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Gebiet der Erfindung
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Das
Gebiet dieser Erfindung sind Polypeptid-Autoantikörper-Inhibitoren und Verfahren
der Verwendung davon.
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Hintergrund
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Multiple
Sklerose (MS) ist eine chronische Krankheit mit rezidivierenden,
remittierenden Störungen
des zentralen Nervensystems, die 350 000 Amerikaner befällt und
nach Traumata an zweiter Stelle der Hauptursachen einer Behinderung
unter jungen Erwachsenen steht. MS ist eine Autoimmunerkrankung,
pathologisch gekennzeichnet durch perivenuläre Infiltrate weißer Hirn-
und Rückenmarkssubstanz,
die Makrophagen und mononukleäre
Zellen (Entzündung)
beinhalten, und Zerstörung
der Myelinscheiden, die Nervenfasern isolieren (Demyelinisierung).
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Experimentelle
allergische Enzephalomyelitis (EAE) bei Nagetieren ist das am meisten
gebrauchte Modell zum Untersuchen von Therapien für MS bei
Menschen gewesen. Diese traditionellen Krankheitsmodelle für MS haben
im Allgemeinen das Konzept gefördert,
dass MS eine T-zellvermittelte Erkrankung ist. Die Autoantigene,
die als Ziel für
den Immunangriff dienen, sind jedoch nicht identifiziert worden,
und die mit dem Myelinschaden verwickelten molekularen Mechanismen
bleiben ungewiss. Während
klar ist, dass eine Entzündung
des ZNS bei EAE durch autoagressive T-Zellen ausgelöst wird, die
Myelinantigene in dem Kontext von Molekülen der MHC-Klasse II erkennen,
mangelt es vielen der Modelle an der frühen Demyelinisierungskomponente der
MS-Läsion.
Die Aktivierung von B-Zellen und die Reaktionen von Antikörpern erscheinen
für die
volle Entwicklung von EAE notwendig, und frühere Studien über autoimmune
Demyeliniesierung unter Verwendung von myelinisierten Kulturen von
ZNS-Gewebe haben humorale Faktoren als Effektor-Mechanismen angedeutet.
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Somit
ist es nicht überraschend,
dass EAE bei Nagetieren kein stabiler Prädiktor der Wirksamkeit bei
Menschen gewesen ist, da fundamentale Unterschiede bei dem klinischen
Verlauf, der Symptomatik und der immunologischen Reaktion auf Myelinproteine
EAE bei Nagetieren von MS bei Menschen unterscheiden.
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Ein
Beispiel einer derartigen Studie ist die von Linington et al. (Brain
112, 895-911, 1989), die die Rolle des Komplements in der Pathogenese
von Demyelinisierung und Entzündung
in einem synergistischen Modell akuter EAE bei der Lewis-Ratte erforscht
haben.
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Kürzlich wurde
eine neue MS-artige Erkrankung bei einem nicht menschlichen Auszucht-Primaten,
dem Weißbüscheläffchen Callithrix
jacchus definiert. Die EAE bei Weißbüscheläffchen weist eine herausragende
MS-artige frühe
Demyelinisierungskomponente auf, die die Gegenwart Myelin-spezifischer Autoantikörper erfordert,
und hat eine Gelegenheit geboten, die Wechselwirkung zwischen diesen
Antikörpern
und ihren Zielantigenen auf dem Myelin zu verstehen. Charakteristika
des Modells umfassen Folgendes: a. milde klinische Befunde und einen
rezidivierenden, remittierenden, MS-ähnlichen
Verlauf; b. eine primäre
demyelinisierende Symptomatik mit früher Gliose, die nicht von MS-Läsionen (demyelinisierenden Plaques)
zu unterscheiden ist; c. natürlichen
Knochenmarks-Chimärismus,
der erfolgreiche adoptive Übertragung
enzephalitogener (z. B. Krankheit hervorrufender) T-Zell-Klone und – Linien
erlaubt; d. Diversität
des enzephalitogenen Repertoires von T-Zellen, die dem Hauptmyelinprotein,
dem Myelinbasisprotein (MBP), gegenüber reaktiv sind; e. unterschiedliche
Krankheitsphänotypen,
die von der Immunisierung mit unterschiedlichen Myelinbestandteilen
herrühren:
Im Gegensatz zu dem Gesamtmyelin produziert die Immunisierung mit
MBP eine nicht demyelinisierende Form von EAE; f. Demonstration, dass
Demyelinisierung antikörpervermittelt
ist, aber ebenfalls eine enzephalitogene T-Zell-Reaktion erfordert, um den Zugang der
Autoantikörper
zu dem Nervensystem zu erleichtern; und g. eine Schlüsselrolle des
Myelin-Oligodendrozyt-Glykoproteins
(MOG) bei der Plaquebildung: adoptive Übertragung von Anti-MOG-Antikörpern bei
nicht demyelinisierender MBP-EAE reproduziert eine voll entwickelte
MS-ähnliche
Symptomatik.
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Die
hoch immunogenen Eigenschaften von MOG (< 0,05 % des gesamten Myelinproteins)
können
mit seinem extrazellulären
Standort auf den äußersten
Lamellen der Myelinscheide zusammenhängen, wo es dem pathogenen
Antkörper
in dem Kontext einer Störung
der Blut-Hirn-Schranke durch enzephalitogene T-Zellen zugänglich ist.
Das C. jacchus-Modell erlaubt präzise
Identifizierung zellulärer und
humoraler Immunreaktionen, die zu einer MS-Läsion bei einer Art mit Immun-
und Nervensystemgenen führen,
die zu Menschen 90-95 % homolog sind. Die Relevanz dieses Modells
für MS
bei Menschen wird durch die kürzliche
Erkenntnis über starke
T-Zell- und Antikörperreaktionen
auf MOG bei MS-Patienten hervorgehoben.
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WO
95/07096 offenbart Verfahren zum Behandeln von MS unter Verwendung
von MOG.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung stellt die Verwendung eines Myelin-Oligodendrozyt-Glykoprotein(MOG)-Polypeptid-spezifischen
Antikörperfragments,
das keinen funktionellen Fc-Abschnitt aufweist, für die Herstellung
eines Medikaments zur Inhibierung einer Demyelinisierung, welche
mit der Bindung eines Autoantikörpers
an ein MOG-Polypeptid verbunden ist, durch das Verabreichen des
Antikörperfragments
an einen Wirt, der für
eine pathogene Bindung zwischen MOG-Polypeptid und Autoantikörper anfällig ist,
bereit.
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Das
Medikament kann ferner ein MOG-tolerogenes T-Zell-Epitop beinhalten.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich somit auf die Inhibierung einer
pathogenen Bindung eines Autoantikörpers an ein Autoantigen, wobei
die Bindung zwischen Autoantigen und Autoantikörper mit einer demyelinisierenden
Krankheit des zentralen oder peripheren Nervensystems verbunden
ist. In einer besonderen Ausführungsform
ist die Krankheit mit einer pathogenen Autoantikörperbindung, wie etwa MS, Lupus,
Arthritis oder Diabetes verbunden. In genaueren Ausführungsformen
ist das Autoantigen ein MOG-Autoantigen, und das Fragment ist ein F(ab')2-Fragment.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Inhibieren der mit der Bindung
eines Autoantikörpers
an ein MOG-Polypeptid verbundenen Symptomatik, wie sie bei MS auftritt.
