CN104965085B - 用于诊断和监测糖尿病的唾液蛋白糖基化测试 - Google Patents

用于诊断和监测糖尿病的唾液蛋白糖基化测试 Download PDF

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Abstract

本文公开了用于诊断和/或监测受试者中的诸如糖尿病等代谢病症的方法和试验，其中所述方法和试验测量唾液糖蛋白。所述方法中的一些是基于使用例如偏高碘酸钠氧化来自所述受试者的样本(如唾液或者尿液)中的糖蛋白，然后用化学检测方法检测氧化过程中产生的醛。还公开了用于检测唾液样本中的糖蛋白的试剂盒和横向流动装置。

Description

用于诊断和监测糖尿病的唾液蛋白糖基化测试
政府利益
本发明是在美国国立卫生研究院授予的拨款/合同号R43 DE020973下的政府支持下作出的。美国政府在本发明中享有某些权利。
技术领域
本文的实施方案涉及糖尿病的领域，并且更加具体地涉及对患有糖尿病前期、糖尿病或者糖尿病并发症的受试者的诊断和监测。
背景技术
见于糖尿病前期、妊娠糖尿病和确诊的糖尿病的升高的葡萄糖水平会影响在生物体液中发现的蛋白质生物标志物。例如，血糖控制可能影响到直接的、非酶的蛋白质的糖化，其中通过在葡萄糖分子的醛基和蛋白质中的赖氨酸残基的氨基之间形成席夫碱，而使葡萄糖共价键连接于靶蛋白。然后，席夫碱经历Amadori重排和氧化而形成晚期糖基化终产物(advanced glycation end product)。晚期糖基化终产物的一个例子是血红蛋白A1c(HbA1c)。HbA1c的血液水平代表平在过去3个月的平均血糖(BG)水平，反映了运载血红蛋白的红细胞的寿命。
使用HbA1c监测葡萄糖稳态产生了大量的问题，包括它不能反映BG中的短期变化、对HbA1c水平的显著遗传和非血糖的影响、以及HbA1c水平和平均BG水平之间的关系中的显著的年龄依赖性和种族差异。使用糖化白蛋白或果糖胺作为替代物提供反映更短的响应时间的优势(例如：代表在过去2-4周的平均BG水平)，但是，妨碍HbA1c的效用的各种因素对这些糖化蛋白和先前的BG水平之间的关系的影响仍是有问题的。
附图说明
通过如下详细描述，结合附图，本公开的实施方案将更容易被理解。实施方案通过举例而非限制的方式在附图的图示中示出。
根据各种实施方案，图1A和1B是示出了基准(baseline)唾液糖基化与果糖胺(图1A)和血红蛋白A1c(图1B)的关系的曲线图；
根据各种实施方案，图2是示出了随着时间推移，受试者中的唾液糖基化的曲线图，其中针对对10个参与者的研究日标绘了每周的唾液糖基化；
根据各种实施方案，图3A、3B和3C是三幅示出了唾液糖基化和在21天的时段内的平均BG、BG SD、以及平均血糖波动幅度(MAGE)的关系的曲线图。其中针对21天的平均血糖(图3A)、血糖标准偏差(图3B)和研究时间为21天和28天的MAGE(图3C)，唾液糖基化被标绘；
根据各种实施方案，图4A、4B和4C示出21天的平均BG与唾液糖基化、果糖胺及HbA1c的比较。其中针对唾液糖基化(图4A)、果糖胺(图4B)以及研究28天的血红蛋白A1c(图4C)，21天内的平均血糖被标绘；
根据各种实施方案，图5A和5B示出具有低血糖变化性和高血糖变化性的受试者的21天的平均血糖和果糖胺的相关性，其中平均血糖与具有低血糖变化性和高血糖变化性的个体的果糖胺(图5A)及唾液糖基化(图5B)相关；
根据各种实施方案，图6A和6B示出本文所述的唾液糖基化方法中所涉及的两个化学反应：生成醛的邻二醇的高碘酸盐氧化(图6A)，以及4-氨基-3-肼基-5-巯基1，2，4-三唑(AHMT)与醛的反应(图6B)；
根据各种实施方案，图7A和7B是示出了唾液总糖基化板测定(salivary totalglycosylation plate assay)的准确性的两张图，比较了牛胎球蛋白标准曲线(图7A)与唾液总糖基化(7B)；
根据各种实施方案，图8A和8B为示出固相测定法的例子的数字图像(图8A)和曲线图(图8B)；
根据各种实施方案，图9A和9B为示出固相测定法的颜色变化的时间进程的数字图像(图9A)和曲线图(图9B)；
根据各种实施方案，图10A、10B和10C示出了板测定法和浸渍片(dipstick)测定法的比较，包括显示视觉测定法和板测定法的比较(图10A)、浸渍片测定法和板测定法的比较(图10B)、以及浸渍片测定法、板测定法和CGMS样品的比较(图10C)的曲线图；
根据各种实施方案，图11A和11B示出浸渍片测试的概要图(图11A)和双膜浸渍片测试的例子的原理图(图11B)；
根据各种实施方案，图12A和12B示出三膜、一步的横向流动测试(lateral flowtest)的例子的原理图(图12A)和用于解释试验结果的比色图表(图12B)；
根据各种实施方案，图13A和13B示出显示了具有偏高碘酸钠浓度为30mg/10mL缓冲液、50mg/10mL缓冲液和100mg/10mL缓冲液的三膜(一步)唾液测试条的三个例子的比较和它们检测胎球蛋白的功效(以百分比反射率衡量)的表格(图13A)，以及显示阴性和阳性对照的三膜唾液测试条的两个例子的数字图像。
