JP5249576B2

JP5249576B2 - エンドトキシンの測定方法及びエンドトキシンの測定用試薬キット

Info

Publication number: JP5249576B2
Application number: JP2007327784A
Authority: JP
Inventors: 克己薮崎
Original assignee: Kowa Co Ltd
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 2007-12-19
Filing date: 2007-12-19
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2027-12-19
Also published as: CA2709828A1; US8211651B2; EP2233927A1; US20110201015A1; EP2233927A4; CN101903776A; JP2009150723A; KR20100101145A; CN101903776B; WO2009078465A1

Description

本発明は、エンドトキシンを検出しまたはその濃度を測定する方法及び、同検出または濃度測定に用いられる試薬キットに関する。

エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在するリポ多糖であり、最も代表的な発熱性物質である。エンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、血液などが人体に入ると、発熱やショックなどの重篤な副作用を惹起するおそれがある。このため、上記の薬剤、器具などは、エンドトキシンにより汚染されることが無いように管理することが義務付けられている。

カブトガニの血球抽出物(以下、「ＬＡＬ : Limulus amoebocyte lysate」ともいう。）の中にはエンドトキシンによって活性化されるセリンプロテアーゼが存在する。そして、ＬＡＬとエンドトキシンとが反応する際には、エンドトキシンの量に応じて活性化されるセリンプロテアーゼによる酵素カスケードによって、ＬＡＬ中に存在するコアギュロゲンがコアギュリンへと水解されて会合し、不溶性のゲルが生成される。

このエンドトキシンの濃度を測定する方法としては、ＬＡＬと混和した試料を静置し、一定時間後に容器を転倒させて、試料の垂れ落ちの有無によりゲル化したかどうかを判定し、試料に一定濃度以上のエンドトキシンが含まれるか否かを調べる半定量的なゲル化法がある。また、エンドトキシンの別の高感度な定量法として、ＬＡＬとエンドトキシンとの反応によるゲルの生成に伴う試料の濁りを経時的に計測して解析する比濁法や、酵素カスケードにより水解されて発色する合成基質を用いる比色法などがある。

上記の定量法のうち比濁法は、低濃度のエンドトキシンを作用させたときには、活性化される酵素が少ないためゲルの生成が検出されるまでに非常に長い反応時間を要する場合があった。一方比色法は、試料の濁り（血脂質など）や混入する色素（溶血によるヘモグロビンなど）の影響を受け易いという不都合があった。これらのことから、特に、救急時における患者の血液中のエンドトキシンの測定や、人工透析時の透析液や血液中のエンドトキシンの測定には、上記の比濁法や比色法は必ずしも最適な方法とは言えなかった。

また、ＬＡＬとエンドトキシンとを混和した試料を攪拌することによりゲル微粒子を早期に生成させるとともに、ゲル微粒子により散乱されるレーザー光の強度からゲル微粒子の大きさと数を解析して、凝集初期のゲル微粒子生成を測定するレーザー光散乱粒子計測法が提案されている。この方法によれば、測定時間を比濁法に比べて約３分の１に短縮でき、且つ、試料の濁りや色の影響を低減できることが報告されている。

しかしながら、上記のレーザー光散乱粒子計測法を用いたとしても、１ＥＵ（エンドトキシンユニット）／Ｌ程度の低濃度のエンドトキシンの測定には４０〜５０分の測定時間を要する。また、レーザー光散乱粒子計測法においては微小空間領域の粒子を観察するため光学系が複雑となり、多検体測定が困難であるという不都合があった。
特許第２６６７６９５号公報

本発明は上述の問題点に鑑みて案出されたものであり、その目的とするところは、試料の濁りや色の影響を受けづらく、迅速且つ簡便なエンドトキシンの検出または濃度測定を
可能とする技術を提供することである。

本発明に係るエンドトキシンの測定方法は以下の点を最大の特徴とする。すなわち、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を、予め準備され薬液中に分散した微粒子の上に吸着または結合させた試薬を作る。そして、この試薬にエンドトキシンを含む試料を作用させることにより、微粒子同士を会合させて早期に大きな凝集塊を生成させ、この凝集塊の生成を検出することでエンドトキシンの測定を行う。

より詳細には、試料中のエンドトキシンを検出しまたは試料中のエンドトキシンの濃度を測定する、エンドトキシンの測定方法であって、
カブトガニの血球の抽出物に含まれる所定の蛋白質を、試薬中に分散可能な微粒子の表面に結合または吸着させ、
前記蛋白質が結合または吸着した前記微粒子が分散した試薬と試料とを混和させ、
前記試薬と前記試料との混和液におけるゲルの生成を検出することでエンドトキシンの検出を行いまたは、前記ゲルの生成の程度を測定することでエンドトキシンの濃度を測定することを特徴とする。

ここで、発明者の鋭意研究によって、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を例えば樹脂製の微粒子の上に結合または吸着させた状態でエンドトキシンを作用させると、ＬＡＬ単体にエンドトキシンを含む試料を作用させた場合と比較して、より大きな凝集塊を早期に生成することが分かってきた。これは、微粒子上のコアギュロゲンがＬＡＬ中の酵素カスケードにより水解されコアギュリンとなり、これらが微粒子同士を会合させることによる。また、この凝集反応は試料の濁りや色の影響を受けづらいこと、さらには、この凝集反応はＬＡＬ単体で惹起される凝集反応よりも、非常に強大であることも明確になってきている。

