DE3609271A1 - Verfahren und reagenz zum nachweis von autoimmunerkrankungen, arzneimittel zur behandlung von autoimmunerkrankungen sowie hierzu geeignete antiparatypische antikoerper - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Reagenz zum Nachweis von Autoimmunerkrankungen sowie ein Arzneimittel mit Wirkung gegen Autoimmunerkrankungen und ein Verfahren zu dessen Herstellung, worin jeweils antiparatypische Antikörper verwendet werden.

Die Immunregulation durch antiidiotypische Antikörper wurde zum erstenmal von Oudin und weiterführend von Jerne in seiner Netzwerk­ theorie beschrieben. Im Gegensatz zum Burnett-Selektionsmodell stellt sie eine in vielen Punkten noch hypothetische Grundlage für das Verständnis einer spezifischen Immunsuppression dar und bietet eine realistische Erklärungsmöglichkeit für die Genese und den Pathomechanismus von Autoaggressionserkrankungen.

Es sind dabei zwei Arten von Antikörpern, die zu einer Antigenbin­ dungsblockierung führen können, zu unterscheiden:

• 1. Antikörper, die antigenunspezifisch am Idiotyp eines anderen Antikörpers binden, und damit möglicherweise durch sterische Interaktion die Antigenbindung jenes Antikörpers verhindern. Man nennt sie antiidiotypische Antikörper.
• 2. Antikörper, die am sogenannten Paratop angreifen, d. h. an der muldenförmigen Umschlagstelle der leichten und schweren Kette, und dadurch befähigt sind, durch van der Waalschen′sche Kräfte die antigenen Epitope physikalisch mit unterschiedlicher Affini­ tät anzuziehen. Gegen diese Antigenbindungsstelle gerichtete Antikörper werden als antiparatypische Antikörper bezeichnet.

Antiidiotypische Antikörper sind definitionsgemäß Antikörper, die gegen den Idiotyp eines anderen Antikörpers gerichtet sind, d. h. gegen den sogenannten hypervariablen Teil eines Immunglobulins, auf dem sich auch der spezifische Teil der Antigenbindungsstelle, der Paratyp, befindet. Diese Definition erscheint deswegen wichtig, weil der gegen den idiotypischen Anteil gerichtete Antikörper - anti­ idiotypischer Antikörper - der den Paratyp mit einschließt, die Antigenbindung bzw. den antiparatypischen Antikörper durch sterische Behinderung von seinem paratypischen Bindungsort zu verdrängen ver­ mag. Der Wirkmechanismus des antiidiotypischen Antikörpers beruht also auf einer unspezifischen sterischen Blockierung mehr oder weniger aller Antigene, während der antiparatypische Antikörper hohe Selektivität aufweist. Der Paratop erkennt das entsprechende Epitop durch die spezifische sterische Anordnung seiner Aminosäuren, die von ihm nur dann erfaßt werden können, wenn Epitopstruktur und Para­ topstruktur sich spiegelbildlich verhalten. Dieser Mechanismus ist vergleichbar mit einem hochdifferenzierten Schloß (Paratop)-Schlüs­ sel (Epitop)-Prinzip. Wenn ein antiparatypischer Antikörper mit dem entsprechenden Paratyp eine Reaktion eingehen soll, müssen also spiegelbildliche Strukturen beider Reaktionspartner vorliegen. Daraus folgt, daß der antiparatypische Antikörper eine identische Formation mit dem entsprechenden Epitop, das durch den Paratop ge­ bunden wird, aufweist.

Durch Immunisierung mit antigenspezifisch an Säulen gereinigten und isolierten Antikörpern ist im Tierversuch eine Induzierung von anti­ idiotypischen Antikörpern möglich. Üblicherweise wird in der Litera­ tur die antigenspezifische Selektivität dieses antiidiotypischen Antikörpers durch zwei Methoden nachgewiesen.

• 1. durch die Präzipitation des antiidiotypischen Antikörpers nach Reaktion mit dem isolierten Jod-markierten Antikörper.
• 2. in Form eines Radio-Liganden Tests durch die Verdrängung der Antigenbindung an den Antikörper durch die spezifische idio­ typische-antiidiotypische Reaktion.

Da antiidiotypische Antikörper generell in der Lage sind, sowohl die Antigenbindung als auch die Bindung des antiparatypischen Antikör­ pers zu blockieren, ist dieses Nachweisverfahren für die Erkennung paratypischer Antikörper ungeeignet. Die Reaktion beider Antikörper miteinander sowie die dadurch bedingte Antigenblockierung rechtfer­ tigen in keinem Fall den Beweisschluß für eine Antikörper/antigen­ spezifische antiidiotypische Antwort, wie vermeintlich auf Grund der Literatur angenommen wird. Dieses Reaktionsprodukt kann ohne Betei­ ligung antiparatypischer Antikörper allein durch idiotypische-anti­ idiotypische Verbindungen oder auch aus der Kombination antiidiotypi­ sche idiotypische und antiparatypische Bindungen hervorgerufen wer­ den. Die Identität mit einer reinen paratypischen-antiparatypischen Reaktion ist damit nicht gewährt. Weil die Nachweisverfahren, die auf dieser Basis beruhen, somit nicht ausreichend spezifisch sind, entbehrt auch der nach diesen Methoden isolierte vermeintlich anti­ genspezifische-antiidiotypische Antikörper für die weitere diagno­ stische und therapeutische Verwendung den Anspruch auf Selektivität und Spezifität im Hinblick auf die daraus resultierenden Ergebnisse.

