JPS6070361A - 抗イディオタイプのモノクローン抗体試薬を用いて、ジロフィラリア犬糸状虫感染の有無を決定するための免疫検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は競合的免疫検定法に関するものである。より
詳しく言えば、競合的免疫検定法におけるラベルされた
抗原の代替物としてのアンチイデオタイプモノクローン
抗体試薬（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ　ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅａｇｅｎｔｓ　）
の用法に関する発明である。そしてアンチイデオタイプ
モノクローン抗体試薬が抽出されるイデオタイプ七ツク
ローン抗体、及びそれらの試薬が適用される競合的免疫
検定に関する発明でもある。

競合的免疫検定によって抗原物質の検出や測定を敏感に
行うことができるが、それらの分析では、１つまたはそ
れ以上の抗原、抗体そして様々に配列された免疫化学的
なラベルを使用するのが普通である。典型的な競合的免
疫検定の場合、ラベルされた（ｑ着体又はラベルされた
巨大分子の抗原アあ６　、＜　／ｌｚされえ、ヵ２２８
、（Ａｇ＊）を使用する。分析においては、ラベルされ
たりガントば、サンプル中の対応するラベルされてない
抗原やアナライ）　（ＡＪ）　と限定された数の抗体結
合点をめて競争する。多くの著者によって書かれた免疫
分析の様々な点に関する論文は［酵素免疫分析Ｊ（Ｅ・
マジオ　ＥｄＣＲＣＰｒｅｓｓ　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ
　、　Ｆｌａ　（１９８０）　）がある。

競合的免疫分析 ＋ Ａ９　Ｌ；Ａｂ　−ｋｇ ラベルされたりガントを結合するのに利用できる抗体結
合点の集中度は、反対にラベルされていないリガンド（
アナライト）の濃度に関係する。そこで、抗体と結合し
たラベルされた成分又は代わシに結合していないラベル
された成分を測定することによって、使用者はラベルか
ら得られたシグナルと、意中のアナライトの濃度を関係
づけることができるのである。

競合的免疫分析には異質的と同質的の二種類がある。異
種免疫分析においては、フリーの（結合していない）ラ
ベルされた抗原を抗体と結合したラベルされた抗原から
物理的に分離することが必要である。ラベルされたフリ
ー及び結合した抗原を分離することによシ、競合的免疫
分析において、ラベルされた抗原の配置を測定すること
ができるのである。異種免疫分析で使用される典型的な
ラベルには、放１射能、酵素活動、螢光、ルミネッセン
ス（発光）などがあシ、米国特許第３．’７０９，８６
８号は放射線免疫分析の例である。異種分析における適
切な分離技術の多くの特徴は、酵素、螢光、ルミネッセ
ンス、そして放射能免疫検定に共通である。正確さと敏
感さを最大１恨にするには、比較的シンプルでかつきわ
めて簡単な操作でフリー及び結合反応物を完全に分離す
ることを確実にしなければならない。分離は、もしよけ
れば精巧で高価な機器なしで、すばやく行なわれなけれ
ばならない。

更に、埋懇的な手法はサンプルの構成物（血清、リンパ
漿、）］図を髄液、尿、唾液など）から影響されてはな
らないし、一般的に、様々な種類の’７ｆライトに応用
可能であシ、オートメーション用に改良することができ
なければならない。

酵素免疫検定に使用される最も一般的な方法には下記の
ものがある。

■　固相法 Ａ　マイクロ滴定板 Ｂ　コートチューブ法又はコートビーズ法Ｃザスベンダ
ブルマイクロビース法 ■　免疫沈澱法 八　二次抗体法 ザヌセンタブルマイクロビーズ法および二次抗体法は、
物理的分離の際に、遠心分離を必要とする。遠心分離は
、技術の自動化にとって大きな障害となる。一方で、マ
イクロ滴定板や、コートチューブ又はコートピースを使
用する物理的分離の場合には、遠心分離は必要とされな
い。遠心分離の手順を省くことができると、分析過程の
自動化はたいへん容易になる。というのは現存のそれら
の方法はピペット、ビューレットや洗浄などのシンプル
な液体を扱う操作であるからである。

同種免疫分析は、抗体の抗原への結合がラベルから出さ
れた信号を直接に調整するように観察される場合に使用
される。同種免疫分析は自由および抗体結合した、ラベ
ルされた構成物を分離することを必要としない。同種免
疫分析で使用される典型的なラベルには、放射性核種（
放射線免疫分析）、酵素（酵素免疫分析）そして発螢光
団（螢光免疫分析）があり、米国特許第３．８１　’？
’、８３７号はこの同種酵素免疫分析の例である。あま
シ一般的でないラベルとしては、化学発光性の分子、ラ
テックス粒子、安定なフリーラジカル、溶菌素生成のバ
クテリオファージ、褐色化した赤血球細胞、金のゾ／Ｌ
／懸濁液、セして補酵素又はインヒビターがある。米国
特許第４，２２０，４５０号は化学ルミネッセンス免疫
分析の例である。

これまでに述べた分析では、ポリクローン抗体と様々な
タイプの免疫分析の過程で使用される様々な信号を出す
ラベルを使用する。米国特許第４，３７６，１１０号（
デウ゛イド）はポリクローン抗体が上記の発明で使われ
るのと同じ様な方法でモノクローン抗体を使用する免疫
分析の一例である。デウ゛イド免疫分析は抗原をめて競
争する二つのイデオタイプ七ツクローン抗体を使用して
いるが、本発明ではイデオタイプ抗体の結合点をめて抗
原と争う一つのアンチイデオタイプモノクローン抗体を
使用する。免疫検定においてイデオタイプ抗体又は受容
器と共に、モノクローンーアンチイデオタイプ抗体を使
用することは、免疫分析の分野における全く新しい発展
である。

競合的免疫検定においてはラベルされた抗原は、試薬の
本質的な構成物となる、すなわち、ラベルされた抗原は
、サンプル中のラベルされていない抗原と、限定された
数の抗体結合点をめて競争するのである。多くの抗原は
安価で入手しやすいのだが、重要な抗原は、しばしば入
手困難で高価である。重要な肉体組織から抽出された人
間抗原（心臓、脳、筋肉、神経組織など）は入手困難で
あり、他の抗体は天然に多くは存在しなかったり性質上
不安定で変性するものであったり、化学的に不安定だっ
たシする。

例えば、神経毒又は殺虫剤として使われるあるエヌテラ
ーゼ抑制因子は水性媒体中に保管すると加水分解を起こ
してしまう。

本発明以前には競合的免疫分析技術は抗原を入手しにく
い分析法として嫌われていたのであるが、本発明により
、ラベルされた抗原の役目を、稀少で処置しにくい抗原
と構造的に同一なラベルされたアンチイデオタイプモノ
クローン抗体が果たすことができるということがわかっ
たのである。本発明によって競合的免疫検定は稀少で処
置しにくい抗原を検出する実用的な手段となったのであ
る。

