JP2001506983A - 新規な低密度リポ蛋白質結合性蛋白質並びにアテローム性動脈硬化症の診断及び治療におけるそれらの利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ネイティブな及びメチル化したＬＤＬ(低密度リポ蛋白質)に結合し得る新規なポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、単離されたＬＢＰ(ＬＤＬ結合性蛋白質)と呼ばれるそれらのポリペプチド、及び生物学的に活性なそれらの断片及びアナログを記載する。動物がアテローム性動脈硬化症の危険にあるかどうかを測定する方法、アテローム性動脈硬化症の治療において使用する薬剤を評価する方法、アテローム性動脈硬化症の治療方法、及びＬＢＰの構造又は代謝に異常を有する細胞の治療方法も又、記載する。医薬組成物及びワクチン組成物も又、提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な低密度リポ蛋白質結合性蛋白質並びに アテローム性動脈硬化症の診断及び治療におけるそれらの利用 発明の分野 この出願は、１９９６年１１月２７日出願の米国仮出願第６０／０３１，９３ ０号及び１９９７年６月３日出願の米国仮出願第６０／０４８，５４７号の利益 を請求する。 この発明は、低密度リポ蛋白質(ＬＤＬ)に結合する新規なポリペプチド(ＬＢ Ｐ)、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにアテローム 性動脈硬化症の治療、診断及び治療剤に関係する。 発明の背景 アテローム性硬化症は、心臓発作の主要な原因である。米国、欧州及び日本に おける全死亡の約５０％がアテローム性動脈硬化症によると報告されている。動 脈壁内のアテローム性硬化病変がアテローム性動脈硬化症の特徴を与える。コレ ステリルエステル(ＣＥ)が、これらのアテローム性病変中に存在する。低密度リ ポ蛋白質(ＬＤＬ)は、血漿ＣＥの主要なキャリアーであることが示されており、 ＣＥをアテローム性病変に入れる因子として関係してきた。 散在性の脂質充満マクロファージ(泡沫細胞と呼ばれる)の群は、アテローム性 動脈硬化症の最初の可視的徴候であり、Ｉ型病変として記載される。これらのマ クロファージは、ＬＤＬに由来するＣＥを含むことが報告されている。これらの マクロファージは、酸化されたＬＤＬを認識するが、ネイティブなＬＤＬを認識 せず、酸化されたＬＤＬのファゴサイトーシスにより泡沫細胞になる。一層大き い一層組織化された泡沫細胞の堆積、脂肪性の縞は、第II型病変に相当する。こ れらの病変は、更に、プラークと呼ばれる複合病変に発達し、それらは動脈内の 血流の妨げとなり得る。 ＬＤＬの動脈内の蓄積は、機能的に変化した内皮細胞の動脈壁内の存在に依存 すると広く信じられている。ＬＤＬ(ネイティブなＬＤＬ及びメチル化したＬＤ Ｌの両方)が大動脈の病変内の再生する内皮の島の縁にのみ集中して不可逆的に 蓄積し、該縁には機能的に変化した内皮細胞が存在するがこれらの島の中心には 存在せずそこでは内皮の再生が完了していることが、アテローム性動脈硬化症の モデル動物において報告されている。同様に、ＬＤＬは、ヒトのアテローム性動 脈硬化症病変に蓄積する。ＬＤＬが動脈の病変内に集中して不可逆的に蓄積する 機構は、現在まで分かっていない。 発明の要約 ＬＤＬに結合するポリペプチドを提供することは、この発明の目的である。 動物がアテローム性動脈硬化症の危険にあるかどうかを測定する方法を提供す ることは、この発明の更に別の目的である。 アテローム性動脈硬化症の治療において用いるための薬剤を評価する方法を提 供することは、この発明の更に別の目的である。 アテローム性動脈硬化症の治療方法を提供することは、この発明の更に別の目 的である。 この発明の更に別の目的は、ＬＢＰ(低密度リポ蛋白質結合性蛋白質)遺伝子及 び／又はポリペプチド、又はこれらの断片、アナログ及び変異物を利用して、ア テローム性動脈硬化症の治療、診断及び／又は治療剤の同定を助成することであ る。 一面において、この発明は、SEQ ID NO:１、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:３、SE Q ID NO:４、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、SEQ ID NO:７、SEQ ID NO:８又はSE Q ID NO:９に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオ チドを含む単離されたポリヌクレオチド；又は上記のポリヌクレオチドの何れか にハイブリダイズすることができる及び少なくとも約９５％同一であるポリヌク レオチド(コードされるポリペプチドは、ＬＤＬに結合することができる)；又は 上記のポリヌクレオチドの何れかの生物学的に活性な断片(コードされるポリペ プチドは、ＬＤＬに結合することができる)を特徴とする。 ある具体例において、このポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:１０、SEQ ID N O:１１、SEQ ID NO:１２、SEQ ID NO:１３、SEQ ID NO:１４、SEQ ID NO:１５、 SEQ ID NO:１６、SEQ ID NO:１７又はSEQ ID NO:１８に示した核酸配列を含む。 この発明の他の面は、SEQ ID NO:１、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:３、SEQ ID N O:４、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、SEQ ID NO:７、SEQ ID NO:８又はSEQ ID N O:９に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む単離されたポリペプチド ；又は上記のポリペプチドの何れかに少なくとも約９５％同一であるポリペプチ ド(このポリペプチドは、ＬＤＬに結合することができる)；又は上記のポリペプ チドの何れかの生物学的に活性な断片(この断片は、ＬＤＬに結合することがで きる)である。 この発明の他の面は、動物がアテローム性動脈硬化症の危険にあるかどうかを 測定する方法である。一の動物を準備する。ＬＢＰの代謝又は構造の面を、この 動物において評価する。ＬＢＰの代謝又は構造の面における異常は、アテローム 性動脈硬化症の危険にあるという診断となる。 この発明の他の面は、アテローム性動脈硬化症の治療において用いるための薬 剤を評価する方法である。一の薬剤を準備する。この薬剤を試験用の細胞、無細 胞系又は動物に治療上有効な量で投与する。この薬剤のＬＢＰの代謝又は構造の 面に対する効果を評価する。ＬＢＰの代謝又は構造の面における変化は、この薬 剤のアテローム性動脈硬化症の治療における有用性を示す。 この発明の他の面は、薬剤を、ＬＢＰポリペプチドの結合性分子(例えば、ネ イティブなＬＤＬ、改変したＬＤＬ例えばメチル化したＬＤＬ若しくは酸化した ＬＤＬ)又は動脈の細胞外マトリクス構造成分への結合を変える能力について評 価する方法である。一の薬剤を準備する。ＬＢＰポリペプチドを準備する。結合 性分子を準備する。この薬剤、ＬＢＰポリペプチド及び結合性分子を合わせる。 このＬＢＰポリペプチド及び結合性分子を含む複合体の形成を検出する。この薬 剤の存在下での複合体の形成における変化(この薬剤の不在時と比較しての変化) は、この薬剤がＬＢＰポリペプチドの結合分子への結合を変えることを示す。 この発明の他の面は、薬剤を、ＬＢＰポリペプチドに結合する能力について評 価する方法である。一の薬剤を準備する。ＬＢＰポリペプチドを準備する。この 薬剤をＬＢＰポリペプチドと接触させる。この薬剤のＬＢＰポリペプチドと結合 する能力を評価する。 この発明の他の面は、薬剤を、ＬＢＰ調節配列をコードする核酸に結合する能 力について評価する方法である。一の薬剤を準備する。ＬＢＰ調節配列をコード する核酸を準備する。この薬剤をこの核酸と接触させる。この薬剤のこの核酸に 結合する能力を評価する。 この発明の他の面は、動物におけるアテローム性動脈硬化症の治療方法である 。アテローム性動脈硬化症の治療の必要な動物を準備する。ＬＢＰの構造又は代 謝の面を変えることのできる薬剤を準備する。この薬剤をこの動物に、治療上有 効な量で、アテローム性動脈硬化症の治療が生じるように投与する。ある具体例 においては、この薬剤は、ＬＢＰポリペプチド例えばＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２若 しくはＬＢＰ−３又はこれらの生物学的に活性な断片若しくはアナログである。 ある具体例においては、この薬剤は、約１００、５０、３０、２０、１０、５、 ４、３又は２アミノ酸残基長以下のポリペプチドである。ある具体例において、 この薬剤は、少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、９０％、９５％又 は９８％の酸性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドである。 この発明の他の面は、アテローム性動脈硬化症の危険にある動物の治療方法で ある。アテローム性動脈硬化症の危険にある動物を準備する。ＬＢＰの構造又は 代謝の面を変えることのできる薬剤を準備する。この薬剤をこの動物に治療上有 効な量で、この動物の治療が生じるように投与する。 この発明の他の面は、ＬＢＰの構造又は代謝に以上を有する細胞を治療する方 法である。ＬＢＰの構造又は代謝に異常を有する細胞を準備する。ＬＢＰの構造 又は代謝の面を変えることのできる薬剤を準備する。この薬剤をこの細胞に治療 上有効な量で、この細胞の治療が生じるように投与する。 この発明の他の面は、動物におけるアテローム性動脈硬化症を治療するための 医薬組成物であって、治療上有効な量の薬剤(この薬剤は、アテローム性動脈硬 化症の治療を生じるようにその動物におけるＬＢＰの代謝又は構造の面を変える ことができる)及び製薬上許容し得るキャリアーを含む上記の医薬組成物である 。 この発明の他の面は、動物におけるアテローム性動脈硬化症を治療するための ワクチン組成物であって、治療上有効な量の薬剤(この薬剤は、アテローム性動 脈硬化症の治療を生じるようにその動物におけるＬＢＰの代謝又は構造の面を変 えることができる)及び製薬上許容し得るキャリアーを含む上記のワクチン組成 物。 この発明の他の面は、動物におけるアテローム性動脈硬化症病変の診断方法で ある。一の動物を準備する。ＬＢＰ例えばＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２又はＬＢＰ− ３に結合し得る標識した薬剤を準備する。この標識した薬剤をこの動物に、標識 されたＬＢＰを生じるようにこの標識した薬剤をＬＢＰと相互作用させる条件下 で投与する。この標識されたＬＢＰの局在性又は定量化を、イメージングにより 、この動物におけるアテローム性動脈硬化症病変の存在を診断するように測定す る。 この発明の他の面は、動物を、ＬＢＰ例えばＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２若しくは ＬＢＰ−３又はこれらの断片若しくはアナログに対して免疫化する方法である。 ＬＤＬを有する動物を準備する。ＬＢＰ又はその断片若しくはアナログをこの動 物に、このＬＢＰ又はその断片若しくはアナログに対するこの動物による抗体産 生を刺激するように投与して、ＬＢＰのＬＤＬへの結合を変える(例えば、減少 させ又は増大させる)。 この発明の他の面は、ＬＢＰポリペプチドの断片又はアナログの製造方法であ る(この断片又はアナログは、ネイティブなＬＤＬに結合する能力及び改変され たＬＤＬ例えばメチル化ＬＤＬ、酸化されたＬＤＬ、アセチル化されたＬＤＬ又 はシクロヘキサンジオン処理したＬＤＬに結合する能力を有する)。ＬＢＰポリ ペプチドを準備する。このＬＢＰポリペプチドの配列を変化させる。この変化さ せたＬＢＰポリペプチドを改変したＬＤＬ及びネイティブなＬＤＬに結合する能 力について試験する。 この発明の更に別の面は、ＬＢＰをコードするｃＤＮＡを単離する方法である 。ｃＤＮＡライブラリーを準備する。このｃＤＮＡライブラリーを、ネイティブ なＬＤＬ及び改変したＬＤＬ例えばメチル化ＬＤＬ又は酸化ＬＤＬに結合するポ リペプチドをコードするｃＤＮＡについてスクリーニングする。このポリペプチ ドをコードするｃＤＮＡを単離する(このｃＤＮＡは、ＬＢＰをコードする)。 本発明の上記の及びその他の特徴、目的及び利点は、下記の詳細な説明を図面 と合わせて読むことにより一層理解されるであろう。 図面の簡単な説明 図１は、ウサギのＬＢＰ−１のアミノ酸配列(SEQ ID NO:１)を描写している。 ウサギとヒトのＬＢＰ−１の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。 図２は、ウサギのＬＢＰ−２のアミノ酸配列(SEQ ID NO:２)を描写している。 ウサギとヒトのＬＢＰ−２の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。 図３は、ウサギのＬＢＰ−２のアミノ酸８６〜３１７のアミノ酸配列(SEQ ID NO:３)を描写している。 図４は、ウサギのＬＢＰ−２のアミノ酸６６〜３１７のアミノ酸配列(SEQ ID NO:４)を描写している。 図５は、ウサギのＬＢＰ−３のアミノ酸配列(SEQ ID NO:５)を描写している。 ウサギとヒトのＬＢＰ−３の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。 図６は、ヒトのＬＢＰ−１のアミノ酸配列(SEQ ID NO:６)を描写している。 ウサギとヒトのＬＢＰ−１の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。 図７は、ヒトのＬＢＰ−２のアミノ酸配列(SEQ ID NO:７)を描写している。 ウサギとヒトのＬＢＰ−２の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。 図８は、ヒトのＬＢＰ−３のアミノ酸配列(SEQ ID NO:８)を描写している。 ウサギとヒトのＬＢＰ−３の間のアミノ酸の差異を太字で描いてある。 図９は、ヒト又はウサギのＬＢＰ−１のアミノ酸１４〜３３のアミノ酸配列( ＢＨＦ−１という)(SEQ ID NO:９)を描写している。 図１０は、ウサギのＬＢＰ−１をコードするｃＤＮＡ配列(SEQ ID NO:１０)及 び対応するアミノ酸配列を描写している。ウサギとヒトのＬＢＰ−１の間のアミ ノ酸の差異を太字で描いてある。 図１１は、ウサギのＬＢＰ−２をコードするｃＤＮＡ配列(SEQ ID NO:１１)及 び対応するアミノ酸配列を描写している。ウサギとヒトのＬＢＰ−２の間のアミ ノ酸の差異を太字で描いてある。 図１２は、ウサギのＬＢＰ−２のｃＤＮＡ配列２５６〜１６１７(SEQ ID NO: １２)及び対応するアミノ酸配列を描写している。 図１３は、ウサギのＬＢＰ−２のｃＤＮＡ配列１９６〜１６１７(SEQ ID NO: １３)及び対応するアミノ酸配列を描写している。 図１４は、ウサギのＬＢＰ−３をコードするｃＤＮＡ配列(SEQ ID NO:１４)及 び対応するアミノ酸配列を描写している。ウサギとヒトのＬＢＰ−３の間のアミ ノ酸の差異を太字で描いてある。 図１５は、ヒトのＬＢＰ−１をコードするｃＤＮＡ配列(SEQ ID NO:１５)及び 対応するアミノ酸配列を描写している。ウサギとヒトのＬＢＰ−１の間のアミノ 酸の差異を太字で描いてある。 