Dies beinhaltet das Verabreichen einer effektiven Menge einer Zusammensetzung,
die ein MOG-Polypeptid-spezifisches Antikörperfragment beinhaltet, das
keinen funktionellen Fc-Abschnitt aufweist und ausreicht, um das MOG-Polypeptid
spezifisch zu binden und die Bindung des Autoantikörpers an
das MOG-Polypeptid kompetitiv zu inhibieren, an einen Wirt, der
für eine pathogene
Bindung zwischen MOG-Polypeptid
und Autoantikörper
anfällig
ist, wodurch die Symptomatik inhibiert wird. In einer besonderen
Ausführungsform wird
das Fragment aus der Gruppe, bestehend aus Fv, F(ab')2,
F(ab), F(ab)2 und Fragmenten davon, ausgewählt.
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Die
Zusammensetzungen umfassen pharmazeutische Zusammensetzungen, die
ein MOG-Polypeptid-spezifisches Antikörperfragment beinhalten, das
ausreicht, um ein natürliches MOG-Polypeptid
spezifisch zu binden und die Bindung eines Antikörpers an das MOG-Polypeptid kompetitiv
zu inhibieren, wobei das Fragment keinen funktionellen Fc-Abschnitt
beinhaltet, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Die
Zusammensetzungen können
ebenfalls ein MOG-tolerogenes T-Zell-Epitop beinhalten, das Toleranz
hervorruft und synergistisch mit dem Antikörperfragment wirkt, um die
Symptomatik zu inhibieren.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Antikörper" auf rekombinierte Immunproteine wie etwa
T-Zell-Antigen-Rezeptoren und Immunoglobuline, wie auch auf chimäre, humanisierte
oder andere rekombinante Antikörper.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Antikörperfragment" auf Fragmente von
Antikörpern
wie etwa Fab, Fab',
F(ab)2, F(ab')2 und Fv oder
jede beliebige Kombination davon. Fv und Fragmente davon können einwertig
oder zweiwertig sein. Fv ist auf dem Stand der Technik ebenfalls
als ein minimales Antikörperfragment
bekannt. Verfahren zur Fertigung von Antikörperfragmenten, insbesondere
F(ab'), sind auf
dem Stand der Technik bekannt. (Siehe zum Beispiel Harlow und Lane,
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
New York (1988)). Zum Beispiel können
F(ab), Fv usw. ebenfalls durch rekombinante Technologie produziert
werden.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich „andere als natürliche MOG-angrenzende Reste
von Menschen oder Weißbüscheläffchen" auf alles andere
als Reste, die an die erwähnten
Peptide in den arteigenen Proteinen natürlich angrenzen. Zum Beispiel
umfassen andere als natürliche
angrenzende Reste keine angrenzenden Reste oder angrenzende Reste, die
sich von dem unterscheiden, was natürlicherweise an das erwähnte Peptid
angrenzt.
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MOG
wurde ursprünglich
durch den monoklonalen Antikörper
8.18.C5 von Mäusen
identifiziert, der gegen zerebellare Glykoproteine von Ratten aufgebracht
wurde. Es handelt sich um ein in geringen Mengen vorliegendes Protein,
das lediglich 0,01 bis 0,05 % der gesamten Myelinproteine repräsentiert und
keine bekannte Funktion innerhalb des ZNS aufweist. MOG ist ein
Mitglied der Immunoglobulin(Ig)-Überfamilie
mit einer immunoglobulin-ähnlichen,
extrazellulären
Domäne,
die 121 Aminosäuren beinhaltet,
welche eine Glykosylierungsstelle (Asn in Position 31) enthalten,
und zwei hoch hydrophoben Regionen, die transmembrane Domänen repräsentieren
könnten,
für eine
Gesamtlänge
von 224 Aminosäuren.
MOG wird weitläufig
auf Oligodendrozyt-Zellkörpern
und Fortsätzen
exprimiert, vor allem auf den äußersten
Schichten der Myelinscheiden, und kann dem Antikörperangriff möglicherweise
leichter zugänglich
sein als intrazytoplasmisches MBP oder intra- und intermembranöses Proteolipidapoprotein (PLP).
Bei allen untersuchten Arten, einschließlich C. jacchus, genügt die glykosylierte,
rekombinante extrazelluläre
Domäne
von MOG (rMOG), die hoch konserviert ist, zum Sensibilisieren von
Tieren für
EAE. Wir haben minimale T-Zell- und
B-Zell-Epitope identifiziert, die die Reste 28-36, 13-21, 62-74,
27-34 oder 40-45
umfassen; natürliche
MOG-Sequenzen bei Menschen und Ratten sind auf dem Stand der Technik
bekannt; natürliches
MOG bei Weißbüscheläffchen ist
identisch mit dem von Menschen, abgesehen von den folgenden Substitutionen:
9S, 13Q, 19A, 20A, 42S, 60E, 75D, 84K, 91P, 112Q, 137F, 148Y und 151H.
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Die
Immunreaktion bei Autoimmunkrankheiten kann sowohl zelluläre als auch
humorale Komponenten besitzen. Unsere Daten zeigen an, dass die folgende
Sequenz an Vorgängen
bei der Autoimmun-Demyelinisierung
des ZNS zu einer Zerstörung von
Myelin führt:
- 1) Vakuolisierung von Myelin, die von löslichen Mediatoren
(Zytokinen, Antikörpern,
freien Radikalen) und/oder zellulärer Zytotoxizität verursacht wird.
Ein Muster eines Intramyelin-Ödems, das ähnlich diesem
ist, wurde ebenfalls zuvor in dem ZNS von Ratten beobachtet, die
mit Triethylzinnsulfat vergiftet wurden, und interessanterweise waren
diese Änderungen
umkehrbar.
- 2) Umwandlung von vakuolisiertem Myelin in Netze kleiner Vesikel,
die durch 2-3 Schichten veränderten
Myelins mit einer reduzierten Periodizität (5-6 nm) getrennt sind. Diese
drastische Umwandlung scheint mit der Ablagerung von MOG- spezifischem IgG
verbunden zu sein und antikörpervermittelte
Schäden,
möglicherweise aufgrund
einer Komplementaktivierung, oder eine durch Makrophagen, die unveränderlich
mit vesikulärer
Myelinstörung
verbunden sind, vermittelte antikörperabhängige Zytotoxizität, zu reflektieren. Es
ist anzunehmen, dass die anfängliche
vakuoläre
Läsion
die Myelin-Membranen zugänglich
zu einem Angriff durch Autoantikörper
macht.
- 3) Aktivierung von Makrophagen, die zu rezeptorvermittelter
Phagozytose der blasigen nekrotischen Myelin-Zelltrümmer führt. Dieser
Mechanismus wurde zuvor bei MS und bei EAE demonstriert, wobei IgG
als ein Ligand zwischen den nekrotischen Myelin-Zelltrümmern und
den Fc-Rezeptoren in clathrinbeschichteten Vertiefungen auf der
Oberfläche
der Makrophagen gedient hat. Diese Stufe der Läsionspathogenese kann unabhängig von
der Spezifität
der Antikörper
sein, obwohl sie antikörpervermittelt
ist.
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Wie
gerade oben umrissen, ist zum Beispiel die entzündliche Komponente bei MS T-zellvermittelt, während die
demyelinisierende Komponente B-zellvermittelt zu sein scheint. Somit
sollten sich effektive Behandlungen gegen beide Komponenten richten.
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Zusammensetzungen,
die die immundominanten Epitope von MOG beinhalten, werden beschrieben.