Die physiologische Bedeutung idiotypischer-antiidiotypischer bzw. paratypischer-antiparatypischer Antikörper liegt in ihrer funktio­ nellen Eigenschaft der Aufrechterhaltung der Immunbalance. Die Been­ digung einer Antikörperantwort bzw. zellulärer Reaktionen mit spezi­ fischen Rezeptoren gegenüber einem Antigen wird durch die Antiant­ wort antiidiotypischer Antikörper, die sich gegen die antigenspezi­ fischen Antikörper oder die antigenspezifischen Rezeptoren dieser Lymphozyten richten, vermittelt. Um mit dieser antigenspezifischen Immunsuppression keine generelle Unterdrückung des Immunsystems nach jeder Sensibilisierung mit einem Antigen zu bewirken, ist das Vor­ handensein einer Antiantwort mit hoch-selektiven Eigenschaften ge­ genüber dem antigeninduzierten Antikörper erforderlich. Somit schützt die ausgewogene Interaktion verschiedener Antikörper unseren Organismus möglicherweise vor der Entstehung von Autoagressionser­ krankungen. Nicht nur beim Patienten mit Autoimmunleiden, sondern auch im gesunden Organismus wurden autoreaktive Zellen, d. h. Lymphozyten, die gegen körpereigene Substanzen gerichtet sind, ent­ deckt. Diese autoreaktive Zellpopulation wird wahrscheinlich durch die Blockierung ihrer spezifischen Antigenrezeptoren durch bestimmte Antikörper oder auch durch Lymphozyten mit Antikörper-Rezeptoren an der Zerstörung körpereigenen Gewebes gehindert. Durch einen angebo­ renen oder erworbenen antigenspezifischen Defekt entfällt die selek­ tive Supprimierung der entsprechenden Lymphozyten, worauf dann eine ungehemmte Autoagressionserkrankung resultiert. Im wesentlichen han­ delt es sich bei diesen Autoimmunerkrankungen um folgende Formen: Autoimmune Schilddrüsenerkrankungen, Diabetes mellitus Typ I, Myasthenia gravis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, autoimmune Hepatitis, Autoimmunerkrankungen des hämopoetischen Systems, Uveitis, Immunvaskulitiden, autoimmune Nephropathien, generalisierte Autoaggressionserkrankungen wie Kollagenosen und andere Bindegewebs­ erkrankungen.

Bei den autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen handelt es sich insbe­ sondere um folgende zwei Formen:

• 1. die chronische Thyreoiditis Hashimoto, die auf einer chronischen autoaggressiven Entzündung basiert, wobei der Selbstzerstörungs­ prozeß der Schilddrüse in einer deutlichen Schilddrüsenunter­ funktion endet.
• 2. Autoimmun bedingte Funktionsstörungen der Schilddrüse, bei der entweder die Schilddrüse zum Wachstum oder hormoneller Überpro­ duktion stimuliert wird. Dafür werden endogene Antikörper, die gegen einen Rezeptor auf der Schilddrüsenmembran gerichtet sind, als ursächlich diskutiert. Sie ahmen unkontrolliert und nicht supprimierbar die Wirkung von TSH, das sowohl wachstums- als auch hormonstimulierende Eigenschaften an diesem TSH-Rezeptor besitzt, nach.

Diese beiden Erkrankungen imponieren serologisch beispielsweise durch das Auftreten hochtitriger Antikörper entweder gegenüber Thyreoglobulin und/oder Schilddrüsenmikrosomen oder gegen den TSH-Rezeptor.

Die bisherigen Nachweismethoden für Schilddrüsenerkrankungen bedie­ nen sich des Antigens als Detektor. Ein immunologisches Nachweisver­ fahren, welches die Detektion mit Hilfe von Anti-antikörpern durch­ führt, ist nicht bekannt.

Die bekannten Nachweismethoden, insbesondere der immunbedingten Funktionsstörungen der Schilddrüse, sind äußerst aufwendig. Ihre diagnostische Treffsicherheit und prognostische Bedeutung ist teil­ weise von unsicherer Relevanz. Diese Diskrepanz ist im wesentlichen durch die Schwächen der bekannten Nachweisverfahren verursacht. Zwar werden zahlreiche Methoden propagiert, die mehr oder weniger mit der Schilddrüsenwachstumsstimulation oder mit der Schilddrüsenüber­ funktion korrelieren, in vielen Fällen kommen aber positive Ergeb­ nisse vor, die keine klinische Korrespondenz besitzen oder auch laborchemisch negative Befunde, bei denen klinisch das Vollbild einer Struma oder Autoimmunhyperthyreose imponiert. Diese Phänomono­ logie ist durch die Unspezifität des zum Autoantikörpernachweis ver­ wendeten Antigens zu erklären. Eine Reinisolierung von TSH-Rezeptoren ist schwierig. Die Antikörperbindung an unterschiedlichen Rezeptorstellen bewirkt einen differenzierten funktionellen Effekt in vivo, der sich durch den in vitro-Bindungsnachweis nicht diskrimi­ nieren läßt. Gerade für die Differentialdiagnose der Hyperthyreosen oder des Strumenwachstums, die für die Entscheidung einer differen­ tialtherapeutischen Strategie unabdingbare Voraussetzung ist, muß ein sicherer Diagnostikparameter gefordert werden. Der Autoantikör­ per muß nicht nur qualitativ spezifisch erfaßt werden können, son­ dern muß insbesondere auch quantitativ meßbar und damit zum Ausmaß der in vivo Funktionsstörung relativierbar sein.