図１６は、ヒトのＬＢＰ−２をコードするｃＤＮＡ配列(SEQ ID NO:１６)及び 対応するアミノ酸配列を描写している。ウサギとヒトのＬＢＰ−２の間のアミノ 酸の差異を太字で描いてある。 図１７は、ヒトのＬＢＰ−３をコードするｃＤＮＡ配列(SEQ ID NO:１７)及び 対応するアミノ酸配列を描写している。ウサギとヒトのＬＢＰ−３の間のアミノ 酸の差異を太字で描いてある。 図１８は、ＢＨＦ−１をコードするｃＤＮＡ配列(SEQ ID NO:１８)を描写して いる。 図１９は、ヒトのＬＢＰ−１のアミノ酸配列(下段の配列)と整列させたウサギ のＬＢＰ−１のアミノ酸配列(上段の配列)に対応する。 図２０は、ヒトのＬＢＰ−２のアミノ酸配列(下段の配列)と整列させたウサギ のＬＢＰ−２のアミノ酸配列(上段の配列)に対応する。 図２１は、ヒトのＬＢＰ−３のアミノ酸配列(下段の配列)と整列させたウサギ のＬＢＰ−３のアミノ酸配列(上段の配列)に対応する。 詳細な説明 本発明の面に従って、新規な成熟したヒト及びウサギのポリペプチドＬＢＰ− １、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３並びにこれらの生物学的に活性なアナログ及び断 片を提供し、そしてかかるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチ ドを提供する。ＬＢＰは、低密度リポ蛋白質(ＬＤＬ)結合性蛋白質の略号である 。用語ポリヌクレ９オチド、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、ここでは 、 交換可能に用い、用語ポリペプチド、蛋白質及びペプチドは、ここでは、交換可 能に用いる。 この発明は、図１に示したウサギのＬＢＰ−１(SEQ ID NO:１)；図２に示した ウサギのＬＢＰ−２(SEQ ID NO:２)；図３に示したウサギのＬＢＰ−２の８６〜 ３１７(SEQ ID NO:３)；図４に示したウサギのＬＢＰ−２の６６〜３１７(SEQ I D NO:４)；図５に示したウサギのＬＢＰ−３(SEQ ID NO:５)；図６に示したヒト のＬＢＰ−１(SEQ ID NO:６)；図７に示したヒトのＬＢＰ−２(SEQ ID NO:７)； 図８に示したヒトのＬＢＰ−３(SEQ ID NO:８)；図９に示したヒト又はウサギの ＬＢＰ−１の１４〜３３(ＢＨＦ−１という)(SEQ ID NO:９)のアミノ酸配列を有 するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオ チド；上記のポリヌクレオチドの何れかとハイブリダイズすることのできる及び 少なくとも約８０％同一の一層好ましくは少なくとも約９０％同一の一層好まし くは少なくとも約９５％同一の最も好ましくは少なくとも約９８％同一のポリヌ クレオチド(コードされるポリペプチドは、ＬＤＬに結合することができる)；又 は上記のポリヌクレオチドの何れかの生物学的に活性な断片(コードされるポリ ペプチドは、ＬＤＬに結合することができる)を提供する。 この発明は又、図７に示したヒトのＬＢＰ−２(SEQ ID NO:７)のアミノ酸残基 ８〜２２(SEQ ID NO:１９)、８〜３３(SEQ ID NO:２０)、２３〜３３(SEQ ID NO :２１)又は２０８〜２１７(SEQ ID NO:２２)を有するポリペプチド；図１(SEQ I D NO:１)及び図６(SEQ ID NO:６)に示したウサギ又はヒトのＬＢＰ−１のアミノ 酸残基１４〜４３(SEQ ID NO:２３)又は３８〜４３(SEQ ID NO:２４)；図２に示 したウサギのＬＢＰ−２(SEQ ID NO:２)のアミノ酸残基１０５〜１２０(SEQ ID NO:２５)、１０５〜１３２(SEQ ID NO:２６)、１２１〜１３２(SEQ ID NO:２７) 又は２１１〜２２０(SEQ ID NO:２８)；図５に示したウサギのＬＢＰ−３(SEQ I D NO:５)；図８に示したヒトのＬＢＰ−３(SEQ ID NO:８)のアミノ酸残基５３〜 ５９(SEQ ID NO:４１)をコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌク レオチド；上記のポリヌクレオチドの何れかとハイブリダイズすることができる 及び少なくとも約８０％同一の一層好ましくは少なくとも約９０％同一の一層好 ましくは少なくとも約９５％同一の最も好ましくは少なく とも約９８％同一のポリヌクレオチド(コードされるポリペプチドは、ＬＤＬに 結合することができる)；又は上記のポリヌクレオチドの何れかの生物学的に活 性な断片(コードされるポリペプチドは、ＬＤＬに結合することができる)をも包 含する。 ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとは、ポリペプチドのコード配列 のみを含むポリヌクレオチド並びに更なるコード配列及び／又は非コード配列を 含むポリヌクレオチドを意味する。従って、例えば、図１〜９の成熟ポリペプチ ド(SEQ ID NO:１〜９)をコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのコ ード配列のみを含むことができ；成熟ポリペプチドのコード配列と更なるコード 配列例えばリーダー配列若しくは分泌用配列又はプロ蛋白質配列を含むことがで き；成熟ポリペプチドのコード配列(及び随意に更なるコード配列)及び非コード 配列例えばイントロン又は成熟ポリペプチドのコード配列の５’及び／又は３’ 側の非コード配列を含むことができる。この発明のポリヌクレオチドは又、成熟 ポリペプチドのコード配列が、ポリペプチドの発現及び／又は宿主細胞からの分 泌を助成するポリヌクレオチド配列例えばリーダー配列と同じリーディングフレ ームで融合しているポリヌクレオチドを含むことも意味する。これらのポリヌク レオチドは又、コード配列が例えばそのポリペプチドの精製を可能にするマーカ ー配列とイン・フレームで融合しているポリヌクレオチドを含むことも意味する 。 本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＰＮＡの形態例えばｃＲＮ Ａ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又は合成のＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはＰＮＡであっ てよい。このＤＮＡは、二本鎖であっても一本鎖であってもよく、もし一本鎖で あれば、コード鎖であっても非コード鎖(アンチセンス鎖)であってもよい。 好適具体例において、このポリヌクレオチドには、図１０に示したウサギのＬ ＢＰ−１の核酸(SEQ ID NO:１０)；図１１に示したウサギのＬＢＰ−２の核酸(S EQ ID NO:１１)；図１２に示したウサギのＬＢＰ−２のヌクレオチド２５６〜１ ６１７(SEQ ID NO:１２)；図１３に示したウサギのＬＢＰ−２のヌクレオチド１ ９６〜１６１７(SEQ ID NO:１３)；図１４に示したウサギのＬＢＰ−３(SEQ ID NO:１４)；図１５に示したヒトのＬＢＰ−１(SEQ ID NO:１５)；図１６に 示したヒトのＬＢＰ−２(SEQ ID NO:１６)；図１７に示したヒトのＬＢＰ−３(S EQ ID NO:１７)；又は図１８に示したウサギのＬＢＰ−１のヌクレオチド９７〜 １５６又はヒトのＬＢＰ−１のヌクレオチド１５７〜２１６(ＢＨＦ−１)が含ま れる。 他の好適具体例において、このポリペプチドには、SEQ ID NO:３０、SEQ ID N O:３１、SEQ ID NO:３２、SEQ ID NO:３３、SEQ ID NO:３４、SEQ ID NO:３５、 SEQ ID NO:３６、SEQ ID NO:３７、SEQ ID NO:３８、SEQ ID NO:３９、SEQ ID N O:４０又はSEQ ID NO:４２に示した核酸が含まれる。 成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１０〜１８(SEQ ID NO:１０ 〜１８)又はSEQ ID NO:３０〜４０若しくは４２に示したコード配列と同一であ ってよく、又は、遺伝コードの重複若しくは縮重の結果として、図１０〜１８(S EQ ID NO:１０〜１８)又はSEQ ID NO:３０〜４０及び４２のＤＮＡと同じ成熟ポ リペプチドをコードする異なるコード配列であってよい。 この発明は又、上記のポリヌクレオチドを含む組換えベクターをも包含する。 このベクターは、例えばプラスミド、ウイルス粒子又はファージであってよい。 ある具体例において、この組換えベクターは、発現ベクターである。これらのベ クターは又、かかるベクターを含む細胞を同定するのに有用な種々のマーカー遺 伝子をも含んでよい。 この発明は又、かかる組換えベクターを含む細胞をも包含する。ここに記載し た組換えベクターは、例えばトランスフォーメーション、トランスフェクション 又は感染により、宿主細胞に導入することができる。 この発明は又、かかる細胞をＬＢＰの発現を与える条件下で培養することを含 むＬＢＰを生成する方法をも包含する。 この発明は又、図１(SEQ ID NO:１)；図２(SEQ ID NO:２)；図３(SEQ ID NO: ３)；図４(SEQ ID NO:４)；図５(SEQ ID NO:５)；図６(SEQ ID NO:６)；図７(SE Q ID NO:７)；図８(SEQ ID NO:８)若しくは図９(SEQ ID NO:９)に示したアミノ 酸配列を有するポリペプチドを含む単離されたポリペプチド；又は上記のポリペ プチドと少なくとも約８０％同一の一層好ましくは少なくとも約９０％同一の一 層好ましくは約９５％同一の最も好ましくは約９８％同一のポリペプチド (該ポリペプチドは、ＬＤＬに結合することができる)；又は上記のポリペプチド の何れかの生物学的に活性な断片(この断片は、ＬＤＬに結合することができる) をも包含する。ウサギ及びヒトのＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３遺伝子 の間のアミノ酸の差異を、これらの図中に太字で描いてある。ウサギ及びヒトの ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３の間のアミノ酸配列の差異も又、図１９ 、２０及び２１にそれぞれ示してある。 この発明は又、図７(SEQ ID NO:７)に示したアミノ酸残基８〜２２(SEQ ID NO :１９)、８〜３３(SEQ ID NO:２０)、２３〜３３(SEQ ID NO:２１)又は２０８〜 ２１７(SEQ ID NO:２２)を有するポリペプチドを含む単離されたポリペプチド； 図１(SEQ ID NO:１)及び図６(SEQ ID NO:６)に示したアミノ酸残基１４〜４３(S EQ ID NO:２３)若しくは３８〜４３(SEQ ID NO:２４)；図２(SEQ ID NO:２)に示 したアミノ酸残基１０５〜１２０(SEQ ID NO:２５)、１０５〜１３２(SEQ ID NO :２６)、１２１〜１３２(SEQ ID NO:２７)若しくは２１１〜２２０(SEQ ID NO: ２８)；図５(SEQ ID NO:５)に示したアミノ酸残基９６〜１１０(SEQ ID NO:２９ )；図８(SEQ ID NO:８)に示したアミノ酸残基５３〜５９(SEQ ID NO:４１)を有 するポリペプチドを含む単離されたポリペプチド；上記のポリペプチドと少なく とも約８０％同一の一層好ましくは少なくとも約９０％同一の一層好ましくは少 なくとも約９５％同一の最も好ましくは少なくとも約９８％同一のポリペプチド (該ポリペプチドは、ＬＤＬに結合することができる)；又は上記のポリペプチド の何れかの生物学的に活性な断片(この断片は、ＬＤＬに結合することができる) をも包含する。 この発明のポリペプチドは、例えば、天然の精製した生成物、化学合成した生 成物及び組換えにより誘導した生成物を包含することを意味する。 これらのポリペプチドを用いて、例えば、ＬＤＬに結合することができ、それ により、アテローム性動脈硬化症プラークの形成を阻止することができる。これ らのポリペプチドを、例えば、遺伝子治療において、かかるポリペプチドのイン ・ビボでの発現により、用いることができる。これらのポリペプチドは又、医薬 組成物又はワクチン組成物において用いることもできる。これらのポリペプチド を免疫原として用いて、それらに対する抗体を生成することもでき、更に、それ らをＬＢＰポリペプチドに対するアンタゴニストとして用いることもできる。 如何なる理論に縛られるものでもないが、ＬＢＰは、アテローム性動脈硬化症 がＬＤＬの酸化を通して促進される機構を与えると考えられる。これらのＬＢＰ は、集中した不可逆的なＬＤＬ結合が動脈壁に起きることが(順序正しく)必要で あると考えられ、かかる結合は、ＬＤＬがネイティブな状態から完全に酸化され た状態に変化するのに必要な時間を与えるので、アテローム性動脈硬化症の決定 的な初期事象であると考えられる。酸化されたネイティブでないＬＤＬは外来蛋 白質であるので、マクロファージがそれを摂食して、最初は、Ｉ型病変の泡沫細 胞となり、その後、II型病変の脂肪性の縞を形成する。 この発明は又、動物がアテローム性動脈硬化症の危険にあるかどうかを測定す る方法を包含する。一の動物を準備する。ＬＢＰの代謝及び構造の面をこの動物 において評価する。ＬＢＰの代謝又は構造の面における異常は、アテローム性動 脈硬化症の危険にあるという診断となる。 アテローム性動脈硬化症とは、ＬＤＬの不可逆的結合、ＬＤＬの酸化、マクロ ファージの動員、動脈の閉塞及び組織の死(梗塞)を含む無知覚で相互に混合する 幾つかのステージを含む病気又は症状を意味する。 動物とは、ヒト並びに非ヒト動物を意味する。非ヒト動物には、例えば、哺乳 動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類及び原生動物が含まれる。好ましく は、非ヒト動物は、哺乳動物例えばウサギ、ゲッ歯類例えばマウス、ラット若し くはモルモット、霊長類例えばサル、又はブタである。動物には、非ヒトトラン スジェニック動物も含まれる。用語トランスジェニック動物は、外来ＤＮＡ(即 ち、部分的に又は全体的に異質のＤＮＡ)のその動物のＤＮＡ中への導入により ；又は、損傷例えばイン・ビトロで導入された突然変異例えば欠失若しくは他の 染色体の再配置のその細胞のＤＮＡ中への導入により：又は、相同なＤＮＡのそ の細胞のＤＮＡ中への、該相同なＤＮＡが挿入された細胞のゲノムが変化する( 例えば、それを、天然の遺伝子と異なる位置に挿入し又はその挿入が相同な宿主 遺伝子のノックアウト若しくは置換を生じるか又はその遺伝子の変化した及び／ 若しくは調節可能な発現若しくは／又は代謝を生じる)ような仕方での導入によ り新たな遺伝情報を得た動物を包含することを意味する。この動物は、生殖系列 細胞を含 むその細胞のすべてにトランスジーンを含むことができる。この発明のトランス ジェニック動物は、アテローム性動脈硬化症の研究用の又はアテローム性動脈硬 化症の治療剤を評価するためのモデルとして役立ち得る。 ある具体例において、アテローム性動脈硬化症の危険にあることについての測 定は、胎児動物において行う。 ＬＢＰとは、ＬＤＬ及びメチル化ＬＤＬに結合することのできる低密度リポ蛋 白質(ＬＤＬ)結合性蛋白質を意味する。メチル化ＬＤＬとは、ＬＤＬのリジン残 基の約５０〜９０％が化学的に結合させたメチル基を有することを意味する。メ チル化ＬＤＬは、前に報告された細胞表面レセプターによっては認識されない。 例えば、Weisgraber等J.Biol.Chem.253:9053-9062(1978)を参照されたい。ある 具体例において、ＬＢＰは又、酸化されたＬＤＬに結合することもできる。ある 好適な具体例において、ＬＤＬのＬＢＰへの結合は、不可逆である。