JP5137016B2

JP5137016B2 - 超高感度ｃ−反応性タンパク質測定試薬及び測定方法

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Publication number: JP5137016B2
Application number: JP2007547851A
Authority: JP
Inventors: 英毅神野; 眞広小川
Original assignee: Nihon University
Current assignee: Nihon University
Priority date: 2005-11-30
Filing date: 2006-06-02
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2026-06-02
Also published as: EP1956372A1; WO2007063616A1; EP1956372A4; JPWO2007063616A1; US20090047685A1

Description

本発明は、高い感度で被検試料中のＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）を測定するための超高感度ＣＲＰ測定試薬及びそれを用いたＣＲＰ測定方法に関する。

Ｃ−反応性タンパク（ＣＲＰ）は、肺炎双球菌のＣ多糖体と沈降反応を示す血清タンパク質で、通常正常ヒト血清中に微量（平均５８０ｎｇ／ｍｌ）に存在する。ＣＲＰは、炎症性疾患や組織の変性・壊死が生じると急速に血中に増加し、病状の回復に伴い速やかに減少する特徴をもつ。従って、血中ＣＲＰ濃度の測定は、細菌性感染症、心筋梗塞、悪性腫瘍等の疾患の重症度、経過、予後、あるいは治療効果の判定に広く臨床的に利用されている（非特許文献１参照）。
従来のＣＲＰ測定は、急性炎症時における通常時からの大幅な濃度上昇を測定していたため、感度に優れた測定法はあまり必要とされていなかった。しかし、近年、例えばラテックス粒子に抗体を担持させた免疫測定試薬等を用いたラテックス凝集法などの高感度ＣＲＰ測定法が開発され、ＣＲＰ濃度を低濃度域で測定することが、心筋梗塞や新生児感染症等の予知マーカーとして、また歯周病等の様々な疾患との関連性からも注目されている（特許文献１、非特許文献２参照）。

ラテックス凝集法は、ＣＲＰ抗体感作ラテックス試薬と検体中のＣＲＰ抗原が、抗原抗体反応により結合し凝集体となることを利用して、この凝集を検出することによりＣＲＰ濃度を定量するものである。低濃度域での抗原量の少ない場合でも大きな凝集として現れ、感度良く測定できる。しかしながら、現在、臨床で使用されているラテックス凝集法によるＣＲＰの定量は、感度が５００ｎｇ／ｍｌ程度であるため、局所的炎症や小部位の病変を捉えることはできない。従って、より多くの炎症・病変を捉えるようにするために、従来よりも微量なＣＲＰ検出が必要であり、そのために、ＣＲＰ測定試薬の感度をさらに高めることが求められている。
特開２００１−３３０６１５号公報福岡良男ら、臨床免疫学、医歯薬出版、１９９７年高橋伯夫、「高感度ＣＲＰ測定法の病態診断的有用性」、臨床病理、２００２年、第５０巻、ｐ３０−３９

本発明は、被検試料中のＣＲＰを高い感度で、迅速且つ簡便に測定できる手段を提供することを目的とする。

本発明者は、ラテックス粒子表面に化学修飾を行い、スペーサー分子を導入して抗ＣＲＰ抗体を感作したラテックス試薬を作製し、高感度化を検討したところ、前記特許文献１のようにポリペプチド（ポリグルタミン酸）等をスペーサーとした場合には、抗体を一定の配向性のもとで安定に固定化することができず、高い感度は得られないものの、スペーサー分子としてアミノ酸を導入し、このアミノ酸を介してラテックス粒子に抗ＣＲＰ抗体を担持させれば、抗体に配向性を持たせることができ、極めて高感度で被検試料中のＣＲＰを測定できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、Ｃ−反応性タンパク質に対する抗体がアミノ酸類を介して担持された不溶性担体粒子を含有することを特徴とするＣ−反応性タンパク質測定試薬を提供するものである。
また、本発明は、上記測定試薬を被検試料中の抗原物質と反応させ、生じる凝集を測定することを特徴とするＣ−反応性タンパク質の測定方法を提供するものである。

本発明のＣＲＰ測定試薬は、被検試料中のＣＲＰを極めて感度良く検出できるため、これを用いれば、局所的炎症や小部位の病変等、体内の極小さい炎症も捉えることができ、臨床検査において疾患患者と正常者との判別、治療経過観察等に極めて有用である。