本発明に特に関係のある重要な抗原のクラスは懐雑な巨
大分子とポリ巨大分子から成っている、すなわち顆粒体
、機能体、染色体などのザブセリューラー成分、ウィル
ス性キャブジッド、ウィルス性核酸又は核蛋白質俊合体
、無傷ウィルス、細胞膜、ホルモン受容体や他の組織な
ど、天然の生物組織に存在するか、顆粒体のように天然
の生物組織から人工的に得られるものかである。以前は
、このような物質の存在を分析するためのラベルされた
試薬を、再生産可能な方法で生産するのは困難であった
。というのは、１）このような物質の調製物が不安定、
２）これらの物質のような溶解性抽出物がコロイド的性
質を持つなど多くの問題があるからである。

本発明はこのような入手困難な、又は使用不可能な抗原
を、それらの抗原の１つまたはそれ以上のエピトウプと
構造的に似ているアンチイデオタイプ抗体に代えようと
いうものである。

すなわちアンチイデオタイプ抗体が溶解性で、容易に交
替物質を使用できるからである。このように煩雑な抗原
物質の分析に、アンチイデオタイプ抗体を使用すること
は、医療や分析化学に重要な一連の免疫検定を行う際に
以前は利用不可能だった手段を実現したのである。

免疫検定を開発する際には多くのことを考慮に入れなく
てはいけない。１つめは、アナライトの濃度の変化に対
するシグナルレスポンスであり、２つめは、分析を容易
にすすめられるような予定手順をつくることである。第
３番目には、サンプルからサンプルへの干渉の変化に気
を（ｑけなくてはならない。その他には準備が手軽なこ
と、試薬が純粋であること喝鴇が利用可能であること、
自動化が容易であること、リガンドの相互作用に気をつ
けることなどである。

遠心分画分析は許容される使用者の実験手順、すなわち
、感度、限定性、分析間、分析中の正確さや、結果を得
るスピードなどの分析実イ１上の特質を決定する。すべ
ての新しい免疫検定の方法論で実用的便利さを評価する
際には、分析で使用される遠心分離分析について調べる
ことが特に役立つのである。

他の方法がすぐには適用できない特殊なケースに使われ
るような、様々η種類のりガントに適用される、新しく
正確な技術への要求は依然として々くなっていない。本
発明は、アンチイデオタイプ七ツクローン抗体を、イデ
オタイプ抗体又は受容体と共に使用することによって免
疫検定の分野を進歩させたのである。

定　義 抗原−特別に抗体に結合するすべての物質。

抗体−たいへん多くの定義された、３次の又は４次の構
造を持つ特別に結合する蛋白質。

インクイグーバリエーション−いわゆる、抗体のコンス
タント期に見られる構造的なバリエーション。抗体は、
ｌｆｆ１１ｆＡ、　■ｙＭ、　■ｇＤ。

Ｉ９Ｅのクラスに分離する。

イデオタイプーバリエーション又はイデオクイプー抗体
構造の超変化部の所与の階級内で示される抗体の構造的
違い。このイデオタイプーバリエーション（イデオタイ
プとも呼ばれる）は、結合点の構造と形を決定し、こう
して、抗体の特殊性を決定する。

モノクローン抗体−同じイデオタイプおよびアイソタイ
プの構造を持つ抗体生産細胞の単一クローンから得られ
る抗体分子。

アンチイデオタイプ抗体−それ自身抗原であシかつ免疫
因子として作用する抗体。対象となる抗体（すなわちイ
デオタイプ部又は対照となる抗体の結合点）の超変化部
に結合する抗体はアンチイデオタイプ抗体と呼ばれる。

このように、対照となる抗体の結合点は、その補足的な
抗原かアンチイデオタイプ抗体のどちらかに結合するこ
とができるのである。言いかえれば、アンチイデオクイ
プ抗体の超変化部は、１つ又はそれ以上の抗原のエピト
ウプと構造が三次匹的にたいへんよく似ているというこ
とである。

ラベル−免疫化学的ラベルとは、抗原や抗体又は、抗原
や抗体の会合の度合を高感度に検出することを容易にす
るために、抗原又は抗体に付着させる物質。よく使用さ
れるラベルには、酵素、発螢光団、ラテックス分子、酵
ｌコア７ククー、化学発光性化合物、そして放射性核種
がある。ガンマ放射以外のすべてのラベルは、ステリッ
ク、アロステリック又はエネルギー転移に関して調整（
変調）可能であり、その結果免疫的反応において結合分
子と非結合分子を物理的に分離することなしに、抗原−
抗体結合のインディケータ−として通用することが証明
されている。

抗グロブリンー他の抗体のコンスタント部に結合する抗
体。

この発明にはお互いに深くつながった２つの部分がある
。すなわち、１）競合的免疫検定で使用されるアンチイ
デオタイプモノクローン抗Ｋｇｉ　２）　アンチイデオ
タイプ七ツクローン抗体を使用する競合的免疫検定であ
る。競合的免疫検定は、抗原やアナライトの存在や集合
を発見するのに使用される。アンチイデオタイプ七ツク
ローン抗体試薬に加えて、競合的免疫検定では、特別に
採用されたイデオタイプ抗体試薬やアンチグロブリン試
薬を使用することがある。

本競合的免疫検定は、ラベルされた参照抗原や１ｑ着物
を競合的反応の間必要とした以前の競合的免疫検定とい
くらか似ている。本競合的免疫検定は、ラベルされた参
照抗原を、１以上の抗原のエピトープと同じ構造を示す
アンチイデオタイプモノクローン抗体試薬と代えたもの
である。このアンチイデオタイプ七ツクローン抗体試薬
は、コスト高、不安定さ、抗原の入手困難さ、診断的試
薬の感染性抗原の使用が、製造者や使用者に潜在的な危
険を与えるなどの理由で従来不可能とされていた競合的
免疫検定を行うことを初めて可能にしたのである。

各アンチイデオタイプ七ツクローン抗体試薬は、特別の
競合的免疫検定のために特別に生産される。第一に、検
定される抗原は、その抗原に対するイデオタイプ七ツク
ローン抗体を生むようなハイプリツドーマを培養するた
めに使用される。ある量のイデオタイプ七ツクローン抗
体が、生産され精製される。第二に精製されたイデオタ
イプ七ツクローン抗体は、アンチイデオタイプモノクロ
ーン抗体を生む二次ハイブリッドーマを生み出すために
育てられる。精製されたイデオクイプ七ツクローン抗体
と結合してしまう二次ハイブリツドーマを抗体から妨げ
ると、抗原の少なくとも１つのエピトープと構造的に似
ているアンチイデオタイプ七ツクローン抗体が生まれる
。そして、アンチイデオタイプ七ツクローン抗体試薬は
、大量に生産され精製される。アンチイデオタイプモノ
クローン抗体は、その使用される免疫検定の性質に応じ
てラベルされる。

精製されたアンチイデオタイプ七ツクローン抗体は、酵
素免疫検定のために酵素で、放射能免疫検定のために放
射能で、螢光免疫検定のために螢光で・・・という風に
ラベルされる。

本発明の競合的免疫検定は、検定される抗原にまで培養
されたイデオタイプ抗体をも必要とする。多くの場合イ
デオタイプ抗体はアンチイデオタイプモノクローン抗体
のかわりにラベルさ扛る。他の場合には、イデオタイプ
抗体とアンチイデオタイプモノクローン抗体の両方がラ
ベルされなければならない。すべての場合に、イテ゛オ
タイプ抗体はモノクローンであることが望ましい。モノ
クローンのイデオタイプ抗体はそれぞれのりガントに対
し一律の結合親和力を持っている。しかし、ポリクロー
ンのイデオタイプ抗体もある免疫検定では使用できる。

