DE69735243T2

DE69735243T2 - Neue low density lipoprotein bindende proteine und deren verwendung in der diagnostik und behandlung von atherosklerose

Info

Publication number: DE69735243T2
Application number: DE69735243T
Authority: DE
Inventors: M. Ann Brookline LEES; S. Robert Brookline LEES; W. Simon Lexington LAW; A. Anibal Boston ARJONA
Original assignee: Boston Heart Foundation Inc Cambridge; Boston Heart Foundation Inc
Current assignee: Boston Heart Foundation Inc Cambridge; Boston Heart Foundation Inc
Priority date: 1996-11-27
Filing date: 1997-11-26
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2017-11-27
Also published as: CA2272243A1; EP0969855A1; EP0969855A4; AU7408898A; IL129910A0; DE69735243D1; US20020052033A1; JP2001506983A; ATE317264T1; EP0969855B1; WO1998023282A1; AU736142B2; JP4184437B2; US6355451B1; ES2258798T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Gegenstand der Erfindung sind neue Polypeptide (LBP), die an Lipoprotein geringer Dichte (LDL) binden, Polynukleotide, die für diese Polypeptide kodieren und Therapeutika gegen Atherosklerose.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Atherosklerose ist die Hauptursache von Herzattacken und Schlaganfällen. Es wurde berichtet, dass ca. 50 % aller Todesfälle in den USA, Europa und Japan auf Atherosklerose zurückzuführen sind. Die Atherosklerose ist durch atherosklerotische Läsionen in der Arterienwand gekennzeichnet. In diesen atherosklerotischen Läsionen liegen Cholesterylester (CE) vor. Es wurde gezeigt, dass Lipoprotein geringer Dichte (LDL) den wichtigsten Träger von CE im Plasma darstellt, und wurde als das Mittel impliziert, über das CE in die atherosklerotischen Läsionen eintritt.
Bei verstreut liegenden Gruppen von Lipid-gefüllten Makrophagen, die als Schaumzellen bekannt sind, handelt es sich um die ersten sichtbaren Zeichen der Atherosklerose, und diese werden als Läsionen des Typs I beschrieben. Es wird berichtet, dass diese Makrophagen sich von LDL herleitende CE enthalten. Die Makrophagen erkennen oxidiertes, aber nicht natives LDL und werden durch phagozytierendes oxidiertes LDL, aber nicht durch natives LDL, zu Schaumzellen. Größere, organisiertere Ansammlungen von Schaumzellen, „Fatty Streaks", stellen Läsionen des Typs II dar. Diese Läsionen entwickeln sich weiter in als Plaques bezeichnete komplexe Läsionen, die zum behinderten Blutfluss in der Arterie führen können.
Es wird weithin angenommen, dass die Akkumulation von LDL in der Arterie von der Anwesenheit von funktionell modifizierten Endothelzellen in der Arterienwand abhängt. Es wurde berichtet, dass sich in Tiermodellen von der Atherosklerose LDL, sowohl natives LDL als auch methyliertes LDL, fokal und irreversibel nur an den Rändern von sich regenerierenden Endothelinseln in aortalen Läsionen akkumuliert, an denen funktionell modifizierte Endothelzellen vorliegen, aber nicht in den Zentren dieser Inseln, in denen die endotheliale Regeneration abgeschlossen ist. Auf ähnliche Weise akkumuliert sich LDL in humanen atherosklerotischen Läsionen. Der Mechanismus über den sich das LDL fokal und irreversibel in Arterienläsionen akkumuliert, wurde bisher nicht verstanden.
Datenbank WPI Section Ch, (Woche 198542 Derwent Publications Limited, London, GB; Class A96, AN 1985-008837 XP002169497) und JP 59 206046 (ASAHI CHEM IND CO LTD), 21. November 1984, betreffen saure Polyanionen mit einem Molekulargewicht von mindestens 600 (einschließlich Poly-L-Glu und Poly-Asp) als Adsorbenzien zur Entfernung von LDL aus dem Serum atherosklerotischer Patienten.
Lees A M et al. (Journal of Lipid Research, Vol. 32, Nr. 1, 1991, Seiten 1–8) betrifft die Gammakamera-Bildgebung in vivo von markierter LDL zur Untersuchung der Rezeptorerkennung von zellulärer Sequestrierung bei Atherosklerose.
EPO391629 (University South Alabama) betrifft die Verwendung von polyanionischen Peptiden zur Behandlung der pathologischen Mineralablagerung, einschließlich Atherosklerose.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung von Polypeptiden, die an LDL binden. Hierin beschriebene Verfahren können zur Bestimmung, ob ein Tier gefährdet ist, an Atherosklerose zu erkranken, nützlich sein.
Ein noch anderer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bewertung eines Mittels zur Anwendung bei der Behandlung der Atherosklerose.
Hierin beschriebene Verfahren können bei der Behandlung der Atherosklerose nützlich sein. Ein LBP-Gen (LBP; Low-density-Lipoprotein-Binding-Protein) und/oder Polypeptid oder Fragmente, Analoga und Varianten davon, wie hierin beschrieben, können als Stütze bei der Behandlung, Diagnose und/oder Identifikation von Therapeutika gegen Atherosklerose nützlich sein.
In einem erfindungsgemäßen Aspekt wird ein isoliertes Polynukleotid herausgestellt, umfassend ein Polynukleotid, das für das Polypeptid kodiert, umfassend die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 oder SEQ ID NO:9 dargelegt ist; oder ein Polynukleotid, das zur Hybridisierung an jedwedes der vorstehenden Polynukleotide fähig ist und das mindestens zu ca. 95 % mit ihnen identisch ist und worin das kodierte Polypeptid zur Bindung an LDL fähig ist; oder ein biologisch aktives Fragment von jedwedem der vorstehenden Polynukleotide, worin das kodierte Polypeptid zur Bindung an LDL fähig ist.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Polynukleotid die Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 oder SEQ ID NO:18 dargelegt ist.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt ist ein isoliertes Polypeptid, umfassend ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 oder SEQ ID NO:9 dargelegt ist; oder ein Polypeptid, das mindestens zu ca. 95 % mit jedwedem der vorstehenden Polypeptide identisch ist und worin das Polypeptid zur Bindung an LDL fähig ist; oder ein biologisch aktives Fragment von jedwedem der vorstehenden Polypeptide, worin das Fragment zur Bindung an LDL fähig ist.
Hierin beschriebene Verfahren können zur Bestimmung, ob ein Tier gefährdet ist, an Atherosklerose zu erkranken, nützlich sein. Ein Tier ist bereitgestellt. Ein Aspekt des LBP-Metabolismus oder der -Struktur wird in dem Tier bewertet. Eine Abnormalität im Aspekt des LBP-Metabolismus oder der -Struktur ist diagnostisch für eine Gefährdung, an Atherosklerose zu erkranken.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt stellt ein Verfahren zur Bewertung eines Mittels zur Anwendung bei der Behandlung von Atherosklerose dar. Eine Testzelle oder ein zellfreies System ist bereitgestellt. Ein Mittel ist bereitgestellt. Das Mittel wird in einer therapeutisch wirksamen Menge an die Testzelle oder das zellfreie System verabreicht. Die Wirkung des Mittels auf einen Aspekt des LBP-Metabolismus oder der -Struktur wird bewertet. Eine Änderung im Aspekt des LBP-Metabolismus oder der -Struktur ist Indikativ für die Nützlichkeit des Mittels bei der Behandlung der Atherosklerose.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt stellt ein Verfahren zur Bewertung eines Mittels auf die Fähigkeit, die Bindung des LBP-Polypeptids an ein Bindungsmolekül, wie z. B. natives LDL, modifiziertes LDL, wie z. B. methyliertes LDL oder oxidiertes LDL, oder eine arterielle extrazelluläre Matrixstrukturkomponente zu ändern, dar. Ein Mittel ist bereitgestellt. Ein LBP-Polypeptid ist bereitgestellt. Ein Bindungsmolekül ist bereitgestellt. Das Mittel, LBP-Polypeptid und das Bindungsmolekül sind kombiniert. Die Bildung eines Komplexes, umfassend das LBP-Polypeptid und Bindungsmolekül, wird nachgewiesen. Eine Änderung der Bildung des Komplexes in Anwesenheit des Mittels im Vergleich zur Abwesenheit des Mittels ist indikativ dafür, dass das Mittel die Bindung des LBP-Polypeptids an das Bindungsmolekül ändert.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt stellt ein Verfahren zur Bewertung eines Mittels auf die Fähigkeit, an das LBP-Polypeptid zu binden, dar. Ein Mittel ist bereitgestellt. Ein LBP-Polypeptid ist bereitgestellt. Das Mittel wird mit dem LBP-Polypeptid in Kontakt gebracht. Die Fähigkeit des Mittels, an das LBP-Polypeptid zu binden, wird bewertet.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt stellt ein Verfahren zur Bewertung eines Mittels auf die Fähigkeit zur Bindung einer Nukleinsäure, die für eine LBP-Regulationssequenz kodiert, dar. Ein Mittel ist bereitgestellt. Eine für eine LBP-Regulationssequenz kodierende Nukleinsäure ist bereitgestellt. Das Mittel wird mit der Nukleinsäure in Kontakt gebracht. Die Fähigkeit des Mittels an die Nukleinsäure zu binden, wird bewertet.
Hierin beschriebene Verfahren können für die Behandlung der Atherosklerose bei einem Tier nützlich sein. Ein Tier mit Bedarf an einer Behandlung gegen Atherosklerose wird bereitgestellt. Ein Mittel, das zur Veränderung eines Aspekts der LBP-Struktur oder des -Metabolismus fähig ist, wird bereitgestellt. Das Mittel wird an das Tier in einer therapeutisch wirksamen Menge dergestalt verabreicht, dass die Behandlung der Atherosklerose eintritt. Das Mittel kann LBP-Potypeptid, z. B. LBP-1, LBP-2 oder LBP-3, oder ein biologisch aktives Fragment oder ein Analogon davon darstellen. Das Mittel kann ein Polypeptid einer Länge von nicht mehr als ca. 100, 50, 30, 20, 10, 5, 4, 3 oder 2 Aminosäureresten darstellen. Das Mittel kann ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz darstellen, die mindestens ca. 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 90 %, 95 % oder 98 % saure Aminosäurereste einschließt.
Hierin beschriebene Verfahren können zur Behandlung eines Tieres, das gefährdet ist, an Atherosklerose zu erkranken, nützlich sein. Ein Tier, das gefährdet ist, an Atherosklerose zu erkranken, ist bereitgestellt. Ein Mittel, das zur Änderung eines Aspekts der LBP-Struktur oder des -Metabolismus fähig ist, ist bereitgestellt. Das Mittel wird an das Tier in einer therapeutisch wirksamen Menge dergestalt verabreicht, dass die Behandlung des Tieres eintritt.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt stellt ein Verfahren zur Behandlung einer Zelle mit einer Abnormalität der Struktur oder des Metabolismus von LBP dar. Eine Zelle mit einer Abnormalität der Struktur oder des Metabolismus von LBP ist bereitgestellt. Ein Mittel, das zur Änderung eines Aspekts der LBP-Struktur oder des -Metabolismus fähig ist, ist bereitgestellt. Das Mittel wird an die Zelle in einer therapeutisch wirksamen Menge dergestalt verabreicht, dass die Behandlung der Zelle eintritt.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung der Atherosklerose in einem Tier, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Mittels, wobei das Mittel zur Änderung des LBP-Metabolismus oder der -Struktur in dem Tier fähig ist, um auf diese Weise in der Behandlung der Atherosklerose zu resultieren, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger dar.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt stellt eine Vakzin-Zusammensetzung zur Behandlung der Atherosklerose in einem Tier, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Mittels, wobei das Mittel zur Änderung eines Aspekts des LBP-Metabolismus oder der -Struktur in dem Tier fähig ist, um auf diese Weise in der Behandlung der Atherosklerose zu resultieren, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger dar.
Hierin beschriebene Verfahren können für die Diagnose atherosklerotischer Läsionen in einem Tier nützlich sein. Ein Tier ist bereitgestellt. Ein markiertes Mittel, das zur Bindung an LBP, z. B. LBP-1, LBP-2 oder LBP-3, fähig ist, das bei atherosklerotischen Läsionen vorliegt, ist bereitgestellt. Das markierte Mittel wird an das Tier unter Bedingungen verabreicht, die dem markierten Mittel die Interaktion mit dem LBP erlauben, um auf diese Weise zu markiertem LBP zu führen. Die Lokalisierung oder Quantifizierung des markierten LBP wird mittels Bildgebung bestimmt, um auf diese Weise die Anwesenheit atherosklerotischer Läsionen in dem Tier zu diagnostizieren.
Hierin beschriebene Verfahren können für die Immunisierung eines Tieres gegen LBP, z. B. LBP-1, LBP-2 oder LBP-3, oder ein Fragment oder Analogon davon nützlich sein. Ein Tier mit LDL ist bereitgestellt. Das LBP oder Fragment oder Analogon davon wird folglich an das Tier verabreicht, um auf diese Weise die Antikörperbildung durch das Tier gegen das LBP oder Fragment oder Analogon davon dergestalt zu stimulieren, dass die Bindung des LBPs an das LDL verändert, z. B. vermindert oder vergrößert, wird.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Fragments oder Analogons des LBP-Polypeptids, des Fragments oder Analogons mit der Fähigkeit dar, an natives LDL und modifizierte LDL, z. B. methyliertes LDL, oxidiertes LDL, acetyliertes LDL oder mit Cyclohexandion behandeltes LDL, zu binden. Ein LBP-Polypeptid ist bereitgestellt. Die Sequenz des LBP-Polypeptids ist verändert. Das veränderte LBP-Polypeptid wird auf die Fähigkeit, an modifiziertes LDL und natives LDL zu binden, getestet.
Ein noch anderer erfindungsgemäßer Aspekt stellt ein Verfahren zum Isolieren einer cDNA, kodierend für ein LBP dar. Eine cDNA-Bibliothek ist bereitgestellt. Die cDNA-Bibliothek wird nach einer cDNA, kodierend ein Polypeptid, das an natives LDL und modifiziertes LDL, z. B. methyliertes LDL oder oxidiertes LDL bindet, durchsucht. Die cDNA, welche für das Polypeptid kodiert, wird isoliert, wobei die cDNA für ein LBP kodiert.
Die erfindungsgemäßen vorstehenden und anderen Merkmale, Gegenstände und Vorteile werden beim Lesen der folgenden Beschreibung im Zusammenhang mit den Zeichnungen besser verstanden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht die Aminosäuresequenz von Kaninchen-LBP-1 (SEQ ID NO:1). Unterschiede in den Aminosäuren zwischen LBP-1 vom Kaninchen und Menschen sind im Fettdruck veranschaulicht.
2 veranschaulicht die Aminosäuresequenz von Kaninchen-LBP-2 (SEQ ID NO:2). Unterschiede in den Aminosäuren zwischen LBP-2 vom Kaninchen und Menschen sind im Fettdruck veranschaulicht.
3 veranschaulicht die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 86 bis 317 von Kaninchen-LBP-2 (SEQ ID NO:3).
4 veranschaulicht die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 66 bis 317 von Kaninchen-LBP-2 (SEQ ID NO:4).
5 veranschaulicht die Aminosäuresequenz von Kaninchen-LBP-3 (SEQ ID NO:5). Unterschiede in den Aminosäuren zwischen LBP-3 vom Kaninchen und Menschen sind im Fettdruck veranschaulicht.
6 veranschaulicht die Aminosäuresequenz von humanem LBP-1 (SEQ ID NO:6). Unterschiede in den Aminosäuren zwischen LBP-1 vom Kaninchen und Menschen sind im Fettdruck veranschaulicht.
7 veranschaulicht die Aminosäuresequenz von humanem LBP-2 (SEQ ID NO:7). Unterschiede in den Aminosäuren zwischen LBP-2 vom Kaninchen und Menschen sind im Fettdruck veranschaulicht.
8 veranschaulicht die Aminosäuresequenz von humanem LBP-3 (SEQ ID NO:8). Unterschiede in den Aminosäuren zwischen LBP-3 vom Kaninchen und Menschen sind im Fettdruck veranschaulicht.
9 veranschaulicht die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 14 bis 33 von als BHF-1 (SEQ ID NO:9) bezeichnetem LBP-1 vom Menschen oder Kaninchen.
10 veranschaulicht die cDNA-Sequenz, kodierend für Kaninchen-LBP-1 (SEQ ID NO:10) und die entsprechende Aminosäuresequenz. Unterschiede in den Aminosäuren zwischen LBP-1 vom Kaninchen und Menschen sind im Fettdruck veranschaulicht.
11 veranschaulicht die cDNA-Sequenz, kodierend für Kaninchen-LBP-2 (SEQ ID NO:11) und die entsprechende Aminosäuresequenz. Unterschiede in Aminosäuren zwischen LBP-2 vom Kaninchen und Menschen sind im Fettdruck veranschaulicht.
12 veranschaulicht die cDNA-Sequenz 256 bis 1617 von Kaninchen-LBP-2 (SEQ ID NO:12) und die entsprechende Aminosäuresequenz.
13 veranschaulicht die cDNA-Sequenz 196 bis 1617 von Kaninchen-LBP-2 (SEQ ID NO:13) und die entsprechende Aminosäuresequenz.
14 veranschaulicht die cDNA-Sequenz, kodierend für Kaninchen-LBP-3 (SEQ ID NO:14) und die entsprechende Aminosäuresequenz. Unterschiede in Aminosäuren zwischen LBP-3 vom Kaninchen und Menschen sind im Fettdruck veranschaulicht.
15 veranschaulicht die cDNA-Sequenz, kodierend humanes LBP-1 (SEQ ID NO:15) und die entsprechende Aminosäuresequenz. Unterschiede in Aminosäuren zwischen LBP-1 vom Kaninchen und Menschen sind im Fettdruck veranschaulicht.
16 veranschaulicht die cDNA-Sequenz, kodierend humanes LBP-2 (SEQ ID NO:16) und die entsprechende Aminosäuresequenz. Unterschiede in Aminosäuren zwischen LBP-2 vom Kaninchen und Menschen sind im Fettdruck veranschaulicht.
17 veranschaulicht die cDNA-Sequenz, kodierend humanes LBP-3 (SEQ ID NO:17) und die entsprechende Aminosäuresequenz. Unterschiede in Aminosäuren zwischen LBP-3 vom Kaninchen und Menschen sind im Fettdruck veranschaulicht.
18 veranschaulicht die cDNA-Sequenz, kodierend für BHF-1 (SEQ ID NO:18).
19 entspricht der Aminosäuresequenz von Kaninchen-LBP-1 (obere Sequenz) in Alignment mit der Aminosäuresequenz von humanem LBP-1 (untere Sequenz).
20 entspricht der Aminosäuresequenz von Kaninchen-LBP-2 (obere Sequenz) in Alignment mit der Aminosäuresequenz von humanem LBP-2 (untere Sequenz).
21 entspricht der Aminosäuresequenz von Kaninchen-LBP-3 (obere Sequenz) in Alignment mit der Aminosäuresequenz von humanem LBP-3 (untere Sequenz).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Gemäß den erfindungsgemäßen Aspekten sind neue mature Polypeptide vom Menschen und Kaninchen, LBP-1, LBP-2 and LBP-3, und biologisch aktive Analoga und Fragmente davon bereitgestellt, und es sind isolierte Polynukleotide bereitgestellt, die für solche Polypeptide kodieren. LBP stellt eine Abkürzung für Low-density-Lipoprotein-Binding-Protein (LDL-Binding-Protein) dar. Die Begriffe Polynukleotid, Nukleotid und Oligonukleotid werden hierin gegeneinander austauschbar verwendet, und die Begriffe Polypeptide, Proteine und Peptide werden hierin gegeneinander austauschbar verwendet.
Gegenstand dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines isolierten Polynukleotids, das ein Polynukleotid umfasst, kodierend für das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von Kaninchen-LBP-1, wie in 1 (SEQ ID NO:1) dargelegt ist; Kaninchen-LBP-2, wie in 2 (SEQ ID NO:2) dargelegt ist; 86 bis 317 von Kaninchen-LBP-2, wie in 3 (SEQ ID NO:3) dargelegt ist; 66 bis 317 von Kaninchen-LBP-2, wie in 4 (SEQ ID NO:4) dargelegt ist; Kaninchen-LBP-3, wie in 5 (SEQ ID NO:5) dargelegt ist; humanem LBP-1, wie in 6 (SEQ ID NO:6) dargelegt ist; humanem LBP-2, wie in 7 (SEQ ID NO:7) dargelegt ist; humanem LBP-3, wie in 8 (SEQ ID NO:8) dargelegt ist; 14 bis 33 von als BHF-1 bezeichnetem LBP-1 vom Menschen oder Kaninchen, wie in 9 (SEQ ID NO:9) dargelegt ist; ein Polynukleotid, das zur Hybridisierung an jedwede der vorstehenden Polynukleotide fähig ist und das mindestens zu ca. 80 % identisch, bevorzugter mindestens zu ca. 90 % identisch, noch bevorzugter mindestens zu ca. 95 % identisch und am bevorzugtesten mindestens zu ca. 98 % identisch mit jedwedem von ihnen ist, und worin das kodierte Polypeptid zur Bindung an LDL fähig ist; oder ein biologisch aktives Fragment von jedwedem der vorstehenden Polynukleotide, worin das kodierte Polypeptide zur Bindung an LDL fähig ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein isoliertes Polynukleotid, das ein Polynukleotid umfasst, kodierend für das Polypeptid mit Aminosäureresten 8–22 (SEQ ID NO: 19), 8–33 (SEQ ID NO:20), 23–33 (SEQ ID NO:21) oder 208–217 (SEQ ID NO:22) von humanem LBP-2, wie in 7 (SEQ ID NO:7) dargelegt ist; Aminosäureresten 14–43 (SEQ ID NO:23) oder 38–43 (SEQ ID NO:24) von LBP-1 vom Kaninchen oder Menschen, wie in 1 (SEQ ID NO:1) und 6 (SEQ ID NO:6) dargelegt ist; Aminosäureresten 105–120 (SEQ ID NO:25), 105–132 (SEQ ID NO:26), 121–132 (SEQ ID NO:27) oder 211–220 (SEQ ID NO:28) von Kaninchen-LBP-2, wie in 2 (SEQ ID NO:2) dargelegt ist; Aminosäureresten 96–110 (SEQ ID NO:29) von Kaninchen-LBP-3, wie in 5 (SEQ ID NO:5) dargelegt ist; Aminosäureresten 53–59 (SEQ ID NO:41) von humanem LBP-3, wie in 8 (SEQ ID NO:8) dargelegt ist; ein Polynukleotid, das zur Hybridisierung an jedwede der vorstehenden Polynukleotide fähig ist und das mindestens zu ca. 80 % identisch, bevorzugter mindestens zu ca. 90 % identisch, noch bevorzugter mindestens zu ca. 95 % identisch und am bevorzugtesten mindestens zu 98 % identisch mit jedwedem von ihnen ist, und worin das kodierte Polypeptid zur Bindung an LDL fähig ist; oder ein biologisch aktives Fragment von jedwedem der vorstehenden Polynukleotide, worin das kodiere Polypeptid zur Bindung an LDL fähig ist.