本発明においては、この現象を利用し、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を微粒子の上に結合または吸着させた試薬を作り、この試薬（以下、「ＬＡＬ試薬」ともいう。）にエンドトキシンを含む試料を作用させることで、微粒子同士を会合させてより大きな凝集塊を早期に生成させ、ＬＡＬ試薬と試料との混和液におけるゲルの生成を促進することとした。これによれば、エンドトキシンの検出または濃度の測定（以下、これらを合わせて「エンドトキシンの測定」ともいう。）において、試料の濁りや色の影響を低減することができ、また、検出または濃度の測定をより迅速且つ簡便にすることができる。

なお、上記において所定の蛋白質は、エンドトキシンと反応してゲルを生成させる特性を有するものであり、少なくともコアギュロゲンを含む。また、セリンプロテアーゼ等の他の蛋白質を含んでいてもよい。また、本発明においてゲルの生成とは、上記の微粒子同士の会合による凝集塊の生成、微粒子に結合または吸着していないコアギュリンが会合することによるゲルの粒子の生成、ＬＡＬ試薬と試料との混和液のゲル化、の少なくともいずれかを含んだ現象を意味している。

また、本発明においてゲルの生成の程度とは、例えば、上記の微粒子同士の会合による凝集塊及び、微粒子に結合または吸着していないコアギュリンが会合することによるゲルの粒子の大きさまたは数の増加を意味する。あるいは、ＬＡＬ試薬と試料との混和液のゲル化に起因する混和液の物理、化学特性（例、濁度）の変化を意味する。

ここで、前記所定の蛋白質は、カブトガニの血球の抽出物から精製されたコアギュロゲンであってもよい。

前述のように、ＬＡＬにエンドトキシンを作用させた際の凝集反応においては、コアギ
ュロゲンがＬＡＬ中の酵素カスケードにより水解されコアギュリンとなり、これらが微粒子同士を会合させる。従って、ＬＡＬ中の蛋白質を予め精製してコアギュロゲンのみを抽出し、微粒子に結合または吸着しておくことで、より効率的に微粒子同士を会合させることが可能となり、より早期に凝集塊を生成させることが可能となる。

また、本発明において、前記所定の蛋白質がセリンプロテアーゼとコアギュロゲンとを含んでいる場合には、前記所定の蛋白質が結合または吸着した前記微粒子が分散した試薬に、試薬の調製過程において該試薬中のセリンプロテアーゼとエンドトキシンとの反応を抑制する抑制剤を添加するようにしてもよい。

ここで、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を微粒子の上に結合または吸着させる際には、まず、蛋白質を結合、吸着することが可能な官能基を微粒子の表面に存在せしめる。そして、その状態でＬＡＬ試薬を作用させて、蛋白質を微粒子表面に化学的に結合させるか、静電的、親水的、疎水的に吸着させる。その際のＬＡＬ中の蛋白質と微粒子の結合、吸着反応は長時間に及ぶため、微粒子や使用する試薬類、水などに微量に混在するエンドトキシンが蛋白質におけるセリンプロテアーゼと反応し、コアギュロゲンをコアギュリンに水解して微粒子の凝集が開始してしまうことが考えられる。そしてこの場合には、酵素の活性化によって試薬中のコアギュロゲンが水解されて消費されてしまうことが考えられる。

これに対し本発明では、前記所定の蛋白質がセリンプロテアーゼとコアギュロゲンとを含んでいる場合に、前記所定の蛋白質が結合または吸着した前記微粒子が分散した試薬に、該試薬中のセリンプロテアーゼとエンドトキシンとの反応を抑制する抑制剤を添加することとした。これにより、試薬の調製過程における微粒子の凝集を抑制するとともに、酵素の活性化によりコアギュロゲンが水解されて消費されるのを抑制することとした。

具体的には前記抑制剤は、エンドトキシンを失活させる作用が知られている鉄イオンやアルミニウムイオンでもよい。また、ＬＡＬ中のセリンプロテアーゼが活性化しないようにする酵素阻害剤であってもよい。

また、本発明においては、前記所定の蛋白質が結合または吸着した前記微粒子が分散した試薬を、さらに、カブトガニの血球の抽出物と混合し、
前記混合と同時または混合後において、前記試薬と前記試料とを混和させるようにしてもよい。

これによれば、蛋白質が結合または吸着した微粒子が分散した試薬に対して、さらにＬＡＬ中の蛋白質を補給しておくことができる。そうすると、エンドトキシンを含有する試料と混和した際に、より確実にエンドトキシンを試薬中のセリンプロテアーゼに作用させ、微粒子上に結合または吸着されたコアギュロゲン及び、混合されたＬＡＬ中のコアギュロゲンを水解してコアギュリンとすることができる。その結果、より確実に、微粒子上に結合または吸着されたコアギュロゲン同士または、微粒子上に結合または吸着されたコアギュロゲンと混合されたＬＡＬ中のコアギュリンとを会合させることができ、微粒子を中心とした凝集塊の生成を促進することができる。これにより、より短時間でのエンドトキシンの測定が可能となる。

また、これによれば、ＬＡＬ中の蛋白質を予め精製してコアギュロゲンのみを抽出し、微粒子に結合または吸着させた場合や、前記試薬の調整過程において試薬中のセリンプロテアーゼとエンドトキシンとの反応を抑制する抑制剤を添加した場合にも有利である。すなわちこれらの場合でも、前記試薬とエンドトキシンを含有する試料とを混和した際に、より確実にエンドトキシンをセリンプロテアーゼに作用させることができる。

なお、上記においては、前記所定の蛋白質が結合または吸着した前記微粒子が分散した試薬を、さらに、カブトガニの血球の抽出物と混合し、その上でエンドトキシンを含有する試料と混和するところ、この混和の時期は、前記血球抽出物との混合の後であってもよいし、混合と同時であってもよい。しかし、試薬中に補給されたコアギュロゲンやセリンプロテアーゼをより均一に分散させておけるという点では、エンドトキシンを含有する試料との混和は、前記試薬と前記血球抽出物との混合時から所定時間が経過した後とするのが望ましい。