例えば、例ｚ（下記）のようにコンテナーバウンド抗体
を使用する異種免疫検定である。イデオタイプボリクロ
ーン抗体が使用される時は、ラベルはアンチイデオタイ
プ七ツクローン抗体につけることが望ましい。

競合的免疫検定には二種類ある、すなわち、１）同種免
疫検定　２）異種免疫検定　であるが、アンチイデオタ
イプモノクローン抗体を使用すると両方とも簡易になる
。

同種免疫検定は抗体が変調可能なラベルでう／＜）ｖさ
れることを必要とする。アンチイデオタイプモノクロー
ン抗体試薬を使用した同種免疫検定の場合、変調可能な
ラベルとは、抗体につけられた時、抗体のりガントとの
結合の状態に従って、はっきりと違うシグナ）Ｖを出す
ものである。例えば、ラベルがアンチイデオタイプモノ
クローン抗体につけられたとき、アンチイデオタイプと
イデオタイプの抗体の組にさらされた場合と結合してな
い抗体にさらされた場合でシグナルかはつきシと変われ
ば、そのラベルは変調可能だといえよう。その一方で、
ラベルがイデオタイプ七ツクローン抗体につけられたと
き、アンチイデオタイプとイデオタイプの抗体の組にさ
らされた場合と、抗原抗体の組にさらされた場合とで、
シグナルが変われば、そのラベルは、変調可能と言える
。螢光免疫検定の場合には、イデオタイプとアンチイデ
オタイプ両方のモノクローン抗体が発螢光団でラベルさ
れていれは６最高である。抗原−イデオタイプ対の場合
でなく、アンチイデオタイプーイデオタイプ対の時に明
滅（消光）するような発螢光団が選ばれることが望まし
い。

アンチイデオタイプモノクローン抗体試薬を使用した異
種競合免疫検定の場合には、アンチイデオタイプとイデ
オタイプの対は、抗原−イデオタイプの対と結合してな
いアンチイデオタイブの片方か両方から物理的に分離で
きることが必要である。物理的分離の望捷しい方法は、
先に述べたように同相法および、免疫滴定法である。同
相法では、抗体が固相キャリアーに付着させられるか、
ラベルにリンクされるかであるが、望ましい方法の１つ
としては、ラベルさノ れ、同相キャリアーに何着させられたアンチイデオタイ
ブ七ツクローン抗体を使用する方法である。この方法を
使えば、モノクローン又はポリクローンのどちらのイデ
オタイプ抗体でも競合反応に使用できる。しかし、イデ
オタイプ七ツクローン抗体の方が、いくらか望ましい。

競合的免疫検定自身には３つの本質的な段階がある。す
なわち、１）抗原イデオタイプ抗体試薬、アンチイデオ
タイプ七ツクローン抗体試薬の間の競合的結合反応　２
）イデオタイブーアンチイデオタイプの抗体の組につけ
られたラベ）ｖｆ測測定ることによる反応生成物の検出
３）抗体対のラベルの検出を、標準抗原から得られたデ
ータと照らしあわせてサンプル中の抗原の存在または濃
度を決定する。

分析混合物中で反応物質を化合させる際に望ましい手順
は、最初に抗原とイデオタイプ抗体を化合させ、その後
に、アンチイデオタイプモノクローン抗体をつけ加える
や９方である。この手順は、検出段階が、分析混合物の
平衡状態を優先させる場合に好まれる。平衡は、抗原と
抗体の強い結合親和力のせいか、又は不可逆的プロセス
の発生によって遅くなるかも知れない、非平衡状態の検
査混合物を調べることによって感度を高められるかもし
れないが、よシ広くちらばってしまうという付随的な危
険が伴う。検査混合物の中で反応物質を結合させる第二
の手順は、まず最初に、抗原とアンチイデオタイプモノ
クローン抗体試薬を結合させ、それからイデオタイプ試
薬を加える方法である。この手順は、時折−特に最終の
検査混合物が平衡でない時−第一の手順よシ感度が落ち
る。二つの抗体が最初に組み合わされ、その後に抗原を
加えるような手順は、最終的な検査混合物が平衡に達す
ることがわかっている場合のみ、使用されるべきである
。

分析混合物の中の抗体ベア中につけられたラベルを検出
する工程手順は、ラベルのタイプによって異なる。免疫
分析の抗体試薬は新しいが、ラベルは以前のものと同一
である。ラベ）Ｖを検出する工程手順はそれらを見れば
明らかである。

抗体対につけられたラベ／Ｖを検出することからサンプ
ル中の抗原の存在又は濃度を決定するためには、検出は
標準抗原から得られたデータと照らしあわされなければ
ならない。標準抗原は既知の濃度を持ち、液体サンプル
の分析と全く同じ手順で進められる。標準抗原の検定混
合物を生成し、抗体ベアにつけられたラベルの存在や濃
度は検出する。ラベルの濃度は、標準抗原の既知の濃度
と互いに関係があるから、未知の抗原サンプルの検定物
混合物の抗体対の中のラベルの検出の程度は、サンプル
中の抗原の濃度又は存在分示唆する標準抗原と互いに関
係があるといえる。

アンチイデオタイプモノクローン抗体試薬はイデオタイ
プの抗体の分析にも利用できる。アンチイデオタイプモ
ノクローン抗体はイデオタイプ抗体に向けて育てられ、
大量に作られ、精製され、固相キャリアーに付着させる
・イデオタイプ抗体を分析するために、抗体と付着され
た固相キャリアーに、サンプルを混ぜあわせる。

イデオタイプ抗体はアンチイデオタイプモノクローン抗
体を経て固相キャリアーに結合する。

そして、固相キャリアーは、溶質から物理的に分離され
、イデオタイプ抗体に対してラベルされたアンチグロブ
リンが、アンチイデオタイプモノクローン抗体を経て固
相キャリアーに結合しているイデオタイプ抗体と結合す
るように同相部分と結合する。その後、ラベルの検出は
、イデオタイプ抗体の存在を決定するだめの標準と関連
づけられる。

この発明の目的は、競合的免疫検定におけるリファレン
ス抗原に対する代替試薬−アンチイデオタイプモノクロ
ーン抗体試薬−を提供することである。

この発明の目的は、参照抗原に対する代替物としての抗
イデオタイプ七ツクローン抗体試薬を使用する競合的免
疫検定の作業手順を提供することである。

この発明の目的は参照抗原に対する代替物としてのアン
チイデオタイプモノクローン抗体試薬を使用する、同質
又は異種の競合的免疫検定の作業手順を提供することで
ある。

