CN116239687A - 一种crp驼源单域抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种CRP驼源单域抗体及其制备方法和应用，涉及生物医药领域，通过免疫CRP抗原的羊驼白细胞进行富集，然后进行单细胞筛选、测序。通过测序结构分析，构建驼源CRP抗体重组质粒，克隆转化真核细胞中表达相关抗体，筛选得到具有人CRP抗性的单抗，对所述单抗的VHH结构域进行克隆表达，通过配对筛选得到具有抗体活性的CRP‑VHH的单抗。该抗体能够应用在ELISA试剂盒、化学发光试剂盒、胶乳试剂盒，且具有和现有的试剂盒同等功能，同时该抗体仍具有在制备抗肿瘤药物上的用途。

Description

一种CRP驼源单域抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体讲是一种CRP驼源单域抗体及其制备方法和应用。
背景技术
免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig），一种具有抗体活性或者化学结构和抗体分子相似的球蛋白。抗血清能与相关抗原免疫结合，根本原因为抗血清中存在免疫球蛋白，它是免疫细胞的产物（单克隆抗体除外），另外，此物质也分布在机体的体液、外分泌液和淋巴细胞的膜上。免疫球蛋白有多种成分，主要是IgG，占总体的70%左右，约为7-16g/L。哺乳动物的Ig分子呈对称型结构，都是由4条肽链组成，肽链间以二硫键链接。如图1所示，其中重链（Heavy chain，H链）为两条长链，轻链（Light chain，L链）为两条短链，链间二硫键将4条链构成经典的Y型。无论是重链或轻链，第一个结构域的氨基酸序列均具有多样性，称为免疫球蛋白分子识别抗原的可变区(variable region)。可变区之后是序列相对固定的区域，称为恒定区(constsant region)，除铰链区外，每个结构域约由 110 个氨基酸残基组成并都有其独特的功能。免疫球蛋白的可变区包括四个为结构域提供骨架结构，维持空间结构的稳定的骨架区（framework region,FR）和介于它们之间的三个与抗原表面形成互补关系的互补决定区(complementary determining region, CDR)。CDR 区的氨基酸序列差异性非常大，又被称为高变区（hypervariable regions）。与可变区相比，恒定区序列在种内较为保守VH和VL内各有4个骨架区，分别以FR1、FR2、FR3和FR4表示。
1993 年， Hammers 等人在骆驼外周血淋巴细胞中分离出一种结构不同于传统抗体的重链抗体，该抗体天然缺失轻链还有重链可变区 CH1，通过将此抗体的可变区进行PCR扩增，即可得到一抗体片段，称单域抗体。此单域抗体的分子量仅有约15 kDa，传统常规抗体分子量一般为 155 kDa左右，因单域抗体分子量只有其分子量的 1/10 左右，故又称单域抗体为纳米抗体（ VHH, variable domain of heavy chain of heavy 2chainantibody）。即使该抗体仅含有重链，但是其仍具有完整的抗原结合性能。VHH 抗体不但具有完整的抗原亲和性，同时还具有诸多的优点，例如 VHH 抗体CDR3 区有一个暴露地大凸环（由二硫键保持稳定），可深入到抗原的裂隙或空腔中，使 VHH 抗体与抗原结合能力增强，该抗体具备分子量小、容易获得和表达、高水溶性和稳定性、靶向性和人源性简单等优点。VHH抗体作为研究工具载体、疾病诊断工具和疾病治疗策略等方面具有很好的应用前景。
C-反应蛋白（CRP）是机体在炎症、感染或损伤时产生的一种急性期反应蛋白，当其升高时提示机体发生炎症反应。人CRP 发挥重要的功能，例如参与宿主防御、抗原清除和代谢等，都需要通过其与一系列外生或自体因子的相互作用。C反应蛋白可以与 DNA 和组蛋白相互作用，它可以清除受损循环细胞释放的核物质。除以上功能和效应外，CRP同时还具有致病效应。例如CRP 浓度的升高被证明与冠状动脉粥样硬化疾病密切相关。CRP 不仅是动脉粥样硬化疾病的标志物，更可能直接参与其形成，CRP 与氧化的 LDL（低密度脂蛋白）结合加剧冠状动脉梗塞中的组织损伤，并抑制受损血管内皮的修复。
发明内容