図１は、各アミノ酸をスペーサー分子として用いたラテックス試薬の反応性の結果を示す図である。図２は、アミノ酸をスペーサー分子として用いたラテックス試薬、スペーサー分子のないラテックス試薬及びプロテインＡをスペーサー分子として用いたラテックス試薬の反応性の結果を示す図である。図３は、肝疾患患者の血中ＣＲＰ濃度を示す図である。

本発明のＣＲＰ測定用試薬は、ＣＲＰに対する抗体がアミノ酸類を介して不溶性担体粒子に担持されている。
本発明における不溶性担体粒子としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができ、特にラテックス粒子を使用するのが好ましい。

ラテックス粒子としては、特に限定されないが、粒径が比較的一定であり、一定の品質及び性能を有し、工業的に大量生産できる有機系微粒子が好ましい。前記有機系微粒子としては特に限定されず、例えばスチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体及び／又は共重合体；スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等が挙げられる。これらのうち、生物学的活性を長期間安定に保持できる点で、ポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい。
また、ラテックス粒子は、その粒子表面に官能基を有していてもよい。官能基は、スペーサー分子として用いられるアミノ酸類を固定化できるものであればよく、例えばカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、グリシジル基、ハロゲン化アシル基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、活性エステル基、酸無水物基等が挙げられる。このうち、特にカルボキシル基修飾のラテックス粒子を用いるのが好ましい。市販品としては、例えば「Ｉｍｍｕｔｅｘ」（ＪＳＲ（株）製）等を用いることができる。

ラテックス粒子の粒径は、０．０１〜１μｍであるのが好ましい。粒径が０．０１μｍより小さいと微凝集が多発し、見かけの粒径が不均一となり、同時再現性等に悪影響が及ぶことがあり、また抗体の数に対して充分な凝集が見られないことがある。他方、粒径が１μｍを超えると、自己凝集が進み、分散性が低下し易い。

本発明におけるアミノ酸類は、アミノ酸、その塩又はそれらの水和物を包含する。また、アミノ酸類は、Ｌ−体、Ｄ−体いずれでもよく、ラセミ体も許容される。アミノ酸としては、特に限定されず、中性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）あるいは塩基性アミノ酸（Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）のいずれも用いることができる。アミノ酸の塩としては、特に制限されず、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩；マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属塩；塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸塩；酢酸、クエン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸塩等が挙げられる。このうち、反応性の点から、塩基性アミノ酸（Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）、含硫アミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）、オキシアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、脂肪族アミノ酸（Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、酸性アミノ酸アミド（Ｇｌｎ）その塩又はそれらの水和物が好ましく、特にアミノ酸の化学的性状よりＡｒｇ、Ｇｌｎが好ましい。
不溶性担体に担持されるアミノ酸類は、１つの不溶性担体に複数個固定化されているのが好ましい。

本発明におけるＣＲＰに対する抗体（抗ＣＲＰ抗体）は、ＣＲＰに特異的に結合すればよく、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状は限定されない。抗体の由来としては、特に限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、サル等が挙げられる。抗体の純度としては特に限定されず、例えばグロブリン画分であってもアフィニティ精製画分であってもよい。抗体は、公知の方法により調製した抗体、あるいは市販品を用いることができる。
また、本発明で用いられる抗体は、抗体の全体分子に限られず、ＣＲＰに結合する限り、抗体の断片またはその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。

本発明において、アミノ酸類を不溶性担体に結合させる手段、及び抗ＣＲＰ抗体をアミノ酸類に結合させる手段としては、不可分に結合させることができれば特に制限されず、例えば共有結合等の化学的結合による結合が挙げられる。

不溶性担体としてカルボキシル基修飾のラテックス粒子を用いた場合、本発明のＣＲＰ測定試薬の一部は、次の一般式（１）で表され、例えば以下の方法で作成できる。

（式中、Ｘ−ＣＯ−はカルボキシル基修飾ラテックス粒子由来の残基を示し、ＮＨＣＨ（Ｒ_１）ＣＯ−はアミノ酸由来の残基を示し、ＮＨ−Ｙは抗ＣＲＰ抗体由来の残基を示す。）
すなわち、ラテックス粒子表面のカルボキシル基とアミノ酸のＮ末端アミノ基とを、例えば活性エステル法、混合酸無水物法等の公知の方法により脱水縮合してペプチド結合を形成させる。次いで、抗ＣＲＰ抗体溶液を加え、公知のカップリング方法によりアミノ酸と結合させることで、本発明のラテックス試薬を得ることができる。

