JP4184437B2 - 新規な低密度リポ蛋白質結合性蛋白質並びにアテローム性動脈硬化症の診断及び治療におけるそれらの利用 - Google Patents
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Description
この出願は、1996年11月27日出願の米国仮出願第60/031,930号及び1997年6月3日出願の米国仮出願第60/048,547号の利益を請求する。
この発明は、低密度リポ蛋白質(LDL)に結合する新規なポリペプチド(LBP)、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにアテローム性動脈硬化症の治療、診断及び治療剤に関係する。
発明の背景
アテローム性硬化症は、心臓発作の主要な原因である。米国、欧州及び日本における全死亡の約50%がアテローム性動脈硬化症によると報告されている。動脈壁内のアテローム性硬化病変がアテローム性動脈硬化症の特徴を与える。コレステリルエステル(CE)が、これらのアテローム性病変中に存在する。低密度リポ蛋白質(LDL)は、血漿CEの主要なキャリアーであることが示されており、CEをアテローム性病変に入れる因子として関係してきた。
散在性の脂質充満マクロファージ(泡沫細胞と呼ばれる)の群は、アテローム性動脈硬化症の最初の可視的徴候であり、I型病変として記載される。これらのマクロファージは、LDLに由来するCEを含むことが報告されている。これらのマクロファージは、酸化されたLDLを認識するが、ネイティブなLDLを認識せず、酸化されたLDLのファゴサイトーシスにより泡沫細胞になる。一層大きい一層組織化された泡沫細胞の堆積、脂肪性の縞は、第II型病変に相当する。これらの病変は、更に、プラークと呼ばれる複合病変に発達し、それらは動脈内の血流の妨げとなり得る。
LDLの動脈内の蓄積は、機能的に変化した内皮細胞の動脈壁内の存在に依存すると広く信じられている。LDL(ネイティブなLDL及びメチル化したLDLの両方)が大動脈の病変内の再生する内皮の島の縁にのみ集中して不可逆的に蓄積し、該縁には機能的に変化した内皮細胞が存在するがこれらの島の中心には存在せずそこでは内皮の再生が完了していることが、アテローム性動脈硬化症のモデル動物において報告されている。同様に、LDLは、ヒトのアテローム性動脈硬化症病変に蓄積する。LDLが動脈の病変内に集中して不可逆的に蓄積する機構は、現在まで分かっていない。
発明の要約
LDLに結合するポリペプチドを提供することは、この発明の目的である。
動物がアテローム性動脈硬化症の危険にあるかどうかを測定する方法を提供することは、この発明の更に別の目的である。
アテローム性動脈硬化症の治療において用いるための薬剤を評価する方法を提供することは、この発明の更に別の目的である。
アテローム性動脈硬化症の治療方法を提供することは、この発明の更に別の目的である。
この発明の更に別の目的は、LBP(低密度リポ蛋白質結合性蛋白質)遺伝子及び/又はポリペプチド、又はこれらの断片、アナログ及び変異物を利用して、アテローム性動脈硬化症の治療、診断及び/又は治療剤の同定を助成することである。
一面において、この発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:9に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド;又は上記のポリヌクレオチドの何れかにハイブリダイズすることができる及び少なくとも約95%同一であるポリヌクレオチド(コードされるポリペプチドは、LDLに結合することができる);又は上記のポリヌクレオチドの何れかの生物学的に活性な断片(コードされるポリペプチドは、LDLに結合することができる)を特徴とする。
ある具体例において、このポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17又はSEQ ID NO:18に示した核酸配列を含む。
この発明の他の面は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:9に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む単離されたポリペプチド;又は上記のポリペプチドの何れかに少なくとも約95%同一であるポリペプチド(このポリペプチドは、LDLに結合することができる);又は上記のポリペプチドの何れかの生物学的に活性な断片(この断片は、LDLに結合することができる)である。
この発明の他の面は、動物がアテローム性動脈硬化症の危険にあるかどうかを測定する方法である。一の動物を準備する。LBPの代謝又は構造の面を、この動物において評価する。LBPの代謝又は構造の面における異常は、アテローム性動脈硬化症の危険にあるという診断となる。
この発明の他の面は、アテローム性動脈硬化症の治療において用いるための薬剤を評価する方法である。一の薬剤を準備する。この薬剤を試験用の細胞、無細胞系又は動物に治療上有効な量で投与する。この薬剤のLBPの代謝又は構造の面に対する効果を評価する。LBPの代謝又は構造の面における変化は、この薬剤のアテローム性動脈硬化症の治療における有用性を示す。
この発明の他の面は、薬剤を、LBPポリペプチドの結合性分子(例えば、ネイティブなLDL、改変したLDL例えばメチル化したLDL若しくは酸化したLDL)又は動脈の細胞外マトリクス構造成分への結合を変える能力について評価する方法である。一の薬剤を準備する。LBPポリペプチドを準備する。結合性分子を準備する。この薬剤、LBPポリペプチド及び結合性分子を合わせる。このLBPポリペプチド及び結合性分子を含む複合体の形成を検出する。この薬剤の存在下での複合体の形成における変化(この薬剤の不在時と比較しての変化)は、この薬剤がLBPポリペプチドの結合分子への結合を変えることを示す。
この発明の他の面は、薬剤を、LBPポリペプチドに結合する能力について評価する方法である。一の薬剤を準備する。LBPポリペプチドを準備する。この薬剤をLBPポリペプチドと接触させる。この薬剤のLBPポリペプチドと結合する能力を評価する。
この発明の他の面は、薬剤を、LBP調節配列をコードする核酸に結合する能力について評価する方法である。一の薬剤を準備する。LBP調節配列をコードする核酸を準備する。この薬剤をこの核酸と接触させる。この薬剤のこの核酸に結合する能力を評価する。
この発明の他の面は、動物におけるアテローム性動脈硬化症の治療方法である。アテローム性動脈硬化症の治療の必要な動物を準備する。LBPの構造又は代謝の面を変えることのできる薬剤を準備する。この薬剤をこの動物に、治療上有効な量で、アテローム性動脈硬化症の治療が生じるように投与する。ある具体例においては、この薬剤は、LBPポリペプチド例えばLBP−1、LBP−2若しくはLBP−3又はこれらの生物学的に活性な断片若しくはアナログである。ある具体例においては、この薬剤は、約100、50、30、20、10、5、4、3又は2アミノ酸残基長以下のポリペプチドである。ある具体例において、この薬剤は、少なくとも約20%、40%、60%、80%、90%、95%又は98%の酸性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
この発明の他の面は、アテローム性動脈硬化症の危険にある動物の治療方法である。アテローム性動脈硬化症の危険にある動物を準備する。LBPの構造又は代謝の面を変えることのできる薬剤を準備する。この薬剤をこの動物に治療上有効な量で、この動物の治療が生じるように投与する。
この発明の他の面は、LBPの構造又は代謝に以上を有する細胞を治療する方法である。LBPの構造又は代謝に異常を有する細胞を準備する。LBPの構造又は代謝の面を変えることのできる薬剤を準備する。この薬剤をこの細胞に治療上有効な量で、この細胞の治療が生じるように投与する。
この発明の他の面は、動物におけるアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬組成物であって、治療上有効な量の薬剤(この薬剤は、アテローム性動脈硬化症の治療を生じるようにその動物におけるLBPの代謝又は構造の面を変えることができる)及び製薬上許容し得るキャリアーを含む上記の医薬組成物である。
この発明の他の面は、動物におけるアテローム性動脈硬化症を治療するためのワクチン組成物であって、治療上有効な量の薬剤(この薬剤は、アテローム性動脈硬化症の治療を生じるようにその動物におけるLBPの代謝又は構造の面を変えることができる)及び製薬上許容し得るキャリアーを含む上記のワクチン組成物。
この発明の他の面は、動物におけるアテローム性動脈硬化症病変の診断方法である。一の動物を準備する。LBP例えばLBP−1、LBP−2又はLBP−3に結合し得る標識した薬剤を準備する。この標識した薬剤をこの動物に、標識されたLBPを生じるようにこの標識した薬剤をLBPと相互作用させる条件下で投与する。この標識されたLBPの局在性又は定量化を、イメージングにより、この動物におけるアテローム性動脈硬化症病変の存在を診断するように測定する。
この発明の他の面は、動物を、LBP例えばLBP−1、LBP−2若しくはLBP−3又はこれらの断片若しくはアナログに対して免疫化する方法である。LDLを有する動物を準備する。LBP又はその断片若しくはアナログをこの動物に、このLBP又はその断片若しくはアナログに対するこの動物による抗体産生を刺激するように投与して、LBPのLDLへの結合を変える(例えば、減少させ又は増大させる)。
この発明の他の面は、LBPポリペプチドの断片又はアナログの製造方法である(この断片又はアナログは、ネイティブなLDLに結合する能力及び改変されたLDL例えばメチル化LDL、酸化されたLDL、アセチル化されたLDL又はシクロヘキサンジオン処理したLDLに結合する能力を有する)。LBPポリペプチドを準備する。このLBPポリペプチドの配列を変化させる。この変化させたLBPポリペプチドを改変したLDL及びネイティブなLDLに結合する能力について試験する。
この発明の更に別の面は、LBPをコードするcDNAを単離する方法である。cDNAライブラリーを準備する。このcDNAライブラリーを、ネイティブなLDL及び改変したLDL例えばメチル化LDL又は酸化LDLに結合するポリペプチドをコードするcDNAについてスクリーニングする。このポリペプチドをコードするcDNAを単離する(このcDNAは、LBPをコードする)。
本発明の上記の及びその他の特徴、目的及び利点は、下記の詳細な説明を図面と合わせて読むことにより一層理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
図1は、ウサギのLBP−1のアミノ酸配列(SEQ ID NO:1)を描写している。ウサギとヒトのLBP−1の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。
図2は、ウサギのLBP−2のアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)を描写している。ウサギとヒトのLBP−2の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。
図3は、ウサギのLBP−2のアミノ酸86〜317のアミノ酸配列(SEQ ID NO:3)を描写している。
図4は、ウサギのLBP−2のアミノ酸66〜317のアミノ酸配列(SEQ ID NO:4)を描写している。
図5は、ウサギのLBP−3のアミノ酸配列(SEQ ID NO:5)を描写している。ウサギとヒトのLBP−3の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。
図6は、ヒトのLBP−1のアミノ酸配列(SEQ ID NO:6)を描写している。ウサギとヒトのLBP−1の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。
図7は、ヒトのLBP−2のアミノ酸配列(SEQ ID NO:7)を描写している。ウサギとヒトのLBP−2の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。
図8は、ヒトのLBP−3のアミノ酸配列(SEQ ID NO:8)を描写している。ウサギとヒトのLBP−3の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。
図9は、ヒト又はウサギのLBP−1のアミノ酸14〜33のアミノ酸配列(BHF−1という)(SEQ ID NO:9)を描写している。
図10は、ウサギのLBP−1をコードするcDNA配列(SEQ ID NO:10)及び対応するアミノ酸配列を描写している。ウサギとヒトのLBP−1の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。
図11は、ウサギのLBP−2をコードするcDNA配列(SEQ ID NO:11)及び対応するアミノ酸配列を描写している。ウサギとヒトのLBP−2の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。
図12は、ウサギのLBP−2のcDNA配列256〜1617(SEQ ID NO:12)及び対応するアミノ酸配列を描写している。
図13は、ウサギのLBP−2のcDNA配列196〜1617(SEQ ID NO:13)及び対応するアミノ酸配列を描写している。
図14は、ウサギのLBP−3をコードするcDNA配列(SEQ ID NO:14)及び対応するアミノ酸配列を描写している。ウサギとヒトのLBP−3の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。
図15は、ヒトのLBP−1をコードするcDNA配列(SEQ ID NO:15)及び対応するアミノ酸配列を描写している。ウサギとヒトのLBP−1の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。
図16は、ヒトのLBP−2をコードするcDNA配列(SEQ ID NO:16)及び対応するアミノ酸配列を描写している。ウサギとヒトのLBP−2の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。
図17は、ヒトのLBP−3をコードするcDNA配列(SEQ ID NO:17)及び対応するアミノ酸配列を描写している。ウサギとヒトのLBP−3の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。
図18は、BHF−1をコードするcDNA配列(SEQ ID NO:18)を描写している。
図19は、ヒトのLBP−1のアミノ酸配列(下段の配列)と整列させたウサギのLBP−1のアミノ酸配列(上段の配列)に対応する。
図20は、ヒトのLBP−2のアミノ酸配列(下段の配列)と整列させたウサギのLBP−2のアミノ酸配列(上段の配列)に対応する。
図21は、ヒトのLBP−3のアミノ酸配列(下段の配列)と整列させたウサギのLBP−3のアミノ酸配列(上段の配列)に対応する。
詳細な説明
本発明の面に従って、新規な成熟したヒト及びウサギのポリペプチドLBP−1、LBP−2及びLBP−3並びにこれらの生物学的に活性なアナログ及び断片を提供し、そしてかかるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。LBPは、低密度リポ蛋白質(LDL)結合性蛋白質の略号である。用語ポリヌクレオチド、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、ここでは、交換可能に用い、用語ポリペプチド、蛋白質及びペプチドは、ここでは、交換可能に用いる。
この発明は、図1に示したウサギのLBP−1(SEQ ID NO:1);図2に示したウサギのLBP−2(SEQ ID NO:2);図3に示したウサギのLBP−2の86〜317(SEQ ID NO:3);図4に示したウサギのLBP−2の66〜317(SEQ ID NO:4);図5に示したウサギのLBP−3(SEQ ID NO:5);図6に示したヒトのLBP−1(SEQ ID NO:6);図7に示したヒトのLBP−2(SEQ ID NO:7);図8に示したヒトのLBP−3(SEQ ID NO:8);図9に示したヒト又はウサギのLBP−1の14〜33(BHF−1という)(SEQ ID NO:9)のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド;上記のポリヌクレオチドの何れかとハイブリダイズすることのできる及び少なくとも約80%同一の一層好ましくは少なくとも約90%同一の一層好ましくは少なくとも約95%同一の最も好ましくは少なくとも約98%同一のポリヌクレオチド(コードされるポリペプチドは、LDLに結合することができる);又は上記のポリヌクレオチドの何れかの生物学的に活性な断片(コードされるポリペプチドは、LDLに結合することができる)を提供する。
この発明は又、図7に示したヒトのLBP−2(SEQ ID NO:7)のアミノ酸残基8〜22(SEQ ID NO:19)、8〜33(SEQ ID NO:20)、23〜33(SEQ ID NO:21)又は208〜217(SEQ ID NO:22)を有するポリペプチド;図1(SEQ ID NO:1)及び図6(SEQ ID NO:6)に示したウサギ又はヒトのLBP−1のアミノ酸残基14〜43(SEQ ID NO:23)又は38〜43(SEQ ID NO:24);図2に示したウサギのLBP−2(SEQ ID NO:2)のアミノ酸残基105〜120(SEQ ID NO:25)、105〜132(SEQ ID NO:26)、121〜132(SEQ ID NO:27)又は211〜220(SEQ ID NO:28);図5に示したウサギのLBP−3(SEQ ID NO:5);図8に示したヒトのLBP−3(SEQ ID NO:8)のアミノ酸残基53〜59(SEQ ID NO:41)をコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド;上記のポリヌクレオチドの何れかとハイブリダイズすることができる及び少なくとも約80%同一の一層好ましくは少なくとも約90%同一の一層好ましくは少なくとも約95%同一の最も好ましくは少なくとも約98%同一のポリヌクレオチド(コードされるポリペプチドは、LDLに結合することができる);又は上記のポリヌクレオチドの何れかの生物学的に活性な断片(コードされるポリペプチドは、LDLに結合することができる)をも包含する。