また、本発明は、カブトガニの血球の抽出物に含まれる所定の蛋白質を、試薬中に分散可能な微粒子の表面に結合または吸着させて調製されたことを特徴とするエンドトキシンの測定用試薬キットであってもよい。

ここで所定の蛋白質は、エンドトキシンと反応してゲルを生成させる特性を有するものであり、少なくともコアギュロゲンを含む。また、セリンプロテアーゼ等の他の蛋白質を含んでいてもよい。

また、本発明に係るエンドトキシンの測定用試薬キットにおいて、所定の蛋白質は、カブトガニの血球の抽出物から精製されたコアギュロゲンであってもよい。

また、本発明に係るエンドトキシンの測定用試薬キットにおいて、所定の蛋白質は、セリンプロテアーゼとコアギュロゲンとを含んでおり、前記所定の蛋白質が結合または吸着した前記微粒子が分散した試薬には、前記セリンプロテアーゼとエンドトキシンとの反応を抑制する抑制剤がさらに添加されるようにしてもよい。

ここで、カブトガニの血球の抽出物に含まれる所定の蛋白質を、試薬中に分散可能な微粒子の表面に結合または吸着させて試薬キットを調製する際には、上述のように、微粒子や使用する試薬類、水などに微量に混在するエンドトキシンが蛋白質におけるセリンプロテアーゼと反応してしまうことが考えられる。そうすると、試薬の調製過程でコアギュロゲンをコアギュリンに水解して微粒子の凝集が開始してしまい、試薬中のコアギュロゲンが消費されてしまうことも考えられる。

これに対し本発明に係るエンドトキシンの測定用試薬キットにおいては、前記所定の蛋白質がセリンプロテアーゼとコアギュロゲンとを含んでいる場合に、前記所定の蛋白質が結合または吸着した前記微粒子が分散した試薬に、前記セリンプロテアーゼとエンドトキシンとの反応を抑制する抑制剤をさらに添加するようにした。そうすれば、試薬の調製過程における微粒子の凝集を抑制できるとともに、酵素の活性化によりコアギュロゲンが水解されて消費されるのを抑制できる。ここで前記抑制剤は、鉄イオンやアルミニウムイオンでもよいし、酵素阻害剤であってもよい。

また、本発明に係るエンドトキシンの測定用試薬キットにおいては、所定の蛋白質が結合または吸着した微粒子が分散した試薬を、さらに、カブトガニの血球の抽出物と混合して調製されるようにしてもよい。

なお、上記した本発明の課題を解決する手段については、可能なかぎり組み合わせて用いることができる。

本発明にあっては、試料の濁りや色の影響を受けづらく、迅速且つ簡便なエンドトキシンの検出または濃度測定が可能となる。

ＬＡＬとエンドトキシンと反応してゲルが生成される過程はよく調べられている。すなわち、エンドトキシンがＬＡＬ中のセリンプロテアーゼであるＣ因子に結合すると、Ｃ因子は活性化し、活性化したＣ因子はＬＡＬ中の別のセリンプロテアーゼであるＢ因子を水解して活性化させる。この活性化したＢ因子は直ちにＬＡＬ中の凝固酵素の前駆体を水解して凝固酵素とし、さらに、この凝固酵素がＬＡＬ中のコアギュロゲンを水解してコアギュリンを生成する。そして、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成すると考えられている。

この一連の反応は哺乳動物に見られるクリスマス因子やトロンビンなどのセリンプロテアーゼを介したフィブリンゲルの生成過程に類似している。このような酵素カスケード反応はごく少量の活性化因子であっても、その後のカスケードを連鎖して活性化していくために非常に強い増幅作用を有する。従って、ＬＡＬを用いたエンドトキシン測定法によれば、サブピコグラム／ｍＬオーダーのきわめて微量のエンドトキシンを検出することが可能になっている。

エンドトキシンを定量することが可能な測定法としては前述のように比濁法、ならびに、レーザー光散乱粒子計測法が挙げられる。これらの測定法はこのＬＡＬの酵素カスケード反応によって生成されるコアギュリンの会合物を前者は試料の濁りとして、後者は系内に生成されるゲルの微粒子として検出することで、高感度な測定を可能にしている。

しかしながら、比濁法では個々のコアギュリンはナノメータオーダーの微小な粒子であるため、これらが漸次会合していっても、光学的に検出可能な大きさまで成長しないと濁りとして検出できない。また、比濁法においては一般的に試料を静置して系全体におけるゲルの生成を待つので、コアギュリン同士の衝突確率が低く、会合の速度は必ずしも速くない。従って、比濁法を用いた場合には、エンドトキシンの検出または濃度測定が可能なるまでには相当の時間を要するという不都合があった。

それに対して、レーザー光散乱粒子計測法では、系内に生成されたゲルの微粒子を直接測定するため、比濁法よりも高感度であり、且つ、一般的にＬＡＬと検体からなる試料を強制的に攪拌するので、比濁法と比較して短時間でゲルの生成を検出できる。

しかしながら、レーザー光散乱粒子計測法においては、微小空間領域の粒子を観察するため光学系が複雑となり、簡便な装置による測定が困難であるという不都合があった。

また、エンドトキシンの別の測定法として比色法がある。これは、ＬＡＬの酵素カスケード反応を利用しつつも、コアギュリンゲルによる試料の濁りを測定するのではなく、凝固酵素により水解を受け発色する合成基質を利用して、合成基質を含んだＬＡＬと検体とを反応させ、その吸光度変化を測定する方法である。この比色法においては、系内に生成されていく発色物質の濃度を測定するので、試料におけるゲルの生成を測定する比濁法やレーザー光散乱粒子計測法と比べると、短時間で低濃度のエンドトキシンを測定することができる。