本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种CRP驼源单域抗体及其制备方法和应用。
本发明的技术解决方案如下：
一种CRP驼源单域抗体，包括框架区和可变区，所述可变区具有第一可变区、第二可变区以及第三可变区；所述第一可变区为氨基酸序列SEQ ID NO:6上的第28-34位氨基酸区域，第二可变区为氨基酸序列SEQ ID NO:6上的第52-58位氨基酸区域，第三可变区为氨基酸序列SEQ ID NO:6上的第97-106位氨基酸区域。
本发明还公开了一种CRP驼源单域抗体的制备方法，通过免疫CRP抗原的羊驼白细胞进行富集，然后进行单细胞筛选、测序。通过测序结构分析，构建驼源CRP抗体重组质粒，克隆转化真核细胞中表达相关抗体，筛选得到具有人CRP抗性的单抗，对所述单抗的VHH结构域进行克隆表达，通过配对筛选得到。
本发明还公开了一种ELISA试剂盒，包含如上所述的CRP驼源单域抗体或如上所述的制备方法制得的CRP驼源单域抗体。
本发明还公开了一种化学发光试剂盒，包含上所述的CRP驼源单域抗体或如上所述的制备方法制得的CRP驼源单域抗体。
本发明还公开了一种胶乳试剂盒，包含如上所述的CRP驼源单域抗体或如上所述的制备方法制得的CRP驼源单域抗体。
本发明还公开了如上所述的CRP驼源单域抗体或如上所述的制备方法制得的CRP驼源单域抗体在制备抗肿瘤药物上的应用。
本发明的有益效果是：本发明通过免疫CRP抗原的羊驼白细胞进行富集，然后进行单细胞筛选、测序。通过测序结构分析，构建驼源CRP抗体重组质粒，克隆转化真核细胞中表达相关抗体，筛选得到具有人CRP抗性的单抗，对所述单抗的VHH结构域进行克隆表达，通过配对筛选得到具有抗体活性的CRP-VHH的单抗。该抗体能够应用在ELISA试剂盒、化学发光试剂盒、胶乳试剂盒，且具有和现有的相关试剂盒进行检测具有同标准功能，同时该抗体仍具有在制备抗肿瘤药物上的用途。
附图说明
图1是背景技术中哺乳动物的Ig分子的结构示意图；
图2是CRP-VHH抗体试剂盒检测标准曲线图；
图3是CRP-VHH抗体化学发光法检测结果图；
图4是CRP-VHH抗体偶联乳胶微球检测结果图。
具体实施方式
本部分将详细描述本发明的具体实施例，但其不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1
通过免疫CRP抗原的羊驼白细胞进行富集，然后通过CytoFLEX LX流式细胞仪进行单细胞筛选，后通过10XGenomics单细胞测序平台进行测序。通过测序结构分析，构建100株驼源CRP抗体重组质粒，克隆转化真核细胞中表达相关抗体，ELISA筛选得到20株具有人CRP抗性的单抗，具体编号见表1。最后把20株CRP单抗的VHH结构域进行克隆表达，通过ELISA配对筛选得到6株具有抗体活性的CRP-VHH的单抗，具体编号见表1。
Figure SMS_1
该抗体包括框架区和可变区，所述可变区具有第一可变区、第二可变区以及第三可变区；其中与可变区至少具有80%的同源性，和/或，与框架区具有至少60%的同源性，都属于本发明的保护范围之列。
该抗体的氨基酸序列如下列氨基酸序列：（黑体加下划线为可变区域，其余为框架区）
如SEQ ID NO：2所示，第一可变区为其上的第28-35位氨基酸区域，第二可变区为其上的第52-58位氨基酸区域，第三可变区为其上的第96-108位氨基酸区域；具体地，SEQID NO：2：
MAEVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSMFSDNVMGWYRQAPGKQRELAFIRTGGSTYADSVKGRFTISRDNSVNTVYLQMDSLKPEDTAIYFCRHTIPVPSTPYDYWGQGTQVTVSS
如SEQ ID NO：2所示，第一可变区为其上的第28-34位氨基酸区域，第二可变区为其上的第52-58位氨基酸区域，第三可变区为其上的第97-106位氨基酸区域；具体地，SEQID NO：2：MAEVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASTSIFDRLMGWYRQAPGKQRELAAFITPSGRTTYADSVKGRFTISRDNSVNTVYLQMDSLKPEDTAIYFCYYRLNPDQNYWGQGTQVTVSS
