JPWO2020027097A1 - 固相担体およびキット - Google Patents
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- WSNXAFKQZXSPTH-UHFFFAOYSA-N CCCC[N](C)(C)CCCC[S](C)(O)(=O)=O Chemical compound CCCC[N](C)(C)CCCC[S](C)(O)(=O)=O WSNXAFKQZXSPTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
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Abstract
本発明の課題は、高い非特異吸着抑制効果と、高いリガンド結合量とを両立した、生理活性物質を担持するための固相担体を提供すること、並びに上記した固相担体を含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットを提供することである。本発明によれば、酸性アミノ酸由来の基に親水性基と生理活性物質反応性基とが所定の連結基を介して結合した構造単位を含む共重合体を含み、上記共重合体が固相の表面に存在する、生理活性物質を担持するための固相担体が提供される。
Description
本発明は、生理活性物質を担持するための固相担体、並びに生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットに関する。
タンパク質、酵素または無機化合物などを定量するための高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する測定対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射した際に発する蛍光を検出することによって測定対象物質の存在を確認する方法である。測定対象物質が蛍光体でない場合には、例えば、測定対象物質と特異的に結合する物質を蛍光色素で標識した状態で試料に接触させ、その後上記と同様にして、励起光を照射した際に発する蛍光を検出することにより、測定対象物質の存在を確認することができる。
上記のような蛍光検出法において、微量に存在する測定対象物質を検出するための感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が知られている。この方法では、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属膜を設けたセンサチップを用意し、支持体と金属膜との界面に対して支持体の金属膜形成面と反対の面側から、全反射角以上の所定の角度で励起光を入射する。かかる励起光の照射により金属膜に表面プラズモンが発生するが、この表面プラズモンの発生による電場増強作用によって、蛍光を増強させることによりシグナル/ノイズ比(S/N比)が向上し高感度な測定が可能となる。表面プラズモン励起による蛍光検出法(以下、「SPF法」とする)は、落射励起による蛍光検出法(落射蛍光法とも称する)に対して、信号増強度が約10倍得られ、高感度に測定することができる。
特許文献1には、非特異吸着を抑制した固相担体として、所定の式で表される2種類の構造単位を含むポリマーが結合してなる固相担体が記載されている。特許文献1にはさらに、リガンド結合固相担体、標的物質の検出又は分離方法、及び上記固相担体の製造方法が記載されている。また、特許文献2には、レチノイドと検出可能な標識とが結合しているポリマーを含む、線維化を特徴とする細胞および/または組織のイメージング剤が記載されている。
特許文献1に記載の固相担体は、高い非特異吸着抑制効果を有するが、リガンド結合量は少ないものであった。本発明は、高い非特異吸着抑制効果と、高いリガンド結合量とを両立した、生理活性物質を担持するための固相担体を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、上記した固相担体を含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットを提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、酸性アミノ酸由来の基に親水性基と生理活性物質反応性基とが所定の連結基を介して結合した構造単位を含む共重合体を、固相の表面に存在させることによって、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
[1] 下記式(1)で表される構造単位を含む共重合体を含み、上記共重合体が固相の表面に存在する、生理活性物質を担持するための固相担体。
式中、R1は水素原子またはメチル基を表す;
Xは−NH−または−O−を表す;
Yは−NH−または−O−を表す;
mは1〜5の整数を示す。
R2は、親水性基または下記式(R−1)で表される基の一方を表す;
R3は、親水性基または下記式(R−1)で表される基の他方を表す。
nは1〜12の整数を表し、R4は生理活性物質反応性基を表し、*はXまたはYとの結合位置を表す。
[2] Xが−NH−であり、Yが−NH−である、[1]に記載の固相担体。
[3] mが1または2である、[1]または[2]に記載の固相担体。
[4] 上記親水性基が、ベタイン構造、糖構造、アミノ酸構造またはスルホン酸基を有する、[1]から[3]の何れか一に記載の固相担体。
[5] 上記生理活性物質反応性基が、カルボキシル基、活性エステル、イソチオシアネート、エポキシ基、またはマレイミドを有する、[1]から[4]の何れか一に記載の固相担体。
[6] 上記式(R−1)中のnが3〜6の整数である、[1]から[5]の何れか一に記載の固相担体。
[7] 上記生理活性物質反応性基の含有量が、固相担体の固形分1gあたり1〜500μmolである、[1]から[6]の何れか一に記載の固相担体。
[8] 固相担体の形状が粒子である、[1]から[7]の何れか一に記載の固相担体。
[9] 上記粒子の粒径が50〜300nmである、[8]に記載の固相担体。
[10] 上記粒子の粒径の多分散指数が0.002以上0.10以下である、[8]または[9]に記載の固相担体。
[11] 上記粒子が、蛍光色素を内包している、[8]から[10]の何れか一に記載の固相担体。
[12] 上記蛍光色素が、アザジピロメテン色素またはジピロメテン色素である、[11]に記載の固相担体。
[13] R4で表される生理活性物質反応性基に生理活性物質が結合している、[1]から[12]の何れか一に記載の固相担体。
[14] 上記生理活性物質が抗体である、[13]に記載の固相担体。
[15] [1]から[14]の何れか一に記載の固相担体;および
検出領域を金属膜上に備えた基板:
を含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット。
[1] 下記式(1)で表される構造単位を含む共重合体を含み、上記共重合体が固相の表面に存在する、生理活性物質を担持するための固相担体。
Xは−NH−または−O−を表す;
Yは−NH−または−O−を表す;
mは1〜5の整数を示す。
R2は、親水性基または下記式(R−1)で表される基の一方を表す;
R3は、親水性基または下記式(R−1)で表される基の他方を表す。
[2] Xが−NH−であり、Yが−NH−である、[1]に記載の固相担体。
[3] mが1または2である、[1]または[2]に記載の固相担体。
[4] 上記親水性基が、ベタイン構造、糖構造、アミノ酸構造またはスルホン酸基を有する、[1]から[3]の何れか一に記載の固相担体。
[5] 上記生理活性物質反応性基が、カルボキシル基、活性エステル、イソチオシアネート、エポキシ基、またはマレイミドを有する、[1]から[4]の何れか一に記載の固相担体。
[6] 上記式(R−1)中のnが3〜6の整数である、[1]から[5]の何れか一に記載の固相担体。
[7] 上記生理活性物質反応性基の含有量が、固相担体の固形分1gあたり1〜500μmolである、[1]から[6]の何れか一に記載の固相担体。
[8] 固相担体の形状が粒子である、[1]から[7]の何れか一に記載の固相担体。
[9] 上記粒子の粒径が50〜300nmである、[8]に記載の固相担体。
[10] 上記粒子の粒径の多分散指数が0.002以上0.10以下である、[8]または[9]に記載の固相担体。
[11] 上記粒子が、蛍光色素を内包している、[8]から[10]の何れか一に記載の固相担体。
[12] 上記蛍光色素が、アザジピロメテン色素またはジピロメテン色素である、[11]に記載の固相担体。
[13] R4で表される生理活性物質反応性基に生理活性物質が結合している、[1]から[12]の何れか一に記載の固相担体。
[14] 上記生理活性物質が抗体である、[13]に記載の固相担体。
[15] [1]から[14]の何れか一に記載の固相担体;および
検出領域を金属膜上に備えた基板:
を含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット。
本発明の固相担体によれば、高い非特異吸着抑制効果と、高いリガンド結合量とを両立することができる。本発明のキットを用いた測定においては、高いシグナル/ノイズ比を達成することができる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を意味する。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を意味する。
本発明の固相担体は、下記式(1)で表される構造単位を含む共重合体を含み、上記共重合体が固相の表面に存在する、生理活性物質を担持するための固相担体である。本発明の固相担体によれば、高い非特異吸着抑制効果と高いリガンド結合量を両立することができる。本発明の固相担体を用いた生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットによれば、高感度に被検物質を分析することが可能となる。
式中、R1は水素原子またはメチル基を表す;
Xは−NH−または−O−を表す;
Yは−NH−または−O−を表す;
mは1〜5の整数を示す。
R2は、親水性基または下記式(R−1)で表される基の一方を表す;
R3は、親水性基または下記式(R−1)で表される基の他方を表す。
nは1〜12の整数を表し、R4は生理活性物質反応性基を表し、*はXまたはYとの結合位置を表す。
Xは−NH−または−O−を表す;
Yは−NH−または−O−を表す;
mは1〜5の整数を示す。
R2は、親水性基または下記式(R−1)で表される基の一方を表す;
R3は、親水性基または下記式(R−1)で表される基の他方を表す。
R1は、好ましくはメチル基を表す。
Xは、好ましくは−NH−であり、Yは好ましくは−NH−である。Xが−NH−であり、かつYが−NH−であることがより好ましい。
mは好ましくは1または2である。
Xは、好ましくは−NH−であり、Yは好ましくは−NH−である。Xが−NH−であり、かつYが−NH−であることがより好ましい。