Die Aufhebung der peripheren T-Zell-Reaktion
durch ein Tolerisierungsprotokoll an dem extrazellulären Abschnitt
von rekombinantem MOG (aa 1-125) (rMOG; rMOG beinhaltet die Reste
1-125 des extrazellulären
Aminoterminus von MOG, der durch MRGS an dem NH2-Terminus
ausgedehnt ist, und ASES(H)6 an den COOH-Terminus)
stellt die Basis für
die epitopabgeleiteten Peptidzusammensetzungen bereit. Das Mapping
der kritischen MOG-Epitope (einschließlich 26-38 und 64-72) wurde
durch Klonen von T-Zellen von rMOG-immunisierten Tieren und durch
Analysieren von T-Zell- und Antikörperreaktionen auf kurze Peptide
von MOG bei rMOG-immunisierten Weißbüscheläffchen erreicht.
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Das
Mapping der Antikörperreaktion
auf MOG bei C. jacchus zeigt eine eingeschränkte Heterogenität an Epitop-Erkennung
durch Antikörper
an. Wir haben unter Verwendung linearer Peptide Regionen von MOG
identifiziert, an die sich demyelinisierende Antikörper anhaften.
Die arteigenen polyklonalen Serumantikörper bei rMOG-immunisierten
Weißbüscheläffchen werden
gegen 4 diskrete Epitope entlang der Aminosäuresequenz aa 13-21, 28-34, 40-45, 65-74 oder kürzerer Sequenzen,
von denen die meisten artenübergreifende
konservierte Sequenzen sind, geleitet. Diese Peptide unterscheiden sich
von denen, die bislang als Antikörper-Epitope bei Nagetieren
(aa 35-55) identifiziert wurden, sie binden sich jedoch an Antikörper, die
innerhalb des Netzes blasigen Myelins bei akuten Läsionen von
MS beim Menschen gegenwärtig
sind, wie in den Beispielen unten gezeigt. Da die meisten Antikörper im Allgemeinen
diskontinuierliche Epitope auf Proteinen erkennen, stellt unsere
Analyse-Methodologie die Kenntnis der Struktur von MOG bereit, die
benötigt wird,
um das antigene Repertoire von demyeliniesierenden Antikörpern bei
dem C. jacchus und bei Menschen vollständig zu definieren. Kombinatorische
Bibliotheken wurden dann gefertigt, um F(ab')2-Fragmente
mit hoher Affinität
zu MOG zu erzeugen, die die Fähigkeit
besitzen, mit pathogenem IgG zu konkurrieren und komplementvermittelte
und antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität zu inhibieren.
Diese F(ab')2-Fragmente wurden alleine und in Kombination
mit T-zelltolerogenen Peptiden auf ihre Fähigkeit untersucht, die Krankheit
bei C. jacchus zu verhindern und zu behandeln.
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Ein
kürzlich
identifizierter Patient mit einer fortschreitenden Rückenmarkserkrankung
in Verbindung mit einer monoklonalen IgG-Gammopathie, die auf MOG reagiert, bot
ein einzigartiges Beispiel der pathophysiologischen Konsequenzen
einer Anti-MOG-Antikörperreaktion
in einem natürlichen
Experiment. Der menschliche monoklonale Antikörper wurde adoptiv auf einen
C. jacchus mit nicht demyelinisierender EAE übertragen. Im Anschluss an
die adoptive Übertragung
entwickelte das Weißbüscheläffchen eine
Demyelinisierung. Die Übertragung
von menschlichem IgG bei dieser Art wird gut toleriert, und die
Blockier-Fähigkeit
von F(ab')2-Fragmenten wird
in dem adoptiven Übertragungssystem
demonstriert. Die Antikörperfragmente
bewahren ihre Fähigkeit,
antigene Epitope zu erkennen, besitzen jedoch nicht die Fähigkeit,
das Komplement zu aktivieren oder Makrophagen zu binden, sie umhüllen das
Autoantigen, so dass die endogenen Autoantikörper unfähig sind, eine pathologische
Ebene zu binden.
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Bei
der Vorbereitung der pharmazeutischen Zusammensetzungen kann eine
Vielfalt von Arzneiträgern
und Bindemitteln und Verabreichungsrouten verwendet werden, wie
dem erfahrenen Fachmann ersichtlich sein wird. Repräsentative
Formulierungstechnologie wird inter alia in Remington: The Science and
Practice of Pharmacy, 19. Auflage, Mack Publishing Co., Easton,
Pennsylvania, 1995; z. B. Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,
9. Auflage, 1996, McGraw-Hill gelehrt.
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Beispiele
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Die
folgenden Beispiele werden geboten, um diese Erfindung darzustellen,
und sollten nicht so ausgelegt werden, dass sie den Bereich dieser
Erfindung einschränken.
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Wir
zeigen, dass Antikörper
gegen MOG, die eine Demyelinisierung bei Weißbüscheläffchen verursachen, chemisch
modifiziert und als therapeutische Werkzeuge verwendet werden können, um
die Bindung eines pathogenen Antikörpers aus dem wirklichen Leben
kompetitiv zu blockieren. Dies wird durch enzymatische Verdauung
erreicht, z. B. mit Pepsin, das den intakten Antikörper in
eine großes Fragment
(F[ab']2),
welches die Stellen enthält,
die sich an das Zielantigen (MOG) binden, und kleinere Fragmente,
die den Fc-Abschnitt,
einen Abschnitt von Antikörpern,
der dafür
bekannt ist, dass er Rezeptoren für Systeme wie etwa Komplement
und Makrophagen enthält
(ebenfalls dafür
bekannt, viele pathogene oder zytotoxische Eigenschaften von Antikörpern zu
vermitteln) umfassen, spaltet. Somit bewahrt das F(ab')2 die
Kapazität,
sich an MOG in dem Gehirn zu binden, ist aber ohne Kapazität, Komplement
oder Makrophagen mit Fc zu aktivieren, und verbirgt MOG, das andernfalls
von den pathogenen Antikörpern
erkannt wird. In einem besonderen Beispiel wurde ein Paar Weißbüscheläffchen zuerst
mit MBP (nicht demyelinisierend) für EAE sensibilisiert, dann
wurden beiden intravenöse
demyelinisierende Antikörper
(monoklonale 8.18.C5 von Mäusen)
gegen MOG gegeben. Gleichzeitig erhielt ein Tier (Kontrolle) eine
Placebo-F(ab')2-Injektion, und das andere erhielt F(ab')2-Fragmente,
die aus demselben demyelinisierenden Antikörper zubereitet wurden. Das Kontrolltier
zeigte eine Verschlimmerung der klinischen Befunde von EAE, und
das experimentelle Tier tat dies nicht. Die Tiere wurden 3-5 Tage
später
gopfert und die Gewebestruktur des Gehirns und des Rückenmarks
eingeholt. Das Kontrolltier wies Anzeichen für demyelinisierende Läsionen auf,
und das experimentelle Tier wies Läsionen mit Entzündung (zelluläre Infiltration),
aber keine Demyelinisierung (keine Myelin-Zerstörung) auf. Dieses Experiment
zeigt, dass Weißbüscheläffchen durch
MOG-spezifische F(ab')2-Fragmente
vor antikörpervermittelter
Demyelinisierung geschützt
werden können.
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Komplementäre Experimente
des oben Genannten zeigen an, dass ein derartiges therapeutisches
Prinzip von F(ab')2- oder F(ab')-Fragmenten
für MS
bei Menschen oder ähnliche
Erkrankungen hilfreich sein könnte:
Antikörper
gegen MOG sind innig mit aktiven Läsionen von MS verbunden, wo
morphologische Anzeichen für
die laufende Zersetzung von Mylin (siehe „Identifizierung von Autoantikörpern, die mit
Demyelinisierung bei multipler Sklerose verbunden ist" unten) vorhanden
sind. In dieser Arbeit werden die Epitope von MOG, die von Weißbüscheläffchen erkannt
werden, zum ersten Mal offenbart, und diese Information wird verwendet,
um Goldkonjugate als Immunsonden zu konstruieren, um die Gegenwart
von MOG-spezifischen Autoantikörpern
in sowohl Primaten-Geweben als auch menschlichen Geweben zu identifizieren.
