CN106556699A - 用于测定豆荚蛋白的血液水平的方法和组合物 - Google Patents

用于测定豆荚蛋白的血液水平的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

在一个方面，本文公开了一种用于测定豆荚蛋白分子(天冬酰胺酰肽链内切酶)的血液水平的均相测定方法。在一个方面，所述测定法利用了包被有特异性针对豆荚蛋白分子或它的一种或多种片段的一种或多种抗体的特定尺寸的纳米粒子。在一个方面，所述测定法以均相方式被设计成具有0.2ng/mL至160ng/mL的动态范围。在另一个方面，本文公开了一种用于测定豆荚蛋白的血液水平的试剂盒，所述试剂盒包含两个部分的试剂(R1和R2)，所述试剂盒适于在临床化学分析仪上使用。在一个方面，用于区分诸如乳腺癌、结肠直肠癌以及胃癌之类的癌症的正常风险和高风险的临界值是18ng/mL±3ng/mL。

Description

用于测定豆荚蛋白的血液水平的方法和组合物
技术领域
在某些方面，本公开涉及用于分析生物分子的方法、试剂盒以及装置。在具体方面，本公开涉及用于测定样品中的豆荚蛋白(legumain)浓度的方法、试剂盒以及装置。在一些实施方案中，基于微粒增强的免疫测定法，如胶乳凝集免疫测定法来测定血液样品中豆荚蛋白的浓度。
背景技术
豆荚蛋白是在人类中由LGMN基因所编码的一种蛋白质(Chen J.M.等,J.Biol.Chem.1997；Tanaka T.等,Cytogenet.Cell Genet.1966；Halfon S.等,FEBS Lett.1998)。该基因编码对天冬酰胺酰键的水解具有严格特异性的半胱氨酸蛋白酶，从而在P1位具有Asn或Asp的情况下切割肽键(Schwarz G.等,J.Biol.Chem.2002)。若干种可变剪接转录物变体已经被描述，但是只有两种的生物有效性已经被确定。这两种变体编码相同同工型(Yamane T.等,Biochem.Biophys.Res.Commum.2013)。豆荚蛋白在结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌以及其它类型的癌症中过表达(Liu C.等,Cancer Res.2003；Murthy R.V.等,Clin.Cancer Res.2005)。豆荚蛋白由基因表达谱分析和肿瘤组织阵列被鉴定为是一种肿瘤生物标志物(Guo P.等,PLoS One,2013)。哺乳动物豆荚蛋白参与在溶酶体/内体系统中对细菌肽和内源性蛋白质的加工以进行II类MHC提呈。豆荚蛋白已经被观测到是多种类型癌症的一种潜在预测性生物标志物(Wu M.等,Asian Pac.J.Cancer Prev.2014；Gawenda J.等,Breast Cancer Res.Treat.2007)。它被证实处在聚集在肿瘤细胞的侵袭伪足处和细胞表面上的膜相关囊泡中，在此它与整合素共定位(Liu Y.,Mol.Pharm.2012)。豆荚蛋白的过表达可能与实体肿瘤的形成相关(Liu等,Cancer Res.2003)。过表达豆荚蛋白的细胞可以在体外具有提高的迁移和侵袭活性并且在体内采用侵袭性和转移性表型，这表明了豆荚蛋白在肿瘤侵袭和转移中的意义(Lin Y.等,J.Nat.Cancer Inst.2014)。还已经证实的是，豆荚蛋白促进细胞迁移，并且过表达与增强的组织侵袭和转移有关(Haugen等,Eur.J.Cancer 2015)。豆荚蛋白的独特功能特性和它在许多人类肿瘤中的高水平表达支持它是作为前药激活和肿瘤根除疗法的酶靶标的潜在候选者(Cheng Liu等,Cancer Res.2003)。研发出将豆荚蛋白可切割的肽底物并入到多柔比星(doxorubicin)上的前药策略(Liu等,Nat Commun.2014；Stern等,Bioconjug.Chem.2009)。尽管豆荚蛋白作为靶标对于抗癌药物设计和对这种靶标进行的药物研究的进展来说是有吸引力的，但是缺乏以自动化方式通过临床化学分析仪或自动化免疫分析仪测定豆荚蛋白的血液水平的临床诊断方法。因此，期望研发一种完全自动化的豆荚蛋白测试，所述测试在临床环境中适合于临床化学分析仪或免疫分析仪。
发明内容
本发明内容不意图用于限制所要求保护的主题的范围。根据具体实施方式，包括附图和所附权利要求书中所公开的那些方面，所要求保护的主题的其它特征、细节、效用以及优势将是显而易见的。
在一些方面，本文提供了一种专门针对血液中的人类豆荚蛋白的高度灵敏的和均相的测定法，所述测定法首次允许临床医师使用完全自动化的化学分析仪来测试血液样品中的豆荚蛋白水平，所述分析仪是临床实验室中最常用的分析仪。在一些方面，所述测定法的高灵敏度是经由在胶乳粒度选择、抗体偶联比、特定类型和/或量的凝集增强剂的使用、和/或以适当的温度和/或持续时间进行热应力处理的条件方面对常规的胶乳凝集免疫测定法进行特定的改进而达到的。在一些方面，所述测定法是快速的，总反应时间少于约40分钟、少于约30分钟、少于约20分钟、少于约10分钟、或少于约5分钟。在一些方面，本公开涉及一种用于克服胶乳凝集免疫测定法对血液样品中的豆荚蛋白的低灵敏度和高度非特异性的方法。在一些方面，使用这种灵敏的和特异的测定法，首次使用完全自动化的化学分析仪测量了血清样品或血浆样品中循环的豆荚蛋白分子。在一些方面，使用本文所公开的方法，来自乳腺癌患者、结肠直肠癌患者以及胃癌患者的样品中豆荚蛋白的血清水平与来自健康志愿者的样品中豆荚蛋白的水平相比显著升高。在一些方面，首次确定了可以由临床医师使用来评估癌症风险的临床临界值(cut-off value)，特别是对于实体肿瘤，如乳腺癌、结肠直肠癌以及胃癌，这些实体肿瘤在血液中的循环豆荚蛋白水平常常显著高于该临界值。
在一个方面，本文公开了一种用于测定样品中的豆荚蛋白水平的方法，所述方法包括：1)使含有或疑似含有豆荚蛋白的样品与包被有特异性结合豆荚蛋白或其降解片段的抗体或其片段的微粒接触；2)检测与所述微粒接触的所述样品的光学变化或信号变化；以及3)通过将所述光学变化或信号变化与已知水平的豆荚蛋白的校准物相比较来确定所述样品中豆荚蛋白的水平。在一些实施方案中，所述样品是生物样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血液样品、血清样品或血浆样品。在任何前述实施方案中，所述微粒可以包括多个微粒。
在任何前述实施方案中，所述方法可以进一步包括：4)将所述样品中豆荚蛋白的水平与正常参考范围或临界值相比较，其中所述样品来自于患有或疑似患有癌症的受试者，并且所述样品中豆荚蛋白的水平处在所述正常参考范围之外或高于所述临界值则表示所述受试者的癌症风险较高。
在任何前述实施方案中，所述豆荚蛋白可以是哺乳动物来源的。在任何前述实施方案中，所述豆荚蛋白可以是人类来源的。在任何前述实施方案中，所述豆荚蛋白可以是天冬酰胺酰肽链内切酶[EC 3.4.22.34]或可以具有天冬酰胺酰肽链内切酶[EC 3.4.22.34]活性。
在任何前述实施方案中，所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在任何前述实施方案中，所述抗体可以对哺乳动物豆荚蛋白、人类豆荚蛋白、或其蛋白水解降解片段具有特异性。在任何前述实施方案中，所述抗体片段可以是Fab、F(ab')2、Fv或scFv。在任何前述实施方案中，所述抗体可以是完全人类抗体。在任何前述实施方案中，所述抗体或其片段可以是重组产生的。
在任何前述实施方案中，所述抗体或其片段和/或所述微粒可以与试剂偶联。在一个方面，所述试剂是用于检测的试剂。在一个方面，所述用于检测的试剂用于化学发光检测或荧光检测。
在任何前述实施方案中，所述微粒可以是胶乳粒子、金粒子、或磁性粒子。在任何前述实施方案中，所述微粒可以具有在约5nm至约2000nm范围的直径。在具体实施方案中，所述直径可以在以下范围：约5nm至约10nm、约10nm至约20nm、约20nm至约40nm、约40nm至约80nm、约80nm至约100nm、约100nm至约120nm、约120nm至约140nm、约140nm至约160nm、约160nm至约180nm、约180nm至约200nm、约200nm至约220nm、约220nm至约240nm、约240nm至约260nm、约260nm至约280nm、约280nm至约300nm、约300nm至约320nm、约320nm至约340nm、约340nm至约360nm、约360nm至约380nm、约380nm至约400nm、约400nm至约500nm、约500nm至约600nm、约600nm至约700nm、约700nm至约800nm、约800nm至约900nm、约900nm至约1000nm、约1000nm至约1100nm、约1100nm至约1200nm、约1200nm至约1300nm、约1300nm至约1400nm、约1400nm至约1500nm、约1500nm至约1600nm、约1600nm至约1700nm、约1700nm至约1800nm、约1800nm至约1900nm、或约1900nm至约2000nm。在任何前述实施方案中，所述微粒可以具有在约40nm至约400nm范围的直径。
