JP2014510898A - エンドトキシン測定剤 - Google Patents

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Abstract

迅速且つ高感度にエンドトキシンを測定する方法を提供する。下記のタンパク質（１）〜（３）を含むエンドトキシン測定剤であって、該タンパク質（１）〜（３）の各々は昆虫細胞をホストとして発現することにより得られる組換えタンパク質である、測定剤を用いてエンドトキシンを測定する。
（１）タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）由来のファクターＣであって、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列を有さないファクターＣ。
（２）カブトガニのファクターＢ。
（３）カブトガニのプロクロッティングエンザイム。

Description

本発明は、エンドトキシン測定剤、当該測定剤の製造方法、及び検体中のエンドトキシンの測定方法に関する。
エンドトキシンは、グラム陰性細菌の細胞壁外膜に存在するリポ多糖であり、強い発熱性物質として知られている。また、エンドトキシンは、発熱以外にも、マクロファージの活性化に伴う炎症性サイトカインの遊離やエンドトキシンショックの誘発等、微量でも細菌感染による様々な病態を惹き起こすことが知られている。このため、注射用医薬品を始めとする医薬品、水、医療器具等におけるエンドトキシンの検出は重要である。また、エンドトキシンはグラム陰性細菌感染症におけるショックの主な原因と考えられており、血液中のエンドトキシンを測定することで、感染の有無や治療効果を判定することができる。
また、アメリカカブトガニ（リムルス・ポリフェムス；Limulus polyphemus）にグラム陰性細菌が感染すると、血管内凝固を引き起こすことが知られており、この現象はエンドトキシンの検出に利用されてきた。
すなわち、カブトガニ血球抽出液（カブトガニ・アメボサイト・ライセート。以下「ライセート」ともいう。）を使用して、エンドトキシンを測定する方法が知られている（例えば、非特許文献１）。この方法は、リムルステストと呼ばれ、エンドトキシンがライセートに接触することによって起きる、ライセート中に存在する種々のタンパク質のカスケード反応を利用するものである。カスケード反応の模式図を図１に示す。
エンドトキシンがライセートに接触すると、ライセート中に存在するファクターＣが活性化されて活性型ファクターＣが生成する。この活性型ファクターＣによって、ライセート中に存在するファクターＢが活性化されて活性型ファクターＢが生成する。この活性型ファクターＢによって、ライセート中に存在するプロクロッティングエンザイムが活性化されてクロッティングエンザイムが生成する。
このクロッティングエンザイムは、ライセート中に存在するコアギュローゲンの分子中の特定の箇所を加水分解する。これによって、コアギュリンゲルが生成してライセートが凝固する。したがって、ライセートの凝固反応を測定することで、エンドトキシンを測定することができる。
また、クロッティングエンザイムを合成基質に作用させることで発色反応を進行させ、エンドトキシンを測定することもできる。例えば、クロッティングエンザイムは、合成基質であるｔ−ブトキシカルボニル−ロイシル−グリシル−アルギニル−ｐＮＡ（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）に作用し、そのアミド結合を加水分解してｐＮＡを遊離する。よって、前記合成基質を反応系に存在させておくことで、発色物質（ｐＮＡ）の吸光度（４０５ｎｍ）を測定することによりエンドトキシンを定量することができる。
また、日本産カブトガニのライセートから精製したファクターＣ、ファクターＢ、およびプロクロッティングエンザイムを用いてカスケード反応系を再構築できることが知られている（非特許文献２）。
また、東南アジア産カブトガニであるカルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Carc
inoscorpius rotundicauda）由来の組換えファクターＣと、日本産カブトガニであるタキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）由来の組換えファクターＢおよび組換えプロクロッティングエンザイムとを用いてカスケード反応系を再構築した例が知られている（特許文献１）。
また、東南アジア産カブトガニであるカルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Carcinoscorpius rotundicauda）由来の組換えファクターＣと、活性型ファクターＣと反応して蛍光物質が遊離する基質とを用いてエンドトキシンを検出する系が知られており（特許文献２）、エンドトキシン検出システムとして商品化されている（商品名：ＰｙｒｏＧｅｎｅ（登録商標）；ロンザ（Lonza）社）。
しかしながら、ライセート、またはそれから調製された天然のファクターＣ、ファクターＢ、およびプロクロッティングエンザイムを利用するには、カブトガニを捕獲して血液を採取する必要があり、生物資源の保護等の観点から、これらの成分を無尽蔵に供給することは困難である。そのため、エンドトキシンの検出に用いる試薬を簡便、迅速、且つ安価に製造する技術が求められていた。
また、組換え型のファクターＣ、ファクターＢ、およびプロクロッティングエンザイムを用いる場合には、前記のいずれの例も、測定に１時間以上を要し、且つ0.001EU／mLオーダーの検出感度を実現していなかった。そのため、より迅速且つ高感度にエンドトキシンを測定する技術が求められていた。
国際公開パンフレット第2008/004674号 米国特許第6,849,426号
Iwanaga S. Curr Opin Immunol. 1993 Feb; 5(1): 74-82. Nakamura T. et. al., J Biochem. 1986 Mar;99(3):847-57.
本発明は、迅速且つ高感度にエンドトキシンを測定する方法を提供することを課題とする。本発明は、また、当該方法に用いるエンドトキシン測定剤およびその製造方法を提供することを課題とする。
本発明者は、昆虫細胞をホストとして用いて発現させた、日本産カブトガニであるタキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）由来の組換えファクターＣ（Ｈｉｓタグなし）、組換えファクターＢ、および組換えプロクロッティングエンザイムを利用することで、迅速且つ高感度にエンドトキシンを測定できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]
下記のタンパク質（１）〜（３）を含むエンドトキシン測定剤であって、該タンパク質（１）〜（３）の各々は昆虫細胞をホストとして発現することにより得られる組換えタンパク質である、測定剤。
（１）タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）由来のファクターＣで
あって、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列を有さないファクターＣ。
（２）カブトガニのファクターＢ。
（３）カブトガニのプロクロッティングエンザイム。
[２]
前記ファクターＢおよび前記プロクロッティングエンザイムが、タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）由来である、[１]に記載の測定剤。
[３]
前記ファクターＣが下記のタンパク質（Ａ）または（Ｂ）であり、前記ファクターＢが下記のタンパク質（Ｃ）または（Ｄ）であり、且つ、前記プロクロッティングエンザイムが下記のタンパク質（Ｅ）または（Ｆ）である、[１]または[２]に記載の測定剤。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターＣの活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｄ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターＢの活性を有するタンパク質。
（Ｅ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｆ）配列番号６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイムの活性を有するタンパク質。
[４]
下記の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む、[１]〜[３]のいずれか１項に記載の測定剤の製造方法。
（Ａ）下記のＤＮＡ（１）〜（３）の各々をウイルスＤＮＡに組み込む工程。
（１）タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）由来のファクターＣであって、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列を有さないファクターＣをコードするＤＮＡ
（２）カブトガニのファクターＢをコードするＤＮＡ