具体实施方式
在下面的详细说明中，参照构成本文一部分的附图，且在附图中通过图示方式示出其中的公开可以被实施的方案。应该理解的是，在不背离本公开的范围的情况下，可以利用其它实施方案，以及可以做出结构或逻辑的改变。因此，下面的详细描述不应被认为具有限制意义，并且根据本公开的实施方案的范围由所附的权利要求及其等同物限定。
可以以有助于理解本公开的实施方案的方式，将各种操作依次描述为多个离散的操作。然而，描述的顺序不应被解释为暗示这些操作是有顺序依赖性的。
所述描述可以使用基于视角的描述，例如上/下、前/后、和顶部/底部。这样的描述仅仅是用来便于论述，并且没有试图限制本公开的实施方案的应用。
为了本公开的目的，短语“A/B”的意思是A或B。为了本公开的目的，短语“A和/或B”的意思是“(A)、(B)或者(A和B)”。为了本公开的目的，短语“A、B和C中的至少一个”的意思是“(A)、(B)、(C)、(A和B)、(A和C)、(B和C)或(A、B和C)”。为了本公开的目的，短语“(A)B”的意思是“(B)或者(AB)”，即，A是可选要素。
该描述可以使用短语“在实施方案中(in an embodiment)”或者“在多个实施方案中(in embodiments)”，它们各自可以指一个或者多个相同或者不同的实施方案。此外，如关于本发明的实施方案中所使用的术语“包含”、“包括”、“具有”等等是同义的。
为了便于评述本公开的各种实施方案，提供了特定术语的如下解释：
本文所用的术语“分析物”指的是试图检测或测量的原子、分子、分子组、或天然来源或合成来源的化合物(例如，醛、糖脂或糖蛋白)。分析物可以包括，但不限于醛、抗体、药物、激素、抗原、半抗原、糖蛋白、糖脂、碳水化合物、脱辅基蛋白、和辅因子。
本文所用的术语“生物样品”是指从植物或动物受试者获得的任何样品。如本文所用，生物样品包括对检测受试者中的糖基化概况(glycosylation profile)、蛋白质量、或蛋白质的糖基化模式有用的所有临床样品，包括但不限于细胞、组织和体液，如：血液；血的衍生物和组分，如血清；提取的胆汁；活检或手术切除的组织，包括例如未固定的、冷冻的、固定在福尔马林中和/或嵌入石蜡中的组织；眼泪；粘液；唾液；牛奶；皮肤擦伤；表面清洗；尿液；痰液；汗液；精液；阴道分泌物；来自溃疡和/或其他表面出疹、水泡、脓肿、和/或组织提取物的液体；细胞或器官；脑脊液；前列腺液；脓；或骨髓穿刺液。生物样品也可以是实验室的研究样品，如细胞培养的上清液。在特定的例子中，所述样品是尿液或唾液。所述样品可以采用本领域技术人员所熟知的方法收集或获得。
本文所用的术语“化学氧化”是指涉及有意使生物样本与化学氧化试剂(诸如唾液样品)接触的过程。如本文所用，术语“化学氧化”排除了自然发生的氧化过程，例如当生物样品暴露在氧气中(例如可能存在于环境空气中)时发生的那些氧化过程。相反，所述术语包括源自与固体或液体氧化剂的有意接触的化学氧化过程。一般来说，这种化学氧化导致样品中全部或大部分的唾液酸和/或岩藻糖被氧化，如存在于样品中的至少50％、至少70％、至少90％、或甚至更多的唾液酸和/或岩藻糖被氧化。
本文所用的术语“检测”指的是定量或定性地确定受调查研究的分析物(诸如糖蛋白或醛)的存在。
本文所用的术语“糖尿病”(diabetes mellitus)是指由导致不受控制的碳水化合物代谢的胰岛素的相对或绝对的缺乏而引发的疾病，通常简化为“糖尿病(diabetes)”，然而糖尿病不应与尿崩症混淆。如本文所用，“糖尿病(diabetes)”是指糖尿病(diabetesmellitus)，除非另有说明。“糖尿病病症”包括糖尿病前期和糖尿病。1型糖尿病(有时被称为“胰岛素依赖型糖尿病”或“幼年发病型糖尿病”)是以破坏胰岛β细胞为特征的自身免疫性疾病，其导致完全或几乎完全缺乏胰岛素。在2型糖尿病中(T2DM；有时被称为“非胰岛素依赖型糖尿病”或“成人发病型糖尿病”)，虽然胰岛素是存在的，但身体对胰岛素不响应。如本文所用，术语“代谢病症”用来指1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前期和糖尿病并发症。
糖尿病的症状包括：过度口渴(多饮)；尿频(多尿)；极度饥饿或经常进食(多食症)；不明原因的体重减轻；尿中出现葡萄糖(糖尿)；疲倦或疲劳；视力变化；在四肢麻木或刺痛(手，脚)；伤口或溃疡愈合缓慢；和异常高频率的感染。糖尿病可以通过以下而进行临床诊断：空腹血糖(FPG)浓度大于或等于7mmol/L(126mg/dL)，或在具有75g的负荷的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)后的约两小时，血浆葡萄糖浓度大于或等于11.1mmol/L(200mg/dL)。糖尿病的更加详细的描述可以在Cecil Textbook of Medicine，J.B.Wyngaarden，等，编辑(W.B.Saunders Co.，费城，1992，第19版)中找到。