この発明の目的は、イデオタイプ抗体の免疫検定におけ
る抗原の代替物としての試薬、すなワチアンチイデオタ
イプモノクローン抗体試薬を提供することである。

この発明の目的は、抗原の代わりにアンチイーｒ’ｙｈ
−ｐイフモノクローン抗体試薬を使用するイデオタイプ
抗体の免疫検定の作業手順を提供することである。

実　施　例 例１　アンチイデオタイプモノクローン抗体試薬は、ア
ンチイデオタイプモノクローン抗体（抗−Ｉｄ　）から
得られる。その抗体は、パラサイト赤痢アメーバをもつ
ねずみのイデオタイプ七ツクローン抗体（Ｉｄ）に対し
て提供される。

アンチイデオタイプ七ツクローン抗体試薬は下記のよう
にして得られる。

Ａ　イデオタイプ七ツクローン抗体の生産：赤痢アメ−
ｚ＜Ｉ−ＩＫ　−９系統に対するモノクローン抗（ｔ４
−分泌するネズミのハイグリコドーマ・セルラインから
の細胞は１０％の牛の胎児の血清を含んだＤ　Ｍ　Ｅ　
Ｍ媒地の組織培養で、１０％の部分的な炭酸ガスの圧力
の下、３７°Ｃで培養する。細胞は集められ、血清のな
い媒地で洗われ、もう一度血清のない媒地か燐酸緩衝溶
液の中につるされて、６−１０ＸＩＯ（６）細胞／　７
ｎＬ　の細胞濃度になる。Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃネズ
ミハ、前もって０，５η２Ｌ　のプリメタン（２，６゜
１０．１４−テトラメチルペンタデカン）ヲ腹膜内注射
される。およそ０．５　ｍＬ　中に３−５×１０（６）
の細胞が各ネズミに注射される。７〜１０日後、ネズミ
の腹腔内にたまった腹水液は１８〜２０ゲージの１７２
インチ針で集められる。２８０Ｃ１の遠心分離を４５分
かけたあとで、腹水液は０．４５マイクロメーターのフ
ィルターを通される。免疫グロブリンの留分け、５０％
の硫酸アンモニウムで滴定され、イデオタイプ七ツクロ
ーン抗体を生むために、ＰＢＳに対して徹底的に透析さ
れる。

Ｂ。アンチイデオクイプ七ツクローン抗体を分泌するハ
イグリコトーマの生産： １ｄは完全なフロイント補助液で乳化し、この乳化液２
００マイクロリツトル中に含まれる５０マイクロクラム
のＩｄ　をネズミに注射する。

同様な成分を１週間後と３週間後に増強のために注射す
ると、ネズミは死ぬので、その牌臓を取り出して、４７
ノ出の血清の々い媒地を含んだ６０１１１ｊ１１のペト
リ皿に置く。鉗子で牌、臓をつつくと、牌細胞の単一サ
スペンションが得うれる。

牌細胞は５０　ｍＬ　の遠心分離チューブに移され、ト
ータルで４０−４５　ｍＬ　の細胞を生むために十分な
媒地が与えられる。婢細胞は８００ｇで１０〜１５分間
、遠心分離され、ベレットは再懸濁と遠心分離によって
洗われ、１０ｍＬの媒地で培養する。ネズミの骨髄腫細
胞（セルラインＰ　３　Ｘ　６３．ＡＪ’８．６５３　
＞は牌細胞に対して１：６の割合で加えられる。ポリエ
チレングリコ−１ｖ　（Ｐ　Ｅ　Ｇ　）は水浴中、５６
°Ｃで溶融し、３７℃で０．６５ｍ１の媒地に対して０
，３５　ｍＬ　が加えられる。ＰＥＧ溶液は混合され、
細胞の混合を早めるためドロツプワイス法で、細胞混合
物に加えられる。そして、９ｎｔＬ　のＤＭＥＭ、１０
％のＦＢＳが加えられ遠心分離によって細胞混合物は洗
われた。洗った細胞は、２Ｘ１０（６）ティ七すイト／
ｙｔｒＬｆ含む、２００　ｍＬ　のＨＡ　Ｔ媒地に置か
れる。その後、セルサヌペンションは８つの９６ウエル
板（２５ｍＬ／板）に分西己される。１０日目と１８日
目に各９６ウエル板から取られた媒地は除去され、新鮮
な媒地に代えられる。ハイブリドーマヲ含むウェルは、
上澄中のアンチイデオタイプモノクローン抗体（抗Ｉｄ
）を酵素免疫検定法（下記）で分析し、検出する。役に
立つ抗１ｄを分泌することが見つけられたハイブリッド
ーマ細胞は、組織培養で増殖さす。組織の一部分は、保
存用に液体窒素中で冷凍する。組織の一部は腹水液と抗
体を生産するためにマウスに法則される。モノクローン
抗１ｄ　は、上記でＩ−ｄのために述べられた手順に従
って融離される。

Ｃ。アンチイデオタイプモノクローン抗体試薬（抗Ｊ、
ｄｌｌゾチーム配合体）の生産：ハイブリツドーマから
作られた抗Ｉｄは、５０％の飽和硫酸アンモニウム滴定
によって、マウスの腹膜から精製される。そして、燐酸
緩衝塩（ＰＢＳ　）に対して徹底的に透析する。

リゾチーム（卵白から）は、抗Ｉｄ　に配合するため以
下のように調製する。

リゾチームはＳ−アセチルメルカプ１゛琥珀酸無水物を
使ってクロツツおよびハイニー法（ハビーフ゛、　Ｉ−
］、Ｆ、Ｓ、Ａ−，（１９７２）　ｍｅ日ｔｏｄｓｉｎ
Ｅ−ｎｇｙｍｏｌｏｇｙ　（Ｈｉｒｓ、　Ｃ，Ｉ−Ｉ、
Ｗ、、　ａｎｄ　Ｔｉｍａｓｈｏｆｆ。

Ｓ、Ｎ、　ｅｄｓ、　）　Ｖｏｌ　ＸＸＶ、　Ｐ　４５
７　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
　）の方法によりス／ｌ’７ヒトリル基でラベルされる
。ラベ）Ｖをする前に、Ｓ−アセチルメルカプト琥珀酸
無水物は、等量の氷酢酸を加え、その後に５′Ａ１のベ
ンジン・ヘキサン混合液から晶出させられ、精製される
。酵素上のスリフヒドリル基は、上記のクロ゛ン゛ノお
よびハイニー法に従って、ＤＴＮＪ３　（５、５’−ジ
チオビス（２−ニトロベンゼン酸））によって滴定され
る。カップリングに先だって、千メーール基は、［）Ｈ
７゜５．５０ｍＭの燐酸カリ緩衝液中で２０分間４°Ｃ
で０．ＬＭのヒドロキシアミンとの反応によりデブロッ
クされる。デフ゛口・ツクされ、チオール化された酵素
は、Ｏ０９Ｘ　２８，５ｏｎのセファデックスＧ−２５
力ラム全通される。

そのカラムは窒素で飽和した５　０　ｙｎＭのＫ　２　
ＨＰ　０４　／　Ｋ　ｌ−１２Ｐ　Ｏ４，２０ｍＭのｐ
Ｈ５のＥＤＴＡで平衡にされている。蛋白質のピークは
窒素で洗われ、４°Ｃで封印され保存された３、０？？
出　ポルメトリックに集められる。集められたピークは
、後述の抗Ｉｄ　のマレイミド′誘導体とのカップリン
グ反応のために２時間以内に使用される。全体のラベル
反応とデブロック反応の化学的生成量は典型的にはＤＴ
ＮＢを使ったスリフヒドリル基の滴定によって決定され
た場合におよそ６０％である。