在任何前述实施方案中，所述微粒可以是磁性粒子，并且所述方法可以进一步包括一个或多个洗涤步骤。在任何前述实施方案中，所述检测步骤可以进一步包括检测化学发光和/或荧光。
在任何前述实施方案中，所述抗体或其片段与所述微粒上可供使用的包被位点的比率可以是约0.1至约1.0。在具体实施方案中，所述比率可以是约0.1至约0.2、约0.2至约0.3、约0.3至约0.4、约0.4至约0.5、约0.5至约0.6、约0.6至约0.7、约0.7至约0.8、约0.8至约0.9、或约0.9至约1.0。在任何前述实施方案中，所述抗体或其片段与所述微粒上可供使用的包被位点的比率可以是约0.5至约1.0。
在任何前述实施方案中，在接触步骤中可以使用凝集增强剂或刺激剂。在一个方面，所述凝集增强剂或刺激剂是聚乙二醇。在一个方面，所述聚乙二醇的分子量在约600Da至约100,000Da的范围。在具体实施方案中，所述聚乙二醇的分子量可以在以下范围：约600Da至约1,000Da、约1,000Da至约2,000Da、约2,000Da至约3,000Da、约3,000Da至约4,000Da、约4,000Da至约5,000Da、约5,000Da至约10,000Da、约10,000Da至约20,000Da、约20,000Da至约30,000Da、约30,000Da至约40,000Da、约40,000Da至约50,000Da、约50,000Da至约60,000Da、约60,000Da至约70,000Da、约70,000Da至约80,000Da、约80,000Da至约90,000Da、或约90,000Da至约100,000Da。在任何前述实施方案中，所述聚乙二醇的最终浓度可以在约0.3％至约1.5％(w/v)的范围。在具体实施方案中，所述聚乙二醇的浓度可以在以下范围：约0.3％至约0.4％、约0.4％至约0.5％、约0.5％至约0.6％、约0.6％至约0.7％、约0.7％至约0.8％、约0.8％至约0.9％、约0.9％至约1.0％、约1.0％至约1.1％、约1.1％至约1.2％、约1.2％至约1.3％、约1.3％至约1.4％、约1.4％至约1.5％(w/v)。
在另一个方面，所述凝集增强剂或刺激剂是聚乙烯吡咯烷酮。在一个方面，所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量在约10,000Da至约750,000Da的范围。在具体实施方案中，所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量可以在以下范围：约10,000Da至约20,000Da、约20,000Da至约40,000Da、约40,000Da至约80,000Da、约80,000Da至约160,000Da、约160,000Da至约320,000Da、约320,000Da至约640,000Da、或约640,000Da至约750,000Da。在任何前述实施方案中，所述聚乙烯吡咯烷酮的最终浓度可以在约0.1％至约3.0％(w/v)的范围。在具体实施方案中，所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度可以在以下范围：约0.1％至约0.2％、约0.2％至约0.3％、约0.3％至约0.4％、约0.4％至约0.5％、约0.5％至约0.6％、约0.6％至约0.7％、约0.7％至约0.8％、约0.8％至约0.9％、约0.9％至约1.0％、约1.0％至约1.1％、约1.1％至约1.2％、约1.2％至约1.3％、约1.3％至约1.4％、约1.4％至约1.5％、约1.5％至约1.6％、约1.6％至约1.7％、约1.7％至约1.8％、约1.8％至约1.9％、约1.9％至约2.0％、约2.0％至约2.1％、约2.1％至约2.2％、约2.2％至约2.3％、约2.3％至约2.4％、约2.4％至约2.5％、约2.5％至约2.6％、约2.6％至约2.7％、约2.7％至约2.8％、约2.8％至约2.9％、或约2.9％至约3.0％(w/v)。
在任何前述实施方案中，可以在约30℃至约50℃的温度对包被有所述抗体或其片段的微粒进行热应力处理至少约10小时。在具体实施方案中，用于热应力的时间是约10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、或约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、或10天。在具体实施方案中，用于热应力的温度是约30℃至约35℃、约35℃至约40℃、约40℃至约45、或约45℃至约50℃。在任何前述实施方案中，可以在约45℃对包被有所述抗体或其片段的微粒进行热应力处理约一天至约五天。
在任何前述实施方案中，所述样品可以是来自人类或非人类哺乳动物的血清样品或血浆样品。
在任何前述实施方案中，所述癌症可以是实体肿瘤。在一个方面，所述癌症选自由乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌以及肺癌组成的组。
在另一个方面，本文公开了一种用于测定样品中豆荚蛋白的水平的试剂盒，所述试剂盒包含：第一试剂(R1)，所述第一试剂包含缓冲液，它的pH值在约3.0至约10.0的范围；以及第二试剂(R2)，所述第二试剂包含包被有特异性结合豆荚蛋白或其降解片段的抗体或其片段的微粒。在具体实施方案中，R1的pH值在以下范围：约3.0至约4.0、约4.0至约5.0、约5.0至约6.0、约6.0至约7.0、约7.0至约8.0、约8.0至约9.0、或约9.0至约10.0。
在任何前述实施方案中，所述微粒可以包括多个微粒。在任何前述实施方案中，所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在任何前述实施方案中，所述抗体可以对哺乳动物豆荚蛋白、人类豆荚蛋白、或其蛋白水解降解片段具有特异性。在任何前述实施方案中，所述抗体片段可以是Fab、F(ab')2、Fv或scFv。在任何前述实施方案中，所述抗体可以是完全人类抗体。在任何前述实施方案中，所述抗体或其片段可以是重组产生的。在任何前述实施方案中，所述抗体或其片段和/或所述微粒可以与试剂偶联。在一个方面，所述试剂是用于检测的试剂。在另一个方面，所述用于检测的试剂是用于化学发光检测或荧光检测。
在任何前述实施方案中，所述微粒可以是胶乳粒子、金粒子、或磁性粒子。在任何前述实施方案中，所述微粒可以具有在约5nm至约2000nm范围的直径。在任何前述实施方案中，所述微粒可以具有在约40nm至约400nm范围的直径。
在任何前述实施方案中，所述微粒可以是磁性粒子。在任何前述实施方案中，所述试剂盒可以进一步包含洗涤缓冲液。
在任何前述实施方案中，所述试剂盒可以进一步包含用于检测化学发光和/或荧光的一种或多种试剂。
在任何前述实施方案中，所述抗体或其片段与所述微粒上可供使用的包被位点的比率可以是约0.1至约1.0。在任何前述实施方案中，所述抗体或其片段与所述微粒上可供使用的包被位点的比率可以是约0.5至约1.0。
在任何前述实施方案中，所述试剂盒可以进一步包含凝集增强剂或刺激剂。在任何前述实施方案中，所述凝集增强剂或刺激剂可以是聚乙二醇。在一个方面，R2中聚乙二醇的分子量在约600Da至约100,000Da的范围。在任何前述实施方案中，R2中聚乙二醇的最终浓度可以在约0.3％至约1.5％(w/v)的范围。在一个方面，所述凝集增强剂或刺激剂是聚乙烯吡咯烷酮。在另一个方面，R2中所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量在约10,000Da至约750,000Da的范围。在任何前述实施方案中，R2中所述聚乙烯吡咯烷酮的最终浓度可以在约0.1％至约3.0％(w/v)的范围。
在任何前述实施方案中，可以在约30℃至约50℃的温度对包被有所述抗体或其片段的微粒进行热应力处理至少约10小时。在任何前述实施方案中，可以在约45℃对包被有所述抗体或其片段的微粒进行热应力处理约一天至约五天。
在任何前述实施方案中，所述豆荚蛋白可以是哺乳动物来源的或人类来源的。在任何前述实施方案中，所述豆荚蛋白可以是天冬酰胺酰肽链内切酶[EC 3.4.22.34]或具有天冬酰胺酰肽链内切酶[EC 3.4.22.34]活性。
在任何前述实施方案中，所述试剂盒可以进一步包含与R1和/或R2一起包装或分开包装的校准物或校准物组。
