FI95627C - Menetelmä ja reagenssipakkaus endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen aineen määrittämiseksi näytteestä sekä menetelmässä käytettäväksi tarkoitetut monoklonaaliset vasta-aineet - Google Patents

Description

1 95627

Menetelmä ja reagenssipakkaus endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen aineen määrittämiseksi näytteestä sekä menetelmässä käytettäväksi tarkoitetut monoklonaaliset vasta-aineet

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen aineen läsnäolon määrittämiseksi näytteestä sekä monoklonaalista vasta-ainetta ja reagenssipakkaus-ta, joka on käyttökelpoinen kyseessä olevassa menetelmässä.

Molukkiravut Limulus polyphemus, Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigas ja Carcinocorpius rotundicauda ovat fyloge-neettisesti alkukantaisia meren niveljalkaisia, jotka eivät ole merkittävästi kehittyneet yli kolmensadan miljoonan vuoden aikana (1).

Molukkiravulla on avoin verenkiertojärjestelmä, joka sisältää sinistä hemolymfaa, ja ainoa muodostunut ainesosa hemolymfassa on solu nimeltään amebosyytti (2).

Limulus amebosyytin soluhajoamistuotteen (LAL) käyttö in vitro kokeessa endotoksiinin määrittämiseksi oli suoraan tuloksena tärkeästä havainnosta, jonka Bang (3) teki. Hän havaitsi, että molukkiravulla ilmeni eräänlainen laajalle levinnyt intravas-kulaarinen koagulaatio (DIC), kun sillä ilmeni yleistynyt gram-negatiivisen meribakteerin aiheuttama infektio. Tätä al-kuhavaintoa in vivo myöhemmin laajensi keksintö, että Limulus-hemolymfan hyytyminen saatiin aikaan in vitro lisäämällä joko eläviä gram-negatiivisia bakteereita tai puhdistettua endotok-siinia, joka oli peräisin gram-negatiivisten bakteereiden so-lunseinämästä (2). Samat tutkijat (1) havaitsivat myös, että amebosyytti oli kaikkien hemolymfan koagulaatiolle välttämättömien tekijöiden lähde.

Esillä oleva määritystä koskeva patenttihakemus endotoksiinin määrittämiseksi in vitro perustuu siihen seikkaan, että ame-bosyyttien, jotka on eristetty hemolymfasta, fysikaalinen pirstominen sentrifugoimalla antaa suspension (LAL), joka sisältää koagulaation komponentit, jotka voivat aktivoitua ainoastaan bakteeriperäisen endotoksiinin avulla.

95627 2 Tämän periaatteen soveltaminen on tehnyt LAL-testin mitä herkimmäksi menetelmäksi, joka on saatavilla gram-negatiivisten bakteerei-den, endotoksiinin ja lipopölysakkaridin (LPS) havaitsemiseksi.

5 LAL, joka on valmistettu yleisesti tiedossa olevilla puhdistus-menetelmillä, voi luotettavasti havaita 0,1 ng/ml puhdistettua Esherichia Colin endotoksiinistandardia. LAL:n on havaittu ilmaisevan joko sidotun (soluun liittyneen) tai vapaan endotoksiinin (4), joka liittyy oleellisesti kaikkien gram-negatiivisten baktee-10 reiden solunseinämiin. Kuitenkin endotoksiini, joka on valmistettu erilaisilla uuttamismenetelmillä eri lajeista, saattaa vaihdella laajalti reaktiokykynsä suhteen (5,6). Näistä syistä the US Food and Drug Administeration (USFDA) on valmistanut vertailuna käytettävän endotoksiinistandardin (RSE) LAL- ja kaniinin pyrogeenisuus-15 testien (Unites States Pharmacopoiea XX) standardointia varten (7).

Amebosyyttien hajoamistuotteita, joilla on samankaltainen reaktio-kyky endotoksiiniin nähden, voidaan valmistaa kaikilta neljältä molukkirapulajilta.

20

Taulukossa 1 on esitetty yhteenvetona yleisesti tunnetut hyytymis-tapahtumat Limulidaessa.

Taulukko 1 25

Hyytymistapahtuma Limulidaessa LPS tai ET ET:ta sitova membraani-proteiini amebosyyttien 30 pinnalla tai (1-3)-yö- D-glukaani-

Tuntemattomat tekijät (?)

Proteäasi N (polyphemus)-»Tekijä C

35 -►aktiivinen Tekijä C (tridentatus) ^nti-LPS Tekijä

Tekijäfr!T**^?0t'ec>ty^S^r aktiivinen Tekijä B

- aktivaattori (trypsiinityyppinen se riiniproteaasi) 40 3 95627

Taulukko 1 (jatkoa)

Tekijä G -f aktiivien Tekijä G

Hyytymää edeltävä entsyymi (seriini- / pr< >teaasi) proteolyysi

Hyytymän aiheuttava entsyymi 10 -proteolyysi

Koagulogeeni -ψ C-peptidi 15 20

Ei-kovalenttisesti ristiinkytketty koagu! iini 2+ + transglutamaasi ja Ca

Kovalenttisesti ristiinkytketty koa-guliini (hyytymä)

Soluperäinen koagulogeeni: Koagulogeeni käsittää polypeptidiketjun, jossa on sisäisiä disulfidisidoksia, jotka ovat tärkeitä molekyylin 25 polymeroituvan muodon stabilisuudelle (8). Limulus polyphemuksella koagulogeenin havaittiin käsittävän 220 aminohappoa, joissa on 18 tähdettä kystiinin puolikasta (9). Ei havaittu yhtään SH-ryhmää; glysiini näyttää olevan ainoa N-terminaalinen tähde, ja seriini on C-terminaalinen tähde (9). Seriiniproteaasientsyymit muuntavat 30 aina koagulogeenia. Hyytymän muodostumisen jälkeen geeliproteiinil-la on elektronimikroskopiassa kierukkamainen rakenne (10). Tachy-pleus tridentatuksella koagulogeeni käsittää 132-135 aminohappoa, joihin kuuluu korkeita tasoja emäksisiä aminohappoja alaniinin ollessa N-terminaalinen ja fenyylialaniinin ollessa C-terminaalinen 35 aminohappo. Limuluksella hyytymän muodostumiseen näyttää kytkeytyvän yksinkertaisen Arg-Lys-peptidisidoksen pilkkoutuminen koagulogeenin pinnalla (11, 9). N-peptidit vuorovaikuttavat keskenään ei-kovalenttisella tavalla liukenemattoman hyytymän muodostumiseksi. Tachypleus tridentatuksella geelin entsymaattiseen muodostumiseen sisältyy Arg-Gly- ja Arg-Thr-peptidisidosten, jotka sijaitsevat 40 4 95627 koagulogeenin N-terminaalisessa osassa, rajoitettu proteolyysi, jolloin peptidi vapautuu (12, 13). Limuluksen C-fragmentti sisältää pääasiallisesti glutamiini- ja asparagiinihappoja (14). Kun sitä vastoin Liu et ai. (9) havaitsivat näillä lajeilla C-peptidin, jossa oli 45 aminohappoa, Nakamura et ai. (13) Shishikura et ai.

(15) esittivät, että tällä C-peptidillä oli 28 aminohappotähdettä järjestäytyneenä lajispesifiseksi sekvenssiksi.

Hyytymäentsyymi: Hyytymäentsyymi on seriiniproteaasientsyymi. Sillä on kaksi aktiivista muotoa, joiden molekyylipainot vastaavasti ovat 78 000 ja 40 000 ja joilla on hyvin samankaltaiset aminohappo-koostumukset, mikä ilmaisee monomeeri-dimeerisuhdetta (9). Tachy-pleus tridentatuksella pelkistämätön hyytymäentsyymi kuvataan glykoproteiiniksi, jonka molekyylipaino on 42 000 ja joka aggregoi-tuu muodostaen proteiinin, jonka molekyylipaino on 350 000.

Hyytymän muodostava entsyymi on peräisin hyytymän muodostuksen inaktiivisesta proentsyymistä. Proentsyymi voidaan aktivoida kahden toisistaan riippumattoman tien kautta (Taulukko 1): Gram-negatiivisten bakteereiden LPSrllä tai (1-3)-yi-D-glukaaneilla, jotka ovat peräisin tiettyjen sienien ja levien solunseinämistä.

LPSjn välittämä koagulaatio: Ensinnä, havainnollistettiin, että endotoksiini tai LPS aktivoi seriiniproteaasityyppisen hyytymäent-syymin esiasteen (pro-clotting enzyme) (16,11). Toiseksi, lisätekijän B tai proaktivaattorin havaittiin myös kytkeytyvän LPSjn indusoimaan LAL:n koagulaatioon, koska se aktivoi hyytymisentsyymin esiasteen (17,18). Tähän aktivaatioon luultavasti kytkeytyy rajoitettu proteolyysi, se on hyytymisentsyymin esiasteen arginyy-li- tai lysyyli-X-sidos (18). Lopuksi, tämän pro-aktivaattorin havaittiin muuttuvan aktiiviseksi tekijäksi B tai aktivaattoriksi (se on trypsiinin tyyppiseksi seriiniproteaasiksi) eräällä toisella proteolyyttisellä entsyymillä, jota nimitetään proteaasi N:ksi (tekijä C T.tridentatuksella), joka näyttää olevan LPS:stä riipu-vainen (18, 19). Nämä peräkkäiset havainnot ilmaisevat, että koagulaatioprosessi edustaa monimutkaista peräkkäisten entsyymien sarjaa, johon saattaa sisältyä myös muita tuntemattomia tekijöitä (Taulukko 1).

tl s 95627

Hyytymistä estävät tekijät: 80 kd:n suuruinen proteiini, joka on peräisin amebosyytin membraanista, sitoo spesifisesti endo-toksiinia tai LPS:a (9, 20). Kirjoittajien mukaan tämä resep-toriproteiini voi tunnistaa ja tehdä liikkumattomaksi pieniä 5 LPS:n määriä Limuluksen veressä ilman laajaa suonensisäistä koagulaatiota. Lisäksi antikoagulantti (anti-LPS-tekijä), joka inhiboi LPS:n indusoiman koagulaation, on läsnä amebosyyteis-sä, jotka ovat peräisin Tachypleus tridentatuksen ja Limulus polyphemuksen hemolymfasta (21). Tämä antikoagulantti inhiboi 10 tekijä B:n aktivaation, mutta ei sen aktiivisuutta. Anti-LPS-tekijä ei vaikuta muuhun, epäsuoraan hyytymistiehen (21).

(1-3)-jS-D-glukaanin välittämä hyytyminen: Sekä kasvaimenvas-taisella tekijällä (1-3)-/3-D-glukaanilla että muilla kasvai-15 menvastaisilla polysakkarideilla on tehokas kyky aiheuttaa LAL:n geelin muodostus (22) aktivoimalla tekijä G, joka toimii hyytymäentsyymin esiastetta kohtaan (23).

Useimmiten käytetty testi on hyytymätesti. Tämä menetelmä pe-20 rustuu siihen tosiasiaan, että LAL:ssä tapahtuvien peräkkäisten reaktioiden lopputulos, kun kysymyksessä on reaktio endo-toksiinin kanssa, on samea geeli tai hyytymä. Testi suoritetaan seuraavasti: 0,1 ml LAL:ta sekoitetaan koeputkessa 0,1 ml:n kanssa koeliuosta. Seosta inkuboidaan 37°C:ssa vesi-25 hauteessa yhden tunnin ajan. Koe katsotaan positiiviseksi, kun hyytymä muodostuu, ja hyytymä on kestävä, kun koeputki käännetään ylösalaisin 180°. On kuvattu vähemmän tehokkaita reaktioita, jotka ilmenevät viskositeetin lisääntymisenä, tärkkelyksen kaltaisten rakeiden, jotka tarttuvat koeputken seinämille, 30 esiintymisenä, mitä usein seuraa lisääntynyt sameus. Vähemmän kuin täydellisen hyytymisen loppupisteiden tulkinnan subjektiivisuus on ollut kritiikin kohteena tämän menetelmän kaltaisen kokeen suhteen. Tämä koskee erityisesti kliinisiä näytteitä, joihin kohdistuvaa erilaisten aineiden aiheuttamaa häi-35 riötä tutkitaan.

LAL:ssä tapahtuvien reaktiomekanismien yllä mainittujen tutkimusten perusteella on julkaistu muita LAL-kokeen muunnoksia. Näihin sisältyvät turbidometriset (24), kromogeeniset (25), kolorimetriset 5 95627 (26), nefelometriset (27), kineettiset menetelmät (20-30), erilaiset liuskamenetelnät (31-3G), kapillaarinenetelnät (30,39), nikrodiluutio (40), LAL-pallo (41), kcayulogeenin radioisotooppi-5 leimaus (42) ja imnunoelektroforeettinen nenetelrl, jo):a mittaa koayulogeenin antigeenisuuden häviämistä, kun koagulogeenin pilkotaan LPSsllä aktivoidulla entsyymillä (43), koetulos luetaan visuaalisesti tai epäsuorasti jonkin laitteen avulla.

10 LAL-reaktion spesifisyyden endotoksiinin tai LPS:n suhteen useat tutkijat ovat asettaneet kyseenalaiseksi. On esitetty, että trombiini, tronboplastiini ja tietyt synteettiset polynukleotidit antavat kaikki positiivisen LAL-testitulcksen (44). Peptidoglykaa-ni, joka on peräisin uram-positiivisilta bakteereilta (45), 15 enöotoksiinit, jotka ovat peräisin ryhmän Λ streptokokilta (-.3), useat yksinkertaiset polysakkaridit, hiivan mannaanit ja bakteeriperäiset dekstraanit multaan luettuina (47), synteettiset cekst-raanijohdannaiset (40) ja citiolit aiheuttavat LAL:n hyytymisen.

20 LAL-testiä on käytetty määritettäessrä erilaisten organismien membraanimateriaaleista eristettyjen endotoksiinin kaltaisten molekyylien biologista aktiivisuutta. Positiiviset LAL-testit saatiin lipoteikohaposta, joka oli peräisin Streptococcus faecalikselta (50), lipoglykaaneilta, jotka olivat erilaisilta 25 Pycoplasma-kannoilta (51, 52), Vicrospora faenin solunseinänäjakeista (53) sekä Chlamydia psittacilta (54), sekä Plasmodium beryhein puhtaista valmisteista (55) ja kuumalla fenolivedellä saaduista Listeria nonoeytogenesin uutteista (56).

30 Viime aikoina on kiistelty LAL-testin kliinisestä käyttökelpoisuudesta. Piin (57) laati ihmisellä LAL:n ja veren avulla suoritetusta 17 erilaisesta tutkimuksesta statistisen analyysin, ja päätteli, että LAL-testin kliininen käyttökelpoisuus yram-ne-_,atiiviscn septikemian diagnoosissa on juuri ja juuri vähin-35 näisvaatimukset täyttävä. Tubbsin (59) ja Gall o*./ay n et ai. (59) suorittamat lisätutkimukset vastaavasti osoittivat, että plasma, joka oli saatu Plasmodium falci^arumir. ja P.orrelia recurentiksen infektoimilta potilailta, reagoi L.AL-testiss" positiivisesti.

40 5 7 Lähes kaikissa yllä mainituissa tutkimuksissa oli käytetty subjektiivisia menetelmiä L.AL-tcstin lukemiseen, positiivinen testi määriteltiin hyytymisenä tai lisääntyneenä sameutena.