精製された抗Ｉｄ　は、リゾザチムとのカップリングの
ために、以下のように調製される。

精製された抗Ｉｄはマレイン酸のＮ−ヒドロキシザクン
ニイミドエヌテ）ｖ　（Ｎ　ＨＳマレイミド）によって
ラベルされる。その方法は、ケラーオヨヒ）Ｊ　ティ：
／　カー法（Ｋｅｌｌｅｒ、　Ｏ，ａｎｄ　Ｒ−ｕｄｉ
ｎｇｅｒ、　Ｊ、　Ｈｅ１ｖ、　ＣｈｉｍｉｃａＡＣｌ
ａ　５８　、５３１（１９’７５））である。４．０１
η／　ｙｎＬ　の抗Ｉｄ溶液は、１規定の水酸化ナトリ
ウＪ・で調整したリン酸カリ緩衝液中に用意される。ド
ライジメチルホルムアミド１７７１Ｌ　中Ｋ　Ｎ　Ｉ−
Ｉ　Ｓマレイミ１ζｆ２．１’ＨＥ／含む溶液のアリコ
ート（２００マイクロリツト／Ｉ／）が、４°Ｃの抗１
ｄ　に加えられ、強くかきまぜられる。３０分後に溶液
のｐｉ（値は６゜５に下げられる。この混合物は、その
後、００９Ｘ　２　ｅ、５　ａｎのセファデック７Ｇ−
２５（ミテ゛イアム）カラムを通される。なお、そのカ
ラムは０．０５　ＭのｖＤＴＡによシ平衡にされ、窒素
により飽和されている。カラムから蛋白質ピークが溶出
し始めるとすぐにそれを集めて、窒素下でシールされた
フラスコに保存される。マレイミド基は、過剰のベーク
メルカプトエタノールとの反応およびジチオジニトロベ
ンゼン酸（ＤＴＮＢ）で過剰のチオールの滴定によって
決定される。典型的には、４−１２のマレイミド基が、
抗Ｉｄ　に付着する。

マレイミドでラベルされだ抗■ｄ　はチオール化された
酵素にコンジュゲートされ、その配合体は下記のように
分離される。

二つの蛋白質は、スリフヒドリル基の酸化を紡ぐために
、窒素下でカップリングされる。チオール化され酵素（
２，ＯｙｎＬ　）　は、各マレイミＦに対してヌリフヒ
ドリル基１：８の比率で非常にゆつくシとマレイン酸に
ラベルされたアンチＩｄ　Ｋ攪拌しながら加える。ｐＨ
値は６．７に上がり、反応混合物は、１時間室温で、そ
の後７２時間４°Ｃでかき“まぜられる。その後ｏ、ｚ
ｍＬの１０（−２）Ｍベータメルカプトエタノールが、
未反応のマレイミドを明滅させるため及び、アミンとマ
レイミド基の反応による蛋白質のクロス結合を妨ぐため
に加えられる。溶液は室温で３０分かき捷ぜられ、この
配合体は０゜１Ｍ、１）Ｈ７゜４　のトリス塩酸で平衡
にされた０、９Ｘ５８酵素から完全に分層される。抗１
ｄ　と酵素の配ｍｌの分析の希釈液中の０，２５　ｎｌ
Ｌのアリコートは、最終的にはＩＸＩＯ（−８）Ｍの配
合体を分析中に生成する。

例２　赤痢アメーバの抗原を検出するだめのアンチイデ
オタイプ抗原試薬（抗Ｉｄ　酵素配合体）を使用する同
種競合免疫検定法は下記のとうりである。

ステップ１．２５マイクロＬのＩｄト緩衝液（トリス／
マレイン酸、ｐＨ６゜０）が合わされる。

ステップ２゜　２５マイクロＬのサンフ諏し又は測定液
が２５０マイクロＬの検定混合物に加えられる。

ステップ３．２５マイクロＬの抗Ｉｄと酵素配合体溶液
が、２５０マイクロＬの検定混合液に加えられる。

ステップ４．２５マイクロＬの基質（緩衝液中に懸濁さ
れたマイクロコヵスリゾダイクテイカヌ細胞）が２５０
マイクロＬの検定混合液に加えられる。

ステップ５゜　検定混合液は、かきまぜられ、−ｊ＜”
［，３０°Ｃで定温化されたフローセルラ’ｃなえた分
光測定Ｒｇ　（例えばギルフォード３０ＯＮ分光測定器
）にアスピレートされる。３０秒程して分析結果が関数
で表されるようになったら、４５０ｎｍ　での光学密度
（濁９度）の減少の比率は１２０秒間モニターされる。

Ｉｄ　の配合体への結合に加えて、配合体の酵素活性も
２０〜９８％の範囲で大きく減少する。

抗原（赤痢アメーバ抽出物、又は組織培養の上澄）の添
加で、阻害の程度は、抗Ｉｄ　／　Ｉｄ結合にとって代
わるような加えた抗原の量に比例して減少する。このよ
うにして、赤痢アメーバ抗原の同種免疫検定のための標
準曲線は得られるのである。

抗１ｄ　とＪ、ｄ　は両方とも免疫クロプリンなので、
それらはほぼ溝造的に類似している（インタイブの類似
）。さらに、抗Ｉｄ　と１．ｄは、リガンド−リガンド
ペアの同定化学量で結合できるのであり、ポリクローン
抗体−抗原量反応でしばしば起こる多数の結合と似てい
ないので、抗ｉｄ　又はＩｄ　のどちらでも、結合的又
は受容的リガンドとして同値とみなすことができる。

このために、本発明では、抗Ｌｄ　とＩｄ　のどちらで
も、一般的に有用な検定で交換可能に酵素でラベルでき
るのである。

例３　アンチイデオタイプ抗体を使用した異種免疫検定
： ジオフラリア犬糸状虫から精製された溶解性の蛋白質と
認められているマウスのモノクローン抗体を例１に述べ
られたのと同じ方法で調製する。ジオフラリア犬糸状虫
抗原は下記のように用意される。雌雄の混ざったジオフ
ラリア犬糸状虫（０，４２９）は、２５ｎｔＬのＰＢＳ
で２分間１５°Ｃで均質化され、４°Ｃで一装置かれる
。

遠心分離の後、１５°Ｃで上澄に、１０％のトリクロロ
酢酸（ＴＣＡ　）を加えてｌ）Ｈ３゜５に酸性化する。

ある場合には、ＴＣＡの超過分を１規定の水酸化ナトリ
ウムを加えて、ｐＨ３，５に戻すことが必要と々ること
もある。遠心分離の後で、上澄中の水溶性蛋白質は、遠
心分離され、４°Ｃで緩衝液に対して徹底的に透析され
る。このように生まれたジオフイラリア犬糸状虫を認識
するモノクローンイデオタイプ抗体は、例１で述べられ
た硫酸アンモニウム滴定によってマウスの腹水から分離
された。精製された抗体はＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスに
免疫をつけるために使用され、アンチイデオタイプ抗体
（抗Ｉｃ＋’）は、例１に述べられた手順に従って生成
させる。