本文所用的术语“糖基化”是指以一个或多个寡糖链共价修饰生物分子(如蛋白质或脂质)。具有至少一个寡糖修饰的蛋白质被称为“糖蛋白”或“糖基化蛋白”。在蛋白质的情况下，糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接糖基化是指寡糖与蛋白质中的天冬酰胺残基的侧链氨基相连接。O-连接糖基化是指寡糖与蛋白质中的丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸氨基酸的羟基侧链相连接。
由于各种糖的组合(例如，N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰基乳糖胺、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰神经氨酸或岩藻糖)和支链结构的存在(如二触角、三触角，或四触角结构)，糖蛋白的寡糖链是非常多样化的。
本文所用的术语“横向流动装置”是指吸收或吸附液体样品、按路线发送液体样品到检测区、并使用检测方法来产生响应于特定的分析物(如糖蛋白、糖脂类或醛)的存在与否的检测信号的装置。该装置可以是在横向流动层析中所使用的测试条，其中的怀疑含有分析物的测试样品液流过(例如，通过毛细管作用)所述条带(通常是由吸水材料如纸、硝化纤维和纤维素制成)。测试液和任何悬浮的分析物可以沿着条带流到检测区，其中分析物(如果存在)与检测试剂相互作用以指示分析物的存在、不存在和/或数量。横向流动装置可以产生定性的或定量的测试结果。
众多的横向流动分析装置已经被公开，包括在以下专利中所示出的那些：美国专利号4,313,734；4,435,504；4,775,636；4,703,017；4,740,468；4,806,311；4,806,312；4,861,711；4,855,240；4,857,453；4,943,522；4,945,042；4,496,654；5,001,049；5,075,078；5,126,241；5,451,504；5,424,193；5,712,172；6,258,548；6,555,390；6,699,722；和6,368,876；EP 0810436；以及WO92/12428；WO 94/01775；WO 95/16207和WO 97/06439，其每一个通过引用并入本文。
许多横向流动装置都是一步的横向流动测定，其中生物流体被放置在吸水条上的样品区域(然而，非吸水的材料可以被使用，通过施用表面活性剂到该材料而使其呈现吸水性)，并让其沿着条带迁移直到液体与化学试剂或特异性结合伴侣相接触，所述化学试剂或特异性结合伴侣与液体中的分析物(如醛、糖蛋白或糖脂类)相互作用。一旦分析物与化学试剂或特异性结合伴侣相互作用，则指示该相互作用的信号(如荧光或其他可见的染料)出现。可以将多个离散的化学试剂或特异性结合伴侣置于所述条带上(例如在平行线上)来检测液体中的多种分析物。测试条也可包含对照指示剂(control indicators)，所述对照指示剂提供该测试已经充分被执行的信号，即使在所述条带上看不到指示分析物的存在(或不存在)的阳性信号的情况下。
如本文所用，两个固体组件在直接或者间接接触时，它们是以以下这样的方式处于″可操作的接触″或″连续的接触″：使水性液体通过毛细作用或其他方式可以从两个组件中的一个实质上不间断地流向另一个。直接的或连续的接触意味着这两个组件处于物理接触，例如边缘到边缘或前面到背面。当两个组件直接接触时，他们可以重叠有约0.5mm到约3mm的重叠。但是，这些组件可以以边缘邻接的方式放置。″间接接触″意味着两个组件没有物理接触，而是通过一个或多个传导物桥接。可操作的接触也可称为″流体传送″或″流体连续″接触。
本文所用的术语“样品施用区域”指的是液体样品被引入到层析测试条的区域，所述层析测试条为诸如存在于横向流动装置的层析测试条。在一个例子中，可以通过外部施用而将样品引入到样品的施用区，如用滴管或其他施用器。在另一例子中，可以将样品的施用区直接浸入样品中，如测试条浸入装载样品的容器中时。在另一例子中，样品可以被倾倒或者表达(expressed)在样品施用区上。
本文所用的术语“固体载体(solid support)”和“基底(substrate)”指的是不溶解的、或者可以通过后续反应制成不溶解的任何材料。许多不同的载体是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，硝化纤维、反应盘的孔的壁、多孔板、试管、聚苯乙烯珠、磁珠、膜和微粒(如乳胶颗粒)。任何具有允许检测试剂进入的足够的孔隙度和具有固定捕获试剂(例如抗体)的合适的表面亲和力的多孔材料是本术语涉及的。例如，硝化纤维的多孔结构对多种试剂(例如，捕获试剂)具有极好的吸收和吸附特性。尼龙具有相似的特性，也是合适的。微孔结构是有用的，水合状态下具有凝胶结构的材料也是如此。