Kaikista vaikeimpana LAL-testille asetettavan haasteena on ollut enö.otoksiinin havaitseminen verestä tai plasmasta. Ensinnä, kiertävän enäotoksiinin konsentraatio veressä on tavallisesti alhainen sen maksassa tapahtuvan nopean poistamisen vuoksi. Toiseksi, plasma 10 sisältää L.ALsn inhibiittoreita, endotoksiinia inaktivoivia aineita ja endotoksiinia sitovia proteiineja.

On käytetty erilaisia menetelmiä end.ctoksiinin uuttamiseksi plasmasta. Parhaat tulokset on saatu plasman laimentamisen ja 15 kuumentamisen yhdistelmällä (43).

Kokeet, jotka on suoritettu raketti-imnunoelektroforeettisella menetelmällä LAL: n reaktiokyvyn määrittämiseksi enäotoksiinin kanssa (43), ovat osoittaneet korkea-asteista tarkkuutta ja 20 herkkyyttä useihin muihin menetelmiin verrattuna ja että LAL-testi soveltuu diagnostisiin tarkoituksiin.

Pseudomonas aeruginosalta ja Staphylococcus aureukselta saatujen liukoisten antigeenien ja L?iL:n välisen vuorovaikutuksen imr.iuno-25 elektroforeettiset tutkimukset ovat osoittaneet, että L7iL on erittäin reaktiokykyinen LPS:n kanssa mutta että se voi yhtä hyvin reagoida muiden antigeenien kanssa, jotka ovat peräisin gram-negatiivisilta ja gram-positiivisilta bakteereilta (60).

30 LAL-testin pääasiallinen käyttäjä on ollut farmaseuttinen teollisuus, joka nykyisin suorittaa vuosittain satojatuhansia testejä 1ääketieteellisten laitteiden, biokenikaalien ja parenteraali-sesti annettavien nesteiden erilaisista suurista ja pienistä tilavuuksista. LAL-testi suoritetaan nykyisin monien ruiskutettava 35 en nesteiden sek" kohoon sijoitettavien lääkintälaitteiden, joita farmaseuttinen teollisuus valmistaa kaikkialla maailmassa, sekä valmistusvaiheen ett" lopullisen tuotteen testauksena.

Jorgensen (Cl) perusteellisesti sitellyt LAL-testin kliinisiä 40 8 95627 sovellutuksia. Johtopäätös, joka voidaan vetää tästä artikkelista, joka koskee LAL-testin kliinisiä sovellutuksia on, että on kuvattu suuri määrä mahdollisesti menestyksellisiä käyttöjä kokeen käyttöönotosta 1960-luvun loppupuolelta lähtien.

5 Niillä kaikilla on etuna nopeus, herkkyys, ja LAL-testin yleinen spesi£isyys bakteeriperäisiä endotoksiineja kohtaan, on kysymyksessä sitten endotoksiini, joka on peräisin gram-negatiivisesta bakteerista, tai vapaa endotoksiini, joka on todisteena aiemmasta tai ajoittaisesta bakteerikasvusta. Kaikissa 10 näissä kokeissa LAL-testi on osoittautunut joissakin suhteissa paremmaksi kuin bakteeriperäisten endotoksiinien tavanomaiset määritysmenetelmät. Kuitenkaan mikään näistä sovellutuksista ei ole korvannut tavanomaisia menetelmiä, niin että määritykseen käytettäisiin yksinään LAL-koetta. Sen sijaan LAL-koe on 15 hyvä lisäkeino gram-negatiivisten bakteereiden läsnäolon määrittämiseksi erilaisissa kliinisissä tapauksissa. Sillä on yleistä, perusteltua diagnostista käyttöä (meningiitti, sil-mäinfektiot, bakteeriuria), ja sen avulla voidaan mahdollisesti paremmin ymmärtää endotoksiinin muita patofysiologisia seu-20 rauksia, so. endotoksemiaa.

Kyseessä olevat keksijät ovat nyt kehittäneet uuden menetelmän Limulus- tai Tachypleus-amebosyytin solunhajoamistuotteen ja endotoksiinin välisen reaktion määrittämiseksi. Menetelmä 25 osoittaa samaa herkkyyttä ja spesifisyyttä endotoksiinin suhteen kuin raketti-immunoelektroforeesimenetelmä (43), mutta se ei vaadi niin erilaistunutta laitteistoa tai erittäin taitavaa henkilökuntaa toimiakseen, niin että se voidaan suorittaa käytännöllisesti katsoen missä tahansa kliinisessä laboratorios-30 sa. Se on myös yksinkertaisempi, so. se vie vähemmän aikaa ja on taloudellisempi suorittaa sekä edellyttää pienempiä määriä amebosyyttisoluja hajoittavaa reagenssia. Uusi menetelmä tarjoaa sen tähden tärkeän taloudellisen edun tunnettuihin menetelmiin verrattuna.

35

Niinpä, esillä oleva keksintö koskee menetelmää endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin määrittämiseksi näytteestä, jolloin a) näytettä inkuboidaan molukkiravun amebosyyttilysaatin tai 40 hemolymfan komponentin tai sen synteettisen analogin kanssa.

9 95627 jolloin mainitun komponentin ominaisuudet muuttuvat, jos näytteessä on läsnä endotoksiinia tai endotoksiinin kaltaista materiaalia, niin että mitään reaktiota ei tapahdu vasta-aineen kanssa, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain 5 mainittua komponenttia tai analogia tai sen immunologista determinanttia vastaan, tai niin että mainitun komponentin tai analogin reaktiotuote näytteeseen sisältyvän endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen aineen kanssa reagoi vasta-aineen kanssa, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain 10 mainittua reaktiotuotetta tai sen immunologista determinanttia vastaan, b) vaiheesta a) saadun mainitun näytteen ja mainitun komponentin tai sen analogin inkuboidun seoksen annetaan reagoida vas- 15 ta-aineen kanssa, joka on muodostettu tai suunnattu oleellisesti vain mainittua komponenttia tai sen analogia tai immunologista determinanttia vastaan, jolloin vasta-aine sidotaan seoksessa läsnä olevaan mainittuun komponenttiin tai sen analogiin, tai vasta-aineen kanssa, joka on muodostettu tai koh-20 distettu oleellisesti vain mainittua reaktiotuotetta tai sen immunologista determinanttia vastaan, jolloin vasta-aine sidotaan johonkin seoksessa läsnä olevaan reaktiotuotteeseen, ja c) määritetään endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen ai-25 neen läsnäolo näytteessä ilmaisemalla sidottu vasta-aine reak- tioseoksessa, joka on saatu vaiheesta b), sidotun vasta-aineen laskevien määrien ilmaisun osoittaessa endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen aineen läsnäolon näytteessä, jos vasta-aine on sellainen, joka on muodostettu tai kohdistettu oleel-30 lisesti vain mainittua komponenttia tai sen analogia tai immunologista determinanttia vastaan, sidotun vasta-aineen lisääntyvien määrien ilmaisun osoittaessa endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin läsnäolon näytteessä, jos vasta-aine on sellainen, joka on muodostettu tai kohdistettu 35 oleellisesti vain mainittua reaktiotuotetta tai sen immunologista determinanttia vastaan, edellyttäen että mainittu komponentti tai sen analogi tai mainittu reaktiotuote, joka on läsnä, sen jälkeen kun näytettä on inkuboitu komponentin tai analogin kanssa vaiheessa a), kytketään kiinteään kantaja-ai-40 neeseen, tai että mainittu vasta-aine kytketään kiinteään kan- 10 95627 taja-aineeseen tai sillan muodostavaan molekyyliin, joka on kytketty kiinteään kantaja-aineeseen, tai että endotoksiini tai endotoksiinin kaltainen materiaali, joka on läsnä näytteessä, kytketään kiinteään kantaja-aineeseen.

5

Esillä olevassa yhteydessä "endotoksiini tai endotoksiinin kaltainen aine” määritellään aineena, joka tavallisesti on bakteerimembraanin ulkopinnan komponentti ja joka tavallisesti on pyrogeeni, mikä merkitsee, että se aiheuttaa kuumeen. Gram-10 negatiivisten bakteereiden endotoksiinin biologisesti aktiivisen osan on osoitettu olevan lipoplysakkaridin, lipidiosan (lipidi A) ollessa vastuussa lipopolysakkaridin endotoksisista ominaisuuksista. On kuitenkin osoitettu (45, 46, 60), että muut pinta-antigeenit voivat myös reagoida LAL:n kanssa, gram-15 positiivisten bakteereiden pinta-antigeenit mukaan luettuina, ja ilmaisuun on sen tähden tarkoitus sisällyttää mikä tahansa komponentti, joka on peräisin bakteereista tai mikro-organismeista, kuten esimerkiksi sienistä, hiivoista tai levistä, ja joka reagoi LAL:n kanssa (22, 23, 47, 48).

20

Termin "molukkiravun amebosyyttilysaatti tai hemolymfa" tarkoituksena on sisältää koko solunhajoamistuote tai hemolymfa samoin kuin siihen sisältyvät yksittäiset komponentit, jolloin koko liukenemistuote tai hemolymfa sisältää sellaisia reak-25 tiokykyisiä komponentteja, jotka reagoivat endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen aineen kanssa. Tällä hetkellä suosittu komponentti käytettäväksi keksinnön mukaisessa metodissa on koagulogeeni (sellaisena kuin se on läsnä koko solunhajoamis-tuotteessa). Solunhajoamistuote ja hemolymfa voivat olla pe-30 räisin kaikilta neljältä molukkiravulta, esimerkiksi Limulus polyphemukselta, Tachypleus tridentatukselta, Tachypleus giga-silta ja Carsinoscorpius rotundicaudalta, Limuluksen ja Tachy-pleuksen solunhajoamistuotteiden tällä hetkellä ollessa suosittuja.

35

Termillä "synteettinen analogi" tarkoitetaan ainetta, jolla on sama tai oleellisesti sama reaktiokyky endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen aineen kanssa kuin komponentilla, jota luonnostaan esiintyy molukkiravun amebosyyttisolujen hajoamis-40 tuotteissa tai hemolymfaasa. Sellaista analogia voidaan vai- ti 11 95627 mistaa kemiallisen synteesin avulla, kuten esimerkiksi tavanomaisen peptidisynteesin, mieluummin kiinteän faasin pepti-disynteesin avulla tai yhdistelmä-DNA-tekniikoilla, mukaanluettuna mainittua komponenttia koodittavan geenin kloonaus 5 sopivaan ilmentymisvektoriin, syntyvän yhdistelmävaktorin transformointi sopivaan mikro-organismiin, organismin kasvattaminen sopivassa elatusaineessa mainitun geenin ilmentämiseksi sekä täten valmistetun komponentin eristäminen elatusai-neesta. Esillä olevassa menetelmässä käytettävät spesifiset 10 komponentit voidaan valita jonkin hyytymistekijän, esimerkiksi tekijän B, tekijän C, tekijän G, tekijän N, hyytymistä edeltävän entsyymin, anti-LPS-tekijän tai koagulogeenin joukosta sekä agglutiniinin, esimerkiksi lektiinin, kuten esimerkiksi limuliinin tai polyfemiinin piiristä, hyytymistekijän esiin-15 tyessä tyypillisesti amebosyyteissä ja agglutiniinin esiintyessä normaalisti hemolymfassa.

Termillä "mainitun komponentin tai analogin reaktiotuote" tarkoitetaan mitä tahansa tuotetta, joka on peräisin entsyymin 20 katalysoimasta substraatin pilkkoutumisesta tai muusta entsymaattisesti aikaansaadusta (mukaanluettuina muut entsyymit yllä kuvatussa peräkkäisten entsyymien sarjassa) substraatin muutoksesta (esimerkiksi proteiinin tertiaarisessa rakenteessa) , jonka aktivoi näytteen sisältämä endotoksiini tai endo-25 toksiinin kaltainen aine yllä kuvatussa peräkkäisessä entsyy-misarjassa. Reaktiotuote voidaan valita koaguliinin, C-peptidin, aktivoidun hyytymäentsyymin, aktivoidun tekijän B, C, G tai N joukosta tai näiden tekijöiden ja hyytymistä edeltävän entsyymin pilkkoutumistuotteista.

30

Termillä "näyte” tarkoitetaan jokaista endotoksiinin suhteen tutkittavaa ainetta. Termiin sisältyvät mieluummin mitkä tahansa materiaalit, joille tavallisesti suoritetaan pyrogeenitesti.

Täten näyte voidaan valita farmaseuttisista valmisteista, kuten 35 esimerkiksi parenteraalisesti annettavista tai ruiskutettavista nesteistä, esimerkiksi valmisteista, jotka sisältävät aktiivista ainetta, kuten esimerkiksi lääkettä tai ravintoainetta, tai lääkintälaitteiden, joita käytetään potilaan kehoon sijoittamisessa, esimerkiksi annosteluun käytettävien kanyylien tai katetrien 40 piiristä. Muihin materiaaleihin, joille yleisesti suoritetaan 12 95627 pyrogeenitesti, kuuluvat mitogeenit, biokemikaalit, ravintoaineet ja puskurit, ruoka-aineet, juomavesi sekä farmaseuttiseen teollisuuteen käytettävä vesi mukaanluettuna. Edelleen näyte voidaan valita kehonnesteiden, kuten esimerkiksi virtsan, sel-5 käydinnesteen, veren seerumin, plasman tai minkä tahansa verestä tai lymfasta valmistetun tuotteen piiristä, jolloin endotoksii-nin indusoimat sairaudet on mahdollista määrittää esillä olevan keksinnön mukaisella metodilla. Tunnettujen menetelmien haittana pyrogeenien havaitsemiseksi kliinisissä näytteissä on ollut, 10 että nämä tunnetut testit, kun ne suoritetaan kehonnesteiden näytteille, pääasiassa plasmalle ja seerumille, eivät ole osoittaneet spesifisyyttä ja herkkyyttä, jota tarvitaan bakteremian ja septikemian täsmälliseen taudinmääritykseen. On ollut hämmästyttävää havaita, että esillä olevan keksinnön mukaista menetel-15 mää voidaan käyttää vieläpä pienen pienten (piko-gramman tasoa) endotoksiinin määrien tarkkaan havaitsemiseen plasmassa ja seerumissa.

Esillä olevassa yhteydessä termillä "immunologinen determinant-20 ti” tarkoitetaan mainitun komponentin tai analogin alasekvens-siä, jota vastaan vasta-aineita, joilla on haluttuja ominaisuuksia esillä olevan keksinnön mukaisessa koemenetelmässä, voidaan muodostaa, tai joka voi reagoida vasta-aineen kanssa. Immunologinen sekvenssi voi täten olla esimerkiksi sekvenssi, joka kä-25 eittää pilkkomiskohdan, jossa komponentti tai analogi pilkkoutuu enteyymisarjalla, jota yllä on kuvattu. Termillä "vasta-aine" tarkoitetaan ainetta, joka muodostuu eläimen tai eläinsolun vasteena altiiksipanolle mainitulle komponentille tai analogille tai reaktiotuotteelle. Esillä olevan keksinnön mukaisen määri-30 tysmenetelmän riittävän spesifisyyden ja herkkyyden varmistamiseksi vasta-aine on mieluummin monospesifinen vasta-aine, jolla on spesifisyyttä molukkiravun amebosyytin solunhajoamistuotteen tai hemolymfan yhtä ainoaa komponenttia vastaan pikemmin kuin koko solunhajoamistuotteen tai hemolymfan useita komponentteja 35 kohtaan.