Die therapeutische Beeinflussung von Schilddrüsenerkrankungen er­ folgt bisher durch Behandlung mit Thyreostatika. Eine Therapie auf immunologischer Basis ist bisher nicht bekannt. Die bisher üblichen Behandlungsmethoden sind mit Nachteilen behaftet, insofern, als er­ hebliche Nebenwirkungen, wie Schädigung des Blutbilds und schwere allergische Reaktionen nicht selten vorkommen.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, diese Nachteile zu beseitigen und Verfahren und Reagentien zu schaffen, welche einen raschen und einfachen Nachweis von Autoimmunerkrankungen ermöglicht und Arzneimittel zur Verfügung zu stellen zur wirksamen Behandlung der Autoimmunerkrankungen.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zum Nachweis sowie ein Verfahren zur Therapie von Autoimmunerkrankungen, welche dadurch gekennzeichnet sind, daß man mindestens einen para­ typischen Antikörper verwendet. Bei den Autoimmunerkrankungen han­ delt es sich dabei im wesentlichen um die vorstehend genannten For­ men. Es handelt sich dabei um antiparatypische Antikörper, die gegen autoreaktive Zellen und Autoantikörper gerichtet sind. Im Fall der Schilddrüsenerkrankungen handelt es sich insbesondere um antiparatypische Antikörper, die gegen die klinisch relevanten Epitope von Antikörpern gegen Thyreo­ globulin, der Schilddrüsenmikrosomen oder des TSH-Rezeptors gerich­ tet sind.

Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren beruht auf der überraschenden Feststellung, daß man Antikörper gewinnen kann, die eine so hohe Selektivität aufweisen, daß damit eine Nachweismethode zur Verfügung gestellt werden kann, durch welche die Prognose der Behandlung be­ züglich der Therapiedauer und -dosis und Remissionserwartung bei Schild­ drüsenerkrankungen auch bei Verwendung von Thyreostatika, kalkulierbar wird.

Die neuen, für den Nachweis und die therapeutische Behandlung der Schilddrüsenerkrankungen verwendeten Antikörper lassen sich erfin­ dungsgemäß erhalten, dadurch, daß man Autoantikörper entweder an Schilddrüsenzellmembranen oder an TSH-Rezeptoren, die in der her­ kömmlichen Weise durch Membranfraktionierung gewonnen werden, adsor­ biert und anschließend diese Antigen-Antikörperkomplexe sprengt. Die Reinigung der Antikörper erfolgt nach Methoden wie Ultrazentrifuga­ tion über Dichtegradienten, Elektrophorese und HPLC. Die selektio­ nierten Antikörperfraktionen werden zur Immunisierung eingesetzt. Aus den Milzzellen der sensibilisierten Tiere wird durch Fusionie­ rung mit Mäusemyelomzellen ein monoklonaler antiparatypischer Anti­ körper gewonnen, dessen Spezifität in der paratypischen-antipara­ typischen Reaktion im wesentlichen durch TSH-Verdrängung an seinen spezifischen Rezeptor und/oder den Rezeptorantikörper an seine funk­ tionelle Bindungsstelle nachgewiesen wird. Ein weiterer Spezifitäts­ test ist ein Verdrängungsassay, in dem monoklonale zum Sensibilisie­ ren verwendete Ausgangsantikörper an eine feste Phase gekoppelt wor­ den.

In einem anderen Verfahren werden Antigensensibilisierte Lymphozyten über eine Rosettentechnik (Hammelerythrozyten mit fixiertem TSH) isoliert und zur Fusionierung mit menschlichen Myelomzellen einge­ setzt. Nach Hybridisierung werden die dadurch gewonnenen einzelnen monoklonalen Antikörper bezüglich ihrer funktionellen Eigenschaften an Thyreozyten-Monolayerkulturen für den weiteren Gebrauch getestet.

Bei den oben erwähnten Immunisierungen wird das Immunogen beispiels­ weise in Kombination mit einem Adjuvans in üblicher Weise verab­ reicht. Bevorzugt wird als Adjuvans Aluminiumhydroxid zusammen mit Bordatella pertussis oder Freund′schem Adjuvans eingesetzt. Die Immunisierung erfolgt vorzugsweise über mehrere Wochen mit minde­ stens vier Immunisierungen in 2-3-wöchigem Abstand (Injektion intra­ peritoneal). Aus so immunisierten Tieren werden B-Lymphozyten gewon­ nen, die mit einer permanenten Myelomzellinie fusioniert werden. Die Fusionierung erfolgt nach dem bekannten Verfahren von Köhler und Milstein. Die hierbei gebildeten Primärkulturen von Hybridzellen werden in üblicher Weise, z. B. unter Verwendung eines handelsübli­ chen Zellsorters oder durch "limiting dilution" kloniert.