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとは、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド並びに更なるコード配列及び/又は非コード配列を含むポリヌクレオチドを意味する。従って、例えば、図1〜9の成熟ポリペプチド(SEQ ID NO:1〜9)をコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのコード配列のみを含むことができ;成熟ポリペプチドのコード配列と更なるコード配列例えばリーダー配列若しくは分泌用配列又はプロ蛋白質配列を含むことができ;成熟ポリペプチドのコード配列(及び随意に更なるコード配列)及び非コード配列例えばイントロン又は成熟ポリペプチドのコード配列の5’及び/又は3’側の非コード配列を含むことができる。この発明のポリヌクレオチドは又、成熟ポリペプチドのコード配列が、ポリペプチドの発現及び/又は宿主細胞からの分泌を助成するポリヌクレオチド配列例えばリーダー配列と同じリーディングフレームで融合しているポリヌクレオチドを含むことも意味する。これらのポリヌクレオチドは又、コード配列が例えばそのポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列とイン・フレームで融合しているポリヌクレオチドを含むことも意味する。
本発明のポリヌクレオチドは、RNA、DNA又はPNAの形態例えばcRNA、cDNA、ゲノムDNA、又は合成のDNA、RNA若しくはPNAであってよい。このDNAは、二本鎖であっても一本鎖であってもよく、もし一本鎖であれば、コード鎖であっても非コード鎖(アンチセンス鎖)であってもよい。
好適具体例において、このポリヌクレオチドには、図10に示したウサギのLBP−1の核酸(SEQ ID NO:10);図11に示したウサギのLBP−2の核酸(SEQ ID NO:11);図12に示したウサギのLBP−2のヌクレオチド256〜1617(SEQ ID NO:12);図13に示したウサギのLBP−2のヌクレオチド196〜1617(SEQ ID NO:13);図14に示したウサギのLBP−3(SEQ ID NO:14);図15に示したヒトのLBP−1(SEQ ID NO:15);図16に示したヒトのLBP−2(SEQ ID NO:16);図17に示したヒトのLBP−3(SEQ ID NO:17);又は図18に示したウサギのLBP−1のヌクレオチド97〜156又はヒトのLBP−1のヌクレオチド157〜216(BHF−1)が含まれる。
他の好適具体例において、このポリペプチドには、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40又はSEQ ID NO:42に示した核酸が含まれる。
成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図10〜18(SEQ ID NO:10〜18)又はSEQ ID NO:30〜40若しくは42に示したコード配列と同一であってよく、又は、遺伝コードの重複若しくは縮重の結果として、図10〜18(SEQ ID NO:10〜18)又はSEQ ID NO:30〜40及び42のDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であってよい。
この発明は又、上記のポリヌクレオチドを含む組換えベクターをも包含する。このベクターは、例えばプラスミド、ウイルス粒子又はファージであってよい。ある具体例において、この組換えベクターは、発現ベクターである。これらのベクターは又、かかるベクターを含む細胞を同定するのに有用な種々のマーカー遺伝子をも含んでよい。
この発明は又、かかる組換えベクターを含む細胞をも包含する。ここに記載した組換えベクターは、例えばトランスフォーメーション、トランスフェクション又は感染により、宿主細胞に導入することができる。
この発明は又、かかる細胞をLBPの発現を与える条件下で培養することを含むLBPを生成する方法をも包含する。
この発明は又、図1(SEQ ID NO:1);図2(SEQ ID NO:2);図3(SEQ ID NO:3);図4(SEQ ID NO:4);図5(SEQ ID NO:5);図6(SEQ ID NO:6);図7(SEQ ID NO:7);図8(SEQ ID NO:8)若しくは図9(SEQ ID NO:9)に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む単離されたポリペプチド;又は上記のポリペプチドと少なくとも約80%同一の一層好ましくは少なくとも約90%同一の一層好ましくは約95%同一の最も好ましくは約98%同一のポリペプチド(該ポリペプチドは、LDLに結合することができる);又は上記のポリペプチドの何れかの生物学的に活性な断片(この断片は、LDLに結合することができる)をも包含する。ウサギ及びヒトのLBP−1、LBP−2及びLBP−3遺伝子の間のアミノ酸の差異を、これらの図中に太字で描いてある。ウサギ及びヒトのLBP−1、LBP−2及びLBP−3の間のアミノ酸配列の差異も又、図19、20及び21にそれぞれ示してある。
この発明は又、図7(SEQ ID NO:7)に示したアミノ酸残基8〜22(SEQ ID NO:19)、8〜33(SEQ ID NO:20)、23〜33(SEQ ID NO:21)又は208〜217(SEQ ID NO:22)を有するポリペプチドを含む単離されたポリペプチド;図1(SEQ ID NO:1)及び図6(SEQ ID NO:6)に示したアミノ酸残基14〜43(SEQ ID NO:23)若しくは38〜43(SEQ ID NO:24);図2(SEQ ID NO:2)に示したアミノ酸残基105〜120(SEQ ID NO:25)、105〜132(SEQ ID NO:26)、121〜132(SEQ ID NO:27)若しくは211〜220(SEQ ID NO:28);図5(SEQ ID NO:5)に示したアミノ酸残基96〜110(SEQ ID NO:29);図8(SEQ ID NO:8)に示したアミノ酸残基53〜59(SEQ ID NO:41)を有するポリペプチドを含む単離されたポリペプチド;上記のポリペプチドと少なくとも約80%同一の一層好ましくは少なくとも約90%同一の一層好ましくは少なくとも約95%同一の最も好ましくは少なくとも約98%同一のポリペプチド(該ポリペプチドは、LDLに結合することができる);又は上記のポリペプチドの何れかの生物学的に活性な断片(この断片は、LDLに結合することができる)をも包含する。
この発明のポリペプチドは、例えば、天然の精製した生成物、化学合成した生成物及び組換えにより誘導した生成物を包含することを意味する。
これらのポリペプチドを用いて、例えば、LDLに結合することができ、それにより、アテローム性動脈硬化症プラークの形成を阻止することができる。これらのポリペプチドを、例えば、遺伝子治療において、かかるポリペプチドのイン・ビボでの発現により、用いることができる。これらのポリペプチドは又、医薬組成物又はワクチン組成物において用いることもできる。これらのポリペプチドを免疫原として用いて、それらに対する抗体を生成することもでき、更に、それらをLBPポリペプチドに対するアンタゴニストとして用いることもできる。
如何なる理論に縛られるものでもないが、LBPは、アテローム性動脈硬化症がLDLの酸化を通して促進される機構を与えると考えられる。これらのLBPは、集中した不可逆的なLDL結合が動脈壁に起きることが(順序正しく)必要であると考えられ、かかる結合は、LDLがネイティブな状態から完全に酸化された状態に変化するのに必要な時間を与えるので、アテローム性動脈硬化症の決定的な初期事象であると考えられる。酸化されたネイティブでないLDLは外来蛋白質であるので、マクロファージがそれを摂食して、最初は、I型病変の泡沫細胞となり、その後、II型病変の脂肪性の縞を形成する。
この発明は又、動物がアテローム性動脈硬化症の危険にあるかどうかを測定する方法を包含する。一の動物を準備する。LBPの代謝及び構造の面をこの動物において評価する。LBPの代謝又は構造の面における異常は、アテローム性動脈硬化症の危険にあるという診断となる。
アテローム性動脈硬化症とは、LDLの不可逆的結合、LDLの酸化、マクロファージの動員、動脈の閉塞及び組織の死(梗塞)を含む無知覚で相互に混合する幾つかのステージを含む病気又は症状を意味する。
動物とは、ヒト並びに非ヒト動物を意味する。非ヒト動物には、例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類及び原生動物が含まれる。好ましくは、非ヒト動物は、哺乳動物例えばウサギ、ゲッ歯類例えばマウス、ラット若しくはモルモット、霊長類例えばサル、又はブタである。動物には、非ヒトトランスジェニック動物も含まれる。用語トランスジェニック動物は、外来DNA(即ち、部分的に又は全体的に異質のDNA)のその動物のDNA中への導入により;又は、損傷例えばイン・ビトロで導入された突然変異例えば欠失若しくは他の染色体の再配置のその細胞のDNA中への導入により;又は、相同なDNAのその細胞のDNA中への、該相同なDNAが挿入された細胞のゲノムが変化する(例えば、それを、天然の遺伝子と異なる位置に挿入し又はその挿入が相同な宿主遺伝子のノックアウト若しくは置換を生じるか又はその遺伝子の変化した及び/若しくは調節可能な発現若しくは/又は代謝を生じる)ような仕方での導入により新たな遺伝情報を得た動物を包含することを意味する。この動物は、生殖系列細胞を含むその細胞のすべてにトランスジーンを含むことができる。この発明のトランスジェニック動物は、アテローム性動脈硬化症の研究用の又はアテローム性動脈硬化症の治療剤を評価するためのモデルとして役立ち得る。
ある具体例において、アテローム性動脈硬化症の危険にあることについての測定は、胎児動物において行う。
LBPとは、LDL及びメチル化LDLに結合することのできる低密度リポ蛋白質(LDL)結合性蛋白質を意味する。メチル化LDLとは、LDLのリジン残基の約50〜90%が化学的に結合させたメチル基を有することを意味する。メチル化LDLは、前に報告された細胞表面レセプターによっては認識されない。例えば、Weisgraber等J.Biol.Chem.253:9053-9062(1978)を参照されたい。ある具体例において、LBPは又、酸化されたLDLに結合することもできる。ある好適な具体例において、LDLのLBPへの結合は、不可逆である。ある好適な具体例において、LBPは、LDLを何れの細胞内コンパートメントへも輸送しない。LBPの例は、ここに記載したLBP−1、LBP−2及びLBP−3である。
LBPの代謝とは、LBPの産生、放出、発現、機能、作用、相互作用又は調節の何れかを意味する。LBPの代謝には、LBPポリペプチドの修飾例えば共有結合による修飾又は非共有結合による修飾が含まれる。LBPの代謝には、LBPが他の物質において誘導するLBPポリペプチドの修飾例えば共有結合による修飾又は非共有結合による修飾が含まれる。LBPの代謝には又、LBPポリペプチドの分布の変化、及びLBPが他の物質の分布において誘導する変化も含まれる。
LBP代謝の任意の面を評価することができる。用いる方法は、当業者に公知の標準的技術であり、標準的参考文献例えば、Ausubel等編、Current Protocols in Mol.Biology,New York:John Wiley & Sons,1990;-Kriegler,M.編、Gene Transfer and Expression,Stockton Press,New York,ニューヨーク、1989;pDisplay gene expression system(Invitrogen,Carlsbad,カリフォルニア)中に見出すことができる。評価することのできるLBP代謝の好適な例には、LBPポリペプチドの結合性分子例えばLDLに対する結合活性;LBPポリペプチドの標的遺伝子に対するトランス活性化活性;LBP蛋白質のレベル;LBPmRNAのレベル;LBP修飾例えばリン酸化、グリコシル化若しくはアシル化のレベル;又はトランスフェクトされた哺乳動物細胞のLDLの結合に対するLBP発現の効果が含まれる。
結合性分子とは、LBPが結合することのできる任意の分子例えば核酸例えばDNA調節領域、蛋白質例えばLDL、代謝産物、ペプチド模倣物、非ペプチド模倣物、抗体又は任意の他の型のリガンドを意味する。ある好適具体例においては、評価するLBP代謝の面は、LBPのネイティブなLDL及び/又はメチル化LDL及び/又は酸化LDLに結合する能力である。LDLへの結合は、例えば、LDLに対する抗体、アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティー同時電気泳動(ACE)アッセイ、又はELISAアッセイにより示すことができる。実施例を参照されたい。他の具体例において、それは、LBPの評価される動脈の細胞外マトリクス構造の成分に結合する能力である。かかる成分の例には、プロテオグリカン例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカン及びヘパリン硫酸プロテオグリカン;コラーゲン;フィブロネクチン;ビトロネクチン;インテグリン;及び関連する細胞外マトリクス分子が含まれる。動脈の細胞外マトリクス構造の成分に対する結合は、当業者に公知の標準的方法により例えばELISAアッセイにより示すことができる。次いで、LBPに対する一次抗体を加え、その後、一次抗体に対する酵素結合した二次抗体を加え、それは、適当な基質の存在下で安定な色を生じ、プレート上での色の発生をミクロ滴定プレートリーダーにて測定する。
LBPによる標的遺伝子のトランス活性化を、例えば、一過性トランスフェクションアッセイにおいて測定することができる(該アッセイでは、標的遺伝子のプロモーターをレポーター遺伝子例えばβ−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼとリンクさせ、LBP発現ベクターを同時トランスフェクトする)。かかる評価をイン・ビトロ又はイン・ビボで行うことができる。LBP蛋白質、mRNA又はリン酸化のレベルは、例えば試料において、例えば組織試料(例えば、動脈壁)において、当業者に公知の標準的方法によって測定することができる。
ある具体例において、LBPの構造の面例えばLBP遺伝子の構造又はLBP蛋白質の構造を評価する。例えば、一次、二次又は三次構造を評価することができる。例えば、この遺伝子のDNA配列を決定し及び/又はこの蛋白質のアミノ酸配列を決定する。標準的なクローニング方法及び配列決定法を、当業者に知られているように用いることができる。ある具体例においては、アンチセンス核酸が通常特異的に結合する標的mRNA又はDNA配列の存在又は不在を検出するために、アンチセンス核酸の細胞性LBPのmRNA及び/又はゲノムDNAとの結合活性を、当業者に公知の標準的方法を用いて測定する。
測定されるアテローム性動脈硬化症の危険は、正常の動物と比較して、減じた危険又は増大した危険であり得る。例えば、減じた危険を与えるであろう異常は、不活性なLBPポリペプチドである。増大した危険を与えるであろう異常は、例えば、ネイティブなLBPポリペプチドより一層高い活性(例えば、LDL結合活性)を有するLBPポリペプチドである。
この発明は又、アテローム性動脈硬化症の治療において用いる薬剤を評価する方法をも包含する。試験細胞、無細胞系又は動物を準備する。一の薬剤を準備する。この薬剤をこの試験細胞、無細胞系又は動物に治療上有効な量で投与する。この薬剤のLBPの代謝又は構造の面に対する効果を評価する。LBPの代謝又は構造の面の変化は、アテローム性動脈硬化症の治療における薬剤の有用性を示している。
ある具体例においては、この方法は、アテローム性動脈硬化症の治療で使用するための薬剤を評価するために2つのフェーズ(初期のイン・ビトロフェーズ及びその後のイン・ビボフェーズ)を用いる。この薬剤を、イン・ビトロで、試験細胞又は無細胞系に投与し、LBPの代謝の面に変化が起きれば、次いで、その薬剤を更に試験動物に治療上有効な量で投与して、LBPの代謝の面に対するその薬剤の効果をイン・ビボで評価する。
細胞とは、細胞若しくは細胞の群又は動物の部分である細胞を意味する。この細胞は、ヒトの細胞又は非ヒト細胞であってよい。細胞は又、トランスジェニック細胞をも包含する。この細胞は、例えば培養から又は動物から得ることができる。動物は、例えば天然の動物及びトランスジェニックの非ヒト動物を包含することを意味する。ある具体例においては、このトランスジェニック細胞又は非ヒトトランスジェニック動物は、LBPトランスジーン又はその断片若しくはアナログを有する。ある具体例においては、トランスジェニック細胞又は非ヒトトランスジェニック動物は、LBP遺伝子についてのノックアウトを有する。
この試験細胞、無細胞系又は動物は、LBP代謝の野生型パターン又は非野生型パターンを有してよい。LBP代謝の非野生型パターンは、例えば、過少発現、過剰発現、非発現又は時間的な、部位による若しくは分布の変化から生じ得る。かかる非野生型パターンは、例えば、LBP遺伝子、結合性分子の遺伝子、調節遺伝子、又は直接若しくは間接にLBP代謝に影響する他の何れかの遺伝子における1つ以上の突然変異から生じ得る。突然変異は、例えば、核酸における大きい又は微細な構造の変化を包含することを意味する。例は、単一塩基対の変化例えばミスセンス若しくはナンセンス変異、フレームシフト、欠失、挿入及び転座を包含する。突然変異は、優性であっても劣性であってもよい。突然変異は、ホモ接合であってもヘテロ接合であってもよい。好ましくは、LBP−1、LBP−2又はLBP−3の代謝の面を評価する。
薬剤は、例えば任意の物質例えば抗アテローム性動脈硬化症薬剤を包含することを意味する。この発明の薬剤は、好ましくは、LBP代謝の面を変化させることができる。かかる変化は、多様な事象(LBPと結合性分子例えばLDL又は動脈の細胞外マトリクス成分との間の防止的又は減少的相互作用;LBP及び/又は結合性分子の例えば開裂又は他の改変による不活性化;LBP及び/又は結合性分子の希釈;LBP及び/又は結合性分子の発現の防止;LBP及び/又は結合性分子の合成の減少;異常なLBP及び/又は結合性分子の合成;選択的スプライスされたLBP及び/又は結合性分子の合成;LBP及び/又は結合性分子の適当なコンホメーションでの折り畳みの防止又は減少;LBP及び/又は結合性分子の結合特性の調節;LBP及び/又は結合性分子の活性化又は不活性化に必要なシグナルの妨害;LBP及び/又は結合性分子の結合を防止するような仕方での活性化又は不活性化;又はLBP及び/又は結合性分子の正常な合成又はこれらの正常な機能に必要な他のレセプター、リガンド又は分子を妨害すること)の何れかの結果であってよい。例えば、この薬剤は、動脈壁の細胞外マトリクスに集中的に発現されるLBPに対するLDL上の結合部位をブロックすることができるか、又はそれは、LDLに対するLBP上の結合部位をブロックすることができ、又はそれは、二官能性であり得よう(即ち、それは、両結合部位をブロックすることができよう)。
薬剤の例には、LBPポリペプチド例えばLBP−1、LBP−2若しくはLBP−3又は生物学的に活性なその断片若しくはアナログ;LBPポリペプチド又は生物学的に活性なその断片若しくはそのアナログをコードする核酸;LBP調節配列又は生物学的に活性なその断片若しくはアナログをコードする核酸;LBPポリペプチドに対する結合性分子;LBP核酸に対する結合性分子(LBP核酸は、例えば、LBPの調節領域を含む核酸又はLBP若しくは生物学的に活性なその断片の構造領域を含む核酸である);アンチセンス核酸;LBP又は結合性分子の模倣物;LBP又は結合性分子に対する抗体;代謝産物;又は阻害性炭水化物若しくは糖蛋白質が含まれる。ある具体例においては、この薬剤は、アンタゴニスト、アゴニスト又はスーパーアゴニストである。