mは好ましくは1または2である。
R2またはR3が示す親水性基は、好ましくは、ベタイン構造、糖構造、アミノ酸構造またはスルホン酸基を有する。
ベタイン構造とは、正電荷を有する部分と負電荷を有する部分とを同一基内の隣り合わせにならない位置に有し、正電荷をもつ原子には解離しうる水素原子が結合しておらず、全体としては電荷を有さず中性である構造のことを言う。正電荷を有する部分は、例えば、四級アンモニウム、スルホニウム、ホスホニウムなどのカチオン構造を有する部分である。負電荷を有する部分は、例えば、スルホン酸基(−SO3 −)、カルボン酸基(−COO−)、リン酸由来の基(−PO4 −−)などを挙げることができる。
ベタイン構造とは、正電荷を有する部分と負電荷を有する部分とを同一基内の隣り合わせにならない位置に有し、正電荷をもつ原子には解離しうる水素原子が結合しておらず、全体としては電荷を有さず中性である構造のことを言う。正電荷を有する部分は、例えば、四級アンモニウム、スルホニウム、ホスホニウムなどのカチオン構造を有する部分である。負電荷を有する部分は、例えば、スルホン酸基(−SO3 −)、カルボン酸基(−COO−)、リン酸由来の基(−PO4 −−)などを挙げることができる。
糖構造としては、糖基を有する構造を意味する。糖としては、グルコース、ガラクトース、フルクトースまたはマンノース等の単糖類、またはスクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、及びフルクトース等の二糖類などが挙げられるが、特に限定されない。
アミノ酸構造としては、天然のアミノ酸(グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、およびヒスチジン)に由来する基を挙げることができるが、その他の非天然アミノ酸に由来する基でもよい。
R2またはR3が示す式(R−1)で表される基において、nは1〜12の整数を表し、好ましくは2〜10の整数であり、より好ましくは3〜6の整数である。
R4は生理活性物質反応性基を表す。生理活性物質反応性基としては、好ましくは、カルボキシル基、活性エステル、イソチオシアネート、エポキシ基、またはマレイミドを有する基である。
R4で表される生理活性物質反応性基の含有量は、固相担体の固形分1gあたり好ましくは1〜500μmolであり、より好ましくは10〜500μmolであり、さらに好ましくは100〜500μmolであり、特に好ましくは100〜300μmolであり、最も好ましくは150〜250μmolである。
R4で表される生理活性物質反応性基の含有量は、固相担体の固形分1gあたり好ましくは1〜500μmolであり、より好ましくは10〜500μmolであり、さらに好ましくは100〜500μmolであり、特に好ましくは100〜300μmolであり、最も好ましくは150〜250μmolである。
式(1)で表される構造単位の具体例を以下に示すが、本発明はこれらに限定されるわけではない。
本発明においては、固相担体の形状は粒子であることが好ましい。この場合、式(1)で表される構造単位を含む共重合体が、核となる粒子の表面に存在する、生理活性物質を担持するための固相担体である態様となる。核となる粒子としては、例えば、ポリスチレンビーズなどの高分子粒子、ガラスビーズ等のガラス粒子を用いることができる。核となる粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル(メタ)アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子、または2つ以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末や無機物質粉末、微生物、血球や細胞膜片、リポソームなどが挙げられる。
核となる粒子としてラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル(メタ)アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸またはメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。但し、抗体標識の際に界面活性剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製には、無乳化剤乳化重合、即ち界面活性剤などの乳化剤を用いない乳化重合が好ましい。
本発明の固相担体は、式(1)で表される構造単位を含む共重合体を含み、上記共重合体が固相の表面に存在している。本発明の固相担体の製造方法は特に限定されない。例えば、上記の方法により固相担体の核となる粒子を調製し、その後、調製した核となる粒子に対して、式(1)で表される構造単位に対応するモノマー化合物と、所望により他のモノマー化合物とを加え、これらのモノマー化合物を重合させることにより、式(1)で表される構造単位を含む共重合体が核となる粒子の表面に存在している粒子形状の固相担体を製造することができる。
本発明の固相担体(好ましくは粒子形状の担体、以下粒子と表記する)は、蛍光色素を内包していることが好ましい。核となる粒子に蛍光色素を添加することによって、蛍光色素を内包している粒子を作製することができる。即ち、蛍光色素を内包している粒子は、水および水溶性有機溶剤を含む粒子の溶液に蛍光色素を添加して攪拌することなどにより、蛍光色素を粒子の内部に含浸させることにより製造することが可能である。
蛍光色素の種類は特に限定されないが、好ましくは、アザジピロメテン色素またはジピロメテン色素を使用することができる。
式中、XはCR17又はNを示す。
R11〜R17は、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、水酸基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリール基、ヘテロアリール基、ハロゲン原子、シアノ基、ホルミル基、R−CO−基、カルボキシ基、R−O−CO−基、R−CO−O−基、(RA)2N−CO−基、アミノ基、ニトロ基又はシリル基を示す。ここで、Rは、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基を示す。RAは、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基を示す。
R11〜R17は、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、水酸基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリール基、ヘテロアリール基、ハロゲン原子、シアノ基、ホルミル基、R−CO−基、カルボキシ基、R−O−CO−基、R−CO−O−基、(RA)2N−CO−基、アミノ基、ニトロ基又はシリル基を示す。ここで、Rは、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基を示す。RAは、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基を示す。
R18およびR19は、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、水酸基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリール基、ヘテロアリール基またはハロゲン原子を示す。
アルキル基は、直鎖または分岐鎖の何れでもよく、直鎖または分岐鎖アルキル基の炭素数は好ましくは1〜36であり、より好ましくは1〜18であり、さらに好ましくは1〜12であり、特に好ましくは1〜6である。シクロアルキル基としては、例えば炭素数3〜8のシクロアルキルなどが挙げられる。アルキル基およびシクロアルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、iso−ブチル基、sec−ブチル基、t−ブチル基、n−ペンチル基、n−ヘキシル基、n−ヘプチル基、n−オクチル基、n−ノニル基、n−デシル基、n−ウンデシル基、n−ドデシル基、n−トリデシル基、n−テトラデシル基、n−ペンタデシル基、n−ヘキサデシル基、n−ヘプタデシル基、n−オクタデシル基、およびシクロヘキシル基などが挙げられる。
脂肪族複素環基としては、特に限定されないが、2−オキソピロリジン環、ピペリジン環、ピペラジン環、モルホリン環、テトラヒドロフラン環、テトラヒドロピラン環、テトラヒドロチオフェン環等から導出される基が挙げられる。
アルケニル基は、直鎖または分岐鎖の何れでもよく、直鎖または分岐鎖アルキル基の炭素数は好ましくは2〜36であり、より好ましくは2〜18であり、さらに好ましくは2〜12であり、特に好ましくは2〜6である。アルケニル基としては、例えば、ビニル基、アリル基、プレニル基、ゲラニル基、オレイル基等が挙げられる。シクロアルケニル基としては、例えば炭素数3〜8のシクロアルケニル基などが挙げられる。シクロアルケニル基としては、例えば、2−シクロペンテン−1−イル基、2−シクロヘキセン−1−イル基等が挙げられる。
アルキニル基は、直鎖または分岐鎖の何れでもよく、直鎖または分岐鎖アルキル基の炭素数は好ましくは2〜36であり、より好ましくは2〜18であり、さらに好ましくは2〜12であり、特に好ましくは2〜6である。アルキニル基としては、例えば、エチニル基、プロパルギル基等が挙げられる。
アルキニル基は、直鎖または分岐鎖の何れでもよく、直鎖または分岐鎖アルキル基の炭素数は好ましくは2〜36であり、より好ましくは2〜18であり、さらに好ましくは2〜12であり、特に好ましくは2〜6である。アルキニル基としては、例えば、エチニル基、プロパルギル基等が挙げられる。
アルコキシ基としては、好ましくは、炭素数1〜20のアルコキシ基であり、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、n−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基などが挙げられる。
アルキルチオ基としては、好ましくは、炭素数1から30のアルキルチオ基であり、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、n−ヘキサデシルチオ基等が挙げられる。
アリールオキシ基としては、好ましくは炭素数6〜14のアリールオキシ基であり、例えば、フェノキシ基、ナフトキシ基、アントリルオキシ基などが挙げられる。
アリールチオ基としては、好ましくは、炭素数6から30のアリールチオ基であり、例えば、フェニルチオ基、p−クロロフェニルチオ基、m−メトキシフェニルチオ基等が挙げられる。
アリールオキシ基としては、好ましくは炭素数6〜14のアリールオキシ基であり、例えば、フェノキシ基、ナフトキシ基、アントリルオキシ基などが挙げられる。
アリールチオ基としては、好ましくは、炭素数6から30のアリールチオ基であり、例えば、フェニルチオ基、p−クロロフェニルチオ基、m−メトキシフェニルチオ基等が挙げられる。