Für diese Bestimmungsverfahren können die monoklonalen Antikörper als solche oder Fragmente hiervon, welche die entsprechenden immuno­ logischen Eigenschaften aufweisen, beispielsweise Fab-Fragmente, verwendet werden. Unter dem Begriff "monoklonale Antikörper" werden daher sowohl die vollständigen Antikörper als auch die Fragmente verstanden.

Die erfindungsgemäßen Antikörper eignen sich hervorragend dazu, in Form eines Reagenzes in einer Probe, beispielsweise Serum oder Plasma, Schilddrüsenerkrankungen nachzuweisen. Die Testdurchführung erfolgt nach der ELISA- oder RIA-Technik. Im Rahmen dieses Reagenzes kann der monoklonale Antikörper, sowohl in kompletter als auch in Form der Fragmente, auch auf einem festen Träger fixiert vorliegen, beispielsweise auf immunosorptivem Papier oder der Oberfläche von Kunststoffröhrchen bzw. -schläuchen.

Zur Herstellung von Arzneimitteln werden die Antikörper in an sich bekannter Weise mit geeigneten pharmazeutischen Trägersubstanzen, Aroma-, Geschmacks- und Farbstoffen gemischt und beispielsweise als Tabletten oder Dragees ausgeformt oder unter Zugabe entsprechender Hilfsstoffe in Wasser oder Öl, wie z. B. Olivenöl, suspendiert oder gelöst.

Die Antikörper können in flüssiger oder fester Form oral und paren­ teral appliziert werden. Als Injektionsmedium kommt vorzugsweise Wasser zur Anwendung, welches die bei Injektionslösungen üblichen Stabilisierungsmittel, Lösungsvermittler und/oder Puffer enthält. Derartige Zusätze sind z. B. Tartrat- oder Borat-Puffer, Ethanol, Dimethylsulfoxid, Komplexbildner (wie Ethylendiamintetraessigsäure), hochmolekulare Polymere (wie flüssiges Polyethylenoxid) zur Viskosi­ tätsregulierung oder Polyethylen-Derivate von Sorbitanhydriden.

Feste Trägerstoffe sind z. B. Stärke, Lactose, Mannit, Methylcellu­ lose, Talkum, hochdisperse Kieselsäure, höhermolekulare Fettsäuren (wie Stearinsäure), Gelatine, Agar-Agar, Calciumphosphat, Magnesium­ stearat, tierische und pflanzliche Fette oder feste hochmolekulare Polymere (wie Polyethylenglykole). Für die orale Applikation geeig­ nete Zubereitungen können gewünschtenfalls Geschmacks- und Süßstoffe enthalten.

Als Tracer der antiparatypischen Antikörper kommen Zytostatika, Komplement und Isotopen in Frage.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel sind nach Applikation zielsicher in der Lage, die entsprechenden autoreaktiven Lymphozyten zu erken­ nen und spezifisch diese Klone zu blockieren.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

A) Nachweis der Immunregulation am Thyreoglobulinantikörper und TSH-Rezeptorantikörper-Modell