Joitakin tarkoituksia varten vasta-aine voi olla polyklonaalinen vasta-aine, mutta mieluummin vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine, koska se varmistaa määrityksen korkeamman spesifisyyden 40 ja herkkyyden, joka sen tähden antaa käyttöön endotoksiinin tai ia 95627 samankaltaisten materiaalien tarkemman määrittämisen kuin tavanomaiset LAL-koemenetelmät, edellyttäen samalla koekomponentin tai sen analogin pieneirpiä määriä, mikä tekee kyseessä olevan keksinnön mukaisen menetelmän käytön taloudellisemmaksi.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti endotoksiini tai endotoksii-nin kaltainen aine voidaan määrittää sekä negatiivisesti että positiivisesti. Negatiivinen määritys on tulos vasta-aineen käytöstä mainittua komponenttia tai analogia vastaan reaktiossa näytteen ja komponentin tai analogin inkuboidun seoksen kanssa, käyttämällä hyväksi vasta-aineen kyvyttömyyttä sitoutua näytteen ja komponentin tai analogin välisen inkuboinnin reaktiotuotteeseen. Jos reaktion jälkeen sidottua vasta-ainetta ei havaita tai sitä havaitaan vähän, tai jos ainakin sidottua vasta-ainetta havaitaan merkittävästi vähentynyt määrä endotoksiinittomaan kontrolliin verrattuna, tämä ilmaisee endotoksiinin tai endotok-siinin kaltaisen materiaalin läsnäolon näytteessä, koska se ilmaisee, että komponentti tai analogi on entsymaattisesti pilkkoutunut tai muuten muuttunut rakenteellisesti, mikä johtuu endotoksiinin läsnäolosta, niin että vasta-aine, joka on suunnattu komponenttia tai analogia vastaan, ei enää pysty sitoutumaan. Toisaalta, jos vasta-aine on sellainen, joka on suunnattu mainittua reaktiotuotetta vastaan, vasta-aine, joka on lisätty esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän vaiheessa b), sitoutuu kokeessa (tai ainakin vasta-aineen lisääntyvät määrät sitoutuvat endotoksiinittomaan kontrolliin verrattuna), antaen käyttöön endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen aineen positiivisen määrittämisen näytteestä.

Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä soveltuu endotoksiinin sekä kvalitatiiviseen että kvantitatiiviseen määrittämiseen. Kvantitatiivista määrittämistä varten sidotun vasta-aineen määrä voidaan kokeessa määrittää näytteiden laimennussarjan avulla, sinänsä tunnetulla tavalla (vrt. 43).

Kun esillä olevan keksinnön mukaisesti jokin komponentti tai analogi tai mainitun reaktion tuote, joka jää jäljelle, sen jälkeen kun näytettä on inkuboitu komponentin tai analogin kanssa yllä esitetyn menetelmän vaiheessa a), kytketään kiinteään kantaja-aineeseen, komponentin tai analogin tai reaktiotuotteen m 95627 vasta-aine voidaan lisätä kiinteään kantaja-aineeseen, sitoutumaton vasta-aine tai pienehkö määrä sidottua vasta-ainetta endo-toksiinittomaan kontrolliin verrattuna osoittaa edellisessä tapauksessa endotoksiinin läsnäolon näytteessä. Jälkimmäisessä 5 tapauksessa sidotun vasta-aineen läsnäolo ilmaisen endotoksiinin läsnäolon näytteessä.

Vaihtoehtoisesti kytketään vasta-aine kiinteään kantaja-aineeseen tai sillan muodostavaan molekyyliin, joka on kytketty kiin-10 teään kantaja-aineeseen, tai jokin mainittu komponentti, joka jää jäljelle, sen jälkeen kun näytettä on inkuboitu komponentin tai analogin kanssa esillä olevan keksinnön mukaisessa vaiheessa a), sidotaan vasta-aineeseen jatkoreaktiota varten vasta-aineen lisämäärän kanssa.

15

Muuna vaihtoehtona endotoksiini tai näytteessä olevan endotoksiinin kaltainen materiaali kytketään kiinteään kantaja-aineeseen. Sitä voidaan sitten inkuboida komponentin tai analogin kanssa lisäämällä komponenttia tai analogia kiinteään kantaja-20 aineeseen, minkä jälkeen lisätään komponentin tai analogin tai reaktiotuotteen, joka on peräisin komponentin tai analogin inku-boinnista näytteen kanssa, vasta-ainetta. Tässä tapauksessa komponentin (tai analogin) tulisi olla koko solunhajoamistuote tai hemolymfa tai solunhajoamistuotteessä jokin yhdiste, jonka kans-25 sa endotoksiini reagoi yllä kuvatun peräkkäisen entsyymisarjan aikaansaamiseksi.

Eräänä toisena näkökohtana esillä oleva keksintö koskee monoklo-naalista vasta-ainetta esillä olevan keksinnön mukaista käyttöä 30 varten, vasta-ainetta, joka on muodostettu tai suunnattu moluk-kiravun amebosyytin solunhajoamistuotteen tai hemolym£an komponenttia tai sen synteettistä analogia tai immunologista determinanttia vastaan.

35 Lisänäkökohtana esillä oleva keksintö koskee testipakkausta näytteeseen sisältyvän endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin läsnäolon määrittämiseksi, pakkauksen sisältäessä a) vasta-aineen, joka on muodostettu ja kohdistettu oleellisesti vain molukkiravun amebosyytin solunhajoamistuotteen tai hemolym-40 fan komponenttia tai sen synteettistä analogia tai immunologista 15 95627 determinanttia vastaan, tai vasta-aineen, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain mainitun komponentin tai sen analogin ja endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin tai sen immunologisen determinantin välisen reaktion tuotetta vastaan, ja b) molukkiravun amebosyyttilysaatin tai hemolymfan komponentin tai sen synteettisen analogin, mainitun komponentin tai sen analogin ollessa kytkettynä kiinteään kantaja-aineeseen tai kiinteään kantaja-aineeseen sidottuun, sillan muodostavaan molekyyliin.

Kuten yllä on osoitettu, vasta-aine, joka sitoo mainitun komponentin tai analogin tai sitoo mainitun reaktiotuotteen, on mieluummin monospesifinen vasta-aine molukkiravun amebosyytin solunhajoamistuotteen tai hemolymfan konponenttia (tai sen synteettistä analogia) vastaan. Monospesifinen vasta-aine voidaan valmistaa ruiskuttamalla sopivaan eläimeen kyseessä olevan komponentin tai sen analogin oleellisesti puhdasta valmistetta, minkä jälkeen seuraa yksi tai useampia tehosteruiskeita sopivin välein (esimerkiksi kahden viikon - kuukauden välein) aina kuuteen kuukauteen saakka ennen ensimmäistä veren keruuta. Sitten, samalla kun jatketaan tätä immunisointiohjelmaa, eläimistä otetaan verta yhden viikon kuluttua kunkin tehosteimmunisoinnin jälkeen, ja vasta-aine eristetään seerumista tavanomaisella tavalla, esimerkiksi kuten Harboe ja Ingild kuvaavat julkaisussa Scand. J. Immun. 2 (täydennysosa 1), 1973, ss. 161-164.

Tarkoituksiin, joissa ei tarvita korkeaa spesifisyyttä, vasta-aine voi olla polyklonaalinen vasta-aine. Polyklonaaliset vasta-aineet voidaan saada oleellisesti Harboen ja Ingildin, op. cit., kuvaamalla tavalla. Useimmissa tapauksissa on kuitenkin edullista, että esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetty vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine, koska se yleensä antaa menetelmälle suuremman spesifisyyden ja tarkkuuden vaatien samalla vähemmän suoritusaikaa. Edelleen voidaan käyttää kahden tai useamman erilaisen monoklonaalisen vasta-aineen seosta, koska se voi nostaa kokeen ilmaisurajaa ja herkkyyttä. Monoklonaalinen vasta-aine voidaan saada alla kuvatulla menetelmällä.

ie 95627

Esillä olevassa menetelmässä käytetty vasta-aine on mieluummin huomattavan puhtaassa muodossa määrityksen tarkkuuden parantamiseksi.

5 Joissakin tapauksissa, kuten esimerkiksi, kun vasta-aine on kytketty kiinteisiin partikkeleihin (kuten myöhemmin selitetään), jotka agglutinoituvat, kun vasta-aine reagoi aineen kanssa, jota vastaan se on suunnattu (se on komponentin, analogin tai reaktiotuotteen kanssa), vasta-ainetta voidaan käyttää muuntamatto-10 massa muodossa. Kuitenkin useimpia tarkoituksia varten vasta-aine mieluummin varustetaan leimalla sidotun vasta-aineen havaitsemista varten, tai vaihtoehtoisesti (kuten esimerkiksi kak-soisvastaainemäärityksessä) voidaan käyttää leimatun ja leimaa-mattoman vasta-aineen yhdistelmää. Leimana käytetty aine voidaan 15 valita minkä tahansa aineen piiristä, joka sinänsä on havaittavissa tai joka voi reagoida toisen aineen kanssa havaittavan lopputuotteen valmistamiseksi. Täten leima voidaan valita entsyymien, fluoresoivien tai kemiluminoivien aineiden, kromoforien, radioaktiivisten isotooppien ja komplekseja muodostavien 20 aineiden joukosta.

Esimerkkejä leimoina käyttökelpoisista entsyymeistä ovat perok-sidaasit (esim. piparjuuriperoksidaasi), fosfataasit (esimerkiksi hapan fosfataasi), 0-galaktosidaasi, ureaasi, glukoosioksi-25 daasi, hiilihappoanhydraasi, asetyylikoliiniesteraasi, glukoamy-laasi, lysotsyymi, malaattidehydrogenaasi, glukoosi-6-fosfaatti-dehydrogenaasi ja ribonukleaasi.

Entsyymit eivät sinänsä ole ilmaistavissa, mutta ne voidaan yh-30 distää substraatin kanssa, joka katalysoi reaktion, jonka lopputuote on ilmaistavissa. Täten substraatti voidaan lisätä reak-tioseokseen, joka saadaan yllä vaiheesta b), antaen värillisen, fluoresoivan tai kemiluminoivan tuotteen tai värin muutoksen tai muutoksen värin intensiteetissä, fluoresenssissä tai kemilumi-35 nesenssissä. Esimerkkejä substraatista, jotka ovat esillä olevassa menetelmässä käyttökelpoisia substraatteina yllä mainituille entsyymeille, ovat HjOj, p-nitrofenyylifosfaatti, laktoosi, urea, β-D-glukoosi, C02, koliiniesteri, tärkkelys, M. lyso-deikticus, malaatti, glukoosi-6-fosfaatti ja RNA. Substraatti 17 95627 voidaan yhdistää esimerkiksi kromoforin kanssa, joka on joko donori tai akseptori.

Fluoresoivia aineita, joita voidaan käyttää leimoina sidotun 5 vasta-aineen suoraa ilmaisua varten, voidaan valita yhdisteiden joukosta, joita ovat 4-metyyliumbelliferyyli-D-galaktopyrano-sidi, 4-metyyli-umbelliferyylifosfaatti ja 3-(p-hydroksifenyy-lDpropionihappo. Nämä aineet sinänsä ovat ilmaistavissa flu-resenssispektrofotometrin avulla, joka antaa mahdollisuuden sekä 10 kvalitatiivisen että kvantitatiiviseen fluoresenssin mittaukseen.

Kemiluminoivia yhdisteitä, joita voidaan käyttää leimoina vasta-aineen sitoutumisen suoraan havaitsemiseen, voidaan valita yh-15 disteiden, joita ovat isoluminoli/EDTA/HjO}, peroksidaasi/eosii-ni/EDTA ja lusiferääsi, sekä niiden substraattien joukosta. Nämä aineet sinänsä ovat ilmaistavissa spektrofotometrin avulla, joka antaa mahdollisuuden sekä kvalitatiiviseen että kvantitatiiviseen kemiluminesenssin mittaukseen.

20

Kromoforit, joita voidaan käyttää sidotun vasta-aineen suoraan ilmaisuun, voidaan valita yhdisteiden joukosta, joita ovat 5-amino-salisyylihappo, 2,2'-atsino-di(3-etyylibentstiatsoliini-6-sulfonihappo, o-fenyleenidiamiini, o-diaminisidiini, 3-metyy-25 li-2-bentso-tiatsoliinin hydratsoni, 3-(dimetyyliamino)bent-soehappo, o-toluidiini, 3,3',5,5'-tetrametyylibentsidiini, o-nitrofenyyli-jS-D-galaktosidi ja p-nitrofenyylifosfaatti. Nämä aineet sellaisinaan voidaan ilmaista spektrofotometrilla, ja niitä voidaan käyttää sekä kvantitatiiviseen että kvalitatiivi-30 seen värin määrittämiseen, esimerkiksi värin intensiteetin tai värin muutoksen määrittämiseen.

Radioaktiiviset isotoopit, joita voidaan käyttää sidotun vasta-aineen suoraan ilmaisuun, voidaan valita 125J:n, 3H:n, 35P:n, mJ: 35 ja MC:n joukosta. Isotooppien lähettämä radioaktiivisuus voidaan mitata γ-laskijassa tai nestetuikelaskijassa, joka antaa mahdollisuuden sidotun radioaktiivisuuden kvalitatiiviseen tai kvantitatiiviseen mittaukseen.

40 Komplekseja muodostavat aineet, joita voidaan käyttää sidotun ie 95627 vasta-aineen ilmaisuun, voidaan valita yhdisteiden joukosta, joita ovat biotiini (joka muodostaa kompleksin avidiinin ja streptavidiinin kanssa), proteiini A (joka muodostaa kompleksin immunoglobuliinien kanssa) ja lektiini (joka muodostaa komplek-5 sin hiilihydraattideterminanttien, esimerkiksi reseptoreiden kanssa). Tässä tapauksessa konpleksi sinänsä ei ole suoraan ilmaistavissa, se tekee mahdolliseksi leimata aine, jonka kanssa kompleksin muodostava aine muodostaa kompleksin. Merkkaus voidaan suorittaa millä tahansa aineella, joka yllä on esitetty 10 vasta-aineen leimaukseen, esim. fluoresoivan, kemiluminoivan aineen, kromoforin, entsyymin tai radioaktiivisen aineen avulla.

Kun yllä esitetyssä menetelmässä vasta-aine kytketään sillan muodostavaan molekyyliin, joka on kytketty kiinteään kantaja-15 aineeseen, sillan muodostava molekyyli, joka toimii yhdyssiteenä kiinteän kantaja-aineen ja vasta-aineen välillä, voidaan valita glutaraldehydin, karbodi-imidin, lysiinin, proteiini A:n ja hyd-ratsiinin joukosta. Vasta-aine voi olla joko leimattu tai lei-maamaton, ja eräässä menetelmän suoritusmuodossa voidaan leimaa-20 maton vasta-aine kytkeä kiinteään kantaja-aineeseen, minkä jälkeen lisätään peräkkäin komponentin tai analogin inkuboitu seos ja näyte sekä laimattu vasta-aine.

Kiinteä kantaja-aine, jota käytetään esillä olevan keksinnön 25 mukaisessa menetelmässä, käsittää mieluummin polymeerin. Kantaja-aine sinänsä voi koostua polymeeristä tai käsittää matriisin, joka on polymeerin päällystämä. Matriisi voi olla mitä tahansa kiinteää ainetta, joka soveltuu esillä olevaan tarkoitukseen, kuten esimerkiksi lasia, paperia tai muovia. Polymeeri, joka voi 30 joko sinänsä muodostaa kiinteän kantaja-aineen tai joka on levitetty matriisin pinnalle, voidaan valita muovin, selluloosan, kuten nitroselluloosapaperin, syanogeenibromidilla aktivoidun paperin, 1-(3-nitrobentsyylioksimetyyli)pyridiumkloridin, diat-sobentsyylioksimetyylipaperin, nitrobentsyylioks imetyy1ipaperin 35 tai aminobentsyylioksimetyylipaperin, silikonipolymeerin ja piidioksidin tai silikaatin jovikosta. Esimerkkejä sopivista muoveista ovat lateksi, polystyreeni, polyvinyylikloridi, polyuretaani, polyakryyliamidi, polyvinyyliasetaatti ja mikä tahansa niiden sopiva kopolymeeri. Silikonipolymeerien esimerkkeihin 40 kuuluvat siloksaani; silikaattien esimerkkeihin kuuluu lasi.