ある好適な 具体例において、ＬＢＰは、ＬＤＬを何れの細胞内コンパートメントへも輸送し ない。ＬＢＰの例は、ここに記載したＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３で ある。 ＬＢＰの代謝とは、ＬＢＰの産生、放出、発現、機能、作用、相互作用又は調 節の何れかを意味する。ＬＢＰの代謝には、ＬＢＰポリペプチドの修飾例えば共 有結合による修飾又は非共有結合による修飾が含まれる。ＬＢＰの代謝には、Ｌ ＢＰが他の物質において誘導するＬＢＰポリペプチドの修飾例えば共有結合によ る修飾又は非共有結合による修飾が含まれる。ＬＢＰの代謝には又、ＬＢＰポリ ペプチドの分布の変化、及びＬＢＰが他の物質の分布において誘導する変化も含 まれる。 ＬＢＰ代謝の任意の面を評価することができる。用いる方法は、当業者に公知 の標準的技術であり、標準的参考文献例えば、Ausubel等編、Current Protocols in Mol.Biology,New York:John Wiley & Sons,1990;-Kriegler,M.編、Gene Tra nsfer and Expression,Stockton Press,New York,ニューヨーク、1989;pDisplay gene expression system(Invitrogen,Carlsbad,カリフォルニア)中に見出すことができる。評 価することのできるＬＢＰ代謝の好適な例には、ＬＢＰポリペプチドの結合性分 子例えばＬＤＬに対する結合活性；ＬＢＰポリペプチドの標的遺伝子に対するト ランス活性 化活性；ＬＢＰ蛋白質のレベル；ＬＢＰｍＲＮＡのレベル；ＬＢＰ修飾例えばリ ン酸化、グリコシル化若しくはアシル化のレベル；又はトランスフェクトされた 哺乳動物細胞のＬＤＬの結合に対するＬＢＰ発現の効果が含まれる。 結合性分子とは、ＬＢＰが結合することのできる任意の分子例えば核酸例えば ＤＮＡ調節領域、蛋白質例えばＬＤＬ、代謝産物、ペプチド模倣物、非ペプチド 模倣物、抗体又は任意の他の型のリガンドを意味する。ある好適具体例において は、評価するＬＢＰ代謝の面は、ＬＢＰのネイティブなＬＤＬ及び／又はメチル 化ＬＤＬ及び／又は酸化ＬＤＬに結合する能力である。ＬＤＬへの結合は、例え ば、ＬＤＬに対する抗体、アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティー 同時電気泳動(ＡＣＥ)アッセイ、又はＥＬＩＳＡアッセイにより示すことができ る。実施例を参照されたい。他の具体例において、それは、ＬＢＰの評価される 動脈の細胞外マトリクス構造の成分に結合する能力である。かかる成分の例には 、プロテオグリカン例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカン及びヘパリン硫 酸プロテオグリカン；コラーゲン；フィブロネクチン；ビトロネタチン；インテ グリン；及び関連する細胞外マトリクス分子が含まれる。動脈の細胞外マトリク ス構造の成分に対する結合は、当業者に公知の標準的方法により例えばＥＬＩＳ Ａアッセイにより示すことができる。次いで、ＬＢＰに対する一次抗体を加え、 その後、一次抗体に対する酵素結合した二次抗体を加え、それは、適当な基質の 存在下で安定な色を生じ、プレート上での色の発生をミクロ滴定プレートリーダ ーにて測定する。 ＬＢＰによる標的遺伝子のトランス活性化を、例えば、一過性トランスフェク ションアッセイにおいて測定することができる(該アッセイでは、標的遺伝子の プロモーターをレポーター遺伝子例えばβ−ガラクトシダーゼ又はルシフェラー ゼとリンクさせ、ＬＢＰ発現ベクターを同時トランスフェクトする)。かかる評 価をイン・ビトロ又はイン・ビボで行うことができる。ＬＢＰ蛋白質、ｍＲＮＡ 又はリン酸化のレベルは、例えば試料において、例えば組織試料(例えば、動脈 壁)において、当業者に公知の標準的方法によって測定することができる。 ある具体例において、ＬＢＰの構造の面例えばＬＢＰ遺伝子の構造又はＬＢＰ 蛋白質の構造を評価する。例えば、一次、二次又は三次構造を評価することがで きる。例えば、この遺伝子のＤＮＡ配列を決定し及び／又はこの蛋白質のアミノ 酸配列を決定する。標準的なクローニング方法及び配列決定法を、当業者に知ら れているように用いることができる。ある具体例においては、アンチセンス核酸 が通常特異的に結合する標的ｍＲＮＡ又はＤＮＡ配列の存在又は不在を検出する ために、アンチセンス核酸の細胞性ＬＢＰのｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡと の結合活性を、当業者に公知の標準的方法を用いて測定する。 測定されるアテローム性動脈硬化症の危険は、正常の動物と比較して、減じた 危険又は増大した危険であり得る。例えば、減じた危険を与えるであろう異常は 、不活性なＬＢＰポリペプチドである。増大した危険を与えるであろう異常は、 例えば、ネイティブなＬＢＰポリペプチドより一層高い活性(例えば、ＬＤＬ結 合活性)を有するＬＢＰポリペプチドである。 この発明は又、アテローム性動脈硬化症の治療において用いる薬剤を評価する 方法をも包含する。試験細胞、無細胞系又は動物を準備する。一の薬剤を準備す る。この薬剤をこの試験細胞、無細胞系又は動物に治療上有効な量で投与する。 この薬剤のＬＢＰの代謝又は構造の面に対する効果を評価する。ＬＢＰの代謝又 は構造の面の変化は、アテローム性動脈硬化症の治療における薬剤の有用性を示 している。 ある具体例においては、この方法は、アテローム性動脈硬化症の治療で使用す るための薬剤を評価するために２つのフェーズ(初期のイン・ビトロフェーズ及 びその後のイン・ビボフェーズ)を用いる。この薬剤を、イン・ビトロで、試験 細胞又は無細胞系に投与し、ＬＢＰの代謝の面に変化が起きれば、次いで、その 薬剤を更に試験動物に治療上有効な量で投与して、ＬＢＰの代謝の面に対するそ の薬剤の効果をイン・ビボで評価する。 細胞とは、細胞若しくは細胞の群又は動物の部分である細胞を意味する。この 細胞は、ヒトの細胞又は非ヒト細胞であってよい。細胞は又、トランスジェニッ ク細胞をも包含する。この細胞は、例えば培養から又は動物から得ることができ る。動物は、例えば天然の動物及びトランスジェニックの非ヒト動物を包含する ことを意味する。ある具体例においては、このトランスジェニック細胞又は非ヒ トトランスジェニック動物は、ＬＢＰトランスジーン又はその断片若しくはアナ ログを有する。ある具体例においては、トランスジェニック細胞又は非ヒトトラ ンスジェニック動物は、ＬＢＰ遺伝子についてのノックアウトを有する。 この試験細胞、無細胞系又は動物は、ＬＢＰ代謝の野生型パターン又は非野生 型パターンを有してよい。ＬＢＰ代謝の非野生型パターンは、例えば、過少発現 、過剰発現、非発現又は時間的な、部位による若しくは分布の変化から生じ得る 。かかる非野生型パターンは、例えば、ＬＢＰ遺伝子、結合性分子の遺伝子、調 節遺伝子、又は直接若しくは間接にＬＢＰ代謝に影響する他の何れかの遺伝子に おける１つ以上の突然変異から生じ得る。突然変異は、例えば、核酸における大 きい又は微細な構造の変化を包含することを意味する。例は、単一塩基対の変化 例えばミスセンス若しくはナンセンス変異、フレームシフト、欠失、挿入及び転 座を包含する。突然変異は、優性であっても劣性であってもよい。突然変異は、 ホモ接合であってもヘテロ接合であってもよい。好ましくは、ＬＢＰ−１、ＬＢ Ｐ−２又はＬＢＰ−３の代謝の面を評価する。 薬剤は、例えば任意の物質例えば抗アテローム性動脈硬化症薬剤を包含するこ とを意味する。この発明の薬剤は、好ましくは、ＬＢＰ代謝の面を変化させるこ とができる。かかる変化は、多様な事象(ＬＢＰと結合性分子例えばＬＤＬ又は 動脈の細胞外マトリクス成分との間の防止的又は減少的相互作用；ＬＢＰ及び／ 又は結合性分子の例えば開裂又は他の改変による不活性化；ＬＢＰ及び／又は結 合性分子の希釈；ＬＢＰ及び／又は結合性分子の発現の防止；ＬＢＰ及び／又は 結合性分子の合成の減少；異常なＬＢＰ及び／又は結合性分子の合成；選択的ス プライスされたＬＢＰ及び／又は結合性分子の合成；ＬＢＰ及び／又は結合性分 子の適当なコンホメーションでの折り畳みの防止又は減少；ＬＢＰ及び／又は結 合性分子の結合特性の調節；ＬＢＰ及び／又は結合性分子の活性化又は不活性化 に必要なシグナルの妨害；ＬＢＰ及び／又は結合性分子の結合を防止するような 仕方での活性化又は不活性化；又はＬＢＰ及び／又は結合性分子の正常な合成又 はこれらの正常な機能に必要な他のレセプター、リガンド又は分子を妨害するこ と)の何れかの結果であってよい。例えば、この薬剤は、動脈壁の細胞外マトリ クスに集中的に発現されるＬＢＰに対するＬＤＬ上の結合部位をブロックするこ とができるか、又はそれは、ＬＤＬに対するＬＢＰ上の結合部位をブロックする こと ができ、又はそれは、二官能性であり得よう(即ち、それは、両結合部位をブロ ックすることができよう)。 薬剤の例には、ＬＢＰポリペプチド例えばＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２若しくはＬ ＢＰ−３又は生物学的に活性なその断片若しくはアナログ；ＬＢＰポリペプチド 又は生物学的に活性なその断片若しくはアナログをコードする核酸；ＬＢＰ調節 配列又は生物学的に活性なその断片若しくはアナログをコードする核酸；ＬＢＰ ポリペプチドに対する結合性分子；ＬＢＰ核酸に対する結合性分子(ＬＢＰ核酸 は、例えば、ＬＢＰの調節領域を含む核酸又はＬＢＰ若しくは生物学的に活性な その断片の構造領域を含む核酸である)；アンチセンス核酸；ＬＢＰ又は結合性 分子の模倣物；ＬＢＰ又は結合性分子に対する抗体；代謝産物；又は阻害性炭水 化物若しくは糖蛋白質が含まれる。ある具体例においては、この薬剤は、アンタ ゴニスト、アゴニスト又はスーパーアゴニストである。 ＬＢＰの配列の存在の知識は、アテローム性動脈硬化症の治療においてＬＤＬ レベルを調節するための天然の又は人工のリガンドの検索を可能にする。ある具 体例において、この薬剤は、ＬＢＰに対する天然のリガンドである。ある具体例 において、この薬剤は、ＬＢＰに対する人工のリガンドである。 アナログとは、アミノ酸配列又は配列に関係しない他の点において、又はこれ らの両方において天然のＬＢＰと異なる化合物を意味する。この発明のアナログ は、一般に、天然のＬＢＰ配列の完全な配列と、好ましくは約１００アミノ酸残 基のセグメントと、一層好ましくは約５０アミノ酸残基のセグメントと、更に一 層好ましくは約３０アミノ酸残基のセグメントと、更に一層好ましくは約２０ア ミノ酸残基のセグメントと、更に一層好ましくは約１０アミノ酸残基のセグメン トと、更に一層好ましくは約５アミノ酸残基のセグメントと、更に一層好ましく は約４アミノ酸残基のセグメントと、更に一層好ましくは約３アミノ酸残基のセ グメントと、最も好ましくは約２アミノ酸残基のセグメントと、実質的に少なく と約８０％相同性を、好ましくは少なくとも約９０％相同性を、一層好ましくは 少なくとも約９５％相同性を、最も好ましくは少なくとも約９８％相同性を示す 。非配列性改変には、例えば、ＬＢＰのイン・ビボ又はイン・ビトロでの化学的 誘導体化が含まれる。非配列性改変には、例えば、リン酸化、アセチル化、メチ ル化、カルボキシル化、又はグリコシル化における変化が含まれる。かかる改変 を行う方法は、当業者に公知である。例えば、リン酸化は、ＬＢＰをリン酸化を 変える酵素例えばキナーゼ又はホスファターゼに曝すことにより改変することが できる。 好適なアナログには、その配列が、少なくとも一の保存的アミノ酸置換により 又は少なくとも一の非保存的アミノ酸置換、欠失若しくは挿入(これらは、ＬＢ Ｐの生物学的活性を完全には破壊しない)により野生型の配列と異なるＬＢＰ又 は生物学的に活性なその断片が含まれる。保存的置換は、典型的には、一のアミ ノ酸の他の類似の特性を有するアミノ酸での置換、例えば次のグループ内での置 換を包含する：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン 、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリ ン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。保存 的置換の他の例を表１に示す。 蛋白質のアミノ酸配列変異物は、当業者に公知の様々な方法の何れかによって 製造することができる。例えば、蛋白質又は蛋白質の特定のドメイン若しくは領 域をコードするＤＮＡのランダム突然変異、例えば、ＰＣＲ突然変異誘発(例え ば、減じたＴａｑポリメラーゼ忠実度を利用してランダムな突然変異をクローン 化したＤＮＡ断片中に導入する；Leung等BioTechnique 1:11-15(1989))、又は飽 和 突然変異誘発(例えば、一本鎖ＤＮＡのイン・ビトロでの化学処理又は照射によ り、及び相補的ＤＮＡ鎖の合成による；Mayers等Science 229:242(1985))を利用 することができる。ランダム突然変異誘発は又、縮重オリゴヌクレオチド生成に よっても達成することができる(例えば、縮重配列を化学合成するための自動化 ＤＮＡシンセサイザーを用いる；Narang,Tetrahedron 39:3(1983)；Itakura等Re combinant DNA,Proc.3rd Cleveland Sympos.Macromolecules,A.G.Walton編Amste rdam:Elsevier,p.273-289(1981))。ランダムでない又は位置指定の突然変異誘発 を用いて特異的配列又は特異的領域内の突然変異を与えることができる。これら の技術を用いて、例えば、蛋白質の公知のアミノ酸配列の残基の欠失、挿入又は 置換を含む変異物を造ることができる。突然変異のための部位を、例えば、(ｉ) 先ず保存的アミノ酸で置換し、次いで、達成された結果に依っては一層過激な選 択物で置換することにより、(ii)標的残基を削除することにより、(iii)同じ又 は異なるクラスの残基を指定部位に隣接して挿入することにより、又は(iv)上記 の組合せにより、個々に又は連続的に改変することができる。例えば、アナログ を、図１０〜１８の配列(SEQ ID NO:１０〜１８)のイン・ビトロＤＮＡ配列改変 により作製することができる。例えば、イン・ビトロ突然変異誘発を用いて、こ れらのＤＮＡ配列の何れかをアナログをコードする配列に変換することができる (該アナログにおいては、少なくとも一のアミノ酸残基が、置換例えば表１に記 載したような保存的置換を受けている)。 望ましい突然変異を同定する方法には、例えば、アラニンスキャニング突然変 異誘発(Cunningham及びWells,Science 244:1081-1085(1989))、オリゴヌクレオ チド媒介の突然変異誘発(Adelmn等DNA2:183(1983))；カセット突然変異誘発(Wel ls等Gene 34:315(1985))、組合せ突然変異誘発、及びファージディスプレーライ ブラリー(Ladner等、ＰＣＴ国際出願Ｎｏ．ＷＯ８８／０６６３０号）が含まれ る。これらのＬＢＰアナログを、例えば、それらのＬＤＬに結合する能力及び／ 又は動脈細胞外マトリクス成分に結合する能力について、ここに記載したように 試験することができる。 この発明の範囲内の他のアナログには、ペプチドの安定性を増大させる改変を 有するものが含まれる。かかるアナログは、ペプチド配列中に１つ以上の非ペプ チド結合(ペプチド結合に取って代わったもの)を含んでよい。例えば、天然のＬ −アミノ酸以外の残基例えばＤ−アミノ酸又は非天然若しくは合成のアミノ酸例 えばβ若しくはγアミノ酸を含むアナログ；及び環状アナログも又、包含される 。 