（３）カブトガニのプロクロッティングエンザイムをコードするＤＮＡ
（Ｂ）前記各ＤＮＡが組み込まれたウイルスを、各々昆虫細胞に感染させる工程。
（Ｃ）前記各ウイルスに感染した昆虫細胞に、各々のＤＮＡにコードされるタンパク質を発現させる工程。
[５]
下記の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む、[１]〜[３]のいずれか１項に記載の測定剤の製造方法。
（Ａ）下記のＤＮＡ（１）〜（３）の各々をベクターに組み込む工程。
（１）タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）由来のファクターＣであって、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列を有さないファクターＣをコードするＤＮＡ
（２）カブトガニのファクターＢをコードするＤＮＡ
（３）カブトガニのプロクロッティングエンザイムをコードするＤＮＡ
（Ｂ）前記各ＤＮＡが組み込まれたベクターを、各々昆虫細胞に導入し、昆虫細胞の染色体に前記各ＤＮＡを組み込む工程。
（Ｃ）前記各ＤＮＡが組み込まれた昆虫細胞に、各々のＤＮＡにコードされるタンパク質を発現させる工程。
[６]
前記ファクターＣをコードするＤＮＡが下記のＤＮＡ（Ａ）または（Ｂ）であり、前記ファクターＢをコードするＤＮＡが下記のＤＮＡ（Ｃ）または（Ｄ）であり、且つ、前記プロクロッティングエンザイムをコードするＤＮＡが下記のＤＮＡ（Ｅ）または（Ｆ）である、[４]または[５]に記載の測定剤の製造方法。
（Ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１に示す塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ファクターＣの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号３または８に示す塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号３または８に示す塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ファクターＢの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号５または９に示す塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｆ）配列番号５または９に示す塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロクロッティングエンザイムの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
[７]
[１]〜[３]のいずれか１項に記載の測定剤と被験試料とを混合する工程、およびカスケード反応の進行を測定する工程を含む、被験試料中のエンドトキシン測定法。
[８]
カスケード反応の進行を検出するための基質を反応系に添加する工程を含む、[７]に記載の測定法。
[９]
さらに、前記基質の反応に基づき、被験試料中のエンドトキシン量を算出する工程を含む、[８]に記載の測定法。
本発明によれば、迅速且つ高感度にエンドトキシンを測定できる。例えば、本発明の一実施形態においては、わずか３０分間の測定で0.0005 EU/mLのオーダーの検出感度を実現できる。また、本発明においては、発現した組換えファクターＣ、組換えファクターＢ、および組換えプロクロッティングエンザイムを精製することなく利用することができ、よって、これら組換えタンパク質を含有するエンドトキシン測定剤を簡便、迅速、且つ安価に製造することができる。
図１は、リムルステストのカスケード反応系を示す図である。 図２は、ベクターｐＩＺ／Ｖ５−Ｈｉｓの構造と遺伝子の挿入箇所を示す図である。上部の矢印が遺伝子の挿入箇所を示す。 図３は、各種ファクターＣの発現量を示す写真である。 図４は、各種ファクターＣの活性を示す図である。 図５は、ウイルス法で発現させたファクターＣの安定性を示す写真である。 図６は、安定発現細胞法で発現させたファクターＣの安定性を示す写真である。 図７は、中空糸膜ろ過による処理が、ウイルス法で発現させた各因子の反応性に与える効果を示す図である。 図８は、ウイルス法で発現させた各因子を含有するエンドトキシン測定剤の反応性を示す図である。 図９は、安定発現細胞法で発現させた各因子を含有するエンドトキシン測定剤の反応性を示す図である。（ａ）エンドトキシン濃度0〜0.1 EU/mLでの反応性。（ｂ）エンドトキシン濃度0〜0.01 EU/mLでの反応性。 図１０は、精製した組換えおよび天然Ｆａｃｔｏｒ Ｃの純度と濃度を示す写真である。 図１１は、ＢＳＡのバンド強度と量の相関を示す検量線である。 図１２は、精製した組換えおよび天然Ｆａｃｔｏｒ Ｃの活性を示す図である。
本発明においては、エンドトキシンによりファクターＣが活性化されて活性型ファクターＣが生成し、活性型ファクターＣによりファクターＢが活性化されて活性型ファクターＢが生成し、活性型ファクターＢによりプロクロッティングエンザイムが活性化されてクロッティングエンザイムが生成する一連の反応を「カスケード反応」という場合がある。
（１）本発明のエンドトキシン測定剤
本発明のエンドトキシン測定剤は、ファクターＣ、ファクターＢ、およびプロクロッティングエンザイムを含む。本発明のエンドトキシン測定剤に含まれるファクターＣ、ファクターＢ、およびプロクロッティングエンザイムを、以下、それぞれ本発明のファクターＣ、本発明のファクターＢ、および本発明のプロクロッティングエンザイムという場合がある。また、ファクターＣ、ファクターＢ、およびプロクロッティングエンザイムを総称して「因子」という場合がある。
本発明のファクターＣ、本発明のファクターＢ、および本発明のプロクロッティングエンザイムは、いずれも昆虫細胞をホストとして発現させることにより得られる組換えタンパク質である。
本発明のファクターＣは、日本産カブトガニであるタキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）由来のファクターＣである。本発明のファクターＣは、Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されていないことを特徴とする。また、本発明のファクターＣは、Ｃ末端にＶ５タグが付加されていないのが好ましい。また、本発明のファクターＣは、Ｃ末端にペプチドが一切付加されていないのがより好ましい。また、本発明のファクターＣは、両末端とも、ペプチドが一切付加されていないのが特に好ましい。タキプレウス・トリデンタツスのファクターＣのアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、タキプレウス・トリデンタツスのファクターＣをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。
本発明のファクターＣは、ファクターＣの活性を有する限り、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のバリアントであってもよい。
ファクターＣの活性とは、エンドトキシンの存在下で活性型となり、ファクターＢを活性型に変化させる活性をいう。「ファクターＣの活性を有する」ことは、例えば、本発明のファクターＣを、好適なファクターＢおよび好適なプロクロッティングエンザイムと組み合わせた際に、エンドトキシンの存在下でカスケード反応の進行を検出することにより確認できる。具体的には、好適なファクターＢとして配列番号４のタンパク質を、好適なプロクロッティングエンザイムとして配列番号６のタンパク質を使用できる。カスケード反応の進行は、後述する検出用基質を用いて測定できる。
本発明のファクターＣは、ファクターＣの活性を有する限り、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質であってもよい。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、例えば、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持
つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来するカブトガニの個体差、株、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異も含まれる。
また、本発明のファクターＣは、上記のようなファクターＣのアミノ酸配列全体、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性または同一性を有し、かつ、ファクターＣの活性を有するタンパク質であってもよい。
本発明のファクターＣをコードする遺伝子は、上記のような本発明のファクターＣをコードする限り特に制限されない。本発明のファクターＣをコードする遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば配列番号１に示す塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ファクターＣの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