Il 19 95627

Polymeeri voi valinnaisesti sisältää toiminnallisia ryhmiä tietyn reagenssin sitoutumisen helpottamiseksi, joka reagenssi muodostaa osan entsyymisarjasta, joka on selitetty yllä, sellaisten ryhmien esimerkkien ollessa sillan muodostavia molekyylejä, jotka yllä on mainittu ja jotka valinnaisesti ovat kytketyt kiinteään kantaja-aineeseen.

Kiinteän kantaja-aineen fysikaalinen muoto ei ole erityisen kriittinen, vaikka tietyt muodot voivat soveltua paremmin kuin muut tiettyihin tarkoituksiin käytettäviksi. Täten kiinteä kantaja-aine voi olla levyn muodossa, esimerkiksi ohuena levynä tai mieluummin mikrotiitterilevynä, kaistaleena, kalvona, kiinteinä partikkeleina, proteiini A:n päällystämät partikkelit mukaan luettuina, tai paperina. Esillä olevassa menetelmässä käytettävien kiinteiden partikkeleiden tyypillinen koko on noin 1-10 μιη.

Eräässä suoritusmuodossa esillä oleva keksintö sisältää vaiheet, joissa a) vasta-aine, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koagulogeeniä tai sen immunologista determinanttia vastaan tai muodostettu tai kohdistettu vain koaguliinia tai C-peptidiä tai sen immunologista determinanttia vastaan, kytketään kiinteään kantaja-aineeseen tai sillan muodostavaan molekyyliin, joka on kytketty kiinteään kantaja-aineeseen, b) inkuboidaan näytettä koagulogeeniä sisältävän materiaalin kanssa koagulogeenin pilkkomiseksi koaguliiniksi ja C-peptidik-si, jos näytteessä on läsnä endotoksiinia tai endotoksiinin kaltaista ainetta, c) inkuboitu seos, joka on saatu vaiheesta b), lisätään kiinteään kantaja-aineeseen näytteessä läsnä olevan koagulogeenin sitomiseksi, jos vasta-aine, joka on kytketty kiinteään kantaja-aineeseen, on sellainen, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koagulogeeniä tai sen immunologista determinanttia vastaan, tai niin että näytteessä oleva koaguliini tai C-peptidi sidotaan, jos kiinteään kantaja-aineeseen sidottu vasta-aine on sellainen, että se on muodostettu tai kohdistettu 20 95627 oleellisesti vain koaguliinia tai C-peptidiä tai niiden immunologista determinanttia vastaan, d) kiinteään kantaja-aineeseen lisätään leimattu vasta-aine, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koagulogee-niä tai sen immunologista determinanttia vastaan, kiinteän kantaja-aineen pinnalla sijaitsevan, sidotun koagulogeenin sitomiseksi, tai joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koaguliinia tai C-peptidiä tai niiden immunologista determinanttia vastaan, niin että sidotaan se sidottuun koagulogeeniin tai sidottuun koaguliiniin tai C-peptidiin, jota on kiinteän kantaja-aineen pinnalla, ja e) näytteen sisältämän endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin läsnäolo määritetään ilmaisemalla vaiheen d) kiinteään kantaja-aineeseen sidottu, leimattu vasta-aine, sidotun vasta-aineen laskevien määrien ilmaisun osoittaessa endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin läsnäoloa näytteessä, jos vasta-aine on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koagulogeeniä tai sen immunologista determinanttia vastaan, ja sidotun vasta-aineen lisääntyvien määrien ilmaisun osoittaessa endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin läsnäoloa näytteessä, jos vasta-aine on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koaguliinia tai C-peptidiä tai niiden immunologista determinanttia vastaan.

Eräässä toisessa esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän suoritusmuodossa a) inkuboidaan näytettä koagulogeeniä sisältävän materiaalin kanssa, niin että koagulogeeni pilkkoutuu koaguliiniksi ja C-peptidiksi, jos näytteessä on endotoksiinia tai endotoksiinin kaltaista materiaalia, b) vaiheesta a) saatu inkuboitu seos lisätään kiinteään kantaja-aineeseen seoksessa läsnä olevan koagulogeenin tai koaguliinin tai C-peptidin sitomiseksi, c) kiinteään kantaja-aineeseen lisätään leimattua vasta-ainetta, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koagulo- 2i 95627 geeniä tai sen immunologista determinanttia vastaan kiinteään kantaja-aineeseen sidotun koagulogeenin sitomiseksi, tai joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koaguliinia tai C-peptidiä tai niiden immunologista determinanttia vastaan, kiinteään kantaja-aineeseen sidotun koaguliinin tai C-peptidin sitomiseksi, ja d) endotoksiini tai endotoksiinin kaltainen materiaali näytteessä määritetään ilmaisemalla vaiheen c) kiinteään kantaja-aineeseen sidotun leimatun vasta-aineen läsnäolo, vasta-aineen laskevien määrien osoittaessa endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin läsnäoloa näytteessä, jos vasta-aine on sellainen, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koa-gulogeeniä tai sen immunologista determinanttia vastaan, ja sidotun vasta-aineen lisääntyvien määrien ilmaisun osoittaessa endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen aineen läsnäoloa näytteessä, jos vasta-aine on muodostettu tai suunnattu oleellisesti vain koaguliinia tai C-peptidiä tai niiden immunologista determinanttia vastaan.

Molemmissa suoritusmuodoissa on edullista pestä kiinteä kantaja-aine ainakin kerran ja mahdollisesti aina useihin kertoihin saakka, sen jälkeen kun inkuboitu reaktioseos on reagoinut vasta-aineen kanssa, sitoutumattoman vasta-aineen poistamiseksi (olisi huomattava, että kaksi suoritusmuotoa, joista yllä on esitetty yhteenveto, läheisesti vastaavat vaastaavasti suoraan ja kaksoisentsyymiin kytkettyä immunosorbenttimääritystä (ELISA) . ELISA-menetelmät ovat erityisen edullisia, koska niiden on havaittu vaativan 40 kertaa vähemmän käytettyä spesifistä komponenttia (se on koagulogeenia, jota on LAL:ssä) kuin tavanomainen geelin hyytymistesti. Edelleen aika, joka tarvitaan kokeen suorittamiseen, on noin 4 tuntia useita satoja testejä kohti, mikä edustaa tärkeää parannusta tunnettuihin koemenetelmiin verrattuna. Paitsi näitä etuja, esillä olevalla menetelmällä saatavia tuloksia kliinisistä näytteistä, erityisesti verestä ja plasmasta häiritsevät aineet eivät huononna, joten menetelmää voidaan käyttää kaikkien kliinisten näytteiden tutkimiseen. ELI-SA-menetelmä on hyvin pystytettävissä, ja se voidaan suorittaa olemassa olevan laboratoriolaitteiston avulla ja voidaan myös automatisoida. Esillä oleva menetelmä on kliinisissä laboratori- 22 95627 oissa sen tähden laajalti käyttökelpoinen diagnoositarkoituksiin ja farmaseuttisessa teollisuudessa raaka-aineiden tai farmaseuttisten valmisteiden epäpuhtauksien määrittämiseen.

Eräässä toisessa suoritusmuodossa esillä olevassa menetelmässä a) vasta-aine, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koagulogeeniä tai sen immunologista determinanttia vastaan tai muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koaguliinia tai C-peptidiä tai niiden immunologista determinanttia vastaan, kytketään kiinteiden partikkeleiden pinnalle, b) näytettä inkuboidaan koagulogeeniä sisältävän materiaalin kanssa, niin että koagulogeeni pilkotaan koaguliiniksi ja C-pep-tidiksi, jos näytteessä on läsnä endotoksiinia tai endotoksiinin kaltaista materiaalia, c) vaiheen b) inkuboitu seos lisätään vaiheen a) vasta-aineeseen kiinteiden partikkeleiden agglutinaation aikaansaamiseksi koagu-logeenin läsnäollessa, kun vasta-aine on sellainen, että se on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koagulogeeniä tai sen immunologista determinanttia vastaan, niin että aiheutetaan kiinteiden partikkeleiden agglutinaatio koaguliinin tai C-pepti-din läsnäollessa, kun vasta-aine on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koaguliinia tai C-peptidiä tai niiden immunologista determinanttia vastaan, ja d) endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin läsnäolo näytteessä määritetään kiinteiden partikkeleiden, joihin vasta-aine, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koagulogeeniä tai sen immunologista determinanttia vastaan, on kytketty, agglutinaation puuttumisen perusteella tai aggluti-noimalla kiinteitä partikkeleita, joihin vasta-aine, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koaguliinia tai C-peptidiä tai niiden immunologista determinanttia vastaan, on kytketty.

Tässä suoritusmuodossa endotoksiinin läsnäolo voidaan havaita suoraan (visuaalisesti) määrittämällä kiinteiden partikkeleiden, joihin vasta-aine on sidottu, agglutinaatio. Toisin sanoen.

23 95627 esillä olevan menetelmän tässä suoritusmuodossa tavallisesti ei tarvita mitään vasta-aineen leimaa.

Esillä olevan keksinnön menetelmässä käytettäväksi tarkoitetulla vasta-aineella, joka yllä esitetyistä syistä on havaittu erityisen edulliseksi käyttää esillä olevassa menetelmässä, voi olla vasta-aineille yleisesti yllä kuvattuja piirteitä. Se voidaan valmistaa menetelmällä, jossa a) sopiva eläin tai eläinsolu immunisoidaan antigeenillä, joka oleellisesti koostuu molukkiravun amebosyytin solunhajoamistuotteen komponentista tai sen synteettisestä analogista tai niiden immunologisesta determinantista tai sisältää oleellisesti mainitun komponentin tai analogin ja endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin tai niiden immunologisen determinantin välisen reaktion tuotteen, jotta saadaan soluja, jotka valmistavat vasta-ainetta mainitulle antigeenille, b) liitetään solut, jotka valmistavat vasta-ainetta mainitulle antigeenille, sopivan solulinjan myeloomasolujen kanssa, c) syntyneet hybridoomasolut, jotka valmistavat mainittua vasta-ainetta, valikoidaan ja kloonataan, d) hybridoomasoluja kasvatetaan sopivassa elatusaineessa mainitun vasta-aineen valmistamiseksi, ja e) syntyvä vasta-aine kootaan viljelmästä.

Eläimen immunisointi suoritetaan mieluummin mainitun koirqponen-tin, sen analogin tai reaktiotuotteen liuoksen avulla sopivassa liuottimessa, kuten esimerkiksi puskurin vesiliuoksessa, esimerkiksi fosfaatilla puskuroidussa keittosuolaliuoksessa, tai adju-vantissa. Sopivia adjuvantteja ovat Freundin täydellinen tai epätäydellinen adjuvantti ja aluminiumhydroksidi. Sopivia eläimiä immunisointitarkoituksiin voidaan valita kaniinien, vuohien, hevosten, lampaan hiiren, kananpoikien ja marsujen joukosta. Veren vuodattaminen eläimistä ja (polyklonaalisen) vasta-aineen eristäminen voidaan suorittaa sinänsä tunnetulla tavalla.

95627 24

Vasta-ainetta valmistavat solut, joita käytetään yhteensulautumiseen myeloomasolujen kanssa, ovat mieluummin pernasoluja ja lymfasolmukkeen soluja. Myeloomasolujen ja vasta-ainetta valmistavien solujen ei tarvitse olla peräisin samoista eläinlajeista, 5 edellyttäen, että on mahdollista sulauttaa soluja, jotka ovat peräisin yhdestä lajista, solujen kanssa, jotka ovat peräisin toiselta lajilta, esimerkiksi hiiren soluja rotan solujen kanssa tai hiiren soluja ihmisen solujen kanssa. On kuitenkin edullista käyttää samoja eläinlajeja sekä myelooma- että vasta-ainetta 10 tuottavien solujen lähteenä. Yksi edullinen hybridoomasolupolvi esillä olevan keksinnön toteuttamiseen voidaan muodostaa sulauttamalla yhteen hiiren myeloomasolupolvi antigeenillä esikäsitel-lyn hiiren pernasolun kanssa.

15 Solujen yhteensulauttamiset voidaan suorittaa menetelmän modifikaation avulla, jonka Köhler ja Milstein ovat esittäneet julkaisussa Nature, 256, 1975, s. 495. Täten solujen, jotka valmistavat vasta-ainetta, yhteensulauttaminen myeloomasolujen kanssa suoritetaan mieluummin yhteensulautumista edistävän aineen, ku-20 ten esimerkiksi polyetyleeniglykolin kanssa. Suhde, jossa on noin 10 vasta-ainetta valmistavaa solua myeloomasolua kohti, on edullinen. Käytetty myeloomasolupolvi on mieluummin niin sanottu lääkkeelle resistentti solutyyppi, niin että valikoivassa ela-tusaineessa sulautumattomat myeloomasolut kuolevat, kun taas 25 yhteensulautuneet hybridisolut jäävät henkiin. Tavanomaisessa suoritusmuodossa, solupolvilta, jotka ovat resistenttejä 8-atsa-guaniinille, puuttuu entsyymihypoksantiini-guaniinifösforibosyy-litransferääsi, ja sen tähden ne ovat kykenemättömiä kasvamaan HAT-väliaineessa (joka sisältää hypoksantiinia, aminopteriiniä 30 ja tymidiiniä), ja ne ovat useimmin käytetyt solujen yhteensu-lauttamisiin. Edelleen myeloomasolupolven tulisi mieluummin olla "ei-erittävää tyyppiä", mikä tarkoittaa, että se ei sinänsä muodosta vasta-aineita tai kevyitä immunoglobuliiniketjuja.

35 Hyridoomasolut, jotka valmistavat vasta-ainetta mainittua komponenttia, analogia tai reaktiotuotetta vastaan, voidaan valita viljelemällä sulautumattornia, vasta-ainetta tuottavia soluja, sulautumattornia myeloomasoluja ja yhteensulautettuja soluja yksittäisissä astioissa ja valikoivassa elatusaineessa, yh-40 teensulautumattomat myeloomasolut eivät jakaudu, niin että ne il 25 95627 kuolevat noin 1-2 viikon kuluttua. Vain yhteensulautumattomat, vasta-ainetta valmistavat solut elävät solunjakaantumiskiertojen rajoitetun lukumäärän ajan, jonka jälkeen ne kuolevat (1-2 viikkoa) , kun taas onnistuneesti yhteensulautuneet solut jatkavat 5 jakaantumista, koska ne ovat perineet pysyviä kasvuominaisuuksia myeloomakantasoluilta sekä kyvyn syntetisoida hypoksantiinifos-foribosyylitransferaasientsyymiä vasta-ainetta valmistavilta kantasoluilta, niin että ne pystyvät kasvamaan selektiivisessä elatusaineessa (in casu HAT-elatusaine).