Unter einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, versteht man ein Polynukleotid, das nur die Kodierungssequenz für das Polypeptid einschließt, ebenso wie ein Polynukleotid, das zusätzlich Kodierungs- und/oder Nichtkodierungssequenzen einschließt. Folglich können z. B. die Polynukleotide, die für die maturen Polypeptide von 1–9 (SEQ ID NO:1–9) kodieren, nur die Kodierungssequenz für das mature Polypeptid; die Kodierungssequenz für das mature Polypeptid und eine zusätzliche Kodierungssequenz, wie zum Beispiel eine Leader- oder sekretorische Sequenz oder eine Proproteinsequenz; die Kodierungssequenz für das mature Polypeptid (und optional eine zusätzliche Kodierungssequenz) und eine Nichtkodierungssequenz, wie zum Beispiel Introne oder nicht kodierende Sequenzen 5' und/oder 3' der Kodierungssequenz für das mature Polypeptid einschließen. Die erfindungsgemäßen Polynukleotide sollen auch Polynukleotide einschließen, worin die Kodierungssequenz für das mature Polypeptid im gleichen Leserahmen mit einer Polynukleotidsequenz fusioniert ist, die die Expression und/oder Sekretion eines Polypeptids aus einer Wirtszelle, z. B. einer Leadersequenz, unterstützt. Die Polynukleotide sollen auch Polynukleotide einschließen, worin die Kodierungssequenz im Rahmen mit einer Markersequenz fusioniert ist, die z. B. die Reinigung des Polypeptids erlaubt.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide können in der Form von RNA, DNA oder PNA, z. B. cRNA, cDNA, genomischer DNA oder synthetischer DNA, RNA oder PNA vorliegen. Die DNA kann doppel- oder einsträngig sein, und wenn sie einsträngig ist, kann sie den kodierenden Strang oder den nicht kodierenden Strang (Antisense-Strang) darstellen.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Polynukleotid die Nukleinsäure von Kaninchen-LBP-1, wie in 10 (SEQ ID NO:10) dargelegt ist; Kaninchen-LBP-2, wie in 11 (SEQ ID NO:11) dargelegt ist; Nukleotid 256 bis 1617 von Kaninchen-LBP-2, wie in 12 (SEQ ID NO:12) dargelegt ist; Nukleotid 196 bis 1617 von Kaninchen-LBP-2, wie in 13 (SEQ ID NO:13) dargelegt ist; Kaninchen-LBP-3, wie in 14 (SEQ ID NO: 14) dargelegt ist; humanem LBP-1, wie in 15 (SEQ ID NO:15) dargelegt ist; humanem LBP-2, wie in 16 (SEQ ID NO:16) dargelegt ist; humanem LBP-3, wie in 17 (SEQ ID NO:17) dargelegt ist; oder Nukleotid 97 bis 156 von Kaninchen-LBP-1 oder Nukleotid 157 bis 216 von humanem LBP-1 (BHF-1), wie in 18 (SEQ ID NO:18) dargelegt ist.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Polynukleotid die Nukleinsäure, wie in SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 oder SEQ ID NO:42 dargelegt ist.
Die Kodierungssequenz, welche für das mature Polypeptid kodiert, kann mit den in 10–18 (SEQ ID NO:10–18) oder SEQ ID NO:30–40 oder 42 gezeigten Kodierungssequenzen identisch sein, oder sie kann eine unterschiedliche Kodierungssequenz darstellen, welche Kodierungssequenz aufgrund der Redundanz oder Degeneriertheit des genetischen Codes, für die gleichen maturen Polypeptide wie die DNA von 10–18 (SEQ ID NO: 10–18) und SEQ ID NO: 30–40 und 42 kodiert.
Gegenstand dieser Erfindung sind auch rekombinante Vektoren, die die vorstehend beschriebenen Polynukleotide umfassen. Der Vektor kann z. B. ein Plasmid, einen Viruspartikel oder einen Phagen darstellen. In bestimmten Ausführungsformen stellt der rekombinante Vektor einen Expressionsvektor dar. Die Vektoren können auch verschiedene Markergene einschließen, die bei der Identifikation von Zellen, enthaltend solche Vektoren nützlich sind.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Zelle, die einen derartigen rekombinanten Vektor umfasst. Die hierin beschriebenen rekombinanten Vektoren können, z. B. durch Transformation, Transfektion oder Infektion, in eine Wirtszelle eingeführt werden.
Gegenstand dieser Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines LBP, umfassend das Kultivieren einer derartigen Zelle unter Bedingungen, die die Expression des LBPs erlauben.
Gegenstand dieser Erfindung ist auch ein isoliertes Polypeptid, umfassend ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, wie in 1 (SEQ ID NO:1); 2 (SEQ ID NO:2); 3 (SEQ ID NO:3); 4 (SEQ ID NO:4); 5 (SEQ ID NO:5); 6 (SEQ ID NO:6); 7 (SEQ ID NO:7); 8 (SEQ ID NO:8) oder 9 (SEQ ID NO:9) dargelegt ist; oder ein Polypeptid, das mindestens zu ca. 80 % identisch, bevorzugter mindestens zu ca. 90 % identisch, noch bevorzugter mindestens zu ca. 95 % identisch und am bevorzugtesten mindestens zu ca. 98 % identisch mit den vorstehenden Polypeptiden ist, und worin dieses Polypeptid zur Bindung an LDL fähig ist; oder ein biologisch aktives Fragment von jedweden der vorstehenden Polypeptide, worin das Fragment zur Bindung an LDL fähig ist. Unterschiede in den Aminosäuren zwischen LBP-1-, LBP-2- und LBP-3-Genen vom Kaninchen und Menschen sind in den Figuren im Fettdruck veranschaulicht. Die Unterschiede in den Aminosäuresequenzen zwischen LBP-1, LBP-2 und LBP-3 vom Kaninchen und Menschen sind auch spezifisch in 19, 20 bzw. 21 ersichtlich.
Gegenstand dieser Erfindung ist auch ein isoliertes Polypeptid, umfassend ein Polypeptid mit Aminosäureresten 8–22 (SEQ ID NO:19), 8–33 (SEQ ID NO:20), 23–33 (SEQ ID NO:21) oder 208–217 (SEQ ID NO:22), wie in 7 (SEQ ID NO:7) dargelegt ist; Aminosäureresten 14–43 (SEQ ID NO:23) oder 38–43 (SEQ ID NO:24), wie in 1 (SEQ ID NO:1) und 6 (SEQ ID NO:6) dargelegt ist; Aminosäureresten 105–120 (SEQ ID NO:25), 105–132 (SEQ ID NO:26), 121–132 (SEQ ID NO:27) oder 211–220 (SEQ ID NO:28), wie in 2 (SEQ ID NO:2) dargelegt ist; Aminosäueresten 96–110 (SEQ ID NO:29), wie in 5 (SEQ ID NO:5) dargelegt ist; und Aminosäureresten 53–59 (SEQ ID NO:41), wie in 8 (SEQ ID NO:8) dargelegt ist; oder ein Polypeptid, das mindestens zu ca. 80 % identisch, bevorzugter mindestens zu ca. 90 % identisch, noch bevorzugter mindestens zu ca. 95 % identisch und am bevorzugtesten mindestens zu ca. 98 % identisch mit den vorstehenden Polypeptiden ist, und worin dieses Polypeptid zur Bindung an LDL fähig ist; oder ein biologisch aktives Fragment von jedweden der vorstehenden Polypeptide, worin das Fragment zur Bindung an LDL fähig ist.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide sollen z. B. ein natürlich gereinigtes Produkt, ein chemisch synthetisiertes Produkt und ein rekombinant hergeleitetes Produkt darstellen.
Die Polypeptide können z. B. zur Bindung an LDL verwendet werden, wodurch sie die Bildung atherosklerotischer Plaques inhibieren. Die Polypeptide können z. B. auch in der Gentherapie durch Expression solcher Polypeptide in vivo verwendet werden. Die Polypeptide können auch in pharmazeutischen oder Vakzin-Zusammensetzungen verwendet werden. Die Polypeptide können auch als Immunogene zur Bildung von Antikörpern dagegen verwendet werden, die wiederum als Antagonisten gegen die LBP-Polypeptide verwendet werden können.
Ohne durch jedwede Theorie gebunden sein zu wollen, besteht die Ansicht, dass die LBP den Mechanismus bereitstellen, über den die Atherosklerose durch die LDL-Oxidation gefördert wird. Es wird angenommen, dass die LBP erforderlich sind, damit die fokale, irreversible LDL-Bindung an die Arterienwand auftreten kann und dass eine derartige Bindung ein kritisches frühes Ereignis bei der Atherosklerose darstellt, weil sie die Zeit erlaubt, die notwendig ist, um das LDL aus seinem nativen Zustand in einen vollkommen oxidierten Zustand umzuwandeln. Da oxidiertes, aber nicht natives, LDL ein Fremdprotein darstellt, wird es von Makrophagen aufgenommen, wobei sie zuerst die Schaumzellen von Läsionen des Typs I werden und in der Folge die „Fatty Streaks" von Läsionen des Typs II bilden.
Die hierin beschriebenen Verfahren können zur Bestimmung nützlich sein, ob ein Tier gefährdet ist, an Atherosklerose zu erkranken. Ein Tier ist bereitgestellt. Ein Aspekt des LBP-Metabolismus oder der -Struktur wird im Tier bewertet. Eine Abnormalität im Aspekt des LBP-Metabolismus oder der -Struktur stellt ein diagnostisches Kriterium für ein Atherosklerose-Risiko dar.
Unter Atherosklerose versteht man eine Erkrankung oder einen Zustand, der mehrere Stufen umfasst, die kaum wahrnehmbar ineinander übergehen, einschließlich der irreversiblen Bindung von LDL, der LDL-Oxidation, der Makrophagen-Rekrutierung, der Blockierung der Arterie und des Gewebetods (Infarkt).
Unter Tier versteht man humane ebenso wie nicht humane Tiere. Nicht humane Tiere schließen z. B. Säuger, Vögel, Reptile, Amphibien, Fische, Insekten und Protozoen ein. Das nicht humane Tier stellt bevorzugt einen Säuger, z. B. ein Kaninchen, einen Nager, z. B. eine Maus, eine Ratte oder ein Meerschweinchen, einen Primaten, z. B. einen Affen oder ein Schwein, dar. Ein Tier schließt auch transgene, nicht humane Tiere ein. Unter dem Begriff transgenes Tier versteht man, dass er ein Tier einschließt, das neue genetische Informationen aus der Einführung von Fremd-DNA, d. h. von teilweise oder vollkommen heterologer DNA, in die DNA seiner Zellen; oder Einführung einer Läsion, z. B. einer in vitro induzierten Mutation, z. B. einer Deletion oder einem anderen chromosomalen Reanangement in die DNA seiner Zellen; oder Einführung von homologer DNA in die DNA seiner Zellen auf eine Weise dergestalt gewonnen hat, um das Genom der Zelle, in die die DNA insertiert wird, zu verändern, z. B. wird sie an einer Stelle insertiert, die sich von der des natürlichen Gens unterscheidet oder seine Insertion zu einem Knockout oder Ersatz des homologen Wirtsgens führt oder zu einer/einem veränderten und/oder regulierbaren Expression und/oder Metabolismus des Gens führt. Das Tier kann ein Transgen in allen seinen Zellen, einschließlich Keimlinienzellen, oder in nur einer oder einigen von seinen Zellen einschließen. Transgene Tiere können als ein Modell zur Untersuchung der Atherosklerose oder zur Bewertung von Mitteln zur Behandlung der Atherosklerose dienen.
Die Bestimmung des Risikos, an einer Atherosklerose zu erkranken, kann an einem pränatalen Tier vorgenommen werden.
Unter LBP versteht man ein Low-density-Lipoprotein-Binding-Protein (LDL-Binding-Protein), das zur Bindung von LDL und methyliertem LDL fähig ist. Unter methyliertem LDL versteht man, dass ca. 50 % bis ca. 90 % der Lysinreste des LDLs eine Methylgruppe chemisch daran gebunden haben. Methylierte LDL wird von zuvor berichteten Zelloberflächenrezeptoren nicht erkannt. Siehe z. B. Weisgraber et al., J. Biol. Chem. 253: 9053–9062 (1978). In bestimmten Ausführungsformen ist das LBP auch zur Bindung von oxidiertem LDL fähig. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die Bindung von LDL an ein LBP irreversibel. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen transportiert das LBP das LDL nicht an jedwedes intrazelluläres Kompartiment. Beispiele von LBP stellen hierin beschriebenes LBP-1, LBP-2 und LBP-3 dar.
Unter LBP-Metabolismus versteht man jedweden Aspekt der Herstellung, Freisetzung, Expression, Funktion, Wirkung, Interaktion oder Regulation von LBP. Der Metabolismus von LBP schließt Modifikationen, z. B. kovalente oder nicht kovalente Modifikationen vom LBP-Polypeptid ein. Der Metabolismus von LBP schließt Modifikationen, z. B. kovalente oder nicht kovalente Modifikationen, die LBP in anderen Substanzen induziert, ein. Der Metabolismus von LBP schließt auch Veränderungen in der Verteilung des LBP-Polypeptids, und durch LBP induzierte Veränderungen in der Verteilung anderer Substanzen ein.
Es kann jedweder Aspekt des LBP-Metabolismus bewertet werden. Bei den verwendeten Verfahren handelt es sich um Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind und in den Standardreferenzen gefunden werden können, wie z. B. Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Mol. Biology, New York: John Wiley & Sons, 1990; Kriegler, M., Hrsg., Gene Transfer and Expression, Stockton Press, New York, NY, 1989; pDisplay-Genexpressionssystem (Invitrogen, Carlsbad, CA). Bevorzugte Beispiele des LBP-Metabolismus, die bewertet werden können, schließen die Bindungsaktivität des LBP-Polypeptids an ein Bindungsmolekül, z. B. LDL; die Transaktivierungsaktivität des LBP-Polypeptids an ein Targetgen; den Spiegel des LBP-Proteins; den Spiegel der LBP-mRNA; den Grad der LBP-Modifikationen, z. B. Phosphorylierung, Glycosylierung oder Acylierung; oder die Wirkung der LBP-Expression auf die transfizierte Säugerzellbindung von LDL, ein.
Unter Bindungsmolekül versteht man jedwedes Molekül, an das LBP, z. B. eine Nukleinsäure, z. B. eine DNA-Regulationsregion, ein Protein, z. B. LDL, ein Metabolit, ein Peptid-Mimetikum, ein Nicht-Peptid-Mimetikum, ein Antikörper, oder jedweder andere Ligandentyp, binden kann. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen, stellt der Aspekt des LBP-Metabolismus, der bewertet wird, die Fähigkeit von LBP, an natives LDL und/oder methyliertes LDL und/oder oxidiertes LDL zu binden, dar. Die Bindung an LDL kann z. B. durch Antikörper gegen LDL, Affinitätschromatographie, ACE-Assays (Affinity Coelectrophoresis Assays) oder ELISA-Assays nachgewiesen werden. Siehe die Beispiele. In anderen Ausführungsformen wird die Fähigkeit des LBPs, an eine arterielle extrazelluläre Matrixstukturkomponente zu binden, bewertet. Beispiele solcher Komponenten schließen Proteoglykane, wie z. B. Chondroitinsulfat-Proteoglykane und Heparinsulfat-Proteoglykane; Elastin; Kollagen; Fibronektin; Vitronektin; Integrine; und verwandte extrazelluläre Matrixmoleküle ein. Die Bindung an arterielle extrazelluläre Matrixstrukturkomponenten können anhand von dem Fachmann bekannten Standardverfahren, wie z. B. durch die ELISA-Assays nachgewiesen werden. Primäre Antikörper gegen das LBP werden dann zugefügt, gefolgt von einem Enzym-konjugierten sekundären Antikörper gegen den primären Antikörper, wodurch in Anwesenheit eines geeigneten Substrats eine stabile Farbe produziert wird, und die Farbentwicklung auf den Platten in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät gemessen wird.
Die Transaktivierung eines Target-Gens durch das LBP kann z. B. in einem transienten Transfektions-Assay bestimmt werden, worin der Promoter des Target-Gens mit einem Reporter-Gen, z. B. β-Galactosidase oder Luciferase verknüpft und mit einem LBP-Expressionsvektor cotransfiziert wird. Solche Bewertungen können in vitro durchgeführt werden. Die Spiegel des LBP-Proteins, der mRNA oder die Grade der Phosphorylierung können z. B. in einer Probe, z. B. in einer Gewebeprobe, z. B. der Arterienwand, anhand von dem Fachmann bekannten Standardverfahren gemessen werden.
In bestimmten Ausführungsformen wird ein Aspekt der LBP-Struktur, z. B. der LBP-Genstruktur oder der LBP-Proteinstruktur bewertet. So können zum Beispiel primäre, sekundäre oder tertiäre Strukturen bewertet werden. Es wird zum Beispiel die DNA-Sequenz des Gens und/oder die Aminosäuresequenz des Proteins bestimmt. Die dem Fachmann bekannten Standardklonierungs- und -sequenzierungsverfahren können verwendet werden. In bestimmten Ausführungsformen wird die Bindungsaktivität einer Antisense-Nukleinsäure mit der zellulären LBP-mRNA und/oder genomischen DNA unter Verwendung der dem Fachmann bekannten Standardverfahren zum Nachweis der An- oder Abwesenheit der Target-mRNA oder -DNA-Sequenzen, an die die Antisense-Nukleinsäure in der Regel spezifisch binden würde, bestimmt.
Das Risiko für Atherosklerose, das bestimmt wird, kann im Vergleich zu einem normalen Tier ein reduziertes Risiko oder ein erhöhtes Risiko darstellen. So stellt zum Beispiel ein inaktives LBP-Polypeptid eine Abnormalität dar, die zu einem reduzierten Risiko führen würde. Bei einer Abnormalität, die zu einem erhöhten Risiko führen würde, würde es sich z. B. um ein LBP-Polypeptid, das eine höhere Aktivität, z. B. LDL-Bindungsaktivität, als ein natives LBP-Polypeptid aufweist, handeln.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Bewertung eines Mittels zur Anwendung bei der Behandlung der Atherosklerose. Eine Testzelle oder ein zellfreies System ist bereitgestellt. Ein Mittel ist bereitgestellt. Das Mittel wird an die Testzelle oder das zellfreie System in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Die Wirkung des Mittels auf einen Aspekt des LBP-Metabolismus oder der -Struktur wird bewertet. Eine Veränderung im Aspekt des LBP-Metabolismus oder der -Struktur ist indikativ für die Nützlichkeit des Mittels bei der Behandlung der Atherosklerose.
Unter Zelle versteht man eine Zelle oder eine Gruppe von Zellen oder eine Zelle, die einen Teil eines Tieres darstellt. Bei der Zelle kann es sich um eine humane oder nicht humane Zelle handeln. Eine Zelle soll auch eine transgene Zelle einschließen. Die Zelle kann z. B. aus einer Kultur oder aus einem Tier gewonnen werden. Unter Tieren versteht man, dass sie z. B. natürliche Tiere und nicht humane transgene Tiere einschließen sollen. In bestimmten Ausführungsformen weist die transgene Zelle oder das nicht humane transgene Tier ein LBP-Transgen oder Fragment oder Analogon davon auf. In bestimmten Ausführungsformen weist die transgene Zelle oder das nicht humane transgene Tier ein Knockout für das LBP-Gen auf.
Die Testzelle oder das zellfreie System kann ein Wildtyp-Muster oder ein Nichtwildtyp-Muster des LBP-Metabolismus aufweisen. Ein Nichtwildtyp-Muster des LBP-Metabolismus kann sich z. B. aus einer Unterexpression, Überexpression, keiner Expression oder einer temporalen Orts- oder Verteilungsveränderung ergeben. Ein derartiges Nichtwildtyp-Muster kann sich z. B. aus einer oder mehr Mutation(en) im LBP-Gen, in einem Bindungsmolekül-Gen, einem Regulationsgen oder in jedwedem anderen Gen ergeben, was sich direkt oder indirekt auf den LBP-Metabolismus auswirkt. Eine Mutation soll, z. B. in einer Grob- oder Feinstruktur, in einer Nukleinsäure eingeschlossen sein. Beispiele schließen die Veränderungen eines einzelnen Basenpaars, z. B. Missense- oder Nonsense-Mutationen, Frameshifts, Deletionen, Insertionen und Translokationen ein. Mutationen können dominant oder rezessiv sein. Mutationen können homozygot oder heterozygot sein. Bevorzugt wird ein Aspekt des LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Metabolismus bewertet.
Ein Mittel soll z.B. jedwede Substanz, wie z. B. ein antiatherosklerotisches Arzneimittel, einschließen. Das erfindungsgemäße Mittel kann bevorzugt einen Aspekt des LBP-Metabolismus verändern. Eine derartige Veränderung kann das Ergebnis von jedwedem von einer Reihe verschiedener Ereignisse, einschließlich z. B. von Folgendem sein: der Verhinderung oder Reduktion einer Interaktion zwischen LBP und einem Bindungsmolekül, z. B. LDL oder einer arteriellen extrazellulären Matrixstrukturkomponente; inaktivierendem LBP und/oder dem Bindungsmolekül, z. B. durch Spaltung oder eine andere Modifikation; Veränderung der Affinität von LBP und dem Bindungsmolekül zueinander, Ausverdünnen von LBP und/oder des Bindungsmoleküls; Verhinderung der Expression von LBP and/oder des Bindungsmoleküls; Reduktion der Synthese von LBP und/oder des Bindungsmoleküls; Synthetisieren eines abnormalen LBP und/oder Bindungsmoleküls; Synthetisieren eines alternativ gespleißten LBP und/oder Bindungsmoleküls; Verhinderung oder Reduktion der ordnungsgemäßen konfirmationalen Faltung des LBP und/oder des Bindungsmoleküls; Modulieren der Bindungseigenschaften des LBP und/oder des Bindungsmoleküls; Eingreifen in Signale, die zur Aktivierung oder Deaktivierung des LBP und/oder des Bindungsmoleküls erforderlich sind; Aktivierung oder Deaktivierung des LBP und/oder des Bindungsmoleküls auf eine Weise, um die Bindung zu verhindern; oder Eingreifen in andere Rezeptoren, Liganden oder andere Moleküle, die für die normale Synthese oder Funktion des LBP und/oder des Bindungsmoleküls erforderlich sind. Das Mittel kann zum Beispiel den Bindungsort an LDL für fokal in die extrazelluläre Matrix in der Arterienwand exprimierte LBP blockieren, wie es gegebenenfalls den Bindungsort an einem LBP für LDL blockieren könnte, oder es könnte bifunktionell sein, d. h. es könnte beide Bindungsorte blockieren.