如SEQ ID NO：3所示，第一可变区为其上的第28-34位氨基酸区域，第二可变区为其上的第52-58位氨基酸区域，第三可变区为其上的第97-106位氨基酸区域；具体地，SEQID NO：3：MAEVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASQSIFDRLMGWYRQAPGKQRELAAFITPGGRTTYADSVKGRFTISRDNSVNTVYLQMDSLKPEDTAIYFCYYRLNPDSNYWGQGTQVTVSS
如SEQ ID NO：4所示，第一可变区为其上的第28-34位氨基酸区域，第二可变区为其上的第52-58位氨基酸区域，第三可变区为其上的第97-106位氨基酸区域；具体地，SEQID NO：4：MAEVQLVESGGGAVQAGESLRLSCAASTSIFDLLMGWYRQAPGKQRELAAFINPSGRTTYADSVKGRFTISRDNSVNTVYLQMDSLKPEDTAIYFCRNRLNPDQNYWGQGTQVTVSS
如SEQ ID NO：5所示，第一可变区为其上的第28-34位氨基酸区域，第二可变区为其上的第52-58位氨基酸区域，第三可变区为其上的第97-105位氨基酸区域；具体地，SEQID NO：5：MAEVQIVESGGGLVNAGESLRLSCAASTTIFDRLMGWYRNAPGKQRELAAFISPSGRTTYADSVKGRFTISRDNSVQTVYLQMDSLKPEDSAIYFCYYRLNPDQNYWGQGTQVTVSS
如SEQ ID NO：6所示，第一可变区为其上的第28-34位氨基酸区域，第二可变区为其上的第52-58位氨基酸区域，第三可变区为其上的第97-106位氨基酸区域，具体地，具体地，SEQ ID NO：6：MAEVQLVESGGGLVQAGESLRLTCAASTSAFDRLMGWYRQAPGKQRELAAFITPTGRTTYADSVKGRFTISRDNSVNTVYLQMDSLKPEDTAIYFCYYRLNPDNQYWGQGTQVTVSS
（1）抗体ELISA筛选方法：
使用试剂：包被液：50mM碳酸盐缓冲液，pH9.6；抗体稀释液：20mM PBS pH 7.4+0.2%BSA；洗涤液：20mM PBS pH 7.4+0.05%Tween-20；封闭液：50mM PBS pH 9.6+2.0%BSA；显色液：TMB-过氧化氢尿素溶液；终止液：2mol/L H2SO4；酶标二抗兔抗驼交联HRP。
包被液稀释CRP抗原1ug/ml进行96孔板包被，每孔100µL，4℃过夜；第二天洗涤液清洗3次，拍干；加入封闭液，每孔120µL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的CRP抗体，100µL/孔，37℃，1h，洗涤液清洗3次，拍干；加入标记兔抗驼交联HRP的二抗，每孔100µL，37℃，1h洗涤液清洗3次，拍干；显色液A液和B液1:1混合后，每孔加入100µL，10min；加入终止液，50µL /孔；酶标仪上450nm处读OD值。结果见表2。
Figure SMS_2
从表2中可以看到，CRP-VHH抗体Seq2、Seq15、Seq33、Seq36、Seq68、Seq81具有吸光值，表示其重组抗体具有效价。
实施例2 上述抗体的应用方向
把纯化后的CRP-VHH单抗交联到磁微球（四氧化三铁纳米粒，1μm自产）、胶乳微球（150nm胶乳羧基微球，自产）和使用包被液包被到ELISA板（corning，货号：42592）上，分别进行化学发光、交联胶乳微球和ELISA检测。
（1）ELISA试剂盒方向
试剂盒成分：原料：抗体mAb135-HRP（筛选表达的鼠单抗标记HRP）、CRP-VHH；显色液A：TMB，显色液B：H2O2；封闭液：脱脂奶粉；洗涤液：1XPBST；终止液：2mol/L浓硫酸。
配对及抗体应用方法：包被液（50mM 碳酸盐缓冲液 pH9.6）稀释CRP-VHH抗体进行96孔板包被，每孔100µL， 4℃过夜；第二天洗涤液清洗3次，拍干；加入封闭液，每孔120µL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的CRP抗原，100µL/孔，37℃，1h，洗涤液清洗3次，拍干；加入标记mAb135-HRP，每孔100µL，37℃，1h洗涤液清洗3次，拍干；显色液A液和B液1:1混合后，每孔加入100µL，10min；加入终止液，50µL /孔；酶标仪上450nm处读OD值。