10

Olisi huomattava, että monoklonaaliset vasta-aineet, joita yhteensulautuneet solut valmistavat ja jotka on muodostettu samaa antigeeniä vastaan, eivät voi erota toisistaan riippuen spesifisestä determinantista, joka indusoi niiden muodostumisen. Kui-15 tenkin tietyn, annetun hybridoomakloonin suhteen kaikki kloonin valmistamat vasta-aineet ovat monospesifisiä antigeenimolekyy-lissä sijaitsevan tietyn determinantin suhteen. Hybridoomat, jotka valmistavat haluttua vasta-ainetta, voidaan valita, esimerkiksi rajalaimennuksen tai jonkin muun sopivan menetelmän 20 avulla, ja ne voidaan kloonata toistetun uusintakloonauksen avulla, esimerkiksi käyttämällä rajalaimennusjärjestelmää sinänsä tunnetulla tavalla, ja erittäin puhtaat, kloonatut, monoklonaaliset vasta-aineet voidaan saada viljelemällä hybridoo-masoluja sopivassa väliaineessa, esimerkiksi Dulbeccon elatusai-25 neessa (Dulbecco's minimal essential medium) . Tällä in vitro-tekniikalla valmistetaan monoklonaalisia vasta-aineita, joita kontaminoivat vain vähäiset määrät proteiineja, jotka ovat peräisin heterologisesta seerumista, esimerkiksi vasikan sikiön seerumista, jota on läsnä elatusaineessa.

30

Valmistettaessa merkittävästi korkeampia konsentraatioita monoklonaalisia vasta-aineita, joiden puhtaus on vain vähän alhaisempi verrattuna in vitro valmistettujen vasta-aineiden puhtauteen, valittuja hybridoomasoluja voidaan myös kasvattaa eläi-35 men ruumiinontelossa. Tämän menetelmän mukaisesti, haluttua hyb-ridoomasolukloonia ruiskutetaan eläimeen, kuten esimerkiksi hiireen, mieluummin syngeneiseen tai semisyngeneiseen hiireen, minkä tuloksena muodostuu ascites-kasvain, joka vapauttaa korkeita vasta-ainekonsentraatioita (noin 2-10 mg/ml) eläimen vereen tai 40 ascites-nesteeseen. Vaikka eläin valmistaa myös normaaleja immu- 26 95627 noglobuliineja, niiden määrä on vain noin 5 % monoklonaalisista vasta-aineista.

Koska esillä olevan keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet normaalisti eritetään soluista, ne voidaan eristää so-lusuperaatantista tai kehon nesteestä normaalein menetelmin, joita käytetään solun ulkopuolisten tuotteiden eristämiseen, kuten esimerkiksi sentrifugoimalla, suodattamalla, saostamalla, uuttamalla ja/tai kromatografiän avulla.

Esillä olevan keksinnön mukaisen reagenssipakkauksen yksittäisillä reagenseilla a) ja b) voi olla mitä tahansa piirteitä, joita yllä on kuvattu vasta-aineen ja molukkikravun amebosyytin solunhajoamistuotteen suhteen. Lukuunottamatta tätä, reagenssi-pakkaus voi olla sellainen, joka sisältää sekä merkattua että merkkaamatonta vasta-ainetta (erityisesti kaksoisvasta-ainemäärityksessä käytettäväksi). Muut esillä olevan keksinnön mukaisen reagenssipakkauksen aineosat voivat olla endotoksiinistandardi, joka on käyttökelpoinen erityisesti kvantitatiivisiin määrityksiin, tehden mahdolliseksi määrittää korkeampia tai alhaisempia vasta-aineen sitoutumistasoja standardikontrolliin varrattuna, sekä pyrogeeniton vesi (jotta vältetään virheelliset koetulokset, jotka johtuvat pyrogeenin kontaminoimasta vedestä) keksinnön mukaisen menetelmän reagenssipakkauksen reagenssien laimentamiseen.

Esillä olevan keksinnön mukaista reagenssipakkausta voidaan käyttää määriteltäeesä kliinisiä/patologisia tiloja, jotka ovat seuraus monista erilaisista patogeeneistä, gram-negatiiviset bakteerit (Enterobacteriaceae, esim. E. coli, Shigella dysente-riae, Pseudomonas-lajit, Neisseria-lajit, Clostridium-lajit, Vibrio cholerae, Pasteurella lajit) sekä gram-negatiiviset bakteerit (esim. Listeria monocytogenes ja Streptococcus-lajit); Mycoplasma-lajit; Chlamydia-lajit; Treponema pallidum; sienet (esimerkiksi Candida albicans) ja prototsoat, kuten esimerkiksi malarialoinen Plasmodium falsiparum mukaan luettuina. Reagenssi-pakkaus on käyttökelpoinen myös farmaseuttisten raakamateriaali-en ja lääkintälaitteiden kontaminaation havaitsemiseen, kun sen aiheuttajana ovat joko nämä patogeenit sellaisenaan tai pyro- li 27 9 5 6 2 7 geenisten endotoksiinien tähteet tai muut pinta-antigeenit, jotka ovat peräisin patogeeneistä.

Esillä olevan keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty 5 oheisissa patenttivaatimuksissa.

Kuva 1 ilmaisee, että koagulogeenivyöhyke häviää Limulus-ame-bosyytin reagoitua endotoksiinin kanssa, mikä ilmaisee koagulo-geenin kyvyn häviämistä reagoida vasta-aineen kanssa.

10

Kuva 2 on LAL-ELISA:n standardikäyrä, joka ilmaisee, että ELISA: 11a mitattu jäännöskoagulogeeni on kääntäen verrannollinen endotoksiinin konsentraatioon.

15 Kuvat 3-6 osoittavat, että LAL-endotoksiinikäyrät ovat tuloksena inkubaatioaikojen ja LAL:n erilaisten laimennusten erilaisista yhdistelmistä.

Kuva 7 ilmaisee, että plasman laimentaminen kymmenkertaisesti ja 20 sitä seuraava 10 minuutin mittainen inkubointi 75°C:ssa antavat endotoksiinin melkein 100 %:n saannon, vaikka vain noin 50 % saavutettiin kahdella muulla käsittelytavalla.

Kuvat 8 ja 9 esittävät gram-negatiivisten bakteereiden eri kan-25 tojen 8 LPS:n LAL-ELISA-määritystä (kuva 8) ja (1-3)-0-D-glukaa-nia (kuva 9). Käytetty LPS oli Salmonella enteritidis (4)/ E. coli J5 (V), Pseudomonas aeruginosa TO, Salmonella abortus equi (Δ), E. coli 055:B5 (o), Salmonella typhimurium (®) , E. coli Olli:B4 (·) ja Salmonella minnesota () . Symboli 30 (+) kuvassa 8 paikantaa LAL:n absorbanssin arvon, joka saadaan endotoksiinittomalla vedellä.

Kuva 10 esittää humaaniseerumin (Q), humaaniplasman (), polymyksiini B:n (·) ja Limuluksen plasman (O) EIA50:een. Hu-35 maaniseerumi ja plasma saatiin yhdeltä vapaaehtoiselta. Limulus-plasma oli soluton supematantti, joka valmistettiin sentrifugoi maila 12 Limulus polyphemukser. yhdistetty", verta nopeudella 5000 >: g, 30 minuutin ajan.

Keksintöä valaistaan edelleen seuraavin esimerkein.

Esimerkki 1

Limuluksen anebosyytin hajoamistuote (LAL) valmistettiin Limulus polyphem.ukseota tavanomaisin menetelmin, kuten on esitetty julkaisussa Tver!e ja Tae’: L, Acta Pathol. "icrobiol. Imnun. Scanc.

Heet. H Γ1, 1902, ss. 0-15.

10 ml hajoamistuotetta dialyscitiin ja sekcitel nm suuren ',05-molaariota Tris-riCl-uuskuria, ui! 7,0, joka tilavuuden kanss; sisälsi O-millimoolia CaCl^ia. Seos pantiin PHAE-Sepharose CL-öE-pylvääseen (15 :: 1,5 cm), joka oli tasapainotettu samalla puskurilla. Jae, joka ei absorboitunut pylvääseen pantiin edelleen Heparin-Sepharosi^ CL-6R-pylvääseen, »oka oli tasapainotettu sanal Tris-puskurilla. Koaguloceeni sidotiin Heparin-.Hexjharose -pylvääseen näissä olosuhteissa, mutta se voitiin cluoida 0,05-molaarisel la Tris-HCl-puskurilla, pH 7,9, joka sisälsi 0,15 moolia HaClia ja 2 mmoolia CaCl^:^. Eluoitu aine sisälsi 90 % puhdasta koayulo-yeer.iä SDE-polyakryylianidigeelieloktroforeesilla määritettynä.

Puhdistettu koayuloyeeni, joka saatiin yllä vaiheessa 1, adsorboitiin aluminiunhydroksiyeeliin (A1(Oil)^) siten, että 200 yq koagulo geeni" vastasi yhtä mg Al(OI?) :a, ja suspensio säädettiin yhdeksi mi 11 i grammaksi 1.1 (OH) ^ :a millilitraa kohti.

Primaari-immunisointia varten kuhunk.in hiireen ruisk.utettiin vatsaontelonsis"isesti 0,5 ml koayuloyeenisuspensiota, joka oli emelgoitu 0,5 niillä Freundin epvtäydel1ist" adjuvattia (100/xq koayuloyeenic hiirtä k.ohti). Kaksi viikkoa my"henmin kukin hiiri sai vatsaontelonsisä.isesti tehosteruisiteen, jonka suuruus oli 0,5 ml kcayulogeenisuspensiota ilman ’"’raundir. ac. juvanttia.

Hamanlainen annos ruiskutettiin 29. päivän", ja neljä päivä" myöhemmin perna soistettiin ja ^.ernasolususpensic valmistettiin leikk.aamalla ja hajoittamalla perna huolellisesti. Paadut per- 29 95627 nasolut käytettiin seuraavassa vaiheessa solujen yhteensulauttamiseen.

5 Yllä saadut pernasolut sekoitettiin nyeloonasolujen (XG3Ag3.653) 8 7 kanssa suhteessa 10:1 (10 pernasolua 10 myeloomasolua kohti), ja niitä inkuboitiin polyetyleeniglykoliliuoksen kanssa (50 % paino/tilavuus PEG1500, 7 5 paino/tilavuus DMSO (dinetyyli- sulfoksidi) fosfaatilla puskuroidussa keittosuolaliuoksessa) 90 10 sekunnin ajan, 37 °C:ssa, solujen yhteensulautumisen edistämiseksi.

Lisättiin 20 ml Dulbeccon elatusainetta (DMEH), ja solut ser.tri- fugoitiin nopeudella 1000 :: g. Solusaostuna lietettiin uudelleen 100 nl:aan ΠΛΤ-elatusainetta (joka sisälsi hypoksantiinia, amino- pteriiniä ja tyrii diiniä.), jossa oli 1C % vasikansikiönseerunia, ja 15 solut levitettiin kymmenelle 9S-kamioiselle nikrotiitterilevylle a CTUTIC, Tanska). Kuhunkin kammioon oli lisätty 10 solua/kamnio normaalin hiiren soluja syöttösoluiksi edistämään solunkasvua ja estämään nikrobikontaninaatio. Elatusaine vaihdettiin kahdesti viikossa.

20

Positiiviset kloonit seulottiin entsyymiin kytketyn imnuno-sorbenttimäärityksen (ELISA) avulla. 96-kammioiset mikrotiitteri-levyt (Immunoplates, HUNC, Tanska) päsllytettiin koagulogeenillä, joka oli puhdistettu yllä kuvatulla tavalla. Koagulogeeni laimen-25 nettiin karbonaattipuskuriin, pH 9,0, konsentraatioksi 2 ug/nl# ja kuhunkin kammioon lisättiin 100/ul koagulogeeniä sisältävää puskuria. Yli yön 4 °C:ssa suoritetun inkuboinnin jälkeen kammiot pestiin neljä kertaa fosfaatilla puskuroidulla keittosuola-liuoksella (?ES), joka sisälsi 0,05 % Tween 20:ta.

30

Kammioita inkuboitiin yhden tunnin ajan 100 ^pl:n kanssa viljelmän supernatanttia, joka oli saatu vaiheessa 3, laimennettiin 1:10 (fr ?ES:ssä, joka sisälsi 0,02 t Tween 20:tc., ne pestiin ja niitä inkuboitiin yhden tunnin ajan kaniinin peroksidaasiin konjugoidun ^5 anti-hiiri Ty:n kanssa (Oakopatts, koodi P260, laimennus 1:1000). Peroksidaasi reagoi 5 /i^n kanssa 35-prosenttista Ho0o:ta sitraatti-fosfaattipusk.urissa (7,3 g sitruunahaxjpo^H^O^:ta 1000 millitraa kohti tislattua vettä), pH 5,0, joka sisälsi G mg ortofenyleeniciamiinia. Reaktio pysäytettiin 1-molaarisella 40 95627 0„:11a, ia absorbanssi luettiin ·ί?2 nrmssä.

kahden viikon mittaisen viljelyn jälkeen hybridoorassupernatantit, 5 jotka oli saatu 17 kammiosta, osoittivat positiivista reaktiota. Valittiin hybridoor.asolut kymmenestä näistä kansioista, ja ne kloonattiin rajalainennusten avulla. Saatuja hybridoonasoluklooneja kasvatettiin solunviljelypulloissa, D"~;'-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10 t:lla vasikansikiönseerumia, 37 °C:ssa, 5 prcsentis-1C sa C0o:ta ja ?0 prosentin kosteudessa ja ruiskutettiin (10‘ solua) Peristanclla käsiteltyihin hiiriin (hiiriin oli ruiskutettu vatsa-ontelonsisUisesti kaitsi viikkoa aiemmin 1 ml Peristänsä), joka tietyn inkukcintiajän johti kasvaimen muodostumiseen hiirellä, riikä vapautti vasta-aineen korkeita konsentraatioita (2-3 mcj/r?.l) hiiren 15 vereen sekä ascites-nesteeseen.

Vi 1 jclmäsupernatantte ja väkevä itiin '.iilliporen ultrasuodatus järjestelmässä. Lisättiin VaCl:a 3,3-molaariseen konsentraatioon, cly-siiniä 1,65-nolaariseen konsentraatioon, ja pH säädettiin S,35:ksi 20 0,2-nolaarisella !!aO!!:lla. Vasta-aineiden annettiin sitten läpäistä proteiini Λ-pylväs. Sidotut vasta-aineet eluoitiin 0,1-nolaarisella sitraatti-fosfaatilla, pH 2,8. ?H säädettiin 8,0:ksi Tris-KCl:llä. Vasta-aineen määrä mitattiin sjaektrofotometrillä A_on:ssa, oletta-en, ettäi = 14. Tarkempaa määritystä varten käytettiin 25 ELIS.L-nenetelnää, joka nittaa vain hiiren vasta-ainetta, -'ikro- tiitterilevyt p.äällytettiin kaniinin anti-hiiren imnunoylobuliinil-la (Dakopatts, koodi 2109), joka oli laimennettu 1:500 PBS:ssa. Lisättiin tunnetun Ig-standardin (20yug hiiren Ic,:tä nillilitraa kohti) ja tuntemattomien, näytteiden laimennukset. Sidottu hiiren Icj 30 ilmaistiin kaniinin peroksidaasiin k on juoeidun anti-hiiren Ic,:n (Dakotatts, koodi P26Q), joka oli laimennettu 1:1000, avulla. Otandardikäyräctä voitiin laskea hiiren Iy:n tunter'.attonat konnent-raatict.