また、本発明のファクターＣをコードする遺伝子は、コドンの組み合わせを昆虫細胞での発現に最適化するよう変更してもよい。最適化は、例えば一般の受託サービスを利用して行うことができる。なお、本発明のファクターＣをコードする遺伝子は、コドンの組み合わせが昆虫細胞での発現に最適化されたＤＮＡのバリアントであってもよい。
なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、本発明のファクターＢおよびプロクロッティングエンザイム、並びにそれらをコードする遺伝子にも同様に適用できる。
本発明のファクターＢは、カブトガニ由来のファクターＢである。また、本発明のプロクロッティングエンザイムは、カブトガニ由来のプロクロッティングエンザイムである。カブトガニとしては、日本産カブトガニであるタキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）、アメリカ産カブトガニであるリムルス・ポリフェムス（Limulus polyphemus）、東南アジア産カブトガニであるカルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Carcinoscorpius rotundicauda）、東南アジア産カブトガニであるタキプレウス・ギガス（Tachypleus gigas）が挙げられる。これらの中では、日本産カブトガニであるタキプレウス・トリデンタツス由来であるのが好ましい。
タキプレウス・トリデンタツスのファクターＢ、プロクロッティングエンザイムのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４、６に示す。また、タキプレウス・トリデンタツスのファクターＢ、プロクロッティングエンザイムをコードする遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号３、５に示す。
本発明のファクターＢは、ファクターＢの活性を有する限り、上記各種カブトガニのファクターＢ、例えば配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のバリアントであってもよい。また、本発明のファクターＢをコードする遺伝子は、上記のような本発明のファクターＢをコードする限り特に制限されない。遺伝子やタンパク質のバリアントについては、上述のファクターＣに関する記載が準用される。
ファクターＢの活性とは、活性型ファクターＣの存在下で活性型となり、プロクロッティングエンザイムを活性型であるクロッティングエンザイムに変化させる活性をいう。「ファクターＢの活性を有する」ことは、例えば、本発明のファクターＢを、好適なファクターＣおよび好適なプロクロッティングエンザイムと組み合わせた際に、エンドトキシンの存在下でカスケード反応の進行を検出することにより確認できる。具体的には、好適なファクターＣとして配列番号２のタンパク質を、好適なプロクロッティングエンザイムとして配列番号６のタンパク質を使用できる。カスケード反応の進行は、後述する検出用基質を用いて測定できる。
本発明のプロクロッティングエンザイムは、プロクロッティングエンザイムの活性を有する限り、上記各種カブトガニのプロクロッティングエンザイム、例えば配列番号６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のバリアントであってもよい。また、本発明のプロクロッティングエンザイムをコードする遺伝子は、上記のような本発明のプロクロッティングエンザイムをコードする限り特に制限されない。遺伝子やタンパク質のバリアントについては、上述のファクターＣに関する記載が準用される。
プロクロッティングエンザイムの活性とは、活性型ファクターＢの存在下で活性型であるクロッティングエンザイムとなり、後述する検出用基質と反応する活性をいう。検出用基質と反応する活性とは、例えばコアギュローゲンと反応し凝固を引き起こす活性や、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡと反応しｐＮＡを遊離させる活性をいう。「プロクロッティングエンザイムの活性を有する」ことは、例えば、本発明のプロクロッティングエンザイムを、好適なファクターＣおよび好適なファクターＢと組み合わせた際に、エンドトキシンの存在下でカスケード反応の進行を検出することにより確認できる。具体的には、好適なファクターＣとして配列番号２のタンパク質を、好適なファクターＢとして配列番号４のタンパク質を使用できる。カスケード反応の進行は、後述する検出用基質を用いて測定できる。
本発明のファクターＢおよび／または本発明のプロクロッティングエンザイムは、それぞれファクターＢの活性、プロクロッティングエンザイムの活性を有する限り、任意のペプチド等が付加されていてもよい。そのようなペプチドとしては、ＨｉｓタグやＶ５タグ等のタグ配列が挙げられる。本発明のファクターＢおよび／または本発明のプロクロッティングエンザイムも、本発明のファクターＣと同様に、Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されていないもの、Ｃ末端にＶ５タグが付加されていないもの、Ｃ末端にペプチドが一切付加されていないもの、両末端ともペプチドが一切付加されていないもの、のいずれを採用してもよい。
また、本発明のファクターＢをコードする遺伝子および／または本発明のプロクロッティングエンザイムをコードする遺伝子は、コドンの組み合わせを昆虫細胞での発現に最適
化するよう変更してもよい。配列番号４のファクターＢをコードし、且つコドンの組み合わせが昆虫細胞での発現に最適化されたＤＮＡとしては、配列番号８のＤＮＡが挙げられる。配列番号６のプロクロッティングエンザイムをコードし、且つコドンの組み合わせが昆虫細胞での発現に最適化されたＤＮＡとしては、配列番号９のＤＮＡが挙げられる。なお、本発明のファクターＢをコードする遺伝子および／または本発明のプロクロッティングエンザイムをコードする遺伝子は、コドンの組み合わせが昆虫細胞での発現に最適化されたＤＮＡのバリアントであってもよい。
本発明のエンドトキシン測定剤は、本発明のファクターＣ、本発明のファクターＢ、および本発明のプロクロッティングエンザイムのみを含有していてもよい。
本発明のエンドトキシン測定剤は、カスケード反応の進行を検出するための基質を含有してもよい。本発明において、そのような基質を検出用基質という場合がある。
検出用基質としては、コアギュローゲンが挙げられる。コアギュローゲンとクロッティングエンザイムが接触することで、コアギュリンとして凝固する。凝固反応の進行は反応液の濁度を測定することで測定することができる。コアギュローゲンはカブトガニ血球抽出液（ライセート）から回収することができる。また、コアギュローゲンをコードする遺伝子の塩基配列は明らかになっており（宮田ら、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.29; P30-43; 1986）、常法に従い遺伝子工学的に生産することもできる。
また、検出用基質としては、合成基質を用いてもよい。合成基質は、クロッティングエンザイムの触媒反応により発色する性質または蛍光を発する性質等の検出に好適な性質を有する限り特に制限されない。合成基質としては、例えば、一般式Ｘ−Ｙ−Ｚ（式中、Ｘは保護基、Ｙはペプチド、ＺはＹとアミド結合した色素である）で表される基質が挙げられる。反応系にエンドトキシンが存在する場合には、カスケード反応の結果として生ずるクロッティングエンザイムの触媒反応によりＹ−Ｚ間のアミド結合が切断され、色素Ｚが遊離して発色する、あるいは蛍光を発する。保護基Ｘとしては、特に制限されず、ペプチドの公知の保護基を好適に用いることができる。そのような保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンゾイル基が挙げられる。色素Ｚは、特に制限されず、例えば、可視光下で検出される色素であってもよく、蛍光色素であってもよい。色素Ｚとしては、ｐＮＡ（パラニトロアニリン）、ＭＣＡ（７−メトキシクマリン−４−酢酸）、ＤＮＰ（２，４−ジニトロアニリン）、Ｄａｎｓｙｌ（ダンシル）系色素が挙げられる。ペプチドＹとしては、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＬＧＲ）、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＩＥＧＲ）（配列番号１２）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＶＰＲ）が挙げられる。遊離した色素Ｚは、色素の性質に応じた手法により測定すればよい。
また、本発明のエンドトキシン測定剤は、エンドトキシンの測定に用いることができる限り、各因子や検出用基質以外の成分を含有していてもよい。そのような成分は、保存性、取扱い易さ、各因子や検出用基質の安定性などを考慮して選定すればよく、特に限定されるものではない。本発明のエンドトキシン測定剤は、例えば、ｐＨ緩衝剤や塩類を含有していてもよい。ｐＨ緩衝剤としては、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＧＴＡ広域バッファー等が挙げられる。本発明のエンドトキシン測定剤は、例えば、アルコール類、エステル類、ケトン類、アミド類等の有機溶媒を含有させることもできる。
