JPH02504308A - 試料中のエンドトキシンの存在を決定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 試料中のエンドトキシンの存在を確認する方法技術分野 本発明は、試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質の存在を確認する 方法、モノクローナル抗体及び該方法に有効な試験キットに関する。 背景技術 カブトガニであるリムルスポリフェムス（Ｌｉｏ＋ｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅｍ ｕｓ）、タキプレアストリデンティタス（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ　ｔｒｉｄｅｎ ｔａｔｕｓ）　、タキブレアスギガス（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ　ｇｉｇａｓ）及 びカルシノスコーピアスローツンディカウダ（Ｃａｒｃｉｎｏｓｃｏｒｐｉｕｓ 　ｒｏｔｕｎｄｉｃａｕｄａ）は、過去３億年にわたってあまり進化しなかった 系統発生学的に原始的な海洋節足動物である（１）。 カブトガニは、青色血リンパを含有する開放循環系を有しており、血リンパに存 在する唯一の生成元素は変形細胞と呼ばれる細胞である（２）。 リムルス変形細胞溶解産物（ＬＡＬ）をエンドトキシンの試験管内試験に使用す ることは、バング（Ｂａｎｇ）によりなされた重要な考察が直接端層となった（ ３）、バングは、カブトガニが、海洋グラム陰性菌での全身感染が生じたときに 、一種の血管向凝固症候群（ＤＩＣ）を示すことを見出した。この最初の生体内 観察は、その後に、生存可能なグラム陰性菌又はダラム陰性菌の細胞壁からの精 製エンドトキシンの添加により、リムルス血リンパの凝固が試験管内で生じるこ とが発見される端層となった（２）、又、同じ研究者（１）により、変形細胞が 、血リンパの凝固に必要な因子源の全てであることも発見された。 現在上記試験をエンドトキシンの試験管内アッセイとして用いているのは、遠心 分離により血リンパから分離した変形細胞を物理的粉砕することにより、細菌性 エンドトキシンでのみ活性化できる凝固成分を含有する懸濁液（ＬＡＬ）を生じ るという事実に基づくものである。この原理を応用することにより、ＬＡＬ試験 がグラム陰性菌、エンドトキシン及びリボ多糖類の検出に関して最も感度の高い 方法となった。現在の精製方法により調製されるＬＡＬは、精製大腸菌標準エン ドトキシン０．１　ｎｇ／ｌａｎを信頗性よく検出できる。　ＬＡＬにより、実 質的に全てのグラム陰性菌の細胞壁に取り入れられている結合（細胞関連）エン ドトキシン又は遊離エンドトキシン（４）を検出できることが判明した。しかし ながら、異なる抽出操作、即ち、異なる種から調製されたエンドトキシンは、反 応性（５゜６）が大きく異なることがある。これらの理由で、対照標準エンドト キシン（ＲＳＥ）が、米国食料医薬品温（ＵＳＦＤＡ）によりＬＡＬ及びウサギ 発熱性試験（米国薬局方ＸＸ）　（７）　　の標準化の手段として調製されてき た。 エンドトキシンと類僚の反応性を有する変形細胞熔解産物は、カブトガニの４種 全てから調製できる。 １ム１　工（Ｌｉｍｕｌｉｄａｅ　　にお番る”リムリダエにおける現在公知の 凝固工程を、表１にまとめて示す。 （本頁以下余白） 、表」− リムリダエにおける凝固工程 ＬＰＳ又はＥＴ　　　　　　又は　　（１−３）−β−Ｄ−グルカンプロ凝固酵 素（セリンプロテアーゼ） 凝固酵素 コアギュローゲン　　　　　　Ｃペプチド非共有的架橋コアギュリン（ｃｏａｇ ｕ　１　ｉ　ｎ）細胞性コアギュローゲン：コアギュローゲンは、分子の重合性 形態の安定性にとって重要である内部ジスフィト結合を有するポリペプチド鎖か らなっている（８）。リムルスボリフェムスにおいて、コアギュローゲンは、残 基１８個の半シスチン含量を有するアミノ酸２２０個からなっていることが見出 された（９）、遊離のＳＨ基が検出されず、グリシンが唯一のＮ末端残基で、セ リンがそのＣ末端残基のように思われる（９）。 コアギュローゲンは、常に、セリンプロテアーゼ酵素により転化される。凝固後 のゲルタンパク質は、電子顕微鏡観察でらせん構造を示す（１０）、タキプレア ストリデンティタスにおいては、コアギュローゲンは、高レベルの塩基性アミノ 酸をを含むアミノ酸１３２〜１３５個で、Ｎ末端がアラニンでＣ末端がフェニル アラニンからなっている。リムルスにおいては、凝塊生成には、コアギュローゲ ンについてのＡｒｇ　−Ｌｙｓペプチド単結合の開裂が伴うと思われる（１１． ９）。Ｎ−ペプチドは、それら同士の間で、非共有形態で相互作用して、不溶性 凝塊を形成する。タキブレアストリデンティタスでは、ゲルの酵素的生成には、 コアギュローゲンのＮ末端に位置するＡｒｇ−Ｇｌｙ及びＡｒｇ−Ｔｈｒペプチ ド結合の限定タンパク賞分解が伴うことにより、ペプチドが放出される（１２． １３）。リムルスのＣ断片には、主に、グルタミン酸及びアスパラギン酸が含ま れている（１４）、リウ（Ｌｉｕ）等（９）はアミノ酸４５個を有するＣ−ペプ チドを検出したが、一方、中村（Ｎａｋａｍｕｒａ）等（１３）及びシシクラ（ Ｓｈｉｓｈｉｋｕｒａ）等（１５）は、このＣ−ペプチドは、種特異性配列で配 列した２８個のアミノ酸残基を存していると主張している。 凝固酵素：凝固酵素は、セリンプロテアーゼ酵素である。 この酵素は、分子量７８，０００及び４０．０００で、非常に類領したアミノ酸 組成を有し、単量体・二量体の関係を示す２つの活性形態で存在する（９）。タ キブレアストリデンティタスでは、未還元凝固系が、分子量４２．０００を有す る糟タンパク質で、凝集して分子量３５０．０００を有するタンパク質を生成す るものとして記載されている。凝固酵素は、不活性前駆凝固酵素（ｉｎａｃｔｉ ｖｅ　ｐｒｏ−ｃｌｏｔｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｌＩ＋ｅ）に由来する。前駆凝固酵 素は、２つの独立した経路（表１）を経由して、グラム陰性菌のＬＰＳ又は一定 の菌類及び＆類の細胞壁からの（１−３）−β−Ｄ−グルカンにより活性化する ことができる。 ＬＰＳ介在凝固：第一に、エンドトキシン又はＬＰＳは、セリンプロテアーゼ型 の前駆凝固酵素を活性化することが実証された（１６．１１）。第二に、更に、 因子Ｂ又は前駆賦活体も、前駆凝固酵素を活性化したことから、ＬＡＬのＬＰＳ 誘発凝固に関与することが判明した（１７．１８）。この活性化には、前駆凝固 酵素の限定タンパク質分解、即ち、アルギニル又はリシル−Ｘ結合のタンパク質 分解が伴うと思われる（１Ｂ）、最後に、この前駆賦活体は、ＬＰＳ依存型と思 われるプロテアーゼＮ（タキブレアストリデンティタスにおける因子Ｃ）と呼ば れる別のタンパク質分解酵素により、活性Ｂ因子又は賦活体（即ち、トリプシン 型セリンプロテアーゼ）に転化されることが認められた（１８．１９）。この一 連の知見は、上記凝固工程が、他の未知の因子（表１）も含んでいるかもしれな い複雑な酵素カスケードを示すことを明らかにしている。 抗凝固因子：変形細胞膜からの８０Ｋｄタンパク質は、エンドトキシンに特異的 に結合する（９．２０）。著者によれば、この受容タンパク質は、多量の胆管内 凝固を生じることなく、リムルス血液における少量のＬＰＳを認識し固定化でき る。更に、ＬＰＳ誘発凝固を妨げる抗凝血剤（抗ＬＰＳ因子）が、タキプレアス トリデンテイタス及びリムルスボリフェムスの血リンパからの変形細胞に存在す る（２１）、この抗凝固剤は、Ｂ因子の活性化を妨げるが、その活性は抑制しな い。他の介在する凝固経路は、抗ＬＰＳ因子によっては影響されない（２１）。 （１−３）−β−Ｄ−グルカン介在凝固：抗腫瘍剤としての（１−３）−β−Ｄ −グルカン及び他の抗腫瘍多Ｉ！類の両方とも、前駆凝固酵素（２３）に作用す るＧ因子を活性化することにより、ＬＡＬ　（２２）のゲル化を生じさせる大き な能力がある。 ＬＡＬによ　エンドトキシン　　　　るドいままで最もよく用いられている方法 は凝固試験である。 この方法は、エンドトキシンと反応するとき、ＬＡＬにおける反応カスケードで 、最終的に不透明のゲル又は凝塊が得られることを基本としている。この試験は 、以下のように行われる。　ＬＡＬｏ、１　ｗｌｌを試験管に入れた試験液０． １　ｌｌ１ｌｌと混合する。この混合液を、水浴中で１時間３７°Ｃでインキュ ベーションする。この試験では、凝塊が生成し、試験管を１８０°逆にしても凝 塊が安定であるとき陽性とみなされる。もっと穏やかな反応も報告されており、 この場合、粘度が増加し、澱粉状の粒子が生成して試験管の壁に付着し、しばし ば不透明度が増加する。ゲル化が完了する前に終点とみなされることがあり、こ の方法での試験の問題点とされてきた。 ＬＡＬにおける反応機構の上記した研究に基づいてなされたＬＡＬ試験の他の変 法も発表された。変法の例としては、濁度法（２４）、色素法（２５）、比色法 （２６）、比濁法（２７）、カイネ千ツク（ｋｉｎｅｔｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ）　 （２８〜３０　）、異スライド法（３１〜３６）、毛管法（３８，３９Ｌ微小希 釈法（４０）、ＬＡＬビーズ法（４１）、コアギュローゲンの放射性同位元素標 識法（４２）、及びＬＰＳ活性化酵素により開裂したときのコアギュローゲンの 抗原性の損失を測定する免疫電気泳動法（４３）が挙げられる。免疫電気泳動法 （４３）を除くこれらの全ての方法において、試験結果は、視覚的又はある種の 装置により容易に読み取られる。 エンドトキシンに・　るＬＡＬの エンドトキシン又はＬＰＳに対するＬＡＬ反応の特異性は、何人かの研究者によ り疑問がなげかけられている。トロンビン、トロンボプラスチン及び一定の合成 ポリヌクレオチドの全てが、ＬＡＬ試験において陽性を示した（４４）、グラム 陽性菌からのペプチドグリカン（４５）、Ａ属連鎖球菌由来のエンドトキシン（ ４６）、酵母マンナン及び細菌デキストラン（４７）、合成デキストラン誘導体 （４８）及びジチオール類（４９）は、ＬＡＬのゲル化を生じる。 ＬＡＬ試験は、種々の生物の膜物質から精製されたエンドトキシン様分子の生物 活性を測定するのに使用されてきた。 陽性ＬＡＬ試験は、大便連鎖球菌から得たりボティコ酸（５０）、マイコプラズ マの異種株から得たりボブリカン類（５１，５２）、ミクロポリスポラファー二 （Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｆ　ａｅｎｉ）　（５３）及びオウム病クラミ ジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｐｓｉｔｔａｃｉ）（５４）から得た細胞壁分画、 プラスモジウムベルブヘイ（Ｐ１ａｓ＋ｓｏｄｉｕｍ　ｂｅｒｇｈｅｉ）の純粋 標本（５５）及びリステリア菌（ｌｉｓｔｅｒｉａ幣ｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ）　（５６）の熱フェノール・水抽出物を用いて行うことができる。 最近、ＬＡＬ試験を臨床に用いることに異議を唱えるものがいる。即ち、ニリン （Ｅｌｉｎ）　（５７）は、ＬＡＬ及び血液を用いて、ヒトにおける異なる１７ の研究の統計解析を行い、グラム陰性敗血症診断用ＬＡＬ試験は、臨床に用いる には不十分であると結論した。更に、それぞれタブス（Ｔｕｂｂｓ）　（５８） 及びガロウェイ（Ｇａｌ　ｌｏｗａｙ）等（５９）による研究により、熱帯熱マ ラリア原虫（Ｐ１ａｓ＋＊ｏｄｉｕ■ｆａｌｃｉｐａｒｕａ＋）に感染した患者 からの血漿及び回帰熱ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｒｅｃｕｒｅｎｔｉｓ）に 感染した患者からの血漿が、ＬＡＬ試験で陽性に反応することが分かった。 上記したほぼ全ての研究では、目的とする方法がＬＡＬ試験の読み取りに用いら れおり、陽性試験がゲル化又は濁り度の増加で定義されている。 いままでのＬＡＬ試験に関して最も困難なこととして、血液又は血漿中のエンド トキシンの検出が挙げられる。第一に、肝臓における循環エンドトキシンの除去 が迅速であるため、通常、血液中の循環エンドトキシンは、低い。第二に、血漿 は、ＬＡＬに対する阻害物質、エンドトキシン不活性化物質及びエンドトキシン 結合タンパク質を含有している。 エンドトキシンを血漿から抽出するのに種々の方法が用いられてきた。これらの うち、血漿の希釈と加熱とを組み合わせることにより、最良の結果が得られた（ ４３）。 ロケット免疫電気泳動法を用いてＬＡＬとエンドトキシンとの反応性を測定する 実験（４３）では、他のいくつかの方法よりも高度の正確さと感度が得られ、こ の方法は、診断用に適している。 ＬＡＬと緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及び黄色ブ ドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）から得た可溶性抗原 との間の相互作用についての免疫電気泳動法による研究から、ＬＡＬがＬＰＳと 非常によく反応するが、他のグラム陰性菌及びグラム陽性菌からの抗原とも反応 することができることが分かった（６０）。 制御　　にお【るＬＡＬｉ ＬＡＬ試験を主に使用してきたのは、現在、種々の大容積及び小容積の非経口液 、生化学薬品及び医療用具について、年間無数の試験を行っている製薬業界であ った。このＬＡＬ試験は、現在一般的に、世界中の製薬業界で製造される多くの 注射液及び観血的医療用具についての、工程内（ｉｎ−ｐ丁ｏｃｅｓＳ）試験及 び最終放出（ｆ　１ｎａｌ−ｒｅｌｅａｓｅ）試験の両方で行われてＬＡＬ試験 の臨床用途については、ジョルゲセン（ＪΦｒｇｅｎｓｅｎ）により徹底的に検 討された（６１）、ＬＡＬ試験の臨床用途についてのこの検討から、１９６０年 代後半にこの試験が紹介されてから、うまくいく可能性のある多数の使用法が記 載されてきたことが結論として得られる。これらの使用法は、全て、速度、感度 、及び生存グラム陰性菌からの結合エンドトキシンであるか、事前又は周期的細 菌成長の残留物としての遊離エンドトキシンであるとは無関係に細菌性エンドト キシンに対するＬＡＬ試験の特異性の点で有利である。これらの全ての用途にお いて、ＬＡＬ試験が、ある点で、従来の細菌性エンドトキシン診断法よりも優れ ていることが判明した。しかしながら、これらの用途のいずれも、従来の方法に 取って代わってＬＡＬ試験単独で診断に用いるようにはならなかった。 その代わり、ＬＡＬ試験は、種々の臨床例においてグラム陰性菌の存在を確認す る補助手段として非常に有効である。ＬＡＬ試験は、現在有効な診断用途（髄膜 炎、眼球感染、細菌尿症）があり、最終的には、エンドトキシンの他の病態生理 学的な結果、即ち、内奏血症がよりよく理解できるようになる。 発明の開示 本発明者等は、リムルス又はタキプレアス変形細胞溶解産物とエンドトキシンと の間の反応を確認するための新規な方法を開発した。この方法は、エンドトキシ ンに対する感度及び特異性は、ロケット免疫電気泳動法（４３）と同じであるが 、高度に専門化した装置又は高度に熟練した操作要員を必要とせず、実質的にい ずれの試験所でも行うことができる。 又、ロケット免疫電気泳動法よりも、簡単であり、即ち、時間がかからないとと もに、経済的に実施でき、変形細胞溶解産物の必要量は少量でよい、新規な方法 は、従って、公知の方法と比較して、重要な経済的利点がある。即ち、本発明は 、ａ）試料を、カブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパの成分又はその合 成類似体とともにインキュベーションすることにより、エンドトキシン又はエン ドトキシン様物質が試料中に存在する場合に前記成分が変性されて、前記成分若 しくは類似体又はそれらの免疫決定基に対する抗体、又は実質的に前記成分若し くは類似体又はそれらの免疫決定基のみに対する抗体との反応が生じないか、前 記成分又は類似体と試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質との反応 の生成物が前記成分若しくは類似体又はそれらの免疫決定基に対する抗体、又は 実質的に前記成分若しくは類似体又はそれらの免疫決定基のみに対する抗体と反 応するようにし、ｂ）工程ａ）から得られる前記試料と前記成分又は類似体との インキュベーション混合物を、前記成分若しくは類似体又は免疫決定基に対する 抗体又は実質的に前記成分若しくはＭ４ｍ体又はそれらの免疫決定基のみに対す る抗体と反応させることにより試料中に存在する前記成分又は類似体に抗体を結 合させるか、前記反応生成物若しくはその免疫決定基に対する抗体又は実質的に 前記反応生成物若しくはその免疫決定基のみに対する抗体と反応させることによ り試料中に存在する前記反応生成物に抗体を結合させ、そしてＣ）工程ｂ）から 得られる反応混合物中の結合抗体を検出して、抗体が前記成分若しくは類似体又 はそれらの免疫決定基に対する抗体又は実質的に前記成分若しくは類似体又はそ れらの免疫決定基のみに対する抗体である場合には、結合抗体量の減少が検出さ れたときにはエンドトキシン又はエンドトキシン様物質が存在することを示して おり、一方、抗体が前記反応生成物若しくはその免疫決定基対する抗体又は実質 的に前記反応生成物若しくはその免疫決定基のみに対する抗体である場合には、 結合抗体量の増加が検出されたときにはエンドトキシン又はエンドトキシン様′ ４ｙＪｒｉが存在することを示していることから、試料中のエンドトキシン又は エンドトキシン様物質の存在を確認する、以上の工程を含むが、但し、工程ａ） における試料と前記成分又は類似体とのインキュベーション後に存在する前記成 分若しくは類似体又は前記反応生成物を固体支持体に結合させるか、前記抗体を 固体支持体又は固体支持体に結合した架橋分子に結合するか、試料中に存在する エンドトキシン又はエンドトキシン様物質を固体支持体に結合することを特徴と するエンドトキシン又はエンドトキシン様物質の存在を確認する方法に関する。 本明細書において、「エンドトキシン又はエンドトキシン様物質（ｅｎｄｏｔｏ ｘｉｎ　ｏｒ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−１ｉｋｅ　ｍａｔｅｒｉａｌ）　Ｊとは、 通常、細菌膜の外表面成分であり且つパイロジエンである、即ち、熱病を誘発す る物質を意味する。グラム陰性菌のエンドトキシンの生化学的に活性な部分はリ ボ多糖体であり、リポ多糖体の発熱性及び内毒素性は脂質成分（リピドＡ）に依 存していることが判明した。しかしながら、グラム陽性菌の表面抗原をはじめと する他の表面抗原も、ＬＡＬと反応することのあることが分かった（４５．４６ ．６０）、従って、ＬＡＬと反応する細菌又はカビ、酵母若しくは藻類等の他の 微生物から得られるいずれの物質又は成分も、エンドトキシン又はエンドトキシ ン様物質に含まれる（２２．２３，４７．４８）。 「カブトガニ変形細胞溶解産物又は血リンパの成分（ｃｏｍｐ。 ｎｅｎｔ　ｏｆ　ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ　ｃｒａｂ　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙ ｓａｔｅ　ｏｒ　ｈａｅｍｏｌｙｍｐｈ）　Ｊとは、全溶解産物又は全血リンパ だけでなく、その中の個々の反応性成分をも意味する。この全溶解産物又は全血 リンパは、エンドトキシン又はエンドトキシン様物質と反応する上記反応成分を 含有している。現時点で本発明の方法に使用するのに適した成分は、コアギュロ ーゲン（全溶解産物に存在するような）である、溶解産物及び血リンパは、カブ トガニの４種、即ち、リムルスポリフェムス（Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅ ｍｕｓ）、タキプレアストリデンテイタス（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ　ｔｒｉｄｅ ｎｔａｔｕｓ）、タキプレアスギガス（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ　ｇｉｇａｓ）及 びカルシノスコーピアスローツンデイカウダ（Ｃａｒｃｉｎｏｓｃｏｒｐｉｕｓ 　ｒｏｔｕｎｄｉｃａｕｄａ）の全てに由来するものでよく、これらのうち、リ ムルス溶解産物及びタキブレアス溶解産物が好ましい。 「合成類似体（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ａｎａｌｏｇｕｅ）　Ｊとは・カブトガニ 変形細胞溶解産物又は血リンパに自然発生する成分と、エンドトキシン又はエン ドトキシン様物質に対する反応性が同じか又は実質的に同じである物質を意味す る。このような類似体は、従来のペプチド合成、好ましくは固相ペプチド合成等 の化学合成か、前記成分をコードしている遺伝子を適当な発現ベクター中にクロ ーニングし、得られる組み換えベクターで適当な微生物を形質転換し、適当な媒 体中で生物を成長させて前記遺伝子を発現させ、そして産生じた成分を培地から 分離する工程を含む組み換えＤＮＡ法により調製できる。本発明で使用される特 異的成分は、凝固因子、例えば、Ｂ因子、Ｃ因子、Ｃ因子、Ｎ因子、前駆凝固酵 素、活性化凝固酵素、抗ＬＰＳ因子又はコアギュローゲン及び凝集素、例えば、 リムリン又はポリフエミン等のレクチンから選択できる。この凝固因子は一般的 に変形細胞中に見出され、一方、凝集素は通常血リンパ中に見出される。 「前記成分又は類似体と試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質との 反応の生成物（ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ａｒｅａｃｔｉｏｎ 　ｏｆ　５ａｉｄ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｏｒ　ａｎａｌｏｇｕｅ　ｌ１１ｉｔ ｈ　ａｎ　ｅｎｄｏｔ。 ｘｉｎ　ｏｒ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−１ｉｋｅ　＋ｌ１ａｔｅｒｉａｌ　ｉｎ　 ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅ）　Ｊとは、上記した酵素カスケードにおける試料中のエ ンドトキシン又はエンドトキシン様物質の存在により活性化される基質（上記し た酵素カスケードにおける他の酵素をはじめとする）の酵素的に触媒された開裂 又は他の酵素的に誘発された変化（例えば、三次タンパク賞構造における）から 生じる生成物を意味する。反応生成物は、コアギュリン、Ｃ−ペプチド、活性化 凝固酵素、活性化Ｂ、Ｃ，Ｇ若しくはＮ因子、並びにこれらの因子及び前駆凝固 酵素からの開裂生成物から選択できる。 「試料」とは、エンドトキシンの存在に関して試験する物質を意味する。「試料 」には、通常パイロジエン試験を受ける物質を含めることが好ましい。従って、 試料は、非経口液又は注射液等の製剤、即ち、薬剤又は栄養剤等の活性物質及び 患者の体内に挿入するのに用いられる医療用具、例えば、カニユーレ又はカテー テル等の観血的用具から選択できる。 通常パイロジエン試験を受ける他の物質としては、マイトジェン、栄養媒体及び 糧衝液をはじめとする生化学薬品、食品、飲料水並びに製薬工業で使用する水が 挙げられる。更に、試料は、尿、髄液、血液、血清、血漿又は血液若しくはリン パ液から製造される生成物等の体液から選択でき、従って、本発明により、エン ドトキシン誘発疾病を診断することが可能となる。臨床試料中のパイロジエンを 検出する公知の方法の欠点は、公知の試験を、体液、主に血漿及び血清の試料に ついて行うとき、菌属症及び敗血症の正確な診断に必要な特異性及び感度示さな いことにあった。驚（べきことに、本発明を用いることにより、血漿及び血清中 のエンドトキシンが少量でも（ピコグラムのレベルでも）正確に検出できること が判明した。 本明細書において、「免疫決定基（ｆ＋ａｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｅｔｅｒｖ ｉｎａｎｔ）　Ｊとは、本発明の試験方法に所望の性質を示す抗体を生じさせる ことのできる前記成分若しくは類似体のサブ配列又は抗体と反応する前記成分若 しくは類似体のサブ配列を意味する。従って、免疫決定基は、例えば、上記した 酵素カスケードにおいて、成分又は類似体が開裂される開裂部位を埋めている配 列でよい、「抗体」とは、動物又は動物細胞を、前記成分、類似体又は反応生成 物に暴露したときの応答として生成される物質を意味する。本発明のアッセイ法 に適した特異性及び感度を確保するために、抗体は、カブトガニ変形細胞の数種 の成分、全溶解産物又は全血リンパに対して特異性を示すのではなく、カブトガ ニ変形細胞溶解産物又は血リンパの単一成分に対して特異性を示す単一特異性抗 体であることが好ましい。目的によっては、抗体はポリクローナル抗体でもよい が、−ｉ的には、モノクローナル抗体であることが好ましい、これは、モノクロ ーナル抗体の場合、アッセイの特異性及び感度が高いので、従来のＬＡＬ試験法 よりもエンドトキシン又は類似物質が正確に測定できると同時に、試験成分又は 類似体が少量で済むので本発明の方法を使用する場合の経済性が高まることによ る。 本発明によれば、エンドトキシン又はエンドトキシン様物質の存在が、陰性法及 び陽性法の両方で確認できる。陰性での確認は、試料と成分又は類似体とのイン キュベーション混合物との反応に成分又は類似体に対する抗体を用い、試料を成 分又は類似体とともにインキュベージシンして得た反応生成物が抗体とは反応し ないことを利用することにより行うことができる０反応後に結合抗体がほとんど 検出されないが、少なくとも、エンドトキシンを含まない対照と比較して結合抗 体の量が相当に減少した場合には、成分又は類似体が酵素的に開裂されたか、さ もなければエンドトキシンの存在により構造的に変化して成分又は類似体の抗体 がもはや結合できないことを示しているので、試料中にエンドトキシン又はエン ドトキシン様物質が存在しているとみなされる。