在任何前述实施方案中，可以首先将样品与第一试剂混合，继而添加第二试剂，所述第二试剂包含包被有特异性结合豆荚蛋白或其降解片段的抗体或其片段的微粒。在一个方面，所述第一试剂包含缓冲液。在一些实施方案中，所述缓冲液具有在约3.0至约10.0范围的pH值。在任何前述实施方案中，所述第一试剂可以包含凝集增强剂或刺激剂。
在任何前述实施方案中，可以使用已确立的临界值来评估癌症风险。在一个方面，使用18.5ng/mL±3ng/mL的豆荚蛋白水平的已确立的临界值来评估癌症风险。在另一个方面，所述已确立的临界值是针对乳腺癌、胃癌和/或结肠直肠癌的。
在一个方面，针对乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌和/或胃癌的临界值是在血浆样品或血清样品中18.5ng/mL的豆荚蛋白。在另一个方面，所述已确立的临界值是根据样品情况、所述样品是来自于雌性受试者还是雌性受试者和/或癌症的类型来设定的。在一些实施方案中，所述已确立的临界值被设定在约15.0ng/mL至约25.0ng/mL。在具体实施方案中，所述临界值被设定在约15.0ng/mL至约16.0ng/mL、约16.0ng/mL至约17.0ng/mL、约17.0ng/mL至约18.0ng/mL、约18.0ng/mL至约19.0ng/mL、约19.0ng/mL至约20.0ng/mL、约20.0ng/mL至约21.0ng/mL、约21.0ng/mL至约22.0ng/mL、约22.0ng/mL至约23.0ng/mL、约23.0ng/mL至约24.0ng/mL、或约24.0ng/mL至约25.0ng/mL。
在一些实施方案中，针对乳腺癌和/或卵巢癌，所述已确立的临界值是在血浆样品或血清样品中约18.5ng/mL的豆荚蛋白。在其它实施方案中，针对胃癌、结肠癌和/或肺癌，所述已确立的临界值是约10ng/mL至约30ng/mL。
附图说明
图1图示了根据本公开的一个方面在日立(Hitachi)917分析仪上进行的测定反应程序(参数)。
图2图示了在日立917分析仪上进行的示例性豆荚蛋白胶乳增强免疫比浊测定。示出了典型的校准曲线。
图3图示了在Modular P分析仪上进行的示例性豆荚蛋白胶乳增强免疫比浊法。示出了典型的线性曲线。
图4图示了示例性豆荚蛋白方法比较(胶乳增强免疫比浊法相比于ELISA)。
图5图示了来自健康志愿者的血液和来自乳腺癌患者的血液中的示例性豆荚蛋白水平。
图6图示了来自胃癌患者的血液中的示例性豆荚蛋白水平。
图7图示了来自结肠直肠癌患者的血液中的示例性豆荚蛋白水平。
具体实施方式
在下文中提供了所要求保护的主题的一个或多个实施方案的具体实施方式以及图示所要求保护的主题的原理的附图。所要求保护的主题是结合这些实施方案来描述的，但是不限于任何具体的实施方案。应当了解的是，所要求保护的主题可以各种形式体现，并且涵盖许多的替代方案、修改方案以及等同方案。因此，本文所公开的具体细节不应当被解释成具有限制性，而是作为权利要求书的基础以及作为用于教导本领域技术人员在几乎任何的适当详述的系统、结构或方式中利用所要求保护的主题的代表性的基础。许多具体细节阐述于以下说明中以提供对本公开的全面理解。提供这些细节以用于举例的目的，并且所要求保护的主题可以根据权利要求书在没有这些具体细节中的一些或全部的情况下实施。应当了解的是，可以使用其它实施方案并且可以作出结构变化而不脱离所要求保护的主题的范围。应当了解的是，在一个或多个单独的实施方案中所述的多个特征和功能在它们的适用性方面不限于与它们一起被描述的具体实施方案。相反，它们可以单独或以一定的组合形式应用于本公开的一个或多个其它实施方案，无论这些实施方案是否被描述，无论这些特征是否被呈现为所描述的实施方案的一部分。为了清楚起见，没有详细描述与所要求保护的主题相关的技术领域已知的技术材料以使所要求保护的主题不会不必要地含糊不清。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语、符号以及其它技术和科学术语或专有名词意图具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚起见和/或为了随时参考，在本文中对具有通常所理解的含义的术语进行定义，并且在本文中包括这些定义不应当必然地被解释为代表与本领域中一般所理解的存在实质性的区别。本文所描述或提到的许多技术和程序由本领域技术人员很好地理解并且通常使用常规的方法加以利用。
在本申请中所提到的所有出版物，包括专利文献、科学论文以及数据库，均出于所有目的以引用的方式整体并入，该引用的程度就如同每一篇单独的出版物均单独地以引用的方式并入一样。如果本文所阐述的定义与以引用方式并入本文的专利、专利申请、公开的申请或其它出版物中所阐述的定义相反或以其它方式不一致，那么本文所阐述的定义优先于以引用的方式并入本文的定义。对出版物或文献的引用并非意图承认它们中的任何一篇是有关的现有技术，它也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的任何承认。
所有标题均是为了读者的方便起见并且不应当被用于限制标题后面的文字的含义，除非这样指明的话。
除非另外指明，否则所提供的实施方案的实施将利用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学以及测序技术的常规技术和说明，它们在本领域实施人员的技能范围内。这些常规技术包括多肽和蛋白质合成以及修饰、多核苷酸合成和修饰、聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接、以及使用标记的杂交检测。可以通过参考本文的实施例来获得对合适技术的具体说明。然而，当然也可以使用其它等效的常规程序。这些常规技术和说明可以见于标准实验室手册中，如Green等编著,Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(《基因组分析：实验室手册系列》)(第I-IV卷)(1999)；Weiner,Gabriel,Stephens编著,GeneticVariation:A Laboratory Manual(《遗传变异：实验室手册》)(2007)；Dieffenbach,Dveksler编著,PCR Primer:A Laboratory Manual(《PCR入门：实验室手册》)(2003)；Bowtell和Sambrook,DNA Microarrays:A MolecularCloning Manual(《DNA微阵列：分子克隆手册》)(2003)；Mount,Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis(《生物信息学：序列和基因组分析》)(2004)；Sambrook和Russell,Condensed Protocols from MolecularCloning:A Laboratory Manual(《分子克隆实验指南精编版：实验室手册》)(2006)；以及Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A LaboratoryManual(《分子克隆：实验室手册》)(2002)(全部均来自冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))；Ausubel等编著,Current Protocolsin Molecular Biology(《最新分子生物学实验方法汇编》)(1987)；T.Brown编著,Essential Molecular Biology(《基础分子生物学》)(1991),IRL出版社(IRL Press)；Goeddel编著,Gene Expression Technology(《基因表达技术》)(1991),学术出版社(Academic Press)；A.Bothwell等编著,Methods forCloning and Analysis of Eukaryotic Genes(《真核基因的克隆和分析方法》)(1990),巴特利特出版公司(Bartlett Publ.)；M.Kriegler,Gene Transfer andExpression(《基因转移和表达》)(1990),斯托克顿出版社(Stockton Press)；R.Wu等编著,Recombinant DNA Methodology(《重组DNA方法》)(1989),学术出版社；M.McPherson等,PCR:A Practical Approach(《PCR：实用方法》)(1991),牛津大学出版社(Oxford University Press)的IRL出版社；Stryer,Biochemistry(《生物化学》)(第4版)(1995),纽约州纽约的W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman,New York N.Y.)；Gait,Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach(《寡核苷酸合成：实用方法》)(2002),伦敦的IRL出版社(IRL Press,London)；Nelson和Cox,Lehninger,Principles ofBiochemistry(《宁格生物化学原理》)(2000)第3版,纽约州纽约的W.H.弗里曼出版公司(W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.)；Berg等,Biochemistry(《生物化学》)(2002)第5版,纽约州纽约的W.H.弗里曼出版公司；D.Weir和C.Blackwell编著,Handbook of ExperimentalImmunology(《实验免疫学手册》)(1996),威利-布莱克威尔公司(Wiley-Blackwell)，它们全部均出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