LBPの配列の存在の知識は、アテローム性動脈硬化症の治療においてLDLレベルを調節するための天然の又は人工のリガンドの検索を可能にする。ある具体例において、この薬剤は、LBPに対する天然のリガンドである。ある具体例において、この薬剤は、LBPに対する人工のリガンドである。
アナログとは、アミノ酸配列又は配列に関係しない他の点において、又はこれらの両方において天然のLBPと異なる化合物を意味する。この発明のアナログは、一般に、天然のLBP配列の完全な配列と、好ましくは約100アミノ酸残基のセグメントと、一層好ましくは約50アミノ酸残基のセグメントと、更に一層好ましくは約30アミノ酸残基のセグメントと、更に一層好ましくは約20アミノ酸残基のセグメントと、更に一層好ましくは約10アミノ酸残基のセグメントと、更に一層好ましくは約5アミノ酸残基のセグメントと、更に一層好ましくは約4アミノ酸残基のセグメントと、更に一層好ましくは約3アミノ酸残基のセグメントと、最も好ましくは約2アミノ酸残基のセグメントと、実質的に少なくと約80%相同性を、好ましくは少なくとも約90%相同性を、一層好ましくは少なくとも約95%相同性を、最も好ましくは少なくとも約98%相同性を示す。非配列性改変には、例えば、LBPのイン・ビボ又はイン・ビトロでの化学的誘導体化が含まれる。非配列性改変には、例えば、リン酸化、アセチル化、メチル化、カルボキシル化、又はグリコシル化における変化が含まれる。かかる改変を行う方法は、当業者に公知である。例えば、リン酸化は、LBPをリン酸化を変える酵素例えばキナーゼ又はホスファターゼに曝すことにより改変することができる。
好適なアナログには、その配列が、少なくとも一の保存的アミノ酸置換により又は少なくとも一の非保存的アミノ酸置換、欠失若しくは挿入(これらは、LBPの生物学的活性を完全には破壊しない)により野生型の配列と異なるLBP又は生物学的に活性なその断片が含まれる。保存的置換は、典型的には、一のアミノ酸の他の類似の特性を有するアミノ酸での置換、例えば次のグループ内での置換を包含する:バリン、グリシン;グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸;アスパラギン、グルタミン;セリン、スレオニン;リジン、アルギニン;及びフェニルアラニン、チロシン。保存的置換の他の例を表1に示す。
蛋白質のアミノ酸配列変異物は、当業者に公知の様々な方法の何れかによって製造することができる。例えば、蛋白質又は蛋白質の特定のドメイン若しくは領域をコードするDNAのランダム突然変異、例えば、PCR突然変異誘発(例えば、減じたTaqポリメラーゼ忠実度を利用してランダムな突然変異をクローン化したDNA断片中に導入する;Leung等BioTechnique 1:11-15(1989))、又は飽和突然変異誘発(例えば、一本鎖DNAのイン・ビトロでの化学処理又は照射により、及び相補的DNA鎖の合成による;Mayers等Science 229:242(1985))を利用することができる。ランダム突然変異誘発は又、縮重オリゴヌクレオチド生成によっても達成することができる(例えば、縮重配列を化学合成するための自動化DNAシンセサイザーを用いる;Narang,Tetrahedron 39:3(1983);Itakura等Recombinant DNA,Proc.3rd Cleveland Sympos.Macromolecules,A.G.Walton編Amsterdam:Elsevicr,p.273-289(1981))。ランダムでない又は位置指定の突然変異誘発を用いて特異的配列又は特異的領域内の突然変異を与えることができる。これらの技術を用いて、例えば、蛋白質の公知のアミノ酸配列の残基の欠失、挿入又は置換を含む変異物を造ることができる。突然変異のための部位を、例えば、(i)先ず保存的アミノ酸で置換し、次いで、達成された結果に依っては一層過激な選択物で置換することにより、(ii)標的残基を削除することにより、(iii)同じ又は異なるクラスの残基を指定部位に隣接して挿入することにより、又は(iv)上記の組合せにより、個々に又は連続的に改変することができる。例えば、アナログを、図10〜18の配列(SEQ ID NO:10〜18)のイン・ビトロDNA配列改変により作製することができる。例えば、イン・ビトロ突然変異誘発を用いて、これらのDNA配列の何れかをアナログをコードする配列に変換することができる(該アナログにおいては、少なくとも一のアミノ酸残基が、置換例えば表1に記載したような保存的置換を受けている)。
望ましい突然変異を同定する方法には、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発(Cunningham及びWells,Science 244:1081-1085(1989))、オリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘発(Adelman等DNA 2:183(1983));カセット突然変異誘発(Wells等Gene 34:315(1985))、組合せ突然変異誘発、及びファージディスプレーライブラリー(Ladner等、PCT国際出願No.WO88/06630号)が含まれる。これらのLBPアナログを、例えば、それらのLDLに結合する能力及び/又は動脈細胞外マトリクス成分に結合する能力について、ここに記載したように試験することができる。
この発明の範囲内の他のアナログには、ペプチドの安定性を増大させる改変を有するものが含まれる。かかるアナログは、ペプチド配列中に1つ以上の非ペプチド結合(ペプチド結合に取って代わったもの)を含んでよい。例えば、天然のL−アミノ酸以外の残基例えばD−アミノ酸又は非天然若しくは合成のアミノ酸例えばβ若しくはγアミノ酸を含むアナログ;及び環状アナログも又、包含される。
アナログは又、ペプチドを加水分解されないようにするために、構造的改変がペプチド主鎖に導入されたペプチドを含むことも意味する。かかるペプチドは、消化されないので、経口投与に特に有用である。ペプチド主鎖の改変には、例えば、アミド窒素、α−炭素、アミドカルボニル又はアミド結合の改変及び伸長、欠失又は主鎖の架橋を含む改変が含まれる。例えば、主鎖を、カルボニルのスルホキシドでの置換により、ペプチド結合を逆にすることにより、又はカルボニル基をメチレンで置換することにより改変することができる。かかる改変は、当業者に公知の標準的手順によって作製することができる。例えば、Spatola,A.F.「Peptide Backbone Modifications:A Structure-Activity Analysis of Peptides Containing Amide Bond Surrogates,Conformational Constraints,and Related Backbone Replacements」{Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides and Proteins,Vol.7,p.267-357,B.Weinstein(編),Marcel Dekker,Inc.New York(1983)}を参照されたい。
アナログは又、少なくとも一のアミノ酸残基が置換基を含むポリペプチド又は他の化合物(例えば、ポリペプチドの半減期を増大させる化合物、例えばポリエチレングリコール)と融合したポリペプチドを含むことも意味する。
断片とは、天然のLBPポリペプチドの幾らかの部分を意味する。好ましくは、この断片は、少なくとも約100アミノ酸残基、一層好ましくは少なくとも約50アミノ酸残基、更に一層好ましくは少なくとも約30アミノ酸残基、更に一層好ましくは少なくとも約20アミノ酸残基、更に一層好ましくは少なくとも約5アミノ酸残基、更に一層好ましくは少なくとも約4アミノ酸残基、更に一層好ましくは少なくとも約3アミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも約2アミノ酸残基長である。断片には、例えば、切りつめられた分泌型、蛋白質分解断片、スプライシング断片、その他の断片、及び関連遺伝子例えばLBP−1、LBP−2又はLBP−3の少なくとも一部分と他の分子との間の化学的構築物が含まれる。LBPの断片は、当業者に公知の方法により生成することができる。ある具体例においては、この断片は、生物学的に活性である。候補の断片のLBPの生物学的活性を示す能力を、当業者に公知の方法によってアッセイすることができる。例えば、LBP断片を、LDL及び/又は動脈細胞外マトリクス構造成分に結合するそれらの能力について試験することができる。断片の生物学的活性に必要でない残基を含むLBP断片又は選択的mRNAスプライシング若しくは選択的蛋白質プロセッシング事象から生じるLBP断片も又包含される。
蛋白質の断片は、当業者に公知の様々な方法の何れかによって、例えば、組換えにより、蛋白質分解消化により又は化学合成により、製造することができる。ポリペプチドの内部断片又は末端断片を、そのポリペプチドをコードする核酸の一方の末端(末端断片を作る場合)又は両端(内部断片を作る場合)から一つ以上のヌクレオチドを除去することにより生成することができる。この変異されたDNAの発現は、ポリペプチド断片を生成する。従って、「末端をかじり取る」エンドヌクレアーゼでの消化は、一連の断片をコードするDNAを生成することがでえきる。蛋白質の断片をコードするDNAは又、例えば、ランダム剪断、制限消化又は上記の方法の組合せによっても生成することができる。例えば、LBPの断片は、所望の断片をコードするようにイン・ビトロで(例えば、図10〜18のDNA配列(SEQ ID NO:10〜18)の何れかの制限消化により)操作したLBP DNAを発現させることにより作成することができる。
断片は又、当分野で公知の技術例えば慣用のMerrifield固相f−Moc又はt−Boc化学を用いて、化学合成することもできる。例えば、本発明のペプチドは、重複を有しない又は重複を有する所望の長さの断片に任意に分割することができる。
LBP又はその生物学的に活性な断片若しくはアナログ、又は結合性分子又はその生物学的に活性な断片若しくはアナログは、例えば、同起源の分子と、相補性分子上の結合部位について競争し、それにより、LBPと細胞性の結合性分子との結合を減じ又は排除する。LBP又は結合性分子は、例えば、天然のLBP若しくは結合性分子の精製若しくは分泌により、組換えLBP若しくは結合性分子から、又は合成のLBP若しくは結合性分子から得ることができる。
それ故、アナログ又は断片を生成する方法及びそれらを活性について試験する方法は、当業者に公知である。
薬剤は、アンチセンス分子として用いる核酸であってもよい。アンチセンス療法は、例えば、コードされた蛋白質の発現を例えば転写及び/又は翻訳を阻止することによって阻止するために、細胞条件下で、LBPポリペプチド又はその変異物をコードする細胞性mRNA及び/又はゲノムDNAと特異的にハイブリダイズする(例えば、結合する)オリゴヌクレオチド又はそれらの誘導体の投与又はその場(in・situ)での生成を包含することを意味する。この結合は、慣用の塩基対相補性によるか、又は、例えば、二本鎖DNAへの結合の場合には、二重らせんの大きい溝における特異的相互作用によるものであってよい。
ある具体例においては、アンチセンス構築物は、天然のLBP遺伝子の配列(例えば、その遺伝子の発現に関与する)に結合する。これらの配列には、例えば、プロモーター、開始コドン、停止コドン及びRNAポリメラーゼ結合部位が含まれる。
他の具体例において、このアンチセンス構築物は、野生型遺伝子中に存在しないヌクレオチド配列に結合する。例えば、このアンチセンス構築物は、外因性の非野生型配列の挿入を含有するLBP遺伝子の領域に結合することができる。或は、このアンチセンス構築物は、欠失を受けたLBP遺伝子の領域に結合し、それにより、自然には一緒に位置することのないその遺伝子の2つの領域を一緒にして、非野生型配列を造ることができる。イン・ビボで患者に投与する場合、非野生型配列に結合するアンチセンス構築物は、何れの野生型LBP遺伝子の発現も阻止せずに変異型LBP遺伝子の発現を阻止する利点を提供する。
本発明のアンチセンス構築物は、細胞中で転写されたときに、LBPポリペプチドをコードする細胞性mRNAの少なくとも一のユニークな部分に相補的なRNAを生成する発現プラスミドとして送達することができる。別法は、アンチセンス構築物が、エキス・ビボで生成され、細胞に導入されたときにLBP遺伝子のmRNA(二本鎖形成)及び/又はゲノム配列(三重鎖形成)とハイブリダイズすることにより発現の阻止を引き起こすオリゴヌクレオチドであることである。かかるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、内因性のヌクレアーゼ例えばエキソヌクレアーゼ及び/又はエンドヌクレアーゼに抵抗性であり、それ故、イン・ビボで安定である改変されたオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての使用のための典型的な核酸分子は、DNAのホスホルアミデート、ホスホチオエート、ホスホロジチオエート及びメチルホスホネートアナログ及びペプチド核酸(PNA)である(米国特許第5,176,996号;5,264,564号及び5,256,775号も参照されたい)。更に、アンチセンス療法において有用なオリゴマーを構築する一般的アプローチは、総説されている(例えば、Van der Krol等Biotechniques 6:958-976(1988);Stein等Cancer Res.48:2659-2668(1988)を参照されたい)。
模倣物とは、形状及び/又は電荷分布においてLBP又は結合性分子に類似している分子を意味する。この模倣物は、ペプチド又は非ペプチドであってよい。模倣物は、例えば、LBPの結合性分子への結合を競争的に阻止することができるので、治療剤として作用することができる。結合性分子への結合に関与する特定のLBPポリペプチドのアミノ酸残基をマップするために、例えばスキャニング突然変異誘発、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、リンカースキャニング突然変異誘発又は飽和突然変異誘発を用いることにより、結合性分子への結合においてそれらの残基を真似し、それ故、LBPの結合性分子への結合を阻止し、それにより、LBPの機能を妨害するペプチド模倣物例えばジアゼピン又はイソキノリン誘導体を生成することができる。かかる残基の加水分解可能でないペプチドアナログは、例えば、ベンゾジアゼピン(例えば、Freidinger等{Peptides:Chemistry and Biology,G.R.Marshall編,ESCOM出版:Leiden,オランダ(1988)}参照);アゼピン(例えば、Huffman等{Peptides:Chemistry and Biology,G.R.Marshall編,ESCOM出版:Leiden,オランダ(1988)}参照);置換されたガンマラクタム環(例えば、Garvey等{Peptides:Chemistry and Biology,G.R.Marshall編,ESCOM出版:Leiden,オランダ(1988)}参照);ケト−メチレンシュードペプチド(例えば、Ewenson等J.Med.Chem.29:295(1986);Ewnson等{Peptieds:Structure and Function(Proceedings of 9th American Peptide Symposium)Pierce Chemical Co.Rockland,IL(1985)参照);β−ターンジペプチドコア(例えば、Nagai等Tetrahedron Lett.26:647(1985);Sato等J.Chem.Soc.Perkin Trans.1:1231(1986)参照);又はβ−アミノアルコール(例えば、Gordon等Biochem.Biophys.Res.Commun.126:419(1985);Dann等Biochem.Biophys.Res.Commun.134:71(1986)参照)を用いて生成することができる。
抗体は、直接又は間接にLBP代謝に影響を及ぼす任意の部分に対する抗体を包含することを意味する。これらの抗体は、例えばLBP又は結合性分子に対する抗体であっても、それらのサブユニット又は断片に対する抗体であってもよい。例えば、抗体には、抗LBP−1、LBP−2又はLBP−3抗体;及び抗結合性分子抗体が含まれる。抗体断片は、例えば、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、F(v)断片、重鎖モノマー、重鎖ダイマー、重鎖トリマー、軽鎖モノマー、軽鎖ダイマー、軽鎖トリマー、一の重鎖と一の軽鎖とからなるダイマー、及び抗LBP又は抗結合性分子抗体の活性を真似るペプチドを包含することを意味する。例えば、阻害性抗体のFab’2断片は、例えば、酵素的開裂によって生成することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方をこの発明において用いることができる。好ましくは、モノクローナル抗体を用いる。天然の抗体、組換え抗体又はキメラ抗体例えばヒト化抗体は、この発明に含まれる。好ましくは、患者がヒトの場合には、ヒト化抗体を用いる。最も好ましくは、これらの抗体は、ヒトの抗体に由来する定常領域及び阻害性のマウスモノクローナル抗体由来の可変領域を有する。LBPに対するポリクローナル抗体の製造を、実施例6に記載する。モノクローナルのヒト化抗体は、当業者に公知の標準的方法によって生成される。モノクローナル抗体は、例えば、連続的細胞株培養により産生される抗体を与える任意の技術により製造することができる。例には、ハイブリドーマ技術(Kohler及びMilstein,Nature 256:495-497(1975))、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor等Immunology Today 4:72(1983))、及びヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBVハイブリドーマ技術(Cole等{Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,A.R.Liss,Inc.,p.77-96(1985)})が含まれる。好ましくは、ヒト化抗体を慣用の製造及び採集技術によって高める(Berkower,I.,Curr.Opin.Biotechnol.7:622-628(1996);Ramharayan及びSkaletsky,Am.Biotechnol.Lab 13:26-28(1995))。ある好適な具体例において、これらの抗体を、LBPに対して、好ましくはLDL結合部位及び製造したFab断片に対して高める。これらの抗体又はそれらから誘導した断片を用いて、例えば、LBP分子上のLDL結合部位をブロックすることができる。