• a) Es wurde festgestellt, daß Patientenseren mit hohen Schild­ drüsenantikörper-Titern nach 1 : 1-Mischung mit einem Serum desselben Patienten mit einem niedrigen Antikörperspiegel, die mit der Haemagglutinationstechnik ermittelt werden, nach erneuter Bestimmung mit dieser Methode weit unter dem zu er­ wartenden arithmetischen Mittel liegen. Daraus ergibt sich, daß die Seren mit niedrigen Antikörper-Titer im Krankheits­ verlauf antiidiotypische Antikörper gebildet haben, die nach Mischen des Serums zu einem Zeitpunkt mit einem hohen Thyreo­ globulinantikörperspiegel eine idiotypische-antiidiotypische Bindung mit diesem Thyreoglobulinantikörper eingehen. Dadurch wird der freie Antikörpergehalt aus dem Serum mit den hohen Thyreoglobulinantikörperkonzentrationen reduziert und steht für die nachfolgende Reaktion in der Haemagglutinationstech­ nik nicht mehr zur Verfügung.
• b) Zum Ausschluß einer Interferenz mit Thyreoglobulin-Antigen in dem Serum mit niedrigen Thyreoglobulin-Antikörper-Titern, das ebenfalls zu einer Reduktion freier Thyreoglobulin-Antikörper im Serum mit den hohen Thyreoglobulin-Antikörpertitern führen kann, wurden Agargel-Diffusionsmethoden durchgeführt. Zu­ nächst wurde mittels einer Ouchterlonytechnik Thyreoglobulin in verschiedenen Konzentrationen dem Agargel beigesetzt. In die gestanzten Löcher wurden Thyreoglobulin-Antikörperhaltige Seren der Patienten und Thyreoglobulin-Antikörper-negative Seren eingefüllt. Gegenüber Thyreoglobulinantikörper-positi­ ven Seren fanden sich Präzipitationsringe. In einem weiteren Ansatz wurde dem Agargel über Säulen gereinigtes humanes Thyreoglobulin-Antikörper-haltiges Serum zugefügt. Als Reaktionsproben wurden diesmal Thyreoglobulin-haltiges Human­ serum, Thyreoglobulin und Thyreoglobulinantikörper-negative Kontrollseren sowie Thyreoglobulinantikörper-positive Seren in die Vorlagen eingefüllt. Präzipitationsringe erschienen in diesem Versuch bei den mit Thyreoglobulin versetzten Human­ seren sowie bei einigen Patienten mit Thyreoglobulinantikör­ per-haltigen Seren in niedriger Konzentration, die durch ir­ gendeinen Zeitpunkt der Erkrankung vorher hohe Anti-Tg autoimmunologische Aktivität aufgewiesen hatten. Dieses Resultat weist auf die Bildung entweder einer Thyreoglobulinantikörper-Thyreoglobu­ linverbindung bzw. Thyreoglobulinantikörper-antiidiotypische Verbindung hin.
• c) In einem dritten Experiment wurden sowohl eine Antikörperfäl­ lung und säulenchromatographische Reinigung der mit Thyreoglobulin versetzten Seren als auch mit Tg-AK positiven Seren durchgeführt. Die so präparierten Pro­ ben wurden erneut in ein Thyreoglobulin-Antikörper-haltiges Agargel-Gemisch eingesetzt. Diesmal trat lediglich ein Präzi­ pitationsring bei den Seren auf, denen Thyreoglobulin zuge­ setzt wurde. Das Verschwinden der zunächst positiven Reaktion im zweiten Ansatz einiger Patientenseren, die einen niedrigen Thyreoglobulinantikörperspiegel aufweisen, nach Immunglobu­ linextraktion weist auf eine idiotypische-antiidiotypische Thyreoglobulinantikörperreaktion hin.
• Um diese idiotypische-antiidiotypische Bindung näher zu cha­ rakterisieren, wurden zahlreiche Lymphozytenkulturen von den Patienten, die offensichtlich antiidiotypische Thyreoglobu­ linantikörper entwickelt hatten, angesetzt. Die Lymphozyten wurden in einen sterilen Brutschrank mit Pokeweedmitogen und LPS über 14 Tage zur Antikörperproduktion angeregt. In einem anderen Ansatz wurden Lymphozyten nach Rosettenbildung an tannierten Schafserythrozyten, die mit Thyreoglobulinantikör­ pern behaftet wurden, durch Dichtezentrifugation isoliert und ebenfalls mit B-Zell-Stimulatoren zur Antikörperproduktion über 14 Tage kultiviert. Bei drei Patienten aus der nicht-se­ lektionierten Lymphozytenkultur sowie in sechs Ansätzen bei Patienten-Lymphozyten, die über die Rosettenbildung isoliert werden konnten, wurde im Medium mit der RIA- und ELISA-Tech­ nik Thyreoglobulin nachgewiesen, das nach erneuter Immunglo­ bulin extraktionegativ war. Ein mit Thyreoglobulin versetztes Kontrollmedium aus dem ebenfalls eine Immunglobulinelimina­ tion durchgeführt wurde, blieb Thyreoglobulin-positiv. Diese Untersuchungen weisen auf das Auftreten und die Produktion antiparatypischer Thyreoglobulinantikörper der Patienten­ lymphozyten im Humansystem hin.