異種免疫検定は、以下のように行われる。９６ウエルの
マイクロ滴定板（ディナテック）！／′１−）−）リウ
ム硼酸塩緩衝液（５０マイクロＬ／ウニ／１／）中で抗
Ｉｄ又はＩｄ（１００−２００ｎ９／ウニ／Ｉ／）によ
ってコートされる。そしてアンチＩｄ又はＩｄ　は、各
ウェルに３７℃で４時間置かれ、その後、４°Ｃでおよ
そ１４時間置かれる。その後、傾けることにより、抗Ｉ
ｄ　又はＩｄは除去される。ウニ／Ｖは０００２５％の
トゥイーンを含む、燐酸緩衝塩で３序次われる。その後
プレートは乾かしてよい。ナカネの方法（Ｎａ　−ｋａ
ｎｃ、　Ｐ、に、、　ａｎｄ　Ｋａｗａｉｏ　、　Ａ、
Ｔｌｌ、ヒｙ、トケマとザイトケミ、２２．１０８４（
１９７４））に従って、抗１ｄ　又はＩｄ　はホークラ
ディシュペルオキシダーゼ（）−Ｉ　ＲＰ　）にカップ
ルされる。

抗１ｄ　でコートされたプレートは１ｄ−ＨＲＰ配合体
を結合し、Ｉｄ　でコートされたプレートは抗１（」−
ト■ＲＰ配合体を結合する。Ｉｄ−ＨＲＰかアンチＩｄ
−ＨＲＰ　の結合かは、下記の分析法を使用して、プレ
ートに結合するＨＲＰ活性の測定が決定する。

各ウェルには、［）Ｈ７−４のＰＢＳ中の酵素配合体を
１５０マイクロＬ加える。もし抗原を追加するのなら、
配合体を加える前か同時にやらなければならない。プレ
ートは３０分間保温され、傾けることによってＰＢＳで
二序次われる。２９７ＢＯｍＬ水のＡＢＴＳ（２，２−
アシノジ（３エチｔｖヘンｘｑ−アゾリン）スルフオニ
ツク酸）を用意し、４°Ｃで保存する。水で３０％の過
酸化水素を希釈して、０゜０１％の過酸化水素水を用意
する。ＨＲＰの測定を始めるために、５０マイクロ１ノ
のＡＢＴＳと、過酸化水素水をウェルに加える。色の変
化は酵素の濃度によるが、典型的には５〜３０分で観察
できる。

両方の場合に、っまシ、抗Ｉｄが又はＩｄ　でコートさ
れたプレートが、その補足的な配合体とともに使用され
る場合に、追加された抗原（ジオフィラリア犬糸状虫溶
解性蛋白質）は、配合体と競合するのが見られる。抗原
の量が増えれば、プレートに結合した配合体が減ること
になるので、抗原の濃度に対する酵素−ＨＲＰ活性を観
察して、プロットすることによって標準曲線を得ること
ができる。

ジオフイラリア犬糸状虫で免疫化された動物の血清から
得たポリクローンＪｄ　を使用しても同じような結果が
得られる。

例４　抗イデオタイプモノクローン抗体を使用した抗体
の検出： 例３に述べた抗１ｄ　でコートされたプレートを使用し
て、ジオフィラリア犬糸伏虫抗原によシ免疫化された山
羊から採取した血清中の抗体を検出できる。例えば、免
疫化された山羊から採取した、山羊血清を連続して燐酸
緩衝塩で希釈して、抗Ｉｄ　でコートされたマイクロ滴
定板のウェルに加える。山羊抗体の結合は、例３で使わ
れた方法と、例３で述べられたＨ　ＲＰへの標準ＡＢＴ
Ｓ分析を使用して、ＨＲＰに配合されたウサギの抗−山
羊Ｉ　ｇＧＫよって検出される。

山羊抗体をもつと希釈すれば（濃度を低めれば）プレー
トに結合するＨＲＰ酵素活性は低くなる。

例５　アンチイデオタイプモノクローン抗体を使用した
螢光エネルギー転移免疫検定法二側１で述べた赤痢アメ
ーバに対するイデオタイプ抗体（Ｉｃｌ）と対応する７
ンチイデオタイプ抗体は、螢光インチオシアン酸塩（Ｆ
　Ｉ　Ｔ　Ｃ）又はローダミンイソチオンアネー）（Ｒ
ＩＴＣ）でラベルされる。その手順は下記の通りである
。１０ｆｆｐのＩｄ　又は抗Ｉｄが、１　ｎｔＬ　のｐ
Ｈ９゜Ｏの燐酸緩衝塩、０゜ＬＭｌそして０゜■ηｒＬ
　の１　ｐｒｙ　／　ｍＬ　のＦＩＴＣ又はＦＩＴＣへ
室温で′攪拌しながら加えられる。ｐＨ値は○。ＩＭＯ
三塩基性ソデイウムフオヌフエイトでｐＨ９，５に調整
する。フリーのＦｊＴＣ又はＲＩＴＣは、ｐＨ７，５の
ＰＢＳで溶出する０゜８×８αのＧ−２５セフアデツク
ヌのクロマトクラフィーによす蛋白質（Ｉｄ又は抗Ｉｄ
）から除去される。

エネルギー転移免疫検定（例えば米国特許第３．９９６
，３４５号）は、螢光染料の螢光の消滅にたよっている
。その螢光染料が、螢光の放出極大と少なくとも部分的
にオーバーラツプするような吸収極大を有する他の染料
のたいへん近く（たとえば、５０オングストロ一ム以内
）にもってこられると消滅するのである。本発明では、
これは、ＲＩＴＣでラベルされたＩｄ（ＲＩＴｃ−Ｉｃ
ｌ）が、ＦＩＴＣでラベルされた抗Ｉｄ（ＦＩＴＣ−抗
Ｉｄ　）に結合したときに起こる。赤痢アメーバ抗原を
加えると、ラベルされたＩｄ　のラベルされたアンチＩ
ｄへの結合を妨げ、そうして、螢光の消滅を妨げること
ができる。

螢光検出（例エバーグリーン）に適するＩＣ＃＋の露出
した四角な一連のキュベツトに、１？ｚ＋Ｌ。

０．０５Ｍ（１り燐酸緩衝液ｐＨ８，２、で０．５　ｎ
１ｇ／　７ｎＬのＢ５Ａ１含むものを加える。１００マ
イクロＬのＦＩＴＣ−抗Ｌｃ＋　（０，０５＋ｖ、／ｍ
Ｌ　）が各キュベツトに加えられる。ＲＩＴＣＩｃ＋ｆ
：どんどん加えて、４８Ｑ７１１Ｊ励起、５２０社放出
で螢光を測定する。使用される機器はスペクトル螢光分
析器であシ、その例は、アミンコモデルＳへ８９６０Ａ
スペクトル螢光分析器である。螢光の消滅は、３０％の
過多における減少で有効である。有効な消滅は、１５０
マイクロＬＲＩ　Ｔ　Ｃ−Ｉｄ、０，０５１Ｖ／　ｍＬ
　で観察される。