また、本発明のエンドトキシン測定剤は、固体状、液体状、ゲル状等の任意の形態で製剤化されていてもよい。製剤化にあたっては、製剤担体として通常使用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、又は溶剤等の添加剤を使用することができる。本発明のエンドトキシン測定剤は、そのまま、あるいは水、生
理食塩水、緩衝液等を用いて希釈、分散、又は溶解し、エンドトキシンの測定に利用できる。このように希釈、分散、又は溶解等した場合にも、本発明のエンドトキシン測定剤の範囲に含まれることは言うまでもない。
本発明のエンドトキシン測定剤において、各因子やその他の成分は、混合して存在していてもよく、それぞれ別個に存在していてもよい。例えば、各因子は、任意の比率で混合され製剤化されていてもよく、それぞれ別個に製剤化されていてもよい。
本発明のエンドトキシン測定剤における各因子やその他の成分の濃度は特に制限されないが、エンドトキシンを測定する際に、後述する好ましい濃度範囲に収まるよう調整されるのが好ましい。本発明のエンドトキシン測定剤（被験試料に接触させる前に溶液にしたもの）における各因子の濃度は、例えば２０〜１００μg／mLであるのが好ましく、４０〜８０μg／mLであるのがより好ましく、約６０μg／mLであるのが特に好ましい。
本発明のエンドトキシン測定剤は、エンドトキシン測定用キットとして提供することができる。エンドトキシン測定用キットは、本発明のエンドトキシン測定剤を含む限り特に制限されない。
（２）本発明のエンドトキシン測定剤の製造法
本発明のエンドトキシン測定剤に含まれる各因子は、昆虫細胞をホストとして用いて発現することで製造できる。
昆虫細胞としては、各因子を発現できる限り特に制限されず、異種タンパク質の発現に通常用いられるものを好適に利用できる。そのような昆虫細胞としては、Sf9、Sf21、SF+、High-Fiveが挙げられる。昆虫細胞としては、Sf9が好ましい。
昆虫細胞を培養する際の培養条件は、昆虫細胞が増殖できる限り特に制限されず、昆虫細胞の培養に通常用いられる条件を、必要により適宜修正して用いることができる。例えば、培地としては昆虫細胞の培養に通常用いられる培地を用いることができる。そのような培地としては、例えば市販の昆虫細胞用の無血清培地が挙げられる。具体的には、Ｓf９００ ＩＩ培地（インビトロジェン（Invitrogen）社）等を好適に用いることができる。培養は、例えば、２７℃〜２８℃で、振とう培養により行うことができる。
昆虫細胞をホストとして用いて各因子を発現する手法は、各因子を発現できる限り特に制限されず、異種タンパク質の発現に通常用いられる手法を好適に利用できる。例えば、各因子をコードする遺伝子を組み込んだウイルスを昆虫細胞に感染させることで各因子を発現させることができる（ウイルス法）。また、各因子をコードする遺伝子を組み込んだベクターを昆虫細胞に導入し、ホストの染色体上に当該遺伝子を組み込むことで各因子を発現させることができる（安定発現細胞株法）。
＜ウイルス法＞
ウイルス法に用いるウイルスは、昆虫細胞に感染し各因子を発現させることができる限り特に制限されず、昆虫細胞でのタンパク質の発現に通常用いられるものを好適に利用できる。そのようなウイルスとしては、バキュロウイルス（Baculovirus）が挙げられる。バキュロウイルスとしては、核多角体病ウイルス（Nucleopolyhedrovirus；NPV）が好ましい。ＮＰＶとしては、ＡｃＮＰＶ（Autographa californica NPV）、ＢｍＮＰＶ（Bombix mori NPV）が挙げられる。ＮＰＶとしては、ＡｃＮＰＶが好ましい。
ウイルスへの核酸の導入は常法により行うことができ、例えば、トランスファーベクターを用いた相同的組換えにより行うことができる。トランスファーベクターとしては、pP
SC8（プロテインサイエンス（Protein Sciences）社）、pFastBac（インビトロジェン（Invitrogen）社）、pVL1393（ファーミンジェン（Pharmingen）社）が挙げられる。トランスファーベクターとしては、pPSC8が好ましい。
各因子をコードする遺伝子を組み込んだウイルスを常法により昆虫細胞に感染させることで、当該ウイルスを保持し、各因子を発現する昆虫細胞が得られる。
＜安定発現細胞株法＞
各因子をコードする遺伝子を昆虫細胞の染色体上に組み込むことで、各因子を安定に発現する安定発現細胞株が得られる。安定発現細胞株の構築手法は、特に制限されず、常法により行うことができる。例えば、pIZ/V5-Hisベクター（インビトジェン（Invitrogen）社）を用いて、マニュアルに従って安定発現細胞株を構築することができる。
いずれの場合にも、発現するファクターＣのＣ末端にＨｉｓタグが付加されないよう発現細胞を構築する。また、ファクターＣのＣ末端のＨｉｓタグに限られず、ペプチドを付加せずに各因子を発現する場合には、ペプチドが付加されないよう発現細胞を構築すればよい。
いずれの場合にも、各因子は単一の発現細胞によりまとめて発現してもよく、因子毎に発現細胞を構築しそれぞれ別個に発現させてもよい。
各因子が発現しているかどうかは、各因子の活性を測定することにより確認できる。また、各因子が発現しているかどうかは、各因子をコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を測定することや、抗体を用いてウエスタンブロットにより各因子を検出することでも確認できる。
発現した各因子は、当該各因子を含有する溶液として回収し、本発明のエンドトキシン測定剤の成分として利用できる。各因子を含有する溶液とは、例えば、培養液、培養上清、細胞破砕抽出物、またはそれらの混合物等でありうる。各因子は、精製して用いてもよく、精製せずに用いてもよい。本発明では、各因子を精製することなく、発現された各因子を含有する細胞培養上清液をそのまま用いても、十分に性能が高いエンドトキシン測定剤を提供することができる。各因子を精製する場合には、各因子の精製は、例えばタンパク質の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等が挙げられる。各因子に、Ｈｉｓタグ等のタグを付加している場合には、当該タグに対する親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより各因子を精製することもできる。
各因子がウイルス法により製造された場合には、ウイルスの除去を行うことが好ましい。ウイルスを除去する手法は特に制限されず常法により行うことができる。例えば、ポアサイズ５００ｋＤａの中空糸濾過膜によりウイルスを除去することができる。
（３）本発明のエンドトキシン測定法
本発明のエンドトキシン測定剤を被験試料と混合することにより、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にはカスケード反応が進行する。カスケード反応の進行を測定することにより、被験試料中のエンドトキシンを測定することができる。すなわち、本発明は、本発明のエンドトキシン測定剤と被験試料とを混合する工程、およびカスケード反応の進行を測定する工程を含む被験試料中のエンドトキシン測定法（以下、第１の態様ともいう）を提供する。
第１の態様において、本発明のエンドトキシン測定剤に含まれる各因子は、本発明のエンドトキシン測定剤を被験試料と混合する工程の当初から反応系に含まれていてもよく、逐次反応系に添加されてもよい。
例えば、本発明のエンドトキシン測定剤を被験試料と混合する工程は、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含んでいてもよい。
（Ａ）本発明のファクターＣを反応系に添加する工程。
（Ｂ）本発明のファクターＢを反応系に添加する工程。
（Ｃ）本発明のプロクロッティングエンザイムを反応系に添加する工程。
工程（Ａ）〜（Ｃ）は別個に行われてもよく、一部同時に行われてもよく、全て同時に行われてもよい。工程（Ａ）〜（Ｃ）は任意の順番で行われてよい。例えば、工程（Ａ）の後に工程（Ｂ）が行われ、工程（Ｂ）の後に工程（Ｃ）が行われてもよい。
第１の態様において、カスケード反応の進行は、検出用基質を反応系に添加し、当該基質の反応（発色や凝固等）を測定することで測定できる。検出用基質は、本発明のエンドトキシン測定剤を被験試料と混合する工程の当初から反応系に含まれていてもよく、当該工程の進行中または完了後に反応系に添加されてもよい。本発明のエンドトキシン測定剤として、検出用基質を予め含有しているものを用いる場合も、当然、第１の態様に包含される。
また、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にカスケード反応が進行する限り、本発明のファクターＢおよびプロクロッティングエンザイム自体は、被験試料と接触しなくともよい。すなわち、本発明のエンドトキシン測定法の別の態様（以下、第２の態様ともいう）は、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む被験試料中のエンドトキシン測定法である。（Ａ）本発明のファクターＣと被験試料とを混合する工程。
