JP5629306B2 - 生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定用試薬キット - Google Patents
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Description
前記蛋白質が吸着した前記微粒子が分散した試薬と試料とを混和させ、
前記試薬と前記試料との混和液におけるゲルの生成を検出することで、前記試料中に存在する生物由来の生理活性物質の検出を行いまたは、前記ゲルの生成の程度を測定することで前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記微粒子は無機性の素材で形成されたことを特徴とする。
前記混合と同時または混合後において、前記試薬と前記試料とを混和させるようにしてもよい。
まず、比較製造例として、カルボキシル基をビーズ表面に有するポリスチレンラテックス粒子とLAL試薬とを不可逆的な酵素阻害剤を作用させた環境下で結合させたLAL結合ビーズ試薬の製造例について説明する。具体的には、カルボキシル基を表面に有するビーズ1として、Polyscience社製の粒径0.45μm、あるいは、1.0μmのPolybead Calboxylate Microsphere(以下「PCM」と略す。)を用いた。
デンカ製の球状アルミナ粒子ASFP−20(平均粒径0.3μm)を、念のため乾熱処理(250℃、3時間)し、コンタミしているエンドトキシンを熱により不活性化した。球状アルミナ粒子は、高温で乾熱滅菌することが可能なので、この段階においてもエンドトキシンをより完全に不活性化することができる。
アエロジル社製アルミナ粒子ALuC(1次粒子粒径0.03μm)を乾熱処理(250℃、3時間)し、コンタミしているエンドトキシンを熱により不活性化した。次に、粒子を10mg/mLの濃度になるように注射用蒸留水に分散させ、3000rpmで1分間遠心し、ダマになっている粒子や大粒径の粒子を遠沈して除去した。次に、微粒子の分散液を2倍に注射用蒸留水で希釈し、リムルス試薬(和光純薬、HS−T)1本に対して100μLになるように加えてリムルス試薬を溶解させた。
光透過率測定法ではφ6mm、長さ50mmのガラス製で、試料を攪拌するためのステンレス製の攪拌子(φ0.75mm、長さ3.5mm)を内在した専用の容器を、一方、レーザー散乱粒子計測法では、φ7mm、長さ50mmのガラス製で、試料を攪拌するためのステンレス製の攪拌子(φ1mm、長さ5mmを)を内在した専用の容器を使用した。これらの容器をガラス容器の開口部をアルミ箔で覆い、さらに、20本ずつアルミ箔で小分けに梱包したものを鉄製の乾熱処理缶に詰め、250℃で3時間加熱処理して、エンドトキシンを不活性化した。
エンドトキシン希釈系列(2、0.2、0.02、0.002、0.0002EU/mLになるように注射用蒸留水で希釈して調製)50μLを製造例3で製造した測定用ガラス容器(φ6mm)に入れた。次に、リムルス試薬(和光純薬製ES−II)を製造例1で製造したLAL結合ビーズ試薬100μLで溶解させ、そのうちの50μLを上記のエンドトキシン希釈水が入ったガラス容器に移注し、攪拌比濁型エンドトキシン測定装置(EX−100、興和)を用いて測定を行った。また、同時にリムルス試薬をLAL結合ビーズ試薬ではなく、注射用蒸留水100μLで溶解させ、そのうちの50μLをエンドトキシン希釈水が入ったガラス容器に移注し、同様に測定を行った。
エンドトキシン希釈系列(2、0.2、0.02、0.002、0.0002EU/mLになるように注射用蒸留水で希釈して調製)100μLを製造例3で製造した測定用ガラス容器(φ7mm)に入れた。次に、リムルス試薬(和光純薬製ES−II)を製造例1で製造したLAL結合ビーズ懸濁液100μLで溶解させ、それを上記のエンドトキシン希釈水が入ったガラスキュベットに移注し、レーザー光散乱粒子計測装置(EX−300、興和)を用いて測定を行った。
次に、ビーズ1としてチタニア粒子を用いた場合について説明する。本実施例においては、チタニア粒子(日本アエロジル製Aeroxide P25)を250℃で3時間乾熱処理し、混入しているエンドトキシンを熱により完全に不活性化した。次に、これを10mg/mLになるように注射用蒸留水(大塚製薬製)で分散させたのち、150μLをリムルス試薬(HS−T、和光純薬製)に加えて試薬を溶解した後、60℃で20分加熱して粒子表面にリムルス試薬の蛋白質を吸着及び固定させた。さらに、これを注射用蒸留水で3.0mLになるように希釈し、そのうちの2.0mLでリムルス試薬(ES-IIマルチテスト試薬、和光純薬製)を溶解し、溶解した試薬50μLとエンドトキシン希釈系列溶液50μLを測定容器内で混和させ、攪拌比濁法測定装置(EX−100、興和製)でエンドトキシン凝集反応を測定した。
次に、ビーズ1に用いられる酸化金属微粒子として、アルミナ(電気化学工業(デンカ)製球状アルミナASFP−20)、シリカ(日本アエロジル製Aerosil300)、チタニア(日本アエロジル製Aeroxide P25)、および、酸化マンガン(IV)粉末(関東化学製)を、鉱物微粒子としてハイドロキシアパタイト(コバレントマテリアル製)、カオリン(関東化学製)、および、ベントナイト(関東化学製)を用いて、これらの無機性の素材で形成されたビーズ1によりLAL結合ビーズ試薬を調製し、エンドトキシン測定時間の短縮効果を調べた。
2・・・コアギュロゲン
3・・・コアギュロゲン
10・・・LAL結合ビーズ
Claims (5)
- カブトガニの血球の抽出物に含まれる所定の蛋白質を、試薬中に分散可能な微粒子の表面に吸着させ、
前記蛋白質が吸着した前記微粒子が分散した試薬と試料とを混和させ、
前記試薬と前記試料との混和液におけるゲルの生成を検出することで、前記試料中に存在する生物由来の生理活性物質の検出を行いまたは、前記ゲルの生成の程度を測定することで前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記微粒子は無機性の素材で形成され、
前記微粒子は、アルミナ、チタニア、カオリン、酸化マンガンのいずれかの素材で形成されたことを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定方法。 - 前記所定の蛋白質は、カブトガニの血球の抽出物から精製されたコアギュロゲンであることを特徴とする請求項1に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
- 前記所定の蛋白質が吸着した前記微粒子が分散した試薬を、さらに、カブトガニの血球の抽出物と混合し、
前記混合と同時または混合後において、前記試薬と前記試料とを混和させることを特徴とする請求項1または2に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。 - カブトガニの血球の抽出物に含まれる所定の蛋白質を、試薬中に分散可能な微粒子の表面に吸着させて調製された、生物由来の生理活性物質の測定用試薬キットであって、前記微粒子は、無機性の素材で形成され、
前記微粒子は、アルミナ、チタニア、カオリン、酸化マンガンのいずれかの素材で形成されたことを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定用試薬キット。 - 前記所定の蛋白質は、カブトガニの血球の抽出物から精製されたコアギュロゲンであることを特徴とする請求項4に記載の生物由来の生理活性物質の測定用試薬キット。
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