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Induktion
von EAE bei Weißbüscheläffchen. EAE
wurde in Weißbüscheläffchen induziert
wie von Genain et al. (1999) Nature Medicine 5, 170-175 beschrieben.
Sechs Weißbüscheläffchen wurden
aktiv mit 50 bis 100 μg
von rekombinantem Ratten-MOG sensibilisiert, das in 100 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufgelöst und mit
einem gleich großen
Volumen an komplettem Freund-Adjuvans (CFA), das 3 mg/ml abgetötetes Mycobacterium tuberculosis
(h37Ra; DIFCO, Detroit, Michigan) enthielt, emulgiert wurde. Die
MOG/CFA-Emulsion wurde mit einem Gesamtvolumen von 0,2 ml an vier
Injektionsstellen intradermal in die Skapula- und Hüftregionen
gegeben. An dem Tag der Immunisierung mit MOG/CFA wurden 1 × 1010 inaktivierte Bordetella pertussis-Organismen
in 2,5 ml isotonischer Kochsalzlösung
intravenös
gegeben, und die Dosis wurde 2 Tage später wiederholt. Zum Vergleich
wurden 4 Weißbüscheläffchen,
die mit 200 mg ganzer weißer Hirn-
und Rückenmarkssubstanz
(WM)/CFA und B. pertussis sensibilisiert wurden, zwischen 18 und
39 Tagen nach der Immunisierung untersucht. MOG-sensibilisierte
Weißbüscheläffchen wurden
für bis
zu 93 Tage nach der Immunisierung behalten. Tiere, die entweder
mit WM oder mit MOG sensibilisiert wurden, zeigten innerhalb von
21 Tagen Immunisierung Zeichen von EAE auf. Die Tiere wurden durch intrakardiale
Perfusion unter tiefer Anästhesie
18 bis 93 nach der Immunisierung geopfert.
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MS-Gewebe
von Menschen. Menschliche ZNS-Gewebe wurden von 3 Testpersonen mit
MS durch Biopsie oder Autopsie (8 Wochen, 11 Jahre und 17 Jahre
nach der Diagnose) erhalten. Patient 1 war eine 18-jährige weiße Frau
mit einer 3-monatigen Vorgeschichte sich akut entwickelnder rechtsseitiger Hemiplegie,
Sinnesverlust und Spastik. Eine computertomographische Abtastung
deckte WM-Hypodensität
in der linken parieto-okzipitalen Region auf. Eine Gehirn-Biopsie
wurde für
die neuropathologische Evaluierung durchgeführt. Die resultierende Diagnose
waren aktiv demyeliniesierende, entzündliche, ödematöse
Läsionen
kürzlichen
Ursprungs, typisch bei fulminanten, entzündlichen demyelinisierenden Leiden,
entsprechend akuter MS.
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Patient
2 war eine 31-jährige
weiße
Frau mit einer 8-jährigen
Vorgeschichte chronischer fortschreitender MS, gekennzeichnet durch
Taubheit und Schwäche
der Glieder, Gangstörung,
Harninkontinenz, Tremor, Nystagmus und verschwommenes Sehvermögen. Schlussendlich
war die Patientin an den Rollstuhl gebunden, entwickelte Anfälle und
Aspirationspneumonie und starb. Eine Autopsie wurde innerhalb von
1,5 Stunden post mortem durchgeführt.
Eine neuropathologische Untersuchung deckte eine Dominanz kleiner
(3-5 mm), verbreiteter, kürzlicher,
intensiv entzündeter, ödematöser, demyelinisierender
Läsionen
sowie großer,
etablierterer Plaques mit fibröser
Astrogliose und gut demarkierten Grenzlinien auf.
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Patient
3 war eine 34-jährige
weiße
Frau mit einer Vorgeschichte von rezidivierender remittierender
MS für
10 Jahre nach der anfänglichen
Diagnose im Alter von 20. Die Krankheit trat während der letzten 7 Jahre ihres
Lebens in einen chronischen fortschreitenden Verlauf. Zu dem Zeitpunkt
ihres Todes wies die Patientin bilaterale Optikusatrophie, internukleäre Ophthalmoplegie,
spastische Paraparese und gemäßigte Gliedataxie
auf. Die Todesursache war Atmungsversagen. Eine Autopsie wurde 4
Stunden post mortem durchgeführt.
Die Neuropathologie dieses Falls deckte intensiv entzündliche, ödematöse, aktiv
demyelinisierende Läsionen
kürzlichen
Ursprungs sowie aktive chronisch demyelinisierte Läsionen auf.
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Gewebevorbereitung
zur Analyse. Zu der Zeit der Probenahme wurden Tiere unter Pentobarbitalanästhesie
durch intrakardiale Perfusion mit 200 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung, gefolgt
von 150 bis 200 ml kaltem PO4-gepuffertem
2,5-prozentigem Glutaraldehyd geopfert. Zwei MOG-sensibilisierte
Weißbüscheläffchen wurden
während
der akuten Phase der Krankheit (14-16 Tage nach der Immunisierung)
erprobt, 3 wurden nach der akuten Phase, entweder während der
Rezidive oder der Remission (23, 25 und 27 Tage nach der Immunisierung)
genommen, und 1 wurde nach zwei Rezidiven 93 Tage nach der Immunisierung
untersucht. Die 4 mit ganzem WM sensibilisierten Tiere wurden 18,
30, 30 und 39 Tage nach der Immunisierung nach akutem Ausbruch,
aber vor dem Rezidiv untersucht. Aus den glutaraldehydperfundierten
Tieren wurde das ZNS entnommen und eine routinemäßige Neuropathologie auf mit
Formalin nachfixiertem, paraffineingebettem Material durchgeführt, das
mit Hematoxylin und Eosin, Lusol Fast Blue (für Myelin) und der Versilberungstechnik
nach Bodian (für
Axone) gefärbt
war.
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Für eine Analyse
der Feinstruktur von Weißbüscheläffchen-Geweben
wurden 1-mm-Scheiben aus dem Sehnerv, den Gehirnhälften, dem
Kleinhirn, dem Gehirnstamm, dem Knochenmark und dem Rückenmark
bei C7, T3, L2, L5, L6 und L7 entnommen. Zusätzlich dazu wurden Proben aus
den Rückenmarksnervenwurzeln
und den Ischiasnerven genommen. Die Scheiben des glutaraldehydfixierten
Gehirngewebes wurden zu flachen Rechtecken (~ 4 × 6 mm) zurechtgeschnitten,
und das Rückenmark
wurde in ganzen Scheiben belassen. Aus den 3 Fällen von MS, die in Beispiel
2 beschrieben wurden, wurden kleine Stücke von Biopsie-Gewebe oder
Scheiben von autopsiertem ZNS-Material, 3 bis 5 mm dick, 4 bis 24
Stunden lang bei 4 °C
immersionsfixiert, dann in dünne
1-mm-Scheiben auf 3 bis 5 mm Durchmesser geschnitten. Glutaraldehydfixierte
Gewebe wurden dann in PO4-gepuffertem 1-prozentigem OsO4 1 Std lang auf Eis nachfixiert. Die Proben
wurden entwässert,
in Propylenoxid gereinigt und flach in Epoxidharz eingebettet. Dünne (1 μm) Teilabschnitte von
epoxid-eingebettetem Gewebe wurden für eine Licht-Mikroskopie (LM)
zubereitet und mit Toluidinblau gefärbt oder für die Immunocytochemie zur
Reaktion gebracht. Für
die Elektronenmikroskopie (EM) wurden Teilabschnitte auf Kupfergittern
platziert, mit Blei- und Uransalzen (Bleizitrat und Uranylazetat) kontrastiert,
mit Kohlenstoff beschichtet und in einem Siemens 101 oder Hitachi
H 600-S abgetastet.