Ascites-nesteen vasta-aine puhdistettiin oleellisesti samalla tavalla. Ascites-neste laimennettiin kuitenkin suhteessa 1:1 -.(Ί /; i i/4, rysiini puskurilla, kuten yllä. or avattu, ennenkuin se pantiin proteiini A-pylv""sec

II

9 9 en

Hybridoomasolujen tuottamien monoklonaalisten vasta-aineiden luokat ja alaluokat tutkittiin ELISA-menetelmällä, käyttämällä biotiinilla leimattuja, luokka/alaluokkaspesifisiä vasta-aineita hiiren Ig:tä 5 vastaan (Zymed Corporation, Yhdysvallat). Menetelmä oli oleellisesti sama kuin yllä on kuvattu hiiren Ig:n määrittämisen suhteen, paitsi että ilmaiseva vasta-aine oli biotiinilla leimattu vasta-aine hiiren IgGl:tä, IgG2a:ta, IgG2b:tä, IgG3:a, lgM:ta tai IgA:ta vastaan. Sitoutuminen ilmaistiin lopullisesti peroksidaasilla 10 leimatulla strepavidiinilla. Kaikki vasta-aineet olivat IgGl-alaluokkaa, ja niillä oli kevyet K-ketjut.

Esimerkki 2 3 >il kutakin Limulus amebosyytin solunhajoamistuotetta (LAL) sekä 15 lipopolysakkaridia (LPS), joka reagoi L7äL:n kanssa, pantiin (IL) agarosegeeliin, ja suoritettiin elektroforeesi kahden tunnin ajan jännitteellä 20 V/cm. Elektroforeesin jälkeen pantiin pala nit-roselluloosapaperia agaroosigeelin pinnalle, ja 5 kg:n suuruista painetta pidettiin yllä noin 20 minuutin ajan, jotta proteiinit 20 agarosegeelissä sitoutuivat nitroselluloosapaperiin. Sitoutumiskohtien ylimäärä nitroselluloosapaperissa suljettiin 0,05-orosent-®) tisella Tv/een 20:llä.

Sitten nitroselluloosapaperia inkuboitiin monoklonaalisen vasta- 25 aineen kanssa esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. 200^ul viljelmän supernatanttia, joka sisälsi vasta-ainetta, lisättiin 50 ml:aan P3S:ta, joka sisälsi 0,02 % Tv/eeii^ 20: tä. Yli yön suoritetun inkuboinnin jälkeen lisättiin entsyymillä leimattua, sekundaarista vasta-ainetta (peroksidaasiin konjugoitu kaniinin anti-hiiri, Dako- 30 patts, Kööpenhamina). Lopuksi lisättiin tetrametyylibentsidiiniä ja H^O :ta (tetrametyylibentsidiiniä (24 mg) liuotettuna 90 ng:n avulla dioktyylinatriumsulfasukkinaattia 10 ml:ssa etanolia ja lisättynä 30 ml saan sitraatti-fosfaatti-puskuria, pH 5,0, johon lisätään 20 ui 30-prosenttista H„0 :ta. Tislattua vettä lisätään 50 / 2.

35 ml:aan saakka). Cidottu vasta-aine visualisoitiin voimakkaasti sinisellä värjäyksellä. Kuvasta 1 käy ilmi, että monoklonaalinen vasta-aine reagoi koagulogeer.in kanssa reagoimattomassa LAL:ssä, mutta ei L?S:n kanssa reagoineen L.AL:n kanssa. Kuussa suhteessa käytetty "irimunoblotting"-menetelr:iä oli samanlainen kuin C. Koch et 40 95 32 ai. ovat esittäneet julkaisussa J. Immunological Methods 2/, 1925, ss. 271-279 5 Esimerkki 3 10^1 kaupallista LAL-valnistetta (toimittanut Assosiation of Cape Cod, Toor.shale, ΜΑ, ΠΞΆ), joka oli liuotettu uudelleen ja laimennettu suhteessa 1:4 pyrogeenittomassa Tris-Mg++-puskurissa, lisättiin kuhunkin pienestä määrästä lasiputkia. Kuhunkin putkeen 10 lisättiin lO^ul koenäytettä, joka sisälsi vaihtelevia konsentraa-tioita Π3?:η suosituksen mukaista standardi endotoksiinia /h.coli 055:E5, '.'hittakkcr !!.A. Bioproducts, Inc., Talkersville, (mukaanluettuna negatiivinen kontrolli, joka on endotoksiinit-tomassa puskurissa). Seosta inkuboitiin 31°C :ssa yhden tunnin ajan.

15 Reaktio pysäytettiin lisäämällä jokaiseen putkeen 0,5 ml karbonaat-tipuskuria, pH 9,5 (joka sisälsi 1,59 g Ma^CO :a ja 2,93 g TTaMCO :a

-6 .3 J

1000 ml:ssa tislattua vettä). Mustakin putkesta valmistettiin karbonaattipuskurissa laimennukset suhteessa 1:50.

20 100^μΐ laimennettua inkubointiseosta lisättiin 96-kammioisen mikrotiitterilevyn kuhunkin kammioon (ITUHC, Tanska). Huoneenlämpötilassa suoritetun, yhden tunnin mittaisen inkuboinnin jälkeen levyt pestiin neljä kertaa PES:11a (joka sisälsi 29,2 g fJaClja,

25 _ . ____ . _ ________.sidaasi konjugoitiin monoklonaalisen anti-koagulogeenivasta-aineen kanssa, joka oli valmistettu esimerkissä 1 kuvatulla tavalla perjodaatti-menetelmää käyttäen, oleellisesti Tilsonin ja Hakanen (62) kuvaamalla tavalla. Täten 4 mg HHP:ta liuotettuna tislattuun veteen 30 sekoitettiin 0,1 ml:n kanssa juuri valmistettua 100-millimolaarista HalO^cta, ja sitä sekoitettiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Tätä liuosta dialysoitiin yön yli 4°C:ssa 1-mi 11imolaarista natriunasctaattipuskuria vastaan (pH 4,4), ja sitten se sekoitettiin 2 mg:n kanssa monoklonaalista vasta-ainetta (liuotettuna 35 1 ml jaan 50-nillinolaarista karbcnaattipuskuria, pH 9,5). Kahden

tunnin mittaisen, huoneenlämpötilassa suoritetun sekoittamisen jälkeen lisättiin 0,1 ml tuoretta HaEH^-liuosta (4 ny/ml), ja sitä inkuboitiin 4- °C:ssa 2 tunnin ajan. Syntyvää konjugaattia dialysoitiin fosfaatilla puskuroitua keittosuolaliuosta vastaan (PES, pH

II

0 s 33 7,3) 4 °C:ssa yön yli. Sitten se lisättiin yhtä suureen tilavuuteen glyserolia (P.7 ?=) ja varastoitiin -20°C:ssa. 100 pii peroksidaasiin konjugoitua monoklonaalista vasta-ainetta laimennettuna 1:20 C00 lainennuspuskurissa (10 g häränseerunin albumiinia 1000 nl:ssa pesupuskuria, pH 7,2) lisättiin kammioihin ja inkuboitiin y h e'en tunnin ajan. Sen jälkeen kun levyt oli pesty neljä kertaa PDS:1'", lisättiin lOO^ul väriliuosta /joka sisälsi 7,3 g sitruunahappo V H20:ta, 11,86 g Na^HPO^·* 2i?20:ta 1000 ml:ssa tislattua vettä, johon peroksidaasin substraatti oli lisätty (40 mg ortofenyleeniöiamiinia liuotettuna 100 ml jaan väripuskuria, johon oli lisätty 40 pui perhydrolia)^7. 30 minuutin kuluttua reaktio pysäytettiin 1-nolaari-sella K^SO^sllä ja absorbanssi mitattiin 492 nmjssä.

Kuvassa 2 on standardikäyrä, joka esittää tuloksia, jotka on saatu lisäämällä vaihtelevat määrät enäotoksiinia näytteeseen.

Käyrästä· käy ilmi, että esillä olevan keksinnön herkkyys (ilmaisu-alue) on alueella 10-0,75 pg endotoksiinia/ml.

Tässä esimerkissä kuvatussa testissä, koagulogeeni, joka saadaan inkubaatioseoksesta, kytketään suoraan nikrotiitterilevyyn, ja jos enäotoksiinia on läsnä, koagulogeeniä on läsnä alhaisempia määriä minkä tuloksena kokeessa havaitaan ilmaistavissa oleva lasku sidotun vasta-aineen määrässä enöotoksiinittomaan kontrolliin verrattuna.

Kuvat 3-6 esittävät reaktiokäyriä LAL:n (koagulogeenir.) reaktioista endotoksiinin kanssa LAL in laimennusten ja inkubaatioaikojen vaihdellessa; näistä käyristä käy ilmi, että (1) endotoksiinin ilnaistavuus lisääntyi inkubaatioajän lisääntyessä kaikilla LAL:n laimennuksilla, tämän tapahtui nopeasti korkeammilla laimennuksilla; (2) sana ilnaistavuus havaittiin laimennuksella suhteessa 1:4 ja havaittiin 30 minuutin inkubointiajän kuluttua, ja ilmaista-vuud.en ero kaikkien laimennusten välillä väheni inkubaatioa jän pidentyessä; (3) endotoksiinin mitattavan konsentraation laajempi alue havaittiin käyrissä, joissa käytettiin LAL:n korkeampia konser.traatioita.

Esillä olevan keksinnön mukaista ELIΓΛ-koemenetelmää verrattiin 34 95627 raketti-immunoelektrofeoreesinenetelnän (!;uvattu 43:ssa) ja tavanomaisen geelihyytynämenetelmän kanssa (jossa 0,1 nl LAL:ta, joka ++ * * oli valmistettu pyrogeenittomaan Tris-IIg -puskuriin, sekoitettiin 5 lasisessa koeputkessa (10 :·: 75 mm) 0,1 ml: n kanssa endotoksiir.i-liuosta. Lujan geelin, joka pystyi junnun koskemattomaksi putkea käännettäessä ylösalaisin, muodostuminen luettiin positiiviseksi tulokseksi, kaikkien muiden tulosten ollessa negatiivisia). Tulokset esitetään taulukossa II, 10

Taulukko II

Endotoksiinin kolmen määritysmenetelmän vertailu LAL-ELISA LAL-TIE GEELIT 15 HYYTYI !I”E!T Endotoksiini ^'492 nm raketti + tai - pg/nl (cm) 0 2,02 4,7 - 0,78 1,96 4,2 - 20 1,56 1,64 3,0 - 3,12 1,00 1,5 - 6,25 0,15 0 + 12,5 0,07 0 + 25 0,07 0 + 25 LAL: n suhteellinen kulutus 1/40 1/2 1 30 vaadittu aika 4 6 1 (tunteja) kvantitointi kyllä kyllä ? 35 soveltuvuus kyllä kyllä o plasmalle Taulukosta II kä y ilmi, että uus i menetelmä on edullisesti verrat tavissa raketti- imnunoelektrofor eesiin, ja se pystyy ilmaisemaan 11 40 35 95627 kertaa alhaisempia endotoksiinin kosentraatioita kuin geelin-hyytymismetodi.

5 LAL-ELISA:n yksi etu on, että standaräikäyrät halutulla herkkyys-alueella voidaan saada kaupallisen LAL:n yhdestä erästä säätämällä LAL:n laimennusta ja inkubointiaikaa. Endotoksiini11a on saavutettu 0,1 pg:n herkkyys (kuva 6).

10 LAL·-test in virallisella hyväksynnällä pyrogeenitestiksi varmistetaan kaupallisen LAL-reagenssin suuri kysyntä. Koska LAL:n ainoa lähde on molukkirapu, selkärangaton, joka on vähitellen kuolemassa sukupuuttoon, herkän LAL-testin, joka vähentää LAL:n kulutusta, kehittäminen on merkittävän tärkeää. ELISA-menetelmän suuri 15 herkkyys koagulogeenin ilmaisemiseksi (arvo ? ^ = 2,0 saavutettiin vieläpä, kun alkuperäinen L.AL laimennettiin kynnentuhatkertaisesti) tarjoaa mahdollisuuden käyttää tässä menetelmässä hyvin pieniä määriä LAL:ta. On laskettu, että mitä tulee tilavuuteen ja LAL:n laimennukseen, LAL-ELISA:ssa tarvitaan vain 1/160 hyytymägeeli-20 menetelmässä käytetystä LAL:n määrästä, kun verrataan samaa herkkyyttä. Tavallisesti LAL-ELISA, joka on kymmenen kertaa herkempi kuin hyytymägeelimenetelmä, edellyttää noin 1/40:a LAL:n määrästä, jota käytetään viimeksi nainitussa menetelmässä.

25 Paitsi LAL-reagenssin vähäistä kulutusta, LAL-reagenssi vaatii hyvin pieniä näytemääriä. 10^1 näytettä on riittävä määrä yhden kokeen suorittamiseen, vastakohtana 100^ul:n näytemäärälle, joka tavallisesti käytetään muissa LAL-kokeissa. Tämä etu voi olla merkittävä tapauksissa, joissa on saatavissa vain hyvin pieni määrä 30 näytettä.

Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän havainnollistamiseksi ilmaista endotoksiinin läsnäolo seeruminäytteessä samalla ilmaisu-rajalla kuin puskuriliuoksessa, lisättiin US?:n vertailu-33 standardina käytettävää endotoksiinia (kts. esimerkki 3) humaani plasmaan, jossa ei ollut L^Orta ja joka oli laimennettu veteen 10-kertaisesti lopulliseksi konscntraatioksi 200 pg/ml. Kontrollina oli endotoksiini pyrogeenittomassa vedessä.

40

3 G

5

Sen jälkeen kun LPS oli lisätty, suoritettiin lämpökäsittely kolmelle eri plasr.anäytteelle vastaavasti 15 ninuutin ajan 65°C:ssa, 10 ninuutin ajan 75°C:ssa sel:ä 5 minuutin ajan 100°C:ssa.

Koe suoritettiin kaksoiskappaleina, suurin piirtein sanalla tavalla kuin kuvataan esimerkissä 3, valmistamalla kunkin plasma- liuoksen, jotka on saatu yllä, lainennusssarjät käyttämällä lai- mentimena yhtäläisesti laimennettua ja kuumennettua plasmaa, jossa 10 ei ollut L?S:ta. Tulokset esitetään kuvassa 7, josta käy ilmi, että o plasman käsittely 75 C:ssa 10 minuutin ajan oli optimi käsittely LPS:n kvantitatiiviseksi määrittämiseksi, Eno.otoksiinittomalla vesikontrol 1 il la saadut A^^-arvct eivät eronneet merkittävästi plasnanäytteillä saaduista arvoista (LAL-3LTG.A:n vaihtelun rajois-15 sa) ilmaisten, että endotoksiinin rajat näissä näytteissä, olivat alle 4 py endotoksiinia/m.l (ilmaisura ja) ja että. plasman väri ja sameus eivät häirinneet LAL-KLISA-määritystä. Saadut tulokset havainnollistavat, ett” esille olevan keksinnön mukainen menetelmä on käyttökelpoinen myös herkkänä menetelmänä kliinisten näytteiden 2C määrittämiseksi endotoksiinin läsnäolon suhteen.

25 Käyttämällä oleellisesti samaa menettelyä kuin kuvataan esimerkissä 1, mutta korvaamalla LAL Tachypleus anebosyytin solunhajoamistuot-teella (TAL) (Tachypelus tridentatus) lähtöaineena, valmistettiin nonoklonaalista vasta-ainetta TAL:n koaguloyeeniä vastaan. Vasta-aine oli reaktiokykyinen esimerkissä 3 kuvatussa LLISA.-testissä.

