁剪成直径为7cm左右的圆形，经酒精浸泡灭菌消毒。

(3)制作部分血淋巴收集装置，具体与实施例1的制备方法相同。

(4)将步骤(1)备用的云杉花墨天牛的两根触角(从触角基部开始剪断)、整个口器部分及第一对足剪去。

(5)制作完成血淋巴收集装置，具体与实施例1的制备方法相同，区别仅在于，云杉花墨天牛两个鞘翅顶部到左右两侧尼龙网的距离d为2mm。每个缓冲区固定块3的长度为d+2mm，高度为5mm，宽度为5mm。

(6)当观察到第一颗水滴状血淋巴外溢时(在20℃下大约1Min即可有血淋巴溢出)立刻将步骤(4)处理后的云杉花墨天牛头朝下放入制作好的血淋巴收集装置中。

(7)迅速放入离心机中进行短暂的离心处理，设置离心速度为11000rpm，时间为32s，温度为4℃(提前预冷)。

(8)离心结束收集到较为纯净的血淋巴130ul。

(9)按照实施例1记载的方法提取血淋巴中的RNA。

RNA提取结果见图4：云杉花墨天牛血淋巴浓度为：1259ng/ul，260/280:2.18，260/230:2.06。

将提取得到的血淋巴RNA进行凝胶电泳测试可出现28s,18s,5s三条较为清晰的条带。

在收集完血淋巴后，用剪刀剪下提取过血淋巴后的云杉花墨天牛的鞘翅，放入1.5ml的离心管中，按照如下操作流程提取云杉花墨天牛的鞘翅RNA：

(1)在管中加入500ul trizol进行研磨操作。

(2)研磨完成后再加入500ul trizol静置15min。

(3)4℃，12000rpm离心10min，取上清液800ul置于离心管中。

(4)用26g注射器抽打3次，剪切gDNA和裂解残留细胞。

(5)加入200ul氯仿(三氯甲烷)预冷，剧烈震荡15s，室温放置3min。

(6)4℃，12000rpm离心，20min，之后配合Rneasy plus强化提取试剂盒QIAGEN使用说明进行鞘翅RNA提取。

鞘翅提取的RNAnanodrop质量检测图见图5。血淋巴浓度为：831.8ng/ul，260/280:2.11，260/230:2.29。

本实施例进一步将提取得到的鞘翅RNA进行凝胶电泳测试，结果可出现28s,18s,5s三条较为清晰的条带。说明在提取血淋巴后，天牛仍能用于进行其他实验操作。

实施例3光肩星天牛(采自河北秦皇岛，经传统分类学研究鉴定)血淋巴的收集及血细胞分离及血淋巴样品总RNA提取

本实施例提供一种本发明的天牛成虫血淋巴收集装置、收集方法及收集物RNA提取方法。

具体如下：

(1)将活体光肩星天牛(去除触角后体长2.7厘米)用75％生理盐水淋洗，再用无菌棉将其擦干。

(2)制备展平装置，方法参见实施例1。区别仅在于，第一固定装置8安装在距玻璃棒下端点1cm的位置。第一定型圈7、第二定型圈9的外径分别为14mm和10mm。

将800目的尼龙网2裁剪成直径为12cm左右的圆形，经酒精浸泡灭菌消毒。

(3)制作部分血淋巴收集装置，具体与实施例1的制备方法相同。

(4)将步骤(1)处理后的光肩星天牛的两根触角(从触角基部开始剪断)、整个口器部分及第一对足剪去。

(5)制作完成血淋巴收集装置，具体与实施例1的制备方法相同，区别仅在于，以15ml离心管作为收集管。光肩星天牛两个鞘翅顶部到左右两侧尼龙网的距离d为2mm。每个缓冲区固定块3的长度为d+2mm，高度为7mm，宽度为7mm。

(6)当观察到第一颗水滴状血淋巴外溢时立刻将步骤(4)处理后的光肩星天牛头朝下放入制作好的血淋巴收集装置中。

(7)迅速放入离心机中进行短暂的离心处理，设置离心速度为5000rpm，时间为55s，温度为4℃(提前预冷)。

(8)离心结束收集到较为纯净的血淋巴220ul。收集血淋巴后的光肩星天牛仍可自主爬行。

(9)按照实施例1记载的方法提取血淋巴中的RNA。

RNA提取结果见图6：光肩星天牛RNA浓度：2823ng/ul，260/280:2.07，260/230:2.23。

对比例1

本对比例提供一种天牛成虫血淋巴收集装置及收集方法。

天牛品种、性别与实施例1相同，体型年龄也基本相同，收集装置制备方法与实施例1基本相同，区别仅在于，以定性的7cm快速双圈滤纸替换尼龙网。

具体收集方法与实施例1相同。

结果：在经过离心处理后，因滤纸材质接触到液体后破损，导致天牛成虫穿透滤纸直接进入管中，如图7。左图为安装好的使用滤纸的收集装置，右图是使用后，收集装置中昆虫冲破滤纸的图片。