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Ultrastrukturelle
Muster von Demyelinisierung sind bei C. jacchus-EAE und bei akuten MS-Plaques identisch.
ZNS-Gewebe von 6 C. jacchus-Pinseläffchen mit MOG-induzierter
EAE und von 3 menschlichen Testpersonen mit MS, die alle akute Läsionen zeigten,
wurden durch Elektronenmikroskopie (EM) untersucht. Bei Weißbüscheläffchen-EAE
waren große
demyelinisierte Plaques bis zu einigen mm Durchmesser im ganzen
ZNS verteilt, immer auf Venulen zentriert und durch perivaskuläre Entzündung und
einen hervortretenden Rand, entlang dem viele myelinisierte Nervenfasern
vakuolisierte Myelinscheiden aufzeigten, gekennzeichnet. Dieses
typische Muster einer Myelinvakuolisierung resultierte aus der Erweiterung
individueller Myelinscheiden aufgrund interlamellarer Spaltung und Schwellung,
wobei das Axon zu einer Seite, die von einigen Schichten intakten
Myelins umgeben war, versetzt war. Mikrographische Darstellungen,
die den Sehnerv eines Tieres mit akuter EAE, die durch Immunisierung
mit 50 μm
von rekombinatem Ratten-MOG in dem Adjuvans induziert wurde, das
3 Tage nach Beginn klinischer Befunde geopfert wurde, zeigen, demonstrierten
die Gegenwart großer
Intramyelin-Vakuolen an dem Perimeter einer demyelinisierten Läsion, wobei
die Axone andernorts von normal erscheinenden Myelinscheiden umgeben
waren.
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Zwischen
dem Läsionszentrum
und dem Rand war eine breite Zone von Demyelinisierung, die mit
nekrotischen Myelin-Zelltrümmern
beladene Makrophagen enthielt. Die auffälligste Erkenntnis war die
Gegenwart großer
Anzahlen an Axonen innerhalb der demyelinisierten Zone, die von
Aggregaten zerstörten
Myelins umgeben waren, das als ein erweitertes Netz neu angeordnet
war. Diese Axone wurden lateral versetzt, als das Membrannetz allmählich von dem
Axon dissoziiert und von den anrenzenden Makrophagen aufgenommen
wurde.
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Die
Demyelinisierung von Fasern bei akuter MS war mit der, die bei der
Weißbüscheläffchen-EAE gesehen
wurde, strukturell identisch, wobei das demyelinisierte Axon innerhalb
eines Membrannetzes von Myelin lag. Andernorts in dem ödematösen Parenchym
kamen frei schwebende Aggregate von nekrotischen Myelin-Zelltrümmern häufug vor.
Elektronenmikroaufnahmen von Gewebe, das aus einer Biopsie der subkortikalen
weißen
Hirn- und Rückenmarkssubstanz
einer 18-jährigen
Patientin mit einer 8-wöchigen
Vorgeschichte neurologischer Anzeichen, Hypodensität von weißer Hirn-
und Rückenmarkssubstanz
auf einem MRI-Bild und eine Diagnose akuter MS genommen wurde, zeigten
Myelin um Axone, die in ein vesikuläres Netz, ähnlich dem oben beschriebenen,
transformiert waren. Fibröse
Astrogliafortsätze,
nackte Axone und eine reaktive amöboide Mikroglia-Zelle (unten)
wurden ebenfalls identifiziert. Eine hochauflösende Analyse der Myelinnetze bei
sowohl Weißbüscheläffchen-EAE
als auch menschlicher MS deckte Vesikel auf, die im Vergleich zu
intaktem Myelin in normalem Gewebe von 2 oder 3 Schichten lose verdichteter
Membranen mit einer reduzierten Periodizität (5-6 nm) umgeben waren.
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MOG-spezifische
Autoantikörper
sind bei der C. jacchus-EAE-Läsion
mit Myelin-Vesikulation verbunden. MOG ist ein in geringen Mengen
vorliegendes Myelinprotein (weniger als 0,05 % des totalen Myelinproteins)
mit einer immunoglobulin(Ig)-ähnlichen
extrazellulären
Domäne,
die in Fülle
auf der äußersten
Schicht der Myelinscheiden exprimiert wird, was sie Antikörperangriffen
zugänglich
machen kann. Obwohl gezeigt wurde, dass Autoantikörper gegen
MOG Demyelinisierung bei einigen EAE-Modellen steigern, wurden die detaillierten
Wechselwirkungen zwischen diesen Antikörpern und Myelinmembranen nicht
erforscht. Um diese Bindungsstellen von Autoantikörpern innerhalb
demyelinisierender Läsionen
zu identifizieren, haben wir an gefrorenem und epoxideingebettetem
Weißbüscheläffchen-ZNS-Gewebe mit goldmarkiertem
anti-menschlichem IgG-Antikörper
(kreuzreaktiv mit Weißbüscheläffchen-IgG)
gefolgt von Silberverstärkung
Immunocytochemie durchgeführt.
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Zur
Demonstration antigen-spezifischer Autoantikörper bei Weißbüscheläffchen-
und menschlichem MS-Gewebe in situ wurde eine Auswahl an myelin-bezogenen
und Kontrollpeptiden direkt an Immunogold gekoppelt und auf Gewebeteilabschnitte
aufgetragen. Immunogoldmarkierung wurde auf ultradünnen Teilabschnitten
gefrorener oder fixierter Gewebe durchgeführt. Goldkonjugate wurden aus
(1) drei MOG-Peptiden (Aminosäuren
[aa] 1-20, aa 21-40 und aa 41-60 von menschlichem MOG) mit bekannter
enzephalitogener Aktivität
bei Weißbüscheläffchen;
(2) einem MOG-Peptid,
das sich als nicht enzephalitogen bei Weißbüscheläffchen erwies (aa 101-120);
(3) einem menschlichen Myelinbasisprotein(MBP)-Peptid (aa 82-101),
das enzephalitogen bei Weißbüscheläffchen und
immundominant bei Menschen mit dem DR2-Haplotyp ist; und zur Kontrolle (4)
einem Peptid eines Serumalbumins der Maus (MSA; aa 560-574) zubereitet.
Peptide, die menschliche MOG-Subsequenzen aufwiesen, wurden unter Verwendung
der Standard-Fmoc-Chemie synthetisiert und durch HPLC (Research
Genetics Inc., Huntsville, Alabama) gereinigt (> 95 %): MOG 1-20, MOG 21-40, MOG 61-80,
MBP 82-101 und MSA 560-574. Die Goldkonjugate wurden unter Verwendung
eines Monosulfo-N-Hydroxysuccinimid-Nanogold-markierenden
Reagens (Partikeldurchmesser 1,4 nm) gemäß den Anweisungen des Herstellers (Nanoprobes,
Stonybrook, New York) synthetisiert, gefolgt von einer umfangreichen
Dialyse, um nicht umgesetzte Peptide zu entnehmen. Immunreaktivität wurde
auf 1-μm-Epoxidteilabschnitten
des Rückenmarksgewebes
von Weißbüscheläffchen und
aktiven MS-Läsionen
nachgewiesen. Dafür
wurden Teilabschnitte mit Natriumethylat geätzt, in PO4-gepufferter Kochsalzlösung, die
0,05 % Triton X-100 enthielt, equilibriert und mit 10 % normalem
Kaninchenserum blockiert. Die Teilabschnitte wurden mit Peptid-Immunogoldkonjugaten
(1:100 in Puffer) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach
dem Waschen wurde der Nachweis durch Verwendung von Silberverstärkung (Nanoprobes)
durchgeführt.