ラテックス粒子表面のカルボキシル基とアミノ酸のＮ末端アミノ基とを縮合させる方法は、特に制限されないが、例えば、０．５〜２．０％（ｗ／ｖ）のラテックス粒子を緩衝液に懸濁し、この懸濁液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）等の水溶性カルボジイミドと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール等を添加して、０℃〜還流温度、好ましくは室温で２０分〜１時間反応させることによりカルボキシル基を活性エステル化する。次いで、０．１〜１０×１０^−４ｍｏｌ／ｍＬ、好ましくは０．５〜５×１０^−４ｍｏｌ／ｍＬに濃度調整したアミノ酸を添加して、室温〜溶媒の沸点付近で加熱し、３０分〜２時間反応させればよい。ここで、反応に用いられる緩衝液としては、例えば、ＭＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液等が挙げられ、反応におけるｐＨは、ｐＨ５〜１０、特にｐＨ６〜９が好ましい。

ラテックス粒子に担持されたアミノ酸に、抗ＣＲＰ抗体をカップリングさせるには、上記緩衝液中で、アミノ酸のＣ末端カルボキシル基を上記と同様に活性エステル化した後、５０〜４００μｇ／ｍｌの抗ＣＲＰ抗体を加えて４℃〜４０℃で、２０分〜１時間反応させればよい。反応後、遠心分離、ブロッキング処理等の通常の後処理を行うことにより本発明のラテックス試薬を得ることができる。

このように本発明のＣＲＰ測定試薬は、不溶性担体にアミノ酸類を介して抗ＣＲＰ抗体を担持させることで、抗ＣＲＰ抗体に配向性を持たせ、安定に保持させることができるため、例えば従来のＬＰＩＡ法を利用したＣＲＰ定量法は、感度が５００ｎｇ／ｍＬ程度であり、局所的炎症や小部位の病変を捉えることはできなかったが、本発明においては、感度が１０ｎｇ／ｍＬと云う約５０倍の感度にまで上昇し、体内の極小さい炎症までも捉えることが可能である。従って、本発明のＣＲＰ測定試薬は、各種の感染症、炎症性疾患及び組織破壊をきたす疾患の診断や治療経過観察等に好適に用いられる。
そのような疾患の例としては、リウマチ、ウィルス性肝炎、肺炎、黄斑変性症、尿路感染症などの炎症、組織破壊性疾患、感染症、口蓋扁桃腺の炎症悪化等が挙げられる。

本発明のＣＲＰ測定試薬中のＣＲＰに対する抗体の濃度としては、被検試料中のＣＲＰを測定できる濃度であれば特に制限されないが、５０〜４００μｇ／ｍＬとするのが好ましく、特に１００〜２００μｇ／ｍＬとするのが好ましい。５０μｇ／ｍＬ未満であると、感度が低いため、低濃度域での正確な定量ができにくく、他方４００μｇ／ｍＬを超えると、非特異的な凝集を生じ易い。

本発明のＣＲＰ測定試薬には、抗ＣＲＰ抗体を担持させた担体以外に、非特異性反応の防止、保存安定性の点から、ウシ血清アルブミン、ショ糖等を適宜溶解させてもよく、また塩濃度調整のために塩化ナトリウム等を溶解させてもよい。
さらに、本発明のＣＲＰ測定試薬は、抗ＣＲＰ抗体がアミノ酸を介して担持された不溶性担体を分散及び溶解させた１液型試薬であってもよく、２液型又は３液型試薬として使用してもよい。また、試薬には、キットも含まれ、該キットは、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。

本発明のＣＲＰ測定試薬を用いたＣＲＰの測定方法の態様としては、ＬＰＩＡ法に代表される凝集反応を利用した測定方法を挙げることができる。ここで、測定とは、定量的又は非定量的な測定を含み、例えば、非定量的な測定としては、生成した凝集物の度合いを目視で陰性（−）か陽性（＋）かを判定する定性法が挙げられ、定量的な測定としては、ＣＲＰの濃度の測定、ＣＲＰの量の測定などを挙げることができる。

ＣＲＰ測定試薬と被検体試料との反応は、抗原抗体反応及びそれに伴う凝集反応であり、該反応が起こり得る条件であれば、その反応条件は特に限定されないが、例えば、恒温（２０〜３７℃）で５秒〜１５分間行うのが好ましい。