在整个本公开中，所要求保护的主题的各个方面以范围的形式来呈现。应当了解的是，呈范围形式的说明仅仅是为了方便和简洁起见并且不应当被理解成对所要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，对范围的说明应当被认为是已经具体地公开了该范围内的所有可能的子范围以及单个数值。举例来说，在提供值的范围的情况下，应当了解的是，该范围的上限和下限在该所述的范围内的任何其它所述的值或中间值之间的每一个中间值均被涵盖在所要求保护的主题内。这些更小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述更小的范围内，并且也被涵盖在所要求保护的主题内，但受制于所述范围中任何被明确排除的限值。在所述范围包括这些限值中的一个或两个的情况下，不包括那些所包括的限值中的任何一个或两个的范围也被包括在所要求保护的主题中。无论范围的宽度如何，这均适用。举例来说，对诸如1至6的范围的说明应当被认为是已经具体地公开了该范围内诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子范围以及单个数值，例如1、2、3、4、5以及6。
除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用的单数形式“a/an(一)”和“所述”包括复数指代对象。举例来说，“a/an(一)”意指“至少一个(种)”或“一个(种)或多个(种)”。因此，在提到“a reagent(一种试剂)”时，指的是一种或多种试剂，并且在提到“所述方法”时，包括提到本文所公开的和/或本领域技术人员已知的等效步骤和方法，诸如此类。
如本文所用的“豆荚蛋白”包括由人类LGMN基因编码的酶或酶片段。所述酶具有EC编号[3.4.22.34]。
如本文所用的“抗体”不仅包括完整的多克隆抗体或单克隆抗体，而且还包括其片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(ScFv)、双体抗体(diabody)、由抗体片段形成的多特异性抗体、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、以及包含具有所需的特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。抗体包括任何类别的抗体，如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不必是任何特定的类别。
如本文所用的“胶乳粒子”包括具有在40nm至500nm范围的直径的聚苯乙烯珠粒。所述胶乳粒子包括被羧化或胺化的聚苯乙烯珠粒。胶乳粒子的密度一般将但不限于在约0.1mg/mL至约0.1g/mL变动。大部分的胶乳由大致呈微球体状的粒子构成，这些粒子具有但不限于在约0.04微米至约1.0微米变动的直径。大部分的胶乳由在中性pH值具有净负表面电荷的粒子构成。胶乳上负表面电荷之间的电荷排斥在维持粒子处于悬浮状态中是重要的。如本文所用的术语胶乳意图意指离散的微粒在水性液体中悬浮的特性。
如本文所用的术语“评估”意图包括在获得样品中所存在的分析物的量或浓度的绝对值以及在获得指示样品中分析物的水平的指标、比率、百分比、目视值或其它值的意义上的定量测定和定性测定。评估可以是直接的或间接的，并且实际检测的化学物质当然不必是分析物本身，而可以例如是其衍生物或一些另外的物质。
如本文所用的术语“样品”包括可能含有期望对其进行分析物测定的分析物的任何物质。样品可以是生物样品，如生物流体或生物组织。生物流体的实例包括尿液、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰液、脑脊髓液、泪液、粘液、羊水等。生物组织是形成人类、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构物质之一的细胞聚集体，通常是某种细胞与其胞间物质一起的聚集体，包括结缔组织、上皮组织、肌肉组织以及神经组织。生物组织的实例还包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉以及一个或多个单独的细胞。如本文所用的“样品”可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊状物、水性样品、非水性样品或其任何组合。本公开的生物样品涵盖了呈溶液、悬浮液、液体、粉末、糊状物、水性样品或非水性样品形式的样品。如本文所用的“生物样品”包括从活的来源或病毒(或朊病毒)来源或其它来源获得的大分子和生物分子的任何样品，并且包括受试者的从中可以获得核酸、蛋白和/或其他大分子的任何细胞类型或组织。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。举例来说，被扩增的分离的核酸构成了生物样品。生物样品包括但不限于体液，如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液以及汗液，来自动物和植物的组织样品和器官样品以及由其所获得的经过处理的样品。
如本文所用的“血液样品”包括全血样品或由其所获得的血浆级分或血清级分。优选地，血液样品指的是人类血液样品，如全血或由其所获得的血浆级分或血清级分。还优选地，在测定之前通过去除基本上所有的血红蛋白(即红细胞)来预处理血液样品，以消除或显著地减少来自血红蛋白分子的氧化干扰。
如本文所用的术语“全血”包括没有经过分级分离并且含有细胞组分和流体组分这两者的血液样品。如本文所用的“全血”指的是新鲜抽取的血液，在它凝固之前对它进行测试；或常规抽取的血液样品，它可以被抽到真空采血管中，并且可以含有抗凝剂，如肝素锂、EDTA等，或可以在常规临床测试过程中向它当中添加一种或多种其它标准临床试剂。
如本文所用的术语“血浆”包括全血的流体——非细胞组分。根据所使用的分离方法，血浆可以完全不含细胞组分，或可以含有不同量的血小板和/或少量的其它细胞组分。由于血浆包含各种凝血因子，如纤维蛋白原，因此术语“血浆”区别于如下文所阐述的“血清”。
如本文所用的术语“血清”包括哺乳动物全血清，如人全血清。此外，如本文所用的“血清”指的是已经被去除了凝血因子(例如纤维蛋白原)的血浆。
如本文所用的术语“流体”包括可以流动的任何组成。流体因此涵盖呈半固体、糊状物、溶液、水性混合物、凝胶、洗液、乳膏以及其它这样的组成形式的组成。
如本文所用的术语“疾病”或“病症”包括由例如感染或遗传缺陷引起的并且由可鉴定的症状表征的生物体的病理状况。
如本文所用的“接触”意指使两种或更多种组分集合在一起。“接触”可以通过将所有组分在流体混合物或半流体混合物中混合来实现。“接触”还可以在使一种或多种组分与诸如实体组织切片或基质之类的固体表面上的一种或多种其它组分接触时实现。
如本文所用的术语“比较”一般意指进行研究以指出两个或更多个值之间的相似性或差异。优选地，“比较”指的是定量比较，例如像将一个值减去另一个值、计算两个值的比率、计算一个值相对于另一个值的百分比、或将这些类型的计算组合以产生单个数值。如本文所用的“比较”进一步指的是由人进行的比较、通过计算机或其它处理器进行的比较、以及通过人与计算机或其它处理器结合所进行的比较。
应当了解的是，本文所述的发明的方面和实施方案包括“由这些方面和实施方案组成”和/或“基本上由这些方面和实施方案组成”。