しかしながら、発色合成基質は４０５〜４１０ｎｍ付近に吸光のピークがあるところ、この波長は溶血に伴う試料中に混入するヘモグロビンの吸光のピーク（４１０ｎｍ）と重複する。また、血液中の乳びなどの白色散乱体は光の波長が短いほどよく散乱するため、発色合成基質の吸光のピークがある可視光領域でも最も短波長側（紫）の光は特に白色散乱体の影響を受け易い。このように、比色法においては測定時間を極めて短時間にすることができるが、その一方で、血液を主とする検体での測定については精度の点で問題がある。

本発明では、試料の濁りや色の測定に対する影響を低減することを目的の１つとしている。従って、比色法のような発色合成基質を使う方法ではなく、ＬＡＬの酵素カスケードによるコアギュリンの生成過程を利用することとした。さらに、比濁法に類似しながらもレーザー光散乱粒子計測法よりもさらに短時間で測定可能で且つ、装置構成が容易な測定手法の確立を目的の一つとしている。従って、ＬＡＬの酵素カスケードにより惹起されるコアギュロゲンからコアギュリンへの水解及び漸次的な凝集過程を、受動的に待つ方法は利用しないこととした。

以下に図面を参照して、この発明を実施するための最良の形態を例示的に詳しく説明する。

本実施例においては、予め、比濁法あるいは、レーザー光散乱粒子計測法で検出され得るか、検出され得る限界より若干小さいサイズの微粒子の表面にコアギュロゲンを結合させておく。そして、これをＬＡＬ試薬と混合して調製した試薬に、エンドトキシンを含有する試料を混和する。これにより、ＬＡＬ中に生成されるコアギュリンと微粒子上に生成されるコアギュリンとを会合させ、また、微粒子上に生成されるコアギュリン同士を会合させて、短時間で、比濁法あるいは、レーザー光散乱粒子計測法で検出可能なサイズの凝集塊を生成する。その結果、比濁法あるいは、レーザー光散乱粒子計測法によって、より迅速にエンドトキシンの測定を行うことができる。

図１には、本実施例による微粒子の凝集メカニズムを示した。図１において中央の矢印の左側はエンドトキシンと反応する前の試薬の模式図である。矢印の右側はエンドトキシンと反応した後の試薬の模式図である。

図１に示すとおり、反応前は、本実施例における微粒子であるビーズ１と、微粒子の表面に結合されたコアギュロゲン２と、微粒子の表面に結合されていないコアギュロゲン３とが分散した状態である。なお、以下において便宜上、ビーズ１にコアギュロゲン２を結合させた状態の微粒子をＬＡＬ結合ビーズ１０と呼ぶことにする。

コアギュロゲン２を結合させる担体となるビーズ１には、ＬＡＬ中の蛋白質に含まれるコアギュロゲン２を吸着、担持あるいは結合でき、反応系内に均一に分散可能であり、且つ、エンドトキシンによるゲル生成過程を妨げたり亢進したりしないものが選定される。ビーズ１の素材は特に限定されるものではないが、ポリスチレンラテックス樹脂、シリカ、シリコン樹脂、セルロース樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ハイドロキシアパタイトなどが例示でき、ポリスチレンラテックス樹脂、シリカ、セルロース樹脂が望ましい。

ビーズ１の大きさは、凝集により早期に光学的に検出可能となる条件と、調製時のハンドリングの容易さ、系内への分散のし易さなどから、０．０５μｍから５０μｍの範囲であるものが用いられる。そして、０．１μｍから３０μｍの範囲であることがさらに望ましい。ビーズ１の表面にコアギュロゲン２を結合させるには、静電的、親水的、あるいは、疎水的にコアギュロゲン２を吸着させる方法と、化学的に結合させる方法とが考えられる。

コアギュロゲン２をビーズ１に静電的、親水的、あるいは疎水的に吸着させるには、ビーズ１の表面には、コアギュロゲン２を担持することを可能とする官能基を存在させる必要がある。このような官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、リン酸基、水酸基、スルホン酸基、チオール基、アルコール基、アルキル基などを挙げることができる。

一方、化学的にビーズ１表面にコアギュロゲン２を結合させる場合、コアギュロゲン２の側鎖中に含まれるアミノ基、カルボキシル基、チオール基などと化学的に結合しうる官能基を存在させる必要がある。このような官能基としては、カルボキシル基、アミノ基、ビニル基、エポキシ基、スチリル基、メタクリロキシ基、アクリロキシ基、ウレイド基、チオール基、スルフィド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基などを挙げることができる。

これらの官能基を表面に有するポリスチレンラテックス樹脂、シリカ、シリコン樹脂、セルロース樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ハイドロキシアパタイトなどのビーズ１にＬＡＬ試薬あるいは、ＬＡＬ試薬などから調製、精製したコアギュロゲンを作用させる。これにより、静電的、親水的、あるいは疎水的にビーズ１の表面にコアギュロゲン２を吸着、担持させる。または、ビーズ１上の反応性官能基とコアギュロゲン２とを、コアギュロゲン２中のアミノ基、カルボキシル基、あるいは、チオール基などを介して化学的に結合させる。このことによってＬＡＬ結合ビーズ１０を調製することができる。

このときの反応温度ならびに反応時間は、吸着、担持を行うのか、あるいは、化学結合を行うのかにもよるが、反応温度は０℃から４５℃が望ましく、４℃から３７℃がさらに望ましい。また、反応時間は１０分から６４時間が望ましく、２時間から２４時間がさらに望ましい。また、反応の際には均一な反応が起こるように、試料をよく攪拌することが望ましい。