Beispiele von Mitteln schließen das LBP-Polypeptid, z. B. LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 oder ein biologisch aktives Fragment oder Analogon davon; eine Nukleinsäure, die für das LBP-Polypeptid oder ein biologisch aktives Fragment oder Analogon davon kodiert; eine Nukleinsäure, die für eine LBP-Regulationssequenz oder ein biologisch aktives Fragment oder Analogon davon kodiert; ein Bindungsmolekül für das LBP-Polypeptid; ein Bindungsmolekül für die LBP-Nukleinsäure, wobei die LBP-Nukleinsäure z. B. eine Nukleinsäure darstellt, umfassend eine Regulationsregion für LBP oder eine Nukleinsäure, umfassend eine Strukturregion für LBP oder ein biologisch aktives Fragment von LBP; eine Antisense-Nukleinsäure; ein Mimetikum von LBP oder einem Bindungsmolekül, einen Antikörper für LBP oder ein Bindungsmolekül; einen Metaboliten oder ein inhibitorisches Kohlenhydrat oder Glykoprotein ein. In bestimmten Ausführungsformen stellt das Mittel einen Antagonisten, Agonisten oder Superagonisten dar.
Kenntnis von der Existenz der Sequenz der LBP ermöglicht eine Suche nach natürlichen oder artifiziellen Liganden zur Regulation der LDL-Spiegel in der Behandlung von Atherosklerose. In bestimmten Ausführungsformen stellt das Mittel einen natürlichen Liganden für LBP dar. In bestimmten Ausführungsformen stellt das Mittel einen artifiziellen Liganden für LBP dar.
Unter Analogon versteht man eine Verbindung, die sich von in der Aminosäuresequenz natürlich vorkommendem LBP oder in Wegen, die keine Sequenz beinhalten, oder beidem unterscheiden. Erfindungsgemäße Analoga weisen im Allgemeinen mindestens eine ca. 80%ige Homologie, bevorzugt mindestens eine ca. 90 %ige Homologie, noch bevorzugter mindestens eine ca. 95%ige Homologie und am bevorzugtesten mindestens eine ca. 98%ige Homologie auf, mit im Wesentlichen der gesamten Sequenz einer natürlich vorkommenden LBP-Sequenz, bevorzugt mit einem Segment von ca. 100 Aminosäureresten, bevorzugter mit einem Segment von ca. 50 Aminosäureresten, noch bevorzugter mit einem Segment von 30 Aminosäureresten, noch bevorzugter mit einem Segment von ca. 20 Aminosäureresten, noch bevorzugter mit einem Segment von ca. 10 Aminosäureresten, noch bevorzugter mit einem Segment von ca. 5 Aminosäureresten, noch bevorzugter mit einem Segment von ca. 4 Aminosäueresten, noch bevorzugter mit einem Segment von ca. 3 Aminosäureresten und am bevorzugtesten mit einem Segment von ca. 2 Aminosäureresten. Nichtsequenz-Modifikationen schließen chemische Derivatisierungen von LBP in vitro ein. Nichtsequenz-Modifikationen schließen z. B. Veränderungen der Phosphorylierung, Acetylierung, Methylierung, Carboxylierung oder Glycosylierung ein. Verfahren zur Herstellung solcher Modifikationen sind dem Fachmann bekannt. So kann zum Beispiel die Phosphorylierung durch Exposition des LBP gegenüber die Phosphorylierung verändernden Enzymen, wie z. B. Kinasen oder Phosphatasen, modifiziert werden.
Bevorzugte Analoga schließen LBP oder biologisch aktive Fragmente davon ein, deren Sequenzen sich von der Wildtyp-Sequenz durch eine oder mehr übliche Aminosäure-Substitution(en) oder durch eine oder mehr nicht übliche Aminosäure-Substitution(en), Deletion(en) oder Insertion(en), welche die biologische Aktivität des LBPs nicht aufheben, unterscheiden. Konservative Substitutionen schließen in der Reget die Substitution von einer Aminosäure für eine andere mit ähnlichen Merkmalen, z. B. Substitutionen in den folgenden Gruppen: Valin, Glycin; Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin ein. Andere Beispiele üblicher Substitutionen sind in Tabelle 1 ersichtlich.
TABELLE 1– ÜBLICHE AMINOSÄURE-SUBSTITUTIONEN
Aminosäuresequenz-Varianten eines Proteins können durch jedwede Reihe verschiedener im Stand der Technik bekannter Verfahren hergestellt werden. So kann zum Beispiel eine zufällige DNA-Mutagenese, die für ein Protein oder eine bestimmte Domäne oder Region eines Proteins kodiert, verwendet werden, wie z. B. die PCR-Mutagenese (unter Verwendung von z. B. reduzierter Taq-Polymerase-Wiedergabetreue zur Einführung zufälliger Mutationen in ein kloniertes DNA-Fragment; Leung et al., BioTechnique 1: 11–15 (1989)), oder Sättigungs-Mutagenese (durch z. B. chemische Behandlung oder Bestrahlung von einsträngiger DNA in vitro und Synthese eines komplementären DNA-Stranges; Mayers et al., Science 229:242 (1985)). Eine zufällige Mutagenese kann z. B. auch durch eine degenerierte Oligonukleotid-Generierung (unter Verwendung von z. B. einem automatischen DNA-Synthesizer zum chemischen Synthetisieren degenerierter Sequenzen erreicht werden; Narang, Tetrahedron 39:3 (1983); Itakura et al., Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, Hrsg. A.G. Walton, Amsterdam: Elsevier, S. 273–289 (1981)). Die nicht zufällige oder gerichtete Mutagenese kann zur Bereitstellung spezifischer Sequenzen oder Mutationen in spezifischen Regionen verwendet werden. Diese Verfahren können zur Herbeiführung von Varianten verwendet werden, die z. B. Deletionen, Insertionen, oder Substitutionen von Resten der bekannten Aminosäuresequenz eines Proteins einschließen. Die Stellen für die Mutation können individuell oder in Reihe modifiziert werden, wie z. B. durch (i) Substitution zuerst mit den konservierten Aminosäuren und dann mit radikaleren Wahlen, in Abhängigkeit von den erreichten Ergebnissen, (ii) Deletion des Target-Restes, (iii) Insertion der Reste von der gleichen oder einer unterschiedlichen Klasse angrenzend an die lokalisierte Stelle, oder (iv) Kombinationen des Vorstehenden. Analoga können zum Beispiel durch in vitro-DNA-Sequenzmodifikationen der Sequenzen von 10–18 (SEQ ID NO:10–18) hergestellt werden. Die in vitro-Mutagenese kann zum Beispiel zur Umwandlung von jedweder dieser DNA-Sequenzen in eine Sequenz verwendet werden, die für ein Analogon kodiert, worin ein oder mehr Aminosäurerest(e) einem Ersatz, z. B. einem wie in Tabelle 1 beschriebenen üblichen Ersatz unterlag.
Verfahren zur Identifikation erwünschter Mutationen schließen z. B. die Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham and Wells, Science 244: 1081–1085 (1989)), die Oligonukleotidvermittelte Mutagenese (Adelman et al., DNA 2:183 (1983)); die Kassetten-Mutagenese (Wells et al., Gene 34:315 (1985)), die kombinatorische Mutagenese und die Phagen-Display-Bibliotheken (Ladner et al., Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO88/06630) ein. Die LBP-Analoga können z. B. auf ihre Fähigkeit zur Bindung an LDL und/oder an eine arterielle extrazelluläre Matrixkomponente, wie hierin beschrieben, getestet werden.
Andere erfindungsgemäße Analoga schließen z. B. die mit Modifikationen ein, die die Peptidstabilität erhöhen. Derartige Analoga können z. B. eine oder mehr Nichtpeptidbindung(en) (welche die Peptidbindungen ersetzen) in der Peptidsequenz enthalten. Auch eingeschlossen sind z. B.: Analoga, die Reste mit Ausnahme der natürlich vorkommenden L-Aminosäuren, z. B. D-Aminosäuren oder nicht natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäuren, z. B. β- oder γ-Aminosäuren; und cyclische Analoga, einschließen.
Analoga sollen auch Peptide einschließen, in welche strukturelle Modifikationen in die Peptidhauptkette eingeführt wurden, um das Peptid nicht hydrolysierbar zu machen. Solche Peptide sind für die orale Verabreichung besonders nützlich, da sie nicht verdaut werden. Modifikationen von Peptidhauptketten schließen z. B. Modifikationen des Amid-Stickstoffs, des α-Kohlenstoffs, des Amidcarbonyls oder der Amidbindung, und Modifikationen, die Erweiterungen, Deletionen oder Vernetzungen von Hauptketten beinhalten, ein. Die Hauptkette kann zum Beispiel durch Substitution eines Sulfoxids für das Carbonyl, durch Umkehrung der Peptidbindung oder durch Substitution eines Methylens für die Carbonylgruppe modifiziert werden. Derartige Modifikationen können durch dem Fachmann bekannte Standardverfahren hergestellt werden. Siehe z. B. Spatola. A.F., „Peptide Backbone Modifications: A Structure-Activity Analysis of Peptides Containing Amide Bond Surrogates, Conformational Constraints, and Related Backbone Replacements," in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, S. 267–357, B. Weinstein (Hrsg.), Marcel Dekker, Inc., New York (1983).
Ein Analogon soll auch Polypeptide einschließen, worin einer oder mehr der Aminosäurereste eine Substituentengruppe oder Polypeptide, die mit einer anderen Verbindung fusioniert sind, z. B. eine Verbindung zur Erhöhung der Halbwertzeit des Polypeptids, z. B. Polyethylenglykol, einschließen.
Unter Fragment versteht man einen Anteil des natürlich vorkommenden LBP-Polypeptids. Das Fragment weist bevorzugt mindestens ca. 100 Aminosäurereste, bevorzugter mindestens ca. 50 Aminosäurereste, noch bevorzugter mindestens ca. 30 Aminosäurereste, noch bevorzugter mindestens ca. 20 Aminosäurereste, noch bevorzugter mindestens ca. 5 Aminosäurereste, noch bevorzugter mindestens ca. 4 Aminosäurereste, noch bevorzugter mindestens ca. 3 Aminosäurereste und am bevorzugtesten mindestens ca. 2 Aminosäurereste in Länge auf. Die Fragmente schließen z. B. trunkierte sezernierte Formen, proteolytische Fragmente; Spleißfragmente, andere Fragmente und chimäre Konstrukte zwischen mindestens einem Anteil des relevanten Gens, z. B. LBP-1, LBP-2 oder LBP-3, und ein anderes Molekül ein. Fragmente von LBP können anhand von dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden. In bestimmten Ausführungsformen ist das Fragment biologisch aktiv. Die Fähigkeit eines Kandidatenfragments, eine biologische Aktivität von LBP aufzuweisen, kann mittels dem Fachmann bekannten Verfahren beurteilt werden. LBP-Fragmente können zum Beispiel auf ihre Fähigkeit, an LDL und/oder eine arterielle extrazelluläre strukturelle Matrixkomponente, wie hierin beschrieben, zu binden, nachgewiesen werden. Auch eingeschlossen sind LBP-Fragmente, enthaltend Reste, die für die biologische Aktivität des Fragmentes nicht erforderlich sind oder die sich aus dem alternativen mRNA-Spleißen oder den alternativen Ereignissen des Protein-Processings ergeben.
Fragmente eines Proteins können durch jedwede Reihe dem Fachmann bekannter verschiedener Verfahren, wie z. B. rekombinant durch proteolytischen Aufschluss oder durch chemische Synthese, hergestellt werden. Interne oder terminale Fragmente eines Polypeptids können durch Entfernung von einem oder mehr Nukleotid(en) von einem Ende (für ein terminales Fragment) oder beiden Enden (für ein internes Fragment) einer Nukleinsäure, die für das Polypetid kodiert, hergestellt werden. Die Expression der mutagenisierten DNA produziert Polypeptidfragmente. Der Aufschluss mit „end-nibbling" Endonukleasen kann folglich DNAs herstellen, die für ein Array von Fragmenten kodieren. DNAs, die für Fragmente eines Proteins kodieren, können auch generiert werden, z. B. durch zufälliges Scheren, Restriktionsaufschluss oder eine Kombination der vorstehend besprochenen Verfahren. So können zum Beispiel Fragmente von LBP durch Expression von LBP-DNA hergestellt werden, die in vitro zum Kodieren des gewünschten Fragments, z. B. durch Restriktionsaufschluss von jedweder der DNA-Sequenzen von 10–18 (SEQ ID NO:10–18), manipuliert wurden.
Die Fragmente können auch unter Verwendung der im Stand der Technik bekannten Verfahren, z. B. der üblichen Menifield-Festphasen-f-Moc- oder -t-Boc-Chemie, chemisch synthetisiert werden. Erfindungsgemäße Peptide können zum Beispiel arbiträr in Fragmente der gewünschten Länge mit keiner Überlappung der Fragmente der gewünschten Länge oder in überlappende Fragmente einer gewünschten Länge aufgeteilt werden.
Ein LBP oder ein biologisch aktives Fragment oder ein Analogon davon, oder ein Bindungsmolekül oder ein biologisch aktives Fragment oder Analogon davon kann z. B. mit seinem verwandten Molekül um die Bindungsstelle am komplementären Molekül konkurrieren und dadurch die Bindung zwischen dem LBP und dem zellulären Bindungsmolekül reduzieren oder eliminieren. Das LBP oder ein Bindungsmolekül kann zum Beispiel aus der Reinigung oder Sekretion von natürlich vorkommendem LBP oder Bindungsmolekül, aus rekombinantem LBP oder Bindungsmolekül oder aus synthetisiertem LBP oder Bindungsmolekül erhalten werden.
Deshalb sind dem Fachmann Verfahren zur Herstellung von Analoga und Fragmenten und ihr Testen auf Aktivität bekannt.
Ein Mittel kann auch eine Nukleinsäure darstellen, die als ein Antisense-Molelül verwendet wird. Die Antisense-Therapie soll z. B. die Verabreichung oder die Herstellung in situ von Oligonukleotiden oder ihrer Derivate einschließen, die spezifisch hybridisieren, z. B. unter zellulären Bedingungen mit der zellulären mRNA und/oder der genomischen DNA, kodierend für ein LBP-Polypeptid, oder einer Mutanten davon zu binden, um die Expression des kodierten Proteins, z. B. durch Inhibition der Transkription und/oder Translation, zu inhibieren. Die Bindung kann durch übliche Basenpaar-Komplementarität oder zum Beispiel im Fall der Bindung an DNA-Duplexe, durch spezifische Interaktionen in der bedeutenden Furche der Doppelhelix, erfolgen.
In bestimmten Ausführungsformen bindet das Antisense-Konstrukt an eine natürlich vorkommende Sequenz eines LBP-Gens, das z. B. an der Expression des Gens beteiligt ist. Diese Sequenzen schließen z. B. einen Promotor, Startcodons, Stoppcodons und RNA-Polymerase-Bindungsstellen ein.
In anderen Ausführungsformen bindet das Antisense-Konstrukt an eine Nukleotidsequenz, die im Wildtyp-Gen nicht vorliegt. Das Antisense-Konstrukt kann zum Beispiel an eine Region eines LBP-Gens binden, das eine Insertion von einer exogenen Nichtwildtyp-Sequenz enthält. Als Alternative kann das Antisense-Konstrukt an eine Region eines LBP-Gens binden, das einer Deletion unterlag, wodurch zwei Regionen des Gens zusammengebracht werden, die in der Regel nicht zusammen positioniert sind und die zusammen eine Nichtwildtyp-Sequenz herbeiführen.
Ein erfindungsgemäßes Antisense-Konstrukt kann z. B. als ein Expressionsplasmid geliefert werden, das – wenn es in die Zelle transkribiert wird – RNA produziert, die mindestens zu einem einzigartigen Anteil der zellulären mRNA, die für ein LBP-Polypeptid kodiert, komplementär ist. Eine Alternative besteht darin, dass das Antisense-Konstrukt ein Oligonukleotid darstellt, das ex vivo gebildet wird und das, wenn es in die Zelle eingeführt wird, zu einer Inhibition der Expression durch Hybridisierung mit der mRNA (Duplexierung) und/oder den genomischen Sequenzen (Triplexierung) eines LBP-Gens führt. Derartige Oligonukleotide stellen bevorzugt modifizierte Oligonukleotide dar, die gegen endogene Nukleasen, wie z. B. Exonukleasen und/oder Andonucleasen resistent und deshalb in vivo stabil sind. Beispielhafte Nukleinsäuremoleküle zum Gebrauch als Antisense-Oligonukleotide stellen Phosphoramidat, Phosphorthioat, Phosphordithioate und Methylphosphonat-Analoga von DNA und Peptid-Nukleinsäuren (PNA) ein. (Siehe auch US-Patente 5,176,996; 5,264,564; und 5,256,775). Zusätzlich wurden allgemeine Ansätze zur Konstruktion von in der Antisense-Therapie nützlichen Oligomeren überprüft. (Siehe z. B. Van der Krol et al. Biotechniques 6: 958–976, (1988); Stein et al. Cancer Res. 48: 2659–2668 (1988).
Unter Mimetikum versteht man ein Molekül, das hinsichtlich der Form und/oder Ladungsverteilung dem LBP oder einem Bindungsmolekül ähnlich ist. Das Mimetikum kann ein Peptid oder ein Nichtpeptid darstellen. Mimetika können als Therapeutika wirken, da sie z. B. die Bindung von LBP an ein Bindungsmolekül kompetitiv inhibieren können. Durch Einsatz von z. B. der Scanning-Mutagenese, z. B. Alanin-Scanning-Mutagenese, Linker-Scanning-Mutagenese oder Sättigungsmutagenese zum Mapping der Aminosäurereste eines bestimmten LBP-Polypeptids, das an der Bindung eines Bindungsmoleküls beteiligt ist, können Peptid-Mimetika, wie z. B. Diazepin oder Isochinolin-Derivate hergestellt werden, die diese Reste bei der Bindung an ein Bindungsmolekül mimicken und die deshalb die Bindung des LBPs an ein Bindungsmolekül inhibieren können und dadurch in die Funktion des LBPs eingreifen. Nicht hydrolysierbare Peptid-Analoga solcher Reste können unter Verwendung von z. B. Benzodiazepin (siehe z. B. Freidinger et al., in Peptides; Chemistry and Biology, G.R. Marshall, Hrsg., ESCOM Publisher Leiden, Niederlande (1988); Azepin (siehe z. B. Huffman et al., in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall, Hrsg., ESCOM Publisher, Leiden, Niederlande (1988)); substituierte γ-Lactamringe (siehe z. B. Garvey et al., in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall, Hrsg., ESCOM Publisher: Leiden, Niederlande (1988)); Ketomethylen-Pseudopeptide (siehe z. B. Ewenson et al., J. Med. Chem. 29:295 (1986); Ewenson et al., in Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL (1985)); Dipeptid-Kerne der β-Schleife (siehe z. B. Nagai et al., Tetrahedron Lett. 26:647 (1985); Sato et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:1231 (1986)); oder β-Aminoalkohole (siehe z. B. Gordon et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 126:419 (1985); Dann et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 134:71 (1486)) hergestellt werden.
Antikörper sollen Antikörper gegen jedwede Komponente einschließen, die sich direkt oder indirekt auf den LBP-Metabolismus auswirken. Die Antikörper können z. B. gegen LBP oder ein Bindungsmolekül, oder eine Untereinheit oder Fragment davon gerichtet sein. Antikörper schließen zum Beispiel Anti-LBP-1-, -LBP-2- oder -LBP-3-Antikörper; und gegen Bindungsmoleküle gerichtete Antikörper ein. Antikörper-Fragmente sollen zum Beispiel Fab-Fragmente, Fab'-Fragmente, F(ab')₂-Fragmente, F(v)-Fragmente, Schwerkettenmonomere, Schwerkettendimere, Schwerkettentrimere, Leichtkettenmonomere, Leichtkettendimere, Leichtkettentrimere, Dimere, die aus einer Schwer- und einer Leichtkette bestehen, und Peptide, die die Aktivität der gegen LBP oder gegen das Bindungsmolekül gerichteten Antikörper mimicken, ein. So können zum Beispiel Fab₂'-Fragmente des inhibitorischen Antikörpers, z. B. durch enzymatische Spaltung herbeigeführt werden. Es können erfindungsgemäß sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper verwendet werden. Monoklonale Antikörper werden bevorzugt verwendet. Erfindungsgemäß eingeschlossen sind natürliche Antikörper, rekombinante Antikörper oder chimäre Antikörper, wie z. B. humanisierte Antikörper. Humanisierte Antikörper werden bevorzugt verwendet, wenn der Proband ein Mensch ist. Die Antikörper weisen am bevorzugtesten eine konstante Region auf, die sich von einem humanen Antikörper herleitet und einer variablen Region, die sich von einem inhibitorischen monoklonalen Antikörper von der Maus herleitet. Die Produktion polyklonaler Antikörper gegen LBP wird in Beispiel 6 beschrieben. Monoklonale und humanisierte Antikörper werden anhand von dem Fachmann bekannten Standardverfahren gebildet. Monoklonale Antikörper können z. B. durch jedwedes Verfahren hergestellt werden, das Antikörper bereitstellt, die von kontinuierlichen Zelllinienkulturen produziert werden. Beispiele schließen das Hybridom-Verfahren (Kohler und Milstein, Nature 256: 495–497 (1975), das Triom-Verfahren, das humane B-Zell-Hybridom-Verfahren (Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983)) und das EBV-Hybridom-Verfahren zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper (Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, A.R. Liss, Inc., S. 77–96 (1985)) ein. Humanisierte Antikörper werden mithilfe üblicher Herstellungs- und Ernteverfahren hergestellt (Berkower, I., Curr. Opin. Biotechnol 7: 622–628 (1996); Ramharayan and Skaletsky, Am. Biotechnol. Lab 13: 26–28 (1995)). In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen werden die Antikörper gegen das LBP, bevorzugt die LDL-Bindungsstelle gebildet und die hergestellten Fab-Fragmente produziert. Diese Antikörper oder sich davon herleitende Fragmente können z. B. zum Blockieren der LDL-Bindungsstellen an den LBP-Molekülen verwendet werden.