アリール基は、炭素数が6〜48のアリール基が好ましく、炭素数が6〜24のアリール基がより好ましく、炭素数が6〜14のアリール基がさらに好ましく、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントリル基、ピレニル基、フェナントレニル基、ビフェニル基、フルオレニル基などが挙げられる。
ヘテロアリール基としては、好ましくは5〜7員の置換もしくは無置換、飽和もしくは不飽和、単環もしくは縮環のヘテロ環基の何れでもよい。ヘテロアリール基は、好ましくは、環構成原子が炭素原子、窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選択され、かつ窒素原子、酸素原子および硫黄原子の何れかのヘテロ原子を少なくとも一個有するヘテロアリール基であり、さらに好ましくは、炭素数3〜30の5もしくは6員のヘテロアリール基である。ヘテロアリール基としては、例えば、イミダゾリル基、ピリジル基、キノリル基、フリル基、チエニル基、ベンゾオキサゾリル基、インドリル基、ベンズイミダゾリル基、ベンズチアゾリル基、カルバゾリル基、アゼピニル基等が挙げられる。
ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子が挙げられる。
アミノ基としては、アミノ基;モノまたはジメチルアミノ基、モノまたはジエチルアミノ基並びにモノまたはジ(n−プロピル)アミノ基等のアルキル置換アミノ基;モノまたはジフェニルアミノ基並びにモノまたはジナフチルアミノ基等の芳香族残基で置換されたアミノ基;モノアルキルモノフェニルアミノ基等のアルキル基と芳香族残基が一つずつ置換したアミノ基;ベンジルアミノ基、アセチルアミノ基、フェニルアセチルアミノ基等が挙げられる。ここで芳香族残基とは、芳香環から水素原子1個を除いた基を意味する。
R11〜R19が表す上記した基は、置換基を有していてもよく、上記置換基としては、下記の置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。置換基群Aの置換基は、置換基群Aの置換基によりさらに置換されていてもよい。
置換基群A:
スルファモイル基、シアノ基、イソシアノ基、チオシアナト基、イソチオシアナト基、ニトロ基、ニトロシル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、アミド基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、カルバモイル基、アシル基、アルデヒド基、カルボニル基、アリール基、アルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基、エテニル基、エチニル基、シリル基、およびトリアルキルシリル基(トリメチルシリル基等)。
スルファモイル基、シアノ基、イソシアノ基、チオシアナト基、イソチオシアナト基、ニトロ基、ニトロシル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、アミド基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、カルバモイル基、アシル基、アルデヒド基、カルボニル基、アリール基、アルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基、エテニル基、エチニル基、シリル基、およびトリアルキルシリル基(トリメチルシリル基等)。
本発明における粒子の粒径の好ましい範囲は、50nm以上300nm以下であり、より好ましい範囲は、60nm以上250nm以下であり、更に好ましい範囲は、70nm以上200nm以下である。
粒子の粒径とは、粒子が蛍光色素を内包している場合においては蛍光色素を内包した粒子(以下、蛍光粒子ともいう)の粒径であってもよく、蛍光色素を内包していない粒子の粒径でもよい。
粒子の粒径とは、粒子が蛍光色素を内包している場合においては蛍光色素を内包した粒子(以下、蛍光粒子ともいう)の粒径であってもよく、蛍光色素を内包していない粒子の粒径でもよい。
粒子および蛍光粒子の平均粒径は、市販の粒度分布計等で計測することが可能である。粒度分布の測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。
粒径範囲及び測定の容易さから、本発明においては動的光散乱法を用いることが好ましい。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックUPA(日機装株式会社)、動的光散乱式粒径分布測定装置LB−550(株式会社 堀場製作所)、濃厚系粒径アナライザーFPAR−1000(大塚電子株式会社)、ZETA SIZER Nano series(マルバーン社)等が挙げられ、本発明においては、25℃の測定温度で測定したメジアン径(d=50)の値として求める。
粒径範囲及び測定の容易さから、本発明においては動的光散乱法を用いることが好ましい。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックUPA(日機装株式会社)、動的光散乱式粒径分布測定装置LB−550(株式会社 堀場製作所)、濃厚系粒径アナライザーFPAR−1000(大塚電子株式会社)、ZETA SIZER Nano series(マルバーン社)等が挙げられ、本発明においては、25℃の測定温度で測定したメジアン径(d=50)の値として求める。
粒子および蛍光粒子の多分散指数(Polydispersity Index:PDI)とは、粒径分布の幅を評価するための指数であり、0から1の範囲の値をとる。多分散指数が0の値である場合、径の分布がない理想的な粒径分布を表す。0.1以下のPDI値を有する分布は単分散であり、0.1から0.3の間の値を有する分散体は、狭い径分布を有すると考えられる。0.5より大きいPDIを有する分散体は、多分散性である。多分散指数は、動的光散乱(Dynamic Light Scattering: DLS)法を使用して得られた値から計算される。本発明において好ましい多分散指数は、0.0001以上0.2以下であり、より好ましくは0.001以上0.15以下であり、更に好ましくは0.002以上0.10以下である。
<生理活性物質>
本発明においては、式(1)におけるR4で表される生理活性物質反応性基に、生理活性物質を結合させることができる。
R4で表される生理活性物質反応性基に結合させる生理活性物質としては、測定対象物質と結合性を有する結合物質(以下、第一の結合物質ともいう)であることが好ましい。第一の結合物質としては、抗原、抗体、またはこれらの複合体を使用できるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、生理活性物質(即ち、第一の結合物質)は抗体である。
本発明においては、式(1)におけるR4で表される生理活性物質反応性基に、生理活性物質を結合させることができる。
R4で表される生理活性物質反応性基に結合させる生理活性物質としては、測定対象物質と結合性を有する結合物質(以下、第一の結合物質ともいう)であることが好ましい。第一の結合物質としては、抗原、抗体、またはこれらの複合体を使用できるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、生理活性物質(即ち、第一の結合物質)は抗体である。
抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスIgG、マウスIgM、ラットIgG、ラットIgM、ハムスターIgG、ハムスターIgM、ウサギIgG、ウサギIgM、ヤギIgG、ヤギIgM、ヒツジIgG、ヒツジIgM、ウシIgG、ウシIgM、トリIgY等であり、ポリクローナルまたはモノクローナルのどちらも使用可能である。
抗体としては、市販の抗体でもよく、あるいは動物血清または培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。例えば、その測定対象物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その測定対象物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られる抗体を用いることができる。
抗体としては、断片化抗体を使用してもよい。断片化抗体は、少なくとも1つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはF(ab’)2、Fab、Fab’、またはFv等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。抗体はキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよい。
R4で表される生理活性物質反応性基と、生理活性物質(第一の結合物質、例えば、抗体)とを反応させることにより、生理活性物質と、式(1)で表される構造単位を含む共重合体とを結合させることができる。例えば、式(1)で表される構造単位を含む共重合体における活性エステル化したカルボキシル基と、生理活性物質(第一の結合物質、例えば、抗体)が有するアミノ基とを、水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させて結合させる方法を挙げることができる。
<キット>
本発明は、上記した本発明の固相担体と、検出領域を金属膜上に備えた基板(即ち、金属膜と上記金属膜上の検出領域とを含む基板)とを含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットに関する。
測定対象物質は、生体試料中に存在するものでもよい。生体試料としては、測定対象物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物(例えば、ヒト、イヌ、ネコなど)の体液(例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、または喀痰)若しくは排泄物(例えば、糞便)、臓器、組織、粘膜や皮膚などを挙げることができる。
本発明は、上記した本発明の固相担体と、検出領域を金属膜上に備えた基板(即ち、金属膜と上記金属膜上の検出領域とを含む基板)とを含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットに関する。
測定対象物質は、生体試料中に存在するものでもよい。生体試料としては、測定対象物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物(例えば、ヒト、イヌ、ネコなど)の体液(例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、または喀痰)若しくは排泄物(例えば、糞便)、臓器、組織、粘膜や皮膚などを挙げることができる。