术语“结合”在本文用以指两个分子之间的吸引相互作用，所述相互作用产生稳定的缔合，其中所述分子彼此紧邻。分子结合可以被分为以下类型：非共价结合、可逆的共价结合以及不可逆的共价结合。可以参与分子结合的分子包括多肽、多核苷酸、碳水化合物、脂质以及小有机分子，如药物化合物。与其它分子形成稳定的复合体的多肽常常被称为受体，而它们的结合伴侣被称作配体。多核苷酸也可以与它们自己或其它物质形成稳定的复合体，例如DNA-蛋白质复合体、DNA-DNA复合体、DNA-RNA复合体。
根据以下说明书，结合附图，本公开的其它目的、优势以及特征将变得显而易见。
胶乳凝集免疫测定法是基于通过多价胶乳抗体试剂与相应的多价形式的抗原之间的结合形成可检测的凝集。胶乳凝集免疫测定法是一种可以与临床实验室中常用的一般临床化学分析仪一起使用的均相测定法。虽然胶乳凝集免疫测定法通常用于临床诊断学中，但是所述方法没有非均相测定法如基于磁性粒子的化学发光免疫测定法那么灵敏。常规的胶乳凝集免疫测定法主要适用于测定血液样品中高于1.0ng/mL的浓度的分析物(蛋白质)。然而，正常受试者的豆荚蛋白的血液浓度是0.3ng/mL至5.0ng/mL，下限的检测灵敏度要求低于常规的胶乳凝集免疫测定法的检测限度。本申请的发明人发现，使用更大尺寸的胶乳粒子(它们的直径大于300nm)，以及使用抗体相对于胶乳粒子上可供使用的偶联位点和空间的更高偶联比率，以及使用恰当的凝集增强剂(刺激剂)，以及对与抗体偶联的胶乳粒子进行的适当的热应力处理，可以研发出具有达到<0.2ng/mL的检测限度的用于豆荚蛋白的高度灵敏的胶乳凝集免疫测定法。使用上述改进的组合，本申请的发明人研发出首个用于测定豆荚蛋白的血液水平的基于胶乳凝集的免疫测定法。所述测定法是完全使用临床化学分析仪自动化的，并且总反应时间<10分钟，它是与耗时超过4小时的耗费时间的和繁琐的ELISA测定法相比要快得多并且方便的测定法。使用完全自动化的用于豆荚蛋白的胶乳免疫测定法，本申请的发明人确定了用于评估癌症、特别是实体肿瘤如乳腺癌、结肠直肠癌以及胃癌的高风险的临床临界值。
可用于本发明中的胶乳粒子对于熟悉胶乳凝集免疫测定法领域的工作人员来说将是明显的。一般来说，这些粒子需要为用作用于所述测定法的所需的抗体试剂的稳定载体以及在足以用于分析目的的刺激剂或增强剂存在下进行凝集所需的特性。胶乳粒子一般是通过乳液聚合或悬浮聚合来制备的[Bangs,L.B.(1984)Uniform Latex Particles(《均一的胶乳粒子》),美国印第安纳州印第安纳波利斯的Seragen诊断产品公司(SeragenDiagnostics Inc.,Indianapolis,IN,USA)]。还可以使用溶胀乳液聚合[Ugelstad,J.等(1980)Adv.Colloid and Interface Sci.13:101-140]。胶乳粒子的良好选择是可商购获得的。聚苯乙烯粒子是特别有用的。
胶乳粒子的密度一般将但不限于在约0.1mg/mL至约0.1g/mL变动。大部分的胶乳由大致呈微球体状的粒子构成，这些粒子具有但不限于在约0.04微米至约1.2微米变动的直径。
使抗体试剂与胶乳粒子连接是应用常规技术的问题。一般来说，所述连接可以是共价的或非共价的。抗体试剂可以由完全抗体、抗体片段、多功能抗体聚集体等组成。通常，利用完全抗体或IgG片段，如Fab、Fab'或F(ab')2。抗体试剂可以通过任何可供使用的技术来获得，如常规的抗血清技术和单克隆技术。然而，胶乳粒度的选择、官能团或停留区域的表面密度以及抗体缀合的浓度对于每一种分析物来说是独特的和特定的，并且这些参数和条件的优化决定了胶乳免疫测定法研发的成功或失败。
所述免疫测定反应是在7.5或更大的pH值下进行的，以中和具有约6.4的理论等电点(IEP)的豆荚蛋白分子的正电性，从而消除在血液样品存在下胶乳试剂的非特异性凝集。当然，将不允许反应混合物的pH值达到豆荚蛋白的IEP，在所述IEP下，分析物与胶乳试剂之间的免疫反应性大幅减小，即达到不可再获得有用的测定的程度。优选地，水性反应混合物的pH值将具有约7.5至约10、优选地小于约8.5的pH值，约8.0的pH值是特别有用的。可以基于便利性和测定性能来选择用于这个目的的合适的缓冲液。甘氨酸缓冲液和N-二羟乙基甘氨酸缓冲液是优选的。
本发明的免疫测定反应是在如下的条件下进行的，所述条件产生背景吸收与样品中0.3ng/ml豆荚蛋白的吸收之间至少50Δmili O.D.以及定量限度(LOQ)与测定线性度的最高点之间至少800Δmili O.D.。
制备用于测定血清或血浆中的豆荚蛋白的胶乳增强免疫测定试剂的实施例提供于实施例部分中。
以下实施方案意图进一步描述和说明本公开的各个方面，但是不以任何方式、形状或形式明确地或隐含地限制本公开的范围。
实施方案1：一种用于测定豆荚蛋白分子的血液水平的方法，所述方法包括：
1)将含有或疑似含有豆荚蛋白分子的血清样品或血浆样品与包被有针对人类豆荚蛋白分子或它的一种或多种降解片段的一种或多种抗体的一种或多种特定尺寸的微粒混合；
2)测量所述反应混合物的光学变化或信号变化，将所述光学变化或信号变化用于通过将所述光学变化或信号变化与已知浓度的豆荚蛋白的校准物相比较来计算所述样品中豆荚蛋白分子的浓度；
3)将样品中豆荚蛋白的浓度与正常参考范围或临界值相比较，浓度高于所述临界值则表示较高的癌症风险。
实施方案2：根据实施方案1的方法，其中所述豆荚蛋白分子是哺乳动物来源的，优选地是人类来源的，并且是天冬酰胺酰肽链内切酶[EC3.4.22.34]。
实施方案3：根据实施方案1的方法，其中所述抗体是对哺乳动物豆荚蛋白分子、优选地对人类豆荚蛋白分子或它的一种或多种蛋白水解降解片段具有特异性亲和力的单克隆抗体或多克隆抗体。
实施方案4：根据实施方案1的方法，其中所述微粒是具有在40nm至400nm范围的特定尺寸(直径)的胶乳粒子或金粒子、或磁性粒子。当使用磁性粒子时，可以结合化学发光检测或荧光检测包括一个或多个洗涤步骤。
实施方案5：根据实施方案1的方法，其中抗体与胶乳粒子上可供使用的包被位点的比率是0.5至1.0。
实施方案6：根据实施方案1的方法，其中所使用的凝集增强剂(刺激剂)是具有在600至100,000范围的分子量并且在R1中具有在0.3％-1.5％(w/v)范围的最终浓度的聚乙二醇。
实施方案7：根据实施方案1的方法，其中所使用的凝集增强剂(刺激剂)是具有在约10,000至约750,000范围的分子量并且在R1中具有在0.1％-3.0％(w/v)范围的最终浓度的聚乙烯吡咯烷酮。
实施方案8：根据实施方案1的方法，其中在30℃至50℃的温度对所述与抗体偶联的胶乳微粒进行热应力处理至少10小时，优选地在45℃进行热应力处理1天-5天。
实施方案9：根据实施方案1的方法，其中所述血液样品是来自哺乳动物、优选地来自人类的血清或血浆。
实施方案10：根据实施方案1的方法，其中所述癌症包括乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌以及其它类型的实体肿瘤。
实施方案11：一种用于测定豆荚蛋白分子的血液水平的试剂盒，所述试剂盒由至少两个部分的试剂(R1和R2)组成，其中这些试剂中的一种含有包被有特异性针对来自哺乳动物、优选地来自人类的血液样品中的豆荚蛋白分子的一种或多种抗体的微粒，并且另一种试剂含有缓冲液，所述缓冲液的pH值在3.0至10.0的范围。校准物或校准物组被包括在所述试剂盒中或被包装在分开的试剂盒中。
实施方案12：根据实施方案7的方法，其中首先将血液样品与缓冲液混合，继而添加含有包被有对哺乳动物豆荚蛋白分子、优选地对人类豆荚蛋白分子具有特异性的一种或多种抗体的微粒的试剂。测量所述反应混合物的光学变化或信号变化，并且使用通过使用已知浓度的豆荚蛋白的校准物或校准物组所构建的校准曲线来确定血液样品中豆荚蛋白分子的浓度。
实施方案13：根据实施方案8的方法，其中测定所述样品中豆荚蛋白的浓度，并且使用针对包括乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌在内的癌症的高风险的18.5ng/mL±3ng/mL的已确立的临界值来评估癌症、特别是包括乳腺癌、胃癌以及结肠直肠癌在内的实体肿瘤的风险。
实施方案14：根据实施方案9的方法，其中对于血浆样品或血清样品，针对乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌以及胃癌的优选的临界值是18.5ng/mL。临界值还可以根据样品情况(雌性对比雌性)和癌症类型而被设定在15.0ng/mL至25.0ng/mL；而对于血浆样品或血清样品，针对乳腺癌和卵巢癌的优选的临界值是18.5ng/mL，并且针对胃癌、结肠癌以及肺癌，临界值还可以被设定在10ng/mL至30ng/mL。
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实施例1：试剂和反应缓冲溶液的制备