有用固体载体的进一步的例子包括：天然聚合物碳水化合物和它们的合成修饰、交联或取代的衍生物，如琼脂、琼脂糖、交联的海藻酸、取代和交联的瓜尔胶、纤维素酯(尤其硝酸和羧酸的纤维素酯)、混合纤维素酯和纤维素醚；含氮天然聚合物，如蛋白质及其衍生物，包括交联或改性的明胶；天然的烃聚合物，如胶乳和橡胶；可由适当的多孔结构制备的合成的聚合物，如乙烯基聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯和它的部分水解的衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、以上缩聚物的共聚物和三元聚合物，如聚酯、聚酰胺和其它聚合物，如聚氨酯或聚环氧化物；无机多孔材料如碱土金属和镁的硫酸盐或碳酸盐，包括硫酸钡、硫酸钙、碳酸钙、碱金属、碱土金属、铝和镁的的硅酸盐；以及铝或硅的氧化物或水合物，如粘土、氧化铝、滑石、高岭土、沸石、硅胶、玻璃或玻璃纤维(在一些例子中，这些材料同以上聚合物材料可以被用作过滤器)；以及上述类别的混合物或共聚物，如通过在已存在的天然聚合物上启动合成的聚合物的聚合而获得的接枝共聚物。
可以通过化学过程活化固体载体的表面，所述化学过程使得试剂(例如，化学试剂)共价连接于所述载体。然而，可以使用其它任何合适的方法来用于将试剂(例如，化学试剂)固定到固体载体，包括但不限于，离子相互作用、疏水相互作用、共价相互作用等。由于固相的吸引和固定试剂(例如，化学试剂)的固有能力，可以选择固相。这些因素可以包括相对于所述化学试剂，带相反电荷的带电物质。除非另有物理上的限制，固体载体可以以任何合适的形状被使用，如膜、片、条或板，或者它可以涂覆到或粘结或层压到合适的惰性载体，如纸张、玻璃，塑料薄膜或织物。如本文所用，“横向流动基底”是在横向流动装置中是有用的的任何载体或基底。
本文所用的术语“受试者”指的活的多细胞脊椎动物生物体，其是包括人类和非人类哺乳动物(如实验室或兽医的受试者)的类别。
这里的实施方案提供用于诊断和/或监测受试者的代谢病症(如糖尿病)的方法和试验。其中所述方法和试验测量唾液糖蛋白。在各种实施方案中，该方法是基于例如使用偏高碘酸钠氧化来自于受试者的样品(唾液或尿液)中的糖蛋白，然后使用化学检测方法检测氧化过程中产生的醛。在各种实施方案中，该方法是基于样品中的经氧化的特定的糖蛋白(主要是唾液酸和岩藻糖)的发现，相比传统的监测工具，如HbA1c和果糖胺，提供了血糖控制的准确测量。
该发现是意想不到的，因为以前对凝集素结合的研究表明，对血糖状态的最精准的预测需要五个成员组的凝集素(例如橙黄网胞盘菌凝集素(Aleuria aurantia lectin)、刀豆素A、菜豆凝集素、欧曼陀罗凝集素(Datura stramonium lectin)和黑接骨木凝集素(Sambucus nigra lectin))。这些凝集素与唾液酸和岩藻糖结合，还且还与甘露糖、半乳糖和N-乙酰葡葡糖胺。相比之下，本文所公开的方法只需检测唾液酸和岩藻糖的氧化产物。该方法的额外优势是，作为纯粹的化学检测方法，它不依赖于与糖蛋白上存在的碳水化合物部分相结合的凝集素或抗体。
HbA1c和果糖胺试验测量直接的、非酶蛋白质糖化。与非酶糖化截然相反，目前公开的方法不是测量通过细胞内糖基化而改性的蛋白质，因此避免了与基于糖化试验的相关问题。高血糖症增加了通过氨基己糖的生物合成途径的葡萄糖通量，该生物合成途径对于各种碳水化合物部分加成到蛋白质提供了UDP-G1cNAc和GalNAc前体，所述各种碳水化合物部分通过细胞内蛋白质的β-连接的O-糖基化以及以及细胞表面和分泌的蛋白的α-连接粘蛋白型O-连接和β-连接的N-糖基化而加成到蛋白质。胞内蛋白的O-糖基化调节各种细胞对胰岛素的反应能力，且不受理论束缚，由于高血糖症，分泌的粘蛋白型O-和N-糖基化蛋白的水平可以反映改变的细胞代谢。此外，不受理论束缚，高脂血症可以调节氨基己糖生物合成途径的活性。因此，生物流体中的糖蛋白水平的测定相比传统的糖化蛋白生物标志物，代表了对代谢控制更快速、灵敏和固有的生理反应。
虽然几乎所有的当前血糖状况评估使用血液样本，但在许多情况下因为患者年龄或对手指针刺或静脉穿刺态度，或者因为在农村或不发达地区的卫生问题，这是不理想的。相比之下，唾液作为诊断液，具有许多明显的优点，包括它的非侵入性和不需要特殊培训或设备就可以得到，并且对于儿童或老年人群体它是特别有利的且适合大规模的人群研究。因此，本文所公开的方法采用唾液的(和在某些情况下的尿液的)糖蛋白分析，用于血糖控制的短期评估。
各种实施方案还公开了板测定、浸渍片测试、以及用于检测唾液糖蛋白的横向流动装置。在一些实施方案中，所述测试可以包括用于检测和/或定量在预先氧化的唾液样品中的糖基化唾液蛋白的双膜浸渍试验。其它的实施方案是氧化唾液样本中的糖蛋白、然后检测产生的醛的三膜横向流动装置。
实施例
实施例1：受试者群体
从在尼扎姆医学科学研究所(印度，海得拉巴)受护理的70位2型糖尿病患者中招募了共10位受试者。受试者的临床特征如表1所示。
表1.受试者的临床特征
参与者特征 数量(％)
男性 9(90)
参与者特征(单位) 平均值(SD)
年龄(岁) 42.6(16.9)
体重指数(kg/m2) 26.3(4.3)
收缩压(mmHg) 127(15)
总胆固醇(mg/dL) 176(42)
LDL(mg/dL) 114(35)
HDL(mg/dL) 32(7)
甘油三酯(mg/dL) 148(68)