測定対象物質としては、特に限定されないが、例えば、コレステロール、ホルモン(ステロイドホルモン、ペプチドホルモンなど)、タンパク質、胆汁酸、コルチゾールなどが挙げられる。測定対象物質としては、特に好ましくは、甲状腺刺激ホルモン(TSH)またはプロゲステロンを挙げることができる。
(基板)
本発明では、高感度な測定を達成するために、後述する表面プラズモン蛍光(SPF)検出を行う測定法を採用することが好ましい。この場合における基板としては、表面に金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、または白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。金を使用する場合、後記する検出領域は、金膜上にある。上記の金属は単独または組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、1nm以上500nm以下であるのが好ましく、特に10nm以上200nm以下であるのが好ましい。500nmを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、0.1nm以上、10nm以下であることが好ましい。
本発明では、高感度な測定を達成するために、後述する表面プラズモン蛍光(SPF)検出を行う測定法を採用することが好ましい。この場合における基板としては、表面に金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、または白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。金を使用する場合、後記する検出領域は、金膜上にある。上記の金属は単独または組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、1nm以上500nm以下であるのが好ましく、特に10nm以上200nm以下であるのが好ましい。500nmを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、0.1nm以上、10nm以下であることが好ましい。
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、マグネトロンスパッタ法を含むスパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、または無電解めっき法等によって行うことができるが、基板材質と金属膜との混合層を設けて、金属膜の密着性を良くするためには、スパッタ法により金属膜を作製することが好ましい。この場合、基板材質と金属膜との混合層の厚さは十分な密着性が確保できれば特に制限はないが、10nm以下が好ましい。
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む。本発明で使用することができる基板の材質としては例えば、一般的な光学ガラスの一種であるBK7(ホウ珪酸ガラス)等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、またはシクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
SPF検出のための基板の好ましい態様としては、ポリメチルメタクリレート(PMMA)に金膜を蒸着した基板などを挙げることができる。
基板は、測定対象物質または生理活性物質(第一の結合物質)の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を、金属膜上に備えている。
(第二の結合物質)
第二の結合物質は、測定対象物質と結合性を有する物質であるか、または生理活性物質(第一の結合物質)と結合性を有する物質である。定量をサンドイッチアッセイ法で行う場合には、第二の結合物質として、測定対象物質と結合性を有する物質を使用することができる。定量を競合法で行う場合には、第二の結合物質として、生理活性物質(第一の結合物質)と結合性を有する物質を使用することができる。
第二の結合物質は、測定対象物質と結合性を有する物質であるか、または生理活性物質(第一の結合物質)と結合性を有する物質である。定量をサンドイッチアッセイ法で行う場合には、第二の結合物質として、測定対象物質と結合性を有する物質を使用することができる。定量を競合法で行う場合には、第二の結合物質として、生理活性物質(第一の結合物質)と結合性を有する物質を使用することができる。
第二の結合物質としては、特に限定されないが、好ましい例としては、抗原、抗体、またはこれらの複合体が挙げられる。第二の結合物質として抗原を用いる場合には、測定対象物質(これは、第一の結合物質と結合性を有する物質である)あるいはそのハプテンを使用することが好ましい。第二の結合物質として、測定対象物質あるいはそのハプテンを使用する場合には、第二の結合物質は、測定対象物質とキャリアとの結合体であることが好ましい。キャリアとは、測定対象物質の複数の分子が結合可能な物質を意味する。好ましいキャリアの一例としては、タンパク質などが挙げられ、その中でも具体的には、ウシ血清アルブミン等を挙げることができる。
第二の結合物質として抗体を用いる場合、抗体を基板上にある金属膜上に固定する方法としては、物理吸着あるいは共有結合による化学結合の何れの原理も採用することが可能である。また、金属消光を防止する目的で、金属膜上に自己組織化単分子膜(Self−Assembled Monolayer:SAM)を形成し、SAM膜上に第二の結合物質を固定したりする方法や、更にこのSAM上にカルボキシメチルデキストラン(CMD)等の親水性高分子層を設け、その親水性高分子層に第二の結合物質を固定したりする方法を利用することもできる。
自己組織化単分子膜(SAM)とは、代表的には、アルカンチオール化合物を、金を含む金属膜表面に接触、放置した際に、アルカンチオ−ル化合物と金を含む表面が反応して、Au−S結合を形成すると共に、アルキル長鎖同士の相互作用によって、金表面に形成される、高い配向性をもつ単分子膜として知られているもので、表面プラズモン共鳴/蛍光や、水晶発振子マイクロバランス(QCM;Quartz Crystal Microbalance)等の分野で広く利用されているものである。
SAMの具体例としては、1−ウンデカンチオールや、10−カルボキシ−1−デカンチオール、11−ヒドロキシ−1−ウンデカンチオールからなる膜、あるいはこれらを組み合わせた膜などを挙げることができる。
上記のSAM上には、親水性高分子層を設けることが好ましく、この親水性高分子層は、SAM上に2次元構造または3次元構造を形成するために設けるものであり、特に3次元構造を設ける場合には、第二の結合物質の固定化を、支持体表面の2次元に限定することなく、基板上の金属膜表面から遊離した3次元空間にまで広げられる親水性高分子層の構造を作製することが可能となる。
この親水性高分子の具体例としては、ポリサッカライド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸からなる群から選択される少なくとも一種の高分子を挙げることができる。ポリサッカライドとしては、デキストラン、あるいはデキストラン誘導体などの親水性高分子であることが好ましく、カルボキシメチルデキストラン(CMD)などのデキストランで構成された親水性高分子層であることが、生体親和性の向上や非特異的な吸着反応の抑制性の向上の観点から好ましい。
第二の結合物質として抗体を用いる場合、この親水性高分子層に固定化する方法としては、例えば、カルボキシメチルデキストラン(CMD)などの反応性官能基を有する高分子が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド(WSC)、例えば、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)などとN−ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)により活性エステル化し、この活性エステル化したカルボキシル基と、第二の結合物質である抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。
<検出領域(テストエリア)>
本発明においては、基板上に、測定対象物質の有無を検出する検出領域(テストエリア)が設けられている。この検出領域では、例えば測定対象物質である抗原を捕まえて、抗原に結合した標識の量を検出し定量することで、抗原を定量することが可能となる。あるいは、抗原に結合した標識のみを結合できないようにし、抗原に結合していない標識のみを捕獲して、抗原に結合した標識の量を算出する方法により、抗原を定量することが可能となる。
本発明においては、基板上に、測定対象物質の有無を検出する検出領域(テストエリア)が設けられている。この検出領域では、例えば測定対象物質である抗原を捕まえて、抗原に結合した標識の量を検出し定量することで、抗原を定量することが可能となる。あるいは、抗原に結合した標識のみを結合できないようにし、抗原に結合していない標識のみを捕獲して、抗原に結合した標識の量を算出する方法により、抗原を定量することが可能となる。
<キットの他の要素>
本発明のキットは、測定対象物質を測定する方法に用いられるものであり、測定対象物質が甲状腺刺激ホルモン(TSH)である場合には、TSH測定診断用のキットである。本発明のキットは、測定対象物質の測定を実施するに当たり、本発明の固相担体;および第二の結合物質を有する検出領域を金属膜上に備えた基板を含むものであるが、表面プラズモン励起装置、および蛍光測定デバイスなどの、測定対象物質の測定に使用される各種の器材または装置を含めてもよい。さらに、キットの要素として、既知量の測定対象物質を含む試料、取扱説明書などを含めてもよい。
本発明のキットは、測定対象物質を測定する方法に用いられるものであり、測定対象物質が甲状腺刺激ホルモン(TSH)である場合には、TSH測定診断用のキットである。本発明のキットは、測定対象物質の測定を実施するに当たり、本発明の固相担体;および第二の結合物質を有する検出領域を金属膜上に備えた基板を含むものであるが、表面プラズモン励起装置、および蛍光測定デバイスなどの、測定対象物質の測定に使用される各種の器材または装置を含めてもよい。さらに、キットの要素として、既知量の測定対象物質を含む試料、取扱説明書などを含めてもよい。
<競合法>
競合法の一例として、プロゲステロンを定量する場合を以下に説明する。プロゲステロン以外の物質を定量する場合も、同様に実施することができる。