第二のキュベツトのセットを用意する。１００マイクロ
ＬＦＩＴＣ−抗Ｉｄ　ｉ含む１．０＊ＩＬｐＨｓの燐酸
緩衝液に赤痢アメーバ抗原を句加的にどんどん増やしな
がら加え、１５０マイクロＬのＲＩＴＣ−Ｉｄを加える
。上述の方法で螢光を測定する。赤痢アメーバを増やす
につれて消滅が少なくなれば、分析は成功である。

特許出願人　シンビオティックス　コーポレイション代
　理　人　新　実　健　部 （外ユ名） 手続補正円 昭和５９年１０月１１　日 １、事（′１の表示　昭和、５９年特許願第　１７７３
５９　号事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　シンビオティックス　コーポレイション
４、代　理　人 ９、添イτｊ書類の目１夛 （１）　’？ｉｌｒ正明細書　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ｊ（ａ）　抗原に対するイデオタイプ抗体およびイデ
   オタイプ抗体に対するアンチイデオタイプ七ツクローン
   抗体をサンプル溶液の一部と結合する工程、これら二種
   の抗体のうち少なくとも一種はラベルされておシ、アン
   チイデオタイプモノクローン抗体は、抗原の少くとも一
   つのエピトープと構造的によく似ているものであって、 上記の結合は、その中で抗原とアンチイデオタイグモノ
   クローン抗体が、イデオタイプ抗体との結合をめて競合
   する検定混合物を形成するものであり、 それによって、上記検定混合物中で、アンチイデオタイ
   プーイデオタイプ抗体対が、抗原−イデオタイプ抗体対
   形成と競合して生成しうる、 （ｂ）　上記検定混合物の結果として生成された、アン
   チイデオタイプーイデオタイプ抗体対の中にある、結合
   しラベルされた抗体の程度を検出する工程、および （Ｃ）　（＋１）工程で検出された、結合しラベルされ
   た抗体を、（ａ）および（ｂ）と同じ手順でかつザンプ
   ／Ｖ液の代わシに標準抗原を使って扱われた一連の標準
   抗原から得られた比較標準と比較してザンプ／Ｉ／液中
   の抗原の存在を決定する工程を含有することを特徴とす
   るサンプ）Ｖ液中の抗原の存在を決定するための競合的
   免疫検定法・ （２）　アンチイデオタイプーイデオタイプ抗原対の中
   の結合しラベルされた抗体の程度を検出し、その後アン
   チイデオタイプーイデオタイプ抗体を、結合していない
   抗体から物理的に分離することを特徴とする特許請求の
   範囲第（１）項記載の競合的免疫検定法。 （３）　ラベルが変調可能な信“号を持ち、アンチイデ
   オタイプーイデオタイプ抗体対の中の結合しラベルされ
   た抗体の程度の検出が、ラベルの信号の同種変調による
   ものであることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項
   記載の競合的免疫検定法。 （４）　ラベルが酵素であることを特徴とする特許請求
   の範囲第（１）項記載の競合的免疫検定法。 ＋５１　ラベルが、発螢光団、放射性核種、化学発光性
   り〆ｚが〆化合物、ラテックス粒子、酵素コファクター
   、酵素インヒビターなどの一般的に使用されるラベルの
   クループから選ばれることを特徴とする特許請求の範囲
   第（１）項記載の競合的免疫検定法。 （６）　サンプルの一部と、イデオタイプ抗体およびア
   ンチイデオタイプ七ツクローン抗体との結合が同時的に
   なされることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記
   載の競合的免疫検定法。 （７）　サンプルの一部と、イデオタイプ抗体およびア
   ンチイデオタイプモノクローン抗体との結合が、最初に
   、イデオタイプ抗体と結合し、次にアンチイデオタイプ
   モノクローン抗体と結合する連続法でなされることを特
   徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の競合的免疫検
   定法。 （８）（ａ）　抗原に対するイデオタイプ抗体およびイ
   デオタイプ抗体に対するアンチイデオタイプ七ツクロー
   ン抗体を、サンプル液の一部と結合する工程、この二種
   の抗体のうち一種はラベルされておシ、ラベルされてな
   い抗体は、固相のキャリアーに付着させられ、アンチイ
   デオタイプ七ツクローン抗体は、抗原の少なくとも１つ
   のエピトープと構造的に似ていて、かつ上記結合は、液
   相および同相を有する、その中では抗原をアンチイデオ
   タイプモノクローン抗体がイデオタイプ抗体との結合を
   めて競合するような検定混合物を形成し、それによって
   、アンチイデオタイプーイデオタイプ抗体対が、上記検
   定混合物中で抗原−イテ′オタイプ抗体対の形成と競合
   して、生成することが可能である、 （ｂ）　次いで、固相のキャリアーを、検定混合物の液
   相から分離する工程、固相のキャリアーは（ｄ着した抗
   体と抗原及びステップ（ａ）の間にイヌ１着した抗体に
   結合した抗体を担持している、（Ｃ）　その後の、固相
   キャリアーに付着し、結合し、検定混合物から分離され
   たアンチイデオタイプーイデオタイプ抗体対の中の結合
   しラベルされた抗体の程度を検出する工程、および （ｄ）　サンプル液中の抗原の存在を、工程（Ｃ）で検
   出された結合しラベルされた抗体の程度と、ザンプ／Ｉ
   ／液の代わりに標準抗原を使う以外は工程（ａＬ　（＋
   ））、および（ｃ）と同様に扱われた一連の標準抗原か
   ら得られた比較標ＷＱと比較することにより、決定する
   工程を有することを特徴とするサンプル液中の抗原の存
   在を決定するだめの、異種競合的免疫検定法。 （９）固相のキャリアーに付着し結合して、検定混合物
   から分離されたアンチイデオタイプーイテ゛オタイブ抗
   体対の中の結合しラベルされた抗体の検出が、分離され
   た固相のキャリアーに結合したラベルを測定することに
   よって達成されることを特徴とする特許請求の範囲第（
   ８）項記載の異種競合的免疫検定法。 （１０）固相のキャリアーに付着し結合して、検定混合
   物から分離されたアンチイデオタイプーイデオタイプ抗
   体対の中の結合しラベルされた抗体の検出が、分離され
   た液相中に残存しているラベルを測定することによって
   達成されることを特徴とする特許請求の範囲第（８）項
   記載の異種競合的免疫検定法。 （Ｉυ　ザンプル液の一部とイデオタイプ抗体およびア
   ンチイデオタイブモノクローン抗体との結合が同時的に
   行われることを特徴とする特許請求の範囲第（８）項記
   載の異種競合的免疫検定法。 ｕり　サンプル液の一部とイデオタイプ抗体およびアン
   チイデオタイプモノクローン抗体との結合が、最初にイ
   デオタイプ抗体と結合し、次いでアンチイデオタイプモ
   ノクローン抗体と結合する連続法で行われることを特徴
   とする特許請求の範囲第（８）項記載の異種競合的免疫