薬剤には、LBP及び/又は結合性分子の合成、翻訳後修飾に若しくは機能に必要とされる分子のインヒビター又は、LBP及び/又は結合性分子の合成又は機能を阻害する分子のアクチベーターをも包含される。薬剤には、例えば、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ホルモン、シグナリング成分、キナーゼ、ホスファターゼ、ホメオボックス蛋白質、転写因子、編集因子、翻訳因子及び翻訳後因子又は酵素が含まれる。薬剤は又、LBP及び/又は結合性分子を少なくとも部分的に不活性化し又は破壊する電離放射線、非電離放射線、超音波及び毒性薬剤をも包含することを意味する。
すべての薬剤は又、完全にLBP特異的ではない薬剤をも包含することを意味する。例えば、薬剤は、動脈のプラーク形成に関係する他の遺伝子又は蛋白質を変化させることができる。かかる重複する特異性は、更なる治療上の利点を提供することができる。
この発明は又、アテローム性動脈硬化症の治療に有用であると同定された薬剤をも包含する。
この発明は又、薬剤を、LBPポリペプチドの結合性分子との結合を変化させる能力について評価する方法をも包含する。一の薬剤を準備する。LBPポリペプチドを準備する。結合性分子を準備する。これらの薬剤、LBPポリペプチド及び結合性分子を合わせる。これらのLBPポリペプチド及び結合性分子を含む複合体の形成を検出する。この薬剤の不在時と比較して該剤の存在下での複合体の形成における変化は、この薬剤がLBPポリペプチドの結合性分子への結合を変化させることを示している。
好適具体例において、LBPポリペプチドは、LBP−1、LBP−2又はLBP−3である。結合性分子の例には、ネイティブなLDL、改変されたLDL例えばメチル化LDL又は酸化LDL、及び動脈細胞外マトリクス構造成分が含まれる。
この結合の変化には、例えば結合の阻止又は促進が含まれる。この薬剤の効力を、例えば、種々の濃度の薬剤を用いて得られたデータから投与量応答曲線を生成することにより査定することができる。複合体の形成を測定する方法は、標準的であり当業者に公知である(例えば、アフィニティー同時電気泳動(ACE)アッセイ又はELISAアッセイ(本明細書中に記載してある))。
この発明は又、LBPポリペプチドの結合性分子への結合を変化させ得ると同定された薬剤をも包含する。
この発明は又、薬剤を、LBPポリペプチドに結合する能力について評価する方法をも包含する。一の薬剤を準備する。LBPポリペプチドを準備する。この薬剤をLBPポリペプチドと接触させる。この薬剤のLBPポリペプチドに結合する能力を評価する。好ましくは、LBPポリペプチドは、LBP−1、LBP−2又はLBP−3である。結合は、例えば、アフィニティー同時電気泳動(ACE)アッセイ又はELISAアッセイ(本明細書中に記載してある)等の当業者に公知の標準的な方法によって複合体の形成を測定することにより測定することができる。
この発明は又、LBPポリペプチドに結合し得ると同定された薬剤をも包含する。
この発明は又、薬剤を、LBP調節配列をコードする核酸に結合する能力について評価する方法をも包含する。一の薬剤を準備する。LBP調節配列をコードする核酸を準備する。この薬剤をこの核酸と接触させる。この薬剤のこの核酸に結合する能力を評価する。好ましくは、LBP調節配列は、LBP−1、LBP−2又はLBP−3調節配列である。結合は、例えば、当業者に公知の標準的な方法例えばDNA移動度シフトアッセイ、DNアーゼIフットプリント分析(Ausubel等編Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,NY,(1989))によって複合体の形成を測定することにより測定することができる。
この発明は又、LBP調節配列をコードする核酸に結合することができると同定された薬剤をも包含する。
この発明は又、動物におけるアテローム性動脈硬化症の治療方法をも包含する。アテローム性動脈硬化症の治療を要する動物を準備する。LBPの構造又は代謝の面を変えることのできる薬剤を準備する。この薬剤を、この動物に、治療上有効な量で、アテローム性動脈硬化症の治療を生じるように投与する。
ある好適具体例において、この薬剤は、LBPポリペプチド例えばLBP−1、LBP−2若しくはLBP−3又は生物学的に活性なそれらの断片若しくはアナログである。この薬剤は、例えば、SEQ ID NO:1〜9に示したポリペプチドであってよい。好ましくは、この薬剤は、約100アミノ酸残基長以下の、一層好ましくは約50アミノ酸残基長以下の、更に一層好ましくは約30アミノ酸残基長以下の、更に一層好ましくは約20アミノ酸残基長以下の、更に一層好ましくは約5アミノ酸残基長以下の、更に一層好ましくは約4アミノ酸残基長以下の、更に一層好ましくは約3アミノ酸残基長以下の、最も好ましくは約2アミノ酸残基長以下のポリペプチドである。好ましくは、このポリペプチドは、少なくとも約20%の酸性アミノ酸残基を、一層好ましくは少なくとも約40%の酸性アミノ酸残基を、更に一層好ましくは少なくとも約60%の酸性アミノ酸残基を、更に一層好ましくは少なくとも約80%の酸性アミノ酸残基を、更に一層好ましくは少なくとも約90%の酸性アミノ酸残基を、更に一層好ましくは少なくとも約95%の酸性アミノ酸残基を、最も好ましくは少なくとも約98%の酸性アミノ酸残基を含む。酸性アミノ酸残基には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。かかるLBPポリペプチドの例は、アミノ酸残基14〜33を含むヒト又はウサギのLBP−1の20アミノ酸長の断片であるBHF−1である。図9(SEQ ID NO:9)を参照されたい。BHF−1のアミノ酸残基の45%は、酸性である。この発明は又、BHF−1の生物学的に活性な断片及びアナログをも包含する。
他の好適なLBPからの酸性領域は、図7に描いたヒトのLBP−2(SEQ ID NO:7)のアミノ酸残基8〜22(SEQ ID NO:19)、8〜33(SEQ ID NO:20)、23〜33(SEQ ID NO:21)及び208〜217(SEQ ID NO:22);図1(SEQ ID NO:1)及び図6(SEQ ID NO:6)に描いたウサギ又はヒトのLBP−1のアミノ酸残基14〜43(SEQ ID NO:23)及び38〜43(SEQ ID NO:24);図2(SEQ ID NO:2)に描いたウサギのLBP−2のアミノ酸残基105〜120(SEQ ID NO:25)、105〜132(SEQ ID NO:26)、121〜132(SEQ ID NO:27)及び211〜220(SEQ ID NO:28);図5に描いたウサギのLBP−3(SEQ ID NO:5)のアミノ酸残基96〜110(SEQ ID NO:29);及び図8に描いたヒトのLBP−3(SEQ ID NO:8)のアミノ酸残基53〜59(SEQ ID NO:41)である。この発明は又、これらのポリペプチドの何れかの生物学的に活性な断片又はアナログをも包含することを意味する。
薬剤の他の例には、任意のアミノ酸又はアミノ酸アナログのホモポリマー又はヘテロポリマーが含まれる。ある好適具体例において、この薬剤は、酸性アミノ酸又はそのアナログのホモポリマーである。ある具体例において、この薬剤は、一種以上の酸性アミノ酸と一種以上の他のアミノ酸との又はこれらのアナログのヘテロポリマーである。例えば、薬剤には、ポリ(glu)、ポリ(asp)、ポリ(glu asp)、ポリ(glu N)、ポリ(asp N)及びポリ(glu asp N)が含まれる。Nとは、glu又はasp以外の任意のアミノ酸又はそのアナログを意味する。ポリ(glu asp)とは、所定の長さのペプチドについてのgluとaspのすべての順列を意味する。好適なペプチドは、約10アミノ酸長以下の、好ましくは約7アミノ酸長以下のポリ(glu)である。
ある好適具体例において、この薬剤は、LBP核酸又は生物学的に活性なその断片若しくはアナログ(例えば、LBP−1、LBP−2若しくはLBP−3ポリペプチドをコードする核酸又はその生物学的に活性な断片若しくはアナログ)である。この薬剤は、例えば、SEQ ID NO:10〜18に示したヌクレオチド配列を含む核酸であってよい。他の具体例において、この薬剤は、アンチセンス分子例えばLBP遺伝子配列に結合することのできるものである。
治療は、例えば、アテローム性動脈硬化症の徴候を予防し、治療し、減じ、又は該動脈硬化症を癒すことを包含することを意味する。この薬剤の投与は、この薬剤を標的細胞に到達させる任意の方法によって達成することができる。これらの方法には、例えば、注射、付着、移植、坐薬、経口摂取、吸入法、局所投与、又はこの薬剤の標的細胞への到来が得られる任意の他の投与が含まれる。注射は、例えば、静脈注射、皮内注射、皮下注射、筋肉注射又は腹腔内注射であってよい。移植は、移植可能な薬物送達システム例えばミクロスフェア、ヒドロゲル、高分子リザーバー、コレステロールマトリクス、高分子システム例えばマトリクス侵食及び/又は拡散システム並びに非高分子システム例えば圧縮した、融合した若しくは部分的に融合したペレットの挿入を包含する。坐薬には、グリセリン坐薬が含まれる。経口摂取の一回分は、腸溶性に被覆されていてよい。吸入法は、薬剤を吸入器内のエアゾールと共に投与する(単独で又は吸収され得るキャリアーに付着させて)ことを包含する。
この薬剤の投与は、単独で又は他の治療剤と組み合わせて行うことができる。ある具体例においては、この薬剤を適当なキャリアーと合わせ、リポソーム中に取り込ませ、又は高分子放出システム中に取り込ませることができる。
この発明のある具体例においては、幾らかの期間(例えば、数時間、数日、数週間、数ヶ月又は数年)にわたって順次的に薬剤にさらされるように投与をデザインすることができる。これは、上記の方法の一つによる薬剤の反復投与によって、或は、反復投与なしで長期間にわたって薬剤を動物に送達する制御された放出用の送達システムによって達成することができる。制御された放出用の送達システムとは、薬剤投与量の全放出が投与に際して直ちには起きないで、幾らかの時間だけ遅れることを意味する。放出を一気に起こすこともできるし、徐々に且つ継続的に起こすこともできる。かかるシステムの投与は、例えば、長期間作用する経口投薬形態、軟塊注入、経皮投与用絆創膏又は皮下インプラントによることができる。
放出が一気に起きるシステムの例には、例えば、薬剤が高分子マトリクス中に封入されたリポソームにトラップされ、これらのリポソームが特定の刺激(例えば、温度、pH、光、磁場又は分解酵素)に感受性であるシステム及びマイクロカプセルコア分解酵素でイオン的に被覆したマイクロカプセルにより薬剤を封入したシステムが含まれる。薬剤の放出が徐々に且つ継続的に起きるシステムの例には、例えば、薬剤が一定の形態でマトリクス中に含まれる侵食システム及び薬剤が例えばポリマーを通して制御された速度で透過する拡散システムが含まれる。かかる持続的放出システムは、例えば、ペレット又はカプセルの形態であってよい。
この薬剤を、液体に懸濁させることができる(例えば、溶解した形態又はコロイド状形態で)。この液体は、溶剤、不完全溶剤又は溶剤以外のものであってよい。多くの場合に、水又は有機液体を用いることができる。
この薬剤を、アテローム性動脈硬化症の徴候の出現の前又は後に投与することができる。ある具体例においては、この薬剤を、アテローム性動脈硬化症の家族病歴のある患者に、又はアテローム性動脈硬化症の素因を示し得る表現型を有する患者に、又はアテローム性動脈硬化症に傾ける遺伝子型を有すると診断された患者に、又は他の危険因子例えば高コレステロール血症、高血圧症若しくは喫煙を有する患者に投与する。
この薬剤を、動物に、治療上有効な量で投与する。治療上有効な量とは、少なくとも部分的にアテローム性動脈硬化症を予防し又は逆行させることのできる量を意味する。治療上有効な量は、個人ベースで決定することができ、少なくとも部分的に、動物の種、動物の大きさ、動物の年齢、使用する薬剤、使用する送達システムの種類、アテローム性動脈硬化症の徴候の開始に対する投与の時期、及び単独の、複数の若しくは制御された放出の投薬養生法の何れを用いるかに基づく。治療上有効な量は、かかる因子を用いる当業者により、日常的実験を用いて決定され得る。
好ましくは、薬剤の濃度は、1日当たり体重1kg当たり約0.1〜1000mg、一層好ましくは約0.1〜500mg、更に一層好ましくは約0.1〜100mg、最も好ましくは約0.1〜5mgの投与量である。特定の濃度は、部分的に、使用する特定の薬剤に依存する(幾つかは、他のものより一層有効であるので)。実際に投与する薬剤の投薬濃度は、少なくとも部分的に、作用部位で望まれる終濃度、投与方法、特定の薬剤の効力、特定の薬剤の寿命、及びアテローム性動脈硬化症の徴候の開始に対する投与のタイミングに依存する。好ましくは、投薬形態は、実質的に動物に悪影響を与えないものである。この投薬は、かかる因子を採用する当業者により、日常的実験を用いて決定され得る。
ある具体例においては、遺伝子治療プロトコールの一部として、種々の遺伝子構築物を用いて、例えばLBPポリペプチドのアゴニスト形態又はアンタゴニスト形態等の薬剤をコードする核酸を送達することができる。例えば、非野生型LBPが発現されている細胞においてLBPポリペプチドの機能を再構成するために、或は、該機能を排除するために、発現ベクターを、イン・ビボトランスフェクション用に及び特定の細胞型におけるLBPポリペプチドの発現用に用いることができる。このLBPポリペプチドの発現用構築物及びその変異物は、任意の生物学的に有効なキャリアーにて(例えば、LBP遺伝子をイン・ビボで細胞に有効に送達することのできる任意の配合又は組成にて)投与することができる。アプローチは、例えば、主題の遺伝子のウイルスベクター(例えば、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及び1型単純ヘルペスウイルス)又は組換えの細菌性若しくは真核生物のプラスミド中への挿入を包含する。ウイルスベクターは、直接細胞に感染し又は形質導入し;プラスミドDNAは、例えばカチオン性リポソーム(リポフェクチン(商標)(Life Technologies,MD,Gaithersburg在))、ポリリジン結合体、グラマシジンS、人工ウイルスエンベロープ若しくは他のかかる細胞内キャリアーの助けにより並びにイン・ビボにて行う遺伝子構築物の直接注射又はCa3(PO4)2沈殿によって送達され得、又は誘導体化(例えば、抗体結合体化)され得る。上記の方法は、当業者に公知であり、過度の実験なしで実施できる。適当な標的細胞の形質導入は遺伝子治療の決定的な第1のステップに相当するので、特定の遺伝子送達システムの選択は、意図される標的の表現型及び投与の経路(例えば、局所的か又は全身投与か)等の因子に依存する。投与は、治療上有効であるように、当業者に公知の方法によって、一種以上の細胞型に対して行うことができ、ある細胞型の内の1つ以上の細胞に対して行うことができる。好適具体例において、この薬剤を、動物の動脈壁細胞に投与する。例えば、遺伝子工学処理されたLBP遺伝子を、動脈壁細胞に投与する。ある具体例においては、投与を、出生前の動物又は胚細胞において行う。LBP発現のイン・ビボでの形質導入のために提供された特定の遺伝子構築物は又、ここに記載の診断アッセイでの使用等のために、細胞のイン・ビトロ形質導入にも有用であるということは認められよう。
ある具体例において、アテローム性動脈硬化症の治療を、LBPをコードする遺伝子のアンチセンスヌクレオチドアナログを用いて行う。好ましくは、アンチセンスヌクレオチドは、加水分解可能でない「主鎖」例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート又はメチルホスホネートを有する。そのヌクレオシド塩基配列は、例えばLBP−1、2又は3をコードする遺伝子の一部の配列と相補的である。かかる配列は、例えば、もしLBPの遺伝子配列がTAACCGであるならば、ATTGGCである。かかる治療の具体例は、LBP遺伝子の一つの一部のアンチセンスアナログのゆっくり放出する媒体(例えば、ポリビニルアルコール)中への取り込みであり、該媒体を、アンチセンスヌクレオチドを数週間又は数ヶ月の期間にわたって放出するように例えば皮下注射によって投与する。他の具体例においては、このアンチセンスアナログを、高分子マトリクス例えばポリビニルアルコール中に、ゲルを傷害された動脈壁に局所的に適用してLBP合成を阻止し及びLDLの蓄積を予防することができるように、例えば、血管形成又はアテローム摘出術後に取り込ませる。
この発明は又、アテローム性動脈硬化症の危険にある動物の治療方法をも包含する。アテローム性動脈硬化症の危険にある動物を準備する。LBPの構造及び代謝の面を変えることのできる薬剤を準備する。この薬剤を、この動物に、治療上有効な量で、その動物の治療が生じるように投与する。アテローム性動脈硬化症の危険にあることは、例えば、家族のアテローム性動脈硬化症の病歴、アテローム性動脈硬化症に傾かせる遺伝子型、又はアテローム性動脈硬化症に傾かせる表現型の徴候例えば高コレステロール血症、高血圧症若しくは喫煙を有することから帰着される。
この発明は又、LBPの構造又は代謝に異常を有する細胞の治療方法をも包含する。LBPの構造又は代謝に異常を有する細胞を準備する。LBPの構造又は代謝の面を変えることのできる薬剤を準備する。この薬剤を、この細胞に、治療上有効な量で、この細胞の治療が生じるように投与する。
ある具体例において、この細胞は、細胞培養若しくは組織培養から又は胎児の繊維芽細胞から得られる。この細胞は、例えば動物(例えば、天然の動物又は非ヒトトランスジェニック動物)の部分であってよい。好ましくは、LBPは、LBP−1、LBP−2又はLBP−3である。
この発明は又、動物におけるアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬組成物であって、治療上有効な量の薬剤(この薬剤は、アテローム性動脈硬化症の治療が生じるように、この動物におけるLBPの代謝又は構造の面を変えることができる)及び製薬上許容し得るキャリアーを含む医薬組成物をも包含する。製薬上許容し得るキャリアーには、例えば、塩溶液、リポソーム及び脂質エマルジョンが含まれる。
ある好適具体例において、この医薬組成物の薬剤は、LBPポリペプチド例えばLBP−1、LBP−2若しくはLBP−3又は生物学的に活性なその断片若しくはアナログである。この薬剤は、例えば、SEQ ID NO:1〜9に示したポリペプチドである。好ましくは、この薬剤は、約100アミノ酸残基長以下の、一層好ましくは約50アミノ酸残基以下の、更に一層好ましくは約30アミノ酸残基以下の、更に一層好ましくは約20アミノ酸残基以下の、更に一層好ましくは約10アミノ酸残基以下の、更に一層好ましくは約5アミノ酸残基以下の、更に一層好ましくは約4アミノ酸残基以下の、更に一層好ましくは約3アミノ酸残基以下の、最も好ましくは約2アミノ酸残基以下のポリペプチドである。好ましくは、このポリペプチドは、少なくとも約20%の酸性アミノ酸残基を、一層好ましくは少なくとも約40%の酸性アミノ酸残基を、更に一層好ましくは少なくとも約60%の酸性アミノ酸残基を、更に一層好ましくは少なくとも約80%の酸性アミノ酸残基を、更に一層好ましくは少なくとも約90%の酸性アミノ酸残基を、更に一層好ましくは少なくとも約95%の酸性アミノ酸残基を、最も好ましくは少なくとも約98%の酸性アミノ酸残基を含む。