Die Mittel schließen auch Inhibitoren eines Moleküls ein, die für die Synthese, die posttranslationale Modifikation oder die Funktion von LBP und/oder ein Bindungsmolekül oder Aktivatoren eines Moleküls erforderlich sind, die die Synthese oder Funktion von LBP und/oder des Bindungsmoleküls inhibieren. Die Mittel schließen z. B. Cytokine, Chemokine, Wachstumsfaktoren, Hormone, Signalisierungskomponenten, Kinasen, Phosphatasen, Homeobox-Proteine, Transkriptionsfaktoren, Editionsfaktoren, Translationsfaktoren und Posttranslationsfaktoren oder Enzyme ein. Die Mittel sollen auch ionisierende Strahlung, nicht ionisierende Strahlung, Ultraschall und toxische Mittel einschließen, die z. B. mindestens teilweise das LBP und/oder das Bindungsmolekül inaktivieren oder zerstören.
Ein Mittel soll auch ein Mittel einschließen, das nicht vollkommen LBP-spezifisch ist. So kann zum Beispiel ein Mittel andere Gene oder Proteine einschließen, die mit der arteriellen Plaquebildung in Beziehung stehen. Eine derartige überlappende Spezifität kann zusätzliche therapeutische Vorteile bereitstellen.
Es ist erfindungsgemäß auch das Mittel eingeschlossen, das als solches als nützlich bei der Behandlung der Atherosklerose identifiziert wurde.
Es ist erfindungsgemäß auch ein Verfahren zur Bewertung eines Mittels mit der Fähigkeit zur Veränderung der Bindung von LBP-Polypeptid an ein Bindungsmolekül eingeschlossen. Ein Mittel ist bereitgestellt. Ein LBP-Polypeptid ist bereitgestellt. Ein Bindungsmolekül ist bereitgestellt. Das Mittel, LBP-Polypeptid und Bindungsmolekül sind kombiniert. Die Bildung eines Komplexes, umfassend das LBP-Polypeptid und Bindungsmolekül wird nachgewiesen. Eine Änderung der Bildung des Komplexes in Anwesenheit des Mittels im Vergleich zur Abwesenheit des Mittels ist indikativ dafür, dass das Mittel die Bindung des LBP-Polypeptids an das Bindungsmolekül ändert.
In bevorzugten Ausführungsformen stellt das LBP-Polypeptid LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 dar. Beispiele eines Bindungsmoleküls schließen native LDL, modifizierte LDL, wie z. B. methylierte LDL oder oxidierte LDL und arterielle extrazelluläre Matrixstrukturkomponenten ein.
Die Veränderung der Bindung schließt z. B. die Inhibition oder Förderung der Bindung ein. Die Wirksamkeit des Mittels kann beurteilt werden, wie z. B. durch Erstellung von Dosis-Wirkungskurven aus den erhaltenen Daten unter Verwendung verschiedener Konzentrationen des Mittels. Bei den Verfahren zur Bestimmung der Bildung eines Komplexes handelt es sich um Standardverfahren, und diese sind dem Fachmann bekannt, wie z. B. die wie hierin beschriebenen ACE-Assays (Affinity Coelectrophoresis Assays) oder ELISA-Assays.
Es sind erfindungsgemäß auch Mittel eingeschlossen, die als solches identifiziert sind, dass sie zur Änderung der Bindung eines LBP-Polypeptids an ein Bindungsmolekül fähig sind.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Bewertung eines Mittels auf die Fähigkeit zur Bindung an ein LBP-Polypeptid. Ein Mittel ist bereitgestellt. Ein LBP-Polypeptid ist bereitgestellt. Das Mittel wird mit dem LBP-Polypeptid kontaktiert. Die Fähigkeit des Mittels, an das LBP-Polypeptid zu binden, wird bewertet. Das LBP-Polypeptid stellt bevorzugt LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 dar. Die Bindung kann z. B. durch Messung der Bildung eines Komplexes durch dem Fachmann bekannte Standardverfahren, wie z. B. die hierin beschriebenen ACE-Assays (Affinity Coelectrophoresis Assays) und ELISA-Assays bestimmt werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Bewertung eines Mittels auf die Fähigkeit, an eine Nukleinsäure zu binden, die für eine LBP-Regulationssequenz kodiert. Ein Mittel ist bereitgestellt. Eine Nukleinsäure, die für eine LBP-Regulationssequenz kodiert, ist bereitgestellt. Das Mittel wird mit der Nukleinsäure kontaktiert. Die Fähigkeit des Mittels, an die Nukleinsäure zu binden, wird bewertet. Die LBP-Regulationssequenz stellt bevorzugt eine LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Regulationssequenz dar. Die Bindung kann z. B. durch Messung der Bildung eines Komplexes anhand von dem Fachmann bekannten Standardverfahren, wie z. B. DNA-Mobility-Shift-Assays, DNase-I-Footprint-Analyse (Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, (1989)) bestimmt werden.
Es ist erfindungsgemäß auch das Mittel eingeschlossen, das so identifiziert ist, dass es zur Bindung an eine Nukleinsäure, kodierend für eine LBP-Regulationssequenz, fähig ist.
Hierin beschriebene Verfahren können zur Behandlung der Atherosklerose bei einem Tier nützlich sein. Ein Tier mit Bedarf an einer Behandlung gegen Atherosklerose ist bereitgestellt. Ein Mittel, das zur Veränderung eines Aspekts der LBP-Struktur oder des -Metabolismus fähig ist, ist bereitgestellt. Das Mittel wird an das Tier in einer therapeutisch wirksamen Menge dergestalt bereitgestellt, dass die Behandlung der Atherosklerose eintritt.
Das Mittel kann ein LBP-Polypeptid, z. B. LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 oder ein biologisch aktives Fragment oder ein Analogon davon, darstellen. Das Mittel kann z. B. das wie in SEQ ID NO:1–9 dargelegte Polypeptid sein. Das Mittel stellt bevorzugt ein Polypeptid von nicht mehr als ca. 100 Aminosäureresten in Länge, bevorzugter von nicht mehr als ca. 50 Aminosäureresten, noch bevorzugter von nicht mehr als ca. 30 Aminosäureresten, noch bevorzugter von nicht mehr als ca. 20 Aminosäureresten, noch bevorzugter von nicht mehr als ca. 10 Aminosäureresten, noch bevorzugter von nicht mehr als ca. 5 Aminosäureresten, noch bevorzugter von nicht mehr als ca. 4 Aminosäureresten, noch bevorzugter von nicht mehr als ca. 3 Aminosäureresten und am bevorzugtesten von nicht mehr als ca. 2 Aminosäureresten dar. Das Polypeptid schließt bevorzugt mindestens ca. 20 % saure Aminosäurereste, noch bevorzugter mindestens 40 % saure Aminosäurereste, noch bevorzugter mindestens ca. 60 % saure Aminosäurereste, noch bevorzugter mindestens ca. 80 % saure Aminosäurereste, noch bevorzugter mindestens ca. 90 % saure Aminosäurereste, noch bevorzugter mindestens ca. 95 % saure Aminosäurereste und am bevorzugtesten mindestens ca. 98 % saure Aminosäurereste ein. Saure Aminosäurereste schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein. Ein Beispiel eines derartigen LBP-Polypeptids stellt BHF-1 dar, das ein 20 Aminosäuren langes Fragment aus LBP-1 vom Menschen oder Kaninchen darstellt, das die Aminosäurereste 14 bis 33 enthält. Siehe 9 (SEQ ID NO:9). 45 % der Aminosäurereste von BHF-1 sind sauer. Gegenstand der Erfindung sind auch biologisch aktive Fragmente und Analoga von BHF-1.
Andere bevorzugte saure Regionen von den LBP stellen Aminosäurereste 8 bis 22 (SEQ ID NO:19), 8 bis 33 (SEQ ID NO:20), 23 bis 33 (SEQ ID NO:21) und 208 bis 217 (SEQ ID NO:22) von humanem LBP-2, wie in 7 (SEQ. ID NO:7) erläutert ist; Aminosäurereste 14 bis 43 (SEQ ID NO:23) und 38 bis 43 (SEQ ID NO:24) von LBP-1 vom Kaninchen oder Menschen, wie in 1 (SEQ ID NO:1) und 6 (SEQ ID NO:6) erläutert ist; Aminosäurereste 105 bis 120 (SEQ ID NO:25), 105 bis 132 (SEQ ID NO:26), 121 bis 132 (SEQ ID NO:27) und 211 bis 220 (SEQ ID NO:28) von LBP-2 vom Kaninchen, wie in 2 (SEQ ID NO:2) erläutert ist; Aminosäurereste 96 bis 110 (SEQ ID NO:29) von LBP-3 vom Kaninchen, wie in 5 (SEQ ID NO:5) erläutert ist; und Aminosäurereste 53–59 (SEQ ID NO:41) von humanem LBP-3, wie in 8 (SEQ ID NO:8) erläutert ist, dar. Es sollen erfindungsgemäß auch biologisch aktive Fragmente und Analoga von jedwedem dieser Polypeptide eingeschlossen sein.
Andere Beispiele von Mitteln schließen Homopolymere und Heteropolymere von jedweder Aminosäure oder jedwedem Aminosäureanalogon ein. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen stellt das Mittel ein Homopolymer einer sauren Aminosäure oder einem Analogon davon dar. In bestimmten Ausführungsformen stellt das Mittel ein Heteropolymer von einer oder mehr sauren Aminosäure(n) und einer oder mehr anderen Aminosäure(n) oder Analoga davon dar. Die Mittel schließen zum Beispiel Poly(Glu), Poly(Asp), Poly(Glu-Asp), Poly(Glu-N), Poly(Asp-N) und Poly(Glu-Asp-N) dar. Unter N versteht man jedwede Aminosäure oder ein Analogon davon mit Ausnahme von Glu oder Asp. Unter Poly(Glu-Asp) versteht man alle Permutationen von Glu und Asp für ein Peptid einer gegebenen Länge. Ein bevorzugtes Peptid stellt Poly(Glu) von einer Länge von nicht mehr als ca. 10 Aminosäuren, bevorzugt von einer Länge von ca. 7 Aminosäuren dar.
Das Mittel kann LBP-Nukleinsäure oder ein biologisch aktives Fragment oder Analogon davon, wie z. B. eine Nukleinsäure darstellen, die für ein LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Polypeptid oder ein biologisch aktives Fragment oder Analogon davon kodiert. Das Mittel kann z. B. eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO:10–18 dargelegt ist, darstellen. In anderen Ausführungsformen stellt das Mittel ein Antisense-Molekül, wie z. B. eines, das an eine LBP-Gensequenz binden kann, dar.
Behandlung soll z. B. Prävention, Behandlung, Reduktion der Symptome von oder Heilen der Atherosklerose einschließen. Die Verabreichung des Mittels soll durch jedwedes Verfahren erreicht werden, welches dem Mittel ermöglicht, dass es die Target-Zellen erreicht. Diese Verfahren schließen z. B. Injektion, Ablagerung, Implantation, Suppositorien, orale Aufnahme, Inhalation, topische Verabreichung oder jedwedes andere Verabreichungsverfahren ein, bei der durch das Mittel Zugang zu den Target-Zellen erhalten wird. Injektionen können z. B. intravenös, intradermal, subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal gegeben werden. Die Implantation schließt die Insertion implantierbarer Arzneimittelabgabesysteme, wie z. B. Mikrosphären, Hydrogele, polymere Reservoire, Cholesterol-Matrices, polymere Systeme, wie z. B. Matrixerosions- und/oder Diffusionssysteme und nicht polymere Systeme, wie z. B. komprimierte, fusionierte oder teilweise fusionierte Pellets ein. Suppositorien schließen Glycerin-Suppositorien ein. Dosen zur oralen Aufnahme können magensaftresistent sein. Die Inhalation schließt die Verabreichung des Mittels mit einem Aerosol in einem Inhalator, entweder allein oder gebunden an einen Träger, der absorbiert werden kann, ein.
Die Verabreichung des Mittels kann allein oder in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln erfolgen. Das Mittel kann mit einem geeigneten Träger, der in ein Liposom inkorporiert ist oder in ein Polymer-Freisetzungssystem inkorporiert ist, kombiniert werden.
Die Verabreichung kann so konzipiert sein, das sie zu sequenziellen Expositionen gegenüber dem Mittel über einen Zeitraum, wie z. B. Stunden, Tage, Wochen, Monate oder Jahre führt. Dies kann durch wiederholte Verabreichung des Mittels durch eines der vorstehend beschriebenen Verfahren erreicht werden, oder als Alternative durch ein Abgabesystem zur kontrollierten Freisetzung, worin das Mittel über einen verlängerten Zeitraum, ohne wiederholte Verabreichungen, an das Tier abgegeben wird. Unter einem Abgabesystem zur kontrollierten Freisetzung versteht man, dass die Gesamtfreisetzung des Mittels nicht sofort nach der Verabreichung auftritt, sondern vielmehr für eine bestimmte Zeitdauer verzögert wird. Die Freisetzung kann in Schüben auftreten, oder sie kann graduell und kontinuierlich auftreten. Die Verabreichung eines solchen Systems kann z. B. lang wirkende orale Dosierungsformen, Bolusinjektionen, transdermale Pflaster oder subkutane Implantate einschließen.
Beispiele von Systemen, in denen die Freisetzung in Schüben auftritt, schließen z. B. Systeme ein, in denen das Mittel in Liposomen eingeschlossen ist, die in einer Polymer-Matrix eingekapselt sind, wobei die Liposomen empfindlich gegen einen spezifischen Stimulus, wie z. B. Temperatur, pH, Licht, Magnetfeld oder Abbauenzym und Systeme sind, in denen das Mittel durch eine ionisch beschichtete Mikrokapsel mit einem Mikrokapsel-Core-Abbauenzym eingekapselt ist. Beispiele von Systemen, in denen die Freisetzung des Mittels graduell und kontinuierlich erfolgt, schließen z. B. Erosionssysteme ein, worin das Mittel in einer Form in einer Matrix enthalten ist, und Diffusionssysteme, in denen das Mittel bei einer kontrollierten Rate, wie z. B. durch ein Polymer, permeiert. Solche Systeme mit hinhaltender Freisetzung können z. B. in der Form von Pellets oder Kapseln vorliegen.
Das Mittel kann in einer Flüssigkeit, z. B. in aufgelöster Form oder kolloidaler Form, suspendiert sein. Die Flüssigkeit kann ein Lösungsmittel, ein Teillösungsmittel oder ein Nichtlösungsmittel darstellen. In vielen Fällen können Wasser oder eine organische Flüssigkeit verwendet werden.
Das Mittel kann vor oder im Anschluss an das Auftreten atherosklerotischer Symptome verabreicht werden. Das Mittel kann an Patienten mit einer Familienanamnese für Atherosklerose oder die Phänotypen aufweisen, die gegebenenfalls auf eine Prädisposition für Atherosklerose hindeuten könnten oder bei denen diagnostiziert wurde, dass sie einen Genotyp aufweisen, der den Patienten für Atherosklerose prädisponiert, oder die andere Risikofaktoren, wie z. B. Hypercholesterinämie, Hypertonie oder Rauchen, aufweisen, verabreicht werden.
Das Mittel kann an das Tier in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht werden. Unter therapeutisch wirksamer Menge versteht man die Menge, die dazu fähig ist, die Atherosklerose mindestens teilweise zu verhindern oder rückgängig zu machen. Eine therapeutisch wirksame Menge kann auf einer individuellen Basis bestimmt werden und wird zumindest teilweise auf der Erwägung der Tierspezies, der Größe des Tieres, dem Alter des Tieres, dem angewendeten Mittel, des Typs des verwendeten Abgabesystems, der Verabreichungszeit in Bezug auf den Beginn der Atherosklerosesymptome und ob Einzel- oder Mehrfachdosisregimen oder Dosisregimen mit kontrollierter Freisetzung eingesetzt werden, basieren. Eine therapeutisch wirksame Menge kann von einem Durchschnittsfachmann hinsichtlich des Einsatzes dieser Faktoren und unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimentierung bestimmt werden.
Die Konzentration des Mittels liegt bevorzugt bei einer Dosis von ca. 0,1 bis ca. 1000 mg/kg Körpergewicht/Tag, bevorzugter bei ca. 0,1 bis ca. 500 mg/kg/Tag, noch bevorzugter bei ca. 0,1 bis ca. 100 mg/kg/Tag und am bevorzugtesten bei ca. 0,1 bis ca. 5 mg/kg/Tag. Die spezifische Konzentration hängt teilweise von dem entsprechenden angewendeten Mittel ab, da einige wirksamer als andere sind. Die Dosierungskonzentration des Mittels, die tatsächlich verabreicht wird, hängt zumindest teilweise von der Endkonzentration, die am Wirkort erwünscht ist, dem Verabreichungsverfahren, der Wirksamtkeit des entsprechenden Mittels, der Langlebigkeit des entsprechenden Mittels und dem genauen Zeitpunkt der Verabreichung relativ zum Beginn der Atherosklerosesymptome ab. Die Dosierungsform ist bevorzugt dergestalt, dass sie sich im Wesentlichen nicht nachteilig auf das Tier auswirkt. Die Dosierung kann von einem Durchschnittsfachmann, der solche Faktoren einsetzt und nicht mehr als Routineexperimentierung verwendet, bestimmt werden.
In bestimmten Ausführungsformen können verschiedene Genkonstrukte als Teil eines Gentherapie-Protokolls zur Abgabe von Nukleinsäuren, die für ein Mittel, z. B. entweder eine agonistische oder antagonistische Form eines LBF-Polypeptids, kodieren, verwendet werden. So können zum Beispiel Expressionsvektoren für die in vivo-Transfektion und -Expression eines LBP-Polypeptids in bestimmtem Zelltypen verwendet werden, um die Funktion des LBP-Polypeptids in einer Zelle, in der das LBP des Nichtwildtyps exprimiert wird, zu rekonstituieren oder als Alternative, die Funktion davon außer Kraft zu setzen. Expressionskonstrukte des LBP-Polypeptids und Mutanten davon können in jedwedem biologisch wirksamen Träger, z. B. jedweder Formulierung oder Zusammensetzung, die zur wirksamen Abgabe des LBP-Gens an Zellen in vivo in der Lage ist, verabreicht werden. Die Ansätze schließen z. B. die Insertion des erfindungsgemäßen Gens in virale Vektoren, einschließlich z. B. rekombinante Retroviren, Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren und Herpes-simplex-Virus-1, oder rekombinante bakterielle oder eukaryote Plasmide ein. Virale Vektoren infizieren oder transduzieren Zellen direkt; Plasmid-DNA kann mithilfe von zum Beispiel kationischen Liposomen (Lipofectin^TM (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) oder derivatisierten (z. B. Antikörper-Konjugat) Polylysin-Konjugaten, Gramicidin S, artifiziellen Virushüllen oder anderen solcher intrazellulärer Träger ebenso wie der direkten Injektion des Genkonstrukts oder in vivo durchgeführter Ca₃(PO₄)₂-Präzipitation, abgegeben werden. Die vorstehend beschriebenen Verfahren sind dem Fachmann bekannt und können ohne übermäßige Experimentierung durchgeführt werden. Da die Transduktion geeigneter Target-Zellen den kritischen ersten Schritt in der Gentherapie darstellt, hängt die Wahl des entsprechenden Genabgabesystems von solchen Faktoren wie dem Phänotyp des beabsichtigten Targets und der Verabreichungsroute, wie z. B. lokal oder systemisch, ab. Die Verabreichung kann auf einen oder mehr Zelltyp(en) und auf eine oder mehr Zelle(n) in einem Zelltyp gerichtet sein, um auf diese Weise therapeutisch wirksam zu sein, mithilfe von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Das Mittel kann an die Arterienwandzellen verabreicht werden. Die Verabreichung kann über das pränatale Tier oder die Embryozelle vorgenommen werden. Man wird erkennen, dass das entsprechend konstruierte Gen, das eine niedrige transduktionale LBP-Expression in vivo bereitstellte, auch für die in vitro-Transduktion von Zellen, wie zum Beispiel zur Anwendung in hierin beschriebenen diagnostischen Assays, nützlich ist.
Die Therapie der Atherosklerose kann mit Antisense-Nukleotid-Analoga der Gene, die für die LBP kodieren, durchgeführt werden. Die Antisense-Nukleotide weisen bevorzugt nicht hydrolysierbare „Hauptketten", wie z. B. Phosphorthioate, Phosphordithioate oder Methylphosphonate auf. Die Nukleosid-Basensequenz ist komplementär zur Sequenz eines Anteils des Gens, das z. B. für LBP-1, –2 oder –3 kodiert. Eine derartige Sequenz könnte z. B. ATTGGC sein, wenn die Gensequenz für das LBP TAACCG darstellt. Eine Ausführungsform einer derartigen Therapie wäre die Inkorporation eines Antisense-Analogons eines Anteils von einem der LBP-Gene in einem Medium mit langsamer Freisetzung, wie z. B. Polyvinylalkohol, das z. B. durch subkutane Injektion verabreicht wird, um das Antisense-Nukleotid-Analogon über einen Zeitraum von Wochen oder Monaten freizusetzen. In einer anderen Ausführungsform wird das Antisense-Analogon in eine polymere Matrix, z. B. Polyvinylalkohol dergestalt inkorporiert, dass das Gel lokal auf eine verletzte Arterienwand appliziert werden kann, um die LBP-Synthese zu inhibieren und die LDL-Akkumulation, z. B. nach der Angioplastie oder der Atherektomie, zu verhindern.
Die hierin beschriebenen Verfahren können zur Behandlung eines Tieres mit Atherosklerose-Risiko nützlich sein. Ein Tier mit Atheroskleroserisiko ist bereitgestellt. Ein Mittel, das zur Änderung eines Aspekts der LBP-Struktur oder des -Metabolismus in der Lage ist, ist bereitgestellt. Das Mittel wird in einer therapeutisch wirksamen Menge dergestalt an das Tier verabreicht, dass die Behandlung des Tieres eintritt. Das Atheroskleroserisiko kann sich zum Beispiel aus einer Familienanamnese für Atherosklerose, einem Genotyp, der zur Atherosklerose prädisponiert oder phänotypischen Symptomen, die zur Atherosklerose prädisponieren, z. B. bei Vorliegen von Hypercholesterinämie, Hypertonie oder Rauchen, ergeben.
Auch eingeschlossen ist ein Verfahren zur Behandlung einer Zelle mit einer Abnormalität der Struktur oder des Metabolismus des LBPs. Eine Zelle mit einer Abnormalität der LBP-Struktur oder des -Metabolismus ist bereitgestellt. Ein Mittel, das zur Änderung eines Aspekts der LBP-Struktur oder des -Metabolismus in der Lage ist, ist bereitgestellt. Das Mittel wird an die Zelle in einer therapeutisch wirksamen Menge dergestalt verabreicht, dass die Behandlung der Zelle einritt.
In bestimmten Ausführungsformen wird die Zelle aus einer Zellkultur oder Gewebekultur oder einem nicht humanen Embryo-Fibroblasten erhalten. Die Zelle kann z. B. einen Teil eines Tieres, z. B. eines natürlichen Tieres oder eines nicht humanen transgenen Tieres darstellen. Das LBP stellt bevorzugt LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 dar.