   検定法。 ３）　ラベルは酵素、発螢光団、化学発光性化合物、ラ
   テックス粒子、放射能性核種、酵素コファクター、酵素
   インヒビターなどの普通に使用されているものから選択
   されることを特徴とする特許請求の範囲第（８）項記載
   の異種競合的免疫検定法。 １４１　（ａ）　抗原に対するイデオタイプ抗体及びイ
   デメータイプ抗体に対するアンチイデオタイプモノクロ
   ーン抗体を、サンプ／Ｉ／液の一部と結合す・る工程容
   ネ種の抗体のうち少なくとも１種は変調可能なラベルに
   共有的に配合され、アンチイデオタイプモノクローン抗
   体は、抗原の少くとも１つのエピトープと構造的に類似
   しており、 上記の結合は、その中で抗原とアンチイブオフイブ七ツ
   クローン抗体がイデオタイプ抗体との結合を競合する検
   定混合物を形成するだめのものであり、 それによって、上記検定混合物中で、アンチイデオタイ
   プーイデオタイプ抗体対が、抗原−イデオタイプの対と
   競合して生成することが可能である、 ど標準抗原が、サンプ／Ｖ液の代わりに使用された以列
   ば、工程（ａ）および（ｂ）と同じ方法で扱われた一連
   の標準抗原から得られた比較標準を比べることによって
   サンプル液中の抗原の存在を決定する工程を有すること
   を特徴とするザンプＪｖＨ中の抗原の存在を決定のため
   の同種競合的免疫検定法。 ［５１変調可能なラベルが、酵素、発螢光団、化学発光
   性化合物、酵素コファクターヌは酵素インヒビターなど
   の普通に使用されるものから選択されることを特徴とす
   る特許請求の範囲第０勺項記載の同種競合的免疫検定法
   。 ０６＋（ａ）　アンチイデオタイプモノクローン抗体ト
   サンプ／Ｌ／ｒ＆の一部を結合する工程、このアンチイ
   デオタイプモノクローン抗体は、抗体が結合することの
   できる抗原の少くとも１つのエピ１−−プと構造的に類
   似しており、かつアンチイデオタイプモノクローン抗体
   は固相のキＡ１リアーに（ｑＨさせられておシ、 上記結合は、その中で抗体が、抗体−アンチイデオタイ
   プ抗体対を作るために、アンチイデオクイプ七ツクロー
   ン抗体に結合することができる、液相と固相を有する検
   定混合物を作るだめのものである。 （Ｉ））　抗体と、同相のキャリアーにイ」着した抗体
   −アンチイデオタイプ抗体列に抗クロプリンが結合して
   、抗りロプリン抗体−アンチイデオタイプ抗体俊合体を
   形成することができるように、上記検定混合物に、ラベ
   ルされた抗クロプリンを加える工程、 （Ｃ）　続いて、同相のキャリアーを、検定混合物の険
   相から分離する工程、固相のキャリアーは、抗グロブリ
   ン抗体−アンチイデオタイプ抗体複合物を担持する、 （ｄ）　その後、固相のキャリアーに付着され結合させ
   られ、検定混合物から分離された抗グロブリン抗体−ア
   ンチイデオタイプ抗体複合物の中にある結合しラベルさ
   れた抗クロプリンの程度を検出する工程、および （ｅ）　工程（ｄ）で検出された、結合しラベルされた
   抗体の程度と、サンプル液の代わシに標準抗原を使用し
   た以外は、工程（ａ）、（ｂ）、（Ｃ）および（ｄ）と
   同じ方法で扱われた一連の標準抗原から得られた比較標
   準を比較して、サンプル液中の抗体の存在を決定する工
   程を有することを特徴とするザンプル液中の抗原に対す
   る抗体の存在を決定する免疫検定法。 （１７）　ラベルが酵素、発螢光団、化学発光性化合物
   、酵素コファクター、酵素インヒビター、ラテックス粒
   子などの普通に使用されるラベル群から選択されること
   を特徴とする特許請求の範囲第（Ｉ６）項記載の方法。 ［８１（ａ）　精製されたアンチイデオタイプモノクロ
   ーン抗体および、 （１つ）　前述の精製されたアンチイデオタイプモノク
   ローン抗体にイ」着したラベルを含み、上記精製された
   アンチイデオタイプモノクローン抗体が抗原の少くとも
   １つのエピトープと構造的に類似しておシ、 上記付着ラベルが、抗原を検定するためにアンチイデオ
   タイプーイデオタイプ列の中に置かれたときに検出でき
   るものである ことを特販とする抗原を検定するための、アンチイデオ
   タイプモノクローン抗体試薬。 （１９）　ラベルが変調可能であることを特徴とする特
   許請求の１面囲第０８１項記１敗のアンチイデオタイプ
   モノクローン抗体試薬。 囚　ラベルが、酵素、発螢光団、化学発光性化合物、酵
   素コファクター、酵素インヒビターナトの変調￥３１能
   なＶ通に使用される一団のラベルから選択されることを
   特徴とする特許請求の範囲第１Ｊ９１　ｓ’５＋　Ｋ己
   １戊のアンチイテ゛オクィプ七ツクローン抗体試薬。 Ｃ７１Ｊ　ラベルが、酵素、発螢光団、化学発光性化合
   物、ラテツクヌ粒子、放射性核種、酵素コファクターそ
   して酵素インヒビターなどの異種免疫検定で普通に使わ
   れる一団のラベルから選択されることを特徴とする特許
   請求の範囲第［８１項記載のアンチイデオタイプ七ツク
   ローン抗体試薬。 ！２２＋　（ａ）　精製されたアンチイデオタイプモノ
   クローン抗体および、 （り）　上記精製されたアンチイデオタイプモノクロー
   ン抗体に付着された、同相のキャリアーを含み、 上記精製されたアンチイデオタイプモノクローン抗体が
   、抗原の少くとも一つのエピトープと構造的に類似して
   おり、 上記付着された固相のキャリアーがアンチイデオタイプ
   七ツクローン抗体を液状の混合物から物理的に分離しう
   ろことを特級とする抗原を検定するためのアンチイデオ
   タイプモノクローン抗体試薬。 ｔ２３Ｊ　上記精製されたアンチイデオタイプモノクロ
   ーン抗体に付着するラベ／しを更に含有し、このラベル
   が抗原を検定するために、アンチイデオタイプーイデオ
   タイプ抗体の対の中に置かれたときに検出可能であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第（２２）項に記載のア
   ンチイデオタイプモノクローン抗体試薬。 九　ラベルが酵素、発螢光団、化学発光性化合物、放射
   性核種、酵素コファクター、酵素インヒビターなどの異
   種免疫検定で普通に使用される一団のラベルから選択さ
   れることを特徴とする特許請求の範囲第（２３）項記載
   のアンチイデオタイプ七ツクローン抗体試薬。 （２５１（ａ）　Ｗｉ’？　ｕ辺されたアンチイデオタ
   イブそツクローン抗体および （１））　上記精製されたアンチイデオタイプモノタロ
   ーン抗体にｆ」着された固相キャリアーを含み、 上記精製されたアンチイデオタイプ七ツクローン抗体が
   抗原の少なくとも１つのエピトープと構造的に似ており
   、 上記固相のキャリアーがアンチイデオタイプモノクロー
   ン抗体を液状混合物から物理的に分離可能なものである
   ことを特徴とする液状混合物中で抗原に対するイデオタ
   イプ抗体を検定するためのアンチイデオタイプモノクロ
   ーン抗体試薬。