ある好適具体例においては、この薬剤は、LBP核酸例えばLBP−1、LBP−2若しくはLBP−3又は生物学的に活性なこれらの断片若しくはアナログをコードする核酸である。この薬剤は、例えば、SEQ ID NO:10〜18に示したヌクレオチド配列を含む核酸であってよい。
この発明は又、動物におけるアテローム性動脈硬化症を治療するためのワクチン組成物であって、治療上有効な量の薬剤(この薬剤は、アテローム性動脈硬化症の治療を生じるように、この動物におけるLBPの代謝又は構造の面を変えることができる)及び製薬上許容し得るキャリアーを含むワクチン組成物をも包含する。
この発明は又、動物におけるアテローム性動脈硬化病変の診断方法をも包含する。一の動物を準備する。アテローム性動脈硬化病変に存在するLBPに結合することのできる標識した薬剤を準備する。この標識した薬剤を、この動物に、標識されたLBPが生じるように、この標識した薬剤がLBPと相互作用する条件下で投与する。この標識されたLBPの位置測定又は定量を、この動物中のアテローム性動脈硬化病変の存在を診断するように、イメージングにより測定する。
好ましくは、LBPは、LBP−1、LBP−2又はLBP−3である。このイメージングは、例えば、磁気共鳴イメージング、ガンマーカメライメージング、単一光子放出コンピューター断層(SPECT)イメージング又は陽電子放出断層撮影法(PET)を包含する当業者に公知の標準的方法によって実施することができる。
好ましくは、アテローム性動脈硬化病変中のLBPに固く結合する薬剤を、アテローム性動脈硬化症のイメージング及び診断に用いる。この薬剤は、例えば、99mTcその他の臨床用イメージング(ガンマーカメラ、SPECT、PETスキャニング又は他の類似の断層撮影法による)に適したアイソトープで放射性標識する。LBPは非常に初期の病変に生じるので、かかるイメージングは、未だ動脈内腔に可視的隆起又は乱れた流れを生じるような影響を与えていない非常に初期の病変をつきとめるために、血管造影法又は超音波より一層鋭敏である。初期の及び一層進んだ病変の両者をつきとめることに加えて、これらのLBPに結合するイメージング剤は又、アテローム性動脈硬化症の進行を追跡するために用いることもできる(食事療法と薬理学的療法の両者の有効性を評価する手段として)。
従って、この発明の診断の具体例は、例えばLBPの一つに相補的なペプチドを、それを放射性標識し、肉眼で見えないアテローム性動脈硬化症の検出のための注射可能なイメージング剤として用いるによって適合させることである。このペプチドは、LBPに結合することが知られているもの(例えば、RRRRRRR又はKKLKLXX)又は、LBPの高度に電気陰性のドメインに結合する任意の他のポリカチオン性ペプチドから選択する。ガンマーシンチレーション(Anger)カメラを用いる生体外での検出のために、テクテチウム結合したリガンド例えばCGC、GGCGC又はGGCGCFをこれらのペプチドのN末端又はC末端に99mTc標識のために取り込むことができる。磁気共鳴イメージング(MRI)による外部イメージングのために、例えば、ガドリニウム結合キレーター、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)を、これらのペプチドのN又はC末端に共有結合させる。更に別の具体例において、LBP結合ペプチドは、当業者に公知の標準的方法によって、例えばこれらのペプチドを磁性イオンを含む活性化ポリスチレン樹脂ビーズと結合させることによって、例えば磁性イオン粒子に共有結合される。
この発明は又、動物をLBP例えばLBP−1、LBP−2若しくはLBP−3又はこれらの断片若しくはアナログに対して免疫化する方法をも包含する。LDLを有する動物を準備する。LBP又はその断片若しくはアナログを準備する。このLBP又はその断片若しくはアナログを、この動物によるLBP又はその断片若しくはアナログに対する抗体産生を刺激するように、この動物に投与し、それにより、LBPのLDLへの結合を変化させる(例えば、減少させ又は増大させる)。
この発明は又、LBPポリペプチドの断片又はアナログの製造方法をも包含する(この断片又はアナログは、改変されたLDL及びネイティブなLDLに結合する能力を有する)。一のLBPポリペプチドを準備する。LBPポリペプチドの配列を変化させる。変化したLBPポリペプチドを、改変したLDL例えばメチル化LDL、酸化LDL、アセチル化LDL、シクロヘキサンジオン処理したLDL(CHD−LDL)及びネイティブなLDLに結合する能力について試験する。
これらの断片又はアナログを生成して、これらの改変したLDL及びネイティブなLDLに結合するそれらの能力について、例えば個々に記載の当業者に公知の方法により試験することができる。好ましくは、それらを、メチル化LDL及びネイティブなLDLに結合するそれらの能力について試験する。この断片又はアナログの結合活性は、ネイティブなLBPの結合活性より強くても弱くてもよい。好ましくは、それは、より強い。好適具体例において、LBPは、LBP−1、LBP−2又はLBP−3である。
この発明は又、LBPをコードするcDNAを単離する方法をも包含する。一のcDNAライブラリーを準備する。そのcDNAライブラリーを、ネイティブなLDL及び改変したLDL例えばメチル化LDL又は酸化LDLに結合するポリペプチドをコードするcDNAについてスクリーニングする。このポリペプチドをコードするcDNA(LBPをコードするcDNA)を単離する。
下記の非制限的実施例は、本発明を更に説明する。
実施例
実施例1:ウサギのcDNAライブラリーの構築
この実施例は、バルーンによる内皮剥奪の治癒からのmRNAを用いるウサギのcDNAライブラリーの構築を説明する。バルーンカテーテルにより内皮剥奪されたウサギの大動脈は、アテローム性動脈硬化症の有効なモデルであることが示されている(Minick等Am.J.Pathol.95:131-158(1979))。
バルーン処理したウサギの大動脈中の集中的なLDL結合を最大にするバルーン処理の4週間後にこのmRNAが得られた。第一鎖cDNA合成を、4μgのmRNA;2μgのオリゴd(T)プライマー;メチル化dNTPmix(各10mM);10mM DTT;800単位のスーパースクリプトIIRT(Life Technologies,MD,Gaithersburg在);1×第一鎖cDNA合成用緩衝液(50mMトリス−HCl、pH8.3;75mM KCl;5mM MgCl2)を含む50μlの反応混合物中で行った(37℃で、1時間インキュベートした)。次いで、この反応混合物を、1×第二鎖用緩衝液(30mMトリス−HCl、pH7.5;105mM KCl;5.2mM MgCl2);0.1mM DTT;メチル化dNTPmix(各10mM);50単位の大腸菌DNAポリメラーゼI、3単位のRNアーゼH;15単位の大腸菌DNAリガーゼ(すべての酵素は、Life Technologiesより購入)の添加により250μlに調節し、更に2.5時間にわたって15℃でインキュベートした。その結果生成した二本鎖cDNA(dscDNA)を、次いで、1.5単位のT4DNAポリメラーゼ(Novagen Inc.,WI,Madison在)で、20分間11℃で処理して鈍端化dscDNAを作製した。次いで、これらを、エタノール沈殿により濃縮して、EcoRI/HindIIIリンカーをT4DNAリガーゼ(Novagen Inc.)により両端に付着させた。これらのリンカーを連結したcDNAを、EcoRI及びHindIII制限酵素で処理してEcoRI及びHindIII認識配列を、それぞれ、それらの5’及び3’末端に作った。リンカーDNAのゲル排除クロマトグラフィーによる除去の後に、dscDNAを、T4DNAリガーゼにより、一方向性の様式で、λEXloxファージアーム(ovagen Inc.)中に挿入し、製造者のプロトコール(Novagen Inc.)に従ってファージ粒子中にパッケージングした。2×106の独立のクローンを含むcDNAのファージライブラリーが、4μgのmRNAから樹立された。
実施例2:LDL結合性蛋白質(LBP)をコードするウサギcDNAの同定
この実施例は、ネイティブなLDL及びメチルLDLの両方に結合するLBPをコードするcDNAを同定するようにウサギのcDNAライブラリーを機能的にスクリーニングする方法を説明する。メチルLDLは、前に報告された細胞表面レセプターによって認識されない。例えば、Weisgraber等,J.Biol.Chem.253:9053-9062(1978)を参照されたい。
大腸菌ER1647細胞(Novagen Inc.)の新鮮な一晩培養物に、実施例1で得られたcDNAファージを感染させ、2XYT寒天を含む直径150mmのプレート中に、2×104プラーク形成単位(pfu)の密度でプレートした。50プレートすべて(1×106ファージに相当)をプレートして、プラークが直径1mmに達するまで(5〜6時間)37℃でインキュベートした。予め10mM IPTG溶液に浸した乾燥ニトロセルロース膜を、各プレート上に重ねて組換え蛋白質の産生を誘導し、それらの蛋白質を膜上に固定した。これらの膜を、37℃で更に3〜4時間インキュベートし、次いで、一晩4℃でインキュベートした。
翌日、これらの膜を、各プレートから取り出して次のように処理した。TBST溶液(10mMトリス−HCl、pH8.0;150mM NaCl、0.05% ツイーン20)中での数回の簡単なすすぎ;HBB(20mM HEPES、pH7.5;5mM MgCl2、1mM DTT及び5mM KCl)中の6Mグアニジン−HClでの2回の10分間ずつのすすぎ;HBB中の3Mグアニジン−HClでの2回の5分間ずつのすすぎ;TBSEN(TBS、1mM EDTA、0.02%NaN3)中での最後の簡単なすすぎ。
次いで、これらの膜を、室温で、5%脱脂粉乳を含むTBSEN溶液にて30分間、その後、1%脱脂粉乳を含むTBSENにて10分間ブロックした。ブロッキングの後に、これらの膜を、ネイティブなヒトLDL(実施例11に記載したようにして得たもの)又はメチル化ヒトLDL(meLDL)(Weisgraber等,J.Biol.Chem.253:9053-9062(1978)参照)と共に、1×TBSEN、1%脱脂粉乳、1mM PMSF、0.5×プロテアーゼインヒビター溶液(1mMε−アミノカプロン酸/1mMベンザミジン)を含む溶液中で、4μg/mlの濃度でインキュベートした。インキュベーションを、4時間、室温で、攪拌用テーブル上で穏やかに攪拌しながらガラス製ペトリ皿中で行い、その後、攪拌せずに4℃で一晩行った。
特異的に結合したmeLDL及びネイティブなLDLを、ニトロセルロース上で、ヒトLDLに対する抗体によって検出した。ヒツジの抗ヒトLDLポリクローナル抗体(Boehringer Mannheim,IN,Indianapolis在)を大腸菌プライE細胞抽出物で吸着してバックグラウンドを無くした。吸着のために、大腸菌プライE細胞を対数期まで増殖させ、遠心分離で沈めて、1mM PMSF、2mMε−アミノカプロン酸及び1mMベンザミジンを含むPBS中に再懸濁した。この細胞懸濁液を、次いで、8サイクルの凍結融解にかけた(液体窒素及び冷たい水道水への浸漬による)。抗LDL抗体/細胞抽出物溶液を、穏やかに攪拌しながら、4℃で1時間インキュベートした(1mlの抗体溶液/3mgの粗細胞抽出物)。インキュベーションの後に、この混合物を遠心分離して(10,000×g;10分間;4℃)、上清を、使用するまで0.02%NaN3の存在下で4℃で貯蔵した。これらの膜を免疫スクリーニングのために次のように処理した:(i)1%ゼラチンを含むTBSENでの室温で5分間ずつ3回の洗浄;(ii)1%ゼラチンを含むpH7.4のPBS中での30分間のインキュベーション;(iii)吸着したヒツジ抗ヒトLDL抗体(Boehringer Mannheim,IN,Indianapolis在)を含む新鮮なPBS/ゼラチン溶液(1:1000希釈)中で穏やかに攪拌しながら室温で2時間のインキュベーション;(iv)TBS、pH7.4中での3回の簡単な洗浄;(v)ロバの抗ヒツジアルカリホスファターゼ結合抗体(Sigma,MO,St.Louis在)を含むPBS/ゼラチン溶液中で穏やかに攪拌しながら室温で1時間のインキュベーション;(vi)TBS、pH7.4での3回の簡単な洗浄;及び(vii)アルカリホスファターゼ基質展開キット(Novagen Inc.)を用いての製造者の指示に従っての展開。LBPを生成したファージプラークは、これらの膜上で青色の「ドーナッツ」として現れた。
LBPcDNAを含む実施例1のファージをプラーク精製して、Novagen Inc.より提供された「Autosubcloning by Cremediated Plasmid Excision」と呼ばれるプロトコールに従ってプラスミドクローンに変換した。ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 74:5463-5467(1977))によりDNA配列を得て、Applied Biosystemsの自動化シーケンサーにより分析した。各cDNAのオープンリーディングフレーム(ORF)を、これらのcDNAのセンス及びアンチセンス鎖の両方から得られた一致する配列から決定した。配列決定は、3つの以前には知られていない遺伝子が単離されたことを確実にした。これらの遺伝子は、LDL結合についての機能的スクリーニングにより選択されたので、これらの遺伝子によりコードされた蛋白質は、LDL結合性蛋白質(LBP)、詳細にはLBP−1、LBP−2及びLBP−3と呼ばれた。ウサギのLBP−1、LBP−2及びLBP−3のcDNA配列並びに対応する蛋白質を、SEQ ID NO:10〜14に示す。
各cDNAのコード配列に基づいて、組換え蛋白質の大きさを、LBP−1は16.2kDa、LBP−2は40kDa、LBP−3は62.7kDaであると決定した。
実施例3:LBPcDNA又はcRNAを用いるウサギRNAのノーザンブロット分析
この実施例は、LBPmRNAの大きさ及び組織分布を説明する。全RNAを種々のウサギ組織(副腎、胸部大動脈、腹大動脈、バルーン処理して内皮再生した腹大動脈、心臓、腎臓、平滑筋細胞、肺、及び肝臓)から、トリゾール試薬(Life Technologies)により単離してエタノール沈殿により濃縮した。RNAのゲル電気泳動を、1×MOPS緩衝液(0.2M MOPS、pH7.0;50mM酢酸ナトリウム;5mM EDTA、pH8.0)及び0.37Mホルムアルデヒドを含む1.2%アガロースゲル中で行った。調べた各組織からの20μgの全RNAをゲルに載せて、100ボルトで1時間、1×MOPS緩衝液中で電気泳動した。RNAを、支持されたニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell,NH,Keene在)上にブロットして、80℃に2時間ベークすることにより固定化した。放射性標識したLBP−1、LBP−2及びLBP−3cDNA又はcRNAプローブへのハイブリダイゼーションを、当業者に公知の標準的手順によって行い(例えば、Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology;John Wiley & Sons(1989)参照);シグナルをオートラジオグラフィーにより検出した。
結果は、次の通りであった:mRNAの大きさは、LBP−1は約1.3kbであり、LBP−2は約2.3〜2.5kbであり、LBP−3は約4.7kbであった。LBP−1、LBP−2及びLBP−3mRNAは、試験したすべての組織で見出されたが、最大量は、バルーン処理した腹大動脈内であった。
実施例4:ヒトLBPcDNAの単離
この実施例は、ヒトLBPcDNAの単離を説明する。ヒトLBPcDNAクローンを、3つのcDNAライブラリーから単離した。ヒト胎児脳cDNAライブラリーをカリフォルニア、LaJolla在、Stratageneから、ヒト大動脈cDNAライブラリーをカリフォルニア、Palo Alto在、Clontechから得て、ウサギLBP−1、LBP−2又はLBP−3由来の放射性標識したcDNAプローブを用いて、Law等,Gene Expression 4:77-84(1994)に記載された方法に従ってスクリーニングした。幾つかの強くハイブリダイズするクローンを同定してプラーク精製した。クローンは、ジデオキシチェーンターミネーション法を用いるDNA配列決定及びApplied Biosystems自動化シーケンサーによる分析によって、ヒトのLBP−1、LBP−2及びLBP−3であることが確認された。これらのcDNA配列及びヒトのLBP−1、LBP−2及びLBP−3の対応する蛋白質をSEQ ID NO:15、16及び17にそれぞれ示す。ウサギとヒトの対応するLBP−1、LBP−2及びLBP−3蛋白質配列の比較を、図19、20及び21に示す。
実施例5:組換えのLBP−1、LBP−2及びLBP−3ウサギ蛋白質の大腸菌からの単離
LBPcDNAを、実施例1及び2で得られた元のpEXloxプラスミドから単離して、組換え蛋白質の発現のために、pPROEX−HTベクター(Life Technologies)中にサブクローン化した。トランスフォームした大腸菌DH10B培養物中へのIPTGの添加による組換え蛋白質の誘導は、6−ヒスチジンタグ(N末端)を含む組換え蛋白質の発現を生じた。このタグを付けた蛋白質を、次いで、全細胞蛋白質から、Ni−NTA(ニッケルニトリロ三酢酸)への結合により、製造者(Qiagen,Inc.,CA,Santa Clara在)により提供されたプロトコールに記載されたようにして精製した。クロマトグラフィーステップの後に得られた標品は、約90%の純度であり;調製用SDS−PAGEを、最終精製ステップとして行った。
特性決定手順により必要とされる場合には、LBPのヨウ素化を、ヨードビーズ(Pierce,IL,Rockford在)を用いて行った。これらのヨードビーズを500μCiのNa125I溶液(17Ci/mg)(New England Nuclear,MA,Boston在)と共に、キャップをした小型遠心分離機用チューブ中で5分間室温でインキュベートした。この蛋白質溶液を、ヨードビーズ−Na125Iの小型遠心分離機用チューブに加えて、15分間室温でインキュベートした。このインキュベーションの最後に、アリコートを、全溶解性カウント及びTCA沈殿されたカウントの測定のために採取した。この放射性標識された蛋白質を、次いで、冷アセトン(2.5容;−20℃;2.5時間)で沈殿させた。このインキュベーションの後に、沈殿した蛋白質を遠心分離(14,000g;1時間;室温)により集めて、試料用緩衝液(6M尿素/50mMトリス、pH8.0/2mM EDTA)に再懸濁した。この蛋白質標品の完全性をSDS−PAGEにより評価した。
