JPWO2010024271A1 - 修飾抗ヘパリン/pf4複合体抗体及びhit抗体標準品 - Google Patents
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Abstract
Description
しかし、ヘパリンを投与することによってHIT(ヘパリン起因性血小板減少症)が発症する事があることが知られ、その原因はヘパリンが結合した血小板第4因子(PF4)に対して自己抗体(HIT抗体)ができるためといわれている。そのため、HIT抗体が産生されているか否か測定することで、この疾患の診断が行われている。HIT抗体はヘパリン/PF4に強く反応し、PF4単独にはほとんど反応しないことから、具体的には、ELISA法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)において、ヘパリン/PF4複合体を固定化したプレートにヒト血漿検体を反応させた後、酵素標識抗ヒトイムノグロブリン抗体を反応させ、その後酵素反応をさせることでHIT抗体の有無を調べる方法が知られている(非特許文献1、非特許文献2、非特許文献3)。
しかし、いずれの文献においても、検体に含まれるHIT抗体を吸光度(OD値)による定性的、あるいは、半定量的にしか測定していない。
すなわち、検体に含まれるHIT抗体を定量的に測定するためには、検体中のHIT抗体と同等な活性を有する標準物質が必要である。しかし、HIT抗体はヒトが作る自己抗体であるため、その測定試薬の標準物質として必要な物質は(1)ヒト(HIT患者)から抽出したHIT抗体を利用するか、(2)ヘパリン/PF4複合体を動物に免疫して得られるヘパリン/PF4抗体のヒトイムノグロブリンとの交差反応性を利用するしかない状態であった。(1)はヒト(HIT患者)材料を用いることから倫理的制約、数量的限界、安定的性能確保等の面で成約を受けるため現実的な実用化は不可能である。一方、(2)は動物に免疫して得られる抗体は、通常、ヘパリン/PF4複合体ともPF4単体とも反応してしまうため、ヘパリン/PF4複合体特異的な標準物質とは言えなかった。(2)の方法の中にはPF4単体に弱く、ヘパリン/PF4複合体に強く結合するマウスモノクローナル抗体が得たという報告が文献(G.M.Arepally et al. Blood, 95(5),1533-1540, 2000)に紹介された例があるが、この特異性を持つモノクローナル抗体が得られることは非常に稀で、全ての当該業者が入手できる状態ではなかった。さらに、この場合、ヒトイムノグロブリンの交差性を利用して測定するため、検体との相関がない恐れが考えられる。
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意検討し、比較的入手しやすい、ヘパリン/PF4抗体を動物に免疫して得られる抗体を使用して、PF4単体と反応せず、ヘパリン/PF4複合体と反応する修飾抗体を容易に作製すること、また、前記修飾抗体を、ヘパリン/PF4複合体特異的なHIT抗体標準品として使用することを可能にした。
従って、本発明の課題は、ヘパリン/PF4複合体特異的なHIT抗体標準品としても使用可能な、PF4単体と反応せず、ヘパリン/PF4複合体と反応する修飾抗体を提供することにある。
(2)ヘパリン/PF4複合体に反応し、PF4単体には反応しない、前記(1)の修飾抗ヘパリン/PF4複合体抗体。
(3)ヘパリン/PF4複合体を動物(ヒトを除く)に免疫して得られるモノクローナル抗体に、ヒトIgGあるいはヒトIgG由来抗体フラグメントを結合させたことを特徴とする、HIT抗体標準品。
(4)ヘパリン/PF4複合体を動物(ヒトを除く)に免疫して得られるモノクローナル抗体に、ヒトIgGあるいはヒトIgG由来抗体フラグメントを結合させることを特徴とする、HIT抗体標準品の作製方法。
(5)前記(3)のHIT抗体標準品を使用することを特徴とする、検体中のHIT抗体を定量的に測定する方法。
(6)前記(3)のHIT抗体標準品を含むことを特徴とする、HIT抗体測定キット。