アナログは又、ペプチドを加水分解されないようにするために、構造的改変が ペプチド主鎖に導入されたペプチドを含むことも意味する。かかるペプチドは、 消化されないので、経口投与に特に有用である。ペプチド主鎖の改変には、例え ば、アミド窒素、α−炭素、アミドカルボニル又はアミド結合の改変及び伸長、 欠失又は主鎖の架橋を含む改変が含まれる。例えば、主鎖を、カルボニルのスル ホキシドでの置換により、ペプチド結合を逆にすることにより、又はカルボニル 基をメチレンで置換することにより改変することができる。かかる改変は、当業 者に公知の標準的手順によって作製することができる。例えば、Spatola,A.F.「 Peptide Backbone Modifications:A Structurc-Activity Analysis of Peptides Containing Amide Bond Surrogatcs,Conformational Constraints,and Related Backbone Replacements」｛Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Pept ides and Proteins,Vol.7,p.267-357,B.Weinstein(編),Marcel Dekker,Inc.New York(1983)｝を参照されたい。 アナログは又、少なくとも一のアミノ酸残基が置換基を含むポリペプチド又は 他の化合物(例えば、ポリペプチドの半減期を増大させる化合物、例えばポリエ チレングリコール)と融合したポリペプチドを含むことも意味する。 断片とは、天然のＬＢＰポリペプチドの幾らかの部分を意味する。好ましくは 、この断片は、少なくとも約１００アミノ酸残基、一層好ましくは少なくとも約 ５０アミノ酸残基、更に一層好ましくは少なくとも約３０アミノ酸残基、更に一 層好ましくは少なくとも約２０アミノ酸残基、更に一層好ましくは少なくとも約 ５アミノ酸残基、更に一層好ましくは少なくとも約４アミノ酸残基、更に一層好 ましくは少なくとも約３アミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも約２アミノ酸 残基長である。断片には、例えば、切りつめられた分泌型、蛋白質分解断片、ス プライシング断片、その他の断片、及び関連遺伝子例えばＬＢＰ−１、ＬＢＰ− ２又はＬＢＰ−３の少なくとも一部分と他の分子との間の化学的構築物が含まれ る。ＬＢＰの断片は、当業者に公知の方法により生成することができる。ある具 体例においては、この断片は、生物学的に活性である。候補の断片のＬＢＰの生 物学的活性を示す能力を、当業者に公知の方法によってアッセイすることができ る。例えば、ＬＢＰ断片を、ＬＤＬ及び／又は動脈細胞外マトリクス構造成分に 結合するそれらの能力について試験することができる。断片の生物学的活性に必 要でない残基を含むＬＢＰ断片又は選択的ｍＲＮＡスプライシング若しくは選択 的蛋白質プロセッシング事象から生じるＬＢＰ断片も又包含される。 蛋白質の断片は、当業者に公知の様々な方法の何れかによって、例えば、組換 えにより、蛋白質分解消化により又は化学合成により、製造することができる。 ポリペプチドの内部断片又は末端断片を、そのポリペプチドをコードする核酸の 一方の末端(末端断片を作る場合)又は両端(内部断片を作る場合)から一つ以上の ヌクレオチドを除去することにより生成することができる。この変異されたＤＮ Ａの発現は、ポリペプチド断片を生成する。従って、「末端をかじり取る」エン ドヌクレアーゼでの消化は、一連の断片をコードするＤＮＡを生成することがで えきる。蛋白質の断片をコードするＤＮＡは又、例えば、ランダム剪断、制限消 化又は上記の方法の組合せによっても生成することができる。例えば、ＬＢＰの 断片は、所望の断片をコードするようにイン・ビトロで(例えば、図１０〜１８ のＤＮＡ配列(SEQ ID NO:１０〜１８)の何れかの制限消化により)操作したＬＢ ＰＤＮＡを発現させることにより作成することができる。 断片は又、当分野で公知の技術例えば慣用のMerrifield固相ｆ−Ｍｏｃ又はｔ −Ｂｏｃ化学を用いて、化学合成することもできる。例えば、本発明のペプチド は、重複を有しない又は重複を有する所望の長さの断片に任意に分割することが できる。 ＬＢＰ又はその生物学的に活性な断片若しくはアナログ、又は結合性分子又は その生物学的に活性な断片若しくはアナログは、例えば、同起源の分子と、相補 性分子上の結合部位について競争し、それにより、ＬＢＰと細胞性の結合性分子 との結合を減じ又は排除する。ＬＢＰ又は結合性分子は、例えば、天然のＬＢＰ 若しくは結合性分子の精製若しくは分泌により、組換えＬＢＰ若しくは結合性分 子から、又は合成のＬＢＰ若しくは結合性分子から得ることができる。 それ故、アナログ又は断片を生成する方法及びそれらを活性について試験する 方法は、当業者に公知である。 薬剤は、アンチセンス分子として用いる核酸であってもよい。アンチセンス療 法は、例えば、コードされた蛋白質の発現を例えば転写及び／又は翻訳を阻止す ることによって阻止するために、細胞条件下で、ＬＢＰポリペプチド又はその変 異物をコードする細胞性ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダ イズする(例えば、結合する)オリゴヌクレオチド又はそれらの誘導体の投与又は その場(in・situ)での生成を包含することを意味する。この結合は、慣用の塩基 対相補性によるか、又は、例えば、二本鎖ＤＮＡへの結合の場合には、二重らせ んの大きい溝における特異的相互作用によるものであってよい。 ある具体例においては、アンチセンス構築物は、天然のＬＢＰ遺伝子の配列( 例えば、その遺伝子の発現に関与する)に結合する。これらの配列には、例えば 、プロモーター、開始コドン、停止コドン及びＲＮＡポリメラーゼ結合部位が含 まれる。 他の具体例において、このアンチセンス構築物は、野生型遺伝子中に存在しな いヌクレオチド配列に結合する。例えば、このアンチセンス構築物は、外因性の 非野生型配列の挿入を含有するＬＢＰ遺伝子の領域に結合することができる。或 は、このアンチセンス構築物は、欠失を受けたＬＢＰ遺伝子の領域に結合し、そ れにより、自然には一緒に位置することのないその遺伝子の２つの領域を一緒に して、非野生型配列を造ることができる。イン・ビボで患者に投与する場合、非 野生型配列に結合するアンチセンス構築物は、何れの野生型ＬＢＰ遺伝子の発現 も阻止せずに変異型ＬＢＰ遺伝子の発現を阻止する利点を提供する。 本発明のアンチセンス構築物は、細胞中で転写されたときに、ＬＢＰポリペプ チドをコードする細胞性ｍＲＮＡの少なくとも一のユニークな部分に相補的なＲ ＮＡを生成する発現プラスミドとして送達することができる。別法は、アンチセ ンス構築物が、エキス・ビボで生成され、細胞に導入されたときにＬＢＰ遺伝子 のｍＲＮＡ(二本鎖形成)及び／又はゲノム配列(三重鎖形成)とハイブリダイズす ることにより発現の阻止を引き起こすオリゴヌクレオチドであることである。か かるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、内因性のヌクレアーゼ例えばエキソヌ クレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼに抵抗性であり、それ故、イン・ビボ で安定である改変されたオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレ オチドとしての使用のための典型的な核酸分子は、ＤＮＡのホスホルアミデート 、ホスホチオエート、ホスホロジチオエート及びメチルホスホネートアナログ及 びペプチド核酸(ＰＮＡ)である(米国特許第５，１７６，９９６号；５，２６４ ，５６４号及び５，２５６，７７５号も参照されたい)。更に、アンチセンス療 法において有用なオリゴマーを構築する一般的アプローチは、総説されている( 例えば、Van der Krol等Biotechniques 6:958-976(1988)；Stein等Cancer Res.4 8:2659-2668(1988)を参照されたい)。 模倣物とは、形状及び／又は電荷分布においてＬＢＰ又は結合性分子に類似し ている分子を意味する。この模倣物は、ペプチド又は非ペプチドであってよい。 模倣物は、例えば、ＬＢＰの結合性分子への結合を競争的に阻止することができ るので、治療剤として作用することができる。結合性分子への結合に関与する特 定のＬＢＰポリペプチドのアミノ酸残基をマップするために、例えばスキャニン グ突然変異誘発、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、リンカースキャニ ング突然変異誘発又は飽和突然変異誘発を用いることにより、結合性分子への結 合においてそれらの残基を真似し、それ故、ＬＢＰの結合性分子への結合を阻止 し、それにより、ＬＢＰの機能を妨害するぺプチド模倣物例えばジアゼピン又は イソキノリン誘導体を生成することができる。かかる残基の加水分解可能でない ペプチドアナログは、例えば、ベンゾジアゼピン(例えば、Freidinger等{Peptid cs:Chemistry and Biology,G.R.Marshall編，ESCOM出版:Leidcn,オンダ(1988)}参照 )；アゼピン(例えば、Huffman等{Peptides:Chemistry and Biology,G.R.Marshal l編，ESCOM出版:Leiden,オランダ(1988)}参照)；置換されたガンマラクタム環(例え ば、Garvey等{Peptides:Chemistry and Biology,G.R.Marshall編，ESCOM出版:Le iden,オランダ(1988)}参照)；ケト−メチレンシュードペプチド(例えば、Ewenson等J .Med.Chem.29:295(1986)：Ewnson等{Peptieds:Structure and Function(Proceed ings of 9th American Peptide Symposium)Pierce Chemical Co.Rockland,IL(19 85)参照)；β−ターンジペプチドコア(例えば、Nagai等Tetrahedron Lett.26:64 7(1985)；Sato等J.Chem.Soc.Perkin Trans.1:1231(1986)参照)；又はβ−アミノ アルコール(例 えば、Gordon等Biochem.Biophys.Res.Commun.126:419(1985);Dann等Biochem.Bio phys.Res.Commun.134:71(1986)参照)を用いて生成することができる。 抗体は、直接又は間接にＬＢＰ代謝に影響を及ぼす任意の部分に対する抗体を 包含することを意味する。これらの抗体は、例えばＬＢＰ又は結合性分子に対す る抗体であっても、それらのサブユニット又は断片に対する抗体であってもよい 。例えば、抗体には、抗ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２又はＬＢＰ−３抗体；及び抗結 合性分子抗体が含まれる。抗体断片は、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ (ａｂ')₂断片、Ｆ(ｖ)断片、重鎖モノマー、重鎖ダイマー、重鎖トリマー、軽鎖 モノマー、軽鎖ダイマー、軽鎖トリマー、一の重鎖と一の軽鎖とからなるダイマ ー、及び抗ＬＢＰ又は抗結合性分子抗体の活性を真似るペプチドを包含すること を意味する。例えば、阻害性抗体のＦａｂ'₂断片は、例えば、酵素的開裂によっ て生成することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を この発明において用いることができる。好ましくは、モノタローナル抗体を用い る。天然の抗体、組換え抗体又はキメラ抗体例えばヒト化抗体は、この発明に含 まれる。好ましくは、患者がヒトの場合には、ヒト化抗体を用いる。最も好まし くは、これらの抗体は、ヒトの抗体に由来する定常領域及び阻害性のマウスモノ クローナル抗体由来の可変領域を有する。ＬＢＰに対するポリクローナル抗体の 製造を、実施例６に記載する。モノクローナルのヒト化抗体は、当業者に公知の 標準的方法によって生成される。モノクローナル抗体は、例えば、連続的細胞株 培養により産生される抗体を与える任意の技術により製造することができる。例 には、ハイブリドーマ技術(Kohler及びMilstein,Nature 256:495-497(1975))、 トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor等Immunology Today 4: 72(1983))、及びヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドー マ技術(Cole等{Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,A.R.Liss,Inc.,p.7 7-96(1985)})が含まれる。好ましくは、ヒト化抗体を慣用の製造及び採集技術に よって高める(Berkower,I.,Curr.Opin.Biotechnol.7:622-628(1996)；Ramharaya n及びSkaletsky,Am.Biotechnol.Lab 13:26-28(1995))。ある好適な具体例におい て、これらの抗体を、ＬＢＰに対して、好ましくはＬＤＬ結合部位及び製造した Ｆａｂ断片に対して高める。これらの抗体又はそれらから誘導した断片を用いて 、例えば、Ｌ ＢＰ分子上のＬＤＬ結合部位をブロックすることができる。 薬剤には、ＬＢＰ及び／又は結合性分子の合成、翻訳後修飾に若しくは機能に 必要とされる分子のインヒビター又は、ＬＢＰ及び／又は結合性分子の合成又は 機能を阻害する分子のアクチベーターをも包含される。薬剤には、例えば、サイ トカイン、ケモカイン、成長因子、ホルモン、シグナリング成分、キナーゼ、ホ スファターゼ、ホメオボッタス蛋白質、転写因子、編集因子、翻訳因子及び翻訳 後因子又は酵素が含まれる。薬剤は又、ＬＢＰ及び／又は結合性分子を少なくと も部分的に不活性化し又は破壊する電離放射線、非電離放射線、超音波及び毒性 薬剤をも包含することを意味する。 すべての薬剤は又、完全にＬＢＰ特異的ではない薬剤をも包含することを意味 する。例えば、薬剤は、動脈のプラーク形成に関係する他の遺伝子又は蛋白質を 変化させることができる。かかる重複する特異性は、更なる治療上の利点を提供 することができる。 この発明は又、アテローム性動脈硬化症の治療に有用であると同定された薬剤 をも包含する。 この発明は又、薬剤を、ＬＢＰポリペプチドの結合性分子との結合を変化させ る能力について評価する方法をも包含する。一の薬剤を準備する。ＬＢＰポリペ プチドを準備する。結合性分子を準備する。これらの薬剤、ＬＢＰポリペプチド 及び結合性分子を合わせる。これらのＬＢＰポリペプチド及び結合性分子を含む 複合体の形成を検出する。この薬剤の不在時と比較して該剤の存在下での複合体 の形成における変化は、この薬剤がＬＢＰポリペプチドの結合性分子への結合を 変化させることを示している。 好適具体例において、ＬＢＰポリペプチドは、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２又はＬ ＢＰ−３である。結合性分子の例には、ネイティブなＬＤＬ、改変されたＬＤＬ 例えばメチル化ＬＤＬ又は酸化ＬＤＬ、及び動脈細胞外マトリクス構造成分が含 まれる。 この結合の変化には、例えば結合の阻止又は促進が含まれる。この薬剤の効力 を、例えば、種々の濃度の薬剤を用いて得られたデータから投与量応答曲線を生 成することにより査定することができる。