これらの組換えLBPの正体を、当業者に公知の標準的な蛋白質配列決定プロトコールを用いて確認した。(A Practical Guide for Protein and Peptide Purification for Microsequencing,Matsudaira編、Academic Press,Inc.,第二版(1993))。分析を、Applied Biosystemsモデル477A蛋白質シーケンサー及びオンラインモデル120PTHアミノ酸アナライザーを用いて行った。
実施例6:LBP−1、LBP−2及びLBP−3に対する抗体の産生
この実施例は、LBP−1、LBP−2及びLBP−3に対するポリクローナル抗体の産生を説明する。精製した組換えLBP蛋白質(0.5ml;200μg)とRIBIアジュバント(RIBI ImmunoChem Research,Inc.,MT,Hamilton在)との混合物を、雄のモルモット(Dunkin Hartley;Hazelton Research Products,Inc.,PA,Denver在)に、背側の胸部及び腹部領域に沿って3〜5カ所に皮下注射した。静脈穿刺により、1日目(免疫化前)、28日目、49日目及び70日目に採血した。追加抗原を21日目(100μg;SC)、42日目(50μg;SC)、及び63日目(25μg;SC)に投与した。このモルモットの抗血清の力価を一連の希釈物の「ドットブロッティング」により評価した。免疫化前抗血清を同時に評価した。LBP蛋白質の第三の追加免疫の後に、この組換え蛋白質に対する力価は、156pgのドットブロットアッセイ上の検出可能な比色応答における最高レベルに達した。
組換えLBP−1、LBP−2又はLBP−3に対するポリクローナル抗体の特異性を、ウエスタンブロット分析(Towbin等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350(1979))を用いて示した。この蛋白質−抗体複合体を、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗モルモットIgGを用い、続いてニトロブルーテトラゾリウム(BioRad Laboratories,CA,Hercules在)で染色することによって免疫化学的に可視化した。非特異的結合を、トリス緩衝塩溶液(100mMトリス;0.9%NaCl、pH7.4)中の3%脱脂粉乳を用いてブロックした。
実施例7:免疫組織化学的特性決定
この実施例は、プラークを覆う内皮細胞内又は該細胞上の、隣接する平滑筋細胞内又は該細胞上の、及び細胞外マトリクス中のLBPの存在を説明する。更に、LDL及びLBPの同所局在性を示した。これらの結果は、バルーン処理したウサギの動脈病変及びヒトのアテローム性動脈硬化症のプラークを免疫組織化学的方法により調べることにより得られた。
バルーン処理して内皮剥奪した大動脈を、組織採取の24時間前にヒトのLDL軟塊の注射(3mg;i.v.)をしたウサギから得た。アテローム性動脈硬化症のプラークを含むヒトの大動脈を、日常的な剖検試料から得た。組織を、10%緩衝ホルマリン(≦24時間)にて固定し、自動化組織包埋機を用いてパラフィンに包埋した。組織切片を切り(5〜7μ)、1時間60℃でインキュベートすることによりスライドガラス上に載せた。切片をパラフィン除去した。脱イオン化H2Oでの最終的洗浄の後に、内因性ペルオキシダーゼ活性を、これらの切片を1%H2O/H2O緩衝液と室温で5分間インキュベートすることにより除去した。切片をリン酸緩衝塩溶液(PBS)で5分間室温ですすぎ、非特異的結合を5%正常ヤギ血清又は5%正常ウサギ血清でブロックした{二次抗体(Sigma,MO,St.Louis在)の起源に依存(1時間;室温)}。次いで、切片を、組換えLBP−1、LBP−2又はLBP−3のウサギ型に対するモルモットのポリクローナル抗体の1:50希釈物(5%正常ヤギ血清/PBS中)と共にインキュベートした。対照は、免疫化前血清並びにLBP−1、LBP−2又はLBP−3に対する特異的抗体を含んだ(そこでは、一次抗体は、組織とのインキュベーションの前に、組換えLBP−1、LBP−2又はLBP−3とのインキュベーションとその後の遠心分離によって完全に吸着除去された)。ヒトのアポリポ蛋白質Bに対するアフィニティー精製したウサギのポリクローナル抗体(Polysciences Inc.;PA,Warrington在)を、1:100の希釈物として用いた(5%正常ウサギ血清/PBS中)。切片を、2時間、室温で、加湿チャンバー中でインキュベートした。インキュベーションの最後に、切片を、PBSですすぎ、ヤギ抗モルモットビオチン化IgG結合体(Vector Laboratories,CA,Burlingame在)の1:200希釈物(5%正常ヤギ血清/PBS中)と又はウサギ抗ヤギビオチン化IgG結合体(Vector Laboratories,CA,Burlingame在)の1:250希釈物(5%正常ウサギ血清/PBS中)と1時間、室温で、加湿チャンバー中でインキュベートした。次いで、切片を、PBSですすぎ、抗原−抗体シグナルをアビジン/ビオチンHRP結合体(Vectastain ABCキット;Vector Laboratories,CA,Burlingame在)を用いて増幅した。切片を、DAB基質を用いて展開させ(4〜6分間;室温)、ヘマトキシリンで対比染色した。
バルーン処理したウサギの動脈において、抗LBP−1、LBP−2及びLBP−3抗体を用いる免疫組織化学は、LBP−1、LBP−2及びLBP−3が再生中の内皮島の縁の機能的に改変された内皮細胞内に及び該細胞上に局在することを示した{不可逆的LDL結合が示された同様の局在}(Chang等,Arteriosclerosis and Thrombosis 12:1088-1098(1992))。LBP−1、LBP−2及びLBP−3は又、機能的に改変された内皮細胞の下の脈管内膜平滑筋細胞内又は該細胞上にも見出され、一層少ないが、細胞外マトリクスにも見出された。LBP−1、LBP−2又はLBP−3は、LDL結合が可逆的であることが示された依然内皮剥奪されたままの領域では、検出されなかった(Chang等,Arteriosclerosis and Thrombosis 12:1088-1098(1992))。バルーン処理したウサギの大動脈の抗ヒトアポリポ蛋白質B抗体を用いる免疫組織化学は、LBP−1、LBP−2及びLBP−3について見出されたのと同じ局在性のLDLの存在を示した。
日常的剖検において得られたヒトのアテローム性プラークにおいて、抗LBP−1、LBP−2及びLBP−3抗体を用いた免疫組織化学は、LBP−1、LBP−2及びLBP−3がプラークを覆う内皮細胞内又は該細胞上及び隣接する平滑筋細胞内又は該細胞上にも見出されることを示した。ヒトの組織においては、細胞外マトリクス中のLBP−1、LBP−2及びLBP−3の一層多くの証拠があった。
これらのパラフィン切片を用いて得られた結果は、凍結切片のものと同一であった。
実施例8:LBPとLDL又はHDLとのアフィニティー同時電気泳動(ACE)分析
この例は、LBP−1、LBP−2又はLBP−3とLDLとの間で結合が起きること、及びLBP−1、LBP−2又はLBP−3とHDL(高密度リポ蛋白質)との間では結合が起きないという事実により説明されるように、この結合が特異的であることを示す。
組換えのウサギLBP−1、LBP−2又はLBP−3のLDLへの結合の親和性及び特異性の分析を、アフィニティー電気泳動の原理(Lee及びLander,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2768-2772(1991))を用いて行った。溶融アガロース(1%;65℃)を、50mM MOPSナトリウム(pH7.0);125mM酢酸ナトリウム、0.5%CHAPSにて調製した。9つの平行なバーよりなるテフロン製のコーム(45×4×4mm/3mmのバー間隔)を、プレキシガラス製のキャスティングトレーに適合させたGelBondフィルム(FMC Bioproducts,ME,Rockland在)上に、バーの長軸をキャスティングトレーの長軸に平行に置いた。テフロン製ストリップ(66×1×1mm)を、縁に、その長軸をキャスティングトレーの短軸に平行に、テフロン製コームの縁から4mmの距離に置いた。次いで、溶融アガロース(>65℃)を、注いで約4mmの高さを達成した。コーム及びストリップの除去は、9つの45×4×4mmの矩形のウェル(66×1mmのスロットに隣接)を含むゲルを生じた。LDL又はHDL試料を、ゲル緩衝液(50mM MOPSナトリウム、pH7.0、125mM酢酸ナトリウム)にて、所望濃度の2倍で調製した。次いで、試料を、等容の溶融アガロース(50mM MOPS、pH7.0;125mM酢酸ナトリウム;50℃)と混合して、ピペットで適当な矩形ウェルに注ぎ、ゲル化させた。LBP−1及びLBP−3の結合親和性及び特異性を、幾つかの濃度のLDL(540〜14nM)及びHDL(2840〜177nM)を用いて試験した。一定量(0.003〜0.016nM)の125I標識したLBP−1、LBP−2又はLBP−3(50mM MOPSナトリウム、pH7.0;125mM酢酸ナトリウム;0.5%ブロモフェノールブルー;6%(wt/vol)シュークロース中に懸濁)を、このスロットに載せた。ゲルを、70v/2時間/20℃で電気泳動した。この操作の最後に、ゲルを風乾して、遅延プロフィルを、X線フィルムをゲルに一晩−70℃で増感スクリーンと共に露出することにより可視化した。
LDLは、ゲル中でのLBP−1、LBP−2及びLBP−3の移動を、濃度依存の飽和し得る様式で遅延させ、これは、LBP−1、LBP−2及びLBP−3のLDLへの結合が高度に特異的であることを示している。この結論は、HDLがLBP−1、LBP−2又はLBP−3を遅延させないという事実によって支持される。アフィニティー同時電気泳動アッセイから生成した結合曲線は、LBP−1が25.6nMのKdでLDLに結合すること、LBP−2(ウサギのクローン26)が100nMのKdでLDLに結合すること、及びLBP−3(80kDaの断片)が333nMのKdでLDLに結合することを示した。
LBP−1、LBP−2及びLBP−3のLDLへの結合の親和性及び特異性を試験することに加えて、「コールド」の(即ち、放射性標識してない)LBP−1、LBP−2又はLBP−3が、それぞれ、放射性標識したLBP−1、LBP−2又はLBP−3のLDLへの結合を競争的に阻害する能力を試験した。競争研究を、固定した濃度のコールドなLDLと放射性標識したLBP−1及び増大する量のコールドな組換えLBP−1(6〜31μM)を用いて行った。ACEアッセイ試料とゲルをここに記載したように調製した。コールドなLBP−1は、放射性標識したLBP−1のLDLへの結合を濃度依存的様式で阻害し、コールドなLBP−2は、放射性標識したLBP−2のLDLへの結合を濃度依存的様式で阻害し、コールドなLBP−3は、放射性標識したLBP−3のLDLへの結合を濃度依存的様式で阻害した。
ウサギ及びヒトのLBP−2は、酸性アミノ酸の長いストレッチをアミノ末端に含む(ウサギLBP−2のアミノ酸残基105〜132及びヒトのLBP−2のアミノ酸残基8〜33)。LBP−2のこのセグメントがLDL結合ドメインである可能性を、この酸性領域の存否によって互いに異なる2つのウサギLBP−2クローン(クローン26及び45)を当業者に公知の標準的方法によって発現ベクター中にサブクローニングすることにより試験した。次いで、ACEアッセイを、これらの2つのクローンのLDLへの結合の親和性及び特異性を評価するために行った。LDLは、クローン26由来の放射性標識したLBP−2のゲル中の移動を濃度依存性の飽和し得る様式で遅延させたが、クローン45由来の放射性標識したLBP−2の移動は遅延されなかった。
固定した濃度のコールドなLDL及びクローン26由来の放射性標識したLBP−2並びに増大する濃度のコールドな組換えLBP−2/クローン26及びLBP−2/クローン45を用いて、競争研究を行った。コールドなクローン26由来のLBP−2は、クローン26由来の放射性標識したLBP−2のLDLへの結合を濃度依存的様式で阻害した。他方、クローン45由来のLBP−2は、クローン26由来の放射性標識したLBP−2のLDLへの結合に影響しなかった。これらの結果は、酸性アミノ酸の長いストレッチがLBP−2のLDLへの結合ドメインを含むことを示している。
実施例9:インヒビターの存在下でのLBP−1又はLBP−2とLDLとのアフィニティー同時電気泳動(ACE)アッセイ
この実施例は、LBP−1又はLBP−2とLDLとの間の結合がポリグルタミン酸又はBHF−1により阻害されるということを説明する。第三の化合物が前に相互作用することを示した2つの蛋白質の間の結合を阻害する能力を、実施例8に記載したACEアッセイの改変によって試験した。この第三の化合物を、上に又はウェルに加えた(放射性標識した蛋白質と共に)。もしこの第三の化合物が結合を阻害したならば、放射性標識された蛋白質は、ゲルを通って進むであろう。もしこの第三の化合物が結合を阻害しなかったならば、放射性標識した蛋白質の移動は、ゲル中への蛋白質キャストにより遅延された。
LBP−1/LDL又はLBP−2/LDL結合のポリグルタミン酸(平均MW約7500、約7モノマーに相当)による阻害が、これらのすべての矩形レーン内の一定量のLDL(148nM)のキャストにより示された。一定量(1μl)の125I標識したLBP−1又はLBP−2(0.003〜0.016nM)をゲル上部のウェル中に、増大する濃度のポリグルタミン酸(Sigmaから得た)(0〜0.4nM)と共に載せた。このゲルを、70ボルトで2時間にわたって電気泳動し、乾燥して、増強スクリーンと共にX線フィルム上に一晩−70℃で置いてから、そのフィルムを現像してLBP−1及びLBP−2の遅延プロフィルを測定した。ポリグルタミン酸濃度を増すにつれて、放射性標識したLBP−1及びLBP−2の移動のLDLによる遅延は、濃度依存的様式で減少し、これは、ポリグルタミン酸がLBP−1、LBP−2とLDLとの間の結合を阻害することを示した。
LBP−1/LDL結合のBHF−1による阻害は、一定量のLDL(148nM)のキャスティングによりすべての矩形レーンにおいて示された。一定量の125I標識したLBP−1(0.003〜0.016nM)を、ゲル上部のウェルに、実施例15に記載したように得た増大する濃度のBHF−1(0〜10nM)と共に載せた。このゲルを、70ボルトで2時間にわたって電気泳動し、乾燥して、増強スクリーンと共に、X線フィルム上に−70℃で一晩置いた。次いで、このフィルムを現像して125I−LBP−1の遅延プロフィルを測定した。BHF−1の濃度が増大するにつれて、LBP−1のLDLによる遅延は、濃度依存的様式で減少し、これは、BHF−1がLBP−1とLDLとの間の結合を阻害することを示した。
実施例10:LDLに結合するLBPの断片、アナログ及び模倣物を同定するためのアフィニティー同時電気泳動(ACE)アッセイ
この実施例は、LDLに結合し、それ故、LDL分子上の結合部位を占めることによりこれらの部位を動脈壁内のLBPへの結合に利用できなくすることによってLDLのLBPへの結合のインヒビターとして用いることのできるLBPの断片、アナログ及び模倣物を同定するための方法を説明する。
LBPの断片は、化学的開裂により生成され又は既知のアミノ酸配列から合成する。これらの断片の試料(コールド)を、個々に、放射性標識したLBPに実施例8に記載のように加えて、種々の断片の潜在的阻害能力を評価する。阻害性であると同定された断片の一層小さい部分へのこの手順の反復適用により、最も小さい活性ポリペプチド断片を同定する。同様の方法において、LBPのアナログを試験して、LDLへの結合によりインヒビターとして作用し得るアナログを同定する。そして、同様にして、LBPの模倣物(LBP分子上のLDL結合部位のコンホメーション及び/又は電荷分布を真似る分子)を、類似の方法で試験して、LBP上のLDL結合部位に対する親和性を示す分子を同定する。
このように同定されたインヒビターの親和性は、少なくとも、LBP上のLDL結合部位に対するLDL自身の親和性と同程度の強さである。これらのインヒビターは、少なくとも競争的に、そして幾らか不可逆的に、そしてその上優先的にLDL結合部位に結合し、それにより、かかる部位を体液性LDLへの結合に利用できなくする。
実施例11:ELISAアッセイ
この実施例は、試験化合物のLDLの特異的LBPへの結合を阻止する能力の定量のためのELISAプレートアッセイの利用を説明する。
このアッセイを次のように行う:LDLを50mM Na2CO3、pH9.6/0.02%NaN3にて希釈し、96ウェルプレート(Immuno Ware 96-Well Reacti-Birid EIA Polystyrene Plates;Pierce(IL,Rockford在))のウェルに加えてウェル当たり0.1〜1μgの終濃度を達成した。これらのプレートを室温で6時間インキュベートした。インキュベーション期間の最後に、これらのウェルをトリス緩衝塩溶液、pH7.4(TBS)で3回洗い、200μlの1%ウシ血清アルブミン(BSA){TBS/0.02%NaN3(Sigma;MO St.Louis在)中}で一晩室温でブロックした。次いで、これらのウェルを200μlのTBS中のLBP蛋白質(5〜10μg/ウェル)とインキュベートし、試験化合物の濃度を変化させた。プレートを1時間室温でインキュベートした。次いで、これらのウェルをTBSで3回洗い、2時間にわたって200μlのTBS/0.02%NaN3中の1%BSAで室温でブロックした。インキュベーション期間の最後に、これらのウェルをTBSで3回洗い、適当なモルモットの抗LBP蛋白質ポリクローナル抗体の1:1000希釈物(TBS/0.05%ツイーン20中)をこれらのウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。次いで、これらのウェルを、TBS/0.05%ツイーン20で3回洗い;ヤギ抗モルモットIgGアルカリホスファターゼ結合体(Sigma)の1:30,000希釈物を各ウェルに加えた。プレートを1時間室温でインキュベートした。これらのウェルを、TBS/0.05%ツイーン20で3回洗い、200μlのp−ニトロフェニルホスフェート基質(Sigma;MO,St.Louis在)をこれらのウェルに加えることにより比色反応を行った。この反応を室温で30分間進行させ、50μlの3N NaOHにより停止させた。吸光度を、ELISAプレートリーダーを用いて、405nmで測定した。この試験化合物の、LDLの組換え蛋白質への結合のブロックにおける有効性を、対照群と処理群の吸光度値を比較することにより評価した。
別法として、LDLではなく、LBPをプレートに結合した。組換えLBP蛋白質のLDLへの結合及びインヒビター濃度を変えることのLBP−LDL結合に対する影響を、LDLに対する抗体を用いて測定した。この相互作用を、レポーター酵素(例えば、アルカリホスファターゼ)に結合させた第2抗体の利用により可視化した。