なお、ビーズ１上にコアギュロゲン２を吸着、担持、結合させる際には、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を選別することなくビーズ１に吸着、担持、結合させてもよいし、ＬＡＬ中のコアギュロゲンを精製して吸着、担持、結合させてもよい。ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を選別することなく微粒子に吸着、担持、結合させる方法をとった場合には、ビーズ１上にコアギュロゲン２以外の蛋白質も吸着、担持、結合されるが、ＬＡＬ中のコアギュロゲンを精製する工程を省略することができるので試薬の調製、精製に係るコストを低減することができる。なお、その場合には、図１において、ビーズ１上及び、ビーズ１の周囲の試薬中にコアギュロゲン２、３以外に、ＬＡＬ中に含まれる他の蛋白質（不図示）がより多く存在することとなる。

ところで、上記において、コアギュロゲンまたはＬＡＬ中の蛋白質とビーズ１との吸着、担持、結合に係る反応は長時間に及ぶ。従って、ビーズ１自身や使用する試薬類、水などにエンドトキシンが微量にでも混入していた場合に、試薬が完成する前に混入したエンドトキシンにより活性化した凝固酵素がコアギュロゲンを水解させてコアギュリンを生成せしめ、系内で凝集させてしまうことが考えられる。これを抑制するために、反応系内にエンドトキシンを失活させる作用が知られている鉄イオンやアルミニウムイオンを添加してもよい。この際に添加する鉄イオンやアルミニウムイオンの濃度は１００ｍＭ以下となることが望ましい。

また、ＬＡＬ中のセリンプロテアーゼが活性化しないようにするために、各種の酵素阻害剤を添加してもよい。この酵素阻害剤としては、Diisopropylfluorophosphate、Benzamidine、Phenylmethanesulfonyl fluoride、4-(2-Aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride、6-Amidino-2-naphthyl-4-guanidinobenzoatedimethanesulfonate、p-Amidinophenylmethylsulfonyl fluoride、Aprotinin、Antipain、Leupeptin、Ecotin、PPACK(Phe-Pro-Arg-chloromethylketone)、α2-Macroglobulin、Trypsin inhibitorなどを例示することができる。これらの酵素阻害剤の濃度は１００ｍＭ以下にするとよい。そして、２０ｍＭ以下がさらに望ましい。

この状態においてＬＡＬ結合ビーズ１０同士は、完全に独立して分散されていてもよい
。また、吸着、担持あるいは化学結合の作用により、ＬＡＬ結合ビーズ１０の一部あるいは全てにおいて、複数のビーズが架橋されていてもよい。このようにして調製されたＬＡＬ結合ビーズ１０は、その後、ビーズ１に結合していない過剰のＬＡＬ中の蛋白質あるいはコアギュロゲン、さらには、鉄イオン、アルミニウムイオンや酵素阻害剤などの添加物を除去する目的で、エンドトキシンを含まない精製水、あるいは、生理食塩水などで洗浄される。そして、最終的には使用目的に合った濃度になるようにこれらの精製水、あるいは、生理食塩水などに再懸濁させて使用に供する。以下、この状態の試薬をＬＡＬ結合ビーズ試薬という。

次に、本実施例におけるＬＡＬ結合ビーズ試薬による実際のエンドトキシンの検出または濃度測定について述べる。本実施例においては、上記のＬＡＬ結合ビーズ試薬に対して、ＬＡＬ試薬をさらに混合し、混合後の試薬と、エンドトキシンを含有する検体試料とを混和させる場合について説明する。なお、以下の説明においては、上記のＬＡＬ結合ビーズ試薬の調製時には、酵素阻害剤が添加されていることを前提とする。

ここで、上記のように、ＬＡＬ結合ビーズ試薬の調製段階においては、ビーズ１に結合していない過剰のＬＡＬ中の蛋白質、あるいは、ＬＡＬ中蛋白質から精製されたコアギュロゲン３は洗浄により除去される。また、ビーズ１に吸着、担持、結合したセリンプロテアーゼは、酵素阻害剤の添加により不可逆的に阻害されている。従って、この状態のＬＡＬ結合ビーズ試薬を単独でエンドトキシンを含有する試料と混和してもＬＡＬ結合ビーズ１０の凝集は期待できない。

そこで、本実施例においては、ＬＡＬ結合ビーズ試薬をさらにＬＡＬ試薬と混合した上で、エンドトキシンを含有する試料と混和し、ＬＡＬ結合ビーズ１０を凝集させることとした。これによれば、セリンプロテアーゼをはじめとするＬＡＬ中の蛋白質の各成分をＬＡＬ結合ビーズ試薬中に補給することができる。そうすると、エンドトキシンを含有する試料と混和した際に、より確実にエンドトキシンを試薬中のセリンプロテアーゼに作用させることができ、より確実にコアギュロゲンを水解してコアギュリンを生成することができる。その結果、より確実にＬＡＬ結合ビーズ１０を凝集させ、迅速なエンドトキシンの測定を行うことが可能となる。

また、この場合には、補給したＬＡＬ試薬中にもコアギュロゲンが含まれているため、補給したＬＡＬ試薬中のコアギュロゲンに由来するコアギュリンを介して、ＬＡＬ結合ビーズ１０の凝集が促進される効果も期待できる。

また、本実施例においては、ＬＡＬ結合ビーズ１０上のセリンプロテアーゼが失活していても、混合させるＬＡＬ試薬中に過剰のセリンプロテアーゼが存在するので、ＬＡＬ結合ビーズ試薬を調製する際には不可逆的で且つ、強い作用のある酵素阻害剤を用いても構わない。