（Ｂ）本発明のファクターＢと、工程Ａの混合後のファクターＣとを混合する工程。
（Ｃ）本発明のプロクロッティングエンザイムと、工程Ｂの混合後のファクターＢとを混合する工程。
（Ｄ）カスケード反応の進行を測定する工程。
第２の態様において、工程（Ａ）〜（Ｄ）は別個に進行してもよく、一部同時に進行してもよく、全て同時に進行してもよい。例えば、工程Ａを開始し、当該工程の進行中または完了後にファクターＢやプロクロッティングエンザイムを反応系に添加してもよい。また、工程Ｂを開始し、当該工程の進行中または完了後にプロクロッティングエンザイムを反応系に添加してもよい。また、工程Ａの当初から３種の因子全てが反応系に含まれていてもよい。また、例えば、工程Ａの接触後のファクターＣを回収して工程Ｂに用いてもよく、工程Ｂの接触後のファクターＢを回収して工程Ｃに用いてもよい。
第２の態様において、カスケード反応の進行は、検出用基質を反応系に添加し、当該基質の反応（発色や凝固等）を測定することで測定できる。検出用基質は、工程Ａの当初から反応系に含まれていてもよく、各工程の進行中または完了後に反応系に添加されてもよい。
本発明のエンドトキシン測定法は、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にカスケード反応が進行する限り、その他の任意の工程を含んでいてよい。例えば、本発明のエンドトキシン測定法は、反応系に検出用基質を添加する工程、あるいは、カスケード反応により生じたクロッティングエンザイムと検出用基質とを混合する工程を含んでいてもよい。また、例えば、本発明のエンドトキシン測定法は、検出用基質の反応に基づき、被験試料中のエンドトキシン量を算出する工程を含んでいてもよい。
本発明のエンドトキシン測定法において、反応は水あるいは緩衝液等の水性溶媒中で行われるのが好ましい。
本発明のエンドトキシン測定法において、反応液中での各因子の濃度は、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にカスケード反応が進行する限り特に限定されず、各因子の性質等に応じて適宜設定することができる。例えば、各因子の濃度は、終濃度で、例えば通常１０〜５０μg／mLであり、２０〜４０μg／mLであるのが好ましく、約３０μg／mLであるのがより好ましい。
本発明のエンドトキシン測定法において、反応液中での検出用基質の濃度は、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にカスケード反応が進行する限り特に限定されず、検出用基質の性質等に応じて適宜設定することができる。例えば、検出用基質が合成基質である場合には、検出用基質の濃度は、終濃度で、例えば通常０．００１ｍＭ〜１００ｍＭであり、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭであるのが好ましい。
いずれの態様においても、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にカスケード反応が進行する限り、反応系には、第１の態様におけるエンドトキシン測定剤あるいは第２の態様における各因子、検出用基質、および被験試料以外に、任意の成分が含まれていてもよい。例えば、反応系には、ｐＨ緩衝剤や塩類が含まれていてもよい。ｐＨ緩衝剤としては、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＧＴＡ広域バッファー等が挙げられる。また、反応系には、例えば、アルコール類、エステル類、ケトン類、アミド類等の有機溶媒が含まれていてもよい。
反応液のｐＨは、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にカスケード反応が進行する限り特に限定されず、各因子の性質に応じて適宜設定することができる。反応液のｐＨは、例えば、通常ｐＨ５〜１０であり、好ましくは７〜８．５である。
反応温度は、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にカスケード反応が進行する限り特に限定されず、各因子の性質に応じて適宜設定することができる。反応温度は例えば通常１０℃〜８０℃であり、好ましくは２０℃〜５０℃である。例えば、反応温度は室温であってもよい。
反応時間は特に限定されず、各因子の性質や反応温度等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。反応時間は例えば通常５分〜１時間であり、好ましくは１５分〜４５分である。例えば、反応時間は３０分であってもよい。
いずれの態様においても、反応の過程において、被験試料、各因子、およびその他の成分を単独で、あるいは任意の組み合わせで追加的に反応系に添加してもよい。これらの成分は１回または複数回添加されてもよく、連続的に添加されてもよい。また、反応開始から反応終了まで均一の条件を用いてもよく、反応の過程において条件を変化させてもよい。
検出用基質の反応（発色や凝固等）を測定することで、エンドトキシンの存在に基づくカスケード反応の進行を測定することができ、被験試料中のエンドトキシンを測定することができる。検出用基質の反応（発色や凝固等）は、用いた検出用基質に応じた手法により測定すればよい。
エンドトキシンの測定を定量的に行う場合には、濃度既知のエンドトキシン標準試料を用いてエンドトキシン量と検出用基質の反応の程度（発色や凝固等の程度）との間の相関
データを取得し、当該相関データに基づき被験試料に存在するエンドトキシンを定量すればよい。相関データとは、例えば検量線である。定量はカイネティック法により行ってもよく、エンドポイント法によって行ってもよい。
エンドトキシンの測定を行うことのできる被験試料としては、特に制限されず、医療用水、医薬品、輸液、血液製剤、医療機器、医療器具、化粧品、飲食品、環境試料（例えば、空気、河川、土壌）、生体成分（例えば、血液、体液、組織）、天然のタンパク質、組み換えタンパク質、核酸、糖質等が挙げられる。被験試料は、それ自体を、あるいはその抽出物や洗浄液を反応系に混合、分散、又は溶解し、エンドトキシンの測定に供することができる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の例示であり、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
実施例１：本発明のエンドトキシン測定剤の製造
（１−１）ウイルスを利用した方法（以下、「ウイルス法」ともいう）
本実施例では、ファクターＣ、ファクターＢ、プロクロッティングエンザイムのそれぞれをコードする遺伝子を組み込んだ組換えバキュロウイルスを利用して、昆虫細胞で各因子を発現させ、エンドトキシン測定剤を製造した。
（１−１−１）組換えバキュロウイルスの作製
Ｈｉｓタグ付ファクターＣをコードするＤＮＡ（Ｈｉｓタグ付ファクターＣ遺伝子）として、配列番号７のＤＮＡを、一般の受託サービス（タカラバイオ）を利用して全合成した。当該Ｈｉｓタグ付ファクターＣは、配列番号２に示す日本産カブトガニのファクターＣのＣ末端に６×Ｈｉｓタグが付加されたものである。当該ＤＮＡをトランスファーベクターｐＰＳＣ８（プロテインサイエンス（Protein Sciences）社）の制限酵素ＮｒｕＩとＳｍａＩ認識部位間に挿入し、組換え用ベクターを得た。当該組換え用ベクターを用いて、Ｈｉｓタグ付ファクターＣ遺伝子をバキュロウイルスＡｃＮＰＶに組み込み、組換えバキュロウイルスを作製した。
さらに、プライマーFC-N-Pst（配列番号１０）およびプライマーFC-notag-R-Bam（配列番号１１）を用い、上述のＨｉｓタグ付ファクターＣをコードするＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲをおこない、Ｈｉｓタグ配列をコードする３’末端部位の塩基配列を除去したファクターＣをコードするＤＮＡ（ＨｉｓタグなしファクターＣ遺伝子）を作製した。当該ＤＮＡは、Ｃ末端にＨｉｓタグの付加されていない配列番号２に示す日本産カブトガニのファクターＣをコードする。当該ＨｉｓタグなしファクターＣ遺伝子についても上記と同様の方法で組換えバキュロウイルスを作製した。
ファクターＢをコードするＤＮＡ（ファクターＢ遺伝子）として、配列番号８のＤＮＡを、一般の受託サービス（タカラバイオ）を利用して全合成した。当該ＤＮＡは、配列番号４に示す日本産カブトガニのファクターＢ（Ｈｉｓタグなし）をコードし、コドンの組み合わせが昆虫細胞での発現に最適化されている。当該ファクターＢ遺伝子についても上記と同様の方法で組換えバキュロウイルスを作製した。ただし、ｐＰＳＣ８ベクターへの挿入位置を、制限酵素ＰｓｔＩとＫｐｎＩ認識部位の間とした。
プロクロッティングエンザイムをコードするＤＮＡ（プロクロッティングエンザイム遺伝子）として、配列番号９のＤＮＡを、一般の受託サービス（タカラバイオ）を利用して全合成した。当該ＤＮＡは、配列番号６に示す日本産カブトガニのプロクロッティングエンザイム（Ｈｉｓタグなし）をコードし、コドンの組み合わせが昆虫細胞での発現に最適
化されている。当該プロクロッティングエンザイム遺伝子についても上記と同様の方法で組換えバキュロウイルスを作製した。ただし、ｐＰＳＣ８ベクターへの挿入位置を、制限酵素ＸｂａＩとＢｇｌＩＩ認識部位の間とした。
（１−１−２）組換えバキュロウイルスの昆虫細胞（Ｓｆ９細胞）への感染