先ず、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されているプロゲステロン免疫測定用基板に、プロゲステロンを含む生体試料、および蛍光色素と抗プロゲステロン抗体とを有する本発明の固相担体を接触させる。その生体試料中にプロゲステロンが存在しない場合には、固相担体上の抗プロゲステロン抗体と、基板上のプロゲステロン(即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロン)とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、生体試料中にプロゲステロンが存在する場合には、生体試料中のプロゲステロンと、固相担体上の抗プロゲステロン抗体との間で抗原抗体反応が起こり、固相担体上の抗プロゲステロン抗体と、基板上のプロゲステロン(即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロン)との間の抗原抗体反応が阻害される。上記の反応が終了した後、基板上のアルブミンに結合しなかった、固相担体上の抗プロゲステロン抗体を除去する。次いで基板上の免疫複合体(即ち、固相担体上の抗プロゲステロン抗体と、基板上のプロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロンとの複合体)の形成の度合いを蛍光強度として検出する。上記により、生体試料中のプロゲステロンの濃度などを測定することができる。
競合法の一例として、プロゲステロンを定量する場合を以下に説明する。プロゲステロン以外の物質を定量する場合も、同様に実施することができる。
先ず、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されているプロゲステロン免疫測定用基板に、プロゲステロンを含む生体試料、および蛍光色素と抗プロゲステロン抗体とを有する本発明の固相担体を接触させる。その生体試料中にプロゲステロンが存在しない場合には、固相担体上の抗プロゲステロン抗体と、基板上のプロゲステロン(即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロン)とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、生体試料中にプロゲステロンが存在する場合には、生体試料中のプロゲステロンと、固相担体上の抗プロゲステロン抗体との間で抗原抗体反応が起こり、固相担体上の抗プロゲステロン抗体と、基板上のプロゲステロン(即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロン)との間の抗原抗体反応が阻害される。上記の反応が終了した後、基板上のアルブミンに結合しなかった、固相担体上の抗プロゲステロン抗体を除去する。次いで基板上の免疫複合体(即ち、固相担体上の抗プロゲステロン抗体と、基板上のプロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロンとの複合体)の形成の度合いを蛍光強度として検出する。上記により、生体試料中のプロゲステロンの濃度などを測定することができる。
競合法における蛍光の測定形態は、プレートリーダー測定、あるいはフロー測定のいずれかの測定を採用することが可能であり、例えば、以下の方法により測定することができる。予め、プロゲステロン濃度が異なるプロゲステロン量既知の試料を複数用意し、この試料および本発明の固相担体を予め混合する。この混合液を、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている領域に接触させる。プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている領域からの蛍光信号を、特定の時間間隔で混合液が結合体に接触している間、複数の蛍光信号として測定する。この複数の蛍光信号から、各プロゲステロン濃度において、蛍光量の時間変化(傾き)を求める。この時間変化をY軸、プロゲステロン濃度をX軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対するプロゲステロン濃度の関係式を取得する。このように取得した関係式に基づき、検査目的とする生体試料を用いた蛍光量の時間変化の結果を用いて、生体試料に含まれるプロゲステロン量を定量することができる。
このプロゲステロン量の定量は、短時間で行うことが好ましい。具体的には、10分以内に行われることが好ましく、8分以内がより好ましく、更には6分以内で行われることが好ましい。この定量時間には、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて予め取得した蛍光量の時間変化とプロゲステロン濃度との関係式を利用して、試料および蛍光標識抗プロゲステロン抗体を、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている検出領域に接触させてから、検査目的とする生体試料を用いた蛍光量の時間変化の結果を基に生体試料に含まれるプロゲステロン量を換算する時間が含まれていることが好ましい。
<サンドイッチ法>
サンドイッチ法の一例として、TSHを定量する場合を以下に説明する。TSH以外の物質を定量する場合も、同様に実施することができる。
先ず、抗TSHモノクローナル抗体1が固定化されているTSH免疫測定用基板に、TSHを含む生体試料、および蛍光色素と抗TSH抗体2とを有する本発明の固相担体を接触させる。その生体試料中にTSHが存在する場合には、あらかじめ抗TSH抗体2と抗原抗体反応したTSHと、基板上の抗TSH抗体1とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、生体試料中にTSHが存在しない場合には、生体試料と混合した抗TSH抗体2と基板上の抗TSH抗体1との間で抗原抗体反応が起こらない。上記の反応が終了した後、基板上の抗TSH抗体1に結合しなかった抗TSH抗体2を除去する。次いで基板上の免疫複合体(即ち、蛍光標識抗TSH抗体2とTSH、基板上の抗TSH抗体1との複合体)の形成の度合いを蛍光強度として検出する。上記により、測定対象物質の濃度などを測定することができる。なお、蛍光強度と測定対象物質の濃度は、正の相関関係がある。
サンドイッチ法の一例として、TSHを定量する場合を以下に説明する。TSH以外の物質を定量する場合も、同様に実施することができる。
先ず、抗TSHモノクローナル抗体1が固定化されているTSH免疫測定用基板に、TSHを含む生体試料、および蛍光色素と抗TSH抗体2とを有する本発明の固相担体を接触させる。その生体試料中にTSHが存在する場合には、あらかじめ抗TSH抗体2と抗原抗体反応したTSHと、基板上の抗TSH抗体1とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、生体試料中にTSHが存在しない場合には、生体試料と混合した抗TSH抗体2と基板上の抗TSH抗体1との間で抗原抗体反応が起こらない。上記の反応が終了した後、基板上の抗TSH抗体1に結合しなかった抗TSH抗体2を除去する。次いで基板上の免疫複合体(即ち、蛍光標識抗TSH抗体2とTSH、基板上の抗TSH抗体1との複合体)の形成の度合いを蛍光強度として検出する。上記により、測定対象物質の濃度などを測定することができる。なお、蛍光強度と測定対象物質の濃度は、正の相関関係がある。
(流路)
本発明の好ましい態様においては、測定対象物質を含む可能性のある生体試料と、本発明の固相担体とを混合した混合液を、基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、生体試料と、本発明の固相担体とが、検出領域まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、生体試料液を点着する点着口、検出領域としての金属膜、および金属膜を超えて流路が存在し、生体試料が、金属膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口を設けることができる。
本発明の好ましい態様においては、測定対象物質を含む可能性のある生体試料と、本発明の固相担体とを混合した混合液を、基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、生体試料と、本発明の固相担体とが、検出領域まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、生体試料液を点着する点着口、検出領域としての金属膜、および金属膜を超えて流路が存在し、生体試料が、金属膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口を設けることができる。
(表面プラズモン蛍光測定)
本発明における蛍光などの標識の検出方法としては、特に限定されないが、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、または表面プラズモン励起による蛍光検出(SPF)を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。好ましくは、表面プラズモン共鳴による蛍光検出により、測定対象物質の量に関連した標識情報を取得することができる。
本発明における蛍光などの標識の検出方法としては、特に限定されないが、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、または表面プラズモン励起による蛍光検出(SPF)を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。好ましくは、表面プラズモン共鳴による蛍光検出により、測定対象物質の量に関連した標識情報を取得することができる。
なお、蛍光の測定の形態は、プレートリーダー測定でもよいし、フロー測定でもよい。表面プラズモン励起による蛍光検出法(SPF法)は、落射励起による蛍光検出法(落射蛍光法)よりも高感度に測定することができる。
表面プラズモン蛍光(SPF)バイオセンサーとしては、例えば、特開2008−249361号公報に記載されているような、所定波長の励起光を透過させる材料から形成された光導波路と、この光導波路の一表面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを光導波路に通し、上記光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、上記表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されることによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、を備えたセンサーを用いることができる。
表面プラズモン励起による蛍光検出(SPF)系は、好ましくは、基板上の金属膜上に固定化された測定対象物質の量に依存した蛍光物質からの蛍光を検出するアッセイ方法であり、例えば、溶液中での反応の進行により、光学的な透明度の変化を濁度として検出する、いわゆるラテックス凝集法とは異なる方法である。ラテックス凝集法とは、ラテックス試薬中の抗体感作ラテックスと生体試料中の抗原が、抗体反応により結合し凝集するが、この凝集塊は時間と共に増大し、この凝集塊に近赤外光を照射して得られた単位時間当たりの吸光度変化から、抗原濃度を定量化する方法である。本発明では、ラテックス凝集法に比べて、非常に簡便な測定対象物質の検出方法を提供できる。