试剂1(R1)的制备：
举例来说，试剂1(R1)缓冲溶液含有至少约以下量的化学品/升溶液：
在这个实施例中，通过添加一定量(例如0.5％-1.5％)的PEG(6K-100K)来完成最终的R1试剂的制备，例如如下文所述。
对于45升的R1试剂，添加324g的PEG100K以产生0.72％的最终PEG100k。PEG100k的量＝R1的升数×最佳的PEG100k浓度(％)×10g/L＝450×0.72＝324g。将所计算的PEG 100K与R1缓冲液充分混合，并且使用HCl和NaOH将R1的pH值调节到8.2±0.1。
试剂2(R2)——胶乳粒子-抗体缀合物的制备：
1.在这个实施例中，如下制备含有100mM NaCl的20mM MES缓冲液(pH 7.3)：
每升H2O 3.95g MES、1.844g NaCl，使用10M NaOH或6N HCl调节pH值。
2.豆荚蛋白抗体的制备描述于下文中。在冷室中在透析管(Spectrum公司)中针对41升MES缓冲液(在上述步骤1中所制备)经两次透析缓冲液交换将来自Abcam公司的抗体(800mg，3.9mg/ml)(ab125286和ab47157，马萨诸塞州剑桥的Abcam公司(Abcam,Cambridge,MA))或来自圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)(美国加利福尼亚州(CA,US))的抗体(如sc-271312和sc-133234)透析2天。使用A280以1.38的消光系数测量抗体浓度。
抗体浓度(mg/mL)＝[A280(0.135)×稀释倍数(31)]/1.38＝3.05mg/mL。
豆荚蛋白洗涤缓冲液的制备：
Tris碱：12.11g，Tween 20：1.0g，在1升H2O中
30升缓冲液：363.3g Tris、30g Tween 20、24升H2O、170mL 6N HCl，pH 8.2
MES活化缓冲液的制备：
MES：3.905g/L，对于30升，117.15g；21升H2O
6N HCl：0ml，10M NaOH：约30mL；最终pH 6.1
豆荚蛋白试剂2(R2)稀释液的制备：
确定每升R2所需的EDAC的量：
[μeq/g×批量大小(L)×1.1％]/0.0052＝[91×1000×0.011]/0.0052＝192500μg＝192.5mg
对于10倍过量的EDAC：192.5×10＝1925mg。
确定每升R2所需的IgG的最佳量：
6/[(密度(g/ml)×平均直径(μm)]×2.5×10
6/(1.05×0.32)×2.5×10＝446.4mg
由可供使用的IgG确定R2(1.1％的粒子悬浮液)的批量大小：
批量大小＝621.9mg/446.4mg＝1.4L R2(1.1％的粒子悬浮液)
粒子活化：
将所计算体积(0.154L)的原始粒子悬浮液原液(10.12％)和1.25L的MES活化缓冲液添加到玻璃容器中并且混合直到均相为止。
通过以下方式测量粒子悬浮液的初始聚集比率：
在340nm和650nm波长处使用MES活化缓冲液使分光光度计置零。使用MES缓冲液稀释粒子悬浮液的少量样品以使它在340nm具有1.0+/-0.1的吸光度并且记录稀释倍数。如下记录A340/A650吸光度比：
稀释倍数：2.5μL:900μL
A340/A650＝1.078/0.174＝6.196
NHS和EDAC活化：
将计算量的NHS(16.1g)添加到1.1％粒子悬浮液中并且混合至少10分钟或直到完全溶解为止，但是不超过20分钟。使用搅拌器帮助溶解(室温)。
立即将计算量的EDAC(2695mg)粉末添加到粒子悬浮液中并且在2℃-8℃使用搅拌器剧烈混合60分钟+/-5分钟(剧烈混合应当产生可见的涡旋但是没有起泡)。
活化粒子的渗滤和超声处理：
一旦系统准备就绪，就开始渗滤并且将滤液收集在适当的容器中。调节输入缓冲液的流动速率以使混合容器中液体的水平保持相对恒定。将泵调到360RMP的设置或直到入口压力达到10PSI的最高压力为止。
将超声发生器打开到最大输出的30％-50％的设置。
MES活化缓冲液的所需量＝12×批量大小＝1.2×1.4＝17L。
对粒子进行渗滤和超声处理直到已经使用所需量的MES活化缓冲液为止。在整个渗滤过程期间持续监测滤液。
在已经使用了所需量的MES活化缓冲液之后，获取粒子的少量样品并且如先前所述测量聚集。
A340/A650＝1.05/0.173＝6.176
获取滤液的少量样品并且测量A280，确保A280<0.1。
在完成超声处理之后，使缓冲液管线断开连接，然后继续渗滤直到粒子混合物被浓缩到原始体积(渗滤前的体积)的约50％为止。
关闭超声发生器，然后排空系统。
取出容纳活化粒子的混合容器。
抗体与活化粒子的偶联：
在能够容纳粒子和IgG原液的组合体积的玻璃混合容器中制备所需量的活化粒子。开始在2℃-8℃混合粒子悬浮液。调节混合速度以使涡旋是可见的以确保实现充分的混合。
在室温将计算量的抗体(622mg)添加到活化微粒(1.4L)中，同时混合。将偶联反应继续2小时+/-10分钟。
监测缀合效率：
获取500μL的缀合溶液，以20K rpm离心20分钟(可以离心两次以去除细粒)。使用活化缓冲液来运行基线光谱(250nm-750nm)。获取150μL-200μL的上清液以记录光谱。读取A280并且使用1.38的吸收和消光系数来计算上清液中抗体的浓度(mg/mL)。偶联效率＝(总抗体浓度－上清液中保留的抗体浓度)/总抗体浓度
A280＝0.0276；上清液抗体浓度＝A280/1.38＝0.0276/1.38＝0.02mg/mL
原始总抗体浓度：在1.4L中622mg的抗体或0.444mg/mL。
偶联效率＝(0.444-0.02)/0.444＝0.955或95.5％。
甘氨酸封闭：
1M甘氨酸溶液的所需量＝批量大小×0.1＝1.4L×0.1＝0.14L或140mL。
将140mL的1M甘氨酸溶液添加到粒子悬浮液中并且在2℃-8℃继续混合6小时-24小时。
缀合后的聚集检查：
在340nm和650nm处使用洗涤缓冲液使分光光度计置零。使用洗涤缓冲液稀释粒子悬浮液的少量样品以使它在340nm具有1.0+/-0.1的吸光度。读取和记录以下A340/A650吸光度比并且记录稀释倍数：
A340/A650＝1.071/0.900＝1.190
与抗体缀合的微粒的渗滤和超声处理：
如上文所述准备渗滤和超声处理器设备。
将缀合的粒子放到适当的密封混合容器中。打开泵以使缀合的粒子在系统中再循环。确保系统中不存在渗漏。将泵调到最多360rpm的设置或直到入口压力达到10PSI的最高压力为止。
将滤液管线打开至中空纤维模块并且监测滤液。确保滤液是澄清的并且没有粒子经由滤液漏出。
一旦系统准备就绪，就开始渗滤并且将滤液收集在适当的容器中。调节输入缓冲液的流动速率以使混合容器中液体的水平保持相对恒定。
将超声发生器打开到最大输出的30％-50％的设置。
洗涤缓冲液的所需量＝15×批量大小＝15×1.4＝21L
对缀合的粒子进行渗滤和超声处理直到使用所需量的洗涤缓冲液为止。在整个渗滤过程期间持续监测滤液。
在已经使用了所需量的洗涤缓冲液之后，获取粒子的少量样品并且如先前所述，使用洗涤缓冲液置零来测量聚集比率。记录以下结果：
A340/A650＝1.025/0.300＝3.417
继续超声处理直到达到目标聚集值(约6)为止。在超声处理结束时测量最终的聚集结果并且记录以下结果：
A340/A650＝1.045/0.169＝6.183
关闭超声发生器，然后排空系统。
取出容纳缀合的粒子的混合容器。
使用以下计算和量将BSA、叠氮化钠以及蔗糖添加到缀合粒子悬浮液中：
BSA：批量大小×5g/L＝7.7×5＝38.5g
叠氮化钠：批量大小×0.9g/L＝7.7×0.9＝6.93g
将上述化学品(BSA、叠氮化钠以及蔗糖)溶解在小体积的洗涤缓冲液中，并且经由0.45μm过滤器过滤，之后添加到缀合粒子悬浮液中。将缀合的粒子充分混合。
检查悬浮液的pH值，并且如果有必要的话，在室温使用1N HCl或1M NaOH将pH调节到8.2+/-0.1。
缀合微粒的热应力处理：
将缀合的微粒储存在密封容器中并且将它在具有约40℃、优选地45℃温度的孵育箱中放置至少1天，优选地3天-5天+/-5小时。
最终的聚集和pH值检查：
检查聚集比率：A340/A650＝1.01/0.170＝5.941
R2微粒优化：
通过用豆荚蛋白R2稀释液稀释以例如制备从1:1.25稀释到1:3稀释的系列稀释液来制备R2微粒的不同稀释液，并且检查背景吸光度。
通过调整PEG的百分比进行的R1试剂优化：
制备含有0％PEG、1％PEG以及2％PEG的一些豆荚蛋白R1试剂。
通过用0％PEG R1稀释或添加2％PEG R1来调整PEG％。
使用R2的3种不同的稀释液和PEG在R1中3种不同的浓度，在化学分析仪上执行校准曲线。