Ｓｆ９細胞（ノバジェン（Novagen）社）を、１．５×１０６細胞／ｍＬとなるように培地に播種し、これに、前記Ｈｉｓタグ付ファクターＣをコードするＤＮＡが導入された組換えバキュロウイルスを添加して、ウイルスを細胞に感染させた。Ｓｆ９細胞用の培地として、抗生物質（抗生物質−抗真菌剤（ｘ１００）；インビトロジェン（Invitrogen）社）（終濃度ｘ１）を含有するＳｆ９００ ＩＩ培地（インビトロジェン（Invitrogen）社）（１Ｌ）を用いた。また、ウイルスの多重感染度（ＭＯＩ）は、１．０とした。その後、これにより得られた細胞を２８℃で４８時間、振とう培養した。
同様に、ＨｉｓタグなしファクターＣをコードするＤＮＡが導入されたウイルスについてもＳｆ９細胞への感染を行った。
また、ファクターＢをコードするＤＮＡが導入されたウイルス、プロクロッティングエンザイムをコードするＤＮＡが導入されたウイルスのそれぞれについてもＳｆ９細胞への感染を行ったが、ＭＯＩを０．５、培養時間を７２時間とした。
（１−１−３）発現された組換えタンパク質溶液の回収
前記培養後の各々の培養液を、４℃で、３０００×ｇ、３０分間遠心分離し、得られた各上清を−８０℃で保存した。
（１−１−４）組換えタンパク質溶液からの不純物およびウイルス除去
前記凍結保存していた各上清を融解し、ポアサイズ０．１μｍのフィルター（カップフィルター（ミリポア（Millipore）社））にアプライして、吸引圧力でろ過し、膜を通過した溶液を回収した。回収された各上清を、ポアサイズ５００ｋＤａの中空糸ろ過膜（ポリエーテルスルホン製の中空糸膜；スペクトラムラボラトリーズ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｂｓ）社）にアプライし、Ｋｒｏｓ Ｆｌｏｗ ＴＦＦポンプろ過システム（スペクトラムラボラトリーズ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｂｓ）社）を用いてろ過し、通過した各溶液を回収した。
（１−１−５）試薬調製
前記（１−１−４）で得られた各溶液（ファクターＣ、ファクターＢ、又はプロクロッティングエンザイムを含有する）を５６０ｍＬ、蒸留水１３４ｍＬ、６．６６ｍＭの合成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）水溶液１２６ｍＬ（終濃度０．３ｍＭ）、及び１５％デキストラン水溶液５６０ｍＬ（終濃度３％）を４℃下で混合した。この混合液を５ｍＬずつバイアルに分注し、凍結乾燥させて、エンドトキシン測定剤１とした。
（１−２）プラスミドを利用した方法（以下、「安定発現細胞株法」ともいう）
本実施例では、ファクターＣ、ファクターＢ、プロクロッティングエンザイムのそれぞれをコードする遺伝子を昆虫細胞の染色体に組み込んで安定発現細胞株を構築し、各因子を発現させてエンドトキシン測定剤を製造した。
（１−２−１）安定発現細胞株の作製および培養
上述のウイルス法で用いたＨｉｓタグなしファクターＣ遺伝子、ファクターＢ遺伝子（配列番号８）、およびプロクロッティングエンザイム遺伝子（配列番号９）の各々を、ｐＩＺベクターキット（インビトロジェン（Invitrogen）社）を用いてＳｆ９細胞（インビ
トロジェン（Invitrogen）社）に導入した。
具体的には、まず、同キットにおけるベクターｐＩＺ／Ｖ５−Ｈｉｓ中のＥｃｏＲＶとＭｌｕＩ認識部位の間に前記ＤＮＡを各々組み込み、各々同キットにおけるセルフェクチンと混合後、各々Ｓｆ９細胞に導入した。ｐＩＺ／Ｖ５−Ｈｉｓへの前記ＤＮＡの組み込み位置等を図２に示す。図２中の最上部にある太い矢印部分に、前記ＤＮＡのいずれかが組み込まれる。Ｓｆ９細胞用の培地として、抗生物質（抗生物質−抗真菌剤（ｘ１００）；インビトロジェン（Invitrogen）社）（終濃度ｘ１）、Ｚｅｏｃｉｎ抗生物質（インビトロジェン（invitrogen）社）（終濃度５０μｇ／ｍＬ）を含有するＳf９００ ＩＩＩ培地（Invitrogen）を用いた。これにより得られた各ＤＮＡが導入された細胞株を、６×１０５細胞／ｍＬ（１Ｌ）となるように前記培地で調製し、２８℃で９６時間、振とう培養した。
なお、ｐＩＺ／Ｖ５−ＨｉｓにはＨｉｓタグ配列が含まれているが、前記ＤＮＡはいずれもストップコドンを有しているため、ファクターＣ、ファクターＢ、及びプロクロッティングエンザイムは、いずれも、Ｈｉｓタグが付加されない形で発現される。
（１−２−２）組換えタンパク質溶液の回収、不純物除去、試薬調製
前記培養後の各々の培養液につき、上述のウイルス法の「（１−１−３）発現された組換えタンパク質溶液の回収」、「（１−１−４）組換えタンパク質溶液からの不純物・ウイルス除去」、「（１−１−５）試薬調製」と同様に処理した。ただし、「（１−１−４）組換えタンパク質溶液からの不純物・ウイルス除去」における中空糸ろ過膜を用いたろ過のプロセスは行わなかった。これにより得られた測定剤を、エンドトキシン測定剤２とした。
実施例２：発現されたタンパク質の諸性質等
（２−１）ファクターＣの発現量比較
ウイルス法及び安定発現細胞株法により得られたＨｉｓタグが付加されていないファクターＣ、並びに、ウイルス法により得られたＨｉｓタグ付ファクターＣについて、各々の発現量を比較した。
発現量は、実施例１におけるろ過後・試薬調製前に相当する溶液を、それぞれ０．５、１．５、５、又は１５μＬ分取し、これをSDS存在下、５−２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（非還元条件下）に供した後、抗ファクターＣ抗体（２Ｃ１２、国立大学法人九州大学 大学院 理学研究院 生物化学部門 川畑 俊一郎教授より入手）を用いたウエスタンブロット法により評価した。
結果を図３に示す。その結果、Ｈｉｓタグが付加されていないファクターＣの発現量は、Ｈｉｓタグ付ファクターＣの発現量よりも少なかった。また、図３のウエスタンブロットのバンドの濃さをデンシトメーターで測定し、その相対値から、各ファクターＣの濃度が等しくなる各々の溶液量比を求めた。かかる量比は、ウイルス法により得られたファクターＣ（Ｈｉｓタグなし）が５０、安定発現細胞株法により得られたファクターＣ（Ｈｉｓタグなし）が１７、ウイルス法により得られたＨｉｓタグ付ファクターＣが７であった。
（２−２）ファクターＣの活性比較
前記各ファクターＣ溶液につき、ファクターＣの量を揃えて、プロクロッティングエンザイムの活性化能を調べた。
具体的には、まず、ウイルス法により得られたＨｉｓタグ付ファクターＣ溶液（０．７
μＬ又は５μＬ）、ウイルス法により得られたファクターＣ（Ｈｉｓタグなし）溶液（５μＬ）、安定発現細胞株法により得られたファクターＣ（Ｈｉｓタグなし）溶液（１．７μＬ）を、各々９６穴プレートのウェルに入れた。次に、各ウェルの全量が１００μＬとなるように、実施例１のウイルス法の（１−１−４）における０．１μｍのフィルター通過後に得られたファクターＢ含有溶液（５μＬ）、プロクロッティングエンザイム含有溶液（５μＬ）、およびＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（終濃度０．３ｍＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（終濃度１００ｍＭ）、エンドトキシン（製品名 ＵＳＰ−Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ、生化学バイオビジネス（株）販売）（検体濃度０、０．０５又は０．５ＥＵ／ｍＬ）５０μＬをウェルに添加し、混合した後、３７℃で３時間インキュベートして、経時的に４０５ｎｍの吸光度を測定した。陰性対照として蒸留水を用いた。かかる吸光度の増加の速度（吸光度変化率）は、プロクロッティングエンザイムの活性化能を反映する。なお、「ＥＵ」とは「エンドトキシンユニット」であり、エンドトキシン量を示す単位である（以下、同じ）。
結果を図４に示す。図４中、「ＤＷ」は蒸留水を、「Ｖｉｒｕｓ ＋ Ｈｉｓ ｔａｇ（ｘ１）」はウイルス法により得られたＨｉｓタグ付ファクターＣ溶液（０．７μＬ）を、「Ｖｉｒｕｓ ＋ Ｈｉｓ ｔａｇ（ｘ７）」は同溶液（５μＬ）を、「Ｖｉｒｕｓ Ｎｏ ｔａｇ（ｘ１）」はウイルス法により得られたファクターＣ（Ｈｉｓタグなし）溶液を、「Ｓｔａｂｌｅ Ｓｆ９ Ｎｏ ｔａｇ（ｘ１）」は安定発現細胞株法により得られたファクターＣ（Ｈｉｓタグなし）溶液をそれぞれ示す。
その結果、Ｈｉｓタグ付ファクターＣ溶液は、ファクターＣの量を揃えたもの（０．７μＬ）のみならず、その量を約７倍にしたもの（５μＬ）についても、プロクロッティングエンザイムの活性化は見られないか、極わずかであった。一方、Ｈｉｓタグが付加されていないファクターＣは、ウイルス法により得たもの、安定発現細胞株法により得たものを問わず、顕著なプロクロッティングエンザイムの活性化能を示した。
以上の結果から、Ｈｉｓタグ配列を付加しない形で発現させた組換えファクターＣ分子は、Ｈｉｓタグ配列を付加した形で発現させた組換えファクターＣ分子よりも、はるかに強いプロクロッティングエンザイム活性化能を有することが示された。また、発現させた各タンパク質を、精製することなく、培養上清に含有されている状態のままで使用できることが示された。
（２−３）発現されたファクターＣの安定性比較
（２−３−１）ウイルス法により発現されるファクターＣの安定性