以下に、本発明の実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例に示される材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
略号は以下の意味を有する。
Bn:ベンジル
Boc:tert−ブトキシカルボニル
t−Bu:tert−ブチル
r.t.:室温
Bn:ベンジル
Boc:tert−ブトキシカルボニル
t−Bu:tert−ブチル
r.t.:室温
化合物1−Aの合成
100mL三口ナスフラスコ中においてN−(tert−ブトキシカルボニル)−L−アスパラギン酸1−ベンジル700mgとアミノ−PEG3−tert−ブチルエステル900mgをメタノール(MeOH)に溶解させた。氷冷下、4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリド(DMT−MM)1.057gを加え、室温で4時間反応させた。反応終了後、溶剤を減圧留去した。残渣を酢酸エチル40mLに溶解させ、飽和重曹水、飽和塩化アンモニウム水、飽和食塩水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶剤を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー(塩化メチレン→塩化メチレン/メタノール=96/4)で精製し、化合物1−Aを1.345g、98%で得た。
100mL三口ナスフラスコ中においてN−(tert−ブトキシカルボニル)−L−アスパラギン酸1−ベンジル700mgとアミノ−PEG3−tert−ブチルエステル900mgをメタノール(MeOH)に溶解させた。氷冷下、4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリド(DMT−MM)1.057gを加え、室温で4時間反応させた。反応終了後、溶剤を減圧留去した。残渣を酢酸エチル40mLに溶解させ、飽和重曹水、飽和塩化アンモニウム水、飽和食塩水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶剤を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー(塩化メチレン→塩化メチレン/メタノール=96/4)で精製し、化合物1−Aを1.345g、98%で得た。
化合物1−Bの合成
化合物1−A1.34gと10%Pd/C370mgにエタノール(EtOH)30mLを加え、水素雰囲気下、オートクレーブ内25℃で9時間反応させた。反応終了後、Pd/Cをセライトろ過で除去し、溶剤を減圧留去して、化合物1−Bを1.11g、収率98%で得た。
化合物1−A1.34gと10%Pd/C370mgにエタノール(EtOH)30mLを加え、水素雰囲気下、オートクレーブ内25℃で9時間反応させた。反応終了後、Pd/Cをセライトろ過で除去し、溶剤を減圧留去して、化合物1−Bを1.11g、収率98%で得た。
化合物1−Cの合成
50mLナスフラスコ中において化合物1−B574mgとN,N−ジメチルエチレンジアミン186μLをメタノール(MeOH)9mLに溶解させた。氷冷下、4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリド(DMT−MM)563mgを加え、室温で24時間反応させた。反応終了後、溶剤を減圧留去した。残渣を塩化メチレンに溶解させ、飽和重曹水、飽和塩化アンモニウム水、飽和食塩水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶剤を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=80/20)で精製し、化合物1−Cを477mg、73%で得た。
50mLナスフラスコ中において化合物1−B574mgとN,N−ジメチルエチレンジアミン186μLをメタノール(MeOH)9mLに溶解させた。氷冷下、4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリド(DMT−MM)563mgを加え、室温で24時間反応させた。反応終了後、溶剤を減圧留去した。残渣を塩化メチレンに溶解させ、飽和重曹水、飽和塩化アンモニウム水、飽和食塩水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶剤を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=80/20)で精製し、化合物1−Cを477mg、73%で得た。
化合物1−Dの合成
化合物1−C477mgと1,4−ブタンスルトン230μLにアセトニトリル(MeCN)1mLを加え、マイクロウェーブ100℃で3時間反応させた。溶剤を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー(水/アセトニトリル=90/10→水/アセトニトリル=50/50)で精製し、化合物1−Dを428mg、収率72%で得た。
化合物1−C477mgと1,4−ブタンスルトン230μLにアセトニトリル(MeCN)1mLを加え、マイクロウェーブ100℃で3時間反応させた。溶剤を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー(水/アセトニトリル=90/10→水/アセトニトリル=50/50)で精製し、化合物1−Dを428mg、収率72%で得た。
化合物1−Eの合成
50mLナスフラスコ中において化合物1−D428mgを塩化メチレン(DCM)6mLに溶解させた。トリフルオロ酢酸(TFA)1.2mLを加え、24時間反応させた。反応終了後、塩化メチレンとトリフルオロ酢酸を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー(水→水/アセトニトリル=90/10)で精製し、化合物1−Eを78mg、収率20%で得た。
50mLナスフラスコ中において化合物1−D428mgを塩化メチレン(DCM)6mLに溶解させた。トリフルオロ酢酸(TFA)1.2mLを加え、24時間反応させた。反応終了後、塩化メチレンとトリフルオロ酢酸を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー(水→水/アセトニトリル=90/10)で精製し、化合物1−Eを78mg、収率20%で得た。
化合物1の合成
50mLナスフラスコ中において化合物1−E78mgとトリエチルアミン(TEA)26μLを塩化メチレン(DCM)2mLに溶解させた。メタクリロイルクロリド17μLを加え、16時間反応させた。反応終了後、溶剤を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー(水/アセトニトリル=90/10→水/アセトニトリル=70/30)で精製し、化合物1を50mg、収率80%で得た。
50mLナスフラスコ中において化合物1−E78mgとトリエチルアミン(TEA)26μLを塩化メチレン(DCM)2mLに溶解させた。メタクリロイルクロリド17μLを加え、16時間反応させた。反応終了後、溶剤を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー(水/アセトニトリル=90/10→水/アセトニトリル=70/30)で精製し、化合物1を50mg、収率80%で得た。
合成例1と同様に、使用する原料を変え化合物2を合成した。
合成例1および2と同様に、使用する原料を変え化合物3を合成した。
化合物4−Aの合成
化合物1−Cと同様に、使用する原料を変え化合物4−Aを合成した。
化合物4−Bの合成
化合物1−Eと同様に、使用する原料を変え化合物4−Bを合成した。
化合物4の合成
化合物1と同様に、使用する原料を変え化合物4を合成した。
化合物1−Cと同様に、使用する原料を変え化合物4−Aを合成した。
化合物4−Bの合成
化合物1−Eと同様に、使用する原料を変え化合物4−Bを合成した。
化合物4の合成
化合物1と同様に、使用する原料を変え化合物4を合成した。
<蛍光標識抗体の作製>
[実施例1]
(粒子の作製)
1L三口フラスコ中においてドデシル硫酸ナトリウム0.6gを超純水400gに溶解させた。窒素下で85℃まで昇温した後、スチレン30gを加え5分間撹拌した。別容器でペルオキソ二硫酸カリウム1gを超純水30gに溶解させ、これを上記三口フラスコに入れ、85℃で6時間重合した。室温まで冷却した後、ナイロンメッシュN−No.230Tでろ過を行い、核粒子を得た。
[実施例1]
(粒子の作製)
1L三口フラスコ中においてドデシル硫酸ナトリウム0.6gを超純水400gに溶解させた。窒素下で85℃まで昇温した後、スチレン30gを加え5分間撹拌した。別容器でペルオキソ二硫酸カリウム1gを超純水30gに溶解させ、これを上記三口フラスコに入れ、85℃で6時間重合した。室温まで冷却した後、ナイロンメッシュN−No.230Tでろ過を行い、核粒子を得た。
次いで、100mL三口ナスフラスコに上記核粒子30gを加え、窒素下で85℃まで昇温した。スチレン0.5gと化合物1(0.2g)を加え5分間撹拌した。別容器でペルオキソ二硫酸カリウム0.067gを超純水2gに溶解させ、これを上記三口フラスコに入れ、85℃で6時間重合した。室温まで冷却した後、ナイロンメッシュ(N−No.230T)でろ過を行い遠心分離により粒子を超純水で洗浄し、ポリマー単位構造として化合物1(下記構造)を表面に有する粒子を得た。
(カルボキシル基の含有量測定)
上記粒子固形分5質量%水分散液2.0gを超純水80gで希釈し、さらに1mol/L塩酸50μLを加え室温で5分間撹拌した。そこに、pHメータHM−30R型(東亜ディーケーケー社製)で電気伝導度を測定しながら0.1mol/L水酸化ナトリウム水溶液を滴下した。カルボキシル基の中和される0.1mol/L水酸化ナトリウム水溶液の量を測定し、その結果からカルボキシル基の含有量を算出した。
上記粒子固形分5質量%水分散液2.0gを超純水80gで希釈し、さらに1mol/L塩酸50μLを加え室温で5分間撹拌した。そこに、pHメータHM−30R型(東亜ディーケーケー社製)で電気伝導度を測定しながら0.1mol/L水酸化ナトリウム水溶液を滴下した。カルボキシル基の中和される0.1mol/L水酸化ナトリウム水溶液の量を測定し、その結果からカルボキシル基の含有量を算出した。
(蛍光粒子の作製)
100mLナスフラスコに上記粒子固形分2質量%水分散液7.5gとテトラヒドロフラン1.5mLを加え、30℃で20分間撹拌した。別容器で3,3’,5,5’−テトラフェニル−メソ−アザ−2,2'−ジピロメテンジフルオロボレート0.9mgをテトラヒドロフラン0.75mLに溶解させ、これを上記ナスフラスコに入れ、30℃で30分間撹拌した。テトラヒドロフランを減圧留去した後、桐山ろ過を行い遠心分離により粒子をPBS(リン酸生理食塩水、富士フイルム和光純薬社製)(pH7.6)で洗浄し、蛍光粒子を得た。