Es ist erfindungsgemäß auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung der Atherosklerose in einem Tier, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Mittels, wobei das Mittel zur Veränderung eines Aspekts des LBP-Metabolismus oder der -Struktur im Tier in der Lage ist, um zur Behandlung der Atherosklerose zu führen, und ein pharmazeutisch verträglicher Träger eingeschlossen. Pharmazeutisch verträgliche Träger schließen z. B. Kochsalzlösung. Liposomen und Lipid-Emulsionen ein.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen, stellt das Mittel der pharmazeutischen Zusammensetzung ein LBP-Polypeptid, z. B. LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 oder ein biologisch aktives Fragment oder ein Analogon davon dar. Das Mittel kann z. B. das wie in SEQ ID NO:1–9 dargelegte Polypeptid sein. Das Mittel stellt bevorzugt ein Polypeptid von nicht mehr als ca. 100 Aminosäureresten in Länge, bevorzugter nicht mehr als ca. 50 Aminosäureresten, noch bevorzugter von nicht mehr als ca. 30 Aminosäureresten, noch bevorzugter von nicht mehr als ca. 20 Aminosäureresten, noch bevorzugter nicht mehr als ca. 10 Aminosäureresten, noch bevorzugter von nicht mehr als ca. 5 Aminosäureresten, noch bevorzugter von nicht mehr als ca. 4 Aminosäureresten, noch bevorzugter von nicht mehr als ca. 3 Aminosäureresten und am bevorzugtesten von nicht mehr als ca. 2 Aminosäureresten dar. Das Polypeptid schließt bevorzugt mindestens ca. 20 % saure Aminosäureresten, noch bevorzugter mindestens ca. 40 % saure Aminosäurereste, noch bevorzugter mindestens ca. 60 % saure Aminosäurereste, noch bevorzugter mindestens ca. 80 % saure Aminosäurereste, noch bevorzugter mindestens ca. 90 % saure Aminosäurereste, noch bevorzugter mindestens ca. 95 % saure Aminosäurereste und am bevorzugtesten mindestens ca. 98 % saure Aminosäurereste ein.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen stellt das Mittel eine LBP-Nukleinsäure, z. B. eine Nukleinsäure, die für das LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Polypeptid kodiert, oder ein biologisch aktives Fragment oder Analogon davon, dar. Das Mittel kann z. B. eine Nukleinsäure, umfassend eine wie in SEQ ID NO:10–18 dargelegte Nukleotidsequenz darstellen.
Es ist erfindungsgemäß auch eine Vakzin-Zusammensetzung zur Behandlung der Atherosklerose in einem Tier, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Mittels, wobei das Mittel zur Veränderung eines Aspekts des LBP-Metabolismus oder der -Struktur in dem Tier dergestalt in der Lage ist, um zur Behandlung der Atherosklerose zu führen, und ein pharmazeutisch verträglicher Träger eingeschlossen.
Die hierin beschriebenen Verfahren können zur Diagnose atherosklerotischer Läsionen in einem Tier nützlich sein. Ein Tier ist bereitgestellt. Ein markiertes Mittel, das zur Bindung des bei atherosklerotischen Läsionen vorliegenden LBP in der Lage ist, ist bereitgestellt. Das markierte Mittel wird an das Tier unter Bedingungen verabreicht, die dem markieren Mittel ermöglichen, mit dem LBP dergestalt zu interagieren, um das markierte LBP zu ergeben. Die Lokalisierung und Quantifizierung des markierten LBP wird durch Bildgebung bestimmt, um die Anwesenheit atherosklerotischer Läsionen in dem Tier zu diagnostizieren.
Das LBP stellt bevorzugt LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 dar. Die Bildgebung kann mithilfe von dem Fachmann bekannten Standardverfahren, einschließlich z. B. Magnetresonanztomographie, Gammakamera-Technik, Single-Photonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) oder Positron-Emissions-Tomographie (PET) dwchgeführt werden.
Mittel, die bevorzugt bei atherosklerotischen Läsionen fest an LBP binden, werden für die atherosklerotische Bildgebung und Diagnose verwendet. Das Mittel ist mit z. B. ^99mTc oder einem anderen Isotop, das zur klinischen Bildgebung mittels der Gammakamera, SPECT, PET-Scanning oder einer anderen ähnlichen Technologie geeignet ist, radiomarkiert. Da LBP bei sehr frühen Läsionen auftreten, ist eine derartige Bildgebung empfindlicher als die Angiographie oder Ultraschall bei der Lokalisierung sehr früher Läsionen, die sich noch nicht auf das arterielle Lumen auswirken, um eine sichtbare Ausbuchtung oder einen gestörten Fluss zu verursachen. Zusätzlich zur Lokalisierung von sowohl frühen als auch ausgeprägteren Läsionen können die bildgebenden Mittel, die an die LBP binden, auch zur Verfolgung der Progression der Atherosklerose, als ein Mittel zur Bewertung der Wirksamkeit von sowohl diätetischen als auch pharmakologischer Behandlungen verwendet werden.
Folglich stellt eine erfindungsgemäße diagnostische Ausführungsform die Anpassung von z. B. eines zu einem der LBP komplementären Peptids durch seine Radiomarkierung und unter seiner Verwendung als ein injizierbares bildgebendes Mittel zum Nachweis von okkulter Atherosklerose dar. Das Peptid wird aus diesen bekannten zur Bindung an LBP, z. B. RRRRRR oder KKLKLXX oder jedwedes andere polykationische Peptid, das an die hoch elektronegativen Domänen der LBP bindet, ausgewählt. Zum extrakorporealen Nachweis mit einer Gammaszintillationskamera (Anger) können Technetiumbindende Liganden, z. B. CGC, GGCGC oder GGCGCF, in die Peptide am N-Terminus oder C-Terminus zur ^99mTc-Markierung inkorporiert werden. Zur externen Bildgebung durch die Magnetresonanztomographie (MRT) wird z. B. der Gadolinium-bindende Chelator, Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), kovalent an den N- oder C-Terminus der Peptide gebunden. In noch anderen Ausführungsformen sind die LBP-bindenden Peptide kovalent gebunden, z. B. an magnetische Eisenoxid-Partikel durch dem Fachmann bekannte Standardverfahren, wie z. B. Konjugation der Peptide mit aktivierten Polystyrol-Harzperlen, enthaltend ein Tier gegen ein LBP, z. B.
Hierin beschriebene Verfahren können zum Immunisieren eines Tieres gegen ein LBP, z. B. LBP-1, LBP-2 oder LBP-3, oder Fragment oder Analogon davon nützlich sein. Ein Tier mit LDL ist bereitgestellt. Ein LBP oder Fragment oder Analogon davon ist bereitgestellt. Das LBP oder Fragment oder Analogon davon wird an das Tier verabreicht, um auf diese Weise die Antikörperproduktion durch das Tier gegen das LBP oder Fragment oder Analogon davon dergestalt zu stimulieren, dass die Bindung des LBPs an das LDL verändert, z. B. vermindert oder erhöht wird.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Herstellung eines Fragments oder Analogons von LBP-Polypeptid, wobei das Fragment oder Analogon die Fähigkeit zur Bindung an modifiziertes LDL und natives LDL aufweist. Ein LBP-Polypeptid ist bereitgestellt. Die Sequenz des LBP-Polypeptids ist verändert. Das veränderte LBP-Polypeptid wird auf die Fähigkeit zur Bindung an modifiziertes LDL, z. B. methyliertes, oxidiertes LDL, acetyliertes LDL, Cyclohexandion-behandeltes LDL (CHD-LDL) und an natives LDL getestet.
Die Fragmente oder Analoga können generiert und auf ihre Fähigkeit zur Bindung an diese modifizierten LDL und an natives LDL mithilfe von dem Fachmann bekannten Verfahren, wie z. B. hierin beschrieben, getestet werden. Sie werden bevorzugt auf ihre Fähigkeit zur Bindung an methylierte LDL und native LDL getestet. Die Bindungsaktivität des Fragments oder Analogons kann größer oder kleiner als die Bindungsaktivität des nativen LBPs sein. Sie ist bevorzugt größer. In bevorzugten Ausführungsformen stellt das LBP LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 dar.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Isolation einer cDNA, die für ein LBP kodiert. Eine cDNA-Bibliothek ist bereitgestellt. Die cDNA-Bibliothek wird auf eine cDNA gescreent, die für ein Polypeptid kodiert, welches an natives LDL und modifiziertes LDL, wie z. B. methyliertes LDL oder oxidiertes LDL, bindet. Die cDNA, welche für dieses Polypeptid kodiert, wird isoliert, wobei die cDNA für ein LBP kodiert.
Die folgenden nicht einschränkenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung weiter.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: KONSTRUKTION EINER KANINCHEN-cDNA-BIBLIOTHEK
Dieses Beispiel veranschaulicht die Konstruktion einer Kaninchen-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von mRNA aus einer mithilfe eines Ballon-Katheters deendothelialisierten, heilenden abdominellen Aorta vom Kaninchen. Es wurde gezeigt, das die mit einem Ballon-Katheter deendothelialisierte Aorta vom Kaninchen ein valides Modell für die Atherosklerose darstellt (Minick et al., Am. J. Pathol. 95: 131–158(1979).
Die mRNA wurde vier Wochen nach dem Ballonieren zur Maximierung der fokalen LDL-Bindung in der ballonierten Kaninchen-Aorta erhalten. Die Erststrang-cDNA-Synthese wurde in einem Reaktionsgemisch (50 μl), enthaltend 4 μg mRNA; 2 μg Oligo-d(T)-Primer; Methylierungs-dNTP-Mischung (je 10 mM); 10 mM DTT; 800 Einheiten Superscript II RT (Life Technologies, Gaithersburg, MD); 1 × Erststrang-cDNA-Synthesepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,3; 75 mM KCl; 5 mM MgCl₂), das 1 h bei 37 °C inkubiert wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann durch das Zufügen von 1 × Zweitstrang-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7,5; 105 mM KCl; 5,2 mM MgCl₂); 0,1 mM DTT; Methylierungs-dNTP-Mischung (je 10 mM; 50 Einheiten DNA-Polymerase I von E. coli, 3 Einheiten RNase H; 15 Einheiten DNA-Ligase von E. coli (alle Enzyme von Life Technologies) auf 250 μl eingestellt, das zusätzliche 2,5 h bei 15 °C inkubiert wurde. Die sich ergebenden doppelsträngigen cDNAs (dscDNA) wurden dann 20 min bei 11 °C mit 1,5 Einheiten T4-DNA-Polymerase (Novagen Inc., Madison, WI) zur Herstellung von dscDNA mit stumpfem Ende behandelt. Diese wurden dann durch Ethanol-Präzipitation konzentriert und EcoR1/Hind III-Linker wurden durch T4-DNA-Ligase (Novagen Inc.) an die Enden gebunden. Die Linkerligierten cDNAs wurden mit EcoR1- und HindIII-Restriktionsenzymen zur Herstellung von EcoR1- und HindIII-Erkennungssequenzen an ihren 5'- bzw. 3'-Enden behandelt. Nach der Entfernung von Linker-DNA durch die Gel-Ausschlusschromatographie wurden die dscDNAs in λEXlox-Phagenanne (Novagen Inc.) auf eine unidirektionale Weise durch die T4-DNA-Ligase insertiert und gemäß dem Protokoll des Herstellers (Novagen Inc.) in Phagenpartikel gepackt. Eine Phagen-Bibliothek von cDNAs, enthaltend 2 × 10⁶ unabhängige Klone, wurde aus 4 μg mRNA etabliert.
BEISPIEL 2: IDENTIFIKATION VON KANINCHEN-cDNAs, DIE FÜR LDL-BINDUNGSPROTEINE (LBP) KODIEREN
Dieses Beispiel veranschaulicht ein Verfahren des funktionellen Screenings einer Kaninchen-cDNA-Bibliothek zur Identifikation von DNAs, kodierend LBP, die sowohl an natives LDL als auch Methyl-LDL binden. Methyl-LDL wird von den zuvor berichteten Zelloberflächenrezeptoren nicht erkannt. Siehe z. B. Weisgraber et al., J. Biol. Chem. 253: 9053–9062 (1978).
Eine frische Übernachtkultur von ER1647-Zellen von E. coli (Novagen Inc.) wurde mit dem aus Beispiel 1 gewonnenen cDNA-Phagen infiziert und bei einer Dichte von 2 × 10⁴ Plaque-bildenden Einheiten (PBE) in Platten mit einem Durchmesser von 150 mm, enthaltend 2 × YT-Agar, ausplattiert. Es wurden insgesamt 50 Platten, entsprechend 1 × 10⁶ Phagen ausplattiert und bei 37 °C inkubiert, bis die Plaques einen Durchmesser von 1 mm erreichten (5–6 h). Eine trockene Nitrocellulose-Membran, die zuvor mit einer 10 mM IPTG-Lösung gesättigt wurde, wurde auf die Oberfläche jeder Platte geschichtet, um sowohl die Produktion von rekombinantem Protein zu induzieren als auch die Proteine auf den Membranen zu immobilisieren. Die Platten wurden zusätzliche 3–4 Stunden bei 37°C und dann über Nacht bei 4 °C inkubiert.
Am nächsten Tag wurden die Membranen von jeder Platte abgehoben und dann wie folgt verarbeitet: Mehrmaliges kurzes Spülen mit TBST-Lösung (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl, 0,05 % Tween 20); zweimaliges 10-minütiges Spülen mit 6 M Guanidin-HCl in HBB (20 mM HEPES, pH 7,5; 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT und 5 mM KCl); zweimaliges 5-minütiges Spülen in 3 M Guanidin-HCl in HBB; ein abschließendes kurzes Spülen in TBSEN (TBS, 1 mM EDTA, 0,02 % NaN₃).
Die Membranen wurden dann 30 min bei Raumtemperatur in einer Lösung aus TBSEN mit 5 % Magermilchpulver, gefolgt von 10 min in TBSEN mit 1 % Magermilchpulver inkubiert. Nach dem Blockieren wurden die Membranen mit nativem humanem LDL (erhalten wie in Beispiel 11 beschrieben) oder methyliertem humanem LDL (meLDL) (siehe Weisgraber et al., J. Biol. Chem. 253: 9053–9062 (1978)), bei einer Konzentration von 4 μg/ml in einer Lösung, enthaltend 1 × TBSEN, 1 % Magermilchpulver, 1 mM PMSF, 0,5 × Protease-Inhibitor-Lösung (1 mM ε-Aminocapronsäure/l mM Benzamidin) inkubiert. Die Inkubation wurde 4 h bei Raumtemperatur in einer Petrischale aus Glas unter vorsichtigem Rühren auf einem Rührtisch, gefolgt bei 4 °C über Nacht ohne Rühren durchgeführt.
Spezifisch gebundenes meLDL und natives LDL wurden auf den Nitrocellulose-Membranen durch Antikörper gegen humanes LDL nachgewiesen. Gegen humanes LDL gerichtete polyklonale Antikörper vom Schaf (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurden mit pLys-E-Zellextrakten von E. coli zum Aufheben des Hintergrunds adsorbiert. Zur Adsorption wurden die pLys-E-Zellen von E. coli bis zur log-Phase gezüchtet, abzentrifugiert und in PBS, enthaltend 1 mM PMSF, 2 mM ε-Aminocapronsäure und 1 mM Benzamidin, resuspendiert. Die Zellsuspension wurde dann 8 Gefrier-Auftau-Zyklen durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff bzw. kaltes Leitungswasser unterzogen. Die Anti-LDL-Antikörper/Zellextrakt-Lösung wurde 1 h bei 4 °C unter vorsichtigem Rühren inkubiert (1 ml Antikörper-Lösung/3 mg Rohzellextrakt). Nach der Inkubation wurde das Gemisch zentrifugiert (10 000 × g; 10 min; 4 °C), und der Überstand wurde bei 4 °C in Anwesenheit von 0,02 % NaN₃ bis zum Gebrauch gelagert. Die Membranen wurden zum Immunoscreening wie folgt verarbeitet: (i) drei 5-minütige Wäschen bei Raumtemperatur in TBSEN, enthaltend 1 % Gelatine; (ii) 30-minütige Inkubation in PBS, pH 7,4 mit 1 % Gelatine; (iii) Inkubation 2 h bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Rühren in frischer PBS/Gelatine-Lösung, enthaltend adsorbierte gegen humanes LDL gerichtete Schaf-Antikörper (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) (1:1000 Verdünnung); (iv) drei kurze Wäschen in TBS, pH 7,4; (v) Inkubation 1 h bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Rühren in PBS/Gelatine-Lösung, enthaltend gegen das Schaf gerichtete alkalische Phosphatase-konjugierte Esel-Antikörper (Sigma, St Louis, MO) (1:10 000 Verdünnung); (vi) drei kurze Wäschen mit TBS, pH 7,4; und (vii) Entwicklung gemäß den Anleitungen des Herstellers unter Verwendung eines Entwicklungskits mit Substrat aus alkalischer Phosphatase (Novagen Inc.). Die LBP produzierenden Phagen-Plaques erschienen auf den Membranen als blau gefärbte „Doughnut"-Form.
Der Phase von Beispiel 1, enthaltend die LBP-cDNAs wurde von Plaques gereinigt und unter Befolgung eines von Novagen Inc. bereitgestellten Protokolls unter dem Titel „Autosubcloning by Cremediated Plasmid Excision" in Plasmid-Subklone umgewandelt. Die DNA-Sequenzen wurden durch das Didesoxynukleotid-Kettenterminierungsverfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 74: 5463–5467 (1977) erhalten und anhand eines automatisierten Sequencers von Applied Biosystems analysiert. Der offene Leserahmen (ORF) von jeder cDNA wurde aus den von sowohl Sense- als auch Antisense-Strängen der cDNAs erhaltenen Konsensus-Sequenzen bestimmt. Die Sequenzierung bestätigte, dass drei zuvor unbekannt gewesene Gene isoliert wurden. Da die Gene durch funktionelles Screening auf LDL-Bindung ausgewählt wurden, wurden die durch diese Gene kodierten Proteine als LDL-Binding-Proteine (LBP), spezifisch LBP-1, LBP-2 und LBP-3 bezeichnet. Die cDNA-Sequenzen für LBP-1, LBP-2 und LBP-3 vom Kaninchen und die entsprechenden Proteine sind in SEQ ID NO: 10–14 dargelegt.
Basierend auf ihren entsprechenden cDNA-Kodierungssequenzen wurde bestimmt, dass die Größen der rekombinanten Proteine 16,2 kDa für LBP-1, 40 kDa für LBP-2 und 62,7 kDa für LBP-3 betragen.
BEISPIEL 3: NORTHERN BLOT-ANALYSE VON KANINCHEN-RNA UNTER VERWENDUNG VON LBP-cDNA ODER -cRNA
Dieses Beispiel veranschaulicht die Größe und Gewebsverteilung von LBP-mRNAs. Die Gesamt-RNA wurde aus verschiedenen Geweben des Kaninchens isoliert: mit Trizol-Reagenz (Life Technologies) aus Nebennieren, der thorakalen Aorta, abdominellen Aorta, der ballonierten und reendothelialisierten abdominellen Aorta, Herz, Nieren, Glattmuskelzellen, Lunge und Leber und mittels Ethanol-Präzipitation konzentriert. Die Gelelektrophorese von RNA wurde in 1,2 % Agarosegel, enthaltend 1 × MOPS-Puffer (0,2 M MOPS, pH 7,0; 50 mM Natriumacetat; 5 mM EDTA, pH 8,0) und 0,37 M Formaldehyd, durchgeführt. Die Gele wurden mit 20 μg Gesamt-RNA aus jedem untersuchten Gewebe beladen und 2 h elektrophoretisch bei 100 Volt in 1 × MOPS-Puffer aufgetrennt. Die RNAs wurden auf die geträgerten Nitrocellulosemembranen (Schleicher & Schüll, Keene, NH) getüpfelt und durch Wärmebehandlung 2 h bei 80 °C immobilisiert. Die Hybridisierung an radiomarkierte LBP-1-, LBP-2- und LBP-3-cDNA- oder -cRNA-Sonden wurde mittels dem Fachmann bekannter Standardverfahren durchgeführt (siehe z. B. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology; John Wiley & Sons (1989)); die Signale wurden mithilfe der Autoradiographie nachgewiesen.
Die Ergebnisse waren wie folgt: Die Größen der mRNAs betrugen ca. 1,3 kb für LBP-1, ca. 2,3–2,5 kb für LBP-2 und ca. 4,7 kb für LBP-3. LBP-1-, LBP-2- und LBP-3-mRNA wurde in allen getesteten Geweben gefunden, die größte Menge befand sich jedoch in der ballonierten abdominellen Aorta.
BEISPIEL 4: ISOLATION VON HUMANEN LBP-cDNAs
Dieses Beispiel veranschaulicht die Isolation von humanen LBP-cDNAs. Die humanen LBP-cDNA-Klone wurden aus drei cDNA-Bibliotheken isoliert. Eine humane fetale Gehirn-cDNA-Bibliothek wurde von Stratagene, LaJolla, CA bezogen, eine humane Leber- und eine humane Aorta-cDNA-Bibliothek wurde von Clontech, Palo Alto, CA, erhalten und mit einer radiomarkierten cDNA-Sonde, die sich von LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 vom Kaninchen herleitete, gemäß dem in Law et al., Gene Expression 4: 77–84 (1994), beschriebenen Verfahren gescreent. Es wurden mehrere stark hybridisierende Klone identifiziert und von Plaques gereinigt. Klone wurden für die humane LBP-1, LBP-2 und LBP-3 mittels DNA-Sequenzierung unter Verwendung des Didesoxynukleotid-Kettenterminierungsverfahrens und Analyse mithilfe eines automatisierten Sequencers von Applied Biosystems bestätigt. Die cDNA-Sequenzen und die entsprechenden Proteine für humanes LBP-1, LBP-2 und LBP-3 sind in SEQ ID NO: 15, 16 bzw. 17 dargelegt. Ein Vergleich zwischen den entsprechenden LBP-1, LBP-2 und LBP-3-Proteinsequenzen für Kaninchen und Menschen sind in 19, 20 und 21 ersichtlich.
BEISPIEL 5: ISOLATION VON REKOMBINANTFN LBP-1-, LBP-2- AND LBP-3-PROTEINEN VOM KANINCHEN AUS E. coli
LBP-cDNA wurde aus den Original-pEXlox-Plasmiden isoliert, die wie in Beispielen 1 und 2 beschrieben erhalten und in den pPROEX-HT-Vektor (Life Technologies) zur rekombinanten Proteinexpression subkloniert wurden. Die Induktion des rekombinanten Proteins durch IPTG-Zugabe zu transformierten DH10B-Kulturen von E. coli führte zur Expression des rekombinanten Proteins, enthaltend ein 6-Histidin-Tag (N-terminal). Dieses getaggte Protein wurde dann aus Ganzzellproteinen durch Bindung an Ni-NTA (Nickel-Nitrilotriessigsäure), wie im vom Hersteller (Qiagen, Inc., Santa Clara, CA) bereitgestellten Protokoll beschrieben, gereinigt. Die nach dem Chromatographieschritt erhaltene Präparation war zu ca. 90 % rein; die präparative SDS-PAGE wurde als abschließender Reinigungsschritt durchgeführt.