一方、抗体が前記反応生成物の 抗体である場合、本発明の方法の工程ｂ）で添加される抗体は、試験において結 合する（又は少なくとも、エンドトキシンを含まない対照よりも多量の抗体が結 合する）ことにより、試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質の陽性 確認ができる。 本発明の方法は、エンドトキシンの定性試験又は定量試験に通している。定量測 定の場合、試験で結合した抗体の量は、自体公知の方法における試料の希釈列に より測定できる（４３参照）。 本発明により、上記した方法の工程ａ）において試料を成分又頻似体とともにイ ンキュベーションした後に残存する前記成分若しくは類似体又は前記反応生成物 を固体支持体に結合するときには、成分若しくは類似体に対する抗体又は反応生 成物に対する抗体を固体支持体に添加することができ、このとき、結合抗体が検 出されないか、エンドトキシンを含まない対照と比較して結合抗体の量が少ない 場合には、前者の場合（抗体が成分若しくは類似体に対するものの場合）、試料 中にエンドトキシンが存在することを示す、一方、後者の場合（抗体が反応生成 物に対する抗体の場合）、結合抗体が存在することが、試料中にエンドトキシン が存在することを示す。 別法として、抗体を、固体支持体又は固体支持体に結合した架橋分子に結合し、 本発明の方法の工程ａ）における試料を成分又は類似体とともにインキュベーシ ョンした後ニ残存する成分を、抗体に結合して更なる量の抗体と反応させてもよ い。 更に、別法として、試料中に存在するエンドトキシン又はエンドトキシン様物質 を、固体支持体に結合してもよい。その後、固体支持体に成分又は類似体を添加 することにより、成分又は類似体とともにインキュベーション後、成分若しくは 類似体の標識抗体か、試料ととともに成分若しくは類似体をインキュベーション することにより得られる反応生成物の標識抗体を添加する。この場合、成分（又 は類似体）は、全溶解産物、全血リンパ、又はエンドトキシンが反応して上記し た酵素カスケードを誘発する溶解産物中に含まれる化合物でなければならない。 別の態様によれば、本発明は、本発明の方法に使用するためのモノクローナル抗 体に関する。この抗体は、カブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパの成分 、その合成類似体又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にカブトガニ変形 細胞溶解産物若しくは血リンパの成分、その合成！（１２体又はその免疫決定基 のみに対する抗体である。 更に、別の態様によれば、本発明は、試料中のエンドトキシン又はエンドトキシ ン様物質の存在を確認するための試験キットであって、 ａ）カブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパの成分、その合成類似体又は その免疫決定基に対する抗体か、実質的にカブトガニ変形細胞溶解産物若しくは 血リンパの成分、その合成類似体又はその免疫決定基のみに対する抗体、又は前 記成分若しくは類似体とエンドトキシン若しくはエンドトキシン様物質との反応 の生成物又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的に前記成分若しくは類似体 とエンドトキシン若しくはエンドトキシン様物質との反応の生成物又はその免疫 決定基のみに対する抗体、及び ｂ）カブトガニ変形細胞若しくは血リンパの成分又はその合成類似体からなるこ とを特徴とする試験キットに関する。 上記で説明したように、前記成分若しくは類似体と結合する抗体又は前記反応生 成物と結合する抗体は、カブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパ（又はそ の合成ｉｌ１体）中の特異的成分に対する単一特異的抗体が好ましい。単一特異 的抗体は、適当な動物に、当該成分又は類（夏休の実質的に純粋な試料を注射後 、最初の放血前に最大６か月まで、適当な間隔（例えば、２週間〜１か月）でブ ースター注射する。その後、この確立された免疫養生を継続しながら、各ブース ター免疫後約１週間動物を放血させ、従来の方法、例えば、ハーボエ（Ｈａｒｂ ｏｅ）及びインギルド（Ｉｎｇｉｌｄ）、スカンド・ジェイ・イムノ（Ｓｃａｎ ｄ、　Ｊ、　Ｉ＋＋ｍｕｎ、）、２（補遺１）、１６１〜１６４（１９７３）に 記載されている方法で血清から抗体を分離する。 高い特異性を必要としない目的の場合には、抗体はポリクローナルでよい。ポリ クローナル抗体は、ハーボエ（Ｈａｒｂｏｅ）及びインギルド（Ｉｎｇｉ　ｌｄ ）　（同書）に記載されているのと実°質的に同様な方法で得ることができる。 しかしながら、はとんどの場合、本発明の方法で用いられる抗体は、モノクロー ナル抗体であることが好ましい。これは、モノクローナル抗体の場合、一般的に 、ポリクローナル抗体よりもアッセイの特異性及び感度が高いと同時に、測定時 間が少なくて済む。更に、試験の検出限界及び感度が増加することから、２種以 上のモノクローナル抗体の混合物を用いてもよい。モノクローナル抗体は、下記 の方法により得ることができる。 本発明の方法に用いる抗体は、アッセイの正確さを向上させるために、実質的に 純粋であることが好ましい。 抗体がそれに対する物質（即ち、成分、類似体又は反応生成物）と反応すると凝 集を生しる固体粒子（後述する）に抗体を結合させる場合等、場合によっては、 抗体を未変性の形態で用いてもよい。しかしながら、はとんどの目的の場合、抗 体に結合抗体の検出用の標識を付けるか、（二抗体アッセイのように）標識抗体 と未標識抗体を組み合わせて用いてもよい。標識に使用される物質は、それ自体 で検出可能である物質又は別の物質と反応させて検出可能な最終生成物を生成す ることのできる物質から選択できる。即ち、標識は、酵素、螢光物質、化学発光 物質、発色団、放射性同位体及び錯生成剤から選択できる。 標識として有効な酵素としては、例えば、ベルオキシダ−ゼ（例えば、ワサビダ イコンペルオキシダーゼ）、ホスファターゼ（例えば、酸ホスファターゼ）、β −ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコース、グルコースオキシダーゼ、炭酸 脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、リン ゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−ｐ−ホスフェート脱水素酵素及びリボヌクレ アーゼが挙げられる。 酵素はそれ自体では検出できないので、基質と併用して検出可能な最終生成物を 生成する反応を触媒する必要がある。 即ち、上記した工程ｂ）から得られる反応混合物に基質を添加して、着色、螢光 又は化学発光生成物を生じさせるか、色の変化を生じさせるか、色、螢光又は化 学発光の強度の変化を生じさせてもよい。上記した酵素用基質として本発明の方 法に有効な基質としては、例えば、ＨｚＯ□、ｐ−ニトロフェニルホスフェート 、ラクトース、尿素、β−Ｄ−グルコース、ＣＯｌ、コリンエステル、デンプン 、リゾディクチカス（ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）　、マレート、グコース− ６−ホスフェート及びＲＮＡが挙げられる。この基質は、例えば、供与体か受容 体である発色団と併用してもよい、結合抗体を直接的に検出するための標識とし て使用できる螢光物質は、４−メチルウンベリフェリル−Ｄ−ガラクトピラノシ ド、４−メチルウンベリフェリル−ホスフェート及び３−（ｐ−ヒドロキシブエ ニル）プロピオン酸から選択できる。これらの物質自体は、螢光分光光度計によ り検出でき、螢光を定性的にも定量的にも測定できる。 抗体結合を直接的に検出するための標識として用いることのできる化学発光物質 は、イソルミノール／ＥＤＴＡ／ＨｚＯｚ、ペルオキシダーゼ／エオシン／ＥＤ ＴＡ及びルシフェラーゼ並びにそれらの基質から選択できる。これらの物質自体 は、分光光度計により検出でき、化学発光を定性的にも定量的にも測定できる。 結合抗体を直接的に検出するのに使用できる発色団は、５−アミノサリチル酸、 ２，２゛−アジノージ−（３−エチルベンズチアプリン−６−スルホン酸、０− フェニレンジアミン、０−ジアミンイシジン（ｏ−ｄｉａｍｉｎｉｃｉｄｉｎｅ ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン、３−（ジメチルアミノ）安 息香酸、ｏ−）ルイジン、３．３’　、５．５”　−テトラメチルベンジジン、 ０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド及びｐ−ニトロフェニルホスフェー トから選択できる。これらの物質自体は、分光光度計により検出でき、色、例え ば、色の強度又は色の変化を、定性的にも定量的にも測定できる。 結合抗体を直接的に検出するのに使用できる放射性同位体は、＋２Ｊ、２Ｈ，３ Ｓｐ　、　＋３Ｊ１及び＋４（から選択できる。同位体により放出される放射能 は、γ−カウンター又はシンチレーションカウンターで測定でき、結合放射能を 定性的及び定量的に測定できる。 結合抗体を検出するのに使用できる錯生成剤は、ビオチン（アビジン及びストレ プトアビジンと錯体を形成する）及びレクチン（炭水化物決定基、例えば、レセ プターと錯体を形成する）から選択できる。この場合、錯体自体は、検出できな いので、錯生成剤が錯体を生成する相手物質を標識する必要がある。マーキング は、抗体の標識に関して上記した物質、即ち、螢光物質、化学発光物質、発色団 、酵素又は放射性物質のいずれを用いて行ってもよい。 本発明の方法において、固体支持体に結合した架橋分子に抗体を結合するとき、 固体支持体と抗体との間の結合の役割を果たす架橋分子は、グルグルアルデヒド 、カルボジイミド、リジン、プロティンＡ及びヒドラジドから選択できる。この 抗体は、標識しても未標識でもよく、本発明の方法の一実施１！様においては、 未標識抗体を固体支持体に結合させた後、成分又は類似体と試料とのインキュベ ーション混合物と未標識抗体を順次添加する。 本発明の方法で用いられる固体支持体は、ポリマーを包含することが好ましい、 この支持体は、それ自体ポリマーから構成されていてもよいし、マトリックスに ポリマーを被覆したものでもよい、マトリックスは、ガラス、紙又はプラスチッ ク等の本発明の目的に適したいずれの物質でもよい、それ自体で固体支持体を構 成するか、マトリックス上に通用するポリマーは、プラスチック、ニトロセルロ ース紙、臭化シアン活性化紙、１−（３−ニトロベンジルオキシメチル）ピリジ ウムクロリド紙、ジアゾベンジルオキシメチル紙、ニトロベンジルオキシメチル 紙又はアミノベンジルオキシメチル紙等のセルロース、シリコーンポリマー及び シリカ又はシリケートから選択できる。適当なプラスチックとしては、例えば、 ラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリアクリルアミ ド、ポリ酢酸ビニル及びそれらの適当な共重合体が挙げられる。シリコーンポリ マーとしては、例えば、シロキサンが挙げられ、シリケートとしては、例えば、 ガラスが挙げられる。ポリマーには、必要に応じて、上記で説明した酵素カスケ ードの特定試薬生成部分の結合を容易にするための官能基が付いていてもよい。 このような官能基としては、例えば、必要に応じて固体支持体に結合した上記の 架橋分子が挙げられる。 目的によっては、ある種の形状が、他の形状よりも使用するのに便利なことがあ るけれども、固体支持体の物理的形状は特に重要ではない、即ち、固体支持体は 、板上、例えば、１Ｆ！若しくは好ましくはマイクロタイタブレート、ストリッ プ、フィルム、プロティンＡ被覆バクテリア等の固体粒子、又は紙の形態でよい 。本発明の方法で使用する固体粒子は、約１〜１０μ園の範囲のサイズを有して いる。 一実施態様によれＬｆ、本発明は、 ａ）コアギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュロ ーゲン又はその免疫決定基のみに対する抗体、又はコアギュリン若しくはＣ−ペ プチド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン若しくはＣ− ベプチド又はその免疫決定基のみに対する抗体を、固体支持体又は固体支持体に 結合した架橋分子に結合させ、ｂ）試料をコアギュローゲン含有物質とともにイ ンキュベーションして、試料中にエンドトキシン又はエンドトキシン様物質が存 在する場合にはコアギュローゲンが開裂されてコアギュリン及びＣ−ペプチドと なるようにし、Ｃ）工程ｂ）から得られるインキュベーション混合物を固体支持 体に添加して、固体支持体に結合した抗体がコアギュローゲン又はその免疫決定 基に対する抗体か、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみに対する 抗体の場合には、試料中に存在するコアギュローゲンを結合するようにし、固体 支持体に結合した抗体がコアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基 に対する抗体か、実質的にコアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定 基のみに対する抗体の場合には、コアギユツンスはＣ−ペプチドを結合すように し、 ｄ）固体支持体に、コアギュローゲン又はその免疫決定基に対する標識抗体か、 実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみに対する標識抗体を添加して 固体支持体上に存在する結合コアギュローゲンに結合すようにするか、又はコア ギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコ アギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗体を添加し て固体支持体上に存在する結合コアギュローゲン、結合コアギュリン又は結合Ｃ −ペプチドに結合するようにし、そしてｅ）工程ｄ）の固体支持体に結合した標 識抗体を検出して、抗体がコアギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体か 、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、 結合抗体量の減少が検出されたときにはエンドトキシン又はエンドトキシン様物 質が存在することを示しており、一方、抗体がコアギュリン若しくはＣ−ペプチ ド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン若しくはＣ−ペプ チド又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、結合抗体量の増加が検出 されたときにはエンドトキシン又はエンドトキシン様物質が存在することを示し ていることから、試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質の存在を確 認することを含む。 別の実施態様によれば、本発明の方法は、ａ）試料をコアギュローゲン含有物質 とともにインキュベーションして、試料中にエンドトキシン又はエンドトキシン 様物質が存在する場合にはコアギュローゲンが開裂されてコアギュリン及びＣ− ペプチドとなるようにし、ｂ）工程ａ）のインキュベーション混合物を固体支持 体に添加して、混合物中に存在するコアギュローゲンを結合するか、混合物中に 存在するコアギユツンスはＣペプチドを結合するようにし、 Ｃ）固体支持体に、コアギエローゲン又はその免疫決定基に対する標識抗体か、 実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみに対する標識抗体を添加して 固体支持体に結合したコアギュローゲンに結合すようにするか、又はコアギュリ ン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュ リン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗体を添加して固体 支持体上に結合したコアギュリン又はＣ−ペプチドに結合するようにし、ｅ）工 程Ｃ）の固体支持体に結合した標識抗体を検出して、抗体がコアギュローゲン又 はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定 基のみに対する抗体の場合には、結合抗体量の減少が検出されたときにはエンド トキシン又はエンドトキシン様物質が存在することを示しており、一方、抗体が コアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的 にコアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗体の場 合には、結合抗体量の増加が検出されたときにはエンドトキシン又はエンドトキ シン様物質が存在することを示していることから、試料中のエンドトキシン又は エンドトキシン様物質の存在をＴａ認することを含む。 上記両方の実施態様において、固体支持体を、インキュベーション混合物と抗体 との反応後に、少なくとも一回、できる限り最高４回洗浄することにより未結合 抗体を除去するのがよい（上記に概略述べた２つの実施１１様は、それぞれ、直 接酵素結合免疫吸着剤アッセイ及び二重酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳ Ａ）によく対応している）。これらのＥＬＩＳＡ法は、用いられる特異成分（即 ち、ＬＡＬに存在するコアギエローゲン）の必要量が４０倍少なくてよいことが 判明したので特に有利である。更に、この試験行うのに必要とする時間は、数百 価の試験について約４時間であり、公知の試験法に対して顕著な向上を達成でき る。これらの利点とは別に、本発明の方法により、臨床試料、特に血液又は血漿 に関して得られる結果は、血液中に妨害物質が存在していても悪影響を受けない 利点がある。　ＥＬＩＳＡ法は、十分確立されており、既存の実験装置を用いて 行うことができ且つ自動化も可能である。 従って、本発明の方法は、臨床試験所では診断目的で、一方、製薬業界において は原料又は製剤中におけるアッセイとして幅広く適用できる。 更に、別の実施態様によれば、本発明の方法は、ａ）コアギュローゲン又はその 免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみ に対する抗体、又はコアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基に対 する抗体か、実質的にコアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基の みに対する抗体を、固体粒子に結合させ、 ｂ）試料をコアギュローゲン含有物質とともにインキュベーションして、試料中 にエンドトキシン又はエンドトキシン様物質が存在する場合にはコアギュローゲ ンが開裂されてコアギュリン及びＣ−ペプチドとなるようにし、Ｃ）工程ｂ）か ら得られるインキュベージジン混合物を工程ａ）の抗体に添加して、抗体がコア ギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュローゲン又 はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、コアギュローゲンの存在下で固 体粒子の凝集を生じさせるようにし、抗体がコアギュリン若しくはＣ−ペプチド 又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン若しくはＣ−ペプチ ド又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、コアギュリン又はＣ−ペプ チドの存在下で固体粒子の凝集を生じさせるようにし、そして ｄ）コアギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュロ ーゲン又はその免疫決定基のみに対する抗体が結合している固体粒子が凝集しな いことにより、又はコアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基に対 する抗体か、実質的にコアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基の みに対する抗体が結合している固体粒子が凝集することにより試料中のエンドト キシン又はエンドトキシン様物質の存在を確認することを含む。 この実施態様では、エンドトキシンの存在は、抗体が結合している固体粒子の凝 集を確認することにより、直接的（視覚的）に検出できる。換言すれば、本方法 のこの実施Ｂ様では、通常、抗体の標識は必要としない。 上記した理由により本方法に用いるのが特に有利であることが判明した本発明の モノクローナル抗体は、一般的に抗体に関連して上記で説明した特徴を示す。こ のモノクローナル抗体は、 ａ）適当な動物又は適当な動物細胞を、カブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血 リンパ、その合成類似体又はその免疫決定基から実質的になる抗原で免疫するか 、前記成分又は類似体とエンドトキシン又はエンドトキシン様物質との反応の生 成物又はその免疫決定基から実質的になる抗原で免疫することにより、前記抗原 に対する抗体を産生ずる細胞を得て、ｂ）前記抗原に抗体を産生ずる細胞を適当 な細胞系と融合させ、 Ｃ）得られる前記抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を選択してクローニングし 、 ｄ）ハイブリドーマ細胞を適当な媒体中で成長させて前記抗体を産生じ、そして ｅ）得られる抗体を培養から回収することにより調製できる。 動物の免疫は、前記成分、類似体又は反応生成物の、緩衝水溶液、例えば、リン 酸緩衝生理食塩水又はアジュバント等の適当な溶媒溶液により行うのが好ましい 、適当なアジュバントとしては、例えば、フロイント完全アジュバント、フロイ ント不完全アジュバント及び水酸化アルミニウムが挙げられる。免疫のための適 当な動物は、ウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、マウス、ニワトリ及びモルモットか ら選択すればよい。 動物の放血及び（ポリクローナル）抗体の分離は、自体公知の方法により行うこ とができる。 ミエローマ細胞との融合に用いられる抗体産生細胞は、膵臓細胞又はリンパ節細 胞が好ましい、ミエローマ細胞と抗体産生細胞は、一方の種からの融合細胞をも う一方の種からの細胞と融合することができれば、同じ動物種由来のものである 必要はない。しかしながら、ミエローマ細胞源と抗体産生細胞源の両方は、同様 の動物種を使用することが好ましい。 本発明を実施するための好ましいハイブリドーマの一つは、マウスミエローマ細 胞を抗原感作マウス肺臓細胞と融合することにより造成できる。 細胞融合は、ケーラー（Ｋｏｈ　１　ｅｒ）及びミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉ ｎ）、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６．４９５　（１９７５）に開示され ている方法を改良して行うことができる。即ち、抗体産生細胞とミエローマ細胞 との融合は、ポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で行うことが好ま しい。この際、ミエローマ細胞１佃当たり抗体産生細胞が約１０個の割合が好ま しい。 用いられるミエローマ細胞系は、選択培地中で未融合ミエローマ細胞が死亡し、 一方、融合したハイブリッド細胞が生存するように、所謂薬剤耐性型が好ましい 。従来の方法では、酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシル−トランスフ アーゼを欠き、従って、）（ＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチ ミジン含有）では成長できない８−アザグアニン耐性の細胞系が、細胞融合に最 もよく用いられている。 更に、ミエローマ細胞系は、それ自体では、抗体、免疫グロブリン重鎮又は免疫 グロブリン軽鎖を生成しないことを意味する「非分泌型（ｎｏｎ−ｓｅｃｒｅｔ ｉｎｇ）　Ｊであることが好ましい。 前記成分、類似体又は反応生成物に対する抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞は 、未融合抗体産生細胞、未融合ミエローマ細胞及び融合細胞を個々の容器におい て、未融合ミエローマが分裂しない選択培地で培養して、約１〜２週間後にそれ らが死亡するようにすることにより選択できる。未融合抗体産生細胞のみが限ら れた数の細胞分裂サイクルで生存し、その後、それらも死亡する（１〜２週間） 。一方、首尾よく融合した細胞は分裂を続ける。これは、親のミエローマ細胞か ら受は継いだ永久成長性を有するとともに、親の抗体産生細胞から酵素ヒポキサ ンチンホスホリボシル−トランスフェラーゼを合成する能力を有しているので、 選択培地（ｃａｓｕ　ＨＡＴ培地）中で成長できるからである。それにもかかわ らず、同じ抗原に対して生じさせた融合細胞により産生じたモノクローナル抗体 は、生成を誘発している特異的決定基に依存して互いに識別し難い場合がある。 