複合体の形成を測定する方法は、標準 的であり当業者に公知である（例えば、アフィニティー同時電気泳動(ＡＣＥ)ア ッセイ又はＥＬＩＳＡアッセイ(本明細書中に記載してある))。 この発明は又、ＬＢＰポリペプチドの結合性分子への結合を変化させ得ると同 定された薬剤をも包含する。 この発明は又、薬剤を、ＬＢＰポリペプチドに結合する能力について評価する 方法をも包含する。一の薬剤を準備する。ＬＢＰポリペプチドを準備する。この 薬剤をＬＢＰポリペプチドと接触させる。この薬剤のＬＢＰポリペプチドに結合 する能力を評価する。好ましくは、ＬＢＰポリペプチドは、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ −２又はＬＢＰ−３である。結合は、例えば、アフィニティー同時電気泳動(Ａ ＣＥ)アッセイ又はＥＬＩＳＡアッセイ(本明細書中に記載してある)等の当業者 に公知の標準的な方法によって複合体の形成を測定することにより測定すること ができる。 この発明は又、ＬＢＰポリペプチドに結合し得ると同定された薬剤をも包含す る。 この発明は又、薬剤を、ＬＢＰ調節配列をコードする核酸に結合する能力につ いて評価する方法をも包含する。一の薬剤を準備する。ＬＢＰ調節配列をコード する核酸を準備する。この薬剤をこの核酸と接触させる。この薬剤のこの核酸に 結合する能力を評価する。好ましくは、ＬＢＰ調節配列は、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ −２又はＬＢＰ−３調節配列である。結合は、例えば、当業者に公知の標準的な 方法例えばＤＮＡ移動度シフトアッセイ、ＤＮアーゼＩフットプリント分析(Aus ubel等編Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New Yor k,NY,(1989))によって複合体の形成を測定することにより測定することができる 。 この発明は又、ＬＢＰ調節配列をコードする核酸に結合することができると同 定された薬剤をも包含する。 この発明は又、動物におけるアテローム性動脈硬化症の治療方法をも包含する 。アテローム性動脈硬化症の治療を要する動物を準備する。ＬＢＰの構造又は代 謝の面を変えることのできる薬剤を準備する。この薬剤を、この動物に、治療上 有効な量で、アテローム性動脈硬化症の治療を生じるように投与する。 ある好適具体例において、この薬剤は、ＬＢＰポリペプチド例えばＬＢＰ−１ 、ＬＢＰ−２若しくはＬＢＰ−３又は生物学的に活性なそれらの断片若しくはア ナログである。この薬剤は、例えば、SEQ ID NO:１〜９に示したポリペプチドで あってよい。好ましくは、この薬剤は、約１００アミノ酸残基長以下の、一層好 ましくは約５０アミノ酸残基長以下の、更に一層好ましくは約３０アミノ酸残基 長以下の、更に一層好ましくは約２０アミノ酸残基長以下の、更に一層好ましく は約５アミノ酸残基長以下の、更に一層好ましくは約４アミノ酸残基長以下の、 更に一層好ましくは約３アミノ酸残基長以下の、最も好ましくは約２アミノ酸残 基長以下のポリペプチドである。好ましくは、このポリペプチドは、少なくとも 約２０％の酸性アミノ酸残基を、一層好ましくは少なくとも約４０％の酸性アミ ノ酸残基を、更に一層好ましくは少なくとも約６０％の酸性アミノ酸残基を、更 に一層好ましくは少なくとも約８０％の酸性アミノ酸残基を、更に一層好ましく は少なくとも約９０％の酸性アミノ酸残基を、更に一層好ましくは少なくとも約 ９５％の酸性アミノ酸残基を、最も好ましくは少なくとも約９８％の酸性アミノ 酸残基を含む。酸性アミノ酸残基には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含ま れる。かかるＬＢＰポリペプチドの例は、アミノ酸残基１４〜３３を含むヒト又 はウサギのＬＢＰ−１の２０アミノ酸長の断片であるＢＨＦ−１である。図９(S EQ ID NO:９)を参照されたい。ＢＨＦ−１のアミノ酸残基の４５％は、酸性であ る。この発明は又、ＢＨＦ−１の生物学的に活性な断片及びアナログをも包含す る。 他の好適なＬＢＰからの酸性領域は、図７に描いたヒトのＬＢＰ−２(SEQ ID NO:７)のアミノ酸残基８〜２２(SEQ ID NO:１９)、８〜３３(SEQ ID NO:２０)、 ２３〜３３(SEQ ID NO:２１）及び２０８〜２１７(SEQ ID NO:２２)；図１(SEQ ID NO:１)及び図６(SEQ ID NO:６)に描いたウサギ又はヒトのＬＢＰ−１のアミ ノ酸残基１４〜４３(SEQ ID NO:２３)及び３８〜４３(SEQ ID NO:２４)；図２(S EQ ID NO:２)に描いたウサギのＬＢＰ−２のアミノ酸残基１０５〜１２０(SEQ I D NO:２５)、１０５〜１３２(SEQ ID NO:２６)、１２１〜１３２(SEQ ID NO:２ ７)及び２１１〜２２０(SEQ ID NO:２８)；図５に描いたウサギのＬＢＰ−３(SE Q ID ＮＯ：５)のアミノ酸残基９６〜１１０(SEQ ID NO:２９)；及 び図８に描いたヒトのＬＢＰ−３(SEQ ID NO:８)のアミノ酸残基５３〜５９(SEQ ID NO:４１)である。この発明は又、これらのポリペプチドの何れかの生物学的 に活性な断片又はアナログをも包含することを意味する。 薬剤の他の例には、任意のアミノ酸又はアミノ酸アナログのホモポリマー又は ヘテロポリマーが含まれる。ある好適具体例において、この薬剤は、酸性アミノ 酸又はそのアナログのホモポリマーである。ある具体例において、この薬剤は、 一種以上の酸性アミノ酸と一種以上の他のアミノ酸との又はこれらのアナログの ヘテロポリマーである。例えば、薬剤には、ポリ(ｇｌｕ)、ポリ(ａｓｐ)、ポリ (ｇｌｕ ａｓｐ)、ポリ(ｇｌｕ Ｎ)、ポリ(ａｓｐ Ｎ)及びポリ(ｇｌｕ ａ ｓｐＮ)が含まれる。Ｎとは、ｇｌｕ又はａｓｐ以外の任意のアミノ酸又はその アナログを意味する。ポリ(ｇｌｕ ａｓｐ)とは、所定の長さのペプチドについ てのｇｌｕとａｓｐのすべての順列を意味する。好適なペプチドは、約１０アミ ノ酸長以下の、好ましくは約７アミノ酸長以下のポリ(ｇｌｕ)である。 ある好適具体例において、この薬剤は、ＬＢＰ核酸又は生物学的に活性なその 断片若しくはアナログ(例えば、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２若しくはＬＢＰ−３ポ リペプチドをコードする核酸又はその生物学的に活性な断片若しくはアナログ) である。この薬剤は、例えば、SEQ ID NO:１０〜１８に示したヌクレオチド配列 を含む核酸であってよい。他の具体例において、この薬剤は、アンチセンス分子 例えばＬＢＰ遺伝子配列に結合することのできるものである。 治療は、例えば、アテローム性動脈硬化症の徴候を予防し、治療し、減じ、又 は該動脈硬化症を癒すことを包含することを意味する。この薬剤の投与は、この 薬剤を標的細胞に到達させる任意の方法によって達成することができる。これら の方法には、例えば、注射、付着、移植、坐薬、経口摂取、吸入法、局所投与、 又はこの薬剤の標的細胞への到来が得られる任意の他の投与が含まれる。注射は 、例えば、静脈注射、皮内注射、皮下注射、筋肉注射又は腹腔内注射であってよ い。移植は、移植可能な薬物送達システム例えばミクロスフェア、ヒドロゲル、 高分子リザーバー、コレステロールマトリクス、高分子システム例えばマトリク ス侵食及び／又は拡散システム並びに非高分子システム例えば圧縮した、融合し た若しくは部分的に融合したペレットの挿入を包含する。坐薬には、グリセリン 坐薬が含まれる。経口摂取の一回分は、腸溶性に被覆されていてよい。吸入法は 、薬剤を吸入器内のエアゾールと共に投与する(単独で又は吸収され得るキャリ アーに付着させて)ことを包含する。 この薬剤の投与は、単独で又は他の治療剤と組み合わせて行うことができる。 ある具体例においては、この薬剤を適当なキャリアーと合わせ、リポソーム中に 取り込ませ、又は高分子放出システム中に取り込ませることができる。 この発明のある具体例においては、幾らかの期間(例えば、数時間、数日、数 週間、数ヶ月又は数年)にわたって順次的に薬剤にさらされるように投与をデザ インすることができる。これは、上記の方法の一つによる薬剤の反復投与によっ て、或は、反復投与なしで長期間にわたって薬剤を動物に送達する制御された放 出用の送達システムによって達成することができる。制御された放出用の送達シ ステムとは、薬剤投与量の全放出が投与に際して直ちには起きないで、幾らかの 時間だけ遅れることを意味する。放出を一気に起こすこともできるし、徐々に且 つ継続的に起こすこともできる。かかるシステムの投与は、例えば、長期間作用 する経口投薬形態、軟塊注入、経皮投与用絆創膏又は皮下インプラントによるこ とができる。 放出が一気に起きるシステムの例には、例えば、薬剤が高分子マトリクス中に 封入されたリポソームにトラップされ、これらのリポソームが特定の刺激(例え ば、温度、ｐＨ、光、磁場又は分解酵素)に感受性であるシステム及びマイクロ カプセルコア分解酵素でイオン的に被覆したマイクロカプセルにより薬剤を封入 したシステムが含まれる。薬剤の放出が徐々に且つ継続的に起きるシステムの例 には、例えば、薬剤が一定の形態でマトリクス中に含まれる侵食システム及び薬 剤が例えばポリマーを通して制御された速度で透過する拡散システムが含まれる 。かかる持続的放出システムは、例えば、ペレット又はカプセルの形態であって よい。 この薬剤を、液体に懸濁させることができる(例えば、溶解した形態又はコロ イド状形態で)。この液体は、溶剤、不完全溶剤又は溶剤以外のものであってよ い。多くの場合に、水又は有機液体を用いることができる。 この薬剤を、アテローム性動脈硬化症の徴候の出現の前又は後に投与すること ができる。ある具体例においては、この薬剤を、アテローム性動脈硬化症の家族 病歴のある患者に、又はアテローム性動脈硬化症の素因を示し得る表現型を有す る患者に、又はアテローム性動脈硬化症に傾ける遺伝子型を有すると診断された 患者に、又は他の危険因子例えば高コレステロール血症、高血圧症若しくは喫煙 を有する患者に投与する。 この薬剤を、動物に、治療上有効な量で投与する。治療上有効な量とは、少な くとも部分的にアテローム性動脈硬化症を予防し又は逆行させることのできる量 を意味する。治療上有効な量は、個人ベースで決定することができ、少なくとも 部分的に、動物の種、動物の大きさ、動物の年齢、使用する薬剤、使用する送達 システムの種類、アテローム性動脈硬化症の徴候の開始に対する投与の時期、及 び単独の、複数の若しくは制御された放出の投薬養生法の何れを用いるかに基づ く。治療上有効な量は、かかる因子を用いる当業者により、日常的実験を用いて 決定され得る。 好ましくは、薬剤の濃度は、１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．１〜１０００ ｍｇ、一層好ましくは約０．１〜５００ｍｇ、更に一層好ましくは約０．１〜１ ００ｍｇ、最も好ましくは約０．１〜５ｍｇの投与量である。特定の濃度は、部 分的に、使用する特定の薬剤に依存する(幾つかは、他のものより一層有効であ るので)。実際に投与する薬剤の投薬濃度は、少なくとも部分的に、作用部位で 望まれる終濃度、投与方法、特定の薬剤の効力、特定の薬剤の寿命、及びアテロ ーム性動脈硬化症の徴候の開始に対する投与のタイミングに依存する。好ましく は、投薬形態は、実質的に動物に悪影響を与えないものである。この投薬は、か かる因子を採用する当業者により、日常的実験を用いて決定され得る。 ある具体例においては、遺伝子治療プロトコールの一部として、種々の遺伝子 構築物を用いて、例えばＬＢＰポリペプチドのアゴニスト形態又はアンタゴニス ト形態等の薬剤をコードする核酸を送達することができる。例えば、非野生型Ｌ ＢＰが発現されている細胞においてＬＢＰポリペプチドの機能を再構成するため に、或は、該機能を排除するために、発現ベクターを、イン・ビボトランスフェ クション用に及び特定の細胞型におけるＬＢＰポリペプチドの発現用に用いるこ とができる。このＬＢＰポリペプチドの発現用構築物及びその変異物は、任意の 生物学的に有効なキャリアーにて(例えば、ＬＢＰ遺伝子をイン・ビボで細胞に 有効に送達することのできる任意の配合又は組成にて)投与することができる。 アプローチは、例えば、主題の遺伝子のウイルスベクター(例えば、組換えレト ロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及び１型単純ヘルペスウイル ス)又は組換えの細菌性若しくは真核生物のプラスミド中への挿入を包含する。 ウイルスベクターは、直接細胞に感染し又は形質導入し；プラスミドＤＮＡは、 例えばカチオン性リボソーム(リボフェクチン(商標)(Life Technologies,MD,Gai thersburg在))、ポリリジン結合体、グラマシジンＳ、人工ウイルスエンベロー プ若しくは他のかかる細胞内キャリアーの助けにより並びにイン・ビボにて行う 遺伝子構築物の直接注射又はＣａ₃(ＰＯ₄)₂沈殿によって送達され得、又は誘導 体化(例えば、抗体結合体化)され得る。上記の方法は、当業者に公知であり、過 度の実験なしで実施できる。適当な標的細胞の形質導入は遺伝子治療の決定的な 第１のステップに相当するので、特定の遺伝子送達システムの選択は、意図され る標的の表現型及び投与の経路(例えば、局所的か又は全身投与か)等の因子に依 存する。投与は、治療上有効であるように、当業者に公知の方法によって、一種 以上の細胞型に対して行うことができ、ある細胞型の内の１つ以上の細胞に対し て行うことができる。好適具体例において、この薬剤を、動物の動脈壁細胞に投 与する。例えば、遺伝子工学処理されたＬＢＰ遺伝子を、動脈壁細胞に投与する 。ある具体例においては、投与を、出生前の動物又は胚細胞において行う。ＬＢ Ｐ発現のイン・ビボでの形質導入のために提供された特定の遺伝子構築物は又、 ここに記載の診断アッセイでの使用等のために、細胞のイン・ビトロ形質導入に も有用であるということは認められよう。 ある具体例において、アテローム性動脈硬化症の治療を、ＬＢＰをコードする 遺伝子のアンチセンスヌクレオチドアナログを用いて行う。好ましくは、アンチ センスヌクレオチドは、加水分解可能でない「主鎖」例えばホスホロチオエート 、ホスホロジチオエート又はメチルホスホネートを有する。そのヌクレオシド塩 基配列は、例えばＬＢＰ−１、２又は３をコードする遺伝子の一部の配列と相補 的である。かかる配列は、例えば、もしＬＢＰの遺伝子配列がＴＡＡＣＣＧであ るならば、ＡＴＴＧＧＣである。かかる治療の一具体例は、ＬＢＰ遺伝子の一つ の一部のアンチセンスアナログのゆっくり放出する媒体(例えば、ポリビニルア ルコール)中への取り込みであり、該媒体を、アンチセンスヌクレオチドを数週 間又は数ヶ月の期間にわたって放出するように例えば皮下注射によって投与する 。他の具体例においては、このアンチセンスアナログを、高分子マトリクス例え ばポリビニルアルコール中に、ゲルを傷害された動脈壁に局所的に適用してＬＢ Ｐ合成を阻止し及びＬＤＬの蓄積を予防することができるように、例えば、血管 形成又はアテローム摘出術後に取り込ませる。 この発明は又、アテローム性動脈硬化症の危険にある動物の治療方法をも包含 する。アテローム性動脈硬化症の危険にある動物を準備する。ＬＢＰの構造及び 代謝の面を変えることのできる薬剤を準備する。この薬剤を、この動物に、治療 上有効な量で、その動物の治療が生じるように投与する。アテローム性動脈硬化 症の危険にあることは、例えば、家族のアテローム性動脈硬化症の病歴、アテロ ーム性動脈硬化症に傾かせる遺伝子型、又はアテローム性動脈硬化症に傾かせる 表現型の徴候例えば高コレステロール血症、高血圧症若しくは喫煙を有すること から帰着される。 