Liotiini konjugoitiin monoklonaalisen anti-koagulogeenin kanssa, joka oli valmistettu esimerkissä 1 kuvatulla tavalla seuraavasti: 30 1 ml puhdistettua monoklonaalisen vasta-aineen liuosta (1 mg

IcjG/ml) clialysoitiin 100-millinolaarista HaHCO^ia (pH 3,0) vastaan o 4 C:ssa yli yön, ja sitten se sekoitettiin 5yul:n kanssa K-sukkin-imidobiotiinic (40 mc/nl; Sigma Chemical Co.). Huoneenlämpötilassa suoritetun 2 tunnin mittaisen sekoittamisen jälkeen seosta dialy-soitiin PEG:ta vastaan (pH 7,3) 4°C:ssa yli yön. Konjuyaatti lisättiin yhtä suureen tilavuuteen glyserolia (37 t) ja varastoitiin -20°C:ssa.

llä 100 ^1 Tätä konjugaattia ’täytettiin CLISA-nenetelnässä iis tl 35 37 95627 laimennettua, inkuboitua LAL:n seosta ja standardi endotoksiinia (valmistettu esimerkissä 3 esitetyllä tavalla) 96-kanr.ioisen mik-rotiitterilevyn (kUHC, Tanska) kuhunkin kammioon ja inkuboitiin 5 huoneenlämpötilassa yhden tunnin ajan. Hei jän pesun jälkeen, mikä suoritettiin pesupuskurilla esimerkissä 3 kuvatulla tavalla, lisättiin 100 jal monoklonaalisen vasta-aineen biotiinikonjugaattia, joka oli laimennettu 1:2000 lainennuspuskurissa. Yhden tunnin mittaisen inkuboinnin jälkeen levy ^pestiin neljä kertaa. Sitten 10 lisättiin 100^ul avidiini-ΓΤΡ.Γ— konjugaattia (Sigma Chemical Co.), joka oli laimennettu 1:4000 lainennuspuskurissa, ja levyä inkuboi-tiin yhden tunnin ajan. Levy pestiin neljä; kertaa, ja siihen lisättiin lOO^ul substraattiliuosta (esimerkissä 3 kuvatulla tavalla). 10 minuutin mittaisen inkuboinnin jälkeen reaktio 15 pysäytettiin lisäämän£ 150 ^tl 1-molaarista K^SO^:ta. Absorbanssi mitattiin Λ 0:ssa.

ELIKAsaan, jossa käytetään IIRP-monoklonaalista vasta-ainekonjugaattia, sisältyy yksi vaihe vähemmän kuin käytettäessä monoklonaalista 20 vasta-ainebiotiinikonjugaattia (HRP-avidiinin käyttö), mutta oli paljon helpompaa valmistaa biotiini-monoklonaalinen vasta-ainekon jugaatti kuin KRP-monoklonaalinen vasta-ainekonjugaatti. lionjugaatit olivat kestäviä, kun niitä säilytettiin 0°C:n alapuolella. koska 1 mg monoklonaalista vasta-ainetta on riittävä määrä 25 20 000 viisinkertaista testiä varten, monoklonaalisen vasta-aineen käyttö ei tee LAL-CLISA-menetelnää kalliiksi.

Vertailustandardina käytettävän endotoksiinin toimitti Thittaker ".A. Oioproducts, Inc. (10 ng/pullo). Puhdistetun L?S:n (k), joka 30 oli Salmonella minnesotalta, Escherichia coli 0111:B4:lta, Escherichia coli 055:E5:lta, Salmonella abortus equilta, Salmonella typhinuriumilta ja Salmonella enteritidikseltä, toimitti Eifco Laboratories (betroit, Michigan). Erittäin puhtaan LPS:n, joka oli Escherichia coli J5:ltä ja Pseudomonas aeruginosalta, toimitti ys-35 tavallisesti totori Anders Fomsgaard (Infektiosairauksien osasto, Rigshospitalet, käöpenham.ina).

kaikki nämä L?S:t liuotettiin uudelleen ja laimennettiin konsent- o raatioon, joka oli 1 ncj/ml, ja ne jäädytettiin -20 C:ssa ennen 3 95627 käyttö?.. Välittömästi ennen käyttöä valmistettiin LPS:n erilaiset laimennukset endotoksiinittonaan veteen. Kaikki LPS-määritylset suoritettiin kaksoisnäärityksinä, ja arvot olivat keskiarvoja, 5 jollei muutoin ole mainittu.

(1-3)-^-D-glukaani Alcaligenes faecalikselta var. nyxocjenes IFC 13140 (Curdlan, Vako Pure Chemicals Industries, Ltd., Osaka, Japani) valmistettiin endotoksiinittomana, kuten Obayashi et ai.

10 (63) ovat kuvanneet. Väkevöity liuos (1 ng/nl) säilytettiin 4°C:ssa käyttöön saakka.

LAL-ELISA suoritettiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla käyttämällä HRP:n monoklonaalista vasta-ainekonjugaattia.

15

Kuvat C ja ? esittävät kahdeksan puhdistetun LPS:n LAL-SLIG7v-määrityksen käyriä ja (1-3)-^-D-glukaanin käyrää. LPS-käyrillä näyttää olevan jyrkkä kulmakerroin, ja ne ovat yhdensuuntaiset toistensa kanssa, mikä ilmaisee todellista samankaltaisuutta niiden 20 reaktioiden välillä L?iL:n kanssa, vaikka tehossa on suuri ero.

(l-3)-^-D-glukaanin teho oli ainakin 1000 kertaa alhaisempi, ja sen reaktiokäyrän kaltevuus oli vähäisempi kuin LPS:llä, mikä ilmaisi hitaampaa reaktiota LAL:n kanssa.

25 Useiden aineiden, muiden kuin endotoksiinin, on ilmoitettu aiheuttavan positiivisia reaktioita korkeissa konsentraatioissa (60,47). (l-3)-^-P-glukaanin osoitettiin pystyvän reagoimaan LAL:n kanssa konsentraationa 1 ng/m.l, minkä perusteella se on tehokkain aine seuraavaksi endotoksiinin jälkeen (23). Kuitenkin näiden tutkinus-30 ten johtopäätökset ovat usein olleet kyseenalaisia tutkittavan materiaalin endotoksiinikontaninaation vuoksi. Kyseessä olevassa tutkimuksessa (1-3)-^J-L-glukaania tutkittiin LAL-SLISA:n avulla, ja san reaktiokyky oli ainakin 1000 kertaa alhaisempi kuin endotoksiinin. Edelleen, (1-3)-^)-0 glukaani näytti käyttäytyvän tavalla, 35 joka olennaisesti erosi endotoksiinin käyttäytymisestä, mitä todisti sen paljon hitaampi reaktionopeus LAL:n kanssa. Tämä voi olla selitettävissä Uoritu et al.:n (23) havainnon avulla,, jonka mukaan L7>.L:n aktivoituminen (1-3)-^)—D-clukaanilla tapahtuu eri tietä kuin endotoksiinin aktivoituminen. Kahdella tiellä uskotaan li 39 95627 olevan yksi yhteinen vaihe, nimittäin hyytymistä edeltävän entsyymin aktivoituminen. Täten jomman kumman tien aktivoitumisen tuloksena on koagulogcenin pilkkoutuminen ja sen antigeenisuuden 5 häviäminen. LAL-ELISA voi olla käyttökelpoinen työväline tutkittaessa enemmän aineita, jotka pystyvät reagoimaan LAL:n kanssa, koska endotoksiinin ja (l-3)-j0-D-glukaanin reaktiot LAL;n kanssa voivat kineettisesti olla erilaiset.

10 Esimerkki 3

Laskinoveri potilaista, joilla epäiltiin verenmyrkytystä sairaalaan sisään otettaessa, otettiin endotoksiinittoniir. lasiputkiin, jotka sisälsivät hepariir.ia (10 IT/ml verta). Plasma, valmistetuin sentrifucoiden nopeudella 2000 kierrosta minuutissa 15 minuutin 15 ajan, laimennettiin 10-kertaisesti endotoksiinittonaan veteen, ja

Q

sitä kuumennettiin 75 C:ssa 10 minuutin ajan. Tämän jälkeen LAL·-ELISA suoritettiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla, paitsi että LAL liuotettiin uudelleen valmistajan ohjeiden mukaan. LAL-ELI5A:n ilmaisuraja plasman endotoksiineille oli 4 pg endotoksiinia/nl.

20 'Täytteiden endotoksiinikonsentraatiot laskettiin standardikäyrältä ottamalla huomioon lainennustekijä.

Taulukko III esittää, tuloksia, jotka on saatu määrittämällä endotoksiini 10 potilaan plasmanäytteistä. Endotoksiinien tasot 25 näillä vercnmyrkytyspotilailla olivat yleensä matalia, eivätkä ne aina korreloineet veren tai selkäydinnesteen (CSF) bakteeri-viljelmien tulosten kanssa.

Potilaalla no 1 oli gonorreainfektio ja verenmyrkytysepäily sai-30 raalaan sisään otettaessa. TIitään bakteereita ei ollut viljelyssä, mutta verestä löydettiin spesifisen gonorreavasta-aineen merkittävä nousu. Potilaalla no 4 oli veressä gram-positiivisia bakteereita sek" CSE;ta, ja hän kuoli verenm.yrkytyssokkiin 4 vuorokauden kuluttua sairaalaan sisäänottamisesta. Potilaalla no 2 epäiltiin 35 verennyrkytvstä virtsatietulehduksen yhteydessä, ja hänellä oli huomattavaa bakteerivirtsaisuutta. Potilaalla no 9 epäiltiin meningokokkien aiheuttamaa verenmyrkytystä, mutta viljelyssä ei ilmennyt bateereita, koska potilasta oli lääkitty penisilliinillä ennen sairaalaan ottamista.

A.p <5.0 95627

Endotoksiinin hyvin alhaisten määrien läsnäolo verenmyrkytyssotilaiden veressä (taulukko III) ilmaisee erittäin herkän L7vL-testin tarpeen, mielenkiintoista oli, ettei missään normaaleissa plasma-näytteissä havaittu endotoksiinin korkeampia määriä kuin LAL-ELISA:n ilmaisuraja on (4 pg endoroksiinia/ml).

Johtopäätöksenä on, että LAL-ELISA on lupaava LAL-testi endotoksiinin kliiniseen havaitsemiseen testin suuren herkkyyden vuoksi, v-ähenmän plasman aiheuttamia häiriö-itä, LAL-reager.ssin ja koenäyt-teen vähinmäiskulutus, hyvä toistettavuus ja helppo suoritus.

/1 95627

Taulukko III

Endotoksiinin havaitseminen verenmyrkytys-potilaiden plasnanäytteistä

Pot. Kliininen Veri- CSF- LAL-ELISA kuut diayn.

no diagnoos i viljely viljely pg CGE/nl kriteerit 1. Gonorrhoea neg. neg· 200 Kuume, niveltu- lehdus, suoni- tulehdus, ko- konnut GAT' 0 *— · Myeloma- P.aeru- neg. 24 tosis ginosa P «j · Menin- neg M. nenin- 20 liussuonipur- gitis gitidis kautuna ihossa, purulenta verenmyrkytys 4. Menin- S. pneuno- S. pneu- 20 K. pneumoniae gitis niae moniae keuhkoissa purulenta 5. Menin- neg H. men- 8 Hiussuonipur- gitis kautuma ihossa, purulenta verenmyrkytys 6. Febris S. typhosa neg. O typhoidea 7. Menin- M. meningiti- neg. 8 Hiussuonipur- gitis kautuma ihos- purulenta sa, verennyr- kytys p 'j · Meningitis neg. neg. 8 Hiussuonipur- kautuna ihossa, verenmyrkytys \ Seticenia neg. neg. 11 >10 E. co1ia virtsassa 0. Menin neg. M. menin 9 Verenpur- gitis gitidis keutuma ihossa, veren- myrkytys + gonorreavasta-aineen tiitteri 42 95627

Esimerkki 9

Annoksesta riippuva LPS:n inaktivoituminen humaani seerumilla ja plasmalla, Limulus-plasnalla, LA:11a ja polymyksiini E:llä havain-5 nollistettiin LAL-ELISA:n avulla esimerkissä 3 ?;uvatulla tavalla.

Kuhunkin endotoksiinittomaan lasiputkeen lisättiin peräkkäin,,50 ui kutakin koenäytettä (humaani seerumia ja plasmaa, Limulus-plasmaa, LAL:ta ja polymyksiini 3:tä) ja 50pii LPS:ta (E. coli 0111:Π4) 10 vaihtelevasti laimennettuina steriilissä keittosuolaliuoksessa.

o

Kunkin putken sisältö sekoitettiin hyvin ja mkuboitiin 37 C:ssa yhden tunnin ajan. Yllä mainittuja liuoksia laimennettiin ainakin 1000 kertaa endotoksiinittomassa vedessä, jotta saavutettiin LP0:n määritysalue (1 - 100 pg/ml) ja eliminoitiin koenäytteiden mahdol-15 linen häiriö myöhemmässä LAL-testissä. LPS-tähde kvantitoitiin käyttämällä L.AL:ta yhdistettynä koagulogeenin ELISA-määritykseen esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.

Kaikki määritykset suoritettiin itsenäisesti ainakin kaksi kertaa, 20 ja arvot olivat keskiarvoja.

LAL:n reaktio LPS:n kanssa antoi lineaarisen käyrän LPS:n konsent-raation ja absorbanssin välillä, LAL-ELISA:11a määritettynä käyttämällä" monoklonaalista koagulogeenin vasta-ainetta, kuten 25 kuvataan esimerkissä 3. Reaktion inhiboituminen seerumilla oli merkittävä, vieläpä kun seerumnäyte laimennettiin 100-kertaisesti. Kuitenkin inhibitio hävisi kokonaan, kun seerumi laimennettiin enemmän kuin 250-kertaisesti.

30 Kuva 10 esittää annoksesta riippuvaa LPS:n inaktivoitumista humaani seerumin plasmalla, polymyksiini Sillä ja Limulus-plasmalla. Ei havaittu mitään eroa humaani seerumin ja plasman EI7.5Q:n välillä. Limulus-plasmalla näytti olevan merkittävästi suurempi kapasiteetti inaktivoida LPS:ta kuin humaani plasmalla.

35 Känä tulokset ilmaisevat, ett" esimerkissä 3 kuvattua LAL-ELISAia voidaan käyttää tutkittaessa plasmaa sen endotoksiinia inak.tivoivan vaikutuksen suhteen. Plasmaa, jolla havaitaan täten suurempi endotoksiinia neutraloiva vaikutus, voidaan antaa veren-40 li 95627 myrkytyspotilaille edistämään paranemista.

On mahdollista havaita tekijän C aktivoituminen endotoksiinilla 5 valmistamalla puhdistettua tekijä C:tr Hahanuran et ai. (5ä) esittämän julkaisun mukaisesti, i'onoklonaalinen vasta-aine puhdistettua tekijä C:tä vastaan voidaan sitten valmistaa esimerkissä 1 kuvatun menetelmän mukaisesti. Tänä monoklonaalinen vasta-aine voidaan sitten kenjugoida esimerkeissä 1 tai G kuvatulla 10 tavalla ja 'täyttää LAL-TLISA-nenetelnässä, kuten esimerkissä 3 kuvataan.

:va* Tämä menettelytapa vastaa oleellisesti esimerkiss 15 menettelyä, paitsi että tekijän C antigeonisuurlen häviäminen, pikemmin kuin koagulogeeni n, joka määritetään tekijä C:nv, m.uut-tetaan aktiiviseksi tekijä C:ksi reaktiolla endotoksiini:-! kanssa.