ELISAプレートアッセイを用いて、LBP蛋白質のLDLへの結合に影響を与え得る薬剤をスクリーニングした。例えば、LBP−1及びヒトのLBP−3蛋白質配列由来のペプチド(それぞれ、BHF−1及びBHF−2)を合成して、LDLの組換えLBP−1及びLBP−2(この形式)への結合を減ずることが示されている。これらの結果は、ACEアッセイにより得られたものと一致した。
実施例12:LBP上のLDL結合部位をブロックするためのLBPに対するヒト化抗体の投与
この実施例は、動脈のLBP分子上のLDL結合部位をブロックするための、LBP−1、LBP−2又はLBP−3に対するヒト化抗体の患者への投与を説明する。マウスモノクローナル抗体を、組換えDNA技術によってヒト化し、当業者に公知の標準的手順(Berkower,I.,Curr.Opin.Biotechnol.7:622-628(1996);Ramharayan及びSkaletsky,Am.Biotechnol.Lab 13:26-28(1995))によって、LBP及び/又はLBP上のLDL結合部位に対して生成した。対応するFab断片も又、Goding,J.W.,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,New York,NY(1986)に記載されたようにして製造する。これらの抗体を、十分な量で(即ち、1日当たり1〜10mg/kg)、LBP分子上のLDL結合部位をブロックするように非経口的に投与する。これは、LDLの酸化を促進するのに必要とされる動脈によるLDLの不可逆的取込みを予防する。
実施例13:LDLの調製
この実施例は、LDLの調製を説明する。LDLを、ノルモ脂血症の(normolipemic)ドナーの血漿から調製した(Chang等,Arterioscler.Thromb.12:1088-1098(1992))。100mlの全血液を100mM EDTAナトリウムを含む管に入れた。血漿を、赤血球から低速遠心分離(2,000g;30分間;4℃)により調製した。血漿の密度を、KBr溶液を用いて1.025g/mlに調節して、18〜20時間にわたって、100,000×gで、12℃で遠心分離した。超低密度リポ蛋白質(VLDL)を、パスツールピペットを用いて遠心管の上部から取り出した。浮遊物(infranate)の密度を、KBr溶液を用いて1.050g/mlまで高め、22〜24時間、100,000×gで、12℃で遠心分離した。LDLを、遠心管の上部からパスツールピペットチップでの吸い出しにより取り出した。このLDL標品の純度を、ヒトLDL、ヒトHDL、ヒト免疫グロブリン及びヒトアルブミンに対する抗体に対するオクタロニー二重免疫拡散法によりチェックした。KBrをLDL溶液から、1mM EDTA及び10μMブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)(後者は、LDLの酸化を防止する)を含む0.9%塩溶液、pH9.0に対する透析(1L、×2,≒16時間)により除去した。透析の後に、LDL蛋白質をローリー法(Lowry等,J.Biol.Chem.193:265-275(1951))によって測定し、このLDLを、使用まで4℃で貯蔵した。LDL標品は、最長で4〜6週間保存した。
実施例14:HDLの調製
この実施例は、HDLの調製を説明する。HDLをノルモ脂血症のドナーの血漿から調製した。100mlの全血液を、100mM EDTA二ナトリウムを含む管に入れ、血漿を遠心分離(2000g;30分間;4℃)によって集めた。次いで、血漿中に存在するアポリポ蛋白質B含有リポ蛋白質を、ヘパリンナトリウム(5,000単位/ml)及びMnCl2(1M)の順次的添加(それぞれ、200単位/ml及び0.46Mの終濃度まで)によって沈殿させた(Warnick及びAlbers,J.Lipid Res.19:65-76(1978))。次いで、試料を遠心分離した(2000g;1時間;4℃)。上清を集めて、密度を、固体のKBrをゆっくり加えることにより1.21g/mlに調節した。HDLを、超遠心分離(100,000g;>46時間;12℃)により分離した。このHDL標品の純度を、ヒトHDL、ヒトLDL、ヒト免疫グロブリン及びヒトアルブミンに対する抗体を用いるオクタロニー二重免疫拡散試験により評価した。HDL試料を、塩溶液pH9.0/1mM EDTA/10μM BHT(4L;24時間/4℃)に対して透析し、全蛋白質をローリーの蛋白質アッセイ(Lowry等,J.Biol.Chem.193:265-275(1951))によって測定した。HDLを、使用まで4℃で貯蔵した。HDL標品は、最長で2週間保存した。
実施例15:BHF−1の合成
この実施例は、BHF−1、ヒト又はウサギのLBP−1の断片(アミノ酸残基14〜33を含む)の合成を説明する。BHF−1を、Applied Biosystems Model 430Aペプチドシンセサイザー(標準的T−BocNMP化学サイクルを使用)を用いて合成した。BHF−1の配列は、下記の通りである:
val-asp-val-asp-glu-tyr-asp-glu-asn-lys-phe-val-asp-glu-glu-asp-gly-gly-asp-gly(SEQ ID NO:9)
合成後、このペプチドを、フッ化水素酸/アニソール(10/1 v/v)により10℃、30分間で開裂させ、次いで、0℃で30分間インキュベートした。次いで、BHF−1を沈殿させて3回洗った(冷ジエチルエーテル使用)。アミノ酸カップリングをニンヒドリン試験(>99%)によりモニターした。
このBHF−1ペプチドを、均質になるまで、逆相Vydac C4カラム(2.24×25cm)にて、直線的勾配分離(2〜98%B;60分間)と9ml/分の流量を用いて、高性能液体クロマトグラフィーにより精製した。緩衝液Aは、0.1%のトリフルオロ酢酸(TFA)/Milli Q水よりなり、緩衝液Bは、0.085%TFA/80%アセトニトリルよりなった。この勾配を、室温で流し、吸光度を210及び277nmにてモニターした。
高速原子衝撃質量分析は、プロトン化分子イオンピーク(M+H)+を、m/z=2290.2に与え、これは、計算値とよく一致した。アミノ酸分析において、ペプチド中の比較的多い各アミノ酸についての実験値は、理論値とよく一致した。凍結乾燥したペプチドを−20℃で貯蔵した。
実施例16:LDLとLBPとの間の結合を阻害する薬剤のイン・ビトロスクリーニング
この実施例は、LDLとLBPとの間の結合を阻害する薬剤のイン・ビトロスクリーニングを説明する。
薬剤であることについての候補のポリペプチドを選択する(例えば、LBP−1、LBP−2、LBP−3、BHF−1又は任意の他のポリペプチド)。LDLのLBPへの結合をイン・ビトロで阻害するポリペプチドの最短の断片を決定する。ペプチドを、ここに記載の標準的技術によって合成する。阻害アッセイを、スクリーニングのための標準的ELISA技術を用いて行い、ここに記載のようにアフィニティー同時電気泳動(ACE)アッセイを行ってELISAの結果を確認した。短いペプチド(例えば、2量体〜20量体)を、候補のポリペプチドの配列を横切って構築する(該配列の化学的特性は、それらをありそうなLDL結合部位例えば酸性領域にする)。一層短い長さのこれらのペプチドのLDLの結合及び培養哺乳動物細胞に対する結合を阻害する能力を試験する。例えば、このペプチドの、LBP遺伝子を発現するようにトランスフェクトされた哺乳動物細胞におけるLDL結合の阻害に対する効果を試験する。インヒビターとして同定されたこれらのペプチドの各々を、LBP−1、LBP−2及びLBP−3の各々を用いて試験して、単一のインヒビターがすべての3つのLBPに対して作用するかどうかを測定する。
一度最小活性配列が決定されれば、このペプチドの主鎖を、ここに記載のように、蛋白質分解を阻止するように改変する。例えば、改変を、カルボニルの代わりにスルホキシドを代用することにより、ペプチド結合を逆にすることにより、カルボニル基の代わりにメチレンを代用することにより、又は他の類似の標準的方法によって達成する。Spatola,A.F.,「Peptide Backbone Modifications:A Structure-Activity Analysis of Peptides Containing Amide Bond Surrogates,Conformational Constraints,and Related Backbone Replacements,」{Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides and Proteins,Vol.7,p.267-357,B.Weinstein(編),Marcel Dekker,Inc.,New York(1983)}を参照されたい。これらのアナログのLDLのLBPへの結合をイン・ビトロで阻害する能力を、ELISA及びACEアッセイにより、上記の天然のペプチドに対するのと同じ仕方で試験する。
実施例17:培養哺乳動物細胞を用いるLDLとLPBとの間の結合を阻害する薬剤のイン・ビトロスクリーニング
この実施例は、ACEアッセイ及びELISA等のイン・ビトロ試験によりLDLとLBPとの間の結合の潜在的インヒビターであることが示された薬剤の細胞ベースのイン・ビトロスクリーニングを説明する。
組換え遺伝子構築物の発現のために一般に用いられる哺乳動物細胞例えば293細胞を用いて、LBPを細胞表面で発現する細胞株を開発する。これは、LBPのオープンリーディングフレーム(ORF)を哺乳動物用発現プラスミドベクターpDisplay(Invitrogen,CA,Carlsbad在)(これは、細胞表面上に関心ある遺伝子を発現するようにデザインされている)中にサブクローン化することにより行う。LBPを生成するために哺乳動物細胞を利用することは、機能的に活性なネイティブなコンホメーションでのそれらの発現を与える。それ故、LBPの表面発現を有する安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞は、個々に又は組み合わせて、細胞培養中のLDL結合をブロックするインヒビターをアッセイし及びスクリーニングするのに並びにこれらの化合物の細胞毒性を評価するのに特に適している。
特に、LBPORFは、cDNAテンプレートから、Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer)及び適当なプライマーを用いて、PCR(Perkin Elmer,CA,Foster City在)により増幅される。これらの増幅されたLBPORFを、アガロースゲル電気泳動により精製し、ゲルスライスからBio-Rad DNA精製キット(Bio-Rad,CA,Hercules在)を用いて抽出する。次いで、これらの精製したDNAを、制限酵素BglII及びSalI(New England Biolabs,MA,Beverly在)で切断して粘着末端を生成し、上記のアガロースゲル電気泳動とDNA抽出により再精製する。次いで、これらのLBPORFを、哺乳動物用発現ベクターpDisplay(Invitrogen)のBglII/SalI部位に、ライゲーションによりサブクローン化する。組換えプラスミドを、大腸菌株TOP10(Invitrogen)又はDH5α(Life Technologics,NY,Grand Island在)におけるトランスフォーメーションにより樹立する。組換えpDisplay/LBPプラスミドDNAを、大腸菌一晩培養物からBio-Radプラスミドミニプレプキットを用いて単離し、BglII/SalIで切断して、アガロースゲル電気泳動により分析する。上首尾にトランスフォームされたクローン中のLBPORFを、自動化ジデオキシDNA配列決定により確認する。ヒトの腎臓の293細胞をトランスフェクトするために、1〜2μgのDNAを、6μlのリポフェクタミン試薬(Life Technologies)と混合して、Life Technologiesのプロトコールに記載されたように細胞とインキュベートする。トランスフェクトされた細胞におけるLBP発現を、トランスフェクションの48時間後に得られた細胞抽出物のウエスタンブロット分析により確認する。安定にトランスフェクトされた293細胞を選択するために、抗生物質G418(Life Technologies)を成長培地に800μg/mlの濃度で加える。G418に耐性のコロニーをウエスタンブロットにより組換えLBP発現について試験し、LBPを発現している組換えクローンを拡大してLDL結合についてアッセイし、化合物をLDL結合を阻害するそれらの能力について試験するのに用いる。
実施例18:LDLとLBPとの間の結合を阻害する薬剤のイン・ビボスクリーニング
この実施例は、イン・ビトロ試験によりLDLとLBPとの間の結合の有望な候補のインヒビターであることが示された薬剤のイン・ビボスクリーニングを説明する。
治癒しつつあるバルーンカテーテルにより内皮剥奪されたウサギ大動脈の動脈病変モデルにおいて、イン・ビボ阻害活性を先ず試験する(Roberts等,J.Lipid Res.24:1160-1167(1983);Chang等,Arterioscler.Thomb.12:1088-1098(1992))。このモデルは、ヒトのアテローム性動脈硬化症病変の優れた類似物であることが示された。各候補のインヒビターを、5〜10匹のバルーン処理したウサギで試験すると同時に、同数のウサギに対照用ペプチド又は偽薬を与える。大動脈の内皮剥奪の4週間後に、再内皮形成(治癒)が部分的に完了するときに、これらのペプチド及びアナログの毎日の非経口投与(静脈又は皮下投与)又は胃内投与を体重1kg当たり10mgの初期濃度で開始し、結果に応じて最大100mg/kg以内で増減させる。30分後に、一塊の125I(又は99mTc)標識したLDLの静脈注射をして候補のインヒビターの治癒しつつある動脈病変におけるLDL封鎖を阻止する能力を短期間の研究で試験する。もし125I−LDLを用いるならば、前に記載されたように(Roberts等,J.Lipid Res.24:1160-1167(1983);Chang等,Arterioscler.Thomb.12:1088-1098(1992))、これらの動物を8〜24時間後に犠牲にして大動脈を切り出し、洗浄して定量的オートラジオグラフィーにかける。もし99mTc−LDLを用いるならば、分析は、前に記載されたように(Lee及びLees,Syndromes of Atherosclerosis,in Fuster,編、Futura Publishing Co.,NY,Armonk,p385-401(1996))、2〜24時間目に、生きている麻酔した動物の外部ガンマーカメライメージングにより、その後、犠牲にして大動脈を切り出してそのイメージングを行う。試験の終了の直前に、これらの動物に、CBC、肝臓酵素及び尿検査を含む標準的な毒性試験を施す。
最も有効で且つ最も低毒性の化合物を、次いで、2%コレステロール食餌を与えられたウサギの短期間の研究で試験する(Schwenke及びCarew,Arteriosclerosis 9:895-907(1989))。各候補のインヒビターを5〜10匹のウサギで試験すると同時に、同数のウサギに対照用ペプチド又は偽薬を投与する。1日当たり1投与以上の候補のインヒビター又は偽薬を最長で2週間にわたって動物に与える。毎日の投与回数は、投与経路によって決定する。もし活性な薬物又は偽薬を非経口投与するならば、それらを、毎日1〜3回与え、2%コレステロール食餌を継続する。もし薬物又は偽薬を経口投与するならば、それらを、2%コレステロール食餌と混合する。Schwenke及びCarew(Arteriosclerosis 9:895-907(1989))は、ウサギ大動脈の病変を受けやすい領域内のLDL濃度が、2%コレステロール食餌を16日間与えたウサギにおいて、正常の22倍に増大すること及び増大したLDL含量が初期アテローム性動脈硬化症の組織学的証拠に先行することを示した。それ故に、候補のインヒビターの効果の分析を、コレステロール給餌の開始から2週間後に、125I−LDLを注射し、その後に8〜24時間循環させ、次いで、試験動物及び対照用動物の両方の切り出した大動脈について定量的オートラジオグラフィーを行うことによって試験する。もし適当であれば、大動脈のコレステロール含量の定量も行う(Schwenke及びCarew,Arteriosclerosis 9:895-907(1989;Schwenke及びCarew,Arteriosclerosis 9:908-918(1989))。
上記の手順は、最も有望な候補のインヒビター、並びに最良の経路及びそれらの投与回数を同定する。こうして同定されたインヒビターを、次いで、コレステロール給餌されたウサギの長期間の研究において試験する。これらの試験を、短期間のコレステロール給餌研究と同じ方法で行うが、但し、インヒビターの有効性を、コレステロール給餌の開始後の125I−LDLの一層長い間隔での注射により試験し、大動脈の病変を受けやすい領域をアテローム性動脈硬化症の証拠について組織学的に調べる。試験期間は、2、4及び6ヶ月である。主要な動脈を、アテローム性動脈硬化症の証拠及び程度について、肉眼的に及び組織学的に調べる。もし必要であれば、他の許容し得る動物モデル例えばアテローム性動脈硬化症にかかり易い霊長類(Williams等,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.15:827-836(1995))及び/又はWatanabeウサギを、短期及び長期のコレステロール給餌を用いて試験する。
実施例19:バルーン処理で内皮剥奪したウサギ大動脈における放射性標識したLDLの蓄積の、LBP蛋白質に対する活性な免疫の誘導によるイン・ビボでの阻止
この実施例は、LBP蛋白質に対する免疫の誘導が、バルーン処理により内皮剥奪されたウサギの大動脈のアテローム性動脈硬化症モデルにおいて、放射性標識したLDLの蓄積に対して有する効果を説明する。
免疫を雄のニュージーランド白ウサギ(Hazelton Research Products,PA,Denver在)において、次のようにして誘導した:精製したヒト組換えLBP−2又はBHF−1ペプチド(1ml;1mg)とRIBIアジュバント(RIBI Immuno ChemResearch,Inc.,MT,Hamilton在)との混合物を、ウサギの背側の胸部及び腹部領域に沿って2〜5カ所に皮下注射した。血液を静脈穿刺により、1日目(免疫化前)、35日目、63日目及び91日目に採血した。追加抗原を、28日目(500μg;SC)、56日目(250μg;SC)及び84日目(125μg;SC)に注射した。
これらのウサギの力価を、一連の希釈物により、ELISAプレート形式を用いて評価した。免疫化前血清を同時に評価した。LBP蛋白質又はペプチドの第三回目の追加免疫の後に、力価は、156pgのELISAプレート上の検出可能な比色応答にて最大レベルに達した。力価は、30分以内に対照を超える0.5の吸光度の読みを生じる抗体の最大希釈として定義される。ポリクローナル抗体の特異性を、実施例6に記載のようにしてウエスタンブロット分析を用いて示した。