この発明は又、ＬＢＰの構造又は代謝に異常を有する細胞の治療方法をも包含 する。ＬＢＰの構造又は代謝に異常を有する細胞を準備する。ＬＢＰの構造又は 代謝の面を変えることのできる薬剤を準備する。この薬剤を、この細胞に、治療 上有効な量で、この細胞の治療が生じるように投与する。 ある具体例において、この細胞は、細胞培養若しくは組織培養から又は胎児の 繊維芽細胞から得られる。この細胞は、例えば動物(例えば、天然の動物又は非 ヒトトランスジェニック動物)の部分であってよい。好ましくは、ＬＢＰは、Ｌ ＢＰ−１、ＬＢＰ−２又はＬＢＰ−３である。 この発明は又、動物におけるアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬組 成物であって、治療上有効な量の薬剤(この薬剤は、アテローム性動脈硬化症の 治療が生じるように、この動物におけるＬＢＰの代謝又は構造の面を変えること ができる)及び製薬上許容し得るキャリアーを含む医薬組成物をも包含する。製 薬上許容し得るキャリアーには、例えば、塩溶液、リポソーム及び脂質エマルジ ョンが含まれる。 ある好適具体例において、この医薬組成物の薬剤は、ＬＢＰポリペプチド例え ばＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２若しくはＬＢＰ−３又は生物学的に活性なその断片若 しくはアナログである。この薬剤は、例えば、SEQ ID NO:１〜９に示したポリペ プチドである。好ましくは、この薬剤は、約１００アミノ酸残基長以下の、一層 好ましくは約５０アミノ酸残基以下の、更に一層好ましくは約３０アミノ酸残基 以下の、更に一層好ましくは約２０アミノ酸残基以下の、更に一層好ましくは約 １０アミノ酸残基以下の、更に一層好ましくは約５アミノ酸残基以下の、更に一 層好ましくは約４アミノ酸残基以下の、更に一層好ましくは約３アミノ酸残基以 下の、最も好ましくは約２アミノ酸残基以下のポリペプチドである。好ましくは 、このポリペプチドは、少なくとも約２０％の酸性アミノ酸残基を、一層好まし くは少なくとも約４０％の酸性アミノ酸残基を、更に一層好ましくは少なくとも 約６０％の酸性アミノ酸残基を、更に一層好ましくは少なくとも約８０％の酸性 アミノ酸残基を、更に一層好ましくは少なくとも約９０％の酸性アミノ酸残基を 、更に一層好ましくは少なくとも約９５％の酸性アミノ酸残基を、最も好ましく は少なくとも約９８％の酸性アミノ酸残基を含む。 ある好適具体例においては、この薬剤は、ＬＢＰ核酸例えばＬＢＰ−１、ＬＢ Ｐ−２若しくはＬＢＰ−３又は生物学的に活性なこれらの断片若しくはアナログ をコードする核酸である。この薬剤は、例えば、SEQ ID NO:１０〜１８に示した ヌクレオチド配列を含む核酸であってよい。 この発明は又、動物におけるアテローム性動脈硬化症を治療するためのワクチ ン組成物であって、治療上有効な量の薬剤(この薬剤は、アテローム性動脈硬化 症の治療を生じるように、この動物におけるＬＢＰの代謝又は構造の面を変える ことができる)及び製薬上許容し得るキャリアーを含むワクチン組成物をも包含 する。 この発明は又、動物におけるアテローム性動脈硬化病変の診断方法をも包含す る。一の動物を準備する。アテローム性動脈硬化病変に存在するＬＢＰに結合す ることのできる標識した薬剤を準備する。この標識した薬剤を、この動物に、標 識されたＬＢＰが生じるように、この標識した薬剤がＬＢＰと相互作用する条件 下で投与する。この標識されたＬＢＰの位置測定又は定量を、この動物中のアテ ローム性動脈硬化病変の存在を診断するように、イメージングにより測定する。 好ましくは、ＬＢＰは、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２又はＬＢＰ−３である。この イメージングは、例えば、磁気共鳴イメージング、ガンマーカメライメージング 、単一光子放出コンピューター断層(ＳＰＥＣＴ)イメージング又は陽電子放出断 層撮影法(ＰＥＴ)を包含する当業者に公知の標準的方法によって実施することが できる。 好ましくは、アテローム性動脈硬化病変中のＬＢＰに固く結合する薬剤を、ア テローム性動脈硬化症のイメージング及び診断に用いる。この薬剤は、例えば、^99m Ｔｃその他の臨床用イメージング(ガンマーカメラ、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴスキ ャニング又は他の類似の断層撮影法による)に適したアイソトープで放射性標識 する。ＬＢＰは非常に初期の病変に生じるので、かかるイメージングは、未だ動 脈内腔に可視的隆起又は乱れた流れを生じるような影響を与えていない非常に初 期の病変をつきとめるために、血管造影法又は超音波より一層鋭敏である。初期 の及び一層進んだ病変の両者をつきとめることに加えて、これらのＬＢＰに結合 するイメージング剤は又、アテローム性動脈硬化症の進行を追跡するために用い ることもできる(食事療法と薬理学的療法の両者の有効性を評価する手段として) 。 従って、この発明の診断の具体例は、例えばＬＢＰの一つに相補的なペプチド を、それを放射性標識し、肉眼で見えないアテローム性動脈硬化症の検出のため の注射可能なイメージング剤として用いるによって適合させることである。この ペプチドは、ＬＢＰに結合することが知られているもの(例えば、ＲＲＲＲＲＲ Ｒ又はＫＫＬＫＬＸＸ)又は、ＬＢＰの高度に電気陰性のドメインに結合する任 意の他のポリカチオン性ペプチドから選択する。ガンマーシンチレーション(Ang er)カメラを用いる生体外での検出のために、テクテチウム結合したリガンド例 えばＣＧＣ、ＧＧＣＧＣ又はＧＧＣＧＣＦをこれらのペプチドのＮ末端又はＣ末 端に^99mＴｃ標識のために取り込むことができる。磁気共鳴イメージング(ＭＲＩ )による外部イメージングのために、例えば、ガドリニウム結合キレーター、ジ エチレントリアミンペンタ酢酸(ＤＴＰＡ)を、これらのペプチドのＮ又はＣ末端 に共有結合させる。更に別の具体例において、ＬＢＰ結合ペプチドは、当業者に 公知の標準的方法によって、例えばこれらのペプチドを磁性イオンを含む活性化 ポリス チレン樹脂ビーズと結合させることによって、例えば磁性イオン粒子に共有結合 される。 この発明は又、動物をＬＢＰ例えばＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２若しくはＬＢＰ− ３又はこれらの断片若しくはアナログに対して免疫化する方法をも包含する。Ｌ ＤＬを有する動物を準備する。ＬＢＰ又はその断片若しくはアナログを準備する 。このＬＢＰ又はその断片若しくはアナログを、この動物によるＬＢＰ又はその 断片若しくはアナログに対する抗体産生を刺激するように、この動物に投与し、 それにより、ＬＢＰのＬＤＬへの結合を変化させる(例えば、減少させ又は増大 させる)。 この発明は又、ＬＢＰポリペプチドの断片又はアナログの製造方法をも包含す る(この断片又はアナログは、改変されたＬＤＬ及びネイティブなＬＤＬに結合 する能力を有する)。一のＬＢＰポリペプチドを準備する。ＬＢＰポリペプチド の配列を変化させる。変化したＬＢＰポリペプチドを、改変したＬＤＬ例えばメ チル化ＬＤＬ、酸化ＬＤＬ、アセチル化ＬＤＬ、シクロヘキサンジオン処理した ＬＤＬ(ＣＨＤ−ＬＤＬ)及びネイティブなＬＤＬに結合する能力について試験す る。 これらの断片又はアナログを生成して、これらの改変したＬＤＬ及びネイティ ブなＬＤＬに結合するそれらの能力について、例えば個々に記載の当業者に公知 の方法により試験することができる。好ましくは、それらを、メチル化ＬＤＬ及 びネイティブなＬＤＬに結合するそれらの能力について試験する。この断片又は アナログの結合活性は、ネイティブなＬＢＰの結合活性より強くても弱くてもよ い。好ましくは、それは、より強い。好適具体例において、ＬＢＰは、ＬＢＰ− １、ＬＢＰ−２又はＬＢＰ−３である。 この発明は又、ＬＢＰをコードするｃＤＮＡを単離する方法をも包含する。一 のｃＤＮＡライブラリーを準備する。そのｃＤＮＡライブラリーを、ネイティブ なＬＤＬ及び改変したＬＤＬ例えばメチル化ＬＤＬ又は酸化ＬＤＬに結合するポ リペプチドをコードするｃＤＮＡについてスクリーニングする。このポリペプチ ドをコードするｃＤＮＡ(ＬＢＰをコードするｃＤＮＡ)を単離する。 下記の非制限的実施例は、本発明を更に説明する。実施例 実施例１ ：ウサギのｃＤＮＡライブラリーの構築 この実施例は、バルーンによる内皮剥奪の治癒からのｍＲＮＡを用いるウサギ のｃＤＮＡライブラリーの構築を説明する。バルーンカテーテルにより内皮剥奪 されたウサギの大動脈は、アテローム性動脈硬化症の有効なモデルであることが 示されている(Minick等Am.J.Pathol.95:131-158(1979))。 バルーン処理したウサギの大動脈中の集中的なＬＤＬ結合を最大にするバルー ン処理の４週間後にこのｍＲＮＡが得られた。第一鎖ｃＤＮＡ合成を、４μｇの ｍＲＮＡ；２μｇのオリゴｄ(Ｔ)プライマー；メチル化ｄＮＴＰｍｉｘ(各１０ ｍＭ)；１０ｍＭ ＤＴＴ；８００単位のスーパースクリプトIIＲＴ(Life Techn ologies,MD,Gaithersburg在)；１×第一鎖ｃＤＮＡ合成用緩衝液(５０ｍＭトリ ス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；７５ｍＭ ＫＣｌ；５ｍＭ ＭｇＣｌ₂)を含む５０μ ｌの反応混合物中で行った(３７℃で、１時間インキュベートした)。次いで、こ の反応混合物を、１×第二鎖用緩衝液(３０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５； １０５ｍＭ ＫＣｌ；５．２ｍＭ ＭｇＣｌ₂）；０．１ｍＭ ＤＴＴ；メチル 化ｄＮＴＰｍｉｘ(各１０ｍＭ)；５０単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、３単 位のＲＮアーゼＨ；１５単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ(すべての酵素は、Life Te chnologiesより購入)の添加により２５０μｌに調節し、更に２．５時間にわた って１５℃でインキュベートした。その結果生成した二本鎖ｃＤＮＡ(ｄｓｃＤ ＮＡ)を、次いで、１．５単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ(NovagenInc.,WI,Madis on在)で、２０分間１１℃で処理して鈍端化ｄｓｃＤＮＡを作製した。次いで、 これらを、エタノール沈殿により濃縮して、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIリンカを Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Novagen Inc.)により両端に付着させた。これらのリンカー を連結したｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII制限酵素で処理してＥｃｏ ＲＩ及びＨｉｎｄIII認識配列を、それぞれ、それらの５’及び３’末端に作っ た。リンカーＤＮＡのゲル排除クロマトグラフィーによる除去の後に、ｄｓｃＤ ＮＡを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより、一方向性の様式で、λＥＸｌｏｘファージ アーム(ovagen Inc.)中に挿入し、製造者のプロトコール(Novagen Inc.)に従っ てファージ粒子中にパッケージングした。２×１０⁶の独立のクローンを含むｃ ＤＮＡのファージライ ブラリーが、４μｇのｍＲＮＡから樹立された。実施例２ ：ＬＤＬ結合性蛍白質(ＬＢＰ)をコードするウサギｃＤＮＡの同定 この実施例は、ネイティブなＬＤＬ及びメチルＬＤＬの両方に結合するＬＢＰ をコードするｃＤＮＡを同定するようにウサギのｃＤＮＡライブラリーを機能的 にスクリーニングする方法を説明する。メチルＬＤＬは、前に報告された細胞表 面レセプターによって認識されない。例えば、Weisgrabcr等,J.Biol.Chcm.253:9 053-9062(1978)を参照されたい。 大腸菌ＥＲ１６４７細胞(Novagen Inc.)の新鮮な一晩培養物に、実施例１で得 られたｃＤＮＡファージを感染させ、２ＸＹＴ寒天を含む直径１５０ｍｍのプレ ート中に、２×１０⁴プラーク形成単位(ｐｆｕ)の密度でプレートした。５０プ レートすべて(１×１０⁶ファージに相当)をプレートして、プラークが直径１ｍ ｍに達するまで(５〜６時間)３７℃でインキュベートした。予め１０ｍＭ ＩＰ ＴＧ溶液に浸した乾燥ニトロセルロース膜を、各プレート上に重ねて組換え蛋白 質の産生を誘導し、それらの蛋白質を膜上に固定した。これらの膜を、３７℃で 更に３〜４時間インキュベートし、次いで、一晩４℃でインキュベートした。 翌日、これらの膜を、各プレートから取り出して次のように処理した。ＴＢＳ Ｔ溶液(１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０ ５％ ツイーン２０)中での数回の簡単なすすぎ；ＨＢＢ(２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ 、ｐＨ７．５；５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ及び５ｍＭ ＫＣｌ)中の６ Ｍグアニジン−ＨＣｌでの２回の１０分間ずつのすすぎ；ＨＢＢ中の３Ｍグアニ ジン−ＨＣｌでの２回の５分間ずつのすすぎ；ＴＢＳＥＮ(ＴＢＳ、１ｍＭ Ｅ ＤＴＡ、０．０２％ＮａＮ₃)中での最後の簡単なすすぎ。 次いで、これらの膜を、室温で、５％脱脂粉乳を含むＴＢＳＥＮ溶液にて３０ 分間、その後、１％脱脂粉乳を含むＴＢＳＥＮにて１０分間ブロックした。ブロ ッキングの後に、これらの膜を、ネイティブなヒトＬＤＬ(実施例１１に記載し たようにして得たもの)又はメチル化ヒトＬＤＬ(ｍｅＬＤＬ)(Weisgraber等,J.B iol.Chem.253:9053-9062(1978)参照)と共に、１×ＴＢＳＥＮ、１％脱脂粉乳、 １ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５×プロテアーゼインヒビター溶液（１ｍＭε−アミノ カプロ ン酸／１ｍＭベンザミジン)を含む溶液中で、４μｇ／ｍｌの濃度でインキュベ ートした。インキュベーションを、４時間、室温で、攪拌用テーブル上で穏やか に攪拌しながらガラス製ペトリ皿中で行い、その後、攪拌せずに４℃で一晩行っ た。 特異的に結合したｅＬＤＬ及びネイティブなＬＤＬを、ニトロセルロース上で 、ヒトＬＤＬに対する抗体によって検出した。ヒツジの抗ヒトＬＤＬポリクロー ナル抗体(Boehringer Mannheim,IN,Indianapolis在)を大腸菌プライＥ細胞抽出 物で吸着してバックグラウンドを無くした。吸着のために、大腸菌プライＥ細胞 を対数期まで増殖させ、遠心分離で沈めて、１ｍＭ ＰＭＳＦ、２ｍＭε−アミ ノカプロン酸及び１ｍＭベンザミジンを含むＰＢＳ中に再懸濁した。この細胞懸 濁液を、次いで、８サイタルの凍結融解にかけた(液体窒素及び冷たい水道水へ の浸漬による)。抗ＬＤＬ抗体／細胞抽出物溶液を、穏やかに攪拌しながら、４ ℃で１時間インキュベートした(１ｍｌの抗体溶液／３ｍｇの粗細胞抽出物)。イ ンキュベーションの後に、この混合物を遠心分離して(１０，０００×ｇ；１０ 分間；４℃)、上清を、使用するまで０．０２％ＮａＮ₃の存在下で４℃で貯蔵し た。これらの膜を免疫スクリーニングのために次のように処理した：(ｉ)１％ゼ ラチンを含むＴＢＳＥＮでの室温で５分間ずつ３回の洗浄；(ii)１％ゼラチンを 含むｐＨ７．