基于背景(校准物0活性)、灵敏度(校准物1活性)以及测量范围(校准物6活性-校准物5活性)/校准物5活性选择PEG在R1中最佳的百分比和最佳的R2稀释液。
选择微粒稀释液和PEG在R1中的百分比的组合，该组合使得校准曲线成为最佳拟合和最宽的窗口。举例来说，发现R1中最佳的PEG％是约0.8％。
通过添加由上述优化实验所确定的最佳百分比的PEG来制备大量试剂(bulk reagent)R1。
通过根据由上述实验所发现的优化结果使用豆荚蛋白稀释液制备缀合的胶乳粒子的最佳稀释液来制备大量试剂R2。
将R1试剂和R2试剂这两者储存在2℃-8℃。保存期应当从制造日期开始超过1年。
使用优化的R1试剂和R2试剂、反应程序(图1)和优化的R1:R2比率(3:1)以及样品体积(3μL-5μL)，典型的剂量响应曲线示于附图的图2中。
实施例2：校准曲线
胶乳增强豆荚蛋白免疫测定法的典型校准曲线(剂量响应曲线)(图2)。当将校准物在日立917仪器上以被设置在570nm的主波长和被设置在800nm的次波长运行时，所述校准物活性(ΔmAb/分钟)如下。
将胶乳增强豆荚蛋白免疫测定法与可商购获得的ELISA方法相比较，并且65个样品的测试结果的相关性示于图3中。与所述基础方法(predicatemethod)相比，所述测定法具有大于0.98的r2。
胶乳增强豆荚蛋白免疫测定法具有广泛的测定动态范围，并且使用罗氏(Roche)Modular P分析仪研究出测定线性度在0.2ng/mL至160ng/mL的范围，如图4中所示。具有大于160ng/mL的豆荚蛋白值的样品需要用盐水稀释并且重新测试。所获得的结果需要乘以稀释倍数。
实施例3采用对照的测定结果
表1：采用对照的测定结果：使用日立917分析仪测试低值、中值以及高值的对照。
表1：批内精确度
对照1(0.5ng/mL) 对照2(18.5ng/mL) 对照3(110ng/mL)
N 80 80 80
平均值 0.492 18.38 112.30
SD 0.03 0.05 0.11
CV％ 9.5 7.8 5.2
根据临床实验室标准化协会(Clinical Laboratory Standards Institute，原先的NCCLS))EP5-A准则来评价豆荚蛋白测定法的精确度。在所述研究中，在20个工作日里，在日立917分析仪上测试三种水平的含有豆荚蛋白的对照，每天运行两次，一式两份。
实施例4：来自健康志愿者和乳腺癌患者的样品的测定结果
图5：来自健康志愿者和乳腺癌患者的样品的测定结果：在日立917分析仪上使用胶乳增强豆荚蛋白免疫测定法测试来自健康志愿者的二十五(25)个血清样品和来自乳腺癌患者的63个血清样品。健康志愿者的豆荚蛋白的血液水平在0至17.4ng/mL的范围，并且健康志愿者的豆荚蛋白浓度的第99个百分位数值是15.7ng/mL。相比之下，乳腺癌患者的豆荚蛋白值显著高于健康志愿者的样品的豆荚蛋白值，它在18.5ng/mL至958.0ng/mL的范围。
实施例5：来自胃癌患者的样品的测定结果
图6：来自胃癌患者的样品的测定结果：使用日立917化学分析仪使用胶乳增强豆荚蛋白免疫测定法测试来自被诊断患有胃癌的患者的二十七(27)个血清样品。发现来自胃癌患者的血清中豆荚蛋白的水平在15.5ng/mL至高达869ng/mL的范围，除了两个样品低于11.0ng/mL之外。
实施例6：来自结肠癌患者的样品的测定结果
图7：来自结肠癌患者的样品的测定结果：在日立917化学分析仪上使用胶乳增强豆荚蛋白免疫测定法测试来自被诊断患有结肠癌的患者的四十九(49)个血清样品。发现结肠癌患者的血清中豆荚蛋白的水平在21.2ng/ml至高达601ng/ml的范围，有两个具有14.0ng/mL和16.1ng/mL值的例外样品。

Claims (80)

1.一种用于测定样品中豆荚蛋白的水平的方法，所述方法包括：
1)使含有或疑似含有豆荚蛋白的样品与包被有特异性结合豆荚蛋白或其降解片段的抗体或其片段的微粒接触；
2)检测与所述微粒接触的所述样品的光学变化或信号变化；以及
3)通过将所述光学变化或信号变化与已知水平的豆荚蛋白的校准物相比较来确定所述样品中豆荚蛋白的水平。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是生物样品。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述生物样品是血液样品、血清样品、或血浆样品。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述微粒包括多个微粒。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：
4)将所述样品中豆荚蛋白的水平与正常参考范围或临界值相比较，
其中所述样品来自于患有或疑似患有癌症的受试者，并且所述样品中豆荚蛋白的水平处在所述正常参考范围之外或高于所述临界值则表示所述受试者的癌症风险较高。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述豆荚蛋白是哺乳动物来源的。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述豆荚蛋白是人类来源的。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述豆荚蛋白是天冬酰胺酰肽链内切酶[EC 3.4.22.34]。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述豆荚蛋白具有天冬酰胺酰肽链内切酶[EC 3.4.22.34]活性。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述抗体对哺乳动物豆荚蛋白、人类豆荚蛋白、或其蛋白水解降解片段具有特异性。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述抗体片段是Fab、F(ab')2、Fv或scFv。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述抗体是完全人类抗体。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段是重组产生的。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段和/或所述微粒与试剂偶联。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述试剂是用于检测的试剂。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述用于检测的试剂用于化学发光检测或荧光检测。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述微粒是胶乳粒子、金粒子或磁性粒子。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述微粒具有在约5nm至约2000nm范围的直径。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述微粒具有在约40nm至约400nm范围的直径。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述微粒是磁性粒子，并且其中所述方法进一步包括一个或多个洗涤步骤。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述检测步骤进一步包括检测化学发光和/或荧光。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段与所述微粒上可供使用的包被位点的比率是约0.1至约1.0。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段与所述微粒上所述可供使用的包被位点的比率是约0.5至约1.0。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中在所述接触步骤中使用凝集增强剂或刺激剂。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述凝集增强剂或刺激剂是聚乙二醇。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述聚乙二醇的分子量在约600Da至约100,000Da的范围。