空腹血糖(mg/dL) 162(60)
血红蛋白A1c(％) 9.3(2.8)
空腹胰岛素(mIU/L) 40.5(43.4)
C-肽(ng/mL) 1.46(0.97)
使用Guardian实时监测仪(美敦力公司，北岭市，加州)对受试者进行连续28天的连续血糖监测(CGM)，对设备校准和样品收集进行每周的研究访问。未基于CGM结果来改变受试者的糖尿病治疗进程。在后续研究中获得的每个受试者BG测量的平均值为6909±436(平均值±SD)。在研究访问之前的至少8个小时内，受试者被要求不能饮食或者吸烟，所述研究访问在基准访问后的第1、7、14、21和28天的早上8点至9点进行。在每次研究访问时收集未受刺激的唾液样本，且标准血液图在基准时和第28天执行。此外，在基准和最后一次研究访问时获取临床参数，包括身高、体重和血压。
实施例2：唾液和血液测试
唾液样本在pH4.5的2％的乙酸中以1∶5的比例稀释。将经稀释样品的双份的50μL等分试样添加到96孔Reacti-Bind聚苯乙烯板的每个孔中(Thermo Scientific，罗克福德，伊利诺伊州)，然后加入25μL的10mM的偏高碘酸钠(在即将使用前用2％的乙酸配制，pH4.5)。将板在旋转振荡器上摇动30秒，然后覆盖起来并在室温下培养10分钟。在培养结束时，加入150μl的AHMT溶液(在35ml 1N氢氧化钠中的175mg 4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三唑；Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)。将板在旋转振荡器上摇动30秒，然后覆盖起来并在室温下培养1个小时。使用ELx800酶标仪(BioTek公司，Winooski，VT)测定在550nm处的吸光度。结果通过总蛋白浓度标准化并以任意单位(AU)进行记录。对于果糖胺的定量，血液样本使用AU400e化学分析仪(Olympus，Center Valley，PA)进行处理，对于HbA1c的测量，血液样本使用HLC-723G8高效液相色谱仪(东曹生物科技，King ofPrussia，PA)进行处理。
实施例3：统计分析
将受试者群体的基准特征以及28天的相关临床参数的变化制成表格。一个受试者丢失了第20-28天的CGM数据，因此在那些天的所有CGM分析都将其排除在外。为了从CGM数据中定量血糖控制，平均BG、BG的标准偏差(SD)和平均血糖波动幅度(MAGE；30)被计算出并且与7、14、21和28天的研究访问进行匹配。由于样本量小，分析主要是描述性的，并包括跨越时间的唾液糖基化测量与HbA1c、果糖胺、平均BG、BGSD、和平均MAGE的标绘图。计算皮氏相关系数，并针对在基准时和第1、7、14、21和28天的所有测量值进行标绘。进行探索性的纵向的重复测量分析，以评估所测量的唾液糖基化预测7、14、21和28天时间间隔的平均BG、BGSD、和MAGE的能力，并确定唾液糖基化最具预测性的时间间隔。血糖变化性对平均BG与果糖胺和唾液糖基化之间关系的影响的二级分析通过以下来进行：创建高BG和低BG变化性组(根据BG SD)，以及针对每个变化性组分别将平均BG与果糖胺和唾液糖基化相关联。为了将组之间的变化性的差异最大化，高、低BG变化性组包括四名分别为最高变化性和最低变化性的受试者。记录的p值是两面的。统计分析采用WindoWs的9.3版本的SAS系统的SAS软件进行。
实施例4：唾液糖基化的变化反映不同水平的血糖
在已经历了28天的CGM的患有2型糖尿病的10个受试者中，使用实施例1-4中的以上描述方法进行唾液糖基化的分析，以确定唾液糖蛋白的水平是否与相对的血糖相关联。如图1A和1B所示，基准唾液糖基化测量与基准果糖胺值密切相关(图1A；r＝0.65，p＝0.06)，并与HbA1c中度相关(图1B；r＝0.30，p＝0.40)。唾液糖基化与果糖胺密切相关且与血红蛋白A1c中度相关。
相对于时间绘制唾液糖基化的纵向值，以分析这些受试者中的范围和变化性(图2)。对于每个受试者，计算了唾液糖基化的平均值、SD和范围，并示于如下表2中。为测量唾液糖基化的变化性和BG变化性之间的关系，在所有可用的数据中使SD唾液糖基化与SD BG相关联，发现两种测量之间有很强的相关性(r＝0.56，p＝0.12)。
表2.受试者唾液糖基化的描述性统计
*受试者5第21天的唾液糖基化数据丢失
唾液糖基化测量结果与跨越7、14、21和28天的平均BG、BG SD和MAGE的相关性的皮氏相关系数和相应的p值，表明唾液糖基化与21天的平均BG之间的关系是最密切的(在第21天，r＝0.56，p＝0.23，以及在第28天，r＝0.42，p＝0.26)。分析结果在图3A、3B和3C中得以显示，所述的三幅图示出了，唾液糖基化和在21天的时段内的平均BG、BG SD、以及平均血糖波动幅度(MAGE)之间的关系，其中根据各种实施方案，其中针对21天的平均血糖(图3A)、血糖标准偏差(图3B)以及21天和28天的MAGE(图3C)，标绘了唾液糖基化。由于唾液糖基化与21天的平均BG具有显著的纵向关系(p＜0.01)，探索性的纵向的重复测量分析的结果证实了这一发现。唾液糖基化与研究日为21天和28天的平均血糖都密切相关，但与血糖标准偏差和MAGE弱相关，除了在第28天与血糖标准偏差密切相关。