ＣＲＰ測定用試薬と被検体試料との反応は、通常緩衝液中で行われる。緩衝液としては、抗原抗体反応が起こり得る溶液であれば特に制限されないが、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が好ましく、反応におけるｐＨは、ｐＨ７〜９の範囲が好ましい。また、上記反応液に、感度向上、反応促進又は安定化を目的に、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、プルラン等の水溶性高分子；ウシ血清アルブミン、ショ糖等の安定剤；アジ化ナトリウム等の防腐剤；塩化ナトリウム等の添加剤等を適宜添加してもよい。

ＣＲＰ測定用試薬を被検体試料中の抗原物質と反応させる際、抗ＣＲＰ抗体を担持させた不溶性担体の反応液中における濃度としては、例えば不溶性担体がラテックス粒子である場合、０．０１〜５％（ｗ／ｖ）とするのが好ましい。０．０１％（ｗ／ｖ）未満であると凝集塊の形成が不十分で必要な感度が得られにくく、他方５％（ｗ／ｖ）を超えるとバックグラウンドとしての吸光度が高すぎ、正確な定量が行えないことがある。

被検試料としては、ＣＲＰが含まれる可能性のある試料であれば特に制限されない。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿などを挙げることができる。また、生物の体から採取された細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。

生成した凝集の程度を定性する場合は肉眼で観察すればよく、凝集の程度を定量する場合は凝集体を光学的に測定すれば良い。光学的な測定方法は、通常行われている方法であれば特に制限されず、汎用の分光光度計、分光光度測定を測定原理とした生化学用自動分析装置、近赤外を測定波長とした装置、積分球濁度を測定原理とした装置、散乱光強度を測定する装置等の光学的測定機器などを用いることができる。
このうち、生成した凝集に近赤外光を照射して得られた単位時間当たりの吸光度変化から、ＣＲＰ濃度を定量する方法が好ましい。測定波長は、４００〜１０００ｎｍ、好ましくは５００〜８００ｎｍである。ＣＲＰの定量を行うには、例えば標準血清とその希釈系列等の既知量の測定試料について、本発明のＣＲＰ測定試薬を用いたＣＲＰ測定を行い、その測定値と既知濃度とから検量線を作成しておき、未知量の測定試料について同一条件で測定した測定値から予め作成しておいた検量線において対応する量を求めることによって行うことができる。

以下、本発明について実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。

実施例で使用した試薬及び材料は以下の通りである。
ラテックス粒子；平均粒径０．２５〜０．３７μｍの表面にカルボキシル基が修飾されたポリスチレンラテックス（「Ｉｍｍｕｔｅｘ」ＪＳＲ（株）製）を用いた。
ラテックス懸濁用緩衝液、抗ＣＲＰ抗体希釈用緩衝液、抗ＣＲＰ抗体、抗原ＣＲＰ標準液；Ｄａｋｏ社製のＣＲＰ測定用の試薬を用いた。

実施例１ラテックス試薬（１）の作製
１％カルボキシル基修飾ラテックス粒子懸濁液１．０ｍＬに、２０ｍｇ／ｍＬ濃度ＷＳＣ溶液２．０ｍＬと５０ｍｇ／ｍＬ濃度ＮＨＳ溶液０．２３ｍＬを攪拌しながら順に加え、２５℃で３０分間攪拌しラテックス表面のカルボキシル基を活性化させた。活性化後、０．０５ＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で洗浄し、次いで同ＭＥＳ緩衝液で１．３３×１０^−４ｍｏｌ／ｍＬに調製した各スペーサー分子（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ）２ｍＬを加え、３７℃で１時間撹拌し、ラテックス粒子に結合させた。得られた溶液に、上記ＷＳＣ溶液２ｍＬとＮＨＳ溶液０．２３ｍＬを順に加えて撹拌し、スペーサー分子のカルボキシル基を活性化させた。攪拌後遠心分離（１６０００ｒｐｍ、４℃、２０ｍｉｎ）し、上澄みと沈殿に分けた。沈殿は上記ＭＥＳ緩衝液で洗浄した。これに５．０ｍｇ／ｍＬの抗ＣＲＰ抗体溶液３０μＬを加え、３７℃で３０分間攪拌しスペーサー分子に結合させた。結合後遠心分離（１６０００ｒｐｍ、４℃、２０ｍｉｎ）し、上澄みと沈殿に分けた。上澄みは後の操作でラテックス粒子への抗ＣＲＰ抗体結合量の定量に使用した。
沈殿を、上記ＭＥＳ緩衝液２ｍＬに懸濁し、粒子洗浄のため、１回結合後遠心分離（１６０００ｒｐｍ、４℃、２０ｍｉｎ）した。遠心分離後、同ＭＥＳ緩衝液１．０ｍＬに懸濁し、変性ＢＳＡを１ｍＬ加え、２５℃で３０分間攪拌し、ラテックス粒子表面の抗ＣＲＰ抗体結合部位のブロッキングを行った。ブロッキング後、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）２．０ｍＬに懸濁し、未反応活性化カルボキシル基を加水分解した。加水分解後粒子洗浄のため、同Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液２．０ｍＬに懸濁して２回遠心分離（１６０００ｒｐｍ、４℃、２０ｍｉｎ）した。最終的にＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液２．０ｍＬに懸濁したものを、ラテックス試薬（１）とした。