28.如权利要求26或27所述的方法，其中所述聚乙二醇的最终浓度在约0.3％至约1.5％(w/v)的范围。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述凝集增强剂或刺激剂是聚乙烯吡咯烷酮。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量在约10,000Da至约750,000Da的范围。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中所述聚乙烯吡咯烷酮的最终浓度在约0.1％至约3.0％(w/v)的范围。
32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中在约30℃至约50℃的温度对包被有所述抗体或其片段的所述微粒进行热应力处理至少约10小时。
33.如权利要求32所述的方法，其中在约45℃对包被有所述抗体或其片段的所述微粒进行热应力处理约一天至约五天。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述样品是来自人类或非人类哺乳动物的血清样品或血浆样品。
35.如权利要求5至34中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体肿瘤。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述癌症选自由乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌以及肺癌组成的组。
37.一种用于测定样品中豆荚蛋白的水平的试剂盒，所述试剂盒包含：
第一试剂(R1)，所述第一试剂包含缓冲液，所述缓冲液的pH值在约3.0至约10.0的范围；以及
第二试剂(R2)，所述第二试剂包含包被有特异性结合豆荚蛋白或其降解片段的抗体或其片段的微粒。
38.如权利要求37所述的试剂盒，其中所述微粒包括多个微粒。
39.如权利要求37或38所述的试剂盒，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
40.如权利要求37至39中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体对哺乳动物豆荚蛋白、人类豆荚蛋白、或其蛋白水解降解片段具有特异性。
41.如权利要求37至40中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体片段是Fab、F(ab')2、Fv或scFv。
42.如权利要求37至41中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体是完全人类抗体。
43.如权利要求37至42中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体或其片段是重组产生的。
44.如权利要求37至43中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体或其片段和/或所述微粒与试剂偶联。
45.如权利要求44所述的试剂盒，其中所述试剂是用于检测的试剂。
46.如权利要求45所述的试剂盒，其中所述用于检测的试剂用于化学发光检测或荧光检测。
47.如权利要求37至46中任一项所述的试剂盒，其中所述微粒是胶乳粒子、金粒子或磁性粒子。
48.如权利要求37至47中任一项所述的试剂盒，其中所述微粒具有在约5nm至约2000nm范围的直径。
49.如权利要求37至48中任一项所述的试剂盒，其中所述微粒具有在约40nm至约400nm范围的直径。
50.如权利要求37至49中任一项所述的试剂盒，其中所述微粒是磁性粒子。
51.如权利要求37至50中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含洗涤缓冲液。
52.如权利要求37至51中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于检测化学发光和/或荧光的一种或多种试剂。
53.如权利要求37至52中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体或其片段与所述微粒上可供使用的包被位点的比率是约0.1至约1.0。
54.如权利要求37至53中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体或其片段与所述微粒上所述可供使用的包被位点的比率是约0.5至约1.0。
55.如权利要求37至54中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含凝集增强剂或刺激剂。
56.如权利要求55所述的试剂盒，其中所述凝集增强剂或刺激剂是聚乙二醇。
57.如权利要求56所述的试剂盒，其中R1中所述聚乙二醇的分子量在约600Da至约100,000Da的范围。
58.如权利要求56或57所述的试剂盒，其中R1中所述聚乙二醇的最终浓度在约0.3％至约1.5％(w/v)的范围。
59.如权利要求55所述的试剂盒，其中所述凝集增强剂或刺激剂是聚乙烯吡咯烷酮。
60.如权利要求59所述的试剂盒，其中R1中所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量在约10,000Da至约750,000Da的范围。
61.如权利要求59或60所述的试剂盒，其中R1中所述聚乙烯吡咯烷酮的最终浓度在约0.1％至约3.0％(w/v)的范围。
62.如权利要求37至61中任一项所述的试剂盒，其中在约30℃至约50℃的温度对包被有所述抗体或其片段的所述微粒进行热应力处理至少约10小时。
63.如权利要求62所述的试剂盒，其中在约45℃对包被有所述抗体或其片段的所述微粒进行热应力处理约一天至约五天。
64.如权利要求37至63中任一项所述的试剂盒，其中所述豆荚蛋白是哺乳动物来源的。
65.如权利要求37至64中任一项所述的试剂盒，其中所述豆荚蛋白是人类来源的。
66.如权利要求37至65中任一项所述的试剂盒，其中所述豆荚蛋白是天冬酰胺酰肽链内切酶[EC 3.4.22.34]。
67.如权利要求37至66中任一项所述的试剂盒，其中所述豆荚蛋白具有天冬酰胺酰肽链内切酶[EC 3.4.22.34]活性。
68.如权利要求37至67中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含与R1和/或R2一起包装或分开包装的校准物或校准物组。
69.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中首先将所述样品与第一试剂混合，继而添加第二试剂，所述第二试剂包含包被有所述特异性结合豆荚蛋白或其降解片段的抗体或其片段的所述微粒。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述第一试剂包含缓冲液。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述缓冲液具有在约3.0至约10.0范围的pH值。
72.如权利要求69至71中任一项所述的方法，其中所述第一试剂包含凝集增强剂或刺激剂。
73.如权利要求5至36和69至72中任一项所述的方法，其中使用已确立的临界值来评估所述癌症风险。
74.如权利要求73所述的方法，其中使用18.5ng/mL±3ng/mL的豆荚蛋白水平的已确立的临界值来评估所述癌症风险。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述已确立的临界值是针对乳腺癌、胃癌和/或结肠直肠癌的。
76.如权利要求73所述的方法，其中所述针对乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌和/或胃癌的临界值是在血浆样品或血清样品中18.5ng/mL的豆荚蛋白。
77.如权利要求73所述的方法，其中所述已确立的临界值是根据样品情况、所述样品是来自于雌性受试者还是雄性受试者、和/或所述癌症类型来设定的。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述已确立的临界值被设定在约15.0ng/mL至约25.0ng/mL。
79.如权利要求73所述的方法，其中针对乳腺癌和/或卵巢癌，所述已确立的临界值是在血浆样品或血清样品中约18.5ng/mL的豆荚蛋白。
80.如权利要求73所述的方法，其中针对胃癌、结肠癌和/或肺癌，所述已确立的临界值是约10ng/mL至约30ng/mL。
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