使血糖控制的CGM测量与唾液糖基化、果糖胺、和HbA1c的测量相关联。图4A、4B和4C示出了21天的平均BG与唾液糖基化、果糖胺及HbA1c的比较，其中根据各种实施方案，针对唾液糖基化(图4A)、果糖胺(图4B)以及研究28天的血红蛋白A1c(图4C)，标绘了21天内的平均血糖。如图4A、4B和4C所示，唾液糖基化的测量证明了其与21天的平均BG比与HbA1c或果糖胺有更强的相关性。唾液糖基化和平均血糖之间有很强的正相关。平均血糖与果糖胺和血红蛋白A1c的相关性较差。表3提供了21天的平均BG、BG SD和MAGE与第28天的唾液糖基化、果糖胺和HbA1c之间的皮氏(Pearson’s)相关系数。与果糖胺和HbA1c相比，唾液糖基化是平均BG和BG SD的最强的预测物，而果糖胺是MAGE的最强的预测物。
表3.21天的平均血糖与第28天的唾液糖基化、果糖胺和HbA1c的相关性
*p＜0.05
执行子分析以确定唾液糖基化和果糖胺与平均BG的关系是否由BG的变化性来调节。低变化性组的受试者的平均BG SD为31mg/dL，而高变化性组的受试者的平均BG SD为65mg/dL。对于低变化性组的受试者，果糖胺是平均血糖的强有力的预测物(r＝0.98)；然而，对于高变化性组，果糖胺的增加很强地预测了平均BG的减少，这与临床预期截然相反。唾液糖基化对低变化性组和高变化性组的平均BG来说都是很强的预测物(r＝0.82，r＝0.64)，并且这极大的受到BG变化性的影响。图5A和5B示出了这些关系。更具体地说，根据各种实施方案，图5A和5B示出了具有低血糖变化性和高血糖变化性的受试者的21天的平均血糖和果糖胺的相关性，其中，平均血糖与具有低血糖变化性和高血糖变化性的个体的果糖胺(图5A)及唾液糖基化(图5B)相关。根据各种实施方案，增加的血糖变化性会削弱平均血糖与果糖胺之间的关系，但是这不会削弱平均血糖与唾液糖基化之间的关系。
在上述方法中，唾液酸和岩藻糖很容易被氧化而生成醛，且图6A和6B示出了本文描述的唾液糖基化方法中所涉及的两个化学反应：生成醛的邻二醇的高碘酸盐氧化(图6A)，以及4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三唑与醛的反应(图6B)，该反应产生颜色的变化，该颜色的变化例如可以通过目视或者色度计检测。
实施例5：用于诊断和监测糖尿病的唾液蛋白糖基化测试
确定血糖控制的方法的阵列的范围为从纯粹基于葡萄糖的参数到高血糖诱导的蛋白糖基化(HbA1c、果糖胺和糖化白蛋白)和1，5-脱水葡萄糖醇的重吸收指数，所述纯粹基于葡萄糖的参数诸如为患有1型糖尿病个体所通常使用的随机BG测试和评估糖尿病前期和2型糖尿病中的空腹血糖受损或葡萄糖耐量受损的空腹BG和口服葡萄糖耐量测试。血糖的变化性已成为监测血糖控制的潜在的重要方面，其与平均BG相比，可与如心血管疾病等并发症的发展更加相关。尽管常规筛查或监测中的评估性血糖变化性的临床应用仍有争议，但是如下文所述，血糖变化性对用于平均血糖的测定的性能的影响是重要的。用于长期和短期的平均血糖的现有的测定存在几个缺点，尤其是HbA1c无法反映个体患者中的血糖水平的固有变化性以及来源于不同的测量的平均血糖水平的差异(所谓的糖基化差距(glycation gap))。
本文所述是的血糖的替代参数(总蛋白糖基化)，它受细胞的新陈代谢推动并在唾液中可辨别。具体而言，基准唾液糖基化的测量与果糖胺(作为2-4周的血糖控制的测量标准)密切相关(r＝0.65)。此外，与HbA1c和果糖胺相比，唾液糖基化的测量是21天间隔的平均BG和BG SD的更好的预测物。此外，唾液糖基化的测量较果糖胺或HbA1c，表现出与血糖控制的测量的更强的相关性，并且就预测高血糖而言，果糖胺的准确度受BG变化性的影响，而唾液糖基化的准确度不受血糖变化性的影响。
因此，对于近来的高血糖，唾液糖基化是有力的替代性生物标志物，因为它比HbA1c或果糖胺具有更好的预测21天的血糖的测量的能力。此外，使用唾液而不是血液的能力构成了唾液糖基化的独特的、显著的优势。对于短期血糖的无创指示剂来说，重要的用途就是让治疗中的患者能更方便地监控他们的血糖控制。这可以使得对糖尿病药物依附的当前的低比率有所增加，所述增加将具有显著节省医疗成本的潜力。
实施例6：板测定
根据各种实施方案，图7A和7B是示出了唾液总糖基化板测定的准确度的两幅图，将牛胎球蛋白标准曲线(图7A)与唾液总糖基化(图7B)进行比较；
在一个特定的、非限制性的例子中，板测定可以按照如下操作进行：
1.在样品孔中加入40μL的2％醋酸(pH 4.5)
2.在适当的孔中加入50μl标准品和10μl样品
3.在使用和加入前，即刻制备25μl NaIO4溶液(10mM，或21.4mg/10mL缓冲液)
4.混合30秒，然后覆盖，并在室温培养10分钟
5.在使用和加入前，即刻制备150μl AHMT(34mM，或在35mL 1N氢氧化钠中的175mg)