比較例１ラテックス試薬（２）の作製
比較例として用いるため、スペーサー分子を介さずに抗ＣＲＰ抗体を担持させたラテックス試薬を作製した。
１％カルボキシル基修飾ラテックス懸濁液１．０ｍＬに、２０ｍｇ／ｍＬ濃度ＷＳＣ溶液２．０ｍＬと５０ｍｇ／ｍＬ濃度ＮＨＳ溶液０．２３ｍＬを攪拌しながら順に加え、２５℃で３０分間攪拌しラテックス表面のカルボキシル基を活性化させた。これに５．０ｍｇ／ｍＬの抗ＣＲＰ抗体溶液３０μｌを加え、３７℃で３０分間攪拌しラテックス粒子に結合させた。結合後遠心分離（１６０００ｒｐｍ、４℃、２０ｍｉｎ）し、上澄みと沈殿に分けた。上清は後の操作でラテックス粒子への抗ＣＲＰ抗体結合量の定量に使用した。
沈殿を、上記ＭＥＳ緩衝液２．０ｍＬに懸濁し、１．５％変性ＢＳＡを１．０ｍＬ加え、２５℃で３０分間攪拌し、ラテックス粒子表面の抗ＣＲＰ抗体結合部位のブロッキングを行った。ブロッキング後、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）２．０ｍＬに懸濁し、未反応活性化カルボキシル基を加水分解した。最終的にＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液２．０ｍＬに懸濁したものを、ラテックス試薬（２）とした。

比較例２ラテックス試薬（３）の作製
スペーサー分子としてプロテインＡ（ＳＩＧＭＡ社製）０．５ｍｇを１ｍＬの０．０５ＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解したものを用い、ラテックス粒子に結合させた以外は、実施例１と同様にしてラテックス試薬（３）を作製した。

試験例１ラテックス粒子への抗ＣＲＰ抗体結合量の測定
上記実施例１及び比較例１で得られた上清を用いて、ＢＣＡ法によりラテックス粒子への抗ＣＲＰ抗体結合量を測定した。すなわち、サンプル溶液とビシンコニン酸試薬をよく混和して、波長５６２ｎｍにおける吸光度測定を行い結合量を算出した。
その結果、ラテックス試薬（１）における結合量は、抗体添加量に対し、平均で約６５〜７５％結合していることが確認された。また、ラテックス試薬（２）における結合量は、抗体添加量に対し、約７０％であった。

試験例２標準液を用いたラテックス試薬の評価
実施例１及び比較例１で作製したラテックス試薬（１）及び（２）をそれぞれＣＲＰと反応させ、近赤外比濁法（ＬＰＩＡ法）でその凝集反応速度を測定した。測定には、全自動免疫血清検査システムＬＰＩＡ−２００（（株）ダイアヤトロン製）を用いた。すなわち、測定キュベット内に、抗原ＣＲＰ標準液３０μＬ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−ＢＳＡ緩衝液（ｐＨ８．２）２３０μＬ、各ラテックス試薬３０μＬを分注し、１２秒毎に１０分間波長９５０ｎｍの吸光度変化を測定した。ＣＲＰ定量と検出限界の測定は、スペーサーの異なるラテックス試薬の平均反応速度から検量線を作成し、それをもとに行った。図１に実施例１で得られた各ラテックス試薬の反応性の結果を示す。
その結果、実施例１で得られたラテックス試薬（１）では、ＣＲＰ抗原濃度１０ｎｇ／ｍＬまで反応する高感度で安定した測定値を示した。一方、比較例１で得られたラテックス試薬（２）では、５００ｎｇ／ｍＬであった。よって、ラッテクス粒子表面にスペーサー分子としてアミノ酸を介して抗体を結合させた試薬は、極めて高感度でＣＲＰを測定できることが確認された。スペーサー分子としては、Ａｒｇ＞Ｇｌｎ＞Ｍｅｔ＞Ｔｈｒ＞Ｈｉｓ＞Ｃｙｓ＞Ｔｒｐ＞Ｇｌｕ＞Ｉｌｅ＞Ｌｙｓ＞Ｇｌｙ＞Ａｓｐ＞Ａｓｎ＞Ｐｈｅ＞Ｐｒｏ＞Ｔｙｒ＞Ａｌａ＞Ｌｅｕ＞Ｖａｌ＞Ｓｅｒの順で感度が優れていた。同じオキシアミノ酸であるＴｈｒとＳｅｒに反応性に差があることからヒドロキシル基の位置が反応性に影響を与えると考えられた。また、同じ含硫アミノ酸であるＭｅｔとＣｙｓでも差が認められたことから、スペーサー自身の性質と側鎖の長さが反応性に影響を与えると考えられた。