对比例2

本对比例提供一种天牛成虫血淋巴收集装置、收集方法及收集物RNA提取方法。

天牛品种、性别相同与实施例2，体型年龄也基本相同，收集装置制备方法与实施例2基本相同，区别仅在于，以纱布替换尼龙网。

具体收集方法与实施例2相同，RNA提取方法与实施例1相同。

结果：在经过离心处理后，因纱布的网眼可伸缩性较大，同时纱布有易于吸水，导致过滤出来的血淋巴液体存在一定的杂质，且收集的量相较于使用尼龙网收集到的血淋巴量少，仅为70uL，且后期RNA浓度检测时，260/230为1.13，显示蛋白污染，如图8。

对比例3

本对比例提供一种天牛成虫血淋巴收集装置及收集方法。

天牛品种、性别与实施例2相同，体型年龄也基本相同，收集装置的制备方法与实施例2相同，具体进行收集时与实施例2的操作基本相同，区别仅在于，仅剪去天牛的两个触角。

结果：在相同的处理条件下，收集到的血淋巴量较少，一头长约2cm左右的云杉花墨天牛按实施例2的方法可收集到130ul左右的血淋巴，但使用该方法只能收集到60ul左右。

对比例4

本对比例提供一种天牛成虫血淋巴收集装置及收集方法。

天牛品种、性别与实施例1相同，体型年龄也基本相同，收集装置的制备方法与实施例1相同，具体进行收集时与实施例1的操作基本相同，区别仅在于，剪去天牛的两个触角和三对足。

结果：在相同的处理条件下，收集到的血淋巴内部污染物较多，液体不纯(如图9中的左侧试管显示)且天牛的虫体因为开口处较多，造成了较为严重的损坏情况(如图9中的右侧显示)。

对比例5

本对比例提供一种天牛成虫血淋巴收集装置及收集方法。

天牛品种、性别与实施例1相同，体型年龄也基本相同，收集装置的制备方法与实施例1相同，具体进行收集时与实施例1的操作基本相同，区别仅在于，离心条件为12000rpm。

结果：因转速过高，天牛成虫的身体结构遭到一定的破坏，如图10中的右侧显示(左侧为血淋巴收集结果)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种收集天牛成虫血淋巴的方法，其特征在于，包括：

(1)将活体天牛成虫用生理盐水淋洗，擦干备用，或者取冷冻的天牛成虫放在冰上备用；

(2)制作展平装置

所述展平装置用于使尼龙网形成一适于待收集血淋巴的天牛成虫放置的空间；

(3)制作部分天牛成虫血淋巴收集装置

所述天牛成虫血淋巴收集装置包括：收集管、尼龙网和两个缓冲区固定块；通过所述展平装置使所述尼龙网在所述收集管中形成一适于所述待收集血淋巴的天牛成虫放置的空间，将所述尼龙网与所述收集管相互固定；

(4)从触角基部去除步骤(1)中备用的天牛成虫的两根触角，同时也去除步骤(1)中备用的天牛成虫的整个口器部分及第一对足；

(5)制作剩余天牛成虫血淋巴收集装置

安装所述缓冲区固定块，使两个所述缓冲区固定块位于所述空间中，并固定在所述尼龙网上，以使经步骤(4)处理后的所述待收集血淋巴的天牛成虫在头向下放入所述空间中时，两个所述缓冲区固定块位于所述天牛成虫的鞘翅最前端，所述天牛成虫的头部与所述尼龙网的底部相距1.8-2.2mm；

(6)当经步骤(4)处理后的所述待收集血淋巴的天牛成虫的血淋巴从触角、口器或前足断口处中的任意一处外溢聚成滴状时，立即将其头向下放入所述空间中，通过离心进行天牛成虫血淋巴的收集。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述展平装置包括展平棒、第一固定装置、第二固定装置、第三固定装置、第四固定装置、第一定型圈和第二定型圈；

所述第一定型圈和第二定型圈可套在所述展平棒上，并具有不同的外径；所述第一定型圈的外径可使位于所述收集管内的尼龙网形成大于待收集血淋巴的天牛成虫的虫体最宽处的空间，所述第二定型圈的外径可使位于所述收集管内的尼龙网形成大于待收集血淋巴的天牛成虫的头部宽度的空间；

所述第一固定装置和第二固定装置分别可使所述第一定型圈和第二定型圈的位置不在套入所述展平棒上后随意向下移动；所述第三固定装置和第四固定装置分别可使所述第一定型圈和第二定型圈的位置不在套入所述展平棒上后随意向上移动。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述离心的速度为4000-11000rpm，时间为30s-60s。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述尼龙网为800目；和/或，所述生理盐水的质量百分比为75％。