Die Teilabschnitte wurden mit Toluidinblau gegengefärbt. Für den Nachweis
von IgG wurden die Teilabschnitte mit goldmarkiertem anti-affen-
oder antimenschlichem IgG (Nanoprobes) bei 1:100 zur Reaktion gebracht.
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Als
Kontrollen wurden Teilabschnitte entweder mit unmarkierten enzephalitogenen
MOG-Peptiden oder MBP vorbehandelt, um die Reaktion zu blockieren,
mit unmarkierten nicht enzephalitogenen MOG-Peptiden (aa 101-120)
vor dem Auftragen der Goldkonjugate zur Reaktion gebracht oder mit
goldmarkierten irrelevanten Antigenen (Histone oder MSA) oder irrelevantem
IgG (anti-Ziege) behandelt. Die Spezifität des Markierens mit den Goldkonjugaten
enzephalitogener MOG-Peptide wurde ebenfalls in Westernblots bewertet,
wobei das MOG-Protein zuerst mit immunem Weißbüscheläffchenserum zur Reaktion gebracht
wurde. Vollständige
Details der Versuchs- und Kontrollreagenzien, die verwendet werden,
um die Spezifität
der Immunreaktivität
zu bestimmen, können
in Genain et al., Nature Med. 5: 170-175 (1999) gefunden werden.
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Teilabschnitte
aus der Lumbalregion des Rückenmarks
der Tiere wurden eingeholt. Die positive Reaktivität (braune
Färbung)
von blasigem Myelin um Axone (Pfeile) zeigten die Gegenwart von
IgG an. Nicht demyelinisierende Axone wurden nicht gefärbt. Positive
Reaktivität
für IgG
wurde spezifisch über
den blasigen Netzen von zerstörtem
Myelin, das die Axone umgab, gefunden.
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Im
Anschluss daran identifizierten wir die Zielantigene, die von diesen
Immunoglobulinen gebunden wurden, durch das Auftragen von immunogoldmarkierten
Konjugaten ausgewählter
Peptide von MOG und Myelinbasisprotein (MBP). Diese Myelinantigene
wurden direkt mit den Goldpartikeln auf ihren primären NH2-Resten markiert und wurden verwendet, um
antigenspezifische Autoantikörper
in situ nachzuweisen. Mit dieser Technik wurden drei separate goldkonjugierte
Peptide von MOG über
die Netze von integrierenden Myelinscheiden in einem Muster ähnlich dem,
dass für
goldkonjugiertes Anti-IgG beobachtet wurde, co-lokalisiert.
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Diese
Peptide enthielten die Aminosäuresequenzen
von MOG, die von demyelinisierenden Antikörpern, die sich in dem Serum
von MOG-immunisierten Weißbüscheläffchen (aa
1-20, aa 21-40 und aa 61-80) entwickeln, erkannt werden. Das verwendete
goldkonjugierte MOG-Peptid (aa 21-40) weist eine Sequenz auf, die
artübergreifend
konserviert ist. MOG-reaktive Tröpfchen
wurden ebenfalls in umgebenden Makrophagen gesehen, wobei sie die
Gegenwart von internalisierten nekrotischen Myelin-Zelltrümmern anzeigen,
an die der Anti-MOG-Antikörper
gebunden wurde. Positive Reaktivität mit dem markierten Antigen
zeigte die Gegenwart des MOG-spezifischen Antikörpers in situ auf vesikulärem Myelin
um Axone und auf nekrotischen Myelin-Zelltrümmern innerhalb des extrazellulären Raumes
und der Makrophagen an. Normales Myelin (um die Mehrheit der Fasern)
wurde nicht gefärbt.
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Im
Gegensatz dazu haben goldmarkierte Konjugate eines Peptids, das
ein immundominantes Epitop von menschlichem MBP (aa 82-101, bei Primaten
artenübergreifend
konserviert), und eines Kontrollpeptids eines Serumalbumins der
Maus (MSA, aa 560-574) enthält,
Myelinmambranen oder Makrophagen nicht markiert. Somit sind die
blasigen Myelinnetze weder durch das goldkonjugierte Peptid von
MBP noch durch das goldkonjugierte Peptid von MSA gefärbt (Pfeile).
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Diese
Beobachtungen demonstrieren bei diesem Modell von EAE eines nicht
menschlichen Primaten, dass Antikörper, die spezifisch für MOG sind,
in direktem Kontakt mit den sich zersetzenden Myelinmembranen stehen,
und zeigen an, dass die Bildung der blasigen membranösen Netze
von einem lytischen Angriff durch diese Autoantikörper herrührt.
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MOG-spezifische
Autoantikörper
sind mit Myelin-Vesikulation bei Läsionen von akuter MS bei Menschen
verbunden. Im Anschluss daran erforschten wir mit ähnlichem
Immunogoldmarkieren die Gegenwart von MOG- und MBP-spezifischen
Autoantikörpern
im ZNS-Gewebe, das bei einer Biopsie oder Autopsie von Patienten
mit MS erhalten wurde. Wie bei der Weißbüscheläffchen-EAE markierte goldkonjugiertes
Anti-IgG die mambranösen
Myelinnetze um einzelne demyelinisierende Axone, zusammen mit Tröpfchen nekrotischer
Myelin-Zelltrümmer,
die durch das Paremchym verstreut sind. IgG ist entlang der zersetzten
Myelinscheide eines Axons (Pfeil), das im Längsschnitt geschnitten ist,
lokalisiert; (as), Zytoplasma eines hypertrophierten Astrozyten,
(ol), tangentialen Teilabschnitt eines Oligodendrozyten. Dicht gefärbte, IgG-beschichtete
nekrotische Myelin-Zelltrümmer
sind in dem Parenchym und in 3 Makrophagen (wahrscheinlich amöboide Mikroglia) sichtbar.
Zusätzlich
dazu zeigten gelegentliche Plasmazellen positives Färben durch
Anti-IgG. Mit den immunogoldmarkierten Myelinantigen-Konjugaten wurden
blasige Myelinnetze intensiv durch goldkonjugierte MOG-Peptide im
mit geringeren Ausmaß durch
goldkonjugierte MBP, aber nicht durch MSA gefärbt.
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IgG-Myelin-Komplexe,
die mit Goldkonjugaten von MOG und MBP markiert wurden, waren ebenfalls
in Makrophagen, aber nicht in Astrozyten oder Oligodendrozyten gegenwärtig. Es
wurden keine MOG- oder MBP-markierten Plasmazellen angetroffen.
Eine Reaktivität
bei Goldkonjugaten wurde nicht bei normal erscheinender weißer MS-Hirn-
und Rückenmarkssubstanz
oder um perivaskuläre
entzündliche
Manschetten beobachtet. Bei Weißbüscheläffchen,
die gegen Gesamtmyelin immunisiert wurden, wurde ein ähnliches
Muster von sowohl Anti-MOG- als auch Anti-MBP-Ig-Ablagerung beobachtet.