100mLナスフラスコに上記粒子固形分2質量%水分散液7.5gとテトラヒドロフラン1.5mLを加え、30℃で20分間撹拌した。別容器で3,3’,5,5’−テトラフェニル−メソ−アザ−2,2'−ジピロメテンジフルオロボレート0.9mgをテトラヒドロフラン0.75mLに溶解させ、これを上記ナスフラスコに入れ、30℃で30分間撹拌した。テトラヒドロフランを減圧留去した後、桐山ろ過を行い遠心分離により粒子をPBS(リン酸生理食塩水、富士フイルム和光純薬社製)(pH7.6)で洗浄し、蛍光粒子を得た。
(蛍光粒子の粒径および多分散指数測定)
上記蛍光粒子固形分2質量%水分散液4.0μLをPBS(リン酸生理食塩水、富士フイルム和光純薬社製)(pH7.6)796μLで希釈し、ゼータサイザーナノZS(マルバーン社製)で蛍光粒子の粒径および多分散指数を測定した。
上記蛍光粒子固形分2質量%水分散液4.0μLをPBS(リン酸生理食塩水、富士フイルム和光純薬社製)(pH7.6)796μLで希釈し、ゼータサイザーナノZS(マルバーン社製)で蛍光粒子の粒径および多分散指数を測定した。
(抗体の固定化)
上記蛍光粒子固形分2質量%水分散液275μLを、50mmol/LのMES(2−モルホリノエタノスルホン酸、同仁化学研究所社製)緩衝液(pH5.6)を88μLで希釈し、10質量%の1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)超純水溶液8.8μLを加え、室温で15分間撹拌した。その後、0.5mg/mLの抗TSHモノクローナル抗体(Meridian life science社製:Anti−TSH Mab MAT04−410)を187μL添加し、室温で1時間撹拌し抗体を蛍光粒子に固定化した。固定化後、2mol/Lグリシン水溶液を27.5μL加え、15分間静置し、ブロッキングを行った。反応終了後、遠心分離による精製を行い、抗体結合蛍光粒子を得た。
上記蛍光粒子固形分2質量%水分散液275μLを、50mmol/LのMES(2−モルホリノエタノスルホン酸、同仁化学研究所社製)緩衝液(pH5.6)を88μLで希釈し、10質量%の1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)超純水溶液8.8μLを加え、室温で15分間撹拌した。その後、0.5mg/mLの抗TSHモノクローナル抗体(Meridian life science社製:Anti−TSH Mab MAT04−410)を187μL添加し、室温で1時間撹拌し抗体を蛍光粒子に固定化した。固定化後、2mol/Lグリシン水溶液を27.5μL加え、15分間静置し、ブロッキングを行った。反応終了後、遠心分離による精製を行い、抗体結合蛍光粒子を得た。
[実施例2]
実施例1と同様に、使用するモノマーを化合物2に変え、抗体結合蛍光粒子を得た。
実施例1と同様に、使用するモノマーを化合物2に変え、抗体結合蛍光粒子を得た。
[実施例3]
実施例1と同様に、使用するモノマーを化合物3に変え、抗体結合蛍光粒子を得た。
実施例1と同様に、使用するモノマーを化合物3に変え、抗体結合蛍光粒子を得た。
[実施例4]
実施例1と同様に、使用するモノマーを化合物4に変え、抗体結合蛍光粒子を得た。
実施例1と同様に、使用するモノマーを化合物4に変え、抗体結合蛍光粒子を得た。
[比較例1]
(粒子の作製)
1L三口フラスコ中においてドデシル硫酸ナトリウム0.6gを超純水400gに溶解させた。窒素下で85℃まで昇温した後、スチレン30gを加え5分間200rpm撹拌した容器でペルオキソ二硫酸カリウム1gを超純水30gに溶解させ、これを上記反応容器に入れ、85℃で6時間重合した。室温まで冷却した後、ナイロンメッシュN−No.230Tでろ過を行い、核粒子を得た。
(粒子の作製)
1L三口フラスコ中においてドデシル硫酸ナトリウム0.6gを超純水400gに溶解させた。窒素下で85℃まで昇温した後、スチレン30gを加え5分間200rpm撹拌した容器でペルオキソ二硫酸カリウム1gを超純水30gに溶解させ、これを上記反応容器に入れ、85℃で6時間重合した。室温まで冷却した後、ナイロンメッシュN−No.230Tでろ過を行い、核粒子を得た。
次いで、100mL三口ナスフラスコに上記核粒子30gを加え、窒素下で85℃まで昇温した。スチレン0.25gとアクリル酸0.05gと2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(東京化成工業)0.2gを加え5分間200rpm撹拌した。別容器でペルオキソ二硫酸カリウム0.067gを超純水2gに溶解させ、これを上記三口ナスフラスコに入れ、85℃で6時間重合した。室温まで冷却した後、ナイロンメッシュ(N−No.230T)でろ過を行い遠心分離により粒子を超純水で洗浄し、ポリマー単位構造としてカルボキシル基とホスホリルコリン基(下記構造)を表面に有する粒子を得た。
以降、実施例1と同様に、上記粒子を使用して、蛍光標識抗体を得た。
<抗体結合量の評価>
上記実施例及び比較例の蛍光標識抗体の作製過程において、遠心分離によって得られた上澄み液に含まれる抗体量をNANODROP 2000c(Thermo Fisher社製)で定量し、蛍光粒子に固定化した抗体量を算出した。算出に用いた計算式と評価基準を以下に示す。
抗体結合量 = (添加した抗体量 (μg))−(遠心分離上澄み中の抗体量 (μg))/(粒子重量 (mg))
上記実施例及び比較例の蛍光標識抗体の作製過程において、遠心分離によって得られた上澄み液に含まれる抗体量をNANODROP 2000c(Thermo Fisher社製)で定量し、蛍光粒子に固定化した抗体量を算出した。算出に用いた計算式と評価基準を以下に示す。
抗体結合量 = (添加した抗体量 (μg))−(遠心分離上澄み中の抗体量 (μg))/(粒子重量 (mg))
(抗体結合量)
S:100μg/mg以上
A:80μg/mg以上100μg/mg未満
B:60μg/mg以上80μg/mg未満
C:40μg/mg以上60μg/mg未満
D:40μg/mg未満
S:100μg/mg以上
A:80μg/mg以上100μg/mg未満
B:60μg/mg以上80μg/mg未満
C:40μg/mg以上60μg/mg未満
D:40μg/mg未満
<非特異吸着抑制効果の評価>
上記実施例及び比較例で得られた蛍光粒子固形分2質量%水分散液500μLをPBS500μLで希釈した。この分散液を遠心分離し上澄み950μLを除去した後に、BSA(ウシ血清アルブミン、富士フイルム和光純薬)PBS溶液(1mg/mL)を950μL加えた。超音波で再分散をした後、室温で2時間撹拌しBSAを蛍光粒子に吸着させた。撹拌後、遠心分離し上澄み液に含まれるBSA量をNANODROP 2000c(Thermo Fisher社製)で定量し、蛍光粒子に非特異吸着したBSA量を算出した。算出に用いた計算式と評価基準を以下に示す。
非特異吸着量 = (添加したBSA量 (μg))−(遠心分離上澄み中のBSA量 (μg))/(粒子重量 (mg))
上記実施例及び比較例で得られた蛍光粒子固形分2質量%水分散液500μLをPBS500μLで希釈した。この分散液を遠心分離し上澄み950μLを除去した後に、BSA(ウシ血清アルブミン、富士フイルム和光純薬)PBS溶液(1mg/mL)を950μL加えた。超音波で再分散をした後、室温で2時間撹拌しBSAを蛍光粒子に吸着させた。撹拌後、遠心分離し上澄み液に含まれるBSA量をNANODROP 2000c(Thermo Fisher社製)で定量し、蛍光粒子に非特異吸着したBSA量を算出した。算出に用いた計算式と評価基準を以下に示す。
非特異吸着量 = (添加したBSA量 (μg))−(遠心分離上澄み中のBSA量 (μg))/(粒子重量 (mg))
(非特異吸着量)
S:10μg/mg未満
A:10μg/mg以上20μg/mg未満
B:20μg/mg以上30μg/mg未満
C:30μg/mg以上40μg/mg未満
D:40μg/mg以上
S:10μg/mg未満
A:10μg/mg以上20μg/mg未満
B:20μg/mg以上30μg/mg未満
C:30μg/mg以上40μg/mg未満
D:40μg/mg以上
<サンドイッチ法によるTSH評価>
上記蛍光標識抗体を用いて、表面プラズモン共鳴による蛍光検出により生体試料中の甲状腺刺激ホルモン(TSH)測定を実施した。
上記蛍光標識抗体を用いて、表面プラズモン共鳴による蛍光検出により生体試料中の甲状腺刺激ホルモン(TSH)測定を実施した。
TSHを定量する場合を以下に説明する。TSH以外の物質を定量する場合も、同様に実施することができる。先ず、抗TSHモノクローナル抗体1が固定化されているTSH免疫測定用基板に、TSHを含む生体試料及び蛍光標識抗TSH抗体2を接触させる。その生体試料中にTSHが存在する場合には、あらかじめ蛍光標識した抗TSH抗体2と抗原抗体反応したTSHと、基板上の抗TSH抗体1とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、生体試料中にTSHが存在しない場合には、生体試料と混合した蛍光標識抗TSH抗体2と基板上の抗TSH抗体1との間で抗原抗体反応が起こらない。上記の反応が終了した後、基板上の抗TSH抗体1に結合しなかった蛍光標識抗TSH抗体2を除去する。次いで基板上の免疫複合体(即ち、蛍光標識抗TSH抗体2とTSH、基板上の抗TSH抗体1との複合体)の形成の度合いを蛍光強度として検出する。
(基板作製)
ポリメチルメタクリレート(PMMA)の基体(三菱レイヨン株式会社製、アクリペット(登録商標)VH)を準備し、スパッタ法により、厚さ45nmの金膜を片面に作製し7mmの幅に裁断して、同じ基板を7枚作製した。この基板の金膜表面上に、調製した抗TSHモノクローナル抗体1(Medix社製、5409)を含む液(濃度:10μg/mL in 150mmol/L NaCl)を点着して乾燥させ、抗TSH抗体を固定化した基板を作製した。調製した基板を、Tween20(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウラート、富士フイルム和光純薬社製)を0.05質量%の濃度で含むPBS溶液(pH7.4))を予め調製し、この溶液300μLを用いて3回繰り返し洗浄した。洗浄終了後、金膜表面上の抗TSH抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、1質量%カゼイン(Thermo Scientific社製)を含むPBS溶液(pH7.4)を300μL添加し、1時間、室温で静置した。上記の洗浄用溶液で洗浄後、安定化剤としてImmunoassay Stabilizer(ABI社製)300μLを添加し、室温で30分間放置し、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除き、評価用基板を作製した。