しかしながら、一定のハイブリドーマクローンの場合、このクローンにより産生 じた全ての抗体は、抗原分子中の特定の決定基に対して単一特異性である。所望 の抗体を産生じているハイブリドーマは、例えば、限界希釈法又は他の適当な方 法により選択し、例えば、自体公知の方法において限界希釈系を用いて、反復再 クローニングによりクローン化し、ハイブリドーマ細胞を適当な媒体、例えば、 ダルベツコ最小エッセッシャル培地中で培養することにより、高純度のクローン 化モノクローナル抗体を得ることができる。この試験管内法により、成長培地に 存在する異種の血清、例えば、ウシ胎児血清からの少量のタンパク質で汚染され るだけでモノクローナル抗体が産生ずる。 試験管内で産生じた抗体と比較して、純度がわずかに減少するが濃度が相当高い モノクローナル抗体を産生ずるために、選択したハイブリドーマ細胞を、動物の 体腔で成長させてもよい、この方法によれば、所望のハイブリドーマクローンを 、マウス等の動物、好ましくは同系又は半開系マウスに注射して、腹水腫瘍を生 成を生じさせることにより、高濃度の抗体を（約２〜１０＋ｓｇ／ｍ　ｌ　）動 物の血液及び腹水に放出させる。たとえ動物が通常の免疫グロブリンも産生ずる としても、モノクローナル抗体の約５％にしか過ぎない１本発明のモノクローナ ル抗体は、一般的に、細胞から分泌されるので、延伸分離、濾過、沈澱、抽出及 び／又はクロマトグラフィー等の細胞外産生物を分離するための標準操作により 細胞上清又は体液から回収できる。 本発明による試験キットの個々の試薬ａ）及びｂ）は、それぞれ、カブトガニ変 形細胞溶解産物の抗体及び成分に関連して上記で説明した特徴を示すことができ る。これとは別に、キットは、標識及び未標識抗体（特に、二抗体アッセイに使 用の場合）の両方を含有するものでよい。本発明のキットにおける他の成分して は、特に定量アッセイに有効で、標準対照よりも高レベル又は低レベルの抗体結 合を測定することが可能となるエンドトキシン標準、並びに本発明の試験キット 及び本発明の方法で用いられる試薬を希釈するためのパイロジエンを含まない水 （パイロジエンで汚染された水を用いることに起因して誤った結果が得られるの を避けるために）が挙げられる０本発明の試験キットは、グラム陰性菌〔例えば 、腸内細菌、例えば、大腸菌、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇａｌｌａ　ｄｙｓｅｎｔｅ ｒｉａｅ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐｐ、　、サルモネ ラ（Ｓａｌａ＋ｏｎｅｌｌａ）ｓｐＬ、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ｓｓ ｐ、　、クロストリジウム（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕ＋ｎ）ｓｐｐ、　、コレラ菌 （Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）　、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ）ｓｓｐ、　）及びグラム陽性菌〔例えば、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　 ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）及びストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ ｃｕｓ）ｓｐｐ、　）　　；マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）ＳｐＩ） −；クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｓｐｐ、）　；梅毒トレポネーマ（Ｔｒ ｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ）　；カビ〔例えば、カンジダアルビカンス （Ｃａｎｄｉｄａ　　ａｌｂｉｃａｎｓ）及びマラリア寄生虫（ｗ＋ａｌａｒｉ ａ　ｐａｒａｓｉｔｅ）熱帯熱マラリア原虫（Ｐ１ａｓｍｏｄｉｕ＋ｍ　ｆａｌ ｓｉｐａｒｕｍ）等の原生動物をはじめとする多種多様の病原体による感染から 生じる臨床／病的状態の診断に用いることができる。又、キットは、これらの病 原体自体又は残留発熱性エンドトキシン若しくば病原体由来の他の表面抗原によ る、医薬品原料、製剤及び医療用具の汚染の検出にも有効である。 （本頁以下余白） 図面の簡単な説明 第１図は、リムルス変形細胞溶解産物とエンドトキシンとの反応後、コアギュロ ーゲンのバンドが消失して、コアギュローゲンと抗体との反応性が喪失したこと を示している。 第２図は、ＥＬＩＳＡ試験により測定される残留コアギュローゲンは、エンドト キシン濃度に逆比例することを示しているＬＡＬ−ＥＬＩＳＡの標準曲線である 。 第３図〜第６図は、インキュベーション時間とＬＡＬの希釈倍数との異なる組み 合わせから得られるＬＡＬ−エンドトキシン反応曲線である。 第７図は、血漿を１０倍希釈した後７５°Ｃで１ｏ分間インキュベーシッン処理 するとエンドトキシンがほぼ１００％回収されたのに対して、他の２つの処理で は回収率が約５０％にすぎなかったことを示している。 第８図及び第９図は、種々のグラム陰性菌株からの８種のＬＰＳのＬＡＬ−ＥＬ ＩＳＡ曲線（第８図）及び（１−３）−β−Ｄ−グルカンの曲線（第９図）であ る、使用したＬＰＳは、腸炎菌（Ｓａｌ＋ｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄ ｉｓ）（ム）、大腸菌Ｊ５（Ｅ、　ｃｏｌｉ）（）、緑膿菌（Ｐｓｅｏｄｏｍｏ ｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（マ）、ウマ流産面（Ｓａ　Ｉｍ。 ｎｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉ）　（Δ）、大腸菌０５５　：　Ｂ５（ ０）　、ネズミチフス菌（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ＋ｏｕｒｉｕｗ） （■）、大腸菌０１１１　：Ｂ４（・）及びサルモネラミネソタ（Ｓａｌｍｏｎ ｅｌｌａ　＋ｗｉｎｎｅｓｏｔａ）（ロ）であった、第８図における符号（＋） は、エンドトキシンを含まない水中で得られるＬＡＬの吸光度の値を示している 。 第１０図は、ヒト血清（ロ）、ヒト血漿（腫）、ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｉ ｘｉｎ　Ｂ）　（・）及びリムルス血漿（０）のＥＩＡ５０に及ぼす希釈倍数の 影響を示している。ヒト血清及びヒト血漿は、−人のボランティアから調製した 。リムルス血漿は、１２のリムルスポリフエムスのプール血液を、５０００ｘ　 ｇで３０分間遠心分離して調製した無細胞上清であった。 発明を実施するための最良の形態 以下、本発明を実施例により更に詳細説明するが、本発明はこれらの実施例には 限定されない。 実施例１ コアギュロー°ン（ＬＡＬ）に・　るモノクロ−ル□□□坦星 １、コアギュローゲンの調製及び精製 リムルス変形細胞溶解産物（ＬＡＬ）を、トベーデ・エム（Ｔｖｅｄｅ　Ｍ）及 びベータ・エル（Ｂｅｋ　Ｌ）　、アクタ　バソル　ミクロパイオル　イムツル 　スカンド（八ｃｔａ　Ｐａｔｈｏｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１ｍｍｕｎｏ １．５ｃａｎｄ、）　、第８９１章、１９８３年、第９〜１５頁に開示されてい る従来の方法により、リムルスポリフェムスから産生した。 溶解産物Ｌｏａｆを透析し、２ｏ＋Ｍ　ＣａＣ］ｚを含有する０、０５Ｍ　）リ ス−ＨＣｌ　緩衝液（ｐＨ７，９）の等容量と混合した。この混合物を、同じ緩 衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース（商標）ＣＬ−６Ｂカラム（１５ｘ　 １．５　ｃｍ）に附した。カラムに吸着しなかった分画を、更に、同じトリス緩 衝液で平衡化したヘパリン−セファロース（商標）　ＣＬ−６Ｂカラムに附した 。これらの条件下で、コアギュローゲンがヘパリン−セファロース（商標）カラ ムに結合したが、０．１５Ｍ　ＮａＣ１及び２ｍＭ　ＣａＣ１ｇを含有する０、 ０５Ｍ　　）リスー〇ＣＩ緩衝液（ｐ）１７．９）を用いて溶離できた。溶離物 質の５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、溶離物質が純度〉９０％ 　のコアギュローゲンを含有していることが判明した。 ２、コアギエローゲンによるＢａ１ｂ／ｃマウスの免疫化上記の工程１で得た精 製コアギュローゲンを、コアギュローゲン２００μｇ　７ｍｇ　Ａｔ（ＯＨ）ｓ に相当する水酸化アルミニウムゲル（Ａ１（叶）、）に吸着させ、得られた懸Ｓ 液をＡｌ（ＯＨ）３１　ｍｇ７１βに調製した。 一次免疫を行うため、各マウスに、フロイント不完全アジュバン）０．５　ｒａ ｎで乳化したコアギュローゲン懸濁液０．５ｍｆｆ１（コアギュローゲン１００ 　μｇ／マウスに相当）を腹腔内注射した。２週間後、各マウスに、フロインド アジュバントなしで、コアギュローゲン懸濁液０．５ｍ１．を腹腔内にブースタ ー注射した。 同様の投与量を２８日目に注射し、その４日後に肺臓を取り出し、肺臓を慎重に 切開及び引き裂いて肺臓細胞懸Ｓ：ａ、を調製した。得られた肺臓細胞を、以下 の工程での細胞融合に使用した。 ３、細胞融合及び細胞の培養 上記で得た肺臓細胞を、ミエローマ細胞（ｘ　６３Ｍｇｓ−”）と１０：１の比 （ｌｌ＋１！臓細胞１０春に対してミエローマ細胞１０？）で混合し、ポリエチ レングリコール溶液〔リン酸緩衝生理食塩水中５０　ｗ／ｖ％ＰＥＧ　１５００ ．７−／■％Ｄ？ＩＳＯ（ジメチルスルホキシド）〕トトモに、３７゛Ｃで９０ 秒間インキュベーションして細胞融合を促進した。ダルベツコ最小工ンセンシャ ル培地（ＤＭＥＭ）　２０ａ　１２を添加し、細胞を１．０００　ｘ　ｇで遠心 分離した。細胞ベレットを、１０％ウシ胎児血清を含有するＨＡＴ培地（ヒポキ サンチン、アミノプテリン及びチミジン含有）１００　ｒｔ＋１に再懸濁し、細 胞（Ｅ、１．０８６つ円４レマイクロタイタプレート（ＮＵＮＣ、デンマーク） に分配した。各ウェルに、細胞成長を促進し且つ微生物汚染を防ぐためのフィー ダ細胞として、清浄マウス由来の細胞を１０４個／ウェルを添加した。培地は１ 週間に２回取りかえた。 ４、抗コアギュローゲン抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞の選択 酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、陽性クローンをスクリーニ ングした。９６ウエルマイクロタイタプレート（イムノプレート、ＮＵＮＣ、デ ンマーク）に、上記した方法で精製したコアギュローゲンを塗布した。このコア ギュローゲンを、炭酸緩衝液（ｐＨ９，０）で２μｇ／ｍ１．に希釈し、コアギ ュローゲン含有緩衝液１００μ！を各ウェルに添加した。４°Ｃで一晩インキュ ベーション後、ウェルを、０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）　（商標 ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で４回洗浄した。 ウェルを、工程３で調製した細胞融合プレートからの培養上清１００μ！ととも に、１時間インキュベーションし、０．０２％ツイーン２０　（Ｔｗｅｅｎ２０ ）　（商標）を含有するＰＢＳで１；ｌＯに希釈し、洗浄後、ペルオキシダーゼ 結合ウサギ抗マウスＩｇ（ダコパンツ（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）　、コペノハーゲ ン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）、コードＰ２６０、ｌ：１０００希釈）とともに１ 時間インキュベーションした。ペルオキシダーゼを、オルソフェニレンジアミン ８　＋ｏｇを含有するクエン酸・リン酸覆衝液（蒸留水１０００曽ｌ当たり、ク エン酸−ｎｚｏ　７．３ｇ及びＮａＪＰＯｚ　　−２Ｈｚｏ　１１．８６ｇ）（ ｐＨ５，０）１０ｍｆｆｉに３５％Ｈ２０□５μｌを添加した溶液と反応させた 。この反応は、ＩＭ　ＨｚＳＯａで停止させ、４９２　ｎａ＋で吸光度を読み取 った。 ２週間の培養の後、１７ウエルからのハイプリドーマ上清は、強い陽性反応を示 した。限界希釈により、これらのウェルの内１０個からハイブリドーマ細胞を選 択し、クローニングし且つ再クローニングを行った。このようにして安定なりロ ーン７個を樹立した。得られたハイブリドーマ細胞クローンを、１０％ウシ胎児 血清を補充したＤＭＥＭ培地中で細胞培養フラスコで、３７°Ｃ１５％ＣＯ□及 び湿度９０％の条件で成長させるとともに、一定のインキュベーション時間後に マウスに腫瘍を形成しその血液及び腹水に高濃度の抗体（２〜３Ｉｌ１ｇ／ｌ１ １）を放出するブリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）で処理したマウス（２週間前に プリスタン１−２を腹腔内注射したマウス）に注射（細胞１０７個）した。 ５、モノクローナル抗体の精製 培養上清を、ミリボア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）限外濾過システムで濃縮した。　 ＮａＣ１を添加して、グリシン濃度を３．３Ｍから１．６５Ｆ’１に調製し、０ ．２Ｍ　ＮａＯＨを用いてｐＨを８．８５に調整した。次に、抗体を、プロティ ンＡカラムを通した。結合抗体を、０．１ｈクエン酸・リン酸糧衝液（ｐＨ２， ８）で溶離した。トリス−ＨＣｌを用いて、ｐ）Ｉを８．０に調整した。　Ａ２ １１０／１％−１４と仮定して、抗体の量（Ａｔｔｏ）を、分光光度計で測定し た。より精密に測定するために、ＥＬＩＳＡ法を用いて、マウス抗体のみを測定 した。 マイクロタイタブレートに、ＰＢＳで１＝５００に希釈したウサギ抗マウス免疫 グロブリン（ダコパッツ、コード２１０９）を塗布した。既知のマウスＩｇ標準 （マウス２０μｓ　Ｉｇ／　＋＊ｆ）の希釈列及び未知試料の希釈物を添加した 。結合マウスＩｇを、１：　１０００に希釈したペルオキシダーゼ結合ウサギ抗 マウスＩｇ（ダコバッツ、コードＰ２６０）を用いて検出した。標準曲線から、 マウスＩｇの未知の濃度が計算できた。腹水からの抗体を、実質的に同様な方法 で精製した。但し、この場合、プロティンカラムに附する前に、上記のＮａＣ１ ／グリシン／ＮａＯＨ１１衝液で１　：１に希釈した。 ６、モノクローナル抗体の特性決定 ハイプリドーマ細胞により産生じたモノクローナル抗体のクラス及びサブクラス を、マウス１．に対するビオチン標識クラス／サブクラス特異的ウサギ抗体（米 国ザイムド社（Ｚｙ■ｅｄＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、ＥＬＩＳＡ法で 試験した。この方法は、検出抗体がマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ　、　ＩｇＧ２ ｂ　、ＩｇＧ３、ＩｇＭ又はＩｇＡに対するビオチン標識ウサギ抗体である以外 は、マウスＩｇＯ量の測定に関連して上記で説明した方法と実質的に同じであっ た。結合を、ペルオキシダーゼ標識ストレプタビジンで最終的に検出した。全て の抗体が、ＩｇＧ１サブクラスであり、Ｘ軽鎖を有していた。 実施例２ モノクロ−ル　　と１ムルス゛ノ　　ＦＩＬＭ　　　　のコアギュロー゛ンとの 　・　　びエンドトキシン　・１ムルスづ　　ｒ”　　との　・　の リムルス変形細胞溶解産物（ＬＡＬ）とリボ多Ｉｉ類（ＬＰＳ）反応ＬＡＬの各 ３μｌを、（１％）アガロースゲルに附した後２時間２０ν／ｃｓ＋で電気泳動 した。電気泳動後、一枚のニトロセルロース紙をアガロースゲル上に置き、５　 ｋｇの圧力を約２０分間維持することにより、アガロースゲル中のタンパク質を ニトロセルロース紙に結合させた。ニトロセルロース紙の過剰の結合部位を０． ０５％ツイーン２０（商標）でブロックした。 次に、ニトロセルロース紙を、実施例１で説明したようにしてモノクローナル抗 体とともにインキュベーションした。 抗体を含有する培養上清２００μ２を、０．０２％ツイーン２０（商標）を含有 するＰＢＳ５０　ｗｉｔに添加した。−晩のインキュベーション後、１：１ＯＯ Ｏに希釈した酵素標識二次抗体（ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス；コペン ハーゲンにあるダコバッッ社製）を添加した。最後に、テトラメチルベンジジン 及びＬＯ２を添加した〔テトラメチルベンジジン（２４＋ｎｇ）を、ジオクチル ソジウムサルファサクシナー）　８０ｓ＋ｇのエタノール１０Ｉ１１！溶液で溶 解し、クエン酸・リン酸緩衝液（ｐＨ５，０）３０　ｍ　Ｉ！を添加後、３０％ Ｈ，０□を２０μ！添加し、蒸留水を加えて５０ｍ　ｆ！とする〕。結合抗体が 濃い青色に着色したのが眼で観察された。 第１図から、モノクローナル抗体は非反応ＬＡＬ中のコアギュローゲンと反応す るが、ＬＰＳ反応ＬＡＬとは反応しないことが明らかである。免疫プロット法は 、シー・コツホ（Ｃ，Ｋｏｃｈ）等、ジェイ　イムノロジカル　メソッズ（Ｊ、 　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ１１’１ｅｔｈｏｄｓ）、第８４巻、１９８５年、 第２７１〜２７８頁に開示されている方法を用いた。 実施例３ −　、人　疫　　　ア・・セイ（ＥＬ４ＳＡ）によるエンドトキシヱ二役上 再構成しパイロジエンを含まないトリス−Ｍｇ”緩衝液で１２４に希釈した市販 のＬＡＬ剤〔米国マサチューセッツ州のウッドショーにあるザ・アソシエーショ ン・オブ・ケープ・コツト（Ｔｈｅ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｐｅ 　Ｃｏｄ）　）　１０ｕ　Ｉ！、を、多数の小さなガラス製試験管に添加した。 各試験管に、米国薬局方標準エンドトキシン〔大腸菌０５５：Ｂ５；米国ウォー カーズビレ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）にあるポインタカー・エムニー・バイ オプロダクツ社（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｍ、Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、　 Ｉｎｃ、）（無エンドトキシン緩衝液である陰性対照を含む）の濃度を変えた（ 第２図参照）試験試料１０μ！を添加した。混合物を、３７°Ｃで１時間インキ ュベーションした。炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）　（蒸留水１０００鶴２当たりＮ ａｚＣＯ３１，５９ｇ及びＮａ）ＩｃＯｓ　２．９３ｇ含有）０．５　ｒｔ＋　 １２を添加して反応を停止させ、試験管ごとに、炭酸緩衝液で１：５０希釈物を 調製した。 希釈インキュベーション混合物１００ｕｆを、９６ウエルマイクロタイタフプレ ー）　（ＮＵＮＣ、デンマーク）の各ウェルに添加した。室温で１時間インキュ ベーション後、プレートを、ＰＢＳ　　（蒸留水１００抛２当たりＮａＣ１２９ ，２ｇ　、　ＭＣＩ　０．２　ｇ　、、ＫｎｚＰＯａ　０．２　ｇ−ＮａｔＨＰ Ｏａ　　・２１ｈ０　１．１５ｇ及びトリトンＸ（商標）１０ａ／！含有〕で４ 回洗浄した。ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）及びナカネ（Ｎａｋａｎｅ）　（６２ ）により記載されている過ヨウ素酸塩法と実質的に同様の方法で、セイヨウワサ ビペルオキシダーゼに、実施例１で記載したようにして調製したモノクローナル 抗体を結合させた。即ち、蒸留水１細ｌに溶解したＨＲＰ４ｍｇを、調製したば かりの１００　＋ｏＭ　Ｎａ１Ｏａ　０．１ａｆと混合し、３０分間室温で攪拌 した。この溶液を、１　ａ＋Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ４．４）で−晩４°Ｃ において透析後、モノクローナル抗体（５０＋ＩＩＭ炭酸緩衝液１鵬ｌにう溶解 、ｐＨ９，５）８　ｓｏｌ！と混合した。室温で２時間攪拌後、新鮮ＮａＢＨａ 溶液（４＋ｌ１ｇ／　ｗ＋１）０．１＋ｆ！を添加し、４°Ｃで２時間インキュ ベーションした。得られた複合体を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、　ｐＨ７ ，３）で４℃において一晩透析した。 その後、等容量のグリセロール（８７％）に添加し、−２０”Ｃで保存した。希 釈緩衝液（洗浄緩衝液１０００＋＋＋　１にウシ血清アルブミン１０　ｇを溶解 したもの、ｐＨ７，２）で１　：２０．ＯＯＯに希釈したペルオキシダーゼ結合 モノクローナル抗体１００μ！をウェルに添加し、１時間インキュベーションし た。プレートをＰＢＳで４回洗浄後、染色溶液〔蒸留水１００抛！当たりクエン 酸・Ｈｚｏ　７．３ｇ及びＮａ２ＨＰＯ，−２Ｈｚｏ　１１．８６ｇクエン酸− Ｈ，８７，３ｇを含有し、そこにペルオキシダーゼの基質を添加した溶液（パー ヒトロール４０μ２を添加した染色緩衝液１００ｍｊ！にオルソフェニレンジア ミン４０＋ｇを溶解したもの））１００μｌを添加した。３０分後ＩＭ　Ｈ，Ｓ Ｏ，で反応を停止し、４９２　ＩＩｍで吸光度を測定した。 第２図は、試料に対するエンドトキシンの添加量を変えた場合の結果を示す標準 曲線である。この曲線から、本発明の方法の感度（検出範囲）は、エンドトキシ ン１０〜０．７５　ｐｇ／ｍｌの範囲であることが分かる。 本実施例で説明した試験では、インキュベーション混合物からのコアギュローゲ ンを、直接マイクロタイタブレートに結合させ、もしエンドトキシンが存在する 場合、コアギュローゲンの存在量が少なく、エンドトキシンを含まない対照と比 較して、試験において検出可能な程度に結合抗体の量が減少する。 第３図〜第６図は、インキュベーション時間及びＬＡＬの希釈倍数を変えた条件 下でＬＡＬ（コアギュローゲン）とエンドトキシンとを反応させた場合の反応曲 線である。これらの曲線から、以下のことが明らかである：（１）エンドトキシ ンの検出性は、全てのＬＡＬ希釈倍数において、インキュベーション時間の増加 とともに増加する。この際、希釈倍数が高いほど２、速に増加する；（２）１： ４以下の希釈では、３０分のインキュベーション後では検出性が同じであり、又 、全ての希釈倍数での検出性の差は、インキュベーション時間の増加とともに減 少した；　（３）ＬＡＬの希釈倍数を高めると、曲線において、エンドトキシン の測定可能濃度のスパンが広がる０本発明のＥＬＩＳＡ試験法を、ロケット免疫 電気泳動法（４３に記載されている）及び従来のゲル凝固法〔無パイロジエント リス−Ｍ、・・緩衝液で再構成したしＡＬｏ、１１１Ｎをガラス製試験管（１０ ｘ　７５＋＋＋ｍ）中でエンドトキシン溶液０．１　ｔａｇと混合し、試験管を さかさにしてもそのままの状態を維持することのできる強固なゲルが生成して場 合を陽性とし、他の全ての場合を陰性とした〕と比較した。結果を表２に示す。 （本頁以下余白） ！ ３つのエンドトキシンアッセイ法の比較０．７８　　　　１．９６　　　４．２ 　　　　　−１．５６　　　　１．６４　　　３．０　　　　　−３．１２　　 　　１．００　　　１．５　　　　　−６．２５　　　　０．１５　　　０　　 　　　　　＋１２．５０．０７０　＋ ２５　　　　　　０．０７　　　０　　　　　　　＋定量化　　　　　可能　　 　可能　　　　　？表２から、新規な方法は、ロケット免疫電気泳動法に優ると も劣らない方法であり、ゲル凝固法よりも８倍も低濃度のエンドトキシンを検出 することができることが明らかである。 ＬＡＬ−ＥＬＩＳＡの利点の一つは、ＬＡＬの希釈倍数及びインキュベーション 時間を調整することにより、１バツチの市販のＬＡＬから所望の感度の標準曲線 を得ることができることにある。 パイロジエンとしてＬＡＬ試験が公式に承認されるとともに、市販のＬＡＬ試薬 に対して大きな需要が生じた。唯一のＬＡＬ源が、絶滅しかけている無を推動物 のカブトガニであるので、ＬＡＬの消費量が最少で済む感度の良いＬＡＬ試験の 開発が重要となっている。コアギュローゲンを検出するためのＥＬＩＳＡ法では 感度が高く（最初のＬＡＬが１００００倍に希釈されたときでも、Ａ４９□の値 は２．０に達した’）　、ＬＡＬの使用量が最少銀で済む可能性がある。計算で は、ＬＡＬの体積及び希釈倍数を考慮して同じ感度で比較すると、ＬＡＬ−ＥＬ ＩＳＡで必要とするＬＡＬＯ量は、凝固−ゲル法で使用されるＬＡＬＯ量のわず か１／１６０でよい、一般的に、凝固−ゲル法よりも１０倍以上感度のよいＬＡ Ｌ−ＥＬＩＳＡでは、凝固−ゲル法で使用されるＬＡＬの必要量の約１７４０で よい。 ＬＡＬ−ＥＬＩＳＡでは、ＬＡＬ試薬の消費量が最少で済む他に、試料の量が非 常に少なくて済む、即ち、他のＬＡＬアッセイでは通常１００μｌの試料を用い るのに対して、ＬＡＬ−ＥＬＩＳＡでは、−回の試験を行うのに１０μ！の試料 で十分である。試料が微量でしか入手できない場合には、この利点は重要となる 。 実施例４ 、゛　・　のエンドトキシンの 緩衝液の場合と同じ高検出限界を有する血清試料中のエンドトキシンの存在を検 出する際の本発明の方法の性能を示すために、米国薬局方標準エンドトキシン（ 実施例３参照）を、水で１０倍希釈して最終濃度を２００Ｎｇ／ｍ　ｊ！とした 無ＬＰＳヒト血漿に添加した。 ＬＰＳを添加後、異なる３つの試料について、血漿を、それツレ、６５°Ｃで１ ５分間、７５°Ｃで１０分間及び１００″Ｃで５分間熱処理した。同一に希釈し 且つ加熱した無ＬＰＳ血漿を希釈剤として用いて、上記で得られた各血漿溶液の 希釈列を調製することにより、実施例３で説明したのと実質的に同様の方法で試 験を２回行った。