Voi olla myös mahdollista aktivoida tekijä G (1-3)-^-D-glukaanilla valmistamalla puhdistettua tekijä G:tä koritan et ai. (23) menetel-20 män mukaisesti ja valmistaa ja kor.jugoida tekijän G monoklonaalista vasta-ainetta esimerkeissä 1 tai 6 kuvatun menetelmän avulla. Konjugoitua monoklonaalista vasta-ainetta voidaan sitten käyttää LAL-ELISA-nenetelnässä esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.

25 Ajatellaan, että kun kerran on valmistettu monoklonaalisia vasta-aineita tekijöitä C ja G vastaan, sanaa solunhajoamistuotetta voidaan käyttää kolmeen eri testiin joissa käytetään tekijää G, tekijää C ja koagulogeeniä solunhajoaniskonponentteina, joiden läsnäolo tai puuttuminen ilmaistaan. Telelleen ajatellaan, että nämä 30 kokeet suoritetaan samalla mikrotiitterilevyllä, mikä nopeuttaa mene teinä*· esimerkiksi verennyrfcytyspot i laiden verenmyrkytyksen syytä määritettäessä.

35

Claims (22)

44 95627

1. Menetelmä endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen aineen määrittämiseksi näytteestä, tunnettu siitä, että a) näytettä inkuboidaan molukkiravun amebosyyttilysaatin tai 5 hemolymfan komponentin tai sen synteettisen analogin kanssa, jolloin mainitun komponentin ominaisuudet muuttuvat, jos näytteessä on läsnä endotoksiinia tai endotoksiinin kaltaista materiaalia, niin että mitään reaktiota ei tapahdu vasta-aineen kanssa, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain 10 mainittua komponenttia tai analogia tai sen immunologista determinanttia vastaan, tai niin että mainitun komponentin tai analogin reaktiotuote näytteeseen sisältyvän endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen aineen kanssa reagoi vasta-aineen kanssa, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain 15 mainittua reaktiotuotetta tai sen immunologista determinanttia vastaan, b) vaiheesta a) saadun mainitun näytteen ja mainitun komponentin tai sen analogin inkuboidun seoksen annetaan reagoida vasta-aineen kanssa, joka on muodostettu tai suunnattu oleelli- 20 sesti vain mainittua komponenttia tai sen analogia tai immunologista determinanttia vastaan, jolloin vasta-aine sidotaan seoksessa läsnäolevaan mainittuun komponenttiin tai sen analogiin, tai vasta-aineen kanssa, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain mainittua reaktiotuotetta tai sen im-25 munologista determinanttia vastaan, jolloin vasta-aine sidotaan johonkin seoksessa läsnä olevaan reaktiotuotteeseen, ja c) määritetään endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen aineen läsnäolo näytteessä ilmaisemalla sidottu vasta-aine reak-tioseoksessa, joka on saatu vaiheesta b), sidotun vasta-aineen 30 laskevien määrien ilmaisun osoittaessa endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen aineen läsnäolon näytteessä, jos vasta-aine on sellainen, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain mainittua komponenttia tai sen analogia tai immunologista determinanttia vastaan, sidotun vasta-aineen li-35 sääntyvien määrien ilmaisun osoittaessa endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin läsnäolon näytteessä, jos vasta-aine on sellainen, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain mainittua reaktiotuotetta tai sen immunolo- II 95627 glsta determinanttia vastaan, edellyttäen että mainittu komponentti tai sen analogi tai mainittu reaktiotuote, joka on läsnä, sen jälkeen kun näytettä on inkuboitu komponentin tai analogin kanssa vaiheessa a), kytketään kiinteään kantaja-aineeseen, tai että mainittu vasta-aine kytketään kiinteään kantaja-aineeseen tai sillan muodostavaan molekyyliin, joka on kytketty kiinteään kantaja-aineeseen, tai että endotoksiini tai endotoksiinin kaltainen materiaali, joka on läsnä näytteessä, kytketään kiinteään kan taja-aineeseen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että molukkiravun amebosyyttilysaatin tai hemolymfan komponentti valitaan koagulaatiotekijän, esim. tekijän B, tekijän C, tekijän G, tekijän N, hyytymistä edeltävän entsyymin, aktivoidun hyytymäentsyymin, anti-LPS-tekijän tai koagulogeenin ja agglutiniinin, esimerkiksi lektiinin, kuten esimerkiksi limu-liinin tai polyhemiinin joukosta, tai että mainitussa näytteessä mainitun komponentin tai analogin reaktion tuote mainitun endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin kanssa valitaan koaguliinin, C-peptidin, aktivoidun hyytymäentsyymin, aktivoidun tekijä B:n, C:n, G:n tai N:n sekä näiden tekijöiden ja hyytymistä edeltävän entsyymin (pro-clotting enzyme) pilkkoutumistuotteiden joukosta.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että endotoksiini tai endotoksiinin kaltainen materiaali valitaan endotoksiinien tai mikro-organismien, kuten esimerkiksi gram-negatiivisten tai gram-positiivisten pinta-antigeenien, sienien, hiivojen ja levien joukosta.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine on monospesifinen vasta-aine, polyklonaalinen vasta-aine, monoklonaalinen vasta-aine tai kahden tai useamman monoklonaalisen vasta-aineen seos.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine on varustettu leimalla, eli valittu entsyymien, fluoresoivien tai kerniluminoivien aineiden, väriä antavien 95627 aineiden, radioaktiivisten isotooppien ja komplekseja muodostavien aineiden joukosta.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine kytketään kiinteään kantaja-aineeseen tai sillan muodostavaan aineeseen, joka on kytketty kiinteään kantaja-aineeseen, ja jokin mainittu komponentti, joka jää jäljelle, sen jälkeen kun näytettä on inkuboitu patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän vaiheessa a) komponentin tai analogin kanssa, sidotaan vasta-aineeseen lisäreaktiota varten lisävas-ta-aineen kanssa.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinteä kantaja-aine on polymeeri tai matriisi, joka on päällystetty polymeerillä.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että a) vasta-aine, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koagulogeeniä tai sen immunologista determinanttia vastaan tai muodostettu tai kohdistettu vain koaguliinia tai C-peptidiä tai sen immunologista determinanttia vastaan, kytketään kiinteään kantaja-aineeseen tai sillan muodostavaan molekyyliin, joka on kytketty kiinteään kantaja-aineeseen, b) inkuboidaan näytettä koagulogeeniä sisältävän materiaalin kanssa koagulogeenin pilkkomiseksi koaguliiniksi ja C-pepti-diksi, jos näytteessä on läsnä endotoksiinia tai endotoksiinin kaltaista ainetta, c) inkuboitu seos, joka on saatu vaiheesta b), lisätään kiinteään kantaja-aineeseen näytteessä läsnäolevan koagulogeenin sitomiseksi, jos vasta-aine, joka on kytketty kiinteään kantaja-aineeseen, on sellainen, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koagulogeeniä tai sen immunologista determinanttia vastaan, tai niin että näytteessä oleva koagu-liini tai C-peptidi sidotaan, jos kiinteään kantaja-aineeseen sidottu vasta-aine on sellainen, että se on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koaguliinia tai C-peptidiä tai niiden immunologista determinanttia vastaan, 95627 d) kiinteään kantaja-aineeseen lisätään leimattu vasta-aine, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koagu-logeeniä tai sen immunologista determinanttia vastaan, kiinteän kantaja-aineen pinnalla sijaitsevan, sidotun koagulogeenin 5 sitomiseksi, tai joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koaguliinia tai C-peptidiä tai niiden immunologista determinanttia vastaan, niin että sidotaan se sidottuun koagu-logeeniin tai sidottuun koaguliiniin tai C-peptidiin, jota on kiinteän kantaja-aineen pinnalla, ja 10 e) näytteen sisältämän endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin läsnäolo määritetään ilmaisemalla vaiheen d) kiinteään kantaja-aineeseen sidottu, leimattu vasta-aine, sidotun vasta-aineen laskevien määrien ilmaisun osoittaessa endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin läsnäoloa 15 näytteessä, jos vasta-aine on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koagulogeeniä tai sen immunologista determinanttia vastaan, ja sidotun vasta-aineen lisääntyvien määrien ilmaisun osoittaessa endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin läsnäoloa näytteessä, jos vasta-aine on 20 muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koaguliinia tai C-peptidiä tai niiden immunologista determinanttia vastaan.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 25 a) inkuboidaan näytettä koagulogeeniä sisältävän materiaalin kanssa, niin että koagulogeeni pilkkoutuu koaguliiniksi ja C-peptidiksi, jos näytteessä on endotoksiinia tai endotoksiinin kaltaista materiaalia, b) vaiheesta a) saatu inkuboitu seos lisätään kiinteään kanta-30 ja-aineeseen seoksessa läsnä olevan koagulogeenin tai koagu- liinin tai C-peptidin sitomiseksi, c) kiinteään kantaja-aineeseen lisätään leimattua vasta-ainetta, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koagulogeeniä tai sen immunologista determinanttia vastaan kiin- 35 teään kantaja-aineeseen sidotun koagulogeenin sitomiseksi, tai joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koaguliinia tai C-peptidiä tai niiden immunologista determinanttia 95627 vastaan, kiinteään kantaja·aineeseen sidotun koaguliinin tai C-peptidin sitomiseksi, ja d) endotoksiini tai endotoksiinin kaltainen materiaali näytteessä määritetään ilmaisemalla vaiheen c) kiinteään kantaja-aineeseen sidotun leimatun vasta-aineen läsnäolo, vasta-aineen laskevien määrien osoittaessa endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin läsnäoloa näytteessä, jos vasta-aine on sellainen, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koagulogeeniä tai sen immunologista determinanttia vastaan, ja sidotun vasta-aineen lisääntyvien määrien ilmaisun osoittaessa endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen aineen läsnäoloa näytteessä, jos vasta-aine on muodostettu tai suunnattu oleellisesti vain koaguliinia tai C-peptidiä tai niiden immunologista determinanttia vastaan.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että a) vasta-aine, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koagulogeeniä tai sen immunologista determinanttia vastaan tai muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koaguliinia tai C-peptidiä tai niiden immunologista determinanttia vastaan, kytketään kiinteiden partikkeleiden pinnalle, b) näytettä inkuboidaan koagulogeeniä sisältävän materiaalin kanssa, niin että koagulogeeni pilkotaan koaguliiniksi ja C-peptidiksi, jos näytteessä on läsnä endotoksiinia tai endotoksiinin kaltaista materiaalia, c) vaiheen b) inkuboitu seos lisätään vaiheen a) vasta-aineeseen kiinteiden partikkeleiden agglutinaation aikaansaamiseksi koagulogeenin läsnäollessa, kun vasta-aine on sellainen, että se on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koagulogeeniä tai sen immunologista determinanttia vastaan, niin että aiheutetaan kiinteiden partikkeleiden agglutinaatio koaguliinin tai C-peptidin läsnäollessa, kun vasta-aine on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koaguliinia tai C-peptidiä tai niiden immunologista determinanttia vastaan, ja d) endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin läsnäolo näytteessä määritetään kiinteiden partikkeleiden, joihin vasta-aine, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti li 95627 vain koagulogeeniä tai sen immunologista determinanttia vastaan, on kytketty, agglutinaation puuttumisen perusteella tai agglutinoimalla kiinteitä partikkeleita, joihin vasta-aine, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain koagu-liinia tai C-peptidiä tai niiden immunologista determinanttia vastaan, on kytketty.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä käytettäväksi tarkoitettu monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että se muodostetaan tai kohdistetaan oleellisesti vain moluk-kiravun amebosyyttilysaatin tai hemolymfan komponenttia tai sen synteettistä analogia tai immunologista determinanttia vastaan, tai joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain molukkiravun amebosyyttilysaatin tai hemolymfan komponentin tai sen synteettisen analogin ja endotoksiinin tai endo-toksiinin kaltaisen materiaalin välistä reaktiotuotetta vastaan, tai mainitun reaktiotuotteen immunologista determinanttia vastaan, kun mainittu vasta-aine on varustettu leimalla.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen vasta-aine, tunnettu siitä, että leima on valittu entsyymien, fluoresoivien tai kemi-luminoivien aineiden, väriä «uitavien aineiden, radioaktiivisten isotooppien ja komplekseja muodostavien aineiden joukosta.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä käytettäväksi tarkoitettu monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että se muodostetaan tai kohdistetaan oleellisesti vain molukkiravun amebosyyttilysaatin tai hemolymfan komponenttia tai sen synteettistä analogia tai immunologista determinanttia vastaan, tai se muodostetaan tai kohdistetaan oleellisesti vain molukkiravun amebosyyttilysaatin tai hemolymfan komponentin tai sen synteettisen analogin ja endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin välistä reaktiotuotetta tai mainitun tuotteen immunologista determinanttia vastaan, mainitun vasta-aineen ollessa kytketty kiinteään kanta-aineeseen tai siihen sidottuun, sillan muodostavaan molekyyliin. 95627

14. Reagenssipakkaus endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin määrittämiseksi näytteessä keksinnön suoritusmuotojen mukaisesti, tunnettu siitä, että reagenssipakkaus sisältää a) vasta-aineen, joka on muodostettu ja kohdistettu oleellisesti vain molukkiravun amebosyytin solunhajoamistuotteen tai hemolymfan komponenttia tai sen synteettistä analogia tai immunologista determinanttia vastaan, tai vasta-aineen, joka on muodostettu tai kohdistettu oleellisesti vain mainitun komponentin tai sen analogin ja endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin tai sen immunologisen determinantin välisen reaktion tuotetta vastaan, ja b) molukkiravun amebosyyttilysaatin tai hemolymfan komponentin tai sen synteettisen analogin, mainitun komponentin tai sen analogin ollessa kytkettynä kiinteään kantaja-aineeseen tai kiinteään kantaja-aineeseen sidottuun, sillan muodostavaan molekyyliin.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen reagenssipakkaus, tunnet-tu siitä, että molukkiravun amebosyyttilysaatin tai hemolymfan komponentti on valittu koagulaatiotekijän, esimerkiksi tekijän B, tekijän C, tekijän G, tekijän N, hyytymistä edeltävän entsyymin, aktivoidun hyytymisentsyymin, anti-LPS-tekijän tai koagulogeenin ja agglutiniinin, esimerkiksi lektiinin, kuten esimerkiksi limuliinin tai polyhemiinin piiristä, tai että mainitun komponentin tai analogin ja mainitussa näytteessä mainitun endotoksiinin tai endotoksiinin kaltaisen materiaalin välisen reaktion tuote valitaan koaguliinin, C-pep-tidin, aktivoidun hyytymisentsyymin, aktivoidun tekijä B:n, C:n, G:n tai N:n tai näiden tekijöiden ja hyytymistä edeltävän entsyymin pilkkoutumistuotteiden piiristä.

16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine, poly-klonaalinen vasta-aine tai kahden tai useamman monoklonaalisen vasta-aineen seos. II 95627

17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että siinä vasta-aine on varustettu leimalla, eli että leima valitaan entsyymien, fluoresoivien tai kemiluminoi-vien aineiden, väriä antavien aineiden, radioaktiivisten isotooppien ja komplekseja muodostavien aineiden piiristä.

18. Patenttivaatimuksen 14 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että reagenssipakkaus sisältää kiinteän kantaja-aineen.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että kiinteä kantaja-aine koostuu polymeeristä tai matriisista, johon polymeeri on sidottu.

20. Patenttivaatimuksen 14 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että se sisältää sekä leimatun että leimaamattoman vasta-aineen.

21. Patenttivaatimuksen 14 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi endotoksiinistandardin.

22. Patenttivaatimuksen 14 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi pyrogeenitonta vettä.