ZNS-Gewebe von amyotrophischer Lateralsklerose, einer anderen neurologischen
Erkrankung, die mit Schäden
an der weißen Hirn-
und Rückenmarkssubstanz
und Makrophagenaktivität
verbunden ist, zeigte keine myelinantigenspezifische Immunogoldreaktivität. Diese
Erkenntnisse identifizieren direkt MOG-spezifische Antikörper in aktiv demyelinisierenden
Läsionen
von MS bei Menschen, wobei sie anzeigen, dass, wie bei MOG-induzierter
EAE, diese Autoantikörper
bei der Bildung kleiner Vesikel in den zersetzten Myelinscheiden
eine kausale Rolle spielen. Das lösliche Ig und das Ig der B-Zell-Oberfläche mit
Anti-MBP-Spezifität
wurden in MS-Gehirngewebe beschrieben, und in der aktuellen Studie
wurde MBP-spezifisches Ig innerhalb der blasigen Myelinnetze in
MS-Läsionen lokalisiert.
Obwohl experimentell nicht gezeigt wurde, dass Anti-MBP-Antikörper die
demyelinisierende Symptomatik einleiten, können diese Autoantikörper separate
pathogene Mechanismen wie etwa rezeptorvermittelte Phagozytose durch
Makrophagen und/oder die Präsentation von
Myelinautoantigenen zu spezifischen T-Zellen vermitteln.
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Es
ist bemerkenswert, dass Autoantikörper ausschließlich an
die kleinen Vesikel, die das Stadium vollständiger Zersetzung der Myelinmembranen kennzeichnen,
und an die nekrotischen Myelin-Zelltrümmer, die
in dem extrazellulären
Raum oder in phagozytischen Zellen gegenwärtig sind, gebunden zu sein
scheinen. Interessanterweise wurde in früheren Studien über EAE
bei Nagetieren eine ähnliche, aber
weniger umfangreiche Vesikulation von Myelin festgestellt, wobei
dies dort als ein vorrübergehendes frühes Phänomen perzipiert
wurde. Bei dem Weißbüscheläffchen,
bei dem Läsionsformation
langwierig ist und sich stets ausdehnt, wurde das zerstörte Myelin
jedoch immer wieder gefunden. Die Vakuolisierung von Myelin in großem Maßstab an
dem Läsionsrand
unter normal myelinisierten Fasern trat in der Abwesenheit signifikanter
lokaler zellulärer
Infiltration oder IgG-Ablagerung auf und wurde ebenfalls an der Grenzlinie
aktiver MS-Läsionen
festgestellt. Diese Änderung
der Myelinstruktur könnte
von löslichen Faktoren,
die von dem Zentrum der demyelinisierenden Plaque oder von aktivierten
Gliazellen an der Grenzlinie der Läsion diffundieren, vermittelt
werden. Morphologische Änderungen,
die diesen großen
Vakuolen ähnlich
sind, wurden in myelinisierten ZNS-Kulturen festgestellt, die TNF-Alpha
ausgesetzt wurden, und einem geringeren Grad in Kulturen, die Serum
von Tieren mit EAE und von Testpersonen mit MS ausgesetzt wurden.
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Viele
der therapeutischen Ansätze,
die auf pathogene T-Zell-Reaktionen
bei EAE-Modellen abzielen, sind noch nicht in eine erfolgreiche
Behandlung von MS bei Menschen umgesetzt worden, wobei vermutlich
angeregt wird, dass andere Komponenten des Immunsystems berücksichtigt
werden müssen. B-Zell-Reaktionen
scheinen ein Schlüsselfaktor
für die
Schwere einer klinischen Krankheit und Symptomatik bei C. jacchus-EAE
zu sein. Die aktuellen Ergebnisse unterstreichen die Rolle von Autoantikörpern bei
der weit verbreiteten Zerstörung
von Myelin bei MS und heben hervor, dass bei Krankheiten, die durch
T-Zell-Reaktionen eingeleitet wurden, Antikörper gegen kritische Antigene
des Zielorgans für
die Entwicklung von unabänderlichen
Gewebeschäden essentiell
sind.
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In
vivo-Verabreichung von MOG-spezifischen F(ab')2-Fragmenten.
Weißbüscheläffchen wurde
am 0. Tag 1 mg MBP in CFA, das B. Pertussis enthielt, verabreicht,
wobei nicht demyelinisierende EAE induziert wurde. Am 21. Tag wurden
den Tieren intravenös
0,17 mmol/kg des F(ab')2 aus entweder 8.18.C5, einem monoklonalen
Maus-Anti-MOG-Antikörper,
oder einem Anti-Influenza-A-(Kontroll-)Antikörper verabreicht, dann wurden
ihnen 0,17 mmol/kg 8.18.C5-Antikörper
verabreicht, gefolgt von einer zweiten intravenösen Verabreichung des ensprechenden
F(ab')2 für zwei Stunden.
Die Tiere wurden am 35. Tag eingeschläfert. Gewebeproben wurden zubereitet
wie in Beispiel 3 beschrieben. Unter Verwendung einer hochauflösenden Mikroskopie
und von immunogoldmarkierten Peptiden von Myelinantigenen, die fähig sind,
antigenspezifische Antikörper in
situ nachzuweisen, haben wir Autoantikörper identifiziert, die für Myelin/Oligodendrozyt-Glykoprotein (MOG)
um individuelle demyelinisierende Axone in akuten Läsionen von
sowohl MS bei Menschen als auch EAE bei Weißbüscheläffchen spezifisch sind, wobei
sie für
die Zersetzung von Myelinscheiden direkt verantwortlich zu sein
scheinen. Tiere, die mit Kontroll-F(ab')2-Fragmenten
behandelt wurden, d. h. gegen das Influenza-Antigen gerichtet, deckten
große
demyelinisierende Plaques in dem zervikalen Rückenmark auf, und mit MOG-spezifischen F(ab')2-Fragmenten
behandelte Tiere zeigten, dass die demyelinisierende Aktivität von Anti-MOG-Antikörpern bei
Weißbüscheläffchen abhängig von
intakter Frangmentfunktion ist, da sie durch Verabreichung von MOG-spezifischen
F(ab')2-Fragmenten
in vivo kompetitiv blockiert werden kann. Diese Erkenntnisse unterstreichen
die Rolle von myelinspezifischen Autoantikörpern bei der weit verbreiteten
Zerstörung
von Myelin bei MS und stellen eine Basis für eine schützende Therapie bei ZNS-demyelinisierenden
Erkrankungen bereit.
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Enzephalitogene
Epitopbestimmung (MOG) bei MS-ähnlicher
Weißbüscheläffchen-EAE.