結果を第７図に示す０図から、ＬＰＳの定量測定には血漿を１ ０分間７５°Ｃで処理するのが最適であることが明らかである。対照である無エ ンドトキシン水で観察されたＡ４，２値は、血漿試料で観察された値とは大きな 差はなく　（ＬＡＬ−ＥＬＩＳＡの変動限界内）、これらの試料中のエンドトキ シンレベルがエンドトキシン４ｐｇ／ｌａ　ｌ　（検出限界）未満であり且っＬ ＡＬ−ＥＬＩＳＡは血漿の色及び濁りには妨害されなかったことを示している。 得られた結果から、本発明の方法は、臨床試料中のエンドトキシンの存在を測定 するための感度のよいアッセイ法としても有効であることが分かる。 実施例５ ＬＡＬＯ代わにタキブレアス変形細胞溶解産物（タキブレアストリデンテイタス ）を出発物質として用いた以外は、実施例１に記載したのと実質的に同じ方法に より、ＴＡＬからのコアギュローゲンに対）−るモノクローナル抗体を調製した 。得られた抗体は、実施例３に記載したＥＬＩＳＡ試験において反応性を示した 。 実施例６ ビオチン−モノクロ−ル　コアギュロー°ン　　　ム、９里里 ビオチンを、実施例１に記載した方法で調製したモノクローナル抗コアギュロー ゲン抗体と、以下のようにして結合させた。精製したモノクローナル抗体溶液（ １ｍｇ　ＩｇＧ／／り　１里里を、１００　ａ＋Ｍ　ＮａＨＣＯ，（ｐ）１８． ０）緩衝液で４°Ｃにおいて一晩透析後、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドビオチ ン（４０ｍｇ／ａ　ｉ！、　；シグマケミカル社（Ｓｉｇ＋ｅａ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　Ｃｏ、）製〕５μ！と混合した。室温で２時間攪拌後、混合物を、ＰＢＳ （ｐＨ７，３）で４°Ｃにおいて一晩透析した。得られた複合体を、等容量のグ リセロール（８７％）に添加し、−２０°Ｃで保存した。 この複合体を下記のようにＥＬＩＳＡ法に用いた。　ＬＡＬと標準エンドトキシ ン（実施例３に記載の方法で調製した）との希釈インキュベーション混合物１０ ０　μｌを、９６カウエルマイクロタイタプレート（ＮｔｌＮＣ、デンマーク） の各ウェルに添加後、室温で１時間インキュベーションした。実施例３に記載し た洗浄緩衝液で４回洗浄後、希釈緩衝液で１：２０００に希釈したモノクローナ ル抗体−ビオチン複合体１００μ！を添加した。 １時間のインキュベーション後、プレートを４回洗浄した。 希釈緩衝液で１：４０００に希釈したアビジン−）ＩＲＰ複合体（シグマケミカ ル社製）１００μ！を添加し、プレートを１時間インキュベーションした。プレ ートを４回洗浄し、基質溶液１００μｌを添加した（実施例３に記載の方法で） 。１ｏ分間のインキュベーション後、ＩＭ　ＨｚＳＯａを１５０μ！添加して反 応を停止した。 吸光度をＡ４９！で測定した。 ＨＲＰ−モノクローナル抗体複合体を用いたＥＬＩＳＡでは、モノクローナル抗 体−ビオチン複合体（ＨＲＰ−アビジンの使用）を使用する場合よりも工程が一 つ少ないが、）ＩＲＰ−モノクローナル抗体複合体よりもビオチン−モノクロー ナル抗体複合体を調製する方がはるかに容易であった。複合体は０°Ｃ未満に保 ったとき安定であった。　２０．０００個の単一試験を行うのにモノクローナル 抗体は１　ｍｇあれば十分であるので、モノクローナル抗体を使用しても、ＬＡ Ｌ−ＥＬＩＳＡ試験は高価とはならない。 実施例７ 標準エンドトキシンを、ホイッタカー・エムニー・バイオプロダクツ社（Ｗｈｉ ｔｔａｋｅｒ　Ｍ、Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｃｌｕｃｔｓ、　Ｉｎｃ、）から購入し た（１０　ｎｇ／バイアル）。サルモネラミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｍｉ ｎｎｅｓｏｔａ）、大腸菌０１１１　：　Ｂ４、大腸菌０５５　：　Ｂ５、ウマ 流産菌（Ｓａｌｏ＋ｏｎｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉ）　、ネズミチフ ス菌（Ｓａｌｉｏｎｅｌ　ｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ＋ｅ）及び腸炎菌（Ｓａ］ ｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）由来の精製ＬＰＳ　（Ｗ）を、ディ フコ・ラボラトリーズ社（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　（所在地 ：ミシガン州のデトロイト）から購入した。大腸菌Ｊ５及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の高度に精製したＬＰＳは、アンダ ース・フォムスガード博士（Ｄｒ、　ＡｎｄｅｒｓＦｏｍｓｇａａｒｄ）　（コ ペンハーゲンにあるタダショスピタレット（Ｒｉｇｓｈｏｓｐｉ　ｔａｌｅｔ） のインフエクシャス・ジイズイーズ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ ）部門〕から提供された。 これらのＬＰＳは全て再構成し、ｌ　ｔａｇ／　ｒａｎの濃度に希釈後、使用す るまで一２０℃に凍結しておいた。アッセイ直前に、無エンドトキシン水により 、ＬＰＳの種々の希釈物を調製した。 ＬＰＳアッセイの全てを２回つづ行い、特記のない限り、得られた値を平均した 。 アルカリ大便菌ｖａｒ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ｖａｒ、 ）ミクソゲネス（ｍｙｘｏｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ１３１４０（カードラン（Ｃｕｒ ｄｌａｎ）　　；和光純薬工業株式会社製〕由来の（１−３）−β−Ｄ−グルカ ンを、大株等（６３）に記載されている方法によりエンドトキシンフリーとした 。濃縮液（１ｍｇ／　ｍｌ）を、使用するまで４°Ｃで保存した。 ＨＲＰ−モノクローナル抗体複合体を用いて、実施例３に記載の方法によりＬＡ Ｌ−ＥＬＩＳＡを行った。 第８図及び第９図は、８種のＬＰＳのＬＡＬ−ＥＬＩＳ八曲線へび（１−３）− β−Ｄ−グルカンの曲線である。ＬＰＳ曲線は、明らかに、勾配がシャープであ り且つお互いに平行となっており、これらは、効力には大きな差があるけれども 、ＬＡＬとの反応性が本質的に類憤していることを示している。　（１−３）− β−Ｄ−グルカンは、ＬＰＳよりも効力が少なくとも１０００倍低く且つ反応曲 線の勾配がはるかに小さく、ＬＡＬとの反応速度がはるかに小さいことを示して いる。 エンドトキシン以外にい（つかの物質が高濃度で陽性反応を生じるとの報告があ る（６０．４７）　、又、（１−３）−β−Ｄ−グルカンは、１　ｎｇ／　ｔａ ｌｌの濃度でＬＡＬと反応できることが判明し、エンドトキシンの次に効力の大 きな物質であるとの報告もある（２３）。しかしながら、試験される物質にエン ドトキシンが混入する恐れがあり、これらの研究の結論は、疑問視されることが よ（ある。本発明者等による研究では、ＬＡＬ−ＥＬＩＳＡを用いて（１−３） −β−Ｄ−グルカンを試験したところ、その反応性は、エンドトキシンよりも、 少なくとも１０００倍低かった。ＬＡＬとの反応速度がエンドトキシンよりもは るかに遅いことから、（１−３）−β−Ｄ−グルカンはエンドトキシンとは本質 的に異なる挙動を示すものと思われる。このことは、（１−３）−β−〇−グル カンによるＬＡＬの活性化は、エンドトキシンとは異なる経路を経由して起きる ことを見い出した森田等（２３）から説明できる。２つの経路は、共通の一工程 、即ち、前駆凝固酵素の活性化工程を有すると思われる。従って、２つの経路の どちらの活性化でも、コアギュローゲンの分解が生じ、抗原性の喪失が起きる。 エンドトキシンとＬＡＬとの反応は、（１−３）−β−Ｄ−グルカンとＬＡＬと の反応と、速度論的に区別できるので、ＬＡＬ−ＥＬＩＳＡは、ＬＡＬと反応す ることのできる物質を更に研究するのに有効な手段である。 実施例８ 罵　のエンドトキシンの 入院中の敗血症の疑いのある患者から採取した静脈血を、ヘパリン（血液１ｍ１ 当たり１０　ｌ１ｌ）を入れた無エンドトキシンガラス管に吸引した。　２００ ０ｒｐａｅで１５分間遠心分離して調製した血漿を、無エンドトキシン水で１０ 倍に希釈後、７５℃で１゜分間加熱した。以下のＬＡＬ−ＥＬＩＳＡ操作を、Ｌ ＡＬを業者が指定した通り再構成した以外は、実施例３に記載の方法で行った。 エンドトキシンに関するＬＡＬ−ＥＬＩＳＡの検出限界は、エンドトキシン４ｐ ｇ／ｌａ　ｌであった。検体中のエンドトキシン濃度は、希釈倍率を考慮して、 標準曲線から計算した。 表３に、患者１０人の血漿試料中のエンドトキシンの測定結果を示す、これらの 敗血症患者のエンドトキシンレベルは、一般的に低く且つかならずしも血液又は 髄液（ＣＳＦ）の細菌検査の結果とは相関がない。 Ｎ１１ｌの患者は、淋病菌感染したことがあり、入院して敗血症の疑いがもたれ ていた。検査では細菌は認められなかったが、血液中に特異的淋菌抗体が相当に 増加していることが分かった。Ｎα４の患者は、血液及び髄液中にグラム陽性菌 が存在しており、入院４日後に敗血症性ショックで死亡した。魔８の患者は、尿 路性敗血症の疑いがあり且つかなりの細菌法がある。Ｎα９の愚者は、９ｙ、炎 菌性敗血症の疑いがあるが、入院前にペニシリン治療をしたため、検査では細菌 は見出されなかった０敗血症患者の血液中にエンドトキシン濃度が極めて低い場 合には（表３）、感度の高いＬＡＬ試験が必要であることが分かる。興味深いこ とに、ＬＡＬ−ＥＬＩＳＡの検出限界（エンドトキシン４ｐｇ／ｍ　ｌ　）より も高い濃度でエンドトキシンを含有している正常血漿試料はなかった。 結論として、ＬＡＬ−ＥＬＩＳＡは、感度が高く、血漿からの妨害が少なく、Ｌ ＡＬ試薬及び試験試料の消費量が最少限でよく、再現性がよく且つ実行が容易で あることから、エンドトキシンを臨床的に検出するための有望なＬＡＬ試験と言 うことができる。 （本頁以下余白） Ｊ− 敗血症患者由来の血漿試料中のエンドトキシンの検出１　　淋病　　　陰性　　 　　陰性　　　２００　　　　　発熱、関節炎、脈管炎高ＧＡＴ　” ２　　骨髄ｌＩＩ　　緑膿菌　　　　陰性　　　　２４９　　敗血症　　陰性　 　　　陰性　　　　１１　　　　　尿中大腸菌〉１０Ｓ備考）：十淋病菌（Ｇｏ ｎｏｒｒｈｏｅａ）抗体タイタ実施例９ ヒト　將のエンドトキシン　″　のアーセイヒト血清、ヒト血漿、リムルス血漿 、ＬＡＬ及びポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ　Ｂ）によるＬＰＳの投与量 依存不活性化が、実施例３に記載されたＬＡＬ−ＥＬＩＳＡにより示された。 各無エンドトキシンガラス管に、試験試料（ヒト血清、ヒト血漿、リムルス血漿 、ＬＡＬ及びポリミキシンＢ）各５０ｕＩ２．、及び無菌生理食塩水で種々の濃 度に希釈したＬＰＳ　（大腸［０１１１：Ｂ４）５０μ！を順次加えた。容管の 内容物を、よく混合して３７°Ｃで１時間インキュベーションした。上記の溶液 を、無エンドトキシン水で少なくとも１０００倍に希釈してＬＰＳアッセイ範囲 （１〜１１００ｐ／ｍｌ）に到達させるとともに、続いて行うＬＡＬ試験での試 験試料による妨害をなくした。残留ＬＰＳの定量化を、実施例３で説明した方法 により、ＬＡＬとコアギュローゲンのＥＬＩＳＡ測定との組み合わせを用いて行 った。 全てのアッセイを、それぞれ少なくとも２回行い、得られた値を平均した。 ＬＡＬとＬＰＳとの反応で、実施例３で説明した方法でコアギュローゲンに対す るモノクローナル抗体を用いてＬＡＬ−ＥＬＩＳＡにより測定した吸光度とＬＰ Ｓ　ｆｉ度の間に、直線関係が得られた。血清による反応妨害は、血清試料を１ ００倍に希釈しても顕著であった。しかしながら、この妨害は、血清を２５０倍 以上に希釈したとき完全に消失した。 第１０図は、ヒト血清、血漿、ポリミキシンＢ及びリムルス血漿によるＬＰＳの 投与量依存不活性化を示している。ヒト血清のＥＩＡ５０と血漿のＥＩＡ５０と の間には、差異は見られなかった。リムルス血漿は、ヒト血漿よりもＬＰＳの不 活性化能がかなり高いことが明らかとなった。 これらの結果から、実施例３で説明したＬＡＬ−ＥＬＩＳＡは、血漿のエンドト キシン不活性化効果を試験するのに使用できることが分かる。このアッセイで高 いエンドトキシン中性化効果を有することが見出された血漿は、敗血症患者に投 与して回復を早めることができる。 中村等に開示されている方法により精製Ｃ因子を調製し、エンドトキシンにより Ｃ因子の活性化を検出することができる（６４）、次に、精製Ｃ因子に対するモ ノクローナル抗体を、実施例１に記載の方法により調製できる。このモノクロー ナル抗体は、次に、実施例１又は実施例６に記載の方法で結合して複合体を形成 し、実施例３で記載したＬＡＬ−ＥＬＩＳＡ法に使用できる。 この操作は、エンドトキシンとの反応でＣ因子を活性Ｃ因子に転換して、コアギ ュローゲンではなくＣ因子の抗原生理食塩水の喪失を測定する以外は、実質的に 、実施例３に記載したものに相当する。 又、森田等（２３）に開示されている方法で精＝Ｃ因子を調製し、実施例１又は 実施例６に記載されている方法によりＧ因′子に対するモノクローナル抗体を調 製及び複合化して、（１−３）−β−Ｄ−グルカンによりＣ因子の活性化を検出 することもできる。この複合モノクローナル抗体は、実施例３に記載したＬＡＬ −ＥＬＩＳＡ法に使用できる。 Ｃ因子及びＣ因子に対するモノクローナル抗体を一度調製したら、Ｃ因子、Ｃ因 子及びコアギュローゲンを溶解産物成分（存在を検出する）として用いた３つの 異なる試験に、同じ溶解産物を用いることができる。更に、これらのＫＭは、同 じマイクロタイタブレートで行うことができるので、例えば、敗血症患者におけ る敗血症の原因を決定する操作の迅速化がはかれる。 皇考文藍 （１）レビン・ジェイ（Ｌｅｖｉｎ　Ｊ）　、バング・エフビー（ＢａｎｇＦＢ ）、「リムルスにおける凝固性タンパク質：エンドトキシンによる凝固の局在化 及び速度論（Ｃ１ｏｔｔａｂｌｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　　 ：　ｉｔ、ｓ　１ｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　 ｉｔｓ　ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）　Ｊ、トロンフ ゛　ダイアス　ハモース（Ｔｈｒｏｗｂ、　Ｄｉａｔｈ、　Ｈａｅｍｏｒｒｈ、 ）、１９．１８６〜１９７（１９６８）（２）レビン・ジェイ（Ｌｅｖｉｎ　Ｊ ）　、バング・エフビー（ＢａｎｇＦＢ）、ｒリムルス中の細胞性コアギュロー ゲンについての報告（Ａ　ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　 ｃｏａｇｕｌｏｇｅｎ　ｉｎ　Ｌｉｍｕｌｕｓ）　Ｊ、プル　ジョンズ　ホブキ ンス　ホス（Ｂｕｌｌ、　Ｊｏｈｎｓ、　ＨｏｐｋｉｎｓＨｏｓｐ、）、１１５ ．３３７〜３４５（１９６４）（３）バング・エフビー（Ｂａｎｇ　ＦＢ）　、 「リムルスボリフェムスの細菌病（Ａ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ　 ｏｆ　Ｌｉｍｕｉｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅｗｉｕｓ）　Ｊ、プル　ジョンズ　ホブ キンス　ホス（Ｂｕｌｌ、　Ｊｏｈｎｓ、　ＨｏｐｋｉｎｓＨｏｓｐ、）、９８ ．３２５〜３５１（１９５８）（４）ジョルゲンセン・ジェイエイチ（Ｊｏｒｇ ｅｎｓｅｎ　ＪＨ）、スミス・アールエフ（Ｓ■ｉｔｈ　ＲＦ）　、ｒリムルス アッセイによる結合及び遊離エンドトキシン（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　 ｂｏｕｎｄ　ａｎｄ　ｆｒｅｅｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｂｙ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　ａ ｓｓａｙ）　Ｊ　、ブロク　ツク　エクスビバイオル　メゾ（Ｐｒｏｃ、　Ｓｏ ｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、）、１４６．１０２４〜１０３１　（１ ９７４） （５）フレイシュマン・ジェイ（Ｆｌｅｉｓｈｍａｎ　Ｊ）　、フォルクスエフ （Ｆｏｗｌｋｅｓ　Ｆ）、ｒ　ＬＡＬ試験により測定される種々のグラム陰性菌 由来の細菌性エンドトキシンの抗原性の比較（Ａ　ｃｏ＋ｍｐａｒｉｓｏｎ　　 ｏｆ　　ｐｙｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　　ｏｆ　　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　　ｅｎｄ ｏｔｏｘｉｎｓ　　ｆｒｏｍ　　ａｖａｒｉｅｔｙ　　ｏｆ　　ＧｒａＩＩｄ− ｎｅｇａｔｉｖｅ　　ｂａｃｔｅｒｉａ　　ａｓ　　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　　 ｂｙ　　ｔｈｅ　ＬＡＬ　ｔｅｓｔ）　Ｊ　、プログ　クリニク　パイオル　リ サーチ（Ｐｒｏｇ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｓ、）、９３．１３１〜１ ４０（１９８２）（６）ウニアリ−・エムイー（Ｗｅａｒｙ　ＭＥ）、トノヒユ ー・ジー（Ｄｏｎｏｈｕｅ　Ｇ）　、ピアソン・エフシー（Ｐｅａｒｓｏｎ　Ｆ Ｃ）、スト−ニー・チー（Ｓｔｏｎｙ　Ｋ）、「リムルス変形細胞溶解産物及び 米国薬局方ウサギパイロジエン試験により測定される４個の対照エンドトキシン 標準の相対的効力（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｐｏｔｅｎｃｉｅｓ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　 ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　５ｔａｎｄａｒｄｓ　ａｓ　ａｎｅ ａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　ａａ＋ｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙ ｓａｔｅ　ａｎｄ　ＵＳＰ　ｒａｂｂｉｔ　ｐｙｒｏｇｅｎ　ｔｅｓｔｓ）　Ｊ 、アプル　エンバイロン　マイクロパイオル（Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ。 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）、４０．１１４８〜１１５１　（１９８０）（７）米国食 品・医薬品温（Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ａｄｓｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ） 、「ヒト及び動物非経口薬剤、生化学品及び医療用具の最終製品エンドトキシン 試験としてリムルス変形細胞溶解産物試験を適用するための指針案（Ｄｒａｆｔ 　ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ　ｆｏｒ　ｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｉａ＋ ｕｌｕｓ　ａｏ＋ｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙｓａｔｅ　ｔｅｓｔ　ａｓ　ａｎ　ｅ ｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　 ａｎｄ　ａｎｉｍａｌ　ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ　ｄｒｕｇｓｓｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　ａｎｄ　＋＊ｅｄｉｅａｌ　ｄｅｖｆｃｅｓ）　Ｊ 　、ファーマコピアル　フォーラム（Ｐｈａｒｙ＋ａｃｏｐｅｉａｌ　Ｆｏｒｕ ｍ）　、９．３０１２〜（８）ソルム・エヌオー（Ｓｏｌｕｍ　Ｎｏ）、「リム ルスボリフェムス　血球細胞の凝固９分子の凝固形態と非凝固形態との比較（Ｔ ｈｅ　ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉ＋ｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅｗｉ ｕｓ　ｈｅｍｏｃｙｔｅｓ、　Ａ　ｃ。 ＋ｍｐａｒｉｓｏｎ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　ｃＩｏｔｔｅｄ　　ａｎｄ　ｎｏｎ　 ｃｌｏｔｔｅｄ　　ｆｏｒｍｓ　ｏｆ　　ｔｈｅ　ｔｍｏｌｅｃｕｌｅ、）　　 Ｊ、トロンフ゛　リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、）、２．５５〜７０（１ ９７３） （９）リウ・テーワイ（Ｌｉｕ　ＴＹ）、セイド・アールシー・ジュニア（Ｓｅ ｉｄ　ＲＣＪｒ）、夕・イ・ジェイヮイ（Ｔａｉ　ＪＹ）、リアング・ニスエム （Ｌｉａｎｇ　ＳＭ）、サクマー・チーピー（Ｓａｋｓ＋ａｒ　ＴＰ）　、ロビ ング・ジェイビ−（Ｒｏｂｂｉｎｓ　ＪＢ）、「リムルス溶解産物凝固系の研究 （Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　Ｌｉｗ＋ｕｌｕｓ　１ｙｓａｔｅ　ｃｏａｇｕｌａｔ ｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）」、バイオメディカル　アプリケーションズ　オブ　ザ 　ホースショー　クラブ（リムリダエ）（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃ ａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ　Ｃｒａｂ（Ｌｉｍｕｌｉｄ ａｅ）、イー・ニーエンＣＢ。 Ｃｏｈｅｎ）　編集、ニューヨークのアラン・アール・リス社（ＡｌａｎＲ，Ｌ ｉ５ｓ）、１４７〜１５８（１９７９）（１０）ホルメ・アール（Ｂｏｌｍｅ　 Ｒ）　、ソルム・エヌオー（ＳｏｌｕｓＮＯ）、「リムルスボリフェムス血球細 胞抽出物の凝固により生成したゲルタンパク賞の電子鏡検法（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ 　５ｉｃｒｏｓｃｏｐｙｏｆ　　ｔｈｅ　　ｇｅｌ　　ｐｒｏｔｅｉｎ　　ｆｏ ｒｉ＋ｅｄ　　ｂｙ　　ｃｌｏｔｔｉｎｇ　　ｏｆ　　Ｌｉｗ＋ｕｌｕｓ　　ｐ ｏｌ■ ｐｂｅｍｕｓ　ｈｅｍｏｃｙｔｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ）　Ｊ　、ジエイ　ウルト ラストラフチャー　リサーチ（Ｊ、　Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｒｅｓ、 ）、４４．３２９〜３３（１１）タイ・ジェーワイ（Ｔａｉ　ＪＹ）、セイド・ アールシー（Ｓｅｉｄ　ＲＣ）　、フーン・アールデー（Ｈｕｈｎ　ＲＤ）　、 ルイ・テーワイ（Ｌｕｉ　ＴＹ）、「リムルス変形細胞溶解産物の研究（Ｓｔｕ ｄｉｅｓ　ｏｎ　Ｌｕｓ＊ｕｌｕｓ　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙｓａｔｅ）、 　Ｉｌ、コアギュローゲンの精製及び凝固の機構（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　 ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏａｇｕｌｏｇｅｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　 ｏｆ　ｃｌｏｔｔｉｎｇ）」、ジェイ　パイオル　ケム（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｓ、）、２５２．４７７３〜４７７６Ｃ１９７７）（１２）ナカムラ・ニス （Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｓ）、タカギ・チー（ＴａｋａｇｉＴ）、イワナガ・ニス （Ｉｗａｎａｇａ　Ｓ）　、ニワ・エム（Ｎｉｗａ　Ｍ）、タカハシ・チー（Ｔ ａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ）、「ゲル生成中のカブトガニコアギエローゲンから調製 した断片についてのアミノ酸配列研究：霊長類フィブリノペプチドとの相同性（ Ａ＋＋＋ｉｎｏ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　　５ｔｕｄｉｅｓ　　ｏｎ　　 ｔｈｅ　　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　　ｆｒｏｍ　　ｈｏｒｓ ｅｓｈｏｅｃｒａｂ　ｃｏａｇｕｌｏｇｅｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｇｅｌ　ｆｏｒｍ ａｔｉｏｎ　：　ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ　ｗｉｔｈｐｒｉｍａｔｅ　ｆｉｂｒｉ ｎｏｐｅｐｔｉｄｅ）　」、ビー　バイオケム　アンドバイオヒイズ　リサーチ 　コムン（Ｂ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　 Ｃｏｍｍｕｎ、）　、７２．