また、用語「抗ヘパリン/PF4複合体抗体」は、特に断らない限り、PF4単体への反応性やその由来に関係なく、ヘパリン/PF4複合体に反応する抗体の意味で使用する。従って、「抗ヘパリン/PF4複合体抗体」には、ヘパリン/PF4複合体に反応する限り、例えば、PF4単体にも反応する抗体、PF4単体には反応しない抗体、ヒト体内で産生される自己抗体(例えば、HIT抗体)、ヒトを除く動物に免疫して得られる抗体等が含まれる。
血小板第4因子(PF4)は、分子量7,800のサブユニットの4量体からなる、分子量31,000のタンパク質である。生体内でヘパリンとPF4は種々の割合で複合体を形成しているが、2つのPF4に1つのヘパリンが結合した状態が、電荷が打ち消しあった最適比とされている。本発明の修飾抗体を作製するために使用するヘパリン/PF4複合体は、ヒト血小板から精製したPF4にヘパリンを混合しても良いが、公知の方法に基づき、公知のリコンビナントタンパク質作成法や後の実施例1に示す融合タンパク質発現法により作製することができ、生体内に存在するヘパリン/PF4複合体と同等の活性を有していれば、ヘパリンの種類や、PF4のアミノ酸配列の一部改変は限定されることはない。生体内に存在するヘパリン/PF4複合体と同等の活性とは、例えば、HIT患者が有するHIT抗体が、作製したヘパリン/PF4複合体に対し、生体内に存在するヘパリン/PF4複合体と同等の反応性を示すことが挙げられる。
また、使用するヘパリンは、未分画ヘパリン・高分子分画ヘパリン・低分子分画ヘパリンなどから、適宜選択することができる。
本発明で使用することのできる抗ヘパリン/PF4複合体モノクローナル抗体は、例えば、公知の細胞融合法で作製されたハイブリドーマによるモノクローナル抗体産生法により得ることができる。抗体産生細胞としては、ヒトを除く動物、例えば、マウス・ラット・モルモット等から選択することができる。すなわち、ヘパリン/PF4複合体を抗原として使用し、次いで、該複合体を用いてスクリーニングを実施することによって、本発明で使用できるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製することができ、そのハイブリドーマから目的のモノクローナル抗体を調製することができる。ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の調製は、定法、例えば、続生化学実験講座(日本生化学会編)又は免疫生化学研究法(日本生化学会編)に記載の方法に従って行うことができる。
本発明に使用するヒトIgGは、AbD serotec社などから購入することができる。また、ヒトIgG由来抗体フラグメントも、BETHYL社等から購入することもできるし、上記(2)に記載の抗体フラグメントと同様に調製することもできる。また、公知の方法によりヒト血清からヒトIgGを精製することもできる。
本発明に使用する抗ヘパリン/PF4複合体モノクローナル抗体に結合させるヒトIgG成分としては、ヒトIgG全体、ヒトIgG由来抗体フラグメント(Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、又はFv等)から、好適なものを選択することができるが、好ましくは、ヒトIgG全体、ヒトIgG由来Fc分画、ヒトIgG由来Fab分画を使用することができる。明細書中、ヒトIgG由来Fc分画をヒトIgG-Fc分画と記載する場合がある。
このようにして作製した修飾抗体(例えば、ヒトIgG結合抗ヘパリン/PF4複合体モノクローナル抗体あるいはヒトIgG由来抗体フラグメント結合抗ヘパリン/PF4複合体モノクローナル抗体)が、ヘパリン/PF4複合体と反応し、PF4単体には反応しないこと、あるいは、HIT抗体標準品として使用できるか否かの評価は、ヘパリン/PF4複合体の反応性とPF4単独の反応性を測定し、生体中のHIT抗体と同等の反応性を示すかどうかを検討することで行うことができる。例えば、実施例5及び6に記載の方法により、ヘパリン/PF4複合体プレートとPF4単独プレートを作製し、ヒトIgG結合抗ヘパリン/PF4複合体モノクローナル抗体あるいはヒトIgG由来抗体フラグメント結合抗ヘパリン/PF4複合体モノクローナル抗体のそれぞれへの反応性を測定する。ヘパリン/PF4複合体プレートにもPF4単独プレートにも同等の反応を示す抗ヘパリン/PF4複合体モノクローナル抗体が、ヒトIgG、あるいはヒトIgG由来抗体フラグメントを結合されたことにより、ヘパリン/PF4複合体プレートへの反応性は変わらず、PF4単独プレートへの反応性が激減し、生体中のHIT抗体と同等の低い反応性を示すかどうか検討する。