• d) TSH-Rezeptorautoantikörper wurden zunächst üblicherweise mit dem Radio-Ligandentest ermittelt. Um Auskunft über ihre funk­ tionelle Bedeutung zu erlangen, wurde im nu/nu Maus-System nach Transplantation von Schilddrüsen-Operationspräparaten die Wachstumsstimulation über den ³H-Thymidin-Einbau im Thyreozytenkern und die hormonelle Aktivität über den Jod-up- take sowohl morphologisch anhand von autoradiographischen Untersuchungen als auch quantitativ durch die Szintillation im Bohrloch ermittelt. Diese Untersuchungen weisen auf die überwiegend heterogene Antigenbindung der polyklonalen Anti­ körper am TSH-Rezeptor hin, die in keinem Falle eine Korrela, tion zur Höhe des Meßwertes im Radio-Ligandentest stand.
• Wurden die Basedow-Immunglobuline analog zu den Thyreoglobu­ linantikörper-Untersuchungen im Individuum 1 : 1 vermischt und zwar mit Proben, die zu einem Zeitpunkt hoher autoimmunologi­ scher Aktivität und im späteren Krankheitsverlauf deutlich niedriger Aktivität gewonnen wurden, so ließ sich diesmal im Radio-Ligandentest ein Antikörpertiter ermitteln, der im we­ sentlichen dem arithmetischen Mittel dieses Gemischs ent­ sprach. Im Stimulationsversuch im nu/nu Maus-assay jedoch lagen nach den Kriterien der Beurteilung der Kernvolumengröße die vermischten Basedow-Immunglobulinpräparationen innerhalb der Werte der negativen Kontrollseren, während die Verwendung der orginären Antikörperpräparationen einzeln eine der Klinik entsprechenden Funktionskorrelation aufwiesen. Diese Ergebnisse beweisen ebenfalls das Auftreten anti­ idiotypischer Antikörper in der Remission, die eine idio­ typische Blockierung der freien TSH-Rezeptorantikörper in dem hochaktiven Serum bedingen. Diese Reaktion besitzt offensichtlich eine diagnostische Bedeutung, ohne daß die Komplexbildung im Radio-Ligandentest nachweisbar ist.
• e) Die weiterführenden Versuchsansätze dienten zur Charakteri­ sierung und Reinigung der idiotypischen-antiidiotypischen bzw. paratypischen-antiparatypischen Antikörper. Sie erfolgte sowohl über Meerschweinchenfettzellmembran-Präparation ent­ sprechend der Methode nach Endo und humanen Membranthyreozy­ tenpräparationen entsprechend der Methode nach Smith and Hall durch Säulenabsorption. Die Waschlösung wurde auf eine konstante Immunglobulinkonzentration, die laser-nephelome­ trisch ermittelt wurde, eingestellt, und in einem Verdrän­ gungsassay wurde die Bindungsabnahme an Rezeptoren von Jod-markiertem TSH gegenüber einer autoantikörpernegativen Probe (Normalassay) als Ausdruck der Verdrängungspotenz antiparatypischer Antikörper vergli­ chen. Die Abweichungen zum Normalassay (= 100%) betrugen zwischen 15 und 27%.
• Anschließend wurde durch Titration dieser konstanten Antikörperfraktion mit zu den Autorezeptorantikörpern, die diesmal mit Chloramin-T-Jod markiert wurden, auf ähnliche Weise die Bin­ dungsabnahme entsprechend titrierten antiparatypischen Antikörper TSH Produkten nachgewiesen. Durch die Zugabe dieser anti­ paratypischen Immunglobuline zu einer konstanten Rezeptor­ antikörpermenge war sowohl im Bioassay als auch durch die Adenylcyclase-Aktivierung oder T3-Release an Schilddrüsen­ schnitten und Schilddrüsenzellkulturen konzentrationsabhängig eine Aktivitätsminderung dieser Rezeptorantikörper, teils mehr auf den wachstumsstimulierenden Einfluß bezogen, teils mit Hinblick auf die Hormonstimulation, festzustellen.
  