９０２〜９０８（１９７６ａ）（１３）ナカムラ・ ニス（Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｓ）、タカギ・チー（ＴａｋａｇｉＴ）、イワナガ・ ニス（Ｉｗａｎａｇａ　Ｓ）　、ニワ・エム（Ｎｉｗａ　Ｍ）、タカハシ・チー （Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ）、「カブトガニの血球細胞由来の凝固性タンパク賞 （コアギュローゲン）、ゲル生成中のポリペプチド鎖の構造的変化（Ａ　ｃｌｏ ｔｔａｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ｃｏａｇｕｌｏｇｅｎ）ｆｒｏｍ　　ｈｏｒｓ ｅｓｈｏｅ　　ｃｒａｂ　　ｈｅｍｏｃｙｔｅｓ、　　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　 　ｃｈａｎｇｅ　　ｏｆｉｔｓ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｃｈａｉｎ　ｄｕｒ ｉｎｇ　ｇｅｌ　ｆｏｒａ＋ａｔｉｏｎ、）　Ｊ　、ジエイバイオケム（Ｊ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ）、８０．６４９〜６５２（１９７６ｂ）（１４）ガフイン・ニス エル（Ｇａｆｆｉｎ　ＳＬ）、「エンドトキシンにより誘発されたリムルスの溶 菌白血球の凝固、■、凝固生成タンパク賞の調製及び特性決定（Ｔｈｅ　ｃｌｏ ｔｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　１ｙｓｅｄ　ｗｈｉｔｅ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　Ｌｉ ｍｕｌｕｓ　１ｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ、　Ｐｒｅｐａｒａｔ ｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｔ　ｆｏｒ ｍｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ、）　ｊ。 バイオロロジ（Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｉ）　、１３．２７３〜２８０（１９７６ ）（１５）シシクラ・エフ（Ｓｈｉｓｈｉｋｕｒａ　Ｆ）、ナカムラ・ニス（Ｎ ａｋａｍｕｒａ　Ｓ）、タカハシ・チー（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ）　、セキグ チ・け−（Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ　Ｘ）、「フィブリノペプチド様ペプチドのアミ ノ酸配列に基づくカブトガニの系統学（Ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ　ｃｒａｂ　ｐｈｙ ｌｏｇｅｎｙ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　 ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｉｂｒｏｎｏｐｅｐｔｉｄｅｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ）　Ｊ 　、シー　ジエイ　エクスブ　ズール（Ｃ，Ｊ。 Ｅｘｐ、　Ｚｏｏｌ、）、２２３．８９〜９１（１９８２）（１６）タイ・ジェ イワイ（Ｔａｉ　ＪＹ）、リウ・テーワイ（Ｌｉｕ　ＴＹ）、「リムルス変形細 胞溶解産物についての研究。■、前駆凝固酵素の単離（Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　 Ｌｉｍｕｌｕｓ　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙｓａｔｅ、　１．Ｉｓ。 １ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｃｌｏｔｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ）　Ｊ　、ジエイ 　パイオル　ケム（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋＋＋、）、２５２．２１７８〜 ２１８１（１９７７）（１７）オオキ・エム（Ｏｈｋｉ　Ｍ）、ナカムラ・チー （Ｎａｋａ＋ｅｕｒａ　Ｔ）、モリタ・チー（Ｍｏｒｉｔａ　Ｔ）、イワナガ・ ニス（Ｉｗａｎａｇａ　Ｓ）、「カブトガニ（リムリダエ）の血リンパ凝固系に 関連した新規なエンドトキシン感受性因子（Ａ　ｎｅｗ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ− ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｆａｃｔｏｒ　　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　　ｗｉｔｈ　　ｈ ｅｍｏｌｙ＋ｍｐｈ　　ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　　ｓｙｓｔｅｍ　　。 ｆ　ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ　ｃｒａｂ（Ｌｉ＋ａｕｌｉｄａｅ）　Ｊ　、フエプス 　レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１２０．２１７〜２２０（１９８０ ）（１８）ナカムラ・ニス（Ｎａｋａｏ＋ｕｒａ　Ｓ）、レビン・ジエイ（Ｌｅ ｖｉｎＪ）、「リムルス変形細胞溶解産物の分画、エンドトキシン介在活性化剤 による前駆凝固酵素の活性化の特性決定、（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ　ｏｆ 　Ｌｉ５ｕｌｕｓ　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙｓａｔｅ、　Ｃｈａｒａｃｔｅ ｒｉｚａｔｔｏｎ　ｏｆ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｌｏ ｔｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　ｂｙ　ａｎ　ｅｎｄ。 ｔｏｘｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ、）、バイオケム　バイオ フイズアクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、八ｃｔａ、）　、７０７． ２１７〜２２５（１９８２ａ） （１９）ナカムラ・ニス（Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｓ）、レビン・ジエイ（Ｌｅｖｉ ｎＪ）、「エンドトキシン介在リムルス前駆凝固酵素活性化剤及び今まで記載さ れたことのないプロテアーゼ（プロテアーゼＮ）の検出（Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ− ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐｒｏｃｌｏｔｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　 　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　　ａｎｄ　　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｐｒｅｖ ｉｏｕｓｌｙ　　ｕｎｄｅｓｃｒｉｂｅｄ　　ｐｒｏｔｅａｓｅ　（ｐｒｏｔｅ ａｓｅ　Ｎ）、バイオケム　バイオフイズ　リサーチ　コムン（Ｂｉｏｃｂｅｍ 、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、）、１０８．１６１９〜１６ ２３　（１９８２ｂ） （２０）リアング・ニスエム（Ｌｉａｎｇ　ＳＭ）、サクマー・チーピー（Ｓａ ｋｍａｒ　ＴＰ）　ｓ　リウ・テーワイ（Ｌｉｕ　ＴＹ）、「リムルス変形細胞 溶解産物の研究、■、リムルス変形細胞膜由来エンドトキシン結合タンパク質の 精製（Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　Ｌｉ５ｕｌｕｓ　ａＩＩｌｏｅｂｏｃｙｔｅｌｙ ｓａｔｅ、　　Ｉ［［、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ｅｎｄｏｔｏ ｘｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒ。 ｔｅｉｎ　　ｆｒｏｍ　　Ｌｉｍｕｌｕｓ　　ａｓｏｅｂｏｃｙｔｅ　　ｍｅｍ ｂｒａｎｅｓ）　　Ｊ　　、、　　ジエイ　　ノくイオル　ケム（Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｗ、）、２５５．５５８６〜５５９０（１９８０）（２１）タナ力 ・ニス（Ｔａｎａｋａ　Ｓ）、ナカムラ・チー（Ｎａｋａ＋＊ｕｒａＴ）、モリ タ・チー（Ｍｏｒｉｔａ　Ｔ）、イワナガ・ニス（Ｉｗａｎａｇａ　Ｓ）、「リ ムルス抗ＬＰＳ因子：リムルス凝固系のエンドトキシン介在活性化を妨害する抗 凝固剤（Ｌｉ５ｕｌｕｓ　ａｎｔｉ−ＬＰＳ　ｆａｃｔｏｒ　：　ａｎａｎｔｉ ｃｏａｇｕｌａｎｔ　ｗｈｉｃｈ　１ｎｈｉｂｉｔｓ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｔｏｘ ｉｎ−ｗ＋ｅｄｉａｔｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｔｈｅ　Ｌｕｍｕｌｕｓ　 ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　５ｙｓｔｅａ＋）　Ｊ　％バイオケム　バイオフィズ 　リサーチ　コムン（Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ ｍｍｕｎ、）、１０５．７１７〜７２３（１９８２）（２２）カキムラ・ニー（ Ｋａｋｉｍｕｒａ　Ａ）、アサノ・チー（Ａｓａｎｏ　Ｔ）、トーア・エイチ（ Ｔｏｒｈ　Ｈ）、スギノ・ワイ（Ｓｕｇｉｎｏ　Ｙ）、「抗腫瘍（１−３）−β −Ｄ−グルカンによるリムルス変形細胞溶解産物のゲル化（Ｇｅｌａｔｉｏｎ　 ｏｆ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙｓａｔｅ　ｂｙ　ａｎ　ａ ｎｔｉｔｕｍｏｒ　（１−３）−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎ）　Ｊ　、バイオケム　 リサーチコムン（Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、　　Ｒｅｓ、　Ｃｏａ＋ｗｕｎ、）、１０ １．４３４〜４３９（１９８１）（２３）モリタ・チー（Ｍｏｒｉｔａ　Ｔ）、 タナ力・ニス（Ｔａｎａｋａ　Ｓ）、ナカムラ・チー（Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｔ） 、イワナガ・ニス（Ｉｗａｎａｇａ　Ｓ）、「リムルス変形細胞中に見出される 新規な（１−３）−β−Ｄ−グルカン介在凝固経路（Ａ　ｎｅｗ　（１−３）− β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎ　ｓ＋ｅｄｉａｔｅｄ　ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｐａｔ ｈｗａｙ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　ａａ＋ｏｅｂｏｃｙｔｅｓ）Ｊ 　、フエプス　レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１２９．３１８〜３２ １（１９８１）（２４）アルバウフ・ピーアール（Ａｌｂａｕｇｂ　ＢＲ）、チ ャンドラ−・シービー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ　ＣＢ）、「マルチスキャン・マイク ロプレート・リーダーを用いたリムルス変形細胞溶解産物（ＬＡＬ）のための自 動化方法論（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　 Ｌｉｓ＋ｕｌｕｓ　　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　　１ｙｓａｔｅ　　（ＬＡＬ）ａ ｓｓａｙ　　ｕｓｉｎｇ　　ｔｈｅ　　ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　　ｍ１ｃｒｏｐｌ ａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ）　Ｊ　、ワトソン・ニス（Ｗａｔｓｏｎ　Ｓ）、レビン ・ジェイ（Ｌｅｖｉｎ　Ｊ）　、ノボピッスキー・デージエイ（Ｎｏｖｉ　ｔｓ ｋｙＴＪ）　Ｃｄｘ集）、「エンドトキシン及びリムルス溶解産物試験を用いた それらの検出（Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏ ｎ　ｗｉｔｈｔｈｅ　Ｌｕｍｕｌｕｓ　１ｙｓａｔｅ　ｔｅｓｔ）　Ｊ　、ニュ ーヨークのアラン・アール・リス社（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ＋　Ｉｎｃ、）、 １８３〜１９４（１９８２）（２５）コツタ・タイ（Ｆｕｊｉｔａ　Ｙ）、ナカ ハラ・シー（ＮａｋａｈａｒａＣ）、「色素産生基質を用いた新規なエンドトキ シン測定キット、パイロディック、の調製及び用途（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　 ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｄ ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　、　Ｐｙｒ。 ｄｉｃｋ、　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｃｈｒｏＩＩｌｏｇｅｎｉｃ　５ｕｂｓｔｒａｔ ｅ）　Ｊ　、ワトソン０ニス（Ｗａｔｓｏｎ　Ｓ）、レビン・ジェイ（Ｌｅｖｉ ｎ　Ｊ）　、ノボピッスキー・デージエイ（Ｎｏｖｉ　ｔｓｋｙ　ＴＪ）　（ｍ 集）、「エンドトキシン及びリムルス溶解産物試験を用いたそれらの検出（Ｅｎ ｄｏｔｏｘｉｎｓ　ａｎｄｔｈｅｉｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ 　Ｌｕｍｕｌｕｓ　１ｙｓａｔｅ　ｔｅｓｔ）　Ｊ　、ニューヨークのアラン・ アール・リス社（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、）、１７３〜１８２（１ ９８２） （２６）ナンダン・アール（Ｎａｎｄａｎ　Ｒ）、ブラウン・デーアール（Ｂｒ ｏｗｎ　ＤＲ）、「試験管内パイロジエン試験の改善：リムルス変形細胞溶解産 物を用いた静脈液へのエンドトキシン混入をピコグラムで検出（Ａｎ　１Ｆｐｒ ｏｖｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐｙｒｏｇｅｎ　ｔｅｓｔ　：　ｔ。 ｄｅｔｅｃｔ　　ｐｉｃｏｇｒａｍ　　ｏｆ　　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　　ｃｏｎ ｔａｍｉｎａｔｉｏｎ　　ｉｎ　　１ｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｆｌｕｉｄｓ　ｕ ｓｉｎｇ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙｓａｔｅ）　Ｊ　、ジ エイラブ　クリニク　メゾ（Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、）、８９． ９１０〜（２７）ダンツアク・ジェイエー（Ｄｕｎｃｚａｋ　ＪＡ）、コツター ・アール（Ｃｏｔｔｅｒ　Ｒ）、ダストリ・エフアール（Ｄａｓｔｏｒｉ　ＦＲ ）、「比濁法によるエンドトキシンの定量的検出（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　 ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｂｙ　ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔ ｒｙ）　Ｊ　、イー・ニーエン（Ｅ、　Ｃｏｈｅｎ）（編集）、「カブトガニ（ リムリダエ）の生物医学的用途（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ ｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ　Ｃｒａｂ（Ｌｉｍｕｌｉｄａｅ）） 　Ｊ　、ニューヨークのアラン・アール・リス社（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　 Ｉｎｃ、）、４０３〜４１４（１９７９）（２８）ジョルゲンセン・ジェイエイ チＵｏｒｇｅｎｓｅｎ　ＪＨ）、レイチラー・ニーニス（Ｒｅｉｃｈｌｅｒ　Ａ Ｓ）、「リムルス変形細胞溶解産物パイロジエン試験の自動化（Ａｕｔｏｍａｔ ｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｉ＊ｕｌｕｓａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙｓａｔｅ　 ｐｙｒｏｇｅｎ　ｔｅｓｔｉｎｇ）　Ｊ　、ジエイ　サイチクノル（Ｊ、　Ｐａ ｒｅｎｔｅｒ、　Ｓｃｉ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、）、３６．１１〜１６（１９８２ ）（２９）ノウイッキ・デージエイ（Ｎｏｗｉｔｓｋｙ　ＴＪ）　、リサー（Ｒ ｙｔｈｅｒ　ＳＳ）　、ケース・エムジｓ　　（Ｃａｓｅ　ＭＪ）　、ワトソン （Ｗａｔｓ。 ｎ）、「アボットＭＳ−Ｔにおける非経口薬剤の自動化ＬＡＬ試験（Ａｕｔｏｍ ａｔｅｄ　ＬＡＬ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｏｆ　ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ　ｄｒｕｇｓ 　ｉｎ　Ａｂｂｏｔ　ＭＳ−２）　Ｊ、ジェイ　ペアレンター　サイ　チクノル （Ｊ、　Ｐａｒｅｎｔｅｒ、　Ｓｃｉ。 Ｔｅｃｈｎｏｌ、）、３６．１１〜１６（１９８２）（３０）　　ディンター・ ブイビー（Ｄｉｔｔｅｒ　ＶＢ）　、ベラカー・デービー（Ｂｅｃｋｅｒ　ＫＰ ）　、ウルバシｘ　”７り・アール（ＵｒｂａｓｃｈｅｃｋＲ）、ウルバシｓツ ク・ビー（Ｕｒｂａｓｃｈｅｃｋ　　Ｂ）、「マイクロタイタブレートにおける 側光的に登録したＬＡＬ反応動力学の評価についての血液及び他の検体中のエン ドトキシンの検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　　ｉｎ　 ｂｌｏｏｄ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　。 ｆ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ　ｒｅｇｉ ｓｔｅｒｅｄ　ＬＡＬ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｉｎ　５ｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｐｌ ａｔｅｓ）　Ｊ　、プログ　クリニ　パイオルリサーチ（Ｐｒｏｇ、　Ｃｌ１ｎ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｓ、）」、９３．３８５〜３９２（１９８２）（３１）フ ラウチ・ビー（Ｆｒａｕｃｈ　Ｐ）、「変性リムルスエンドトキシン試験のマイ クロ法としてのスライド試験（Ｓｌｉｄｅ　ｔｅｓｔａｓ　　ａ　　ｍｉｃｒｏ −ｍｅｔｈｏｄ　　ｏｆ　　ａ　　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　　Ｌｉ５ｕｌｕｓ　　ｅ ｎｄｏｔｏｘｉｎ　　ｔｅｓｔ）i　　、 ジェイ　ファーム　サイ（Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｓｃｉ、）、６３．８０８〜８ ０９（３２）ゴトー・エイチ（Ｇｏｔｏ　Ｈ）、ワタナベ・エム（Ｗａｔａｎａ ｂｅＭ）、ナカムラ・ニス（Ｎａｋａ＋ｎｕｒａ　Ｓ）、「簡便なリムルス試験 、スライド法についての研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ａ　ｓｉ＋ｍｐｌｅ　Ｌ ｉｍｕｌｕｓ　ｔｅｓｔ、　ａ　５ｌｉｄｅ　ｍｅｔｈｏｄ）」、ジャパン　ジ エイ　エクスブ　メディ（Ｊｐｎ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、）　　、４７． ５２３〜５２４（１９７７）（３３）ゴトー・エイチ（Ｇｏｔｏ　Ｈ）、ナカム ラ・ニス（Ｎａｋａ＋５ｕｒａＳ）、「ゲル化阻害物質除去のための新規な手法 を用いた変更リムルス試験としてのドライ・アップ法（Ｄｒｙ　ｕｐ　ｍｅｔｈ ｏｄ　ａｓａ　ｒｅｖｉｓｅｄ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｔｅｓｔ　ｗｉｔｈ　ａ　ｎ ｅｗ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｇｅｌａｔｉｏｎ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　 ｒｅｍｏｖｉｎｇ）」、ジャパン　ジエイ　エクスプメディ（Ｊｐｎ、　Ｊ、　 Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、）　、４９．１９〜２５　（１９７９）（３４）メルベーア ・デーエル（Ｍｅｌｖａｅｒ　ＫＬ）、タイストロ・デー（Ｆｙｓｔｒｏ　Ｄ） 、「エンドトキシン用リムルス変形細胞溶解産物アッセイの変更マイクロ法（Ｍ ｏｄｉｆｉｅｄ　＋ｍｉｃｒｏ−ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｉｗｕｌｕｓ 　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙｓａｔｅ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｅｎｄｏｔｏｘ ｉｎ）　Ｊ　、、アブル　エンバイロン　マイクロパイオル（Ａｐｐｌ、　Ｅｎ ｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）Ｊ　、４３．４９３〜４９４（１９８２ ）（３５）フラウワーズ・デージエイ（Ｆｌｏｗｅｒｓ　ＤＪ）、「リムルス溶 解産物を用いたエンドトキシンアッセイのためのマイクロ法（Ａ　　ｍ１ｃｒｏ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　　ｆｏｒ　　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　　ａｓｓａｙ　　ｂｙ 　　ｕｓｉｎｇ　　Ｌｉ５ｕｌｕｓ　１ｙｓａｔｅ）」、メディ　ラブ　サイ（ Ｍｅｄ、　Ｌａｂ、　Ｓｃｉ、）、３６．１７１〜１７６　（１９７９） （３６）オフグチ・ニス（Ｏｋｕｇｕｃｈｉ　Ｓ）、「リムルス溶解産物試験用 マイクロ法の改善（Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｉｃｒｏｍｅｔ ｈｏｄ　ｆ。 ｒ　ｔｈｅ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　１ｙｓａｔｅ　ｔｅｓｔ）、マイクロパイオル　 イミノル（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１ｍｏ＋ｕｎｏ１．）　％　２２．１１３〜 １２１（１９８７）（３８）クリーフテン・ジェイジー（Ｋｒｅｅｆｔｅｎｂｅ ｒｇ　ＪＧ）　、０７ゲン・エイチジー（Ｌｏｇｇｅｎ　ＨＧ）　、ファン・ラ ムショースト・シェープイー（Ｖａｎ　Ｒａｍ５ｈｏｒｓｔ　ＪＤ）、ボーベリ ー・イージー（Ｂａｕｖｅｒｙ　ＥＣ）、「リムルス変形細胞溶解産物試験マイ クロ法及び血清及びワクチンの制御における用途（Ｔｈｅ　Ｌｉｇｍｕｌｕｓ　 ａ＠ｏｅｂｏｃｙｔｅ　Ｘｙｓａｔｅ　ｔｅｓｔ　＋ａｉｃｒｏｍｅｔｈｏｄ　 ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　５ｅｒ ａ　ａｙ＋ｄ　ｖａｃｃｉｎｅｓ）　」、タブ　パイオル　スタンダード（Ｄｅ ｖ、　Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄａｒｄ）　ｓ　３４．１５〜２０（１９７７）（ ３９）ガーディ’ニー（Ｇａｒｄｔ　Ａ）　、デーバガス・ジ−アール（Ａｒｐ ａｇａｕｓ　ＧＲ）、「リムルス変形細胞溶解産物試験によるエンドトキシンア ッセイの改善されたマイクロ法（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍ１ｃｒｏｔｅｃｈｎｉｑ ｕｅ　ｆｏｒ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｌｉｍｕｌ ｕｓ　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙｓａｔｅ　ｔｅｓｔ）Ｊ　、アナル　バイオ ケム（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、）、１０９．