上記のように調製されたＬＡＬ結合ビーズ試薬は、測定の利便性を図るために、規定量のＬＡＬ結合ビーズ試薬を凍結乾燥させて、検体試料を加えるだけで測定が可能になるような調製を行なってもよい。また、この場合には、凍結乾燥させたＬＡＬ試薬と同様に凍結乾燥させたＬＡＬ結合ビーズ試薬とを任意の比率で混合するか、ＬＡＬ結合ビーズ試薬とＬＡＬ試薬を任意の比率で混合させた後に凍結乾燥させるかしてもよい。

(製造例１)
次に、カルボキシル基をビーズ表面に有するポリスチレンラテックス粒子とＬＡＬ試薬を不可逆的な酵素阻害剤を作用させた環境下で結合させたＬＡＬ結合ビーズ試薬の実際の製造例について説明する。カルボキシル基を表面に有するビーズ１としては、Polyscienc
e社製の粒径０．４５μｍ、あるいは、１．０μｍのPolybead Calboxylate Microsphere（以下「ＰＣＭ」と略す。）を用いた。

ＬＡＬ試薬としては、和光純薬製のエンドトキシン検出試薬であるリムルスＨＳ−Ｔシングルテストワコー（以下「ＬＡＬ試薬」と略す。）を用いた。１．０ｍＬのＰＣＭを最大容量２．０ｍＬの遠心管に入れて、さらにｐＨ９．６の０．１Ｍ炭酸バッファを最大容量まで加えてよく混合した後、卓上遠心器で１２５００ｒｐｍにて５分間遠心してＰＣＭを沈殿させて上澄みを除去した。この炭酸バッファとの混和、遠心、上澄みの除去といった一連の作業をさらに２回繰り返し、次に、沈殿させたＰＣＭにｐＨ４．５の０．０２Ｍのリン酸バッファを最大容量まで加えて混和させた後、同様に遠心、上澄みの除去という操作を合計３回行なった。

得られたＰＣＭの沈殿物にここで使用したリン酸バッファを０．７５ｍＬ加え、さらに、０．７５ｍＬの２．０％カルボジイミド水溶液（水溶性カルボジイミド、同仁化学製）を加えて、室温で３時間転倒攪拌法を用いて攪拌してＰＣＭ上のカルボキシル基を活性化させた。反応後のＰＣＭは遠心して上澄みを除去した後、再び、同様にリン酸バッファで３回洗浄し、最後に得られたＰＣＭの沈殿物にｐＨ８．５の０．２Ｍホウ酸バッファ０．５ｍＬを加えて懸濁させ、次に、ＬＡＬ試薬にホウ酸バッファを０．２５ｍＬ加えて溶解させたＬＡＬ試薬溶液を２本用意し、これらとＰＣＭ懸濁液を混合して容量を１．０ｍＬとした。さらに、これにセリンプロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦ（Phenylmethanesulfonyl fluoride）を最終濃度で４ｍＭになるように加えた。混合溶液中のＰＣＭ上にある活性化したカルボキシル基とＬＡＬ中の各蛋白質が持つアミノ基がアミド結合するように室温で２時間反応させた後に、４℃で一晩反応させた。

混合溶液を遠心して上澄みを除去した後、１．２ｍＬのホウ酸バッファに再懸濁させ、さらに、この溶液に０．２５Ｍの２−アミノエタノール／ホウ酸バッファを５０μＬ加えて室温で３０分転倒攪拌させて、ＰＣＭ上の未反応の活性化カルボキシル基をアミノエタノールで消費した。最後に、ＰＣＭ懸濁液を遠心してＰＣＭ沈殿物を得た後に注射用生理食塩水（大塚製薬製）で再懸濁、遠心、上澄みの除去による一連の操作で合計３回洗浄してＬＡＬ結合ビーズ試薬を得た。

（測定例１）
次に、上記の製造例１で得られたＬＡＬ結合ビーズ試薬を実際に使用した測定例１について説明する。製造例１で得られたＬＡＬ結合ビーズ試薬を１０ｍＬになるように注射用生理食塩水に懸濁させた。種々の量のＬＡＬ結合ビーズ懸濁液を注射用水（大塚製薬製）と混合して１００μＬとした。これをさらに、ＬＡＬ試薬（リムルスＨＳ−Ｔシングルテストワコー）と混合し、さらに、２ＥＵ／Ｌの濃度のエンドトキシン水溶液を１００μＬ加えた。この合計２００μＬの混和液を、外径７ｍｍで内部にマグネチックスターラーバーを内在し、且つ、乾熱滅菌（２５０℃、５時間）処理したガラス製測定キュベットに移し、試料を攪拌しながら経時的な濁度変化を記録することが可能な血小板凝集測定装置ＰＡ−２００（興和製）でＬＡＬ結合ビーズ１０の凝集に伴う透過光強度の時間変化を記録した。

図２には、上記の測定によって得られた透過光強度の時間変化を示す。図２において横軸は時間、縦軸は混和液の透過光強度である。図２においては、記録したデータの攪拌開始から５分後の透過光強度を１００％として、ＬＡＬ結合ビーズ１０の添加量が異なる場合の各試料の透過光強度の変化が示されている。図２によれば、添加したＬＡＬ結合ビーズ１０の量が多いほど、変化量を大きくすることができ、且つ、凝集の開始時間を早くできることが判る。