B) Erzeugung antiparatypischer Antikörperklone

Hierzu wurden zwei Tierexperimente etabliert:

• 1. je eine Balb-C-Maus-Gruppe wurde mit Freud′schem Adjuvans aufbereiteten humanen TSH-Rezeptorpräparationen und gereinig­ ten TSH-Rezeptorantikörper-Fraktionen sensibilisiert.
  • a) nach ausreichendem TSH-Rezeptorantikörperanstieg nach 12 Wochen durch mehrmalige Immunisierung wurden die Milz­ zellen kloniert und hybridisiert nach dem Verfahren von Köhler und Milstein (Nature 256, 1975, S. 495-497). Die Klone wurden verworfen, die positiv gegenüber verschiede­ nem humanem Gewebe (nicht Schilddrüse) reagierten. Durch zahlreiche Umsetzungen konnten Klone gezüchtet werden, die monoklonale Bindungsaffinität sowohl im Radio-Ligan­ dentest als auch in den für Hormonstimulierung und different für Thyreozytenwachstum bei beschriebenen Test­ systemen in Thyreozytenkulturen und Funktionsassay hervorbrachten.
  • b) Immunisierung mit Rezeptorantikörpern führte auf ähnliche Weise zur Klonierung von monoklonalen Antikörpern, die eine Bindung an jodmarkiertem TSH aufwiesen, das nach Präzipitation mit Antimaus-Serum im Pellet gecountet werden konnte.
• Zur Absicherung, daß hier antiparatypische Antikörper gene­ riert wurden, wurden die monoklonalen Antikörper an Maus-IgG-beschichteten Säulen von möglichen antiidiotypischen Antikörpern befreit.
• Durch Zugabe dieser antiparatypischen monoklonalen Antikör­ per zu den bereits funktionell charakterisierten monoklona­ len TSH-Rezeptorantikörpern konnte je nach antiparatypischen Klonen entweder die Hormonstimulierung oder das Thyreozyten­ wachstum gehemmt werden.
• Der damit verbundene Nachweis funktionell unterschiedlicher Antiparatop-Strukturen wurde dazu verwendet, um aus polyklonalen Antirezeptor-haltigen Humanseren ihre spezifischen funk­ tionsstimulierenden Antikörpereigenschaften zu charakteri­ sieren. Dazu wurden die jeweiligen entiparatypischen Anti­ körper an Mikrotiterplatten "gecoated" mit den Serumproben des Patienten inkubiert, gewaschen und in Form eines ELISA-Systems mit einem konjugierten Antihumanantikörper, die im Assay spezifische Bindung nachgewiesen. Zur quantitativen Ermittlung des Autoantikörpergehaltes wurden vergleichende Untersuchungen mit einem monoklonalen TSH-ELISA-Test durchge­ führt, wobei die Bindungsaktivität dieses monoklonalen Anti­ körpers in Äquivalenz zur Bindung des antiparatypischen Anti­ körpers mit dem Paratyp des Rezeptorantikörpers gesetzt wurde.
• Eine andere direkte quantifizierbare Meßvariante stellte die Bindungs­ fähigkeit von bekannten b-TSH-Konzentrationen an die antiparatypischen Antikörper dar, auf die dann die Bindung der Auto-Antikörper bezogen werden konnte (Maßeinheit: TSH-Bindungsaequivalente).
• Die gefundenen Autoantikörper in diesem RIA-System korrelieren sehr gut mit dem klinischen Erscheinungsbild und der Aktivi­ tät der jeweiligen Erkrankung. Damit liegt ein Assay-System vor, das sowohl eine Möglichkeit zur qualitativen Differen­ zierung von TSH-Rezeptorantikörpern erlaubt, als auch Krank­ heitsspezifität und Korrelationen zur Krankheitsaktivität aufweist.
• Die Gewinnung dieser antiparatypischen Antikörper, die einen hohen funktionellen Differenzierungsgrad besitzen, können nach entsprechender Markierung zu spezifischen Eliminationen der aetiologisch relevanten durch den antiparatypischen ELISA-Assay aufgedeckten Lymphozytenklone verwendet werden, wie entsprechende tierexperimentelle Untersuchungen zeigen.
• 2. Die paratypischen Antikörper wurden in einem modifizierten System gewonnen. Meerschweinchen wurden mit TSH-Rezeptoren, welche mit Freud′schem Adjuvans aufbereitet wurden, immuni­ siert. Die TSH-Rezeptorantikörperaktivität wurde wiederum im Radio-Ligandentest und funktionell nachgewiesen. Nach Er­ reichen eines angemessenen Antikörperspiegels nach ca. 12 Wochen wurden die Tiere entblutet und die Antikörperfraktion gegenüber Humangewebe und Meerschweinchen (nicht Schilddrüse) adsorbiert. Die von humanen Thyreozyten getrennten Rezeptorantikörper wurden für die weitere Immunisierung im Balb-C-Modell verwendet. Nach wiederholter Boosterung wurde die Bindungsfähigkeit der Maus-Immunglobuline an TSH geprüft. Analoge Studien folgten im Bioassay und im Radio-Ligandentest durch die Fähigkeit dieses Antikörpers, TSH von seinen Funktionseinheiten zu in­ hibieren.
• Nach ca. 8 Wochen wurden die Milzzellen erneut mit Mäusemye­ lomzellen hybridisiert und bis zur Entlimitierung kloniert. Die dadurch ermittelten monoklonalen Antikörper, die keine Bindung gegenüber Kaninchenimmunglobulin aufwiesen, wurden auf ihre antigenspezifische Reaktion untersucht. Dabei kam erneut der Verdrängungsversuch von markierten TSH an TSH-Re­ zeptor zum Einsatz. Weiterhin wurde die funktionelle Aktivität dieser Antikörper durch ihre Fähigkeit, TSH in den Funk­ tions- und Bioassays zu verdrängen, geprüft. In diesem Zusam­ menhang konnte durch die Inhibierung der minimalen TSH-Kon­ zentration bei einer konstanten Immunglobulinmenge eine der TSH-Verdrängung entsprechende Einheit festgelegt werden (Ver­ drängung % TSH). Damit war eine Quantifizierung dieses Meß­ systems möglich.
• Auch hier konnte der polyklonale Patientenrezeptorantikörper durch unterschiedliche antiparatypische AK auf den Monoclones quantifizierbar in TSH-Verdrängungseinheiten im Hinblick auf seinen funktionellen Angriffspunkt gemessen werden.
• Die auf diese Weise provozierten monoklonalen Antikörper wurden in gleicher Weise zu einem ELISA-System ausgebaut, das eine sichere Erkennung unterschiedlicher TSH-Rezeptorauto­ antikörper-Spezifitäten sowohl qualitativ als auch quantita­ tiv erkennen läßt.
• 3. Durch Antikörperabsorption an Augenmuskelgewebe oder Retro­ orbitalgewebe und anschließender Immunglobulinseparierung kann durch eine Sensibilisierung tierexperimentell ein Anti­ körper hergestellt werden, der analog zu den Vorexperimenten zum TSH-Rezeptorantikörper und antiparatypischen Antikörper durch antiparatypische-paratypische Bindung Ophthalmo­ pathie-Antigenspezifität aufweist.
• Dieser in Analogieschritten erzeugte antiparatypische Anti­ körper kann in gleicher Weise therapeutisch und diagnostisch angewendet werden.