Wenn vom Charakterisierungsverfahren vorgeschrieben, wurde eine Iodierung von LBPs unter Verwendung von Iodobeads (Pierce, Rockford, IL) durchgeführt. Die Iodobeads wurden mit 500 μCi Na¹²⁵I-Lösung (17 Ci/mg) (New England Nuclear, Boston, MA) in einem verkappten Mikrofugen-Röhrchen 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proteinlösung wurde dem Mikrofugen-Röhrchen mit den Iodobeads-Na¹²⁵I zugefügt und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Am Ende dieser Inkubation wurden Aliquote zur Bestimmung der löslichen und „TCA-präzipitierbaren" Gesamtcounts entnommen. Das radiomarkierte Protein wurde dann mit kaltem Aceton (2,5 Vol; –20 °C; 2,5 h) präzipitiert. Im Anschluss an diese Inkubation wurde das präzipitierte Protein durch Zentrifugation (14 000 g; 1 h; Raumtemperatur) gesammelt und in Probenpuffer (6 M Harnstoff/50 mM Tris, pH 8,0/2 mM EDTA) resuspendiert. Die Integrität der Proteinpräparation wurde mittels der SDS-PAGE beurteilt.
Die Identitäten der rekombinanten LBP wurden unter Verwendung der dem Fachmann bekannten Standard-Protein-Sequenzierungsprotokolle bestätigt. (A Practical Guide for Protein and Peptide Purification for Microsequencing, Matsudaira, Hrsg., Academic Press, Inc., 2. Auflage (1993)). Die Analyse wurde unter Verwendung eines Protein Sequencers, Modell 477A, mit einem Aminosäure-Analysator, On-line-Modell 120 PTH von Applied Biosystems, durchgeführt.
BEISPIEL 6: PRODUKTION VON ANTIKÖRPERN GEGEN LBP-1, LBP-2 UND LBP-3
Dieses Beispiel veranschaulicht die Produktion polyklonaler Antikörper gegen LBP-1, LBP-2 und LBP-3. Ein Gemisch aus gereinigtem, rekombinantem LBP-Protein (0,5 ml; 200 μg) und RIBI-Adjuvans (RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) wurde subkutan in männliche Meerschweinchen (Dankin Hartley; Hazelton Research Products, Inc., Denver, PA) an 3–5 Stellen entlang den dorsalen thorakalen und abdominellen Regionen des Meerschweinchens injiziert. Das Blut wurde mittels Venenpunktion an den Tagen 1 (präimmune Blutentnahme), 28, 49 und 70 entnommen. Booster-Injektionen wurden an den Tagen 21 (100 μg; s.c.), 42 (50 μg; s.c.) und 63 (25 μg; s.c.) verabreicht. Der Titer des Meerschweinchen-Antiserums wurde mittels „Dot-Blotting" in Reihenverdünnung bewertet. Das präimmune Antiserum wurde zur gleichen Zeit bewertet. Nach dem dritten Booster von LBP-Protein erreichte der Titer gegen das rekombinante Protein einen maximalen Spiegel mit einer nachweisbaren kolorimetrischen Response auf einen Dot-Blot-Assay von 156 pg.
Die Spezifität des polyklonalen Antikörpers für rekombinantes LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 wurde unter Verwendung der Western Blot-Analyse nachgewiesen. (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350 (1979)). Der Protein-Antikörper-Komplex wurde immunchemisch mit alkalischer Phosphatasekonjugiertem Ziegen-Anti-Meerschweinchen IgG, mit anschließendem Färben mit Nitroblau-Tetrazolium (BioRad Laboratories, Hercules, CA) sichtbar gemacht. Die nicht spezifische Bindung wurde unter Verwendung von 3 % Magermilchpulver in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (100 mM Tris; 0,9 % NaCl, pH 7,4) blockiert.
BEISPIEL 7: IMMUNISTOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG
Dieses Beispiel veranschaulicht die Anwesenheit von LBP in oder auf die Plaques überziehenden Endothelzellen in oder auf angrenzende Glattmuskelzellen und in der extrazellulären Matrix. Außerdem wurde eine Colokalisierung von LDL und LBP nachgewiesen. Diese Ergebnisse wurden durch Untersuchung ballonierter Arterienläsionen bei Kaninchen und humanen atherosklerotischen Plaques anhand immunhistochemischer Verfahren erhalten.
Ballonierte deendothelialisierte Aorta wurde von Kaninchen gewonnen, die eine Bolusinjektion von humanem LDL (3 mg; i.v.) 24 h vor der Gewebeentnahme erhalten hatten. Humane Aorten, enthaltend atherosklerotische Plaques, wurden von Routineobduktionsproben erhalten. Die Gewebe wurden in 10 % gepuffertem Formalin (≤ 24 h ) fixiert und unter Verwendung eines automatisierten Gewebe-Einbettungsgerätes eingebettet. Es wurden Gewebeschnitte (5–7 μm) geschnitten und auf Glasobjektträger aufgezogen, gefolgt von einer einstündigen Inkubation bei 60 °C. Die Schnitte wurden entparaffiniert. Nach abschließendem Waschen mit deionisiertem H₂O wurde die endogene Peroxidase-Aktivität durch Inkubation der Schnitte mit 1 % H₂O/H₂O-Puffer 5 min bei Raumtemperatur eliminiert. Die Schnitte wurden mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) 5 min bei Raumtemperatur gespült und die nicht spezifische Bindung wurde mit 5 % normalem Ziegenserum oder 5 % normalem Kaninchenserum, in Abhängigkeit von der Quelle des sekundären Antikörpers (Sigma, St. Louis, MO) (1 h; Raumtemperatur) blockiert. Die Schnitte wurden dann mit einer Verdünnung von 1:50 (in 5 % normalem Ziegenserum/PBS) eines polyklonalen Antikörpers vom Meerschweinchen gegen die Kaninchen-Form des rekombinanten LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 inkubiert. Die Kontrollen schlossen präimmunes Serum ebenso wie spezifische Antiseren gegen LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 ein, worin der primäre Antikörper vollkommen adsorbiert und durch Inkubation mit rekombinanter LBP-1, LBP-2 oder LBP-3, gefolgt von Zentrifugation vor der Inkubation mit den Gewebeschnitten entfernt wurde. Es wurde eine Affinität gereinigter polyklonaler Antikörper vom Kaninchen gegen humanes Apolipoprotein B (Polysciences Inc.; Warrington, PA) bei einer Verdünnung von 1:100 (in 5 % normalem Kaninchenserum/PBS) verwendet. Die Schnitte wurden 2 h bei Raumtemperatur in einer Feuchtkammer inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Schnitte mit PBS gespült und mit einer Verdünnung von 1:200 (in 5 % normalem Ziegenserum/PBS) von Ziegen-Anti-Meerschweinchen-biotinyliertem IgG-Konjugat (Vector Laboratories, Burlingame, CA) oder einer Verdünnung von 1:250 (in 5 % normalem Kaninchenserum/PBS) von Kaninchen-Anti-Ziegenbiotinyliertem IgG-Konjugat (Vector Laboratories, Burlingame, CA) 1 h bei Raumtemperatur in einer Feuchtkammer inkubiert. Die Schnitte wurden dann mit PBS gespült und das Antigen-Antikörper-Signal unter Verwendung von Avidin/Biotin-HRP-Konjugat (Vectastain ABC Kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA) amplifiziert. Die Schnitte wurden unter Verwendung von DAB-Substrat (4–6 min; Raumtemperatur) entwickelt und mit Hämatoxylin gegengefärbt.
In der ballonierten Kaninchen-Arterie zeigte die Immunhistochemie mit den gegen LBP-1, LBP-2 und LBP-3 gerichteten Antikörpern, dass sich LBP-1, LBP-2 und LBP-3 in oder auf funktionell modifizierten Endothelzellen an den Rändern der regenerierenden Endothelinseln, der gleichen Stelle, an der die irreversible LDL-Bindung nachgewiesen wurde, befanden (Chang et al., Arteriosclerosis and Thrombosis 12: 1088–1098 (1992)). LBP-1, LBP-2 und LBP-3 wurden auch in oder auf den Glattmuskelzellen der Intima unter den funktionell modifizierten Endothelzellen und in einem geringeren Ausmaß in der extrazellulären Matrix gefunden. Kein LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 wurde in noch deendothelialisierten Bereichen nachgewiesen, in denen gezeigt wurde, dass die LDL-Bindung reversibel ist (Chang et al., Arteriosclerosis and Thrombosis, 12: 1088–1098 (1992)). Die Immunhistochemie der ballonierten Kaninchen-Aorta mit anti-humanen Apolipoprotein B-Antikörpern zeigte die Anwesenheit von LDL an den gleichen Stellen wie denen, die für LBP-1, LBP-2 und LBP-3 gefunden wurden.
In den bei Routineobduktionen entnommenen humanen atherosklerotischen Plaques zeigte die Immunhistochemie mit den Anti-LBP-1-, Anti-LBP-2- und Anti-LBP-3-Antikörpern, dass LBP-1, LBP-2 und LBP-3 auch in oder auf mit Endothelzellen überzogenen Plaques und in oder auf angrenzenden Glattmuskelzellen gefunden wurden. Im humanen Gewebe fanden sich größere Hinweise auf LBP-1, LBP-2 und LBP-3 in der extrazellulären Matrix.
Die mit den Paraffinschnitten erhaltenen Ergebnisse waren mit denen von Gefrierschnitten identisch.
BEISPIEL 8: ACE-ASSAYS (AFFINITY COELECTROPHORESIS ASSAYS) VON LBP UND LDL ODER HDL
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass eine Bindung zwischen LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 und LDL auftritt und dass diese Bindung spezifisch ist, wie durch die Tatsache veranschaulicht wird, dass die Bindung nicht zwischen LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 und HDL (Lipoprotein hoher Dichte) auftritt.
Die Analyse der Affinität und Spezifität der rekombinanten Kaninchen-LBP-1, -LBP-2 oder -LBP-3-Bindung an LDL wurde unter Verwendung des Prinzips der Affinitätselektrophorese (Lee und Lander, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2768–2772 (1991)) durchgeführt. Geschmolzene Agarose (1 %; 65 °C) wurde in 50 mM Natrium-MOPS, pH 7,0; 125 mM Natriumacetat, 0,5 % CHAPS hergestellt. Ein Teflonkamm, der aus neun Parallelzinken (45 × 4 × 4 mm/3 mm Abstand zwischen den Zinken) bestand, wurde auf einen GelBond-Film (FMC Bioproducts, Rockland, ME) platziert, der auf einer Gussschale aus Plexigas angebracht wurde, wobei sich die Längsachse der Zinken parallel zur Längsachse der Gussschale befand. Ein Teflonstreifen (66 × 1 × 1 mm) wurde auf den Rand mit der Längsachse parallel zur kurzen Achse der Gussschale, bei einem Abstand von 4 mm vom Rand des Teflonkamms platziert. Die geschmolzene Agarose (>65 °C) wurde dann zum Erreichen einer Höhe von ca. 4 mm ausgegossen. Die Entfernung des Kamms und Streifens führte zu einem Gel, das neun 45 × 4 × 4 mm rechteckige Vertiefungen angenzend an einen 66 × 1 mm messenden Schlitz enthielt. Die LDL- oder HDL-Proben wurden in einem Gelpuffer (50 mM Natrium-MOPS, pH 7,0, 0,125 mM Natriumacetat) bei der 2-fachen der gewünschten Konzentration hergestellt. Die Proben wurden dann mit einem gleichen Volumen geschmolzener Agarose (in 50 mM MOPS, pH 7,0; 125 mM Natriumacetat; 50 °C) gemischt, in die entsprechenden rechteckigen Vertiefungen pipettiert und gelieren lassen. Die Bindungsaffinität und Spezifität von LBP-1 und LBP-3 wurde unter Verwendung von mehreren Konzentrationen von LDL (540 bis 14 nM) und HDL (2840–177 nM) getestet. Eine konstante Menge (0,003 nM–0,016 nM) von ¹²⁵I-markiertem LBP-1, -LBP-2 oder -LBP-3 (suspendiert in 50 mM Natrium-MOPS, pH 7,0; 125 mM Natriumacetat; 0,5 % Bromphenolblau; 6 % (w/v) Saccharose) wurde in den Schlitz geladen. Die Gele wurden bei 70 V/2 h/20 °C elektrophoretisch aufgetrennt. Am Ende des Laufs wurden die Gele luftgetrocknet und die Verzögerungsprofile wurden durch Exposition der Gele gegenüber Röntgenfilmen über Nacht bei –70 °C mit Verstärkerfolien sichtbar gemacht.)
LDL verzögerte die LBP-1-, LBP-2- und LBP-3-Migration durch das Gel auf eine konzentrationsabhängige, sättigbare Weise, was darauf hindeutet, das die LBP-1-, LBP-2- und LBP-3-Bindung an LDL hoch spezifisch war. Diese Schlussfolgerung wird von der Tatsache unterstützt, dass HDL das LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 nicht verzögerte. Eine anhand des ACE-Assays erstellte Bindungskurve deutete darauf hin, dass LBP-1 mit einem K_d von 25,6 nM an LDL bindet, dass LBP-2 (Kaninchen-Klon 26) mit einem K_d von 100 nM an LDL bindet und dass LBP-3 (Fragment von 80 kDa) mit einem K_d von 333 nM an LDL bindet.
Außer dem Testen der Affinität und Spezifität der LBP-1-, LBP-2- und LBP-3-Bindung an LDL, wurde die Fähigkeit von „kaltem" (d. h. nicht radiomarkiertem) LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 auf die kompetitive Inhibition der radiomarkierten LBP-1-, LBP-2- bzw. LBP-3-Bindung an LDL getestet. Kompetitivstudien wurden unter Verwendung von fixierten Konzentrationen von „kaltem" LDL und radiomarkiertem LBP-1 und zunehmenden Mengen an „kaltem" rekombinantem LBP-1 (6–31 μM) durchgeführt. Die ACE-Assay-Proben und das Gel wurden wie hierin beschrieben hergestellt. „Kaltes" LBP-1 inhibierte die Bindung von radiomarkiertem LBP-1 an LDL auf eine konzentrationsabhängige Weise, „kaltes" LBP-2 inhibierte die Bindung von radiomarkiertem LBP-2 an LDL auf eine konzentrationsabhängige Weise und „kaltes" LBP-3 inhibierte die Bindung von radiomarkiertem LBP-3 an LDL auf eine konzentrationsabhängige Weise.
LBP-2 vom Kaninchen und Menschen enthalten eine lange Strecke von sauren Aminosäuren am Aminoterminal (LBP-2-Aminosäurereste 105 bis 132 vom Kaninchen und LBP-2-Aminosäurereste 8 bis 33 vom Menschen). Die Möglichkeit, dass dieses Segment von LBP-2 die LDL-bindende Domäne darstellte, wurde durch Subklonieren von zwei LBP-2-Klonen vom Kaninchen, die sich durch die An- oder Abwesenheit dieser sauren Region (Klon 26 bzw. Klon 45) in Expressionsvektoren unterscheiden, durch dem Fachmann bekannte Standardverfahren getestet. Die ACE-Assays wurden dann durchgeführt, um die Affinität und Spezifität der Bindung dieser beiden Klone an LDL zu beurteilen. LDL verzögerte die sich von Klon 26 herleitende radiomarkierte LBP-2-Migration durch das Gel auf eine konzentrationsabhängige, sättigbare Weise, während die sich von Klon 45 herleitende radiomarkierte LBP-2-Migration nicht verzögert war.
Kompetitivstudien unter Verwendung fixierter Konzentrationen von „kalter" LDL und sich von Klon 26 herleitendem radiomarkiertem LBP-2 und zunehmenden Konzentrationen von „kaltem" rekombinantem LBP-2/Klon 26 und LBP-2/Klon 45 wurden durchgeführt. Das „kalte", sich von Klon 26 herleitende LBP-2 inhibierte die Bindung des sich von Klon 26 herleitendem radiomarkiertem LBP-2 an LDL auf eine konzentrationsabhängige Weise. Das sich von Klon 45 herleitende LBP-2 wirkte sich andererseits nicht auf die Bindung des sich von Klon 26 herleitendem radiomarkiertem LBP-2 an LDL aus. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die lange Strecke von sauren Aminosäuren eine Bindungsdomäne von LBP-2 an LDL enthalten.
BEISPIEL 9: ACE-ASSAYS (AFFINITY COELECTROPHORESIS ASSAYS) VON LBP-1 ODER LBP-2 UND LDL IN ANWESENHEIT VON INHIBITOREN
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass die Bindung zwischen LBP-1 oder LBP-2 and LDL durch Polyglutaminsäure oder BHF-1 inhibiert wird. Die Fähigkeit einer dritten Verbindung, die Bindung zwischen zwei Proteinen zu inhibieren, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie interagieren, wurde durch eine Modifikation der in Beispiel 8 beschriebenen ACE-Assays getestet. Die dritte Verbindung wurde oben oder den Vertiefungen zusammen mit dem radiomarkierten Protein zugefügt. Wenn die dritte Verbindung die Bindung inhibieren würde, würde das radiomarkierte Protein durch das Gel laufen. Wenn die dritte Verbindung die Bindung nicht inhibierte, wurde die Migration des radiomarkierten Proteins durch das in das Gel gegossene Protein verzögert.
Die Inhibition der LBP-1/LDL- oder LBP-2/LDL-Bindung durch Polyglutaminsäure (durchschnittliches MG ca. 7500, entspricht ca. 7 Monomeren) wurde durch Ausgießen einer konstanten Menge von LDL (148 nM) in alle rechteckigen Lanes gezeigt. Eine konstante Menge (1 μl) von ¹²⁵I-markiertem LBP-1 oder LBP-2 (0,003 nM– 0,016 nM) wurde zusammen mit zunehmenden Konzentationen der Polyglutaminsäure (bezogen von Sigma) (0–0,4 nM) am oberen Ende des Gels in die Vertiefungen geladen. Das Gel wurde bei 70 Volt 2 h elektrophoretisch aufgetrennt, getrocknet und auf einen Röntgenfilm mit Verstärkerfolien, über Nacht bei –70 °C gebracht, bevor der Film zur Bestimmung des Verzögerungsprofils von LBP-1 und LBP-2 entwickelt wurde. Mit zunehmender Konzentration der Polyglutaminsäure, nahm die Verzögerung der radiomarkierten LBP-1- und LBP-2-Migration durch LDL auf eine konzentrationsabhängige Weise ab, was erkennen ließ, das die Polyglutaminsäure die Bindung zwischen LBP-1, LBP-2 und LDL inhibierte.
Die Inhibition der LBP-1/LDL-Bindung durch BHF-1 wurde durch das Ausgießen einer konstanten Menge von LDL (148 nM) in allen rechteckigen Lanes gezeigt. Es wurde eine konstante Menge von ¹²⁵I-markiertem LBP-1 (0,003 nM–0,016 nM) in die Vertiefungen am oberen Ende des Gels zusammen mit zunehmenden Konzentrationen von BHF-1 (0–10 nM) geladen, das wie in Beispiel 15 beschrieben erhalten wurde. Das Gel wurde bei 70 Volt 2 h elektrophoretisch aufgetrennt, getrocknet und auf einen Röntgenfilm mit Verstärkerfolien, über Nacht bei –70 °C gebracht. Der Film wurde dann zur Bestimmung des Verzögerungsprofils von ¹²⁵I-LBP-1 entwickelt. Mit zunehmender Konzentration von BHF-1 verminderte sich die Verzögerung von LBP-1 auf eine konzentrationsabhängige Weise, womit nachgewiesen wurde, das BHF-1 die Bindung zwischen LBP-1 und LDL inhibierte.
BEISPIEL 10: ACE-ASSAYS (AFFINITY COELECTROPHORESIS ASSAYS) ZUR IDENTIFIKATION VON FRAGMENTEN, ANALOGA UND MIMETIKA VON AN LDL BINDENDEN LBP
Dieses Beispiel veranschaulicht ein Verfahren zur Identifikation von Fragmenten, Analoga oder Mimetika von an LDL bindenden LBP, und die folglich als Inhibitoren der LDL-Bindung an LBP in den Arterienwänden durch Besetzen der Bindungsstellen an LDL-Molekülen verwendet werden können, wobei diese Stellen für die Bindung an LBP in den Arterienwänden unverfügbar gemacht werden.
Fragmente von LBP werden durch chemische Spaltung generiert oder aus den bekannten Aminosäuresequenzen synthetisiert. Die Proben aus diesen Fragmenten werden individuell („kalt") dem radiomarkierten LBP, wie in Beispiel 8 beschrieben, zugefügt, um die inhibitorische Potenz der verschiedenen Fragmente zu beurteilen. Durch iterative Applikation dieses Verfahrens auf progressiv kleinere Anteile von Fragmenten, die als inhibitorisch identifiziert wurden, werden das kleinste aktive Polypeptid-Fragment oder die -Fragmente identifiziert. Auf ähnliche Weise werden Analoga der LBP zur Identifikation von Analoga getestet, die durch Bindung an LDL als Inhibitoren wirken können. Und auf ähnliche Weise werden Mimetika von LBP (Moleküle, die der Konformation und/oder den Ladungsverteilungen der LDL-Bindungstellen an LBP-Molekülen ähnlich sind) auf ähnliche Weise zur Identifikation von Molekülen, die Affinitäten zu LDL-Bindungsstellen an LBP aufweisen, getestet.
Die Affinitäten der auf diese Weise identifizierten Inhibitoren sind mindestens so stark wie die Affinität von LDL selbst zu den LDL-Bindungsstellen an LBP. Die Inhibitoren binden mindestens kompetitiv und einige auch irreversibel und präferenziell, an die LDL-Bindungsstellen, wodurch solche Stellen zur Bindung an humorale LDS unverfügbar gemacht werden.
BEISPIEL 11: ELISA-ASSAYS
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung eines ELISA-Plattenassays zur Quantifikation der Kapazität einer Testverbindung bei der Inhibition der Bindung von LDL an ein spezifisches LBP.