ポリメチルメタクリレート(PMMA)の基体(三菱レイヨン株式会社製、アクリペット(登録商標)VH)を準備し、スパッタ法により、厚さ45nmの金膜を片面に作製し7mmの幅に裁断して、同じ基板を7枚作製した。この基板の金膜表面上に、調製した抗TSHモノクローナル抗体1(Medix社製、5409)を含む液(濃度:10μg/mL in 150mmol/L NaCl)を点着して乾燥させ、抗TSH抗体を固定化した基板を作製した。調製した基板を、Tween20(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウラート、富士フイルム和光純薬社製)を0.05質量%の濃度で含むPBS溶液(pH7.4))を予め調製し、この溶液300μLを用いて3回繰り返し洗浄した。洗浄終了後、金膜表面上の抗TSH抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、1質量%カゼイン(Thermo Scientific社製)を含むPBS溶液(pH7.4)を300μL添加し、1時間、室温で静置した。上記の洗浄用溶液で洗浄後、安定化剤としてImmunoassay Stabilizer(ABI社製)300μLを添加し、室温で30分間放置し、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除き、評価用基板を作製した。
(センサチップの作製)
特開2010−190880号公報の第2の実施形態の構成となるように、流路型センサチップを作製した。その概略図を図1及び図2に示した。図1は、センサチップ1の概略図であり、図2はセンサチップ1の分解図である。センサチップ1は、上部部材2、中間部材3及び基板4から構成されている。上部部材2には、第一の容器5及び第二の容器6が設けられている。なお、第一の容器5及び第二の容器6を併せて、容器群7と称する。基板4には、流路10が形成されており、流路10の上には、検出領域8及び参照領域9が形成されている。
特開2010−190880号公報の第2の実施形態の構成となるように、流路型センサチップを作製した。その概略図を図1及び図2に示した。図1は、センサチップ1の概略図であり、図2はセンサチップ1の分解図である。センサチップ1は、上部部材2、中間部材3及び基板4から構成されている。上部部材2には、第一の容器5及び第二の容器6が設けられている。なお、第一の容器5及び第二の容器6を併せて、容器群7と称する。基板4には、流路10が形成されており、流路10の上には、検出領域8及び参照領域9が形成されている。
(被検試料の準備)
被検試料として、TSH濃度が約0ng/mLと約0.4ng/mLのイヌ血清を使用した。イヌ血清は、北山ラベスから購入した東洋ビーグル犬の血清を用意した。
被検試料として、TSH濃度が約0ng/mLと約0.4ng/mLのイヌ血清を使用した。イヌ血清は、北山ラベスから購入した東洋ビーグル犬の血清を用意した。
(TSH評価)
上記で調製した蛍光標識抗体を用い、IMMUNO AU10V(富士フイルム社製)にてTSHの測定を実施した。上記で準備した被検試料(イヌ血清)100μLと、蛍光標識した抗TSH抗体との混合液を調製し、この混合液を10分間攪拌した。次に、上記で作製した基板を封入した流路型センサチップに蛍光標識抗体と被検試料との混合液をそれぞれ点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液を10μL/minの速度で流下させ、抗TSH抗体を固定した金膜面上に接触させてから、蛍光強度を1.5分間継続して測定した。基板において得られた蛍光強度の単位時間における増加速度を求めた。得られた2被検試料の増加速度から、S/Nを求め、相対S/Nを比較した。算出に用いた計算式と評価基準を以下に示す。
S/N =(TSH濃度約0.4ng/mL被検試料から得られた増加速度)/(TSH濃度約0ng/mL被検試料から得られた増加速度)
相対S/N =(各実施例及び比較例のS/N)/(比較例1のS/N)
上記で調製した蛍光標識抗体を用い、IMMUNO AU10V(富士フイルム社製)にてTSHの測定を実施した。上記で準備した被検試料(イヌ血清)100μLと、蛍光標識した抗TSH抗体との混合液を調製し、この混合液を10分間攪拌した。次に、上記で作製した基板を封入した流路型センサチップに蛍光標識抗体と被検試料との混合液をそれぞれ点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液を10μL/minの速度で流下させ、抗TSH抗体を固定した金膜面上に接触させてから、蛍光強度を1.5分間継続して測定した。基板において得られた蛍光強度の単位時間における増加速度を求めた。得られた2被検試料の増加速度から、S/Nを求め、相対S/Nを比較した。算出に用いた計算式と評価基準を以下に示す。
S/N =(TSH濃度約0.4ng/mL被検試料から得られた増加速度)/(TSH濃度約0ng/mL被検試料から得られた増加速度)
相対S/N =(各実施例及び比較例のS/N)/(比較例1のS/N)
(相対S/N)
S:2.0以上
A:1.7以上2.0未満
B:1.4以上1.7未満
C:1.1以上1.4未満
D:1.1未満
S:2.0以上
A:1.7以上2.0未満
B:1.4以上1.7未満
C:1.1以上1.4未満
D:1.1未満
本発明における実施例1、あるいは実施例2を用いた場合に、抗体結合量と非特異吸着抑制効果が両立でき、高感度で被検試料の検出が可能であることが分かる。
1 センサチップ
2 上部部材
3 中間部材
4 基板
5 第一の容器
6 第二の容器
7 容器群
8 検出領域
9 参照領域
10 流路
2 上部部材
3 中間部材
4 基板
5 第一の容器
6 第二の容器
7 容器群
8 検出領域
9 参照領域
10 流路
Claims (15)
- Xが−NH−であり、Yが−NH−である、請求項1に記載の固相担体。
- mが1または2である、請求項1または2に記載の固相担体。
- 前記親水性基が、ベタイン構造、糖構造、アミノ酸構造またはスルホン酸基を有する、請求項1から3の何れか一項に記載の固相担体。
- 前記生理活性物質反応性基が、カルボキシル基、活性エステル、イソチオシアネート、エポキシ基、またはマレイミドを有する、請求項1から4の何れか一項に記載の固相担体。
- 前記式(R−1)中のnが3〜6の整数である、請求項1から5の何れか一項に記載の固相担体。
- 前記生理活性物質反応性基の含有量が、固相担体の固形分1gあたり1〜500μmolである、請求項1から6の何れか一項に記載の固相担体。
- 固相担体の形状が粒子である、請求項1から7の何れか一項に記載の固相担体。
- 前記粒子の粒径が50〜300nmである、請求項8に記載の固相担体。
- 前記粒子の粒径の多分散指数が0.002以上0.10以下である、請求項8または9に記載の固相担体。
- 前記粒子が、蛍光色素を内包している、請求項8から10の何れか一項に記載の固相担体。
- 前記蛍光色素が、アザジピロメテン色素またはジピロメテン色素である、請求項11に記載の固相担体。
- R4で表される生理活性物質反応性基に生理活性物質が結合している、請求項1から12の何れか一項に記載の固相担体。
- 前記生理活性物質が抗体である、請求項13に記載の固相担体。
- 請求項1から14の何れか一項に記載の固相担体;および
検出領域を金属膜上に備えた基板:
を含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット。
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---|---|
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Citations (4)
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---|---|---|---|---|
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JP2010190880A (ja) | 2008-04-18 | 2010-09-02 | Fujifilm Corp | 光信号検出方法、光信号検出装置、光信号検出用試料セルおよび光信号検出用キット |
JP5744723B2 (ja) | 2008-09-12 | 2015-07-08 | 日東電工株式会社 | 線維性疾患のイメージング剤 |
EP3193172B1 (en) * | 2014-09-08 | 2021-11-03 | JSR Corporation | Solid phase carrier, ligand-bound solid phase carrier, method for detecting or separating target substance, and method for producing solid phase carrier |
CZ2015313A3 (cs) * | 2015-05-07 | 2016-07-07 | Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. | Polymerní kartáče odolné proti depozici složek biologických médií, způsob jejich přípravy a jejich použití |
CZ307026B6 (cs) * | 2016-06-17 | 2017-11-22 | Ústav Fotoniky A Elektroniky Av Čr, V. V. I. | Způsob přípravy povrchu substrátu obsahujícího karboxybetainové funkční skupiny |
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- 2019-07-30 EP EP19843594.3A patent/EP3832307A4/en active Pending
- 2019-07-30 JP JP2020534652A patent/JPWO2020027097A1/ja active Pending
- 2019-07-30 WO PCT/JP2019/029758 patent/WO2020027097A1/ja unknown
-
2021
- 2021-01-29 US US17/162,124 patent/US20210148900A1/en active Pending
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Publication number | Publication date |
---|---|
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EP3832307A4 (en) | 2021-11-17 |
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EP3832307A1 (en) | 2021-06-09 |
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