試験例３標準液を用いたラテックス試薬の評価
実施例１で作製したラテックス試薬（１）のうち、スペーサー分子としてグリシン（Ｇｌｙ）を用いた試薬、比較例１及び２で作製したラテックス試薬（２）、（３）をそれぞれＣＲＰと反応させ、試験例２と同様にして、近赤外比濁法（ＬＰＩＡ法）でその凝集反応速度を測定した。図２に各ラテックス試薬の反応性の結果を示す。
その結果、スペーサー分子としてグリシン（Ｇｌｙ）を用いたラテックス試薬（１）は、低濃度領域において、比較例１及び２で得られたラテックス試薬（２）及び（３）に比して約５倍の高感度で安定した測定値を示した。

試験例４ヒト血清中ＣＲＰ測定
上記試験例２の抗原ＣＲＰ標準液に代えて、正常者及び加齢（老年性）黄斑変性患者から採血して得られた血清０．５μＬを用い、血清中のＣＲＰ濃度を測定した。

その結果、実施例１で得られたラテックス試薬（１）では、ＣＲＰ抗原濃度は、正常者検体数３０で平均値４２２ｎｇ／ｍＬ（最大値１８２５ｎｇ／ｍＬ、最小値１９９ｎｇ／ｍＬ）で、老年性黄斑変性患者検体数３２で平均値８６７ｎｇ／ｍＬ（最大値２６９４ｎｇ／ｍＬ、最小値３２７ｎｇ／ｍＬ）であり黄斑変性症患者と正常者を判別できた。よって、本発明の測定試薬を用いれば、体内の極小さい炎症までも捉えられることができることが確認された。

試験例５肝疾患患者血液中ＣＲＰ測定
上記試験例２の抗原ＣＲＰ標準液に代えて、各種肝疾患患者から採血をした血液０．５μＬを用い、血中ＣＲＰ濃度を測定した。ラテックス試薬は、スペーサー分子としてグリシン（Ｇｌｙ）を用いた試薬を用いた。その結果を図３に示す。
測定の結果、ＣＲＰ抗原濃度は、検体数５１４で平均値１１０６ｎｇ／ｍＬ、最高値１４４１９ｎｇ／ｍＬ、最低値１５７ｎｇ／ｍＬであった。肝臓疾患ではＣＲＰは肝臓で生産されるため、ＣＲＰ産生能の低下が示唆されている。しかし、本発明のラテックス試薬を用いることにより、疾患によるこのような高い値のＣＲＰが確認された。このデータから、肝臓疾患がある人にも肝臓の炎症からＣＲＰが産生されていることが明らかとなった。従って、本発明の測定試薬を用いて血清中ＣＲＰ濃度を測定することにより、肝疾患患者等における合併症や治療経過観察に役立つことが期待出来る。

Claims

Ｃ−反応性タンパク質に対する抗体が、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから選ばれるアミノ酸、その塩又はそれらの水和物を介して担持されたカルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス粒子を含有するＣ−反応性タンパク質測定試薬を、被検試料中のＣ−反応性タンパク質と反応させ、生じる凝集に近赤外光を照射して、得られた単位時間当たりの吸光度変化からＣ−反応性タンパク質濃度を定量することを特徴とするＣ−反応性タンパク質の測定方法。
被検試料が、血液、血清又は血漿である請求項１記載の測定方法。