Claims (23)

1. Verfahren zum Nachweis von Autoimmunerkrankungen, dadurch ge­ kennzeichnet, daß mindestens ein antiparatypischer Antikörper verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die anti­ paratypischen Antikörper gegen autoreaktive Zellen gerichtet sind.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeich­ net, daß die antiparatypischen Antikörper gegen Lymphozyten mit Antikörper-Rezeptoren gerichtet sind.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeich­ net, daß es sich bei den Autoimmunerkrankungen um die Formen autoimmune Schilddrüsenerkrankungen, Diabetes mellitus Typ I, Myasthenia gravis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, autoimmune Hepatitis, Autoimmunerkrankungen des hämopoetischen Systems, Uveitis, Immunvaskulitiden, autoimmune Nephropathien, generali­ sierte Autoaggressionserkrankungen wie Kollagenosen und andere Bindegewebserkrankungen handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Schilddrüsenerkrankungen um Autoimmunhyperthyreosen oder um Autoimmunorbithopathien handelt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeich­ net, daß die antiparatypischen Antikörper gegen die klinisch-re­ levanten Epitope von Antikörpern des Thyreoglobulins, der Schilddrüsenmikrosomen oder des TSH-Rezeptors gerichtet sind.

7. Reagenz zum Nachweis von Autoimmunerkrankungen, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es mindestens einen antiparatypischen Antikörper enthält.

8. Reagenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die anti­ paratypischen Antikörper gegen autoreaktive Zellen gerichtet sind.

9. Reagenz nach einem der Ansprüche 7 und 8, dadurch gekennzeich­ net, daß die antiparatypischen Antikörper gegen Lymphozyten mit Antikörper-Rezeptoren gerichtet sind.

10. Reagenz nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeich­ net, daß es sich bei den Autoimmunerkrankungen um die Formen autoimmune Schilddrüsenerkrankungen, Diabetes mellitus Typ I, Myasthenia gravis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, autoimmune Hepatitis, Autoimmunerkrankungen des hämopoetischen Systems, Uveitis, Immunvaskulitiden, autoimmune Nephropathien, generalisierte Autoaggressionserkrankungen wie Kollagenosen und andere Bindegewebserkrankungen handelt.

11. Reagenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Schilddrüsenerkrankungen um Autoimmunhyperthyreosen oder um Autoimmunorbitopathien handelt.

12. Reagenz nach einem der Ansprüche 10 und 11, dadurch gekennzeich­ net, daß die antiparatypischen Antikörper gegen die klinisch-re­ levanten Epitope von Antikörpern des Thyreoglobulins, der Schilddrüsenmikrosomen oder des TSH-Rezeptors gerichtet sind.

13. Arzneimittel mit Wirkung gegen Autoimmunerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen antiparatypischen Anti­ körper enthält.

14. Arzneimittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die paratypischen Antikörper gegen autoreaktive Zellen gerichtet sind.

15. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 13 und 14, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die antiparatypischen Antikörper gegen Lymphozyten mit Antikörperrezeptor gerichtet sind.

16. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es sich bei den Autoimmunerkrankungen um die For­ men autoimmune Schilddrüsenerkrankungen, Diabetes mellitus Typ I, Myasthenia gravis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, auto­ immune Hepatitis, Autoimmunerkrankungen des hämopoetischen Systems, Uveitis, Immunvaskulitiden, autoimmune Nephropathien, generalisierte Autoaggressionserkrankungen wie Kollagenosen und andere Bindegewebserkrankungen handelt.

17. Arzneimittel nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Schilddrüsenerkrankungen um Autoimmunhyperthyreosen oder um Autoimmunorbitopathien handelt.

18. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 16 und 17, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das die antiparatypischen Antikörper gegen die klinisch-relevanten Epitope von Antikörpern des Thyreoglobulins, der Schilddrüsenmikrosomen oder des TSH-Rezeptors gerichtet sind.

19. Verwendung der von einem oder mehreren antiparatypischen Anti­ körpern zur Herstellung von Arzneimitteln gemäß einem der An­ sprüche 13 bis 18.

20. Antiparatypische Antikörper, die gegen autoreaktive Zellen ge­ richtet sind.

21. Antiparatypische Antikörper nach Anspruch 20, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie gegen Lymphozyten mit Antikörper-Rezeptoren gerichtet sind.

22. Antiparatypische Antikörper, die gegen die klinisch-relevanten Epitope von Antikörpern des Thyreoglobulins, der Schilddrüsen­ mikrosomen oder des TSH-Rezeptors gerichtet sind.

23. Antiparatypische Antikörper, erhältlich durch folgende Verfah­ rensschritte

• a) Sensibilisierung je einer Balb-C-Maus-Gruppe mit einer durch Freundsches Adjuvans aufbereiteten humanen TSH-Rezeptorpräpa­ ration und gereinigten TSH-Rezeptorantikörper-Fraktionen,
• b) mehrmalige Immunisierung nach ausreichendem TSH-Rezeptor­ antikörper- und Anti-TSH-Rezeptorantikörperanstieg, Klonierung und Hybridisierung nach Köhler und Milstein,
• c) Verwerfung der Klone, die positiv gegenüber humanen Nicht-Schilddrüse-Geweben reagieren,
• d) Züchtung der Klone, die monoklonale Bindungsaffinität sowohl im Radio-Ligandentest als auch in den für Hormonstimulierung und Differenz für Thyreozytenwachstum umschriebenen Test­ systemen in Thyreozytenkulturen hervorbringen,
• e) Befreiung der erhaltenen monoklonalen Antikörper von anti­ idiotypischen Antikörpern an Maus-IgG-beschichteten Säulen.