6.搅拌30秒，然后覆盖，并在室温培养60分钟
7.在A550nm处读数。
实施例7：浸渍片(dipstick)测试的创建
虽然实施例1-6中的上述测定法产生了与21天的平均血糖的相关性很好的准确结果，但在一些实施方案中，对于即时使用，基于浸渍片的测试可能较在微量滴定板上进行的基于液体的测定更加可取。因此，在一些实施方案中，所公开的方法可以使用基于浸渍片的测试进行。然而，在各种实施方案中，以浸渍片的方式调整待用的板测定可能是具有挑战性的。例如，AHMT的固定需要选择最佳的膜基底(总共评价了超过50种不同的膜，但只有少数被证明是适用的)、最佳试剂浓度、以及最佳反应时间，且比色结果的稳定性可能也难以实现。在一些实施方案中，将偏高碘酸盐和碱掺入到膜中可能也具有挑战性。
根据各种实施方案，图8A和8B是示出固相原型测定的例子的数字图像(图8A)和曲线图(图8B)。在图8中所示的例子中，固相试验是通过将AHMT固定在膜上而设计的(用溶解在20mL DMSO中的0.2g AHMT的溶液所浸透的VWR 698玻璃纤维膜，吸干(blotted)、然后在50℃干燥1小时)。样品被氧化，将20μL样品加入到每个膜中，然后加入25μL 2NNaOH。根据各种实施方案，图9A和9B是示出固相测定法的颜色变化的时间进程的数字图像(图9A)和曲线图(图9B)。
在一些实施方案中，二膜浸渍片测试可用于替代图8和图9所述的固相测定。在典型的，二膜浸渍片法中，使用包括AHMT膜和碱性膜的膜装置。令人惊讶的是，氢氧化钠的普通水溶液在膜上被干燥时就不起作用了。然而，当使用80％的乙醇水溶液作为溶剂溶解氢氧化钠时，所得到的膜大大加快了反应速度。在将样品施用到膜前先进行30秒的氧化步骤，再将样品添加到膜，5分钟后，用色度计读取浸渍片。
在一些实施方案中，三膜浸渍片测试可用于替代图8和图9所述的固相测定。在示例性的三膜浸渍片测试中，使用包括AHMT膜、碱性膜和偏高碘酸钠膜的膜装置。偏高碘酸钠的乙酸溶液在膜上被干燥后就没有很好的表现，并且在不存在糖蛋白的情况下，在pH 5的MES缓冲液中的偏高碘酸钠(通常用于糖蛋白氧化研究)产生了高得令人无法接受的背景信号。然而，溶解于pH 5.5的50mM的磷酸钠中的偏高碘酸钠在VWR 692玻璃纤维膜上被干燥后能很好地起作用并且稳定。图13A和图13B是证实一步测定法的可行性的表格和数字图像。
同需要在使用前立即制备AHMT的氢氧化钠新鲜溶液的实施例6中的上述液体板测定相比，二膜浸渍片测试通过包括由网状层分隔开的两个单独的膜规避了这个问题，所述的两张膜中的一个具有固定化的AHMT，另一个具有NaOH。在各种实施方案中，两个膜之间不能彼此紧密接触，否则AHMT将被灭活。因此，网状分隔件被用于防止膜之间的紧密接触。
液体测定需要在高碘酸盐氧化后用AHMT进行60分钟的培养，但固相测定仅需要5-10分钟。醛与AHMT的初始加合物是无色的，只有随后被空气中的氧气氧化后才变成紫色。这一过程是扩散限制的，固定了AHMT的膜的高表面积促进了该反应的该部分。
此外，膜的选择是重要的。在各种实施方案中，必须选择不与高碘酸盐、AHMT或氢氧化钠反应的膜，并且它们需要足够的孔隙度，以让液体从一个膜流向另一个膜。
图10A、10B和10C示出了板测定和浸渍片测定的比较，包括显示了固相测定和板测定的比较的图(图10A)、浸渍片测定和板测定的比较的图(图10B)、以及浸渍片测定、板测定和CGMS样品之间的比较的图(图10C)。根据各种实施方案，图11A、11B示出了浸渍片测试的概要图(图11A)和双膜浸渍片测试中的例子的原理图(图11B)。在图11B中示出的实施方案中，两个分开的膜彼此之间可操作接触，且由网状层分开，其中的一个膜具有固定化的AHMT，且另一个膜具有NaOH。在各种实施方案中，网状分隔件用于防止膜之间的紧密接触，从而防止AHMT的失活。
根据各种实施方案，图12A和12B示出了一步横向流动测试的例子的原理图(图12A)和用于解释试验结果的比色图表(图12B)。在示出的实施方案中，样品被施加到样品的应用区域并流向(或直接施加)NaIO4膜(例如第一膜)，其中样品中的糖基化的蛋白质被化学氧化。氧化产物(主要是氧化的唾液酸和岩藻糖)然后通过网状分隔件而传递到具有固定的氢氧化钠的第二膜，以及传递到其上固定有AHMT的第三膜。在各种实施方案中，网状分隔件允许第二膜和第三膜之间可操作性接触但防止它们之间的紧密接触，从而防止AHMT的失活。
根据各种实方案，图13A和13B示出了显示具有偏高碘酸钠浓度为30mg/10mL缓冲液、50mg/10mL缓冲液和100mg/10mL缓冲液的三膜(一步)唾液测试条的三个例子的比较和它们检测胎球蛋白的功效(以百分比反射率衡量)的表格(图13A)，以及显示阴性和阳性对照的三膜唾液测试条的两个例子的数字图像。示范性测试条很容易在阴性对照(0mg/m胎球蛋白)和阳性对照(5mg/ml胎球蛋白)之间进行区分。
实施例8：测定受试者中的血糖状态的方法