实验结果见表3、表4和图2。通过建立标准曲线检测，可以看出筛选到的CRP-VHH具有抗体效价，Seq33和Seq81的效价更高一些，可以应用于ELISA试剂盒方向。标准曲线由RD浓度作为纵坐标，OD值作为横坐标，建立标准曲线y=4.482x2+5.6224x，R2=0.9997，每一个CRP-VHH检测的OD值在0.8以上认为具有抗体效价。
Figure SMS_3
/>
Figure SMS_4
（2）化学发光试剂盒应用方向
试剂盒成分：
原料R1：抗体mAb135-HRP、实施例1得到的6种CRP-VHH分别偶联磁微球，CRP抗原标准品；显色液A，B；洗涤液：TBST。
化学发光法使用方法：取出已经包被CRP-VHH单抗的包被板，CRP抗原标准品使用梯度稀释，每孔加入20µL标准品，加入00µLmAb135-HRP，37℃，1h；洗涤液清洗5次，使用吸水纸拍干；每孔加入显色液A液和B液各50µL，室温避光孵育20min后使用化学发光仪检测结果。
检测结果见表5和图3。通过建立标准曲线检测，可以看出筛选到的CRP-VHH具有抗体效价，可以应用于化学发光试剂盒方向。
Figure SMS_5
（3）胶乳试剂盒应用方向
试剂盒成分反应液1：150nm胶乳羧基微球分别交联实施例1得到的6种CRP-VHH 抗体；反应液2：150nm胶乳羧基微球交联mAb135；CRP抗原标准品；缓冲液：10mM Tris缓冲液。
免疫比浊法的检测方法：反应中加入已经配置好的反应液1，240µL，标准品使用梯度稀释，每孔加入3ul，37℃，5min；加入240µL反应液2，混匀，5min后使用生化仪检测结果。
实验结果见表6和图4。
Figure SMS_6
临床结果对比：
使用公司筛选的正常CRP鼠单抗ELISA试剂盒和驼源CRP-VHH单抗（选择Seq2序列抗体）ELISA检测临床样本（使用检测的血清样本一共50例，判断标准为临床诊断正常血清和CRP检测异常样本），结果见表7，两组对照显示：筛选的CRP-VHH驼源单抗和正常CRP鼠单抗检测结果一样，并且检测结果与临床结果一致，准确性高。
Figure SMS_7
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Figure SMS_8
根据化学发光、乳胶比浊法和ELISA检测，可知筛选的6条驼源抗体均可以用于以上用途。由CRP-VHH和抗体FC段组成的完成抗体序列仍然具有上述用途（即CRP-VHH加上Fc端组成完整的抗体序列，完整的序列依然保持CRP-VHH的应用方向，并可以用于肿瘤药物开发方向）。
在不出现冲突的前提下，本领域技术人员可以将上述附加技术特征自由组合以及叠加使用。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，只要以基本相同手段实现本发明目的的技术方案都属于本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种CRP驼源单域抗体，其特征在于，包括框架区和可变区，所述可变区具有第一可变区、第二可变区以及第三可变区；所述第一可变区为氨基酸序列SEQ ID NO:6上的第28-34位氨基酸区域，第二可变区为氨基酸序列SEQ ID NO:6上的第52-58位氨基酸区域，第三可变区为氨基酸序列SEQ ID NO:6上的第97-106位氨基酸区域。
2.一种ELISA试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的CRP驼源单域抗体。
3.一种化学发光试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的CRP驼源单域抗体。
4.一种胶乳试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的CRP驼源单域抗体。
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