93日目に、免疫化したウサギ及び対照用のウサギの腹大動脈を、Fogarty4番塞栓摘出用カテーテル(Chang等,Arteriosclerosis and Thrombosis 12:1088-1098(1992))を用いて内皮剥奪した。バルーン処理の4週間後に、ウサギに一塊の125I標識したLDLを注射した(1ml;i.v.)。血液試料を、1時間間隔で、注射後8時間にわたって及び24時間にて採取した。血液試料を30分間にわたって2000rpm(40℃)で遠心分離し、血清中に存在するすべての活性を、ガンマーカウンターを用いて測定した。全TCA沈降性のカウントを、TCAをこの血清に10%の終濃度まで加え、その後4℃で10分間インキュベートすることにより測定した。次いで、血清試料を遠心分離し(2000rpm;30分間;40℃)、上清に存在する全活性を測定した。TCA沈降性カウントを減算により計算した(全可溶性カウント−TCA沈殿後の上清中に存在するカウント)。抗体力価の測定のための血液試料を、放射性標識したLDLの注射前に集めた。
24時間後に、これらのウサギに、5%エバンス青染料を静脈注射して15分間循環させた。内皮の被覆が存在しない大動脈の領域は、青く染まるが、内皮による被覆が残っている領域は染まらない。インキュベーション期間の最後に、これらのウサギを麻酔して腹部及び胸部の大動脈を切開してすすぎ、一晩10%TCA中で室温で固定した。これらの大動脈を、次いで、生理的塩溶液で徹底的にすすぎ、重さを量り、計数し、吸い取って乾燥させ、内皮剥奪したウサギの腹大動脈中の放射性標識したLDL蓄積のパターンを可視化するためにX線フィルム上に置いた。
組換えのヒトLBP−2又はBHF−1ペプチドに対するウサギの免疫化は、バルーン処理した内皮剥奪した腹大動脈中の放射性標識したLDL蓄積のパターンを変化させた。投薬量及び内皮再生パーセントを補正すると、免疫化したバルーン処理したウサギは、免疫化してないバルーン処理したウサギに比較して一層低い放射性標識LDLの蓄積を有した。これらの結果は、LBPに対する活性な免疫化が傷害された動脈壁内のLDLの蓄積を変えることのできる有効な手段を提供することを示している。
実施例20:ヒトにおけるLDLとLBPとの間の結合を阻止する薬剤のスクリーニング
ヒトの研究を、新たな薬物の安全性(フェーズI)、効力(フェーズII)及び他の治療剤と比較しての効力(フェーズIII)の試験に関する標準的FDAプロトコールに従って行う。インフォームドコンセント後に研究に登録された患者は、18〜70歳である。妊娠中若しくは妊娠しそうな女性又は初期アテローム性動脈硬化症以外の病気例えば癌、肝臓病若しくは糖尿病を有する患者は、除外する。FDAのフェーズII及びフェーズIII試験における研究のために選択する患者は、標準的技術例えば超音波及び/又は血管造影法により以前に記録されたアテローム性動脈硬化症を有するか、又は少なくとも一人の記録されたアテローム性動脈硬化症を有する一親等の親類を有することによりアテローム性動脈硬化症の高度の危険にあることが知られている患者である。患者自身は、正常又は異常な血漿脂質を有する。最初の試験には、活性薬物について20〜50人の患者が、偽薬について20〜50人の患者(同じ年齢、性別及びアテローム青銅脈硬化症の状態を有する)が含まれる。患者数を、予め、統計的有意性に必要な数により決定する。インヒビターの効力についての終点には、高い危険にある患者並びに既知の頸動脈又は冠状動脈疾患を有する患者の頸動脈の厚みの超音波測定;アテローム性動脈硬化事象;アテローム性動脈硬化症による死亡;及びすべての患者におけるすべての原因による死亡が含まれる。Stadler(Med.and Biol.22:25-34(1996))による非侵襲的分析(超音波による頸動脈の厚みの測定)を、6〜12ヶ月の間隔で3年間にわたって行う。アテローム性動脈硬化事象及び死亡並びにすべての原因による死亡を、3年目に表にする。
FDAフェーズI試験における薬物の経口投与量は、0.01〜10g/日にわたり、動物研究の結果により決定する(kgベースにて推定する)。フェーズIの研究から得られたデータに基づいて、投与量の範囲及び回数をフェーズII及びIIIの試験において狭める。もし薬物の非経口投与が、動物研究により、唯一の有効な方法であると決定されたならば、ヒト患者における非経口投与を注射により並びに経皮的経路及び鼻吸入経路により試験する。非経口薬物の試験は、経口投与についてのものと同じアウトラインに従う。
こうして、ヒトについての最適な治療スケジュール及び投薬量を確立する。
実施例21:アテローム性動脈硬化症を有する個人のBHF−1による治療
この実施例は、アテローム性動脈硬化症を有する個人を、その個人における動脈に結合したLDLのレベルを低下させるようにLBP断片例えばBHF−1を用いて治療する方法を説明する。BHF−1をここに記載したようにして得る。そのBHF−1を動物に体重1kg当たり0.5〜10mgの濃度で一塊として又は一回の注射にて静脈投与する。かかる投与を、アテローム性動脈硬化症の徴候の発生又は進行を防止するために無期限に繰り返す(丁度、現在、コレステロール低下剤を用いて行われているように)。安定な患者を、年に2回調べて任意のアテローム性動脈硬化症疾患の程度を物理的検査及び非侵襲的研究例えば頸動脈の厚み、主要な動脈の超音波及び/又はガンマーカメライメージングにより評価して、アテローム性動脈硬化症病変が存在するかどうか及び以前に存在した場合には後戻り又は進行しているかどうかを測定する。
当業者は、ここに記載した発明の特定の具体例の多くの同等物を日常的実験を用いて確認することができるであろう。これらの及び他のすべての同等物は、後記の請求の範囲に包含されるべきものである。
Claims (63)
- 下記よりなる群から選択するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸:
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7又はSEQ ID NO:8のアミノ酸配列;
低密度リポ蛋白質(LDL)に結合し且つSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7又はSEQ ID NO:8の配列の一又は数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入により得られるアミノ酸配列;及び
LDLに結合し且つSEQ ID NO:9、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23又はSEQ ID NO:29の配列を含むアミノ酸配列。 - 上記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、又はSEQ ID NO:8の配列を含む、請求項1に記載の核酸。
- 上記ポリペプチドが、SEQ ID NO:2の配列を含む、請求項2に記載の核酸。
- 上記ポリペプチドが、SEQ ID NO:7の配列を含む、請求項2に記載の核酸。
- 上記アミノ酸配列が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、又はSEQ ID NO:8の配列の一又は数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入により得られる、請求項1に記載の核酸。
- 上記アミノ酸配列が、SEQ ID NO:2の配列の一又は数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入により得られる、請求項5に記載の核酸。
- 上記アミノ酸配列が、SEQ ID NO:7の配列の一又は数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入により得られる、請求項5に記載の核酸。
- 上記アミノ酸配列が、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23又はSEQ ID NO:29の配列を含む、請求項1に記載の核酸。
- 上記ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、又はSEQ ID NO:17のヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の核酸。
- 請求項1〜9いずれか1項に記載の核酸を含む組換えベクター。
- 請求項10に記載の組換えベクターを含む細胞。
- ポリペプチドの製造方法であって、請求項11に記載の細胞を該ポリペプチドの発現を与える条件下で培養することを含む当該製造方法。
- 下記よりなる群から選択するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド:
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7又はSEQ ID NO:8のアミノ酸配列;
LDLに結合し且つSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7又はSEQ ID NO:8の配列の一又は数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入により得られるアミノ酸配列;及び
LDLに結合し且つSEQ ID NO:9、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23又はSEQ ID NO:29の配列を含むアミノ酸配列。 - 上記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、又はSEQ ID NO:8の配列を含む、請求項13に記載のポリペプチド。
- 上記ポリペプチドが、SEQ ID NO:2の配列を含む、請求項14に記載のポリペプチド。
- 上記ポリペプチドが、SEQ ID NO:7の配列を含む、請求項14に記載のポリペプチド。
- 上記アミノ酸配列が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7又はSEQ ID NO:8の配列の一又は数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入により得られる、請求項13に記載のポリペプチド。
- 上記アミノ酸配列が、SEQ ID NO:2の配列の一又は数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入により得られる、請求項17に記載のポリペプチド。
- 上記アミノ酸配列が、SEQ ID NO:7の配列の一又は数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入により得られる、請求項17に記載のポリペプチド。
- 上記アミノ酸配列が、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23又はSEQ ID NO:29の配列を含む、請求項13に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7又はSEQ ID NO:8の配列よりなるポリペプチドに特異的に結合する、抗体又はその断片。
- 上記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:2の配列よりなるポリペプチドに特異的に結合する、請求項21の抗体又はその断片。
- 上記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:7の配列よりなるポリペプチドに特異的に結合する、請求項21の抗体又はその断片。
- Fab断片、Fab’断片及びF(ab’)2断片よりなる群から選択する抗体断片を含む、請求項21〜23いずれか1項に記載の抗体又はその断片。
- F(v)断片、重鎖モノマー、重鎖ダイマー、重鎖トリマー、軽鎖モノマー、軽鎖ダイマー、軽鎖トリマー、及び一本の重鎖と一本の軽鎖よりなるダイマーよりなる群から選択する抗体断片を含む、請求項21〜23いずれか1項に記載の抗体又はその断片。
- モノクローナル抗体である抗体を含む、請求項21〜23いずれか1項に記載の抗体又はその断片。
- 上記抗体又はその断片が、ヒト化抗体又はその断片である、請求項21〜23いずれか1項に記載の抗体又はその断片。
- 上記抗体又はその断片が、キメラ抗体又はその断片である、請求項21〜23いずれか1項に記載の抗体又はその断片。
- 上記キメラ抗体又はその断片が、ヒト抗体に由来する定常領域及びマウス抗体に由来する可変領域を含む、請求項28に記載の抗体又はその断片。
- 上記抗体又はその断片が、ヒト抗体若しくは抗体又はその断片である、請求項21〜23いずれか1項に記載の抗体又はその断片。
- 上記抗体又はその断片が、LDLのポリペプチドへの結合をブロックする、請求項21〜30いずれか1項に記載の抗体又はその断片。
- 上記抗体又はその断片が、標識を含む、請求項21〜31いずれか1項に記載の抗体又はその断片。
- 上記標識が、放射性標識である、請求項32に記載の抗体又はその断片。
- 上記抗体又はその断片が、テクネチウム結合性リガンドを含む、請求項21〜31いずれか1項に記載の抗体又はその断片。
- 上記抗体又はその断片が、ガドリニウム結合性キレーターを含む、請求項21〜31いずれか1項に記載の抗体又はその断片。
- 上記ガドリニウム結合性キレーターが、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)である、請求項35に記載の抗体又はその断片。
- SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7又はSEQ ID NO:8の配列よりなるポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体の調製物。
- 上記抗体が、LDLのポリペプチドへの結合をブロックする、請求項37に記載の調製物。
- 請求項21〜36いずれか1項に記載の抗体又はその断片及び製薬上許容しうるキャリアーを含む医薬組成物。
- 請求項39に記載の抗体を産生する細胞株。
- ハイブリドーマである、請求項40に記載の細胞株。
- LBP−1、LBP−2又はLBP−3の代謝又は構造を調節する候補の薬剤を同定する方法であって、下記を含む当該方法:
候補の薬剤とLBP−1、LBP−2又はLBP−3ポリペプチドをイン・ビトロで接触させ;そして
候補の薬剤のLBP−1、LBP−2又はLBP−3の代謝又は構造に対する効果を評価する:
但し、上記LBP−1、LBP−2又はLBP−3ポリペプチドは、下記よりなる群から選択するアミノ酸配列を含むポリペプチドである:
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7又はSEQ ID NO:8のアミノ酸配列;
低密度リポ蛋白質(LDL)に結合し且つSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7又はSEQ ID NO:8の配列の一又は数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入により得られるアミノ酸配列;及び
LDLに結合し且つSEQ ID NO:9、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23又はSEQ ID NO:29の配列を含むアミノ酸配列。 - 上記LBP−1、LBP−2又はLBP−3ポリペプチド、LBP−1、LBP−2又はLBP−3結合性分子、及び候補の薬剤をイン・ビトロで接触させ;そして
LBP−1、LBP−2又はLBP−3ポリペプチド及びLBP−1、LBP−2又はLBP−3結合性分子を含む複合体の形成を測定する
ことを含み、該候補の薬剤の非存在下と比較しての該候補の薬剤の存在下での該複合体の形成の減少が、該候補の薬剤がLBP−1、LBP−2又はLBP−3のLBP−1、LBP−2又はLBP−3結合性分子への結合を阻止することを示す、請求項42に記載の方法。 - 上記候補の薬剤のLBP−1、LBP−2又はLBP−3ポリペプチドへの結合を測定し、それにより、LBP−1、LBP−2又はLBP−3ポリペプチドに結合する候補の薬剤を同定する
ことを含む、請求項42に記載の方法。 - 上記候補の薬剤が、LBP−1、LBP−2又はLBP−3の断片、類似体又は模倣物である、請求項42〜44いずれか1項に記載の方法。
- 上記候補の薬剤が、核酸、抗体、代謝産物、炭水化物、糖蛋白質、ペプチド又は非ペプチド模倣物である、請求項42〜44いずれか1項に記載の方法。
- LBP−1、LBP−2又はLBP−3結合性分子が、LDLである、請求項43に記載の方法。
- 上記LDLが、天然LDLである、請求項47に記載の方法。
- 上記LDLが、メチル化LDL又は酸化LDLである、請求項47に記載の方法。
- 上記LBP−1、LBP−2又はLBP−3結合性分子が、細胞外マトリクス成分である、請求項43に記載の方法。
- 上記細胞外マトリクス成分が、プロテオグリカンである、請求項50に記載の方法。
- 上記候補の薬剤の、LBP−1、LBP−2又はLBP−3の一次、二次又は三次構造に対する効果を評価することを含む、請求項42に記載の方法。
- 上記候補の薬剤の、LBP−1、LBP−2又はLBP−3のコンホメーション折畳みに対する効果を評価することを含む、請求項42に記載の方法。
- 上記候補の薬剤の、LBP−1、LBP−2又はLBP−3の発現に対する効果を評価することを含む、請求項42に記載の方法。
- 上記候補の薬剤の、LBP−1、LBP−2又はLBP−3の放出に対する効果を評価することを含む、請求項42に記載の方法。
- 上記候補の薬剤の、LBP−1、LBP−2又はLBP−3の分布に対する効果を評価することを含む、請求項42に記載の方法。
- アテローム性動脈硬化症の治療に利用するための、請求項13〜20いずれか1項に記載のポリペプチド。
- アテローム性動脈硬化症の診断に利用するための、請求項13〜20いずれか1項に記載のポリペプチド。
- 免疫化に利用するための、請求項13〜20いずれか1項に記載のポリペプチド。
- アテローム性動脈硬化症の治療における利用のための、請求項21〜38いずれか1項に記載の抗体若しくはその断片又はポリクローナル抗体の調製物。
- アテローム性動脈硬化症の診断における利用のための、請求項21〜38いずれか1項に記載の抗体若しくはその断片又はポリクローナル抗体の調製物。
- 請求項61に記載の抗体又はその断片であって、診断が、下記を含む、当該抗体又はその断片:
患者に、この抗体又はその断片を、その抗体又はその断片とアテローム性動脈硬化の病巣に存在する蛋白質との相互作用により標識された蛋白質が生成する条件下で投与し;
標識された蛋白質の位置又は量を、アテローム性動脈硬化の病巣の存在を検出するように画像化を行なうことにより測定する。 - 上記画像化を、磁気共鳴画像化、ガンマカメラ画像化、単光子射出コンピューター断層撮影画像化及び陽電子射出断層撮影よりなる群から選択する、請求項62に記載の抗体又はその断片。
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