４のＰＢＳ中での３０分間のインキュベーション；(iii)吸着した ヒツジ抗ヒトＬＤＬ抗体(Boehringer Mannheim,IN，Indianapolis在)を含む新鮮 なＰＢＳ／ゼラチン溶液(１：１０００希釈)中で穏やかに攪拌しながら室温で２ 時間のインキュベーション；(iv)ＴＢＳ、ｐＨ７．４中での３回の簡単な洗浄； (ｖ)ロバの抗ヒツジアルカリホスファターゼ結合抗体(Sigma,MO,St.Louis在)を 含むＰＢＳ／ゼラチン溶液中で穏やかに攪拌しながら室温で１時間のインキュベ ーション；(vi)ＴＢＳ、ｐＨ７．４での３回の簡単な洗浄；及び(vii)アルカリ ホスファターゼ基質展開キット(Novagen Inc.)を用いての製造者の指示に従って の展開。ＬＢＰを生成したファージプラークは、これらの膜上で青色の「ドーナ ッツ」として現れた。 ＬＢＰｃＤＮＡを含む実施例１のファージをプラーク精製して、Novagcn Inc. より提供された「Autosubcloning by Cremediatcd Plasmid Excision」と呼ばれ るプ ロトコールに従ってプラスミドクローンに変換した。ジデオキシヌクレオチドチ エーンターミネーション法(Sanger等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 74:5463-5467(1 977))によりＤＮＡ配列を得て、Applied Biosystemsの自動化シーケンサーによ り分析した。各ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を、これらの ｃＤＮＡのセンス及びアンチセンス鎖の両方から得られた一致する配列から決定 した。配列決定は、３つの以前には知られていない遺伝子が単離されたことを確 実にした。これらの遺伝子は、ＬＤＬ結合についての機能的スクリーニングによ り選択されたので、これらの遺伝子によりコードされた蛋白質は、ＬＤＬ結合性 蛋白質(ＬＢＰ)、詳細にはＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３と呼ばれた。 ウサギのＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３のｃＤＮＡ配列並びに対応する 蛋白質を、SEQ ID NO:１０〜１４に示す。 各ｃＤＮＡのコード配列に基づいて、組換え蛋白質の大きさを、ＬＢＰ−１は １６．２ｋＤａ、ＬＢＰ−２は４０ｋＤａ、ＬＢＰ−３は６２．７ｋＤａである と決定した。実施例３ ：ＬＢＰｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを用いるウサギＲＮＡのノーザンブロッ ト分析 この実施例は、ＬＢＰｍＲＮＡの大きさ及び組織分布を説明する。全ＲＮＡを 種々のウサギ組織(副腎、胸部大動脈、腹大動脈、バルーン処理して内皮再生し た腹大動脈、心臓、腎臓、平滑筋細胞、肺、及び肝臓)から、トリゾール試薬(Li fe Technologies)により単離してエタノール沈殿により濃縮した。ＲＮＡのゲル 電気泳動を、１×ＭＯＰＳ緩衝液(０．２Ｍ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０；５０ｍＭ 酢酸ナトリウム；５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０)及び０．３７Ｍホルムアルデ ヒドを含む１．２％アガロースゲル中で行った。調べた各組織からの２０μｇの 全ＲＮＡをゲルに載せて、１００ボルトで１時間、１×ＭＯＰＳ緩衝液中で電気 泳動した。ＲＮＡを、支持されたニトロセルロース膜(Schleichcr & Schuell,NH ,Keene在)上にブロットして、８０℃に２時間ベークすることにより固定化した 。放射性標識したＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ プローブへのハイブリダイゼーションを、当業者に公知の標準的手順によって行 い(例えば 、Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology;John Wiley & Sons(198 9)参照)；シグナルをオートラジオグラフィーにより検出した。 結果は、次の通りであった：ｍＲＮＡの大きさは、ＬＢＰ−１は約１．３ｋｂ であり、ＬＢＰ−２は約２．３〜２．５ｋｂであり、ＬＢＰ−３は約４．７ｋｂ であった。ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３ｍＲＮＡは、試験したすべて の組織で見出されたが、最大量は、バルーン処理した腹大動脈内であった。実施例４ ：ヒトＬＢＰｃＤＮＡの単離 この実施例は、ヒトＬＢＰｃＤＮＡの単離を説明する。ヒトＬＢＰｃＤＮＡク ローンを、３つのｃＤＮＡライブラリーから単離した。ヒト胎児脳ｃＤＮＡライ ブラリーをカリフォルニア、LaJolla在、Stratageneから、ヒト大動脈ｃＤＮＡ ライブラリーをカリフォルニア、Palo Alto在、Clontechから得て、ウサギＬＢ Ｐ−１、ＬＢＰ−２又はＬＢＰ−３由来の放射性標識したｃＤＮＡプローブを用 いて、Law等,Gene Expression 4:77-84(1994)に記載された方法に従ってスクリ ーニングした。幾つかの強くハイブリダイズするクローンを同定してプラーク精 製した。クローンは、ジデオキシチェーンターミネーション法を用いるＤＮＡ配 列決定及びApplied Biosystems自動化シーケンサーによる分析によって、ヒトの ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３であることが確認された。これらのｃＤ ＮＡ配列及びヒトのＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３の対応する蛋白質を SEQ ID NO:１５、１６及び１７にそれぞれ示す。ウサギとヒトの対応するＬＢＰ −１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３蛋白質配列の比較を、図１９、２０及び２１に 示す。実施例５ ：組換えのＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３ウサギ蛋白質の大腸 菌からの単離 ＬＢＰｃＤＮＡを、実施例１及び２で得られた元のｐＥＸｌｏｘプラスミドか ら単離して、組換え蛋白質の発現のために、ｐＰＲＯＥＸ−ＨＴベクター(Life Technologies)中にサブクローン化した。トランスフォームした大腸菌ＤＨ１０ Ｂ培養物中へのＩＰＴＧの添加による組換え蛋白質の誘導は、６−ヒスチジンタ グ (Ｎ末端)を含む組換え蛋白質の発現を生じた。このタグを付けた蛋白質を、次い で、全細胞蛋白質から、Ｎｉ−ＮＴＡ(ニッケルニトリロ三酢酸)への結合により 、製造者(Qiagen,Inc.,CA,Santa Clara在)により提供されたプロトコールに記載 されたようにして精製した。クロマトグラフィーステップの後に得られた標品は 、約９０％の純度であり；調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、最終精製ステップとして 行った。 特性決定手順により必要とされる場合には、ＬＢＰのヨウ素化を、ヨードビー ズ(Pierce,IL,Rockford在)を用いて行った。これらのヨードビーズを５００μＣ ｉのＮａ¹²⁵Ｉ溶液(１７Ｃｉ／ｍｇ)(New England Nuclear,MA,Boston在)と共に 、キャップをした小型遠心分離機用チューブ中で５分間室温でインキュベートし た。この蛋白質溶液を、ヨードビーズ−Ｎａ¹²⁵Ｉの小型遠心分離機用チューブ に加えて、１５分間室温でインキュベートした。このインキュベーションの最後 に、アリコートを、全溶解性カウント及びＴＣＡ沈殿されたカウントの測定のた めに採取した。この放射性標識された蛋白質を、次いで、冷アセトン(２．５容 ；−２０℃；２．５時間)で沈殿させた。このインキュベーションの後に、沈殿 した蛋白質を遠心分離(１４，０００ｇ；１時間；室温)により集めて、試料用緩 衝液(６Ｍ尿素／５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０／２ｍＭ ＥＤＴＡ)に再懸濁した 。この蛋白質標品の完全性をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。 これらの組換えＬＢＰの正体を、当業者に公知の標準的な蛋白質配列決定プロ トコールを用いて確認した。(A Practical Guide for Protein and Peptide Pur ification for Microsequencing,Matsudaira編、Academic Press,Inc.,第二版(1 993))。分析を、Applied Biosystemsモデル477A蛋白質シーケンサー及びオンラ インモデル120PTHアミノ酸アナライザーを用いて行った。実施例６ ：ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３に対する抗体の産生 この実施例は、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３に対するポリクローナ ル抗体の産生を説明する。精製した組換えＬＢＰ蛋白質(０．５ｍｌ；２００μ ｇ)とＲＩＢＩアジュバント(RIBI ImmunoChem Research,Inc.,MT,Hamilton在)と の混合物を、雄のモルモット(Dunkin Hartley;Hazelton Research Products,Inc .,P A,Denver在)に、背側の胸部及び腹部領域に沿って３〜５カ所に皮下注射した。 静脈穿刺により、１日目(免疫化前)、２８日目、４９日目及び７０日目に採血し た。追加抗原を２１日目(１００μｇ；ＳＣ)、４２日目(５０μｇ；ＳＣ)、及び ６３日目(２５μｇ；ＳＣ)に投与した。このモルモットの抗血清の力価を一連の 希釈物の「ドットブロッティング」により評価した。免疫化前抗血清を同時に評 価した。ＬＢＰ蛋白質の第三の追加免疫の後に、この組換え蛋白質に対する力価 は、１５６ｐｇのドットブロットアッセイ上の検出可能な比色応答における最高 レベルに達した。 組換えＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２又はＬＢＰ−３に対するポリクローナル抗体の 特異性を、ウエスタンブロット分析(Towbin等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:435 0(1979))を用いて示した。この蛋白質−抗体複合体を、アルカリホスファターゼ 結合ヤギ抗モルモットＩｇＧを用い、続いてニトロブルーテトラゾリウム(BioRa d Laboratories,CA,Hercules在)で染色することによって免疫化学的に可視化し た。非特異的結合を、トリス緩衝塩溶液(１００ｍＭトリス；０．９％ＮａＣｌ 、ｐＨ７．４)中の３％脱脂粉乳を用いてブロックした。実施例７ ：免疫組織化学的特性決定 この実施例は、プラークを覆う内皮細胞内又は該細胞上の、隣接する平滑筋細 胞内又は該細胞上の、及び細胞外マトリクス中のＬＢＰの存在を説明する。更に 、ＬＤＬ及びＬＢＰの同所局在性を示した。これらの結果は、バルーン処理した ウサギの動脈病変及びヒトのアテローム性動脈硬化症のプラークを免疫組織化学 的方法により調べることにより得られた。 バルーン処理して内皮剥奪した大動脈を、組織採取の２４時間前にヒトのＬＤ Ｌ軟塊の注射(３ｍｇ；ｉ．ｖ．)をしたウサギから得た。アテローム性動脈硬化 症のプラークを含むヒトの大動脈を、日常的な剖検試料から得た。組織を、１０ ％緩衝ホルマリン(≦２４時間)にて固定し、自動化組織包埋機を用いてパラフィ ンに包埋した。組織切片を切り(５〜７μ)、１時間６０℃でインキュベートする ことによりスライドガラス上に載せた。切片をパラフィン除去した。脱イオン化 Ｈ₂Ｏでの最終的洗浄の後に、内因性ペルオキシダーゼ活性を、これらの切片を １ ％Ｈ₂Ｏ₂／Ｈ₂Ｏ緩衝液と室温で５分問インキュベートすることにより除去した 。切片をリン酸緩衝塩溶液(ＰＢＳ)で５分間室温ですすぎ、非特異的結合を５％ 正常ヤギ血清又は５％正常ウサギ血清でブロックした｛二次抗体(Sigma,MO,St.L ouis在)の起源に依存(１時間；室温)}。次いで、切片を、組換えＬＢＰ−１、Ｌ ＢＰ−２又はＬＢＰ−３のウサギ型に対するモルモットのポリクローナル抗体の １：５０希釈物(５％正常ヤギ血清／ＰＢＳ中)と共にインキュベートした。対照 は、免疫化前血清並びにＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２又はＬＢＰ−３に対する特異的 抗体を含んだ(そこでは、一次抗体は、組織とのインキュベーションの前に、組 換えＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２又はＬＢＰ−３とのインキュベーションとその後の 遠心分離によって完全に吸着除去された)。ヒトのアポリポ蛋白質Ｂに対するア フィニティー精製したウサギのポリクローナル抗体(Polysciences Inc.;PA,Warr ington在)を、１：１００の希釈物として用いた(５％正常ウサギ血清／ＰＢＳ中 )。切片を、２時間、室温で、加湿チャンバー中でインキュベートした。インキ ュベーションの最後に、切片を、ＰＢＳですすぎ、ヤギ抗モルモットビオチン化 ＩｇＧ結合体(Vector Laboratories,CA,Burlingame在)の１：２００希釈物(５％ 正常ヤギ血清／ＰＢＳ中)と又はウサギ抗ヤギビオチン化ＩｇＧ結合体(Vector L aboratories,CA,Burlingame在)の１：２５０希釈物(５％正常ウサギ血清／ＰＢ Ｓ中)と１時間、室温で、加湿チャンバー中でインキュベートした。次いで、切 片を、ＰＢＳですすぎ、抗原−抗体シグナルをアビジン／ビオチンＨＲＰ結合体 (Vectastain ABCキット；Vector Laboratories,CA,Burlingame在)を用いて増幅 した。切片を、ＤＡＢ基質を用いて展開させ(４〜６分間；室温)、ヘマトキシリ ンで対比染色した。 バルーン処理したウサギの動脈において、抗ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢ Ｐ−３抗体を用いる免疫組織化学は、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３が 再生中の内皮島の縁の機能的に改変された内皮細胞内に及び該細胞上に局在する ことを示した{不可逆的ＬＤＬ結合が示された同様の局在}(Chang等,Arterioscle rosis and Thrombosis 12:1088-1098(1992))。ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢ Ｐ−３は又、機能的に改変された内皮細胞の下の脈管内膜平滑筋細胞内又は該細 胞上にも見出され、一層少ないが、細胞外マトリクスにも見出された。ＬＢＰ− １ 、ＬＢＰ−２又はＬＢＰ−３は、ＬＤＬ結合が可逆的であることが示された依然 内皮剥奪されたままの領域では、検出されなかった(Chang等,Arteriosclerosis and Thrombosis 12:1088-1098(1992))。