ここで、本実施例におけるＬＡＬ結合ビーズ試薬をエンドトキシンの検出に使用する場合には、例えば図２における透過光強度が所定値に達したことをもって、試料がエンドトキシンを含んでいると判断するようにしてもよい。その場合には、本実施例によれば、添加したＬＡＬ結合ビーズ１０の量が多いほど、エンドトキシンの検出に要する時間を短くすることができる。ここで、図２における透過光強度が所定値に達したことをもって、試料がエンドトキシンを含んでいると判断することは、混和液におけるゲルの生成を検出することでエンドトキシンの検出を行うことに相当する。

（測定例２）
次に、製造例１で得られたＬＡＬ結合ビーズ試薬を使用した別の測定例について説明する。本測定においては、製造例１で得られたＬＡＬ結合ビーズ試薬を２０ｍＬになるように注射用生理食塩水に懸濁させた。これから、１００μＬをとり、ＬＡＬ試薬に混合させ、さらに、種々の濃度のエンドトキシンを含有する水溶液１００μＬと混和させて合計容量を２００μＬとした。そして、上記の測定例１と同様に攪拌開始５分後の透過光強度を１００％とした透過光強度変化を各試料について記録した。

図３には、本測定によって得られた透過光強度の時間変化を示す。図３において横軸は時間、縦軸は混和液の透過光強度である。図３に示したように、試料のエンドトキシンの添加濃度が高いほど、透過光強度の立ち上がりが急峻となり、凝集開始時間が短くなった。すなわち、本実施例におけるＬＡＬ結合ビーズ試薬をエンドトキシンの濃度測定に使用する場合には、例えば図３において透過光強度が所定値に達するまでに要した時間（凝集開始時間）に基づいて濃度測定を行うことができる。また、このことは、本発明において、ゲルの生成の程度を測定することでエンドトキシンの濃度を測定することに相当する。

次に、このときに得られたエンドトキシンの濃度と凝集開始時間との関係を、ＬＡＬ結合ビーズ１０を用いなかった場合にレーザー光散乱粒子計測法において得られたエンドトキシンの濃度と凝集開始時間との関係と比較した。図４には比較結果を示す。図４に示したように、ＬＡＬ結合ビーズ１０を用いた場合（図４においては簡単のため「ＬＡＬ結合ビーズ法」と記載した。）には、比濁法を用いたにも拘らず、レーザー光散乱粒子計測法を用いた場合よりも凝集開始時間が短くなっている。これにより、ＬＡＬ結合ビーズ１０を用いることによって、レーザー光散乱粒子計測法を用いた場合よりもさらに迅速にエンドトキシンの検出が可能であることが分かる。

なお、本実施例における製造例１では、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を選別することなくビーズ１に結合させてＬＡＬ結合ビーズ試薬を調製している。しかし、本実施例のように、ＬＡＬ結合ビーズ試薬をさらにＬＡＬ試薬と混合した上で、エンドトキシンを含有する試料と混和し、ＬＡＬ結合ビーズ１０を凝集させる場合には、ＬＡＬ結合ビーズ１０を形成するビーズ１上にはなるべく多くのコアギュロゲンが吸着、担持、結合していることが望ましい。従って、ＬＡＬ結合ビーズ１０を生成する際には、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を選別することなくビーズ１に結合させるよりもむしろ、精製したコアギュロゲンをビーズ１に吸着、担持、結合させるようにしてもよい。

また、本実施例のように、ＬＡＬ中の各蛋白質を選定することなくビーズ１に吸着、担持、結合させてＬＡＬ結合ビーズ試薬を調製する場合には、酵素阻害剤を少なくとも１種類以上、ならびに、エンドトキシン自体の機能を減衰させる作用を持つ鉄イオン、あるいはアルミニウムイオンを少なくとも１種類以上を共存させて、コアギュロゲンがコアギュリンに加水分解されないように調製してもよい。また、鉄イオン、あるいはアルミニウムイオンを少なくとも１種類以上を単独で添加しても構わない。

また、上記の実施例においては、ＬＡＬ結合ビーズ試薬をＬＡＬ試薬と混合し、さらに
エンドトキシン水溶液と混和して、混和液を攪拌しながら経時的な濁度変化を測定したが、混和液の攪拌は必ずしも必要ではない。混和液を攪拌せずに静置しながら経時的な濁度変化を測定することによっても、ＬＡＬ結合ビーズ試薬を用いることによって、迅速なエンドトキシンの測定が期待できる。

また、上記の実施例においては、ＬＡＬ結合ビーズ試薬をＬＡＬ試薬と混合し、さらにエンドトキシン水溶液を混和して、混和液を攪拌しながらレーザー光散乱粒子計測法によってゲルの生成（ＬＡＬ結合ビーズ１０同士の会合による凝集塊の生成）を測定してもよい。そうすれば、ＬＡＬ結合ビーズ法とレーザー光散乱粒子計測法との相乗効果により、さらに迅速にエンドトキシンの測定を行うことが期待できる。

次に、本発明における実施例２について説明する。本実施例においては、ＬＡＬ結合ビーズ試薬を単独でエンドトキシンを含有する検体試料と混和して使用する例について説明する。

ＬＡＬ結合ビーズ試薬を単独でエンドトキシンを含有する検体試料と混合して使用する場合には、ＬＡＬ結合ビーズ試薬とＬＡＬ試薬との混合という工程を省略できるので、より簡便にエンドトキシンの測定を行うことが可能である。一方でこの場合には、ＬＡＬ結合ビーズ試薬に対してＬＡＬ試薬をさらに加えることができないので、ＬＡＬ結合ビーズ試薬に対してＬＡＬ中の蛋白質を補給することができない。