上記の検討で適しているものを、本発明の修飾抗体又はHIT抗体標準品として、使用することができる。
検体中のHIT抗体の定量方法としては、公知の免疫学的測定方法を使用することができる。免疫学的測定方法としては、ELISA法やRIA法、免疫凝集法やイムノクロマト法などが挙げられる。
前記HIT抗体標準品による標準曲線の作成は、検体の測定と同時に行っても良いし、別に行って参照しても良い。
標識物質としては、酵素、蛍光物質、又は発光物質を使用するのが有利である。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−D−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、ルシフェリン等を使用することができる。
ヘパリン/PF4複合体の作製
リコンビナント血小板第4因子(Platelet Factor 4; PF4)は、以下のように作製した。
ヒト血小板第4因子[NCBI (National Center for Biotechnology Information) Accession No.P02776]の32-101番目のアミノ酸に対応する遺伝子をPCR法により化学合成し、大腸菌発現系にて直接発現を行うため、GST(glutathione S-transferase)とPSP(PreScission Protease)切断配列をN末端に有するPF4(GST-PF4)発現ベクターを構築した。これらにより大腸菌宿主BL21(DE3)を形質転換し、培養条件の検討を行った。
GST-PF4ではGlutathione Sepharose 4Bアフィニティー精製収量が1 L培養液あたり約20 mgであった(PF4相当に換算すると約5 mg。SDS-PAGEにより定量)。さらに、PSPによる切断を一終夜間行ったところ、GST-PF4の切断効率はほぼ100%であり、精製純度向上のため、切断後のサンプルをRESOURCE S(NaCl溶出)により精製した後、HiTrap Heparin HP(NaCl溶出)により精製した。その結果、3 L培養液相当の菌体より6.4 mg/mL(Abs280の吸光度より換算)のPF4が1.1 mL得られた。
マウス抗ヘパリン/PF4抗体の作製
実施例1で作製したヘパリン/PF4複合体を、7週齢のメスBALB/Cマウスに免疫してマウス抗ヘパリン/PF4抗体を作製した。具体的には、ヘパリン/PF4複合体を4倍希釈後、フロイントのコンプリートアジュバントと等量混合して、500μLを皮内と腹腔内に免疫した。これと同様に2週おきに3回の免疫を行い、脾臓細胞から通常の方法でハイブリドーマ作製した。実施例5に示すELISA法により、上記で作製したハイブリドーマの中から、ヘパリン/PF4複合体に反応する5クローン(10E6、6G5-6H4、5A1、1G2B、2D6B)を選択した。また、定法に従ってモノクローナル抗体のタイピングを行ったところ、すべてIgGkであることがわかった。このハイブリドーマをマウス腹腔に投与し、2週間後から腹水を採取し、腹水をプロテインGカラムでIgGに精製して、抗ヘパリン/PF4マウスモノクローナル抗体を作製した。
また、上記5クローンにおいて、PF4のみとの反応性を実施例5に示すELISA法により検討したところ、いずれもPF4にも高い反応を示した。
HIT抗体標準品の作製(ヒトIgGのマウス抗ヘパリン/PF4抗体への結合)