３８２〜３８５（１９８０） （４０）プライヤー・アールビー（Ｐｒｉｏｒ　ＲＢ）、スバグナ・ブイエイ（ Ｓｐａｇｎａ　ＶＡ）、「エンドトキシンのリムルス溶解産物アッセイへのミク ロ希釈操作の通用（Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｗ＋１ｃｒｏｄｉｌｕｔ ｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　１ｙｓａｔｅ　 ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）　Ｊ　、ジェイ　クリソ　マイクロ パイオル（Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉ。 １、）　、１０．３９４〜３９５（１９７９）（４１）ハリス・エヌエス（）ｌ ａｒｒｉｓ　ＮＳ）　、フェインスタイン・アール（Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ　Ｒ） 、「エンドトキシンのＬＡＬビーズアッセイ（Ｔｈｅ　ＬＡＬ−ｂｅａｄ　ａｓ ｓａｙ　ｆｏｒ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）」、イー・ニーエン（Ｅ、　Ｃｏｈｅｎ ）（ｋｌａ集）、「カブトガニ（リムリダエ）の生物医学的用途（Ｂｉｏｍｅｄ ｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ　Ｃ ｒａｂ（Ｌｉ輸ｕｌｉｄａｅ））　Ｊ　、ニューヨークのアラン・アール・リス 社（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、）、２６５〜２７４（１９７９）（４ ２）マンフォード・アールニス（Ｍｕｎｆｏｒｄ　ＲＳ）、「エンドトキシン活 性の定量的リムルス溶解産物アッセイ：放射性ヨウ素標識コアギュローゲンモノ マ−（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　１ｙｓａｔｅ　ａｓｓａｙ 　ｆｏｒ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　：　ａｇｇｒｅｇａｔｉｏ ｎ　ｏｆ　ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅｄ　ｃｏａｇｕｌｏｇｅｎ　ｏ＋ｏｎｏ ｍｅｒｓ）　Ｊ　、アナル　バイオケム（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、９ １．５０９〜５１５（１９７Ｂ）　（（４３）ベーク・エル（Ｂａｅｋ　Ｌ）、 ’エンドトキシン及びリムルス変形細胞溶解産物との間の反応を測定するための 新規な感度のよいロケット免疫電気泳動アッセイ（Ｎｅｗ、　５ｅｎｓｉｔｉｖ ｅ　ｒ。 ｃｋｅｔ　ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ 　ｍｅａｓｕｒｅａ＋ｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅ ｎ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ａｎｄ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ ｙｓａｔｅ）　Ｊ　％ジェイ　クリソ　マイクロパイオル（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　、１７．１０１３〜１０２０（１９８３）（４４）ニ リン・アールシエイ（Ｅｌｉｎ　ＲＪ）　、ウオルフ・ニスエム（Ｗｏｌｆｆ　 ＳＭ）、「リムルス変形細胞溶解産物試験の非特異性：ポリヌクレオチド及びタ ンパク質を用いた陽性反応（Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌ ｉｗ＋ｕｌｕｓ　ａｎ＋ｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙｓａｔｅ　ｔｅｓｔ　　：　ｐ ｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）　Ｊ　％ジェイ　インフェクト　ディス（Ｎｏ ｎｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　ａ＋ｌ１ｏｅｂｏ ｃｙｔｅ　’１ｙｓａｔｅ　ｔｅｓｔ　：　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅａｃｔｉｏ ｎ　ｗｉｔｈ　ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ ）　　」、ジエイ　インフェクトディス（Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、）　 Ｊ　、１２８．３４９〜３５２（１９７３）（４５）ウイルドフェール・ニー（ Ｗｉｌｄｆｅｕｅｒ　Ａ）　、ヘイマー・ビー（Ｈｅｙａ＋ｅｒ　Ｂ）、シュレ イファー・チーエイチ（Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ　Ｋ）１）、ハファーカンプ・オー Ｃ）ｌａｆｅｒｋａｍｐ　Ｏ）、「エンドトキシンの検出に対するリムルス試験 の特異性についての研究（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　５ｐｅ ｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒｔｈｅ　 ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）　Ｊ　、アブル　マイクロパ イオル（Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）、２８．８６７〜８７Ｈ１９７４ ）（４６）ブルンソン・チーダブリュ（Ｂｒｕｎｓｏｎ　ＭＷ）、ワトソン・デ ーダプリュ（Ｗａｔｓｏｎ　ＤＷ）、「連鎖球菌性発熱エキソトキシンとリムル ス変形細胞溶解産物との反応（Ｌｉｍｕｌｕｓ　ａｏ＋ｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙ ｓａｔｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　ｐｙｒ ｏｇｅｎｉｃ　ｅｘｏｔｏｘｉｎ）」、インフェクト　イムノ（Ｉｎｆｅｃｔ、 　Ｉｍｍｕｎ、）、１４．１２５６〜１２５Ｂ　（１９７６） （４７）ミカミ・チー（Ｍｉｋａｍｉ　Ｔ）、ナガセ・チー（Ｎａｇａｓｅ　Ｔ ）、マツモト・チー（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ　Ｔ）　、スズキ・ニス（Ｓｕｚｕｋ ｉ　Ｓ）、スズキ・エム（Ｓｕｚｕｋｉ　Ｍ）、「単純多糖類によるリムルス変 形細胞溶解産物のゲル化（Ｇｅｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　ａｍｏｅ ｂｏｃｙｔｅ　１ｙｓａｔｅ　ｂｙ　ｓｉｍｐｌｅ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉ ｄｅｓ）　」、マイクロパイオルイムツル（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏ ｌ）　、２６．４０３〜４０９（１９８２）（４８）スズキ・エム（Ｓｕｚｕｋ ｉ　Ｍ）、ミカミ・チー（Ｍｉｋａｍｉ　丁）、マツモト・チー（Ｍａｔｓｕ＋ ＊ｏｔｏ　Ｔ）　、スズキ・ニス（Ｓｕｚｕｋｉ　Ｓ）、「合成デキストラン誘 導体によるリムルス溶解産物のゲル化（Ｇｅｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｍｕｌｕ ｓ　１ｙｓａｔｅ　ｂｙ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｄｅｘｔｒａｎ　ｄｅｒｉｖａ ｔｉｖｅｓ）　Ｊ　、マイクロパイオル　イムツル（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｗ ＋ｍｕｎｏ１）　、２１．４１９〜４２５（１９７７）（４９）プラチカ・エム （Ｐｌａｔｉｃａ　Ｍ）　、バーディング・ダブリュ（ｌａｒｄｉｎｇ　Ｗ）　 、ホランダー・ブイビー（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ　ＶＰ）、「リムルス反応におけ るジチオール類シュミレートエンドトキシン（Ｄｉｔｈｉｏｌｓ　　ｓｉｍｕｌ ａｔｅ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｒｅａＣｔｌＯ ｎ）Ｊ　１、Ｘクスベリエンシア（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ）　％　３４．１１ ５４〜１１５５（１９７８） （５０）ファイン・デーエイチ（Ｆｉｎｅ　ＤＯ）　、ケスシー・アールイー（ Ｋｅｓｓｅｌｅｒ　ＲＥ）　％タバク・エルニー（Ｔａｂａｋ　ＬＡ）、ショッ クマン・ジーデー（Ｓｈｏｃｋｍａｎ　ＧＤ）、「リポティコリック酸のリムル ス溶解産物活性（Ｌｉｍｕｌｕｓ　１ｙｓａｔｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　１ ｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ　ａｃｉｄ）」、ジェイ　プント　リサーチ（Ｊ、　Ｄ ｅｎｔ、　Ｒｅｓ、）、５６．１５００　（１９７７） （５１）セイド・アールシー・ジュニア（Ｓｅｉｄ　ＲＣＪｒ）、スミス・ビー エフ（Ｓ＋５ｉｔｈ　ＰＦ）、ゲバラ・ジー（Ｇｕｅｖａｒｒａ　Ｇ）、ホヒシ ュタイン・エイチデー（Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ　ＨＤ）、バリレ・エムエフ（Ｂｒ ｉｌｅ　ＭＦ）、「マイコプラスマールリボ多糖類（リポグリカン）のエンドト キシン禄活性（Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−１ｉｋｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　 ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｌ　ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ｌｉｐｏ ｇｌｙｃａｎｓ）　」、インフェクト　イムノ（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、 ）、２９．９９０〜９９４（１９８０）（５２）ウニインベルブ・ジエービー（ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ　ＪＢ）　、スミス・ビーエフ（Ｓ＋５ｉｔｈ　ＰＦ）、カハ ネ・アイ（Ｋａｈａｎｅ　Ｉ）、「細菌性リポ多糖類及びマイコプラスマールリ ポグリカン：マクロファージ介在腫瘍細胞殺傷とリムルス変形細胞溶解産物凝固 との間の比較（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ 　ａｎｄ　ｍｙｃｏｐｌａｓ＋ｓａｌ　ｌｉｐｏｇｌｙｃａｎｓ　：　ａ　ｃｏ ｍｐａｒｉｓｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅｉｒ　ａｂｉｌｉｔｉｅｓ　ｔｏ　 １ｎｄｕｃｅ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌ ｌ　ｋｉｌｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｌｉ＋１ｌｕｌｕｓ　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ ｙｓａｔｅ　ｃｌｏｔｔｉｎｇ）　Ｊ　、バイオケム　バイオフィズ　リサーチ 　コムン（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ１ｌｕｎ、 ）、９７．４９３〜４９９　（１９８０）（５３）スミス・ニスエム（Ｓｗｉｔ ｈ　ＳＭ）、ヒル・ジエーオー（ＨｉｌＩ　ＪＯ）　、シンダー・アイニス（Ｓ ｙｎｄｅｒ　ＩＳ）　、ブレル・アール（Ｂｕｒｒｅｌ　Ｒ）、「マイクロポリ スボーラフニー二の細胞壁分画の分裂促進性（Ｍｉｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ 　ｃｅｌｌ　ｗａｌｌ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏ ｒａ　ｆａｅｎｉ）　Ｊ　、アン　アラ−シイ（Ａｎｎ、　Ａｌｌｅｒｇｙ）、 ４０、１２〜１４（１９７８） （５４）ルイス・ブイジエイ（Ｌｅｗｉｓ　ＶＪ）、サラチャー・エル（Ｔｈａ ｔｃｈｅｒ　Ｌ）、ミッチェル・エスエイチ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ　ＳＨ）、「ク ラミジアエンドトキシン様活性の実証（Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ ｈｌａｍｙｄｉａ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−１ｉｋｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）　」、 ジエイ　ジエン　マイクロパイオル（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）　 、１４４．２１５〜２１６（１９（５５）へエルトン・ニスシー（Ｆｅｌｔｏｎ 　ＳＣ）　、プライヤー・アールビー（Ｐｒｉｏｒ　ＲＢ）、スパグナ・ブイエ イ（Ｓｐａｇｎａ　ＶＡ）　、クレイエル・ジェイビー（Ｋｒｅｉｅｒ　ＪＰ） 　、’リムルス溶解産物アッセイによるエンドトキシンのプラスモジウムバーブ ヘイの評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｂｅｒｇｈ ｅｉ　ｆｏｒ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｂｙｔｈｅ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　１ｙｓａｔ ｅ　ａｓｓａｙ）」、ジェイ　バラシトール（Ｊ。 Ｐａｒａｓｉｔｏｌ）、６６．８４６〜８４７（１９８０）（５６）ウニツクス ラー・エイチ（Ｗｅｘｌｅｒ　）ｌ）％オッペンハイム・ジェイデ−（Ｏｐｐｅ ｎｈｅｉｍ　ＪＤ）、「グラム陽性微生物リステリア菌由来のエンドトキシン様 物質の単離、特性決定及び生物学的性質（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ、　ｃｈａｒａｃ ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅ ｓ　ｏｆ　ａｎ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−１ｉｋｅ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｆｒｏｍ 　　ｔｈｅ　ｇｒａｌｌ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｏｒｇａｎｉｓ＋ａ　Ｌｉ５ｔｅ ｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｓ）　Ｊ　、インフェクト　イムノ（Ｉｎｆｅ ｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、）、２３．８４５〜８５７（１９７９）（５７）　ｘす７ ・７−）Ｌｔジェイ（Ｅｌｉｎ　ＲＪ）、「血液、ＣＳＰ及び滑液を用いたリム ルス試験の臨床的効用（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　ｕｔｉｌｉｔｙｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｉ ａ＋ｕｌｕｓ　ｔｅｓｔ　ｗｉｔｈ　ｂｌｏｏｄ、　ＣＳＦ　ａｎｄ　５ｙｎｏ ｖｉａｌ　ｆｌｕｉｄ）」、イー・ニーエン（Ｅ、　Ｃｏｈｅｎ）　（編集）、 「カブトガニ（リムリダエ）の生物医学的用途（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ａｐｐ ｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅＨｏｒｓｅｓｈｏｅ　Ｃｒａｂ（Ｌｉｍｕｌ ｉｄａｅ））　Ｊ　、ニューヨークのアラン・アール・リス社（Ａｌａｎ　Ｒ， Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、）、２７９〜２９２（１９７９）（５８）タフブス・エイ チ（Ｔｕｂｂｓ　Ｈ）　、ヒト及びマウスマラリア中のエンドトキシン（Ｅｎｄ ｏｔｏｘｉｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　　ａｎｄ　ｍｕｒｉｎｅ　ｌ１ａｌａｒｉａ ）、トランス　アール　ソサ　ドロップ　メゾ　ハイジ（Ｔｒａｎｓ、　Ｒ，Ｓ ｏｃ、　Ｔｒｏｐ、　Ｍｅｄ、　Ｈｙｇ、）　Ｊ　、７４．１２１〜１２３（１ ９８０）（５９）ギヤロウエイ・アールイー（Ｇａｌｌｏｗａｙ　ＲＥ）　、レ ビン・ジェイ（Ｌｅｖｉｎ　Ｊ）　、ブトシー・チー（Ｂｕｔｌｅｒ　Ｔ）、ナ ラ・ジービー（Ｎａｆｆ　ＧＢ）　、ゴールドスミス・ジーエイチ（Ｇｏｌｄｓ ｍｉｔｈ　ＧＨ）、サイトウ・エイチ（Ｓａｉｔｏ　Ｈ）　、アうオフ・ニス（ Ａｗｏｋｅ　Ｓ）　％ウォレス・シーヶ−（Ｗａｌｌａｃｅ　ＣＫ）、「回帰熱 ボレリア感染における内毒血症に関する炎症のタンパク賞媒介物の活性化とその 確証（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｅｄｉａｔｏｒｓ　ｏ ｆ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｅｎｄｏ ｔｏｘｅｗｉａ　ｉｎ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ　１ｎｆｅ ｃｔｉｏｎ）」、アム　ジエイ　メト（Ａ＋ｗ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、）　、６３． ９３３〜９３８（１９７７） （６０）ベーク・エル（Ｂｅｋ　Ｌ）　、ホイビー・エフ（Ｈｏｉｂｙ　Ｎ）、 ヘルツ・ジェービ−（Ｈｅｒｔｚ　ＪＢ）、エスパーセン・エフ（Ｅｓｐｅｒｓ ｅｎ　Ｆ）、「定量的免疫電気泳動法により研究された、リムルス変形細胞溶解 産物と、緑膿菌及び黄色ブドウ球菌由来の溶解性抗原との間の相互作用（Ｉｎｔ ｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　 １ｙｓａｔｅ　ａｎｄ　５ｏｌｕｂｌｅ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｆｒｏ＋ｅ　Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ａｎｄ　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ ｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　５ｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｉｍ ｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、１　、ジエイ　クリソ　マイクロ パイオルＵ、　Ｃｌ１ｎ、　？１ｉｃｒｏｂｉｏ１．）　、２２．２２９〜２３ ７　（１９８５）（６１）ジョルゲンセン・ジェーエイチ（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ 　ＪＨ）、リムルス変形細胞溶解産物試験の臨床的用途（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　ａ ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　ａｍｏｅｂｏｃｙｔ ｅ　１ｙｓａｔｅ　ｔｅｓｔ）　Ｊ　、ブロクドア・アールエイ（Ｐｒｏｔｏｃ ｔｏｒ　ＲＡ）（編集）、エンドトキシンハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏ ｆ　Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）　、４　　：エンドトキシンショックの臨床的観点（ Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　ａｓｐｅｃｔ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　５ｈｃｏｋ）　 、アムステルダムのエルセピア・サイエンス・パブリッシャー・ビーブイ（Ｅｌ ｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ　Ｂ、Ｖ、）、１９８６年 （６２）ウイソン・エムビー（Ｗｉｌｓｏｎ　ＭＢ）及びピーチー・ナヵネ（Ｐ Ｋ　Ｎａｋａｎｅ）、「螢光抗体法及び関連手法（ｉｎ　ｌｌ１１＋＊ｕｎｏｆ ｌｕ。 ｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　（ダブ り二〇ナツプ（−０Ｋｎａｐｐ）、エイチ・ホルバー（Ｈ，Ｈｏ１ｕｂａｒ）及 びジー・ウィック（Ｇ、　Ｗｉｃｋ）　Ｗ集〕、エルセピア／北オランダ、アム ステルダム、２１５〜２２１　（１９７８） （６３）オオバヤシ・チー（Ｏｂａｙａｓｈｉ　Ｔ）等、クリニヵ　ケミヵアク タ（Ｃ１ｉｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ）、１４９．５５〜６５（１９ ８５）（６４）ナラムラ・チー（Ｎａｋａ＋ａｕｒａ　Ｔ）、モリタ・チー（Ｍ ｏｒｉｔａＴ）及びイワナガ・ニス（Ｉｗａｎａｇａ　Ｓ）、「リムルス血球細 胞中に見出されるリポ多糖感受性セリンプロテアーゼチモーゲン（Ｃ因子）、単 離と特性決定（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｓ ｅｒｉｎｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｚｙｍｏｇｅｎ（Ｆａｃｔｏｒ　Ｃ）　ｆｏｕ ｎｄ　ｉｎ　Ｌｉｏ＋ｕｌｕｓ　ｈｅｍｏｃｙｔｅｓ、　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　 　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）」、１５４．５１１〜５２１（ １９８６） （本頁以下余白） 第１図 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成１年１１月２０日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １　特許出願の表示 Ｐ　ＣＴ／ＤＫ８８１０　ＯＯ８１ 、発明の名称 試料中のエンドトキシンの存在を確認する方法３　特許出願人 住所　　デンマーク国、デーニー−２２００コペンハーゲンエフ、ハイネスガー デ　１．４．テーベー氏　名　ベータ、ライフ　　（外１名）４代理人 請求の範囲 １、ａ）試料を、カブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパの成分又はその 合成類似体とともにインキユベーションすることにより、エンドトキシン又はエ ンドトキシン様物質が試料中に存在する場合に前記成分が変性されて、前記成分 若しくは類似体又はそれらの免疫決定基に対する抗体、又は実質的に前記成分若 しくは類似体又はそれらの免疫決定基のみに対する抗体との反応が生じないか、 前記成分又は類似体と試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質との反 応の生成物が前記成分若しくは類似体又はそれらの免疫決定基に対する抗体、又 は実質的に前記成分若しくは類似体又はそれらの免疫決定基のみに対する抗体と 反応するようにし、ｂ）工程ａ）から得られる前記試料と前記成分又は類似体と のインキュベーション混合物を、前記成分若しくは類似体又は免疫決定基に対す る抗体又は実質的に前記成分若しくは類似体又はそれらの免疫決定基のみに対す る抗体と反応させることにより試料中に存在する前記成分又は類似体に抗体を結 合させるか、前記反応生成物若しくはその免疫決定基に対する抗体又は実質的に 前記反応生成物若しくはその免疫決定基のみに対する抗体と反応させることによ り試料中に存在する前記反応生成物に抗体を結合させ、そしてＣ）工程ｂ）から 得られる反応混合物中の結合抗体を検出して、抗体が前記成分若しくは類似体又 はそれらの免疫決定基に対する抗体又は実質的に前記成分若しくは類似体又はそ れらの免疫決定基のみに対する抗体である場合には、結合抗体量の減少が検出さ れたときにはエンドトキシン又はエンドトキシン様物質が存在することを示して おり、一方、抗体が前記反応生成物若しくはその免疫決定基対する抗体又は実質 的に前記反応生成物若しくはその免疫決定基のみに対する抗体である場合には、 結合抗体量の増加が検出されたときにはエンドトキシン又はエンドトキシン様物 質が存在することを示していることから、試料中のエンドトキシン又はエンドト キシン様物質の存在を確認する、以上の工程を含むが、但し、工程ａ）における 試料と前記成分又は類似体とのインキュベーション後に存在する前記成分若しく は類似体又は前記反応生成物を固体支持体に結合させるか、前記抗体を固体支持 体又は固体支持体に結合した架橋分子に結合するか、試料中に存在するエンドト キシン又はエンドトキシン様物質を固体支持体に結合することを特徴とするエン ドトキシン又はエンドトキシン様物質の存在を確認する方法。 ２、カブトガニ変形細胞溶解産物又は血リンパの成分が、凝固因子、例えば、Ｂ 因子、Ｃ因子、Ｃ因子、Ｎ因子、前駆凝固酵素、活性化凝固酵素、抗ＬＰＳ因子 又はコアギュローゲン及び凝集素、例えば、リムリン又はポリフェミン等のレク チンから選択されたものである請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記成分又は類似体と試料中の前記エンドトキシン又はエンドトキシン様物 質との反応の生成物が、コアギュリン、Ｃ−ペプチド、活性化凝固酵素、活性化 Ｂ、Ｃ，Ｇ若しくはＮ因子、並びにこれらの因子及び前駆凝固酵素からの開裂生 成物から選択されたものである請求の範囲第１項に記載の方法。 ４、試料が、尿、髄液、血液、血清、血漿、血液から製造される生成物又はリン パ液等の体液、非経口液又は注射液等の製剤、医療用具、マイトジェン、栄養培 地及び緩衝液等の生化学薬品、食品、飲料水並びに製薬工業で使用する水から選 択されたものである請求の範囲第１項に記載の方法。 ５、エンドトキシン又はエンドトキシン様物質が、エンドトキシン、又はグラム 陰性菌、グラム陰性菌、カビ、酵母及び藻類等の微生物由来の表面抗原から選択 されたものである請求の範囲第１項に記載の方法。 ６、抗体が、単一特異性抗体である請求の範囲第１項に記載の方法。 ７、抗体が、ポリクローナル抗体である請求の範囲第１項に記載の方法。 ８、抗体が、モノクローナル抗体であるか、２種以上のモノクローナル抗体から なる混合物である請求の範囲第１項に記載の方法。 ９、抗体が標識を有している請求の範囲第１項に記載の方法。 １０、標識が、酵素、螢光物質、化学発光物質、発色団、放射性同位体及び錯生 成剤から選択されたものである請求の範囲第９項に記載の方法。 １１、酵素が、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウ レアーゼ、グルコース、グルコースオキシダーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリ ンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素・クルコ ース−６−ｐ−ホスフェート脱水素酵素及びリボヌクレアーゼから選択されたも のである請求の範囲第１０項に記載の方法。 １２、酵素を標識として使用し、酵素の基質を請求の範囲第１項の工程ｂ）で得 られる反応混合物に添加して、着色、螢光又は化学発光生成物を生じさせるか、 色の変化を生じさせるか、色、螢光又は化学発光の強度の変化を生じさせる請求 の範囲第１０項に記載の方法。 １３、螢光物質が、４−メチルウンベリフェリル−ホスフェート、４−メチルウ ンベリフェリル−Ｄ−ガラクトピラノシド及び３−（ｐ−ヒドロキシフェニル） プロピオン酸から選択されたものである請求の範囲第１０項に記載の方法。 １４、化学発光物質は、イソルミノール／ＥＤＴＡ／ＨｔＯｔ−ペルオキシダー ゼ／エオシン／ＥＤＴＡ及びルシフェラーゼ並びにそれらの基質から選択された ものである請求の範囲第１０項に記載の方法。 １５、発色団は、５−アミノサリチル酸、２，２”−アジノージ−（３−エチル ベンズチアゾリン−６−スルホン酸、０−フェニレンジアミン、０−ジアミンイ シジン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン、３−（ジメチルアミノ ）安息香酸、０−）ルイジン、３．３”、５，５“　−テトラメチルベンジジン 、０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド及びｐ−ニトロフェニルホスフェ ートから選択されたものである請求の範囲第１０項に記載の方法。 １６、放射性同位体は、ｌ　！ｓ工、３Ｈ，３Ｓｐ　、　”ｔ＆ヒ”Ｃカら選択 されたものである請求の範囲第１０項に記載の方法。 １７、錯生成剤は、ビオチン、プロティンＡ及びレクチンから選択されたもので ある請求の範囲第１０項に記載の方法。 １８、抗体を、固体支持体又は固体支持体に結合した架橋分子に結合させるとと もに、請求の範囲第１項の方法の工程ａ）における成分又は類似体と試料とのイ ンキュベーション後に残存している前記成分は、抗体に結合させ更なる量の抗体 と反応させる請求の範囲第１項に記載の方法。 １９、固体支持体がポリマーを包含する請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２０、固体支持体が、ポリマーを被覆したマトリックスを包含する請求の範囲第 １９項の方法。 ２１、ポリマーが、プラスチック、ニトロセルロース紙、臭化シアン活性化紙、 １−（３−ニトロベンジルオキシメチル）ピリジウムクロリド紙、ジアゾベンジ ルオキシメチル紙、ニトロベンジルオキシメチル紙又はアミノベンジルオキシメ チル紙等のセルロース、シリコーンポリマー及びシリカ又はシリケートから選択 されたものである請求の範囲第１９項又は第２０項に記載の方法。 ２２、プラスチックがラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタ ン、ポリアクリルアミド、ポリ酢酸ビニル及びそれらの適当な共重合体から選択 されたものである請求の範囲第２１項に記載の方法。 ２３、固体支持体が、板状、ストリップ、フィルム、プロティンＡ被覆バクテリ ア等の固体粒子、又は紙の形態である請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２４、ａ）コアギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコア ギュローゲン又はその免疫決定基のみに対する抗体、又はコアギュリン若しくは Ｃ−ペプチド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン若しく はＣ−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗体を、固体支持体又は固体支 持体に結合した架橋分子に結合させ、ｂ）試料をコアギュローゲン含有物質とと もにインキュベーションして、試料中にエンドトキシン又はエンドトキシン様物 質が存在する場合にはコアギュローゲンが開裂されてコアギュリン及びＣ−ペプ チドとなるようにし、Ｃ）工程ｂ）から得られるインキュベーション混合物を固 体支持体に添加して、固体支持体に結合した抗体がコアギエローゲン又はその免 疫決定基に対する抗体か、実質的にコアは、試料中に存在するコアギュローゲン を結合するようにし、固体支持体に結合した抗体がコアギュリン若しくはＣ−ペ プチド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン若しくはＣ− ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、コアギユツンスはＣ −ペプチドを結合すようにし、 ｄ）固体支持体に、コアギュローゲン又はその免疫決定基に対する標識抗体か、 実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみに対する標識抗体を添加して 固体支持体上に存在する結合コアギュローゲンに結合すようにするか、又はコア ギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコ アギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗体を添加し て固体支持体上に存在する結合コアギュローゲン、結合コアギュリン又は結合Ｃ −ペプチドに結合するようにし、そしてｅ）工程ｄ）の固体支持体に結合した標 識抗体を検出して、抗体がコアギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体か 、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、 結合抗体量の減少が検出されたときにはエンドトキシン又はエンドトキシン様物 質が存在することを示しており、一方、抗体がコアギュリン若しくはＣ−ペプチ ド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン若しくはＣ−ペプ チド又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、結合抗体量の増加が検出 されたときにはエンドトキシン又はエンドトキシン様物質が存在することを示し ていることから、試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質の存在を確 認することを含む請求の範囲第１項に記載の方法。 ２５、ａ）試料をコアギュローゲン含有物質とともにインキュベーションして、 試料中にエンドトキシン又はエンドトキシン様物質が存在する場合にはコアギュ ローゲンが開裂されてコアギュリン及びＣ−ペプチドとなるようにし、ｂ）工程 ａ）のインキュベーション混合物を固体支持体に添加して、混合物中に存在する コアギュローゲンを結合するか、混合物中に存在するコアギュリン又はＣペプチ ドを結合するようにし、 Ｃ）固体支持体に、コアギュローゲン又はその免疫決定基に対する標識抗体か、 実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみに対する標識抗体を添加して 固体支持体に結合したコアギュローゲンに結合すようにするか、又はコアギュリ ン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュ リン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗体を添加して固体 支持体上に結合したコアギュリン又はＣ−ペプチドに結合するようにし、ｄ）工 程Ｃ）の固体支持体に結合した標識抗体を検出して、抗体がコアギュローゲン又 はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギエローゲン又はその免疫決定 基のみに対する抗体の場合には、結合抗体量の減少が検出されたときにはエンド トキシン又はエンドトキシン様物質が存在することを示しており、一方、抗体が コアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的 にコアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗体の場 合には、結合抗体量の増加が検出されたときにはエンドトキシン又はエンドトキ シン様物質が存在することを示していることから、試料中のエンドトキシン又は エンドトキシン様物質の存在を確認することを含む請求の範囲第１項に記載の方 法。 ２６、ａ）コアギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコア ギュローゲン又はその免疫決定基のみに対する抗体、又はコアギエリン若しくは Ｃ−ペプチド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン若しく はＣ−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗体を、固体粒子に結合させ、 ｂ）試料をコアギュローゲン含有物質とともにインキュベーションして、試料中 にエンドトキシン又はエンドトキシン様物質が存在する場合にはコアギュローゲ ンが開裂されてコアギュリン及びＣ−ペプチドとなるようにし、Ｃ）工程ｂ）か ら得られるインキュベーション混合物を工程ａ）の抗体に添加して、抗体がコア ギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギエローゲン又 はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、コアギュローゲンの存在下で固 体粒子の凝集を生じさせるようにし、抗体がコアギュリン若しくはＣ−ペプチド 又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギエリン若しくはＣ−ペプチ ド又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、コアギュリン又はＣ−ペプ チドの存在下で固体粒子の凝集を生じさせるようにし、そして ｄ）コアギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュロ ーゲン又はその免疫決定基のみに対する抗体が結合している固体粒子が凝集しな いことにより、又はコアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基に対 する抗体か、実質的にコアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基の みに対する抗体が結合している固体粒子が凝集することにより試料中のエンドト キシン又はエンドトキシン様物質の存在を確認することを含む請求の範囲第１項 に記載の方法。 ２７、カブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパの成分、その合成類似体又 はその免疫決定基に対するか、実質的にカブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血 リンパの成分、その合成類似体又はその免疫決定基のみに対するモノクローナル 抗体、又はカブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパの成分又はその合成類 似体とエンドトキシン又はエンドトキシン様物質との反応の生成物に対するか、 実質的に前記反応生成物にのみ対するか、前記反応生成物の免疫決定基に対する モノクローナル抗体であって、前記抗体が標識を有することを特徴とするモノク ローナル抗体。 放射性同位体及び錯生成剤から選択されたものである請求の範囲第２７項に記載 のモノクローナル抗体。 ２９、酵素が、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウ レアーゼ、グルコース、グルコースオキシダーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリ ンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素、グルコ ース−６−ホスフェート脱水素酵素及びリボヌクレアーゼから選択されたもので ある請求の範囲第２８項に記載のモノクローナル抗体。 ３０、酵素を標識として使用し、酵素の基質を請求の範囲第１項の工程ｂ）で得 られる反応混合物に添加して、着色、螢光又は化学発光生成物を生じさせるか、 色の変化を生じさせるか、色、螢光又は化学発光の強度の変化を生じさせる請求 の範囲第２８項に記載のモノクローナル抗体。 ３１、螢光物質が、４−メチルウンベリフェリル−ホスフェート、４−メチルウ ンベリフェリル−Ｄ−ガラクトピラノシド及び３−（ｐ−ヒドロキシフェニル） プロピオン酸から選択されたものである請求の範囲第２８項に記載のモノクロー ナル抗体。 ３２、化学発光物質は、イソルミノール／ＥＤＴＡ／Ｈｚ（ｈ、ペルオキシダー ゼ／エオシン／ＥＤＴＡ及びルシフェラーゼ並びにそれらの基質から選択された ものである請求の範囲第２８項に記載のモノクローナル抗体。 ３３、発色団は、５−アミノサリチル酸、２．２”−アジノージ−（３−エチル ベンズチアゾリン−６−スルホン酸、０−〕二ニレンジアミン、０−ジアミンイ シジン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン、３−（ジメチルアミノ ）安息香酸、０−トルイジン、３，３”、５．５”−テトラメチルベンジジン、 ０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド及びｐ　−ニトロフェニルホスフェ ートから選択されたものである請求の範囲第２８項に記載のモノクローナル抗体 。 ３４、　放射性同位体は、１２ＳＩ、　３Ｈ，３Ｓｐ　、　＋３１１及ヒｌ−Ｃ 力ら選択されたものである請求の範囲第２８項に記載のモノクローナル抗体。 ３５、錯生成剤は、ビオチン、プロティンＡ及びレクチンから選択されたもので ある請求の範囲第２８項に記載のモノクローナル抗体。 ３６、カブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパの成分、その合成類似体又 はその免疫決定基に対するか、実質的にカブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血 リンパの成分、その合成類似体又はその免疫決定基のみに対するモノクローナル 抗体、又はカブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパの成分又はその合成類 似体とエンドトキシン又はエンドトキシン様物質との反応の生成物に対するか、 実質的に前記反応生成物にのみ対するか、前記反応生成物の免疫決定基に対する モノクローナル抗体であって、前記抗体が固体支持体又は固体支持体に結合した 架橋分子に結合していることを特徴とするモノクローナル抗体。 ３７、架橋分子が、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、リジン、プロティン Ａ及びヒドラジドから選択されたものである請求の範囲第３６項に記載のモノク ローナル抗体。 ３８、試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質の存在を確認するため の試験キットであって、ａ）カブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパの成 分、その合成類似体又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にカブトガニ変 形細胞溶解産物若しくは血リンパの成分、その合成類似体又はその免疫決定基の みに対する抗体、又は前記成分若しくは類似体とエンドトキシン若しくはエンド トキシン様物質との反応の生成物又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的に 前記成分若しくは類似体とエンドトキシン若しくはエンドトキシン様物質との反 応の生成物又はその免疫決定基のみに対する抗体、及び ｂ）カブトガニ変形細胞若しくは血リンパの成分又はその合成類似体を包含し、 前記成分又は類似体が固体支持体に結合しているか、前記抗体が固体支持体又は 固体支持体に結合した架橋分子に結合していることを特徴とする試験キット。 ３９、カブトガニ変形細胞溶解産物又は血リンパの成分は、凝固因子、例えば、 Ｂ因子、Ｃ因子、Ｃ因子、Ｎ因子、前駆凝固酵素、活性化凝固酵素、抗ＬＰＳ因 子又はコアギエローゲン及び凝集素、例えば、リムリン又はポリフェミン等のレ クチンから選択されたものである請求の範囲第３８項に記載のキット。 ４０、前記成分又は類似体と前記試料中の前記エンドトキシン又はエンドトキシ ン様物質との反応の生成物は、コアギュリン、Ｃ−ペプチド、活性化凝固酵素、 活性化Ｂ、Ｃ，Ｇ若しくはＮ因子、並びにこれらの因子及び前駆凝固酵素からの 開裂生成物から選択されたものである請求の範囲第３８項に記載のキット。 ４１、抗体が単一特異性抗体である請求の範囲第３８項に記載のキット。 ４２、抗体がポリクローナル抗体である請求の範囲第３８項に記載のキット。 ４３、抗体がモノクローナル抗体又は２種以上のモノクローナル抗体の混合物で ある請求の範囲第３８項に記載のキット。 ４４、抗体が標識を有している請求の範囲第３８項に記載のキット。 ４５、標識が、酵素、螢光物質、化学発光物質、発色団、放射性同位体及び錯生 成剤から選択されたものである請求の範囲第４４項に記載のキット。 ４６、酵素が、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウ レアーゼ、グルコース、グルコースオキシダーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリ ンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素、グルコ ース−６−ホスフェート脱水素酵素及びリボヌクレアーゼから選択されたもので ある請求の範囲第４５項に記載のキット。 ４７、標識として酵素を含むとともに、請求の範囲第１項の工程ｂ）で得られる 反応混合物に添加したとき、着色、螢光又は化学発光生成物を生じさせるか、色 の変化を生じさせるか、色、螢光又は化学発光の強度の変化を生じさせる酵素の 基質を特徴とする請求の範囲第４５項に記載のキット。 ４８、螢光物質が、４−メチルウンベリフェリル−ホスフェート、４−メチルウ ンベリフェリル−Ｄ−ガラクトピラノシド及び３−（ｐ−ヒドロキシフェニル） プロピオン酸から選択されたものである請求の範囲第４５項に記載のキット。 ４９、化学発光物質は、イソルミノール／ＥＤＴＡ／ＨｚＯ！、ペルオキシダー ゼ／エオシン／ＥＤＴＡ及びルシフェラーゼ並びにそれらの基質から選択された ものである請求の範囲第４５項に記載のキット。 ５０、発色団は、５−アミノサリチル酸、２，２”−アジノージ−（３−エチル ベンズチアゾリン−６−スルホン酸、０−フェニレンジアミン、０−ジアミンイ シジン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン、３−（ジメチルアミノ ）安息香酸、０−トルイジン、３．３’、５，５°−テトラメチルベンジジン、 ０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド及びｐ　−ニトロフェニルホスフェ ートから選択されたものである請求の範囲第４５項に記載のキット。 ５１、放射性同位体は、＋ｚｓＩ、　３Ｈ，ｘｓｐ　、　＋３１１及びＩ４Ｃか ら選択されたものである請求の範囲第４５項に記載のキット。 ５２、錯生成剤は、ビオチン、プロティンＡ及びレクチンから選択されたもので ある請求の範囲第４５項に記載のキット。 ５３、固体支持体を包含する請求の範囲第３８項に記載のキット。 ５４、固体支持体が、ポリマーを包含する請求の範囲第５３項に記載のキット。 ５５、固体支持体が、ポリマーが結合したマトリックスを包含する請求の範囲第 ５４項に記載キット。 ５６、ポリマーが、プラスチック、ニトロセルロース紙、臭化シアン活性化紙、 １−（３−ニトロベンジルオキシメチル）ビリジウムクロリド紙、ジアゾベンジ ルオキシメチル紙、ニトロベンジルオキシメチル紙又はアミノベンジルオキシメ チル紙等のセルロース、シリコーンポリマー及びシリカ又はシリケートから選択 されたものである請求の範囲第５４項又は第５５項に記載のキット。 ５７、プラスチックがラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタ ン、ポリアクリルアミド、ポリ酢酸ビニル及びそれらの適当な共重合体から選択 されたものである請求の範囲第５６項に記載のキット。 ５８、固体支持体が、板状、ストリップ、フィルム、プロティンＡ被覆バクテリ ア等の固体粒子、又は紙の形態である請求の範囲第５３項に記載のキット。 ５９、標識抗体と未標識抗体の両方を包含する請求の範囲第３８項に記載のキッ ト。 ６０、エンドトキシン標準を特徴とする請求の範囲第３８項に記載のキット。 ６１、無パイロジエン水を特徴とする請求の範囲第３８項に記載のキット。 （本頁以下余白）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）試料を、カブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパの成分又はその 合成類似体とともにインキュペーションすることにより、エンドトキシン又はエ ンドトキシン様物質が試料中に存在する場合に前記成分が変性されて、前記成分 若しくは類似体又はそれらの免疫決定基に対する抗体、又は実質的に前記成分若 しくは類似体又はそれらの免疫決定基のみに対する抗体との反応が生じないか、 前記成分又は類似体と試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質との反 応の生成物が前記成分若しくは類似体又はそれらの免疫決定基に対する抗体、又 は実質的に前記成分若しくは類似体又はそれらの免疫決定基のみに対する抗体と 反応するようにし、ｂ）工程ａ）から得られる前記試料と前記成分又は類似体と のインキュベーション混合物を、前記成分若しくは類似体又は免疫決定基に対す る抗体又は実質的に前記成分若しくは類似体又はそれらの免疫決定基のみに対す る抗体と反応させることにより試料中に存在する前記成分又は類似体に抗体を結 合させるか、前記反応生成物若しくはその免疫決定基に対する抗体又は実質的に 前記反応生成物若しくはその免疫決定基のみに対する抗体と反応させることによ り試料中に存在する前記反応生成物に抗体を結合させ、そしてｃ）工程ｂ）から 得られる反応混合物中の結合抗体を検出して、抗体が前記成分若しくは類似体又 はそれらの免疫決定基に対する抗体又は実質的に前記成分若しくは類似体又はそ れらの免疫決定基のみに対する抗体である場合には、結合抗体量の減少が検出さ れたときにはエンドトキシン又はエンドトキシン様物質が存在することを示して おり、一方、抗体が前記反応生成物若しくはその免疫決定基対する抗体又は実質 的に前記反応生成物若しくはその免疫決定基のみに対する抗体である場合には、 結合抗体量の増加が検出されたときにはエンドトキシン又はエンドトキシン様物 質が存在することを示していることから、試料中のエンドトキシン又はエンドト キシン様物質の存在を確認する、以上の工程を含むが、但し、工程ａ）における 試料と前記成分又は類似体とのインキュペーション後に存在する前記成分若しく は類似体又は前記反応生成物を固体支持体に結合させるか、前記抗体を固体支持 体又は固体支持体に結合した架橋分子に結合するか、試料中に存在するエンドト キシン又はエンドトキシン様物質を固体支持体に結合することを特徴とするエン ドトキシン又はエンドトキシン様物質の存在を確認する方法。 ２．カブトガニ変形細胞溶解産物又は血リンパの成分が、凝固因子、例えば、Ｂ 因子、Ｃ因子、Ｃ因子、Ｎ因子、前駆凝固酵素、活性化凝固酵素、抗ＬＰＳ因子 又はコアギュローゲン及び凝集素、例えば、リムリン又はポリフェミン等のレク チンから選択されたものである請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．前記成分又は類似体と試料中の前記エンドトキシン又はエンドトキシン様物 質との反応の生成物が、コアギュリン、Ｃ−ペプチド、活性化凝固酵素、活性化 Ｂ、Ｃ、Ｇ若しくはＮ因子、並びにこれらの因子及び前駆凝固酵素からの開裂生 成物から選択されたものである請求の範囲第１項に記載の方法。 ４‘試料が、尿、髄液、血液、血清、血漿、血液から製造される生成物又はリン パ液等の体液、非経口液又は注射液等の製剤、医療用具、マイトジェン、栄養培 地及び緩衝液等の生化学薬品、食品、飲料水並びに製薬工業で使用する水から選 択されたものである請求の範囲第１項に記載の方法。 ５．エンドトキシン又はエンドトキシン様物質が、エンドトキシン、又はグラム 陰性菌、グラム陽性菌、カビ、酵母及び藻類等の微生物由来の表面抗原から選択 されたものである請求の範囲第１項に記載の方法。 ６．抗体が、単一特異性抗体である請求の範囲第１項に記載の方法。 ７．抗体が、ポリクローナル抗体である請求の範囲第１項に記載の方法。 ８．抗体が、モノクローナル抗体であるか、２種以上のモノクローナル抗体から なる混合物である請求の範囲第１項に記載の方法。 ９．抗体が標識を有している請求の範囲第１項に記載の方法。 １０．標識が、酵素、螢光物質、化学発光物質、発色団、放射性同位体及び錯生 成剤から選択されたものである請求の範囲第９項に記載の方法。 １１．酵素が、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウ レアーゼ、グルコース、グルコースオキシダーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリ ンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素、グルコ ース−６−Ｐ−ホスフェート脱水素酵素及びリポヌクレアーゼから選択されたも のである請求の範囲第１０項に記載の方法。 １２．酵素を標識として使用し、酵素の基質を請求の範囲第１項の工程ｂ）で得 られる反応混合物に添加して、着色、螢光又は化学発光生成物を生じさせるか、 色の変化を生じさせるか、色、螢光又は化学発光の強度の変化を生じさせる請求 の範囲第１０項に記載の方法。 １３．螢光物質が、４−メチルウンペリフェリルーホスフェート、４−メチルウ ンペリフェリル−Ｄ−ガラクトピラノシド及び３−（ｐ−ヒドロキシフェニル） プロピオン酸から選択されたものである請求の範囲第１０項に記載の方法。 １４．化学発光物質は、イソルミノール／ＥＤＴＡ／Ｈ２Ｏ２、ペルオキシダー ゼ／エオシン／ＥＤＴＡ及びルシフェラーゼ並びにそれらの基質から選択された ものである請求の範囲第１０項に記載の方法。 １５．発色団は、５−アミノサリチル酸、２，２′−アジノ−ジ−（３−エチル ペンズチアゾリン−６−スルホン酸、ｏ−フェニレンジアミン、ｏ−ジアミンイ シジン、３−メチル−２−ペンゾチアゾリンヒドラゾン、３−（ジメチルアミノ ）安息香酸、ｏ−トルイジン、３，３′，５，５′−テトラメチルペンジジン、 ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド及びｐ−ニトロフェニルホスフェー トから選択されたものである請求の範囲第１０項に記載の方法。 １６．放射性同位体は、１２５Ｉ、３Ｈ、３５Ｐ、１３１Ｉ及び１４Ｃから選択 されたものである請求の範囲第１０項に記載の方法。 １７．錯生成剤は、ピオチン、プロテインＡ及びレクチンから選択されたもので ある請求の範囲第１０項に記載の方法。 １８．抗体を、固体支持体又は固体支持体に結合した架橋分子に結合させるとと もに、請求の範囲第１項の方法の工程ａ）における成分又は類似体と試料とのイ ンキュベーション後に残存している前記成分は、抗体に結合させ更なる量の抗体 と反応させる請求の範囲第１項に記載の方法。 １９．固体支持体がポリマーを包含する請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２０．固体支持体が、ポリマーを被覆したマトリックスを包含する請求の範囲第 １９項の方法。 ２１．ポリマーが、プラスチック、ニトロセルロース紙、臭化シアン活性化紙、 １−（３−ニトロペンジルオキシメチル）ピリジウムクロリド紙、ジアゾペンジ ルオキシメチル紙、ニトロペンジルオキシメチル紙又はアミノペンジルォキシメ チル紙等のセルロース、シリコーンポリマー及びシリカ又はシリケートから選択 されたものである請求の範囲第１９項又は第２０項に記載の方法。 ２２．プラスチックがラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタ ン、ポリアクリルアミド、ポリ酢酸ビニル及びそれらの適当な共重合体から選択 されたものである請求の範囲第２１項に記載の方法。 ２３．固体支持体が、板状、ストリップ、フィルム、プロテインＡ被覆バクテリ ア等の固体粒子、又は紙の形態である請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２４．ａ）コアギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコア ギュローゲン又はその免疫決定基のみに対する抗体、又はコアギュリン若しくは Ｃ−ペプチド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン若しく はＣ−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗体を、固体支持体又は固体支 持体に結合した架橋分子に結合させ、ｂ）試料をコアギュローゲン含有物質とと もにインキュペーションして、試料中にエンドトキシン又はエンドトキシン様物 質が存在する場合にはコアギュローゲンが開裂されてコアギュリン及びＣ−ペプ チドとなるようにし、ｃ）工程ｂ）から得られるインキュベーション混合物を固 体支持体に添加して、固体支持体に結合した抗体がコアギュローゲン又はその免 疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみに 対する抗体の場合には、試料中に存在するコアギュローゲンを結合するようにし 、固体支持体に結合した抗体がコアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫 決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免 疫決定基のみに対する抗体の場合には、コアギュリン又はＣ−ペプチドを結合す ようにし、 ｄ）固体支持体に、コアギュローゲン又はその免疫決定基に対する標識抗体か、 実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみに対する標識抗体を添加して 固体支持体上に存在する結合コアギュローゲンに結合すようにするか、又はコア ギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコ アギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗体を添加し て固体支持体上に存在する結合コアギュローゲン、結合コアギュリン又は結合Ｃ −ペプチドに結合するようにし、そしてｅ）工程ｄ）の固体支持体に結合した標 識抗体を検出して、抗体がコアギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体か 、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、 結合抗体量の減少が検出されたときにはエンドトキシン又はエンドトキシン様物 質が存在することを示しており、一方、抗体がコアギュリン若しくはＣ−ペプチ ド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン若しくはＣ−ペプ チド又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、結合抗体量の増加が検出 されたときにはエンドトキシン又はエンドトキシン様物質が存在することを示し ていることから、試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質の存在を確 認することを含む請求の範囲第１項に記載の方法。 ２５．ａ）試料をコアギュローゲン含有物質とともにインキュペーションして、 試料中にエンドトキシン又はエンドトキシン様物質が存在する場合にはコアギュ ローゲンが開裂されてコアギュリン及びＣ−ペプチドとなるようにし、ｂ）工程 ａ）のインキュベーション混合物を固体支持体に添加して、混合物中に存在する コアギュローゲンを結合するか、混合物中に存在するコアギュリン又はＣペプチ ドを結合ずるようにし、 ｃ）固体支持体に、コアギュローゲン又はその免疫決定基に対する標識抗体か、 実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみに対する標識抗体を添加して 固体支持体に結合したコアギュローゲンに結合すようにするか、又はコアギュリ ン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュ リン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗体を添加して固体 支持体上に結合したコアギュリン又はＣ−ペプチドに結合するようにし、ｄ）工 程ｃ）の固体支持体に結合した標識抗体を検出して、抗体がコアギュローゲン又 はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定 基のみに対する抗体の場合には、結合抗体量の減少が検出されたときにはエンド トキシン又はエンドトキシン様物質が存在することを示しており、一方、抗体が コアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的 にコアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗体の場 合には、結合抗体量の増加が検出されたときにはエンドトキシン又はエンドトキ シン様物質が存在することを示していることから、試料中のエンドトキシン又は エンドトキシン様物質の存在を確認することを含む請求の範囲第１項に記載の方 法。 ２６．ａ）コアギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコア ギュローゲン又はその免疫決定基のみに対する抗体、又はコアギュリン若しくは Ｃ−ペプチド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン若しく はＣ−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗体を、固体粒子に結合させ、 ｂ）試料をコアギュローゲン含有物質とともにインキュペーションして、試料中 にエンドトキシン又はエンドトキシン様物質が存在する場合にはコアギュローゲ ンが開裂されてコアギュリン及びＣ−ペプチドとなるようにし、ｃ）工程ｂ）か ら得られるインキュベーション混合物を工程ａ）の抗体に添加して、抗体がコア ギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュローゲン又 はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、コアギュローゲンの存在下で固 体粒子の凝集を生じさせるようにし、抗体がコアギュリン若しくはＣ−ペプチド 又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン若しくはＣ−ペプチ ド又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、コアギュリン又はＣ−ペプ チドの存在下て固体粒子の凝集を生じさせるようにし、そして ｄ）コアギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュロ ーゲン又はその免疫決定基のみに対する抗体が結合している固体粒子が凝集しな いことにより、又はコアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基に対 する抗体か、実質的にコアギュリン若しくはＣ−ペプチド又はその免疫決定基の みに対する抗体が結合している固体粒子が凝集することにより試料中のエンドト キシン又はエンドトキシン様物質の存在を確認することを含む請求の範囲第１項 に記載の方法。 ２７．カブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパの成分、その合成類似体又 はその免疫決定基に対するか、実質的にカブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血 リンパの成分、その合成類似体又はその免疫決定基のみに対するモノクローナル 抗体。 ２８．カブトガニ変形細胞溶解産物又は血リンパの成分が、凝固因子、例えば、 Ｂ因子、Ｃ因子、Ｇ因子、Ｎ因子、前駆凝固酵素、活性化凝固酵素、抗ＬＰＳ因 子又はコアギュローゲン及び凝集素、例えば、リムリン又はポリフェミン等のレ クチンから選択されたものである請求の範囲第２７項に記載のモノクローナル抗 体。 ２９．カブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパの成分又はその合成類似体 とエンドトキシン又はエンドトキシン様物質との反応の生成物に対するか、、実 質的に前記反応生成物にのみ対するか、前記反応生成物の免疫決定基に対するモ ノクローナル抗体。 ３０．前記反応生成物が、コアギュリン、Ｃ−ペプチド、活性化凝固酵素、活性 化Ｂ、Ｃ、Ｇ若しくはＮ因子、並びにこれらの因子及び前駆凝固酵素からの開裂 生成物から選択されたものである請求の範囲第２９項に記載のモノクローナル抗 体。 ３１．抗体が標識を有している請求の範囲第２７項又は第２９項に記載のモノク ローナル抗体。 ３２．標識が、酵素、螢光物質、化学発光物質、発色団、放射性同位体及び錯生 成剤から選択されたものである請求の範囲第３１項に記載のモノクローナル抗体 。 ３３．酵素が、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウ レアーゼ、グルコース、グルコースオキシダーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリ ンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素、グルコ ース−６−ホスフェート脱水素酵素及びリポヌクレアーゼから選択されたもので ある請求の範囲第３２項に記載のモノクローナル抗体。 ３４．酵素を標識として使用し、酵素の基質を請求の範囲第１項の工程ｂ）で得 られる反応混合物に添加して、着色、螢光又は化学発光生成物を生じさせるか、 色の変化を生じさせるか、色、螢光又は化学発光の強度の変化を生じさせる請求 の範囲第３２項に記載のモノクローナル抗体。 ３５．螢光物質が、４−メチルウンペリフェリルーホスフェート、４−メチルウ ンペリフェリルーＤ−ガラクトピラノシド及び３−（ｐ−ヒドロキシフェニル） プロピオン酸から選択されたものである請求の範囲第３２項に記載のモノクロー ナル抗体。 ３６．化学発光物質は、イソルミノール／ＥＤＴＡ／Ｈ２Ｏ２、ペルオキシダー ゼ／エオシン／ＥＤＴＡ及びルシフェラーゼ並びにそれらの基質から選択された ものである請求の範囲第３２項に記載のモノクローナル抗体。 ３７．発色団は、５−アミノサリチル酸、２，２′−アジノ−ジ−（３−エチル ペンズチアゾリン−６−スルホン酸、ｏ−フェニレンジアミン、ｏ−ジアミンイ シジン、３−メチル−２−ペンゾチアゾリンヒドラゾン、３−（ジメチルアミノ ）安息香酸、ｏ−トルイジン、３，３′，５，５′−テトラメチルペンジジン、 ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド及びｐ−ニトロフェニルホスフェー トから選択されたものである請求の範囲第３２項に記載のモノクローナル抗体。 ３８．放射性同位体は、１２５Ｉ、３Ｈ、３５Ｐ、１３１Ｉ及び１４Ｃから選択 されたものである請求の範囲第３２項に記載のモノクローナル抗体。 ３９．錯生成剤は、ビオチン、プロテインＡ及びレクチンから選択されたもので ある請求の範囲第３２項に記載のモノクローナル抗体。 ４０．抗体を、固体支持体又は固体支持体に結合した架橋分子に結合させる請求 の範囲第２７項又は第２９項に記載のモノクローナル抗体。 ４１．架橋分子が、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、リジン、プロテイン Ａ及びヒドラジドから選択されたものである請求の範囲第４０項に記載のモノク ローナル抗体。 ４２．ａ）適当な動物又は適当な動物細胞を、カブトガニ変形細胞溶解産物若し くは血リンパ、その合成類似体又はその免疫決定基から実質的になる抗原で免疫 するか、前記成分又は類似体とエンドトキシン又はエンドトキシン様物質との反 応の生成物又はその免疫決定基から実質的になる抗原で免疫することにより、前 記抗原に対する抗体を産生する細胞を得て、 ｂ）前記抗原に対する抗体を産生する細胞を適当な細胞系と融合させ、 ｃ）得られる前記抗体を産生するハイプリドーマ細胞を選択してクローニングし 、そして ｄ）ハイプリドーマ細胞を適当な媒体中で成長させて前記抗体を産生することを 含む請求の範囲第２７項〜第４１項のいずれかに記載のモノクローナル抗体の製 造方法。 ４３．免疫する動物は、ウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、マウス、ニワトリ及びモ ルモットから選択されたものである請求の範囲第４２項に記載の方法。 ４４．前記抗原に対する抗体を産生する細胞は、リンパ節細胞及び脾臓細胞から 選択されたものである請求の範囲第４２項に記載の方法。 ４５．前記抗原に対する抗体を産生する細胞とミエローマ細胞との融合は、ポリ エチレングリコール等の融合促進剤の存在下で行う請求の範囲第４２項に記載の 方法。 ４６．請求の範囲第４２項に記載の方法の工程ｃ）で生じるハイプリドーマ細胞 を、マウス等の動物の体腔内で成長させる請求の範囲第４２項に記載の方法。 ４７．請求の範囲第４２項に記載の方法の工程ｃ）で生じるハイプリドーマ細胞 を、試験管内で成長させる請求の範囲第４２項に記載の方法。 ４８．試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質の存在の存在を確認す るための試験キットであって、ａ）カブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リン パの成分、その合成類似体又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にカブト ガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパの成分、その合成類似体又はその免疫決 定基のみに対する抗体、又は前記成分若しくは類似体とエンドトキシン若しくは エンドトキシン様物質との反応の生成物又はその免疫決定基に対する抗体か、実 質的に前記成分若しくは類似体とエンドトキシン若しくはエンドトキシン様物質 との反応の生成物又はその免疫決定基のみに対する抗体、及び ｂ）カブトガニ変形細胞若しくは血リンパの成分又はその合成類似体からなるこ とを特徴とする試験キット。 ４９．カブトガニ変形細胞溶解産物又は血リンパの成分は、凝固因子、例えば、 Ｂ因子、Ｃ因子、Ｇ因子、Ｎ因子、前駆凝固酵素、活性化凝固酵素、抗ＬＰＳ因 子又はコアギュローゲン及び凝集素、例えば、リムリン又はポリフェミン等のレ クチンから選択されたものである請求の範囲第４８項に記載のキット。 ５０．前記成分又は類似体と前記試料中の前記エンドトキシン又はエンドトキシ ン様物質との反応の生成物は、コアギュリン、Ｃ−ペプチド、活性化凝固酵素、 活性化Ｂ、Ｃ、Ｇ若しくはＮ因子、並びにこれらの因子及び前駆凝固酵素からの 開裂生成物から選択されたものである請求の範囲第４８項に記載のキット。 ５１．抗体が単一特異性抗体である請求の範囲第４８項に記載のキット。 ５２．抗体がポリクローナル抗体である請求の範囲第４８項に記載のキット。 ５３．抗体がモノクローナル抗体又は２種以上のモノクローナル抗体の混合物で ある請求の範囲第４８項に記載のキット。 ５４．抗体が標識を有している請求の範囲第４８項に記載のキット。 ５５．標識が、酵素、螢光物質、化学発光物質、発色団、放射性同位体及び錯生 成剤から選択されたものである請求の範囲第５４項に記載のキット。 ５６．酵素が、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウ レアーゼ、グルコース、グルコースオキシダーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリ ンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素、グルコ ース−６−ホスフェート脱水素酵素及びリポヌクレアーゼから選択されたもので ある請求の範囲第５５項に記載のキット。 ５７．酵素を標識として使用し、酵素の基質を請求の範囲第１項の工程ｂ）で得 られる反応混合物に添加して、着色、螢光又は化学発光生成物を生じさせるか、 色の変化を生じさせるか、色、螢光又は化学発光の強度の変化を生じさせる請求 の範囲第５５項に記載のキット。 ５８．螢光物質が、４−メチルウンペリフェリルーホスフエート、４−メチルウ ンペリフェリル−Ｄ−ガラクトピラノシド及び３−（ｐ−ヒドロキシフェニル） プロピオン酸から選択されたものである請求の範囲第５５項に記載のキット。 ５９．化学発光物質は、イソルミノール／ＥＤＴＡ／Ｈ２Ｏ２、ペルオキシダー ゼ／エオシン／ＥＤＴＡ及びルシフェラーゼ並びにそれらの基質から選択された ものである請求の範囲第５５項に記載のキット。 ６０．発色団は、５−アミノサリチル酸、２，２′−アジノ−ジ−（３−エチル ペンズチアゾリン−６−スルホン酸、ｏ−フェニレンジアミン、ｏ−ジアミンイ シジン、３−メチル−２−ペンゾチアゾリンヒドラゾン、３−（ジメチルアミノ ）安息香酸、ｏ−トルイジン、３，３′，５，５′−テトラメチルペンジジン、 ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド及びｐ−ニトロフェニルホスフェー トから選択されたものである請求の範囲第５５項に記載のキット。 ６１．放射性同位体は、１２５Ｉ、３Ｈ、３５Ｐ、１３１Ｉ及び１４Ｃから選択 されたものである請求の範囲第５５項に記載のキット。 ６２．錯生成剤は、ビオチン、プロテインＡ及びレクチンから選択されたもので ある請求の範囲第５５項に記載のキット。 ６３．固体支持体を包含する請求の範囲第４８項に記載のキット。 ６４．固体支持体が、ポリマーを包含する請求の範囲第６３項に記載のキット。 ６５．固体支持体が、ポリマーが結合したマトリックスを包含する請求の範囲第 ６４項に記載キット。 ６６．ポリマーが、プラスチック、ニトロセルロース紙、臭化シアン活性化紙、 １−（３−ニトロペンジルオキシメチル）ピリジウムクロリド紙、ジアゾペンジ ルオキシメチル紙、ニトロペンジルオキシメチル紙又はアミノペンジルオキシメ チル紙等のセルロース、シリコーンポリマー及びシリカ又はシリケートから選択 されたものである請求の範囲第６４項又は第６５項に記載のキット。 ６７．プラスチックがラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタ ン、ポリアクリルアミド、ポリ酢酸ビニル及びそれらの適当な共重合体から選択 されたものである請求の範囲第６６項に記載のキット。 ６８．固体支持体が、板状、ストリップ、フィルム、プロテインＡ被覆バクテリ ア等の固体粒子、又は紙の形態である請求の範囲第６３項に記載のキット。 ６９．標識抗体と未標識抗体の両方を包含する請求の範囲第４８項に記載のキッ ト。 ７０．エンドトキシン標準を更に包含する請求の範囲第４８項に記載のキット。 ７１．無パイロジェン水を更に包含する請求の範囲第４８項に記載のキット。