従って、この場合には、ＬＡＬ結合ビーズ１０には、コアギュロゲン及び、セリンプロテアーゼの両方が吸着、担持、結合していることが望ましい。そうすることで、ＬＡＬ結合ビーズ試薬をさらにＬＡＬ試薬と混合しなくても、ＬＡＬ結合ビーズ試薬単体をエンドトキシンを含有する試料と混和させることにより、エンドトキシンをＬＡＬ結合ビーズ試薬に含有されるセリンプロテアーゼに作用させることができる。これによって、ＬＡＬ結合ビーズ試薬に含有されるコアギュロゲンをコアギュリンに水解することができ、その結果、ＬＡＬ結合ビーズ試薬中のＬＡＬ結合ビーズ１０同士を会合させて早期に凝集させることが可能となる。

このように本実施例では、ＬＡＬ結合ビーズ試薬の調製時において、ビーズ１の表面には精製されたコアギュロゲンのみを吸着、担持、結合させるのではなく、ＬＡＬ中の各蛋白質をビーズ１の表面に吸着、担持、結合させることが望ましい。

次に、本実施例において、ビーズ１に対してコアギュロゲン及び、セリンプロテアーゼをはじめとするＬＡＬ中の蛋白質のコアギュロゲン以外の各成分が結合している場合について考える。このような場合でも本実施例において、ＬＡＬ結合ビーズ試薬の調製過程で、セリンプロテアーゼの活性が添加した酵素阻害剤により不可逆的に阻害されているような状態では、ＬＡＬ結合ビーズ試薬をエンドトキシンを含有する試料と混和してもＬＡＬ結合ビーズ１０の凝集を期待できない。

従って、本実施例においては、酵素機能が不可逆的に阻害されたり、あるいは、失活したりしないような酵素阻害剤の選定や調製法をとることが望まれる。例えば、ＬＡＬ結合ビーズ試薬の調製過程において、エンドトキシンの作用を減弱させるために過剰量の鉄イオンやアルミニウムイオンを添加して、酵素機能を阻害することなくコアギュロゲンがコアギュリンに加水分解されるのを防いでもよい。また、例えばＬＡＬ結合ビーズ試薬の調製過程において、不可逆的でない酵素阻害剤（可逆性阻害剤）によってセリンプロテアーゼの活性を阻害するようにしてもよい。この場合は、洗浄により酵素の失活が解除される可能性がある。

これによれば、ビーズ１上に吸着、担持、結合されたＬＡＬ中蛋白質の酵素機能が不可逆的に阻害されたり、あるいは、失活したりすることを抑制できる。その結果、ＬＡＬ結合ビーズ試薬にさらにＬＡＬ試薬を混合しなくても、エンドトキシンを含有する試料と混和することで、エンドトキシンの高感度な測定を行うことができる。

なお、上記の実施例において調製されたＬＡＬ結合ビーズ試薬は、本発明におけるエンドトキシンの測定用試薬キットに相当する。

本発明の実施例におけるＬＡＬ結合ビーズの凝集メカニズムについて説明するための図である。本発明におけるＬＡＬ結合ビーズ試薬を、エンドトキシンを含む試料と混和させた場合の、ＬＡＬ結合ビーズの量と混和液の透過光強度の変化との関係を説明するためのグラフである。本発明におけるＬＡＬ結合ビーズ試薬を、エンドトキシンを含む試料と混和させた場合の、エンドトキシンの濃度と混和液の透過光強度の変化との関係を説明するためのグラフである。ＬＡＬ結合ビーズ法を用いた場合とレーザー光散乱粒子計測法を用いた場合の、ＬＡＬ中の蛋白質とエンドトキシンとの反応における、エンドトキシン濃度とゲル凝集開始時間との関係を比較するためのグラフである。

符号の説明

１・・・ビーズ
２・・・コアギュロゲン
３・・・コアギュロゲン
１０・・・ＬＡＬ結合ビーズ

Claims

試料中のエンドトキシンを検出しまたは試料中のエンドトキシンの濃度を測定する、エンドトキシンの測定方法であって、
カブトガニの血球の抽出物に含まれる所定の蛋白質を、試薬中に分散可能な微粒子の表面に結合または吸着させ、
前記蛋白質が結合または吸着した前記微粒子が分散した試薬と試料とを混和させ、
前記試薬と前記試料との混和液におけるゲルの生成を検出することでエンドトキシンの検出を行いまたは、前記ゲルの生成の程度を測定することでエンドトキシンの濃度を測定することを特徴とするエンドトキシンの測定方法。
前記所定の蛋白質は、カブトガニの血球の抽出物から精製されたコアギュロゲンであることを特徴とする請求項１に記載のエンドトキシンの測定方法。
前記所定の蛋白質が結合または吸着した前記微粒子が分散した試薬を、さらに、カブトガニの血球の抽出物と混合し、
前記混合と同時または混合後において、前記試薬と前記試料とを混和させることを特徴とする請求項１または２に記載のエンドトキシンの測定方法。
カブトガニの血球の抽出物に含まれる所定の蛋白質を、試薬中に分散可能な微粒子の表面に結合または吸着させて調製されたことを特徴とするエンドトキシンの測定用試薬キット。
前記所定の蛋白質は、カブトガニの血球の抽出物から精製されたコアギュロゲンであることを特徴とする請求項４に記載のエンドトキシンの測定用試薬キット。
前記所定の蛋白質は、セリンプロテアーゼとコアギュロゲンとを含み、
前記所定の蛋白質が結合または吸着した前記微粒子が分散した試薬に、前記セリンプロテアーゼとエンドトキシンとの反応を抑制する抑制剤がさらに添加されたことを特徴とする請求項４に記載のエンドトキシンの測定用試薬キット。
前記所定の蛋白質が結合または吸着した前記微粒子が分散した試薬を、さらに、カブトガニの血球の抽出物と混合して調製されたことを特徴とする請求項４から６のいずれか１項に記載のエンドトキシンの測定用試薬キット。