実施例１のウイルス法の（１−１−２）のウイルス感染細胞を２８℃で振とう培養する工程において、培養後４８時間、７２時間、９６時間の各タイミングで上清を回収し、これをSDS存在下、５−２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（非還元条件下）に供した後、抗ファクターＣ抗体（２Ｃ１２。前記と同じ。）を用いたウエスタンブロット法によりファクターＣの残存量を評価した。また、別途、ウイルス感染後２４時間目に培養液にプロテアーゼ阻害剤（終濃度０．５μｇ／ｍＬのロイペプチン＋終濃度０．７μｇ／ｍＬのペプスタチンＡ）を添加したものについても、同様にサンプリングして分析した。
結果を図５に示す。その結果、ウイルス法で発現されたファクターＣは、培養時間とともに分解することが示された。また、プロテアーゼ阻害剤を添加したものについても、ある程度分解していることが示された。
（２−３−２）安定発現細胞株法により発現されるファクターＣの安定性
同様に、実施例１の安定発現細胞株法の（１−２−１）の安定発現細胞株を２８℃で振とう培養する工程において、培養後７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６
８時間の各タイミングで上清を回収し、これをSDS存在下、５−２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（非還元条件下）に供した後、抗ファクターＣ抗体（２Ｃ１２。前記と同じ。）を用いたウエスタンブロット法によりファクターＣの残存量を評価した。また、ウイルス法の培養後４８時間目の上清についても、併せてアプライした。
結果を図６に示す。その結果、安定発現細胞株法で発現されたファクターＣは、プロテアーゼ阻害剤の非存在下で１６８時間経過しても分解されなかった。このことから、安定発現細胞株法を採用すると、ファクターＣの分解を阻止できることが示された。
（２−４）中空糸膜ろ過による処理の要否の検討
ウイルス法における、（１−１−４）の中空糸ろ過膜による処理の必要性を検討した。（１−１−４）における中空糸膜ろ過前の各溶液、同ろ過後の各溶液（３ロット）を用いて、前記（２−２）と同様の方法で、エンドトキシン（ＵＳＰ−ＲＳＥ）を終濃度０又は０．０５ＥＵ／ｍＬ添加した場合の、吸光度の増加の速度（吸光度変化率）を測定した。
結果を図７に示す。なお図７中の「未ろ過液」は、ろ過されずに中空糸膜カートリッジ内に残存した溶液を示す。その結果、中空糸膜ろ過後の各溶液を用いた場合には、エンドトキシンが０ＥＵ／ｍＬである場合にはプロクロッティングエンザイムの活性化の程度が低く（換言すれば、エンドトキシン測定時のブランク値が低く）、良好な結果が得られた。一方、中空糸膜ろ過前の各溶液（「ろ過前」、「未ろ過液」）を用いた場合には、エンドトキシンが０ＥＵ／ｍＬである場合においてもプロクロッティングエンザイムの活性化の程度が高く、エンドトキシン測定の際のブランク値が高くなってしまうことが明らかになった。
一方、安定発現細胞株法によれば、このような中空糸ろ過膜によるろ過の工程を経なくても、エンドトキシンが０ＥＵ／ｍＬにおけるプロクロッティングエンザイムの活性化（エンドトキシン測定時のブランク値）が低く抑えられていた（図４）。
これらの結果から、ウイルス法を用いる場合には中空糸ろ過膜によるろ過が必須である反面、安定発現細胞株法によれば、かかるろ過が不要であることが示された。
実施例３：本発明測定剤を用いたエンドトキシン測定
（３−１）エンドトキシン測定剤１を用いた測定
前記エンドトキシン測定剤１（凍結乾燥物）に、３．３ｍＬの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）緩衝液を添加して溶解した。この溶液中における、ファクターＣ、ファクターＢ及びプロクロッティングエンザイムを含む培養上清のタンパク質濃度は、各々、約６０μg／mLである。
９６穴マイクロタイタープレートのウェルに濃度０、０．００１、０．０１、又は０．１ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン溶液５０μＬを分注し、溶解したエンドトキシン測定剤溶液５０μＬを添加、混合した後、３７℃で３０分間インキュベートして、４０５ｎｍにおける吸光度を経時的に測定することによる反応速度法により、エンドトキシン濃度を測定した。この反応液中における、ファクターＣ、ファクターＢ及びプロクロッティングエンザイムを含む培養上清のタンパク質濃度は、各々、約３０μg／mLである。
結果を図８に示す。その結果、ウイルス法で発現させた各因子を用いた場合、０．００１〜０．１０ＥＵ／ｍＬの範囲内で、エンドトキシン濃度の増加に応じて吸光度変化率が直線的に増加することが示された。
（３−２）エンドトキシン測定剤２を用いた測定
前記エンドトキシン測定剤２（凍結乾燥物）に、３．３ｍＬの１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
（ｐＨ７．６）緩衝液を添加して溶解した。この溶液中における、ファクターＣ、ファクターＢ及びプロクロッティングエンザイムを含む培養上清のタンパク質濃度は、各々、約６０μg／mLである。
９６穴マイクロタイタープレートのウェルに濃度０、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、又は０．１ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン溶液５０μＬを分注し、溶解したエンドトキシン測定剤溶液５０μＬを添加、混合した後、３７℃で３０分間インキュベートして、４０５ｎｍにおける吸光度を経時的に測定することによる反応速度法により、エンドトキシン濃度を測定した。この反応液中における、ファクターＣ、ファクターＢ及びプロクロッティングエンザイムを含む培養上清のタンパク質濃度は、各々、約３０μg／mLである。
結果を図９に示す。その結果、安定発現細胞法で発現させた各因子を用いた場合、０．０００５〜０．１ＥＵ／ｍＬの範囲内で、エンドトキシン濃度の増加に応じて吸光度変化率が直線的に増加することが示された。
以上の結果から、いずれのエンドトキシン測定剤を用いた場合も、３０分以内で、０．００１ＥＵ／ｍＬのエンドトキシンの定量が可能であった。さらに、エンドトキシン測定剤２を用いた場合、３０分以内で、０．０００５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシンが測定できた。したがって、本発明のエンドトキシン測定剤により、従来の手法（測定に１時間以上を要し、０．００１ＥＵ／ｍＬの検出感度を実現できていない）と比較して、短時間且つ高感度でのエンドトキシンの定量が可能であることが示された。また、いずれの場合も、発現された各因子について、精製を行うことなくそのまま測定剤に用いることができることが示された。
実施例４：組換えFactor Cタンパク質と天然Factor Cタンパク質の活性の差
（４−１）組換えFactor Cタンパク質と天然Factor Cタンパク質の精製
抗Factor C抗体（２C１２、前記と同様）2mgをセファロースカラム1ml（ジーイーヘルスケア（GE helthcare）社）に共有結合させてFactor C抗体カラムを２本作製した。作製方法は添付の説明書に従った。上述「（１−２−２）組換えタンパク質の回収」と同様の処理で調製した安定発現細胞法由来の組換えFactor Cタンパク質を含む培養上清液76mLに等量の2M 塩化ナトリウムと2mMEDTAを含む20mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0）を加えて薄めた後に、Factor C抗体カラム１本にかけた。カブトガニ血球細胞の抽出液76mLに対しても同様に等量の2M 塩化ナトリウムと2mMEDTAを含む20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）を添加して薄めた後、もう一方のFactor C抗体カラムにかけた。両カラム共に、200mMまたは450mMの塩化ナトリウムを含む20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）、各20mLで順次洗浄後、50mM グリシン緩衝液（pH2.5）で溶出をおこなった。1M Trizma base（シグマ（Sigma）社）0.025mLを予め添加した1.5mLのチューブに対し、溶出画分１ｍLを回収して溶出液のpHを中性に戻した。
（４−２）精製した組換えおよび天然Factor Cタンパク質の濃度比較
精製した組換えおよび天然Factor Cタンパク質の溶出画分をSDS存在下、5-20%ポリアクリルアミド電気泳動（非還元条件下）で分離した。その際に同一ゲルに濃度が既知の精製牛血清アルブミン（=BSA）を濃度参照サンプルとして分離した（図１０）。クマシーブリリアントブルー染色したゲルのBSAバンド強度をデンシトメーターで定量してBSAタンパク質濃度とプロットし検量線を作成した（図１１）。精製したFactor Cのタンパク質のバンド強度と検量線から精製Factor Cタンパク質の濃度を概算した。その結果、精製サンプルについて、天然Factor Cタンパク質の方が組換えFactor Cタンパク質よりも約4倍濃度が濃いことが判明した。