Der Assay wurde wie folgt durchgeführt: LDL wurde in 50 mM Na₂HCO₃, pH 9,6/0,02% NaN₃ verdünnt und den Vertiefungen einer 96-Well-Platte (Immuno Ware 96-Well Reacti-Bind EIA Polystyrene Plates; Pierce (Rockford, IL)) zugefügt, um eine Endkonzentration im Bereich von 0,1 bis 1 μg/Vertiefung zu erlangen. Die Platten wurden 6 h bei Raumtemperatur inkubiert. Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Vertiefungen 3 × mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 (TBS) gewaschen und über Nacht mit 200 μl eines 1%igen bovinen Serumalbumins (BSA) in TBS/0,02 % NaN₃ (Sigma; St. Louis MO) bei Raumtemperatur blockiert. Die Vertiefungen wurden dann mit 200 μl LBP-Protein (5–10 μg/Vertiefung) in TBS und variierenden Konzentrationen der Testverbindung inkubiert. Die Platten wurden 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann 3 × mit TBS gewaschen und 2 h mit 200 μl 1%iger BSA in TBS/0,02 % NaN₃ bei Raumtemperatur blockiert. Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Vertiefungen 3 × mit TBS gewaschen und der entsprechende Meerschweinchen-Anti-LBP-Protein polyklonale Antikörper wurde den Vertiefungen in einer Verdünnung von 1:1000 (in TBS/0,05 % Tween 20) zugefügt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann 3 × mit TBS/0,05 % Tween 20 gewaschen; jeder Vertiefung wurde Ziegen-Anti-Meerschweinchen-IgG alkalisches Phophatase-Konjugat (Sigma) in einer Verdünnung von 1:30 000 zugefügt. Die Platten wurden 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden 3 × mit TBS/0,05 % Tween 20 gewaschen und es wurde eine kolorimetrische Reaktion durch Zufügen von 200 ml p-Nitrophenylphosphat-Substrat (Sigma; St Louis MO) zu den Vertiefungen durchgeführt. Die Reaktion wurde 30 min bei Raumtemperatur ablaufen lassen und wurde mit 50 μl 3N NaOH gestoppt. Die Absorption wurde bei 405 nm unter Verwendung eines ELISA-Plattenlesegeräts ermittelt. Die Wirksamkeit der Testverbindung beim Blockieren der Bindung von LDL an das rekombinante Protein wurde durch Vergleich der Absorptionswerte von Kontrollgruppen und behandelten Gruppen beurteilt.
Als Alternative wurden LBP anstelle von LDL an die Platte gebunden. Die rekombinante LBP-Proteinbindung an LDL und die Wirkung von variierenden Konzentrationen des Inhibitors auf die LBP-LDL-Bindung wurde durch die Verwendung von Antikörpern gegen LDL bestimmt. Diese Interaktion wurde durch die Verwendung von einem an ein Reporter-Enzym (z. B. alkalische Phosphatase) konjugierten sekundären Antikörper sichtbar gemacht.
Die ELISA-Plattenassays wurden zum Screening nach Mitteln verwendet, die sich auf die Bindung von LBP-Proteinen an LDL auswirken können. So wurden zum Beispiel sich von LBP-1- und humanen LBP-3-Proteinsequenzen (BHF-1 bzw. BHF-2) herleitende Peptide synthetisiert, und es wurde gezeigt, dass sie die Bindung von LDL an rekombinante LBP-1 und LBP-2 in diesem Format reduzieren. Diese Ergebnisse stimmten mit den mit den ACE-Assays erhaltenen überein.
BEISPIEL 12: VERABREICHUNG VON HUMANISIERTEN ANTIKÖRPERN GEGEN LBP ZUR BLOCKIERUNG DER LDL-BINDUNGSSTELLEN AN LBP
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verabreichung von humanisierten Antikörpern gegen LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 zur Blockierung von LDL-Bindungsstellen an arteriellen LBP-Molekülen an Patienten. Monoklonale Maus-Antikörper werden durch rekombinante DNA-Verfahren humanisiert und durch dem Fachmann bekannte Standardverfahren (Berkower, I., Curr. Opin. Biotechnol. 7: 622–628 (1996); Ramharayan und Skaletsky, Am. Biotechnol. Lab 13: 26–28 (1995)) gegen LBP und/oder die LDL-Bindungstellen an den LBP produziert. Die entsprechenden Fab-Fragmente werden auch, wie in Goding, J.W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, New York, NY (1986) beschrieben, produziert. Diese Antikörper werden parenteral in ausreichenden Mengen zur Blockierung der LDL-Bindungsstellen an LBP-Molekülen, d. h. 1–10 mg/kg täglich, verabreicht. Dies verhindert die irreversible arterielle Aufnahme von LDL, die zur Förderung der Oxidation des LDLs erforderlich ist.
BEISPIEL 13: PRÄPARATION VON LDL
Dieses Beispiel veranschaulicht die Präparation von LDL. LDL wurde aus dem Plasma von normolipämischen Donoren (Chang et al., Arterioscler. Thromb. 12: 1088–1098 (1992)) präpariert. 100 ml Vollblut wurden in Röhrchen mit 100 mM Dinatrium-EDTA gegeben. Das Plasma wurde von den roten Blutzellen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (2 000 g; 30 min; 4 °C) abgetrennt. Die Plasmadichte wurde auf 1,025 g/ml mit einer Lösung aus KBr angepasst und 18–20 h bei 100 000 × g, 12°C, zentrifugiert.
Lipoproteine sehr geringer Dichte (VLDL) wurden von der Oberseite der Zentrifugenröhrchen mit einer Pasteur-Pipette entfernt. Die Dichte der übrigen Lösung wurde auf 1,050 g/ml mit KBr-Lösung angehoben und 22–24 h, 100 000 × g, 12 °C zentrifugiert. LDL wurde von den Oberseiten der Zentrifugenröhrchen mit einer ausgezogenen Pasteur-Pipettenspitze entfernt. Die Reinheit der LDL-Präparation wurde mithilfe der Ouchterlony-Doppelimmundiffusion unter Verwendung von Antikörpern gegen humanes LDL, humanes HDL, humane Immunglobuline und humanes Albumin geprüft. KBr wurde durch Dialyse (11, × 2, = 16 h) gegen 0,9%ige Kochsalzlösung, pH 9,0, enthaltend 1 mM EDTA und 10 μM butyliertes Hydroxytoluen (BHT) aus der LDL-Lösung, das letztere zur Verhinderung der Oxidation von LDL, entfernt. Nach der Dialyse wurde das LDL-Protein nach dem Verfahren von Lowry (Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265–275 (1951)) gemessen, und das LDL wurde bis zum Gebrauch bei 4 °C gelagert. Die LDL-Präparationen wurden nicht länger als 4–6 Wochen aufbewahrt.
BEISPIEL 14: PRÄPARATION VON HDL
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von HDL. HDL wurde aus Plasma von normolipämischen Donoren hergestellt. 100 ml Vollblut wurden in Röhrchen mit 100 mM Dinatrium-EDTA gegeben und das Plasma wurde durch Zentrifugation (2000 g; 30 min; 4 °C) gesammelt. Im Plasma vorliegendes Apolipoprotein B, enthaltend Lipoproteine, wurde dann durch das sequenzielle Zufügen von Natrium-Heparin (5 000 Einheiten/ml) und MnCl₂ (1 M) zum Erlangen einer Endkonzentration von 200 Einheiten/ml bzw. 0,46 M präzipitiert (Warnick und Albers, J. Lipid Res. 19: 65–76 (1978)). Die Proben wurden dann zentrifugiert (2000 g; 1 h; 4 °C). Der Überstand wurde gesammelt und die Dichte auf 1,21 g/ml durch langsames Zufügen von festem KBr angepasst. HDL wurde durch Ultrazentrifugation (100 000 g; > 46 h; 12 °C) abgetrennt. Die Reinheit der HDL-Präparation wurde über den Ouchterlony-Doppelimmundiffusionstest unter Verwendung von Antikörpern gegen humanes HDL, humanes LDL, humane Immunglobuline und humanes Albumin gemessen. HDL-Proben wurden gegen Kochsalzlösung, pH 9,0/1 mM EDTA/10 μM BHT (4 l; 24 h/4 °C) dialysiert und das Gesamtprotein wurde anhand des Protein-Assays nach Lowry (Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265–275 (1951)) bestimmt. HDL wurde bei 4 °C bis zum Gebrauch gelagert. Die HDL-Präparationen wurden nicht länger als 2 Wochen aufbewahrt.
BEISPIEL 15: SYNTHESE VON BHF-1
Dieses Beispiel veranschaulicht die Synthese von BHF-1, einem Fragment des LBP-1 vom Kaninchen oder Menschen, das die Aminosäurereste 14 bis 33 enthält. BHF-1 wurde unter Verwendung eines Peptid-Synthesizers, Model 430A, von Applied Biosystems mit den chemischen Standard-t-Boc-NMP-Zyklen synthetisiert. Die Sequenz von BHF-1 ist wie folgt:
val-asp-val-asp-glu-tyr-asp-glu-asn-lys-phe-val-asp-glu-glu-asp-gly-gly-asp-gly (SEQ ID NO:9)
Nach der Synthese wurde das Peptid mit Fluorwasserstoffsäure/Anisol (10/l v/v) 30 min bei –10 °C gespalten und dann 30 min bei 0 °C inkubiert. BHF-1 wurde dann präzipitiert und 3 × mit kaltem Diethylether gewaschen. Die Aminosäure-Kopplung wurde mit dem Ninhydrin-Test überwacht (> 99 %).
Das BHF-1-Peptid wurde mittels der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie an einer Umkehrphasen-Vydac-C₄-Säule (2,24 × 25 cm) unter Verwendung einer linearen Gradiententrennung (2–98% B in 60 min) mit einer Fließrate von 9 ml/min bis zur Homogenität gereinigt. Puffer A bestand aus 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA)/Milli-Q-Wasser und Puffer B bestand aus 0,085 % TFA/80 % Acetonitril. Der Gradient wurde bei Raumtemperatur laufen lassen und die Absorption wurde bei 210 und 277 nm überwacht.
Die Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie ergab einen protonierten Molekülionen-Peak (M + H)⁺ bei m/z = 2290,2, der gut mit dem berechneten Wert übereinstimmte. Bei der Aminosäure-Analyse stimmten die experimentellen Werte für die relative Häufigkeit von jeder Aminosäure im Peptid gut mit den theoretischen Werten überein. Das lyophilisierte Peptid wurde bei –20 °C gelagert.
BEISPIEL 16: IN VITRO-SCREENING NACH MITTELN, WELCHE DIE BINDUNG ZWISCHEN LDL UND LBP INHIBIEREN
Dieses Beispiel veranschaulicht das in vitro-Screening nach Mitteln, welche die Bindung zwischen LDL und LBP inhibieren.
Ein Kandidaten-Polypeptid, bei dem es sich um ein Mittel handelt, wie z. B. LBP-1, LBP-2, LBP-3, BHF-1 oder jedwedes andere Polypeptid, wird gewählt. Das kürzeste Fragment des Polypeptids, das die LDL-Bindung an LBP in vitro inhibiert, wird ermittelt. Peptide werden mithilfe von hierin beschriebenen Standardverfahren synthetisiert. Die Inhibitionsassays werden unter Verwendung von Standard-ELISA-Verfahren zum Screening und ACE-Assays (Affinity Coelectrophoresis Assays) zur Bestätigung der ELISA-Ergebnisse, wie hierin beschrieben, durchgeführt. Kurze Peptide, die zum Beispiel von Dimeren bis 20-meren reichen, werden über Sequenzen des Kandidaten-Polypeptids konstruiert, deren chemische Charakteristika sie zu wahrscheinlichen LDL-Bindungsstellen, z. B. sauren Regionen, machen. Die Fähigkeit von kürzeren und kürzeren Längen der Peptide, um die LDL-Bindung in vitro und an Säugerzellen in Kultur zu inhibieren, wird getestet. So wird zum Beispiel die Wirkung des Peptids auf die Inhibition der LDL-Bindung in Säugerzellen, die zur Expression eines LBP-Gens transfiziert sind, getestet. Jedes der so als einen Inhibitor identifizierten Peptide wird mit jedem von LBP-1, LBP-2 und LBP-3 zur Bestimmung getestet, ob ein einzelner Inhibitor gegen alle drei LBP wirkt.
Sobald die geringst mögliche aktive Sequenz bestimmt ist, wird die Peptid-Hauptkette modifiziert, um die Proteolyse, wie hierin besprochen, zu inhibieren. Die Modifikation wird zum Beispiel durch Substitution eines Sulfoxids für das Carbonyl, durch Umkehren der Peptid-Bindung, durch Substitution eines Methylens für die Carbonyl-Gruppe oder eine andere ähnliche Standardmethodik erreicht. Siehe Spatola, A.F., „Peptide Backbone Modifications: A Structure-Activity Analysis of Peptides Containing Amide Bond Surrogates, Conformational Constraints, and Related Backbone Replacements", in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, S. 267–357, B. Weinstein (ed.), Marcel Dekker, Inc., New York (1983). Die Fähigkeit dieser Analoga, die LDL-Bindung an die LBP in vitro zu inhibieren, wird anhand der ELISA- und ACE-Assays auf ähnliche Weise wie für die vorstehend beschriebenen natürlichen Peptide getestet.
BEISPIEL 17: IN VITRO-SCREENING MIT KULTIVIERTEN SÄUGERZELLEN NACH MITTELN, WELCHE DIE BINDUNG ZWISCHEN LDL UND LPB INHIBIEREN
Dieses Beispiel veranschaulicht das Zellen-basierte in vitro-Screening nach Mitteln, von denen durch in vitro-Tests, wie zum Beispiel den ACE- und ELISA-Assay gezeigt wurde, dass sie potenzielle Inhibitoren der Bindung zwischen LDL und LBP darstellen.
Säugerzellen, wie zum Beispiel 293-Zellen, die im Allgemeinen zur Expression von rekombinanten Gen-Konstrukten verwendet werden, werden zur Entwicklung von Zelllinien verwendet, die LBP auf der Zelloberfläche exprimieren. Dies wird durch Subklonieren von offenen Leserahmen (ORFs) für LBP in einen Säuger-Expressionsplasmidvektor, pDisplay (Invitrogen, Carlsbad, CA) durchgeführt, der zum Exprimieren des Gens von Interesse auf der Zelloberfläche ausgelegt ist. Die Verwendung von Säugerzellen zur Herstellung von LBP lässt ihre Expression in einer funktionell aktiven, nativen Konformation zu. Deshalb sind stabil transfizierte Säugerzelllinien mit Oberflächenexpression von LBP, individuell oder in Kombination, insbesondere zur Bestimmung und Screening von Inhibitoren geeignet, die die LDS-Bindung in der Zellkultur blockieren ebenso wie die Cyctotoxizität dieser Verbindungen bewerten.
LBP-ORFs werden speziell durch die PCR (Perkin Elmer, Foster City, CA) aus cDNA-Matrizen unter Verwendung von Taq-Polymerase (Perkin Elmer) und geeigneten Primern amplifiziert. Die amplifizierten LBP-ORF werden mittels Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und aus den Gelscheiben mit dem Bio-Rad DNA Purification Kit (Bio-Rad, Hercules, CA) gereinigt. Die gereinigten DNAs werden dann mit den Restriktionsenzymen Bgl II und Sal I (New England Biolabs, Beverly, MA) zur Herbeiführung kohäsiver Enden zerschnitten und wieder mittels der Agarosegel-Elektrophorese und DNA-Extraktion wie vorstehend beschrieben gereinigt.
Die LBP-ORFs werden dann in die Bgl II/Sal I-Stellen in dem Säugerexpressionsvektor, pDisplay (Invitrogen), durch Ligation subkloniert. Rekombinante Plasmide werden durch Transformation in den E. coli-Stämmen TOP10 (Invitrogen) oder DH5α (Life Technologies, Grand Island, NY) etabliert. Rekombinante pDisplay/LBP-Plasmid-DNA wird aus E. coli-Übernachtkulturen mit dem Bio-Rad Plasmid Miniprep Kit isoliert, mit Bgl II/Sal I geschnitten und mittels Agarosegel-Elektrophorese analysiert. LBP-ORFs in erfolgreich transformierten Klonen werden anhand der automatisierten Didesoxy-DNA-Sequenzierung verifiziert. Zum Transfizieren humaner Nieren-293-Zellen werden 1–2 μg DNA mit 6 μl Lipofectamin-Reagenz (Life Technologies) gemischt und mit den Zellen wie im Protokoll von Life Technologies beschrieben inkubiert. Die LBP-Expression in transfizierten Zellen wird anhand der Western Blot-Analyse von Zellextrakten, die nach 48-stündiger Transfektion erhalten wurden, bestätigt. Zur Wahl von stabil transfizierten 293-Zellen wird dem Wachstumsmedium das Antibiotikum G418 (Life Technologies) in einer Konzentration von 800 μg/ml zugefügt. Gegen G418 resistente Kolonien werden auf rekombinante LBP-Expression anhand des Western Blot getestet, und rekombinante Klone, die LBP exprimieren, werden erweitert, auf LDL-Bindung analysiert und zum Testen von Verbindungen auf ihre Fähigkeit zur Inhibition der LDL-Bindung verwendet.
BEISPIEL 18: IN VIVO-SCREENING NACH MITTELN, WELCHE DIE BINDUNG ZWISCHEN LDL UND LBP INHIBIEREN
Dieses Beispiel veranschaulicht das in vivo-Screening von Mitteln, von denen durch in vitro-Tests gezeigt wurde, dass sie vielversprechende Kandidaten-Inhibitoren für die Bindung zwischen LDL und LBP darstellen.
Die inhibitorische Aktivität in vivo wird zuerst im heilenden, mithilfe des Ballon-Katheters deendothelialisierten Kaninchen-Aortamodell einer arteriellen Verletzung getestet (Roberts et al., J. Lipid Res. 24: 1160–1167 (1983); Chang et al., Arterioscler. Thomb. 12: 1088–1098 (1992)). Es wurde gezeigt, dass dieses Modell ein ausgezeichnetes Analogon für humane atherosklerotische Läsionen darstellt. Jeder Kandidaten-Inhibitor wird in fünf bis zehn ballonierten Kaninchen getestet, während eine gleiche Anzahl von Kaninchen ein Kontroll-Peptid oder Placebo erhalten. Vier Wochen nach der Deendothelialisierung der Aorta, wenn die Reendothelialisierung (Heilung) teilweise abgeschlossen ist, beginnt die tägliche parenterale (intravenös oder subkutan) oder intragastrische Verabreichung der Peptide und Analoga in einer initialen Konzentration von 10 mg/kg Körpergewicht, die in Abhängigkeit von den Ergebnissen nach unten oder nach oben auf 100 mg/kg, variiert wird. 30 min später wird ein Bolus von intravenös injiziertem mit ¹²⁵I-markiertem (oder ^99mTc-markiertem) LDL verabreicht, um die Fähigkeit des Kandidaten-Inhibitors in Kurzzeitstudien zur Inhibition der LDL-Sequestrierung bei der Heilung arterieller Läsionen zu testen. Wenn ¹²⁵I-LDL verwendet wird, werden die Tiere 8–24 h später getötet, die Aorten exzidiert, gewaschen und der quantitativen Autoradiographie von exzidierten Aorten, wie zuvor beschrieben wurde, unterzogen (Roberts et al., J. Lipid Res. 24: 1160–1167 (1983); Chang et al., Arterioscler. Thomb. 12: 1088–1098 (1992)). Wenn ^99mTc-LDL verwendet wird, erfolgt die Analyse mit der Bildgebung des lebenden anästhesierten Tieres nach 2–24 h durch die externe Gammakamera, wie zuvor beschrieben wurde (Lees and Lees, Syndromes of Atherosclerosis, in Fuster, Hrsg., Futura Publishing Co., Armonk, NY, S. 385–401 (1996)), gefolgt durch Tötung, Exzision und Bildgebung der exzidierten Aorta. Sofort vor dem Ende des Testens, werden an den Tieren Standard-Toxizitätstests, einschließlich Gesamtblutbild, Leberenzyme und Urinanalyse durchgeführt.
Die Verbindungen, die am wirksamsten und am wenigsten toxisch sind, werden dann in Kurzzeitstudien mit Kaninchen gestestet, denen eine 2%ige Cholesterol-Ration verfüttert wurde (Schwenke und Carew, Arteriosclerosis 9: 895–907 (1989)). Jeder Kandidaten-Inhibitor wird in fünf bis zehn Kaninchen getestet, während eine gleiche Anzahl an Kaninchen ein Kontroll-Peptid oder Placebo erhält. Die Tiere erhalten für eine Dauer bis zu zwei Wochen pro Tag eine Dosis oder mehr Dosen des Kandidaten-Inhibitors oder Placebos. Die tägliche Frequenz der Dosen wird durch die Verabreichungsroute bestimmt. Wenn das aktive Arzneimittel oder Placebo parenteral verabreicht wird, wird es 1 bis 3 × täglich gegeben und die 2%ige Cholesterol-Ration wird fortgesetzt. Wenn das Arzneimittel oder Placebo oral verabreicht wird, wird es mit der 2%igen Cholesterol-Ration vermischt. Schwenke and Carew (Arteriosclerosis 9: 895–907 (1989)) haben gezeigt, dass die LDL-Konzentration in zur Läsion neigenden Bereichen der Kaninchen-Aorta um das 22fache über dem Normbereich bei Kaninchen erhöht ist, denen über 16 Tage eine 2%ige Cholesterol-Ration verfüttert wird, und dass der erhöhte LDL-Gehalt dem histologischen Nachweis der frühen Atherosklerose vorausgeht. Deshalb wird die Analyse der Wirkung der Kandidaten-Inhibitoren zwei Wochen nach dem Beginn der Verfütterung von Cholesterol durch Injektion von ¹²⁵I-LDL durchgeführt, wobei ihm erlaubt wird, 8–24 h zu zirkulieren, und danach wird die quantitative Autoradiographie an den exzidierten Aorten von den Test- wie auch Kontrolltieren durchgeführt. Gegebenenfalls wird auch die Quantifizierung des aortalen Cholesteringehalts durchgeführt (Schwenke und Carew, Arteriosclerosis 9: 895–907 (1989); Schwenke und Carew, Arteriosclerosis 9: 908–918 (1989).
Die vorstehenden Verfahren identifizieren die viel versprechendsten Kandidaten-Inhibitoren ebenso wie die beste Route und Frequenz ihrer Verabreichung. Die auf diese Weise identifizierten Inhibitoren werden dann in Langzeitstudien an Kaninchen getestet, denen Cholesterol verfüttert wurde. Diese Tests werden auf die gleiche Weise wie die kurzzeitigen Cholesterol-Fütterungsstudien durchgeführt, außer dass die Wirksamkeit des Inhibitors durch Injektion von ¹²⁵I-LDL nach der Einleitung der Fütterung von Cholesterol bei längeren Intervallen getestet werden, und zur Läsion neigende Bereiche der Aorta zum Nachweis von Atherosklerose histologisch untersucht werden. Die Testzeiten erstrecken sich über zwei, vier und sechs Monate. Größere Arterien werden makroskopisch und histologisch auf Hinweise und die Ausbreitung der Atherosklerose untersucht. Gegebenenfalls werden andere zulässige Tiermodelle, wie zum Beispiel für Atherosklerose suszeptible Primaten (Williams et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 15: 827–836 (1995) und/oder Watanabe-Kaninchen durch kurz- oder langzeitige Fütterung mit Cholesterin getestet.