Bei C. jacchus-Pinseläffchen
mit demyelinisierender EAE, die mit rekombinantem Ratten-MOG (rMOG:
extrazelluläre
Domäne
aa 1-125) induziert wurde, wurden die genauen Spezifitäten von
T-Zell-Reaktivität
(proliferative Reaktionen bei PBMC) und B-Zell-Reaktivität (Serumantikörper) auf
MOG unter Verwendung sich überlappender
15-mer PIN-Peptide (Verschiebungen von 1 und 3), die den Aminosäuresequenzen von
sowohl Ratten- als auch menschlichem MOG entsprechen (Chiron Mimotopes,
San Diego, Kalifornien), serienmäßig geprüft. Ergebnisse:
Alle geprüften
Tiere (n = 6) wiesen eine herausragende und anhaltende T-Zell-Reaktion
auf, die auf aa 27-36 beschränkt
ist, einer Sequenz, die artübergreifend
vollständig
konserviert ist. Ein einzelnes Weißbüscheläffchen reagierte auf ein zweites
T-Zell-Epitop, das innerhalb von aa 62-72 lokalisiert ist. Serumantikörper-Reaktionen (n = 10),
die in 4 unterschiedlichen Regionen von MOG, einschließlich 2
Hauptepitopen, aa 13-21 und aa 62-74 (100 % bzw. 60 von Tieren) und
zusätzlichen
Epitopen, abgebildet sind, wurden bei einigen Tieren (aa 28-36 und
40-45) identifiziert. Weder für
T-Zellen noch für Antikörper bei
Tieren mit rezidivierender EAE, die für bis zu 93 Tage überwacht wurden,
wurde eine Epitopausbreitung beobachtet. Schlussfolgerungen: Enzephalitogene
Reaktionen auf MOG bei MS-ähnlicher
Weißbüscheläffchen-EAE scheinen
auf eine begrenzte Anzahl an B-Zell- und T-Zell-Epitopen beschränkt zu sein.
Diese Erkenntnisse demonstrieren die Umsetzbarkeit von spezifischer
Immuntherapie für
MS bei Menschen.
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Nachweisen
von B-Zellen mit oberflächengebundenen
Antikörpern.
Frühzeitig
bei der Immunreaktion weisen B-Zellen auf ihrer Oberfläche Immunoglobuline
auf, die spezifisch mit Antigenen reagieren können. Das B-Zell-Immunoglobulin,
das mit einem Selbstantigen reagiert, kann der erste Schritt in
einer Autoimmunkrankheit sein. Somit kann einen frühzeitigen
Nachweis von Autoantikörpern
auf der Oberfläche
von B-Lymphozyten das Mittel zum Entwerfen einer Methode einer Behandlung
vor dem Ausbruch von Symptomen bereitstellen.
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B-Zellen
konstituieren ungefähr
3-5 % von Lymphozyten und wurden positiv aus frisch isolierten peripheren
mononuklearen Blutzellen (PBMC), die unter Verwendung Anti-CD-19-beschichteter
Körner von
C. jacchus-Pinseläffchen
mit MOG-induzierter EAE, von Menschen mit MS und von gesunden Kontrollen
erhalten wurden, ausgewählt.
Antikörper
für jeden
anderen geeigneten B-Zell-Marker können verwendet werden. Objektträger, die
2 × 105 B-Zellen (> 98 Reinheit) enthalten, wurden mit 1
% Glutaraldehyd fixiert und gewaschen. Alternativ dazu können nicht fixierte
Zellen verwendet werden. Die isolierten B-Zellen wurden dann mit
markierten Immunogoldkonjugaten einer Mischung von elf überlappenden 20mer-Peptiden,
die der Sequenz des NH2-Terminus von menschlichem
MOG (1-120) entsprechen, inkubiert; identische B-Zell-Präparate wurden
mit Kontroll-Polypeptiden, die der Sequenz von Histon- oder MBP-Peptiden
entsprechen, markiert. Objektträger wurden
mit Silber verstärkt,
und markierte B-Zellen wurden von zwei unterschiedlichen neutralen
Beobachtern gezählt.
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B-Zellen,
die MOG-spezifische Oberflächenimmunoglobuline
exprimieren, wurden mit goldkonjugierten MOG-Peptiden in PBMC von
MOG-immunisierten Weißbüscheläffchen (n
= 8) leicht nachgewiesen. Bei diesen Tieren, die dafür bekannt
sind, dass sie Anti-MOG-Serumantikörper entwickeln, traten zirkulierende
MOG-spezifische
B-Zellen mit einer Häufigkeit
von ungefähr
1:500 bis zu ungefähr
1:2 000, erhöht
von 0-1:10 000 bei gesunden, nicht immunisierten Weißbüscheläffchen (n
= 8) auf. Nicht markierte MOG-Peptide,
die im Übermaß hinzugegeben wurden,
inhibierten das Markieren vollständig,
und das goldkonjugierte Kontrollprotein markierte keine B-Zelle.
Bei Menschen konnten zirkulierende MOG-spezifische B-Zellen bei 8 von 17 MS-Patienten
(47 %) und bei 9 von 18 gesunden Kontrollen (50 %) nachgewiesen
werden. Die Häufigkeit
dieser autoreaktiven B-Zellen reichte von ungefähr 1:11 000 bis ungefähr 1:200
000 B-Zellen, wobei die höchsten Häufigkeiten
bei zwei Patienten mit rezidivierender-remittierender MS (1:16 000
bzw. 1:11 000) beobachtet wurden.
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Dieser
Immunogold-Assay weist empfindlich MOG-spezifische B-Zellen in peripherem
Blut nach. Dieser Assay weist eine Empfindlichkeit von ungefähr 1:500,
vorzugsweise von ungefähr
1:2 000, besser von ungefähr
1:10 000, noch besser von ungefähr 1:15
000 und am besten von ungefähr
1:200 000 auf. Bei Menschen können
autoreaktive B-Zellen bei etwa 50 % der Individuen nachgewiesen
werden und sind ebenso gegenwärtig
bei MS-Patienten
und Kontrollen. Dies legt nahe, dass die Gegenwart von Anti-MOG-Antikörpern in
dem Nervensystem von Individuen mit MS nicht mit einer wesentlichen
Ausdehnung von MOG-reaktiven B-Zellen
in dem peripheren Blut in Verbindung steht. Die hohe Häufigkeit
von MOG-reaktiven B-Zellen, die bei PBMC beobachtet wurde, stellt
neue Unterstützung
für die
Hypothese bereit, dass MOG ein wichtiges Autoantigen bei Menschen
ist.
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Bei
dem obigen Beispiel wurden MOG-spezifische Antikörper ausschließlich in
Bereichen, in denen die Transformation von kompaktem Myelin in kleine
Vesikel um einzelne demyelinisierende Axone auftrat, und in nekrotischen
Myelin-Zelltrümmern,
die entweder in dem ZNS-Parenchym schweben oder von phagozytischen
Zellen (Makrophagen und Mikroglia) internalisiert sind, lokalisiert.
Somit können
diese Antikörper
zusätzlich
zu einem direkten lytischen Angriff auf Myelin und Oligodendrozyte
ebenfalls für rezeptorvermittelte
Phagozytose durch Makrophagen oder antikörperabhängige zelluläre Zytotoxität verantwortlich
sein, die schon lange als möglicher
Effektormechanismus von Myelinschäden erkannt wurden. Unter Verwendung
passiver Übertragung
von Antikörpern
in das C. jacchus-System haben unsere Experimente gezeigt, dass
es möglich
ist, pathogene Effekte des monoklonalen Anti-MOG-Antikörpers 8.18.C5
durch In vivo-Verabreichung von gereinigten 8.18.C5-F(ab')2-Fragmenten
kompetitiv zu blockieren, wobei angezeigt wurde, dass intakte Fc-Fragmente
und nicht die MOG-spezifische CDR3-Sequenz selbst Myelin Schäden zufügten. Basierend auf
diesen Erkenntnissen stellen Analoge oder kompetitive Inhibitoren
einer Antikörperbindung,
die ohne toxische Wirkungen auf Myelin sind, einen rationalen Ansatz
für eine
Therapie bei EAE und zugehörigen demyelinisierenden
Erkrankungen bereit. Somit benutzt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen
von Autoantigenepitopen, Anti-Autoantigen-Antikörperfragmenten oder Kombinationen
daraus, um eine Behandlung von demyelinisierenden Autoimmunkrankheiten
zu erzielen.