（４−３）精製した組換えおよび天然Factor Cタンパク質の活性比較
精製した組換えおよび天然由来のFactor Cタンパク質を使用して、活性の比較をおこなった。この際に（４−２）の結果より、精製Factor Cのタンパク質濃度を揃えた。９６穴マイクロタイタープレートのウェルに濃度０、０．０５、０．１、又は０．５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン溶液５０μＬを分注した。Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）緩衝液が50mM、精製Factor Cタンパク質が0.2μg/mL、組換えFactor Bと組換えプロクロッティングエンザイムを含む培養上清がそれぞれ30μg/mL、合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡが0.3 mMになるように添加し、反応液の総体積が100μLになるように注射用水で調製した。３７℃で３０分間インキュベートして、４０５ｎｍにおける吸光度を経時的に測定することによる反応速度法による解析をおこなった。
その結果、精製した組換えFactor Cタンパク質の方が、精製した天然Factor Cタンパク質よりも約2倍活性が強いことが判明した（図１２）。以上の結果は組換えFactor Cが天然Factor Cよりも比活性が優れていることを示唆している。
本発明によれば、迅速且つ高感度にエンドトキシンを測定できる。また、本発明によれば、エンドトキシン測定剤を簡便、迅速、且つ安価に製造することができる。したがって、本発明は、エンドトキシンの検出において、極めて有効に利用できる。
配列表の説明
配列番号１：日本産カブトガニのファクターＣ遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号２：日本産カブトガニのファクターＣのアミノ酸配列
配列番号３：日本産カブトガニのファクターＢ遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号４：日本産カブトガニのファクターＢのアミノ酸配列
配列番号５：日本産カブトガニのプロクロッティングエンザイム遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号６：日本産カブトガニのプロクロッティングエンザイムのアミノ酸配列
配列番号７：Ｈｉｓタグ付ファクターＣ遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号８：昆虫細胞での発現にコドンを最適化したファクターＢ遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号９：昆虫細胞での発現にコドンを最適化したプロクロッティングエンザイム遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号１０：ＨｉｓタグなしファクターＣ遺伝子作成用プライマー
配列番号１１：ＨｉｓタグなしファクターＣ遺伝子作成用プライマー
配列番号１２：ペプチド配列

Claims (9)

  1. 下記のタンパク質（１）〜（３）を含むエンドトキシン測定剤であって、該タンパク質（１）〜（３）の各々は昆虫細胞をホストとして発現することにより得られる組換えタンパク質である、測定剤。
    （１）タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）由来のファクターＣであって、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列を有さないファクターＣ。
    （２）カブトガニのファクターＢ。
    （３）カブトガニのプロクロッティングエンザイム。
  2. 前記ファクターＢおよび前記プロクロッティングエンザイムが、タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）由来である、請求項１に記載の測定剤。
  3. 前記ファクターＣが下記のタンパク質（Ａ）または（Ｂ）であり、前記ファクターＢが下記のタンパク質（Ｃ）または（Ｄ）であり、且つ、前記プロクロッティングエンザイムが下記のタンパク質（Ｅ）または（Ｆ）である、請求項１または２に記載の測定剤。
    （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
    （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターＣの活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
    （Ｄ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターＢの活性を有するタンパク質。
    （Ｅ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
    （Ｆ）配列番号６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイムの活性を有するタンパク質。
  4. 下記の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定剤の製造方法。
    （Ａ）下記のＤＮＡ（１）〜（３）の各々をウイルスＤＮＡに組み込む工程。
    （１）タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）由来のファクターＣであって、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列を有さないファクターＣをコードするＤＮＡ
    （２）カブトガニのファクターＢをコードするＤＮＡ
    （３）カブトガニのプロクロッティングエンザイムをコードするＤＮＡ
    （Ｂ）前記各ＤＮＡが組み込まれたウイルスを、各々昆虫細胞に感染させる工程。
    （Ｃ）前記各ウイルスに感染した昆虫細胞に、各々のＤＮＡにコードされるタンパク質を発現させる工程。
  5. 下記の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定剤の製造方法。
    （Ａ）下記のＤＮＡ（１）〜（３）の各々をベクターに組み込む工程。
    （１）タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）由来のファクターＣであって、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列を有さないファクターＣをコードするＤＮＡ
    （２）カブトガニのファクターＢをコードするＤＮＡ
    （３）カブトガニのプロクロッティングエンザイムをコードするＤＮＡ
    （Ｂ）前記各ＤＮＡが組み込まれたベクターを、各々昆虫細胞に導入し、昆虫細胞の染色体に前記各ＤＮＡを組み込む工程。
    （Ｃ）前記各ＤＮＡが組み込まれた昆虫細胞に、各々のＤＮＡにコードされるタンパク質
    を発現させる工程。
  6. 前記ファクターＣをコードするＤＮＡが下記のＤＮＡ（Ａ）または（Ｂ）であり、前記ファクターＢをコードするＤＮＡが下記のＤＮＡ（Ｃ）または（Ｄ）であり、且つ、前記プロクロッティングエンザイムをコードするＤＮＡが下記のＤＮＡ（Ｅ）または（Ｆ）である、請求項４または５に記載の測定剤の製造方法。
    （Ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ。
    （Ｂ）配列番号１に示す塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ファクターＣの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    （Ｃ）配列番号３または８に示す塩基配列を含むＤＮＡ。
    （Ｄ）配列番号３または８に示す塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ファクターＢの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    （Ｅ）配列番号５または９に示す塩基配列を含むＤＮＡ。
    （Ｆ）配列番号５または９に示す塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロクロッティングエンザイムの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  7. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定剤と被験試料とを混合する工程、およびカスケード反応の進行を測定する工程を含む、被験試料中のエンドトキシン測定法。
  8. カスケード反応の進行を検出するための基質を反応系に添加する工程を含む、請求項７に記載の測定法。
  9. さらに、前記基質の反応に基づき、被験試料中のエンドトキシン量を算出する工程を含む、請求項８に記載の測定法。
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