5.一种天牛成虫血淋巴收集装置，其特征在于，包括：收集管、尼龙网和两个缓冲区固定块；

所述尼龙网在所述收集管中形成一适于待收集血淋巴的天牛成虫放置的空间，两个所述缓冲区固定块位于所述空间中，并固定在所述尼龙网上，以使所述天牛成虫在头向下放入所述空间中时，两个所述缓冲区固定块位于所述天牛成虫的鞘翅最前端，所述天牛成虫的头部与所述尼龙网的底部相距1.8-2.2mm；所述尼龙网与所述收集管相互固定。

6.根据权利要求5所述的天牛成虫血淋巴收集装置，其特征在于，所述尼龙网为800目。

7.一种制备权利要求1-4任一项所述的方法中使用的天牛成虫血淋巴收集装置，或权利要求5或6所述的天牛成虫血淋巴收集装置的方法，其特征在于，包括：

(1)制备展平装置

所述展平装置包括展平棒、第一固定装置、第二固定装置、第三固定装置、第四固定装置、第一定型圈和第二定型圈；

所述第一定型圈和第二定型圈可套在所述展平棒上，并具有不同的外径；所述第一定型圈的外径可使位于所述收集管内的尼龙网形成大于待收集血淋巴的天牛成虫的虫体最宽处的空间，所述第二定型圈的外径可使位于所述收集管内的尼龙网形成大于待收集血淋巴的天牛成虫的头部宽度的空间；

所述第一固定装置和第二固定装置分别可使所述第一定型圈和第二定型圈的位置不在套入所述展平棒上后随意向下移动；所述第三固定装置和第四固定装置分别可使所述第一定型圈和第二定型圈的位置不在套入所述展平棒上后随意向上移动；

制备时，将待收集血淋巴的经生理盐水淋洗后的活体天牛成虫或冷冻的天牛成虫与所述展平棒平行放置，使天牛成虫的头部端点与所述展平棒自底端点起往上1.8-2.2mm处齐平，在所述展平棒上标记出待收集血淋巴的天牛成虫的头部最前端位置以及鞘翅最前端位置，然后先将所述第二固定装置固定在所述展平棒上标记的所述头部最前端位置，再将所述第二定型圈套入所述展平棒，使其紧邻所述第二固定装置并对应位于所述待收集血淋巴的天牛成虫的头部前端位置，然后将所述第四固定装置固定在所述展平棒上，使其紧邻所述第二定型圈，之后将所述第一固定装置固定在所述展平棒上标记的所述鞘翅最前端位置的下方，再将所述第一定型圈套入所述展平棒，使其紧邻所述第一固定装置并对应位于所述鞘翅最前端位置，最后将所述第三固定装置固定在所述展平棒上，使其紧邻所述第一定型圈；

(2)将所述尼龙网置于所述收集管中，通过从所述收集管的管口插入所述展平装置，使所述尼龙网在所述收集管中形成适于待收集血淋巴的天牛成虫放置的空间；或者，通过所述展平装置将平放于所述收集管的管口的所述尼龙网，贴合所述收集管的内边缘塞入所述收集管内，形成适于待收集血淋巴的天牛成虫放置的空间；

(3)拿出所述展平装置，将所述尼龙网与所述收集管固定；

(4)确定缓冲区固定块的位置并安装：

将待收集血淋巴的经生理盐水淋洗后的活体天牛成虫或冷冻的天牛成虫的两根触角、整个口器部分及第一对足去除后，头向下放入所述收集管中的所述尼龙网形成的所述空间内，待天牛成虫的头部最前端距离所述尼龙网的底部1.8-2.2mm的位置时，记录此时其鞘翅最前端在所述尼龙网中的位置，作为缓冲区固定块放置的位置，随后保持目前所述天牛成虫的上下位置不变，将其与所述收集装置一同调整为水平放置，并调整所述天牛成虫距离所述尼龙网左右两侧的位置，使其位于中间，测量此时所述天牛成虫的两个鞘翅顶部到左右两侧尼龙网的距离，计为d；

制作两个缓冲区固定块，每个所述缓冲区固定块的长度为d+(1.8-2.2)mm，高度为2-10mm，宽度为2-10mm；将制作好的两个所述缓冲区固定块分别通过由所述缓冲区固定块的高度和宽度组成的截面，固定在所述尼龙网中上述确定的缓冲区固定块放置的位置。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述尼龙网与所述收集管固定的方法为：将未装入所述收集管中的尼龙网部分与所述收集管的外部进行固定。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述展平棒为玻璃棒，所述第一固定装置、第二固定装置、第三固定装置和第四固定装置为卡扣，所述第一定型圈和第二定型圈为表面光滑的橡胶圈。

10.权利要求1-4任一项所述的方法，或权利要求5或6所述的天牛成虫血淋巴收集装置，或权利要求7-9任一项所述的方法制备得到的天牛成虫血淋巴收集装置在提取天牛成虫RNA中的应用，所述RNA位于血淋巴的血细胞中。

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