BEISPIEL 19: IN VIVO-INHIBITION VON RADIOMARKIERTER LDL-AKKUMULATION IN DER BALLONIERTEN DEENDOTHELIALISIERTEN KANINCHEN-AORTA ÜBER DIE INDUKTION AKTIVER IMMUNITÄT GEGEN LBP-PROTEIN
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkung, die die Induktion von Immunität gegen LBP-Protein auf die Akkumulation von radiomarkierter LDL im ballonierten deendothelialisierten Kaninchen-Aortamodell der Atherosklerose ausübt.
Immunität wurde in männlichen weißen Neuseeland-Kaninchen (Hazelton Research Products, Denver, PA) wie folgt induziert: Ein Gemisch aus gereinigtem humanem rekombinantem LBP-2- oder BHF-1-Peptide (1 ml; 1 mg) und RIBI-Adjuvans (RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) wurde subkutan an 2–5 Stellen entlang den dorsalen thorakalen und abdominellen Regionen des Kaninchens injiziert. Blut wurde mittels Venenpunktur an den Tagen 1 (präimmune Blutentnahme), 35, 63 und 91 entnommen. Booster-Injektionen wurden an den Tagen 28 (500 μg; s.c.), 56 (250 μg; s.c.) und 84 (125 μg; s.c.) verabreicht.
Der Titer der Kaninchen wurde mittels Reihenverdünnung unter Verwendung eines ELISA-Plattenformats bewertet. Das präimmune Serum wurde zur gleichen Zeit bewertet. Nach dem dritten Booster mit LBP-Protein oder -Peptid erreichte der Titer einen maximalen Spiegel mit einer nachweisbaren kolorimetrischen Response auf einer ELISA-Platte von 156 pg. Der Titer wird als die maximale Verdünnung des Antikörpers definiert, die in 30 min eine Ablesung der Absorption von 0,5 über der Kontrolle ergibt. Die Spezifität der polyklonalen Antikörper wurde unter Verwendung der Western Blot-Analyse, wie in Beispiel 6 beschrieben, nachgewiesen.
Am Tag 93 wurde die abdominelle Aorta von immunisierten Kaninchen und Kontrollkaninchen unter Verwendung eines Embolektomie-Katheters (Fogarty Nr. 4) deendothelialisiert (Chang et al., Arteriosclerosis and Thrombosis 12: 1088–1098 (1992)). Vier Wochen nach der Ballonierung erhielten die Kaninchen eine Bolusinjektion von ¹²⁵I-markiertem LDL (1 ml; i.v.). Die Blutproben wurden in einstündigen Intervallen über 8 Stunden und 24 Stunden nach der Injektion gesammelt. Die Blutproben wurden 30 min bei 2000 U/min (40 °C) zentrifugiert und die im Serum vorliegende Gesamtaktivität wurde unter Verwendung eines Gammazählers bestimmt. Die „TCA-präzipitierbaren" Gesamtcounts wurden durch Zufügen von TCA zum Serum bis zu einer Endkonzentration von 10 %, gefolgt von einer Inkubation für 10 min bei 4 °C durchgeführt. Die Serumproben wurden dann zentrifugiert (2000 U/min; 30 min; 40 °C) und die im Überstand vorliegende Gesamtaktivität wurde bestimmt. Die „TCA präzipitierbaren" Counts wurden durch Subtraktion berechnet: Lösliche Gesamtcounts minus der im Überstand nach der TCA-Präzipitation vorliegenden Counts. Die Blutproben für die Bestimmung der Antikörperfiter wurden vor der Injektion des radiomarkierten LDL gesammelt.
After 24 h wurden die Kaninchen intravenös mit 5 % Evan's Blau-Farbstoff injiziert, der 15 min zirkulieren durfte. Bereiche in der Aorta, in denen der Endothelüberzug fehlt, färben sich Blau an, während die Bereiche, die von Endothel überzogen sind, ungefärbt bleiben. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Kaninchen euthanasiert und die abdominelle und thorakale Aorta wurden herauspräpariert, gespült, und über Nacht in 10 % TCA bei Raumtemperatur fixiert. Die Aorten wurden dann sehr gründlich mit physiologischer Kochsalzlösung gespült, gewogen, gezählt, trocken getupft und zur Sichtbarmachung des Musters der radiomarkierten LDL-Akkumulation in der deendothelialisierten abdominellen Aorta vom Kaninchen auf einen Röntgenfilm gegeben.
Die Immunisierung von Kaninchen gegen rekombinantes humanes LBP-2- oder BHF-1-Peptid veränderte das Muster der radiomarkierten LDL-Akkumulation in der ballonierten deendothelialisierten abdominellen Aorta. Bei Bereinigung für die Dosierung und die prozentuale Reendothelialisierung wiesen immunisierte, ballonierte Kaninchen im Vergleich zu nicht immunen, ballonierten Kaninchen eine geringere Akkumulation radiomarkierter LDL auf. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die aktive Immunisierung gegen LBP ein wirksames Mittel bereitstellt, mit dem die Akkumulation von LDL in der verletzten Arterienwand modifiziert werden kann.
BEISPIEL 20: SCREENING-MITTEL IN MENSCHEN, DIE DIE BINDUNG ZWISCHEN LDL UND LBP INHIBIEREN
Studien am Menschen wurden gemäß den Standardprotokollen der FDA zum Testen neuer Arzneimittel auf Sicherheit (Phase I), Wirksamkeit (Phase II) und Wirksamkeit im Vergleich zu anderen Behandlungen (Phase III) durchgeführt. Die Probanden, die nach ihrer Einwilligung nach Aufklärung in die Studien aufgenommen wurden, sind zwischen 18 und 70 Jahre alt. Schwangere Frauen oder Frauen, die möglicherweise schwanger werden könnten, oder Probanden mit Erkrankungen mit Ausnahme der primären Atherosklerose, wie zum Beispiel Krebs, Lebererkrankungen oder Diabetes, werden ausgeschlossen. Zur Teilnahme an den Studien der Phase II und Phase III nach dem FDA-Protokoll ausgewählten Probanden leiden an einer atherosklerotischen Erkrankung, die zuvor anhand von Standardverfahren, wie zum Beispiel Ultraschall und/oder Angiographie dokumentiert wurde, oder von denen bekannt ist, dass sie ein hohes Risiko aufweisen, an Atherosklerose zu erkranken, aufgrund dessen, dass sie mindestens einen Verwandten ersten Grades mit dokumentierter Atherosklerose haben. Die Probanden selbst weisen normale oder abnormale Plasmalipide auf. Der initiale Test schließt 20–50 Probanden unter dem aktiven Arzneimittel und 20–50 Probanden, die hinsichtlich des Alters, Geschlechts und atherosklerotischen Status abgestimmt sind, unter Placebo ein. Die Anzahl an Probanden wird anhand der zum Erreichen von statistischer Signifikanz erforderlichen Zahl prädeterminiert. Endpunkte für die Wirksamkeit des Inhibitors schließen Ultraschall-Messungen der Carotisdicke bei Probanden mit hohem Risiko ebenso wie bei Probanden mit bekannter Erkrankung der Carotis oder Koronararterienerkankung; mit atherosklerotischen Ereignissen; atherosklerotische Todesfälle; und Todesfälle aufgrund aller Ursachen bei allen Probanden ein. Die nicht invasive Analyse (Carotisdicke mittels Ultraschall) nach Stadler (Med. and Biol. 22: 25–34 (1996)) wird in 6- bis 12-monatlichen Intervallen für die Dauer von 3 Jahren durchgeführt. Atherosklerotische Ereignisse und Todesfälle ebenso wie die Todesfälle aufgrund aller Ursachen sind für den Zeitpunkt zum Jahr 3 tabellarisch angegeben.
Die orale Dosierung des Arzneimittels in den Studien der Phase I nach Richtlinien der FDA liegt im Bereich von 0,01 bis 10 g/Tag und wird anhand der Ergebnisse von Tierstudien ermittelt und auf einer pro kg Basis extrapoliert. Basierend auf den aus Studien der Phase I erhaltenen Daten werden der Dosisbereich und die Frequenz in den Studien der Phasen II und III eingegrenzt. Wenn anhand der Tierstudien bestimmt wird, dass die parenterale Verabreichung das einzig wirksame Verfahren ist, wird die parenterale Verabreichung bei humanen Probanden durch Injektion ebenso wie über transdermale Routen und nasale Insufflationsrouten getestet. Das Testen eines parenteralen Arzneimittels erfolgt nach den gleichen Vorgaben wie das für die orale Verabreichung.
Der optimale Behandlungsplan und die Dosierung für Menschen wird auf diese Weise etabliert.
BEISPIEL 21: BEHANDLUNG EINES AN ATHEROSKLEROSE LEIDENDEN PATIENTEN MIT BHF-1
Dieses Beispiel veranschaulicht ein Verfahren zur Behandlung eines an Atherosklerose leidenden Patienten mit einem LBP-Fragment, z. B. BHF-1, um den Spiegel von arteriell gebundenem LDL bei dem Patienten zu senken. BHF-1 wird wie hierin beschrieben gewonnen. Der BHF-1 wird an den Säuger intravenös als ein Bolus oder als eine Injektion in einer Konzentration von 0,5–10 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Derartige Verabreichungen werden unbegrenzt lange wiederholt, um die Entwicklung oder Progression einer symptomatischen Atherosklerose zu verhindern, genau wie dies derzeit mit Cholesterinsenkenden Arzneimitteln getan wird. Stabile Probanden werden zweimal jährlich zur Bewertung der Ausbreitung von jedweder atherosklerotischer Erkrankung, durch körperliche Untersuchung und nicht invasive Studien, wie zum Beispiel die Carotisdicke, Ultraschall und/oder Gammakamera-Bildgebung der wichtigsten Arterien, zur Bestimmung, ob atherosklerotische Läsionen vorliegen, und– wenn sie vorbestehend sind– ob sie sich zurückgebildet haben oder progredient sind, untersucht. Ein derartiges Regimen führt zur Behandlung der Atherosklerose.
Der Fachmann wird dazu in der Lage sein, unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimentierung, viele Äquivalente der hierin beschriebenen erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen zu ermitteln. Es besteht die Absicht, dass diese und alle anderen Äquivalente in den folgenden Ansprüchen abgedeckt sind. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polynukleotid umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, umfassend eine Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: einer Aminosäuresequenz, die an Lipoprotein geringer Dichte (LDL) bindet und mit der Sequenz von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 mindestens zu 80% identisch ist; einer Aminosäuresequenz, die an LDL bindet und die Sequenz von SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:23 oder SEQ ID NO:29 umfasst; einer Aminosäuresequenz, die an LDL bindet und mit einem Fragment aus mindestens 20 Aminosäureresten von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 identisch ist; und einer Aminosäureseqeunz, die an LDL bindet, worin die Nukleotidsequenz spezifisch an SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 oder SEQ ID NO:17 hybridisiert.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz mit der Sequenz von SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:6 mindestens zu 90% identisch ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz mit der Sequenz von SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:6 mindestens zu 95% identisch ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz mit der Sequenz von SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:7 mindestens zu 90% identisch ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz mit der Sequenz von SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:7 mindestens zu 95% identisch ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz mit der Sequenz von SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:8 mindestens zu 90% identisch ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz mit der Sequenz von SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:8 mindestens zu 95% identisch ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz die Sequenz von SEQ ID NO:1 umfasst.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz die Sequenz von SEQ ID NO:6 umfasst.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin das Polypeptid aus der Sequenz von SEQ ID NO:1 besteht.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin das Polypeptid aus der Sequenz von SEQ ID NO:6 besteht.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz die Sequenz von SEQ ID NO:2 umfasst.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz die Sequenz von SEQ ID NO:7 umfasst.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz die Sequenz von SEQ ID NO:5 umfasst.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz die Sequenz von SEQ ID NO:8 umfasst.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin das Polypeptid aus der Sequenz von SEQ ID NO:5 besteht.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz die Sequenz von SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23 oder SEQ ID NO:29 umfasst.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz mit einem Fragment aus mindestens 30 Aminosäureresten von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 identisch ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz mit einem Fragment aus mindestens 100 Aminosäureresten von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 identisch ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Nukleotidsequenz mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 oder SEQ ID NO:17 mindestens zu 80% identisch ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Nukleotidsequenz mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 oder SEQ ID NO:17 mindestens zu 95% identisch ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, worin die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 oder SEQ ID NO:17 umfasst.
Rekombinanter Vektor umfassend das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1– 22.
Zelle umfassend den rekombinanten Vektor nach Anspruch 23.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Zelle nach Anspruch 24 unter Bedingungen umfasst, welche die Expression des Polypeptids erlauben.
Isoliertes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: Einer Aminosäuresequenz, die an LDL bindet und mit der Sequenz von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 mindestens zu 80% identisch ist; einer Aminosäuresequenz, die an LDL bindet und die Sequenz von SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23 oder SEQ ID NO:29 umfasst; und einer Aminosäuresequenz, die an LDL bindet und mit einem Fragment aus mindestens 20 Aminosäureresten von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 identisch ist.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin die Aminosäuresequenz mit der Sequenz von SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:6 mindestens zu 90% identisch ist.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin die Aminosäuresequenz mit der Sequenz von SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:6 mindestens zu 95% identisch ist.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin die Aminosäuresequenz mit der Sequenz von SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:7 mindestens zu 90% identisch ist.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin die Aminosäuresequenz mit der Sequenz von SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:7 mindestens zu 95% identisch ist.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin die Aminosäuresequenz mit der Sequenz von SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:8 mindestens zu 90% identisch ist.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin die Aminosäuresequenz mit der Sequenz von SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:8 mindestens zu 95% identisch ist.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin die Aminosäuresequenz die Sequenz von SEQ ID NO:1 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin die Aminosäuresequenz die Sequenz von SEQ ID NO:6 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin das Polypeptid aus der Sequenz von SEQ ID NO:1 besteht.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin das Polypeptid aus der Sequenz von SEQ ID NO:6 besteht.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin die Aminosäuresequenz die Sequenz von SEQ ID NO:2 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin die Aminosäuresequenz die Sequenz von SEQ ID NO:7 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin die Aminosäuresequenz die Sequenz von SEQ ID NO:5 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin die Aminosäuresequenz die Sequenz von SEQ ID NO:8 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin das Polypeptid aus der Sequenz von SEQ ID NO:5 besteht.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin die Aminosäuresequenz die Sequenz von SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23 oder SEQ ID NO:29 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin die Aminosäuresequenz mit einem Fragment aus mindestens 30 Aminosäureresten von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 identisch ist.
Polypeptid nach Anspruch 26, worin die Aminosäuresequenz mit einem Fragment aus mindestens 100 Aminosäureresten von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 identisch ist.
Antikörper oder ein Fragment davon, der/das spezifisch an ein Polypeptid bindet, bestehend aus der Sequenz von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8.
Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 45, umfassend ein Antikörper-Fragment, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Fab-Fragment, einem Fab'-Fragment und einem F(ab')₂-Fragment.
Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 45, umfassend ein Antikörper-Fragment, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem F(v)-Fragment, einem Schwerketten-Monomer, einem Schwerketten-Dimer, einem Schwerketten-Trimer, einem Leichtketten-Monomer, einem Leichtketten-Dimer, einem Leichtketten-Trimer und einem Dimer, bestehend aus einer schweren und einer leichten Kette.
Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 45, umfassend einen Antikörper, der einen monoklonalen Antikörper darstellt.
Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 45, worin der Antikörper oder ein Fragment davon einen humanisierten Antikörper oder ein Fragment davon darstellt.
Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 45, worin der Antikörper oder ein Fragment davon einen chimären Antikörper oder ein Fragment davon darstellt.
Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 50, worin der chimäre Antikörper oder ein Fragment davon eine sich von einem humanen Antikörper herleitende konstante Region und eine sich von einem Mausantikörper herleitende variable Region enthält.
Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 45, worin der Antikörper oder ein Fragment davon einen humanen Antikörper oder einen Antikörper oder ein Fragment davon darstellt.
Antikörper oder ein Fragment davon nach einem der Ansprüche 45–52, worin der Antikörper oder ein Fragment davon die Bindung von LDL an das Polypeptid blockiert.
Antikörper oder ein Fragment davon nach einem der Ansprüche 45–53, worin der Antikörper oder ein Fragment davon eine Markierung umfasst.
Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 54, worin die Markierung eine Radiomarkierung darstellt.
Antikörper oder ein Fragment davon nach einem der Ansprüche 45–53, worin der Antikörper oder ein Fragment davon einen Technetium-bindenden Liganden umfasst.
Antikörper oder ein Fragment davon nach einem der Ansprüche 45–53, worin der Antikörper oder ein Fragment davon einen Gadolinium-bindenden Chelator umfasst.
Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 57, worin der Gadolinium-bindende Chelator Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) darstellt.
Präparation aus polyklonalen Antikörpern, die spezifisch an ein Polypeptid binden, bestehend aus der Sequenz von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8.
Präparation nach Anspruch 59, worin die Antikörper die Bindung von LDL an das Polypeptid blockieren.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Antikörper oder ein Fragment davon nach einem der Ansprüche 45–58 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Zelllinie, die den Antikörper nach Anspruch 61 bildet.
Zelllinie nach Anspruch 62, worin die Zelllinie ein Hybridom darstellt.
Verfahren zur Identifikation eines Kandidatenmittels, das den LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Metabolismus oder die -Struktur moduliert, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Kontaktieren in vitro eines Kandidatenmittels und eines LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Polypeptids; und Bewerten der Wirkung des Kandidatenmittels auf den LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Metabolismus oder die -Struktur.
Verfahren nach Anspruch 64, worin das Verfahren Folgendes umfasst: Kontaktieren in vitro eines LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Polypeptids, eines LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Bindungsmoleküls und eines Kandidatenmittels; und Messen der Bildung eines Komplexes, enthaltend das LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Polypeptid und das LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Bindungsmolekül, worin eine Reduktion der Bildung des Komplexes in Anwesenheit des Kadidatenmittels im Vergleich zur Abwesenheit des Kandidatenmittels anzeigt, dass das Kandidatenmittel die Bindung von LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 an das LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Bindungsmolekül inhibiert.
Verfahren nach Anspruch 64, worin das Verfahren Folgendes umfasst: Messen der Bindung des Kandidatenmittels an das LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Polypeptid, um dadurch ein Kandidatenmittel zu identifizieren, das an ein LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Polypeptid bindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 64– 66, worin das LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: Einer Aminosäuresequenz, die an LDL bindet und mit der Sequenz von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 mindestens zu 80% identisch ist; einer Aminosäuresequenz, die an LDL bindet und die Sequenz von SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:23 oder SEQ ID NO:29 umfasst; und einer Aminosäuresegeunz, die an LDL bindet und mit einem Fragment aus mindestens 20 Aminosäureresten von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 identisch ist.
Verfahren nach Anspruch 67, worin das LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die an LDL bindet und mit der Sequenz von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 mindestens zu 80% identisch ist.
Verfahren nach Anspruch 68, worin das LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 64–69, worin das Kandidatenmittel ein LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Fragment, -Analogon oder -Mimetikum darstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 64–69, worin das Kandidatenmittel eine Nukleinsäure, einen Antikörper, einen Metaboliten, ein Kohlenhydrat, ein Glycoprotein, ein Peptid oder ein Nichtpeptid-Mimetikum darstellt.
Verfahren nach Anspruch 65, worin das LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Bindungsmolekül LDL darstellt.
Verfahren nach Anspruch 72, worin das LDL natives LDL darstellt.
Verfahren nach Anspruch 72, worin das LDL modifiziertes LDL darstellt.
Verfahren nach Anspruch 74, worin das modifizierte LDL methyliertes LDL oder oxidiertes LDL darstellt.
Verfahren nach Anspruch 65, worin das LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Bindungsmolekül eine arterielle, extrazelluläre Matrixkomponente darstellt.
Verfahren nach Anspruch 76, worin die arterielle, extrazelluläre Komponente ein Proteoglykan darstellt.
Verfahren nach Anspruch 64, worin das Verfahren die Bewertung der Wirkung des Kandidatenmittels auf die primäre, sekundäre oder tertiäre Struktur von LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 64, worin das Verfahren die Bewertung der Wirkung des Kandidatenmittels auf die Konformationsfaltung von LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 64, worin das Verfahren die Bewertung der Wirkung des Kandidatenmittels auf die LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Expression umfasst.
Verfahren nach Anspruch 64, worin das Verfahren die Bewertung der Wirkung des Kandidatenmittels auf die Freisetzung von LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 64, worin das Verfahren die Bewertung der Wirkung des Kandidatenmittels auf die Verteilung von LBP-1, LBP-2 oder LBP-3 umfasst.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 26–44 zur Anwendung bei der Behandlung der Atherosklerose bei einem Patienten.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 26–44 zur Anwendung bei der Diagnose der Atherosklerose bei einem Patienten.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 26–44 zur Anwendung bei der Immunisation eines Patienten gegen ein LBP-1, LBP-2 oder LBP-3-Polypeptid.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 26–44 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Atherosklerose.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 26–44 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Diagnose der Atherosklerose.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 26–44 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Anwendung bei der Immunisation eines Patienten gegen ein LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Polypeptid.
Antikörper oder ein Fragment davon oder die Präparation polyklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 45–60 zur Anwendung bei der Behandlung der Atherosklerose bei einem Patienten.
Antikörper oder ein Fragment davon oder die Präparation polyklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 45–60 zur Anwendung beim Diagnostizieren der Atherosklerose bei einem Patienten.
Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 90, worin das Diagnostizieren Folgendes umfasst: Bestimmung der Lokalisierung oder Quantifizierung des markierten LBP-1, LBP-2 oder LBP-3, das mit dem verabreichten Antikörper oder einem Fragment davon interagiert, mittels eines bildgebenden Verfahrens zum Nachweis der Anwesenheit einer atherosklerotischen Läsion bei dem Patienten.
Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 91, worin das bildgebende Verfahren aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Magnetresonanztomographie, Gammakamera-Technik, Single-Photon-Emissionscomputertomographie und Positronen-Emissionstomographie.
Verwendung des Antikörpers oder eines Fragmentes davon oder die Präparation polyklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 45–60 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Atherosklerose.
Verwendung des Antikörpers oder eines Fragmentes davon oder die Präparation polyklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 45–60 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Diagnose der Atherosklerose.
Antisense-Molekül, das unter zellulären Bedingungen an die Nukleinsäure von SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 oder SEQ ID NO:17 auf eine Weise hybridisiert, welche die Expression des durch die Nukleinsäure kodierten LBP-1-, LBP-2- oder LBP-3-Polypeptids inhibiert.
Antisense-Molekül nach Anspruch 95 zur Anwendung bei der Behandlung der Atherosklerose bei einem Patienten.
Verwendung des Antisense-Moleküls nach Anspruch 95 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Atherosklerose.