0.5mgの市販精製ヒトIgG(1mL、0.25mol/L食塩を含む50mmol/Lリン酸緩衝液pH7.0)に21.3μgのLC-SPDP(Succinimidyl 6-(3-[2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate、ピアス社、10μLジオキサン)を加え、室温で1時間、回転させながら反応させた。次いで、140mmol/Lのジチオスレイトール(蒸留水)を0.28mL加え、室温30分、静置し還元させ、1mmol/LのEDTAを含む50mmol/Lリン酸緩衝液pH7.0で平衡化したセファデックスG-25カラム(1.5cm×12cm)を通し、最初に溶出されるタンパク質のピークを280nmでモニターしながら取得した。
なお、溶出時間50分付近のピークは、反応しなかった過剰のヒトIgGであり、溶出時間80分付近のピークは、反応しなかった過剰の架橋剤(ブロック剤)などの低分子である。
HIT抗体標準品の作製(ヒトIgG-Fc分画のマウス抗ヘパリン/PF4抗体への結合)
ヒトIgG-Fc分画1mg(BETHYL社、カタログ番号P80-204、コスモバイオ扱い)を、マウス抗ヘパリン/PF4抗体 (5A1、2D6B、10E6)のそれぞれ0.5mgと結合させた。対象抗体クローン及びヒトIgGの代わりに、ヒトIgG-Fc分画を使用したこと以外は、実施例3の方法と同様に行った。
なお、溶出時間60分付近のピークは、反応しなかった過剰のヒトIgG-Fc分画であり、溶出時間80分付近のピークは、反応しなかった過剰の架橋剤(ブロック剤)などの低分子である。
HIT抗体標準品の反応性の確認
実施例3及び4で調製したヒトIgG結合抗ヘパリン/PF4マウスモノクローナル抗体、ヒトIgG-Fc分画結合抗ヘパリン/PF4マウスモノクローナル抗体の反応性の確認は以下のように行った。
物理吸着用ELISAプレート(コースターEIA/RIAプレート、ハイバインディング2592:コースター社製)に、実施例1で作製した1.2μgのリコンビナント血小板第4因子(PF4)と0.04単位のヘパリン(ヘパリン、ナトリウム塩、ブタ小腸粘膜由来/CALBIOCHEM社製)を含む10mmol/L PBSpH7.3を100μL分注し、4℃で一夜静置し、反応ウェルをコートした。また、別の反応ウェルを、ヘパリンを含まないPF4入り緩衝液を100μL分注し、4℃で一夜静置コートした。
洗浄液で3回希釈した後、希釈液で3000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトイムノグロブリン抗体(ペルオキシダーゼ標識アフィニティー精製抗ヒトイムノグロブリン・ヤギ抗体F(ab')2分画/ジャクソンイムノリサーチ社製)を100μLずつ分注し、室温で1時間、静置反応させた。次に、洗浄液で4回洗浄した後、発色液(0.006%過酸化水素と2mgのオルトフェニレンジアミンを含む50mmol/L酢酸緩衝液pH5.5)を100μLずつ分注し、室温で10分間、反応させた。停止液(0.5mol/L硫酸)を100μLずつ加えた後、ELISAプレートリーダー(マイクロプレートリーダーMPR-A4i/東ソー社)に主波長492nm、副波長620nmのフィルターをセットして、発色度を測定した。
陰性の対象実験として、抗ヘパリン/PF4マウスモノクローナル抗体のヘパリン/PF4複合体プレートとPF4プレートに対する反応性を、上記と同様の方法で実施した。抗ヘパリン/PF4マウスモノクローナル抗体は、ヒトIgG成分を有しないため、標識抗体にHRP標識抗マウスイムノグロブリン抗体(西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン・ウサギIgG抗体/DAKO社製)を用いた。その結果を図7(5A1)、図8(2D6B)、図9(10E6)に示す。
すなわち、いずれの抗ヘパリン/PF4マウスモノクローナル抗体においても、ヒトIgG成分を結合することにより、ヒト自己抗体(HIT抗体)と同様に、PF4単独とは反応しにくく、ヘパリン/PF4複合体に強く反応する修飾抗体が得られた。
したがって、上記修飾抗体(ヒトIgG結合抗ヘパリン/PF4マウスモノクローナル抗体、及び、ヒトIgG-Fc分画結合抗ヘパリン/PF4マウスモノクローナル抗体)は、ヒト検体中のHIT抗体を測定する際のHIT抗体標準品として使用できることが示された。