在各种实施方案中，所公开的方法和测试装置可以用来测定受试者的血糖状态，例如，诊断受试者的如糖尿病、糖尿病前期或妊娠糖尿病等代谢病症，或确定受试者中的血糖控制的程度。在一些实施方案中，可以从受试者得到唾液样本，并使其经受本文所公开的方法或将其应用于到本文所公开的测试装置，如横向流动装置。在一些实施方案中，样品可以被氧化，然后可以如本文所公开的应用于浸渍片(双层膜)测试。
本文所描述的方法和测试装置可以产生量化的结果，所述量化的结果可以通过视觉或在比色读数装置的帮助下被评估。一旦获得结果，可以与标准相比较，如图12B所示的例子。明显高于既定的正常参考范围的结果可以指示受试者患有糖尿病、糖尿病前期或妊娠糖尿病。
在一些实施方案中，所公开的方法和测试可用于监测受试者的血糖状态，例如建立血糖控制的基准度(如：与前三周期间的平均血糖值相对应的单个点测量)或监测血糖控制随时间的变化(如：确定在一定时期内血糖控制是否改善或恶化，或者响应于治疗中的变化)。在这个实施例中，测试结果比以前的测试结果高可以表明血糖控制的恶化，其中测试结果低于以前的测试结果可以反映血糖控制的改善。在各种实施方案中，测试可以定期重复，如每三周、每六周、每三个月、每四个月、每六个月、或者每年。
尽管为了对优选的实施方案进行描述，某些实施方案在此已经被示出和描述，但本领域的普通技术人员将理解，为达到相同的目的所设计的多种的替代和/或等同的实施方案或实现可以取代所示出或描述的实施方案，而不脱离本发明的范围。本领域的技术人员将很容易理解，依照本发明的实施方案可以以非常广泛的各种各样的方式实施。本申请旨在涵盖本文所讨论的实施方案中的任何修改或变化。因此，显而易见的是，依据本发明的实施方案仅由权利要求及其等同物来限定。

Claims (18)

1.测定受试者中的血糖状态的非诊断方法，所述方法包括:
化学氧化来自所述受试者的唾液样本，从而氧化所述唾液样本中的一种或多种糖蛋白以产生一种或多种氧化产物，其中所述一种或多种氧化产物包含一种或多种醛；
对所述经氧化的唾液样本中的一种或多种醛进行定量；以及
比较所述一种或多种醛的水平与正常对照值，其中所述一种或多种醛的水平的增加表明所述受试者具有升高的血糖状态。
2.根据权利要求1所述的非诊断方法，其中测定所述受试者中的血糖状态包括产生对应于所述受试者的平均血糖值的信息。
3.根据权利要求2所述的非诊断方法，其中所述平均血糖值是三周的平均血糖值。
4.根据权利要求2所述的非诊断方法，其中所述方法是监测所述受试者中的血糖控制的方法。
5.根据权利要求1所述的非诊断方法，其中氧化所述唾液样本包括使所述唾液样本与偏高碘酸钠反应。
6.根据权利要求1所述的非诊断方法，其中氧化所述唾液样本包括将所述唾液样本施用到偏高碘酸钠膜。
7.根据权利要求1所述的非诊断方法，其中对所述经氧化的唾液样本中的醛进行定量包括使用化学检测方法。
8.根据权利要求1所述的非诊断方法，其中所述一种或多种糖蛋白包括唾液酸和岩藻糖。
9.用于检测唾液样本中的糖蛋白的横向流动装置，所述的横向流动装置包括:
包含偏高碘酸钠的第一膜；
与所述第一膜可操作的接触的第二膜，所述第二层膜包含NaOH；
与所述第二膜可操作的接触的第三膜，所述第三膜包含固定的AHMT；以及
设置于所述第二膜和第三膜之间的网状层。
10.根据权利要求9所述的横向流动装置，其中所述第一膜配置为氧化所述唾液样本中的唾液酸和岩藻糖。
11.根据权利要求10所述的横向流动装置，其中所述第三膜配置为检测所述经氧化的唾液样本中的醛。
12.根据权利要求10所述的横向流动装置，其中所述第三膜配置为产生比色结果，所述比色结果对应于所述经氧化的唾液样本中的醛的量。
13.用于检测唾液样本中的糖蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括:
用于氧化唾液样本中的糖蛋白的试剂；
用于检测所述经氧化的唾液样本的中醛的测试条，所述测试条包括:
包含NaOH的第一膜:
与所述第一膜可操作的接触的第二膜，所述第二膜包含固定的AHMT；以及
设置于所述第一膜和第二膜之间的网状层:以及
用于使用所述试剂盒的说明。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述用于氧化唾液样本中的糖蛋白的试剂包括偏高碘酸钠。
15.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述用于氧化唾液样本中的糖蛋白的试剂包括膜，所述膜包含偏高碘酸钠。
16.根据权利要求13所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括用于读取所述测试条的色度计。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述色度计配置为产生对应于由所述测试条所检测到的醛的量的数字。
18.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述对应于由所述测试条所检测到的醛的量的数字的范围为4.0-12.0，且其中高于6.0的数字反映相对于正常的平均血糖值的升高的平均血糖值。
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