バルーン処理したウサギの大動脈の抗ヒ トアポリポ蛋白質Ｂ抗体を用いる免疫組織化学は、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及び ＬＢＰ−３について見出されたのと同じ局在性のＬＤＬの存在を示した。 日常的剖検において得られたヒトのアテローム性プラークにおいて、抗ＬＢＰ −１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３抗体を用いた免疫組織化学は、ＬＢＰ−１、Ｌ ＢＰ−２及びＬＢＰ−３がプラークを覆う内皮細胞内又は該細胞上及び隣接する 平滑筋細胞内又は該細胞上にも見出されることを示した。ヒトの組織においては 、細胞外マトリクス中のＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３の一層多くの証 拠があった。 これらのパラフィン切片を用いて得られた結果は、凍結切片のものと同一であ った。実施例８ ：ＬＢＰとＬＤＬ又はＨＤＬとのアフィニティー同時電気泳動(ＡＣＥ) 分析 この例は、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２又はＬＢＰ−３とＬＤＬとの間で結合が起 きること、及びＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２又はＬＢＰ−３とＨＤＬ(高密度リポ蛋 白質)との間では結合が起きないという事実により説明されるように、この結合 が特異的であることを示す。 組換えのウサギＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２又はＬＢＰ−３のＬＤＬへの結合の親 和性及び特異性の分析を、アフィニティー電気泳動の原理(Lee及びLander,Proc. Natl.Acad.Sci.USA 88:2768-2772(1991))を用いて行った。溶融アガロース(１％ ；６５℃)を、５０ｍＭ ＭＯＰＳナトリウム(ｐＨ７．０)；１２５ｍＭ酢酸ナ トリウム、０．５％ＣＨＡＰＳにて調製した。９つの平行なバーよりなるテフロ ン製のコーム(４５×４×４ｍｍ／３ｍｍのバー間隔)を、プレキシガラス製のキ ャスティングトレーに適合させたGelBondフイルム(FMC Bioproducts,ME,Rocklan d在)上に、バーの長軸をキャスティングトレーの長軸に平行に置いた。テフロン 製ストリップ(６６×１×１ｍｍ)を、縁に、その長軸をキャスティングトレーの 短軸 に平行に、テフロン製コームの縁から４ｍｍの距離に置いた。次いで、溶融アガ ロース(＞６５℃)を、注いで約４ｍｍの高さを達成した。コーム及びストリップ の除去は、９つの４５×４×４ｍｍの矩形のウェル(６６×１ｍｍのスロットに 隣接)を含むゲルを生じた。ＬＤＬ又はＨＤＬ試料を、ゲル緩衝液(５０ｍＭ Ｍ ＯＰＳナトリウム、ｐＨ７．０、１２５ｍＭ酢酸ナトリウム)にて、所望濃度の ２倍で調製した。次いで、試料を、等容の溶融アガロース(５０ｍＭ ＭＯＰＳ 、ｐＨ７．０；１２５ｍＭ酢酸ナトリウム；５０℃)と混合して、ピペットで適 当な矩形ウェルに注ぎ、ゲル化させた。ＬＢＰ−１及びＬＢＰ−３の結合親和性 及び特異性を、幾つかの濃度のＬＤＬ(５４０〜１４ｎＭ)及びＨＤＬ(２８４０ 〜１７７ｎＭ)を用いて試験した。一定量(０．００３〜０．０１６ｎＭ)の¹²⁵Ｉ 標識したＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２又はＬＢＰ−３(５０ｍＭ ＭＯＰＳナトリウ ム、ｐＨ７．０；１２５ｍＭ酢酸ナトリウム；０．５％ブロモフェノールブルー ；６％(ｗｔ／ｖｏｌ)シュークロース中に懸濁)を、このスロットに載せた。ゲ ルを、７０ｖ／２時間／２０℃で電気泳動した。この操作の最後に、ゲルを風乾 して、遅延プロフィルを、Ｘ線フィルムをゲルに一晩−７０℃で増感スクリーン と共に露出することにより可視化した。 ＬＤＬは、ゲル中でのＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３の移動を、濃度 依存の飽和し得る様式で遅延させ、これは、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ −３のＬＤＬへの結合が高度に特異的であることを示している。この結論は、Ｈ ＤＬがＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２又はＬＢＰ−３を遅延させないという事実によっ て支持される。アフィニティー同時電気泳動アッセイから生成した結合曲線は、 ＬＢＰ−１が２５．６ｎＭのＫ_dでＬＤＬに結合すること、ＬＢＰ−２(ウサギの クローン２６)が１００ｎＭのＫ_dでＬＤＬに結合すること、及びＬＢＰ−３(８ ０ｋＤａの断片)が３３３ｎＭのＫ_dでＬＤＬに結合することを示した。 ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３のＬＤＬへの結合の親和性及び特異性 を試験することに加えて、「コールド」の(即ち、放射性標識してない)ＬＢＰ− １、ＬＢＰ−２又はＬＢＰ−３が、それぞれ、放射性標識したＬＢＰ−１、ＬＢ Ｐ−２又はＬＢＰ−３のＬＤＬへの結合を競争的に阻害する能力を試験した。競 争研究を、固定した濃度のコールドなＬＤＬと放射性標識したＬＢＰ−１及び増 大する量のコールドな組換えＬＢＰ−１(６〜３１μＭ)を用いて行った。ＡＣＥ アッセイ試料とゲルをここに記載したように調製した。コールドなＬＢＰ−１は 、放射性標識したＬＢＰ−１のＬＤＬへの結合を濃度依存的様式で阻害し、コー ルドなＬＢＰ−２は、放射性標識したＬＢＰ−２のＬＤＬへの結合を濃度依存的 様式で阻害し、コールドなＬＢＰ−３は、放射性標識したＬＢＰ−３のＬＤＬへ の結合を濃度依存的様式で阻害した。 ウサギ及びヒトのＬＢＰ−２は、酸性アミノ酸の長いストレッチをアミノ末端 に含む(ウサギＬＢＰ−２のアミノ酸残基１０５〜１３２及びヒトのＬＢＰ−２ のアミノ酸残基８〜３３)。ＬＢＰ−２のこのセグメントがＬＤＬ結合ドメイン である可能性を、この酸性領域の存否によって互いに異なる２つのウサギＬＢＰ −２クローン(クローン２６及び４５)を当業者に公知の標準的方法によって発現 ベクター中にサブクローニングすることにより試験した。次いで、ＡＣＥアッセ イを、これらの２つのクローンのＬＤＬへの結合の親和性及び特異性を評価する ために行った。ＬＤＬは、クローン２６由来の放射性標識したＬＢＰ−２のゲル 中の移動を濃度依存性の飽和し得る様式で遅延させたが、クローン４５由来の放 射性標識したＬＢＰ−２の移動は遅延されなかった。 固定した濃度のコールドなＬＤＬ及びクローン２６由来の放射性標識したＬＢ Ｐ−２並びに増大する濃度のコールドな組換えＬＢＰ−２／クローン２６及びＬ ＢＰ−２／クローン４５を用いて、競争研究を行った。コールドなクローン２６ 由来のＬＢＰ−２は、クローン２６由来の放射性標識したＬＢＰ−２のＬＤＬへ の結合を濃度依存的様式で阻害した。他方、クローン４５由来のＬＢＰ−２は、 クローン２６由来の放射性標識したＬＢＰ−２のＬＤＬへの結合に影響しなかっ た。これらの結果は、酸性アミノ酸の長いストレッチがＬＢＰ−２のＬＤＬへの 結合ドメインを含むことを示している。実施例９ ：インヒビターの存在下でのＬＢＰ−１又はＬＢＰ−２とＬＤＬとのア フィニティー同時電気泳動(ＡＣＥ)アッセイ この実施例は、ＬＢＰ−１又はＬＢＰ−２とＬＤＬとの間の結合がポリグルタ ミン酸又はＢＨＦ−１により阻害されるということを説明する。第三の化合物が 前に相互作用することを示した２つの蛋白質の間の結合を阻害する能力を、実施 例８に記載したＡＣＥアッセイの改変によって試験した。この第三の化合物を、 上に又はウェルに加えた(放射性標識した蛋白質と共に)。もしこの第三の化合物 が結合を阻害したならば、放射性標識された蛋白質は、ゲルを通って進むであろ う。もしこの第三の化合物が結合を阻害しなかったならば、放射性標識した蛋白 質の移動は、ゲル中への蛋白質キャストにより遅延された。 ＬＢＰ−１／ＬＤＬ又はＬＢＰ−２／ＬＤＬ結合のポリグルタミン酸(平均Ｍ Ｗ約７５００、約７モノマーに相当)による阻害が、これらのすべての矩形レー ン内の一定量のＬＤＬ(１４８ｎＭ)のキャストにより示された。一定量(１μｌ) の¹²⁵Ｉ標識したＬＢＰ−１又はＬＢＰ−２(０．００３〜０．０１６ｎＭ)をゲ ル上部のウェル中に、増大する濃度のポリグルタミン酸(Sigmaから得た)(０〜０ ．４ｎＭ)と共に載せた。このゲルを、７０ボルトで２時間にわたって電気泳動 し、乾燥して、増強スクリーンと共にＸ線フィルム上に一晩−７０℃で置いてか ら、そのフィルムを現像してＬＢＰ−１及びＬＢＰ−２の遅延プロフィルを測定 した。ポリグルタミン酸濃度を増すにつれて、放射性標識したＬＢＰ−１及びＬ ＢＰ−２の移動のＬＤＬによる遅延は、濃度依存的様式で減少し、これは、ポリ グルタミン酸がＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２とＬＤＬとの間の結合を阻害することを 示した。 ＬＢＰ−１／ＬＤＬ結合のＢＨＦ−１による阻害は、一定量のＬＤＬ（１４８ ｎＭ）のキャスティングによりすべての矩形レーンにおいて示された。一定量の¹²⁵ Ｉ標識したＬＢＰ−１(０．００３〜０．０１６ｎＭ)を、ゲル上部のウェル に、実施例１５に記載したように得た増大する濃度のＢＨＦ−１(０〜１０ｎＭ) と共に載せた。このゲルを、７０ボルトで２時間にわたって電気泳動し、乾燥し て、増強スクリーンと共に、Ｘ線フィルム上に−７０℃で一晩置いた。次いで、 このフィルムを現像して¹²⁵Ｉ−ＬＢＰ−１の遅延プロフィルを測定した。ＢＨ Ｆ−１の濃度が増大するにつれて、ＬＢＰ−１のＬＤＬによる遅延は、濃度依存 的様式で減少し、これは、ＢＨＦ−１がＬＢＰ−１とＬＤＬとの間の結合を阻害 することを示した。実施例１０ ：ＬＤＬに結合するＬＢＰの断片、アナログ及び模倣物を同定するた めのアフィニティー同時電気泳動(ＡＣＥ)アッセイ この実施例は、ＬＤＬに結合し、それ故、ＬＤＬ分子上の結合部位を占めるこ とによりこれらの部位を動脈壁内のＬＢＰへの結合に利用できなくすることによ ってＬＤＬのＬＢＰへの結合のインヒビターとして用いることのできるＬＢＰの 断片、アナログ及び模倣物を同定するための方法を説明する。 ＬＢＰの断片は、化学的開裂により生成され又は既知のアミノ酸配列から合成 する。これらの断片の試料(コールド)を、個々に、放射性標識したＬＢＰに実施 例８に記載のように加えて、種々の断片の潜在的阻害能力を評価する。阻害性で あると同定された断片の一層小さい部分へのこの手順の反復適用により、最も小 さい活性ポリペプチド断片を同定する。同様の方法において、ＬＢＰのアナログ を試験して、ＬＤＬへの結合によりインヒビターとして作用し得るアナログを同 定する。そして、同様にして、ＬＢＰの模倣物(ＬＢＰ分子上のＬＤＬ結合部位 のコンホメーション及び／又は電荷分布を真似る分子)を、類似の方法で試験し て、ＬＢＰ上のＬＤＬ結合部位に対する親和性を示す分子を同定する。 このように同定されたインヒビターの親和性は、少なくとも、ＬＢＰ上のＬＤ Ｌ結合部位に対するＬＤＬ自身の親和性と同程度の強さである。これらのインヒ ビターは、少なくとも競争的に、そして幾らか不可逆的に、そしてその上優先的 にＬＤＬ結合部位に結合し、それにより、かかる部位を体液性ＬＤＬへの結合に 利用できなくする。実施例１１ ：ＥＬＩＳＡアッセイ この実施例は、試験化合物のＬＤＬの特異的ＬＢＰへの結合を阻止する能力の 定量のためのＥＬＩＳＡプレートアッセイの利用を説明する。 このアッセイを次のように行う：ＬＤＬを５０ｍＭ Ｎａ₂ＣＯ₃、ｐＨ９．６ ／０．０２％ＮａＮ₃にて希釈し、９６ウェルプレート(Immuno Ware 96-Well Re acti-Birid EIA Polystyrene Plates;Pierce(IL,Rockford在))のウェルに加えて ウェル当たり０．１〜１μｇの終濃度を達成した。これらのプレートを室温で６ 時間インキュベートした。インキュベーション期間の最後に、これらのウェルを トリ ス緩衝塩溶液、ｐＨ７．４(ＴＢＳ)で３回洗い、２００μｌの１％ウシ血清アル ブミン(ＢＳＡ){ＴＢＳ／０．０２％ＮａＮ₃(Sigma;MO St.Louis在)中}で一晩室 温でブロックした。次いで、これらのウェルを２００μｌのＴＢＳ中のＬＢＰ蛋 白質(５〜１０μｇ／ウェル)とインキュベートし、試験化合物の濃度を変化させ た。プレートを１時間室温でインキュベートした。次いで、これらのウェルをＴ ＢＳで３回洗い、２時間にわたって２００μｌのＴＢＳ／０．０２％ＮａＮ₃中 の１％ＢＳＡで室温でブロックした。インキュベーション期間の最後に、これら のウェルをＴＢＳで３回洗い、適当なモルモットの抗ＬＢＰ蛋白質ポリクローナ ル抗体の１：１０００希釈物(ＴＢＳ／０．０５％ツイーン２０中)をこれらのウ ェルに加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、これらのウェルを、Ｔ ＢＳ／０．０５％ツイーン２０で３回洗い；ヤギ抗モルモットＩｇＧアルカリホ スファターゼ結合体(Sigma)の１：３０，０００希釈物を各ウェルに加えた。プ レートを１時間室温でインキュベートした。これらのウェルを、ＴＢＳ／０．０ ５％ツイーン２０で３回洗い、２００μのｐ−ニトロフェニルホスフェート基質 (Sigma;MO，St.Louis在)をこれらのウェルに加えることにより比色反応を行った 。この反応を室温で３０分間進行させ、５０μｌの３Ｎ ＮａＯＨにより停止さ せた。吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍで測定した 。この試験化合物の、ＬＤＬの組換え蛋白質への結合のブロックにおける有効性 を、対照群と処理群の吸光度値を比較することにより評価した。 別法として、ＬＤＬではなく、ＬＢＰをプレートに結合した。組換えＬＢＰ蛋 白質のＬＤＬへの結合及びインヒビター濃度を変えることのＬＢＰ−ＬＤＬ結合 に対する影響を、ＬＤＬに対する抗体を用いて測定した。この相互作用を、レポ ーター酵素(例えば、アルカリホスファターゼ)に結合させた第２抗体の利用によ り可視化した。 ＥＬＩＳＡプレートアッセイを用いて、ＬＢＰ蛋白質のＬＤＬへの結合に影響 を与え得る薬剤をスクリーニングした。例えば、ＬＢＰ−１及びヒトのＬＢＰ− ３蛋白質配列由来のペプチド(それぞれ、ＢＨＦ−１及びＢＨＦ−２)を合成して 、ＬＤＬの組換えＬＢＰ−１及びＬＢＰ−２(この形式)への結合を減ずることが 示されている。これらの結果は、ＡＣＥアッセイにより得られたものと一致した 。実施例１２ ：ＬＢＰ上のＬＤＬ結合部位をブロックするためのＬＢＰに対するヒ ト化抗体の投与 この実施例は、動脈のＬＢＰ分子上のＬＤＬ結合部位をブロックするための、 ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２又はＬＢＰ−３に対するヒト化抗体の患者への投与を説 明する。マウスモノクローナル抗体を、組換えＤＮＡ技術によってヒト化し、当 業者に公知の標準的手順(Berkower,I.,Curr.Opin.Biotechnol.7:622-628(1996) ；Ramharayan及びSkaletsky,Am.Biotechnol.Lab 13:26-28(1995))によって、Ｌ ＢＰ及び／又はＬＢＰ上のＬＤＬ結合部位に対して生成した。対応するＦａｂ断 片も又、Goding,J.W.,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academ ic Press,New York,NY(1986)に記載されたようにして製造する。これらの抗体を 、十分な量で(即ち、１日当たり１〜１０ｍｇ／ｋｇ)、ＬＢＰ分子上のＬＤＬ結 合部位をブロックするように非経口的に