ヒト検体中のHIT抗体の測定と定量
まず、ヒト検体中のHIT抗体を定量するために、上記で作製したHIT抗体標準品(ヒトIgG-Fc分画結合抗ヘパリン/PF4マウスモノクローナル抗体(5A1))により、標準曲線を作成した。HIT抗体標準品は、1μg/mLあたり2単位に相当する。HIT抗体標準品を0、0.3、0.6、1μg/mL(それぞれ、0、0.6、1.2、2単位に相当)にそれぞれ調製し、実施例5と同様に、ヘパリン/PF4複合体プレートに対する反応性を測定した。OD値は、それぞれ、0.005、1.140、1.743、2.191を示した。次に、スプライン近似曲線の式により標準曲線を作成した。この結果を図10に示す。得られた4点を通る標準曲線が描けることがわかった。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
すなわち、検体に含まれるHIT抗体を定量的に測定するためには、検体中のHIT抗体と同等な活性を有する標準物質が必要である。しかし、HIT抗体はヒトが作る自己抗体であるため、その測定試薬の標準物質として必要な物質は(1)ヒト(HIT患者)から抽出したHIT抗体を利用するか、(2)ヘパリン/PF4複合体を動物に免疫して得られるヘパリン/PF4抗体のヒトイムノグロブリンとの交差反応性を利用するしかない状態であった。(1)はヒト(HIT患者)材料を用いることから倫理的制約、数量的限界、安定的性能確保等の面で成約を受けるため現実的な実用化は不可能である。一方、(2)は動物に免疫して得られる抗体は、通常、ヘパリン/PF4複合体ともPF4単体とも反応してしまうため、ヘパリン/PF4複合体特異的な標準物質とは言えなかった。(2)の方法の中にはPF4単体に弱く、ヘパリン/PF4複合体に強く結合するマウスモノクローナル抗体が得たという報告が文献(G.M.Arepally et al. Blood, 95(5),1533-1540, 2000)に紹介された例があるが、この特異性を持つモノクローナル抗体が得られることは非常に稀で、全ての当該業者が入手できる状態ではなかった。さらに、この場合、ヒトイムノグロブリンの交差性を利用して測定するため、検体との相関がない恐れが考えられる。
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意検討し、比較的入手しやすい、ヘパリン/PF4複合体を動物に免疫して得られる抗体を使用して、PF4単体と反応せず、ヘパリン/PF4複合体と反応する修飾抗体を容易に作製すること、また、前記修飾抗体を、ヘパリン/PF4複合体特異的なHIT抗体標準品として使用することを可能にした。
従って、本発明の課題は、ヘパリン/PF4複合体特異的なHIT抗体標準品としても使用可能な、PF4単体と反応せず、ヘパリン/PF4複合体と反応する修飾抗体を提供することにある。
Claims (6)
- ヘパリン/PF4複合体を動物(ヒトを除く)に免疫して得られるモノクローナル抗体に、ヒトIgGあるいはヒトIgG由来抗体フラグメントを結合させたことを特徴とする、修飾された抗ヘパリン/PF4複合体抗体。
- ヘパリン/PF4複合体に反応し、PF4単体には反応しない、請求項1に記載の修飾抗ヘパリン/PF4複合体抗体。
- ヘパリン/PF4複合体を動物(ヒトを除く)に免疫して得られるモノクローナル抗体に、ヒトIgGあるいはヒトIgG由来抗体フラグメントを結合させたことを特徴とする、HIT抗体標準品。
- ヘパリン/PF4複合体を動物(ヒトを除く)に免疫して得られるモノクローナル抗体に、ヒトIgGあるいはヒトIgG由来抗体フラグメントを結合させることを特徴とする、HIT抗体標準品の作製方法。
- 請求項3に記載のHIT抗体標準品を使用することを特徴とする、検体中のHIT抗体を定量的に測定する方法。
- 請求項3に記載のHIT抗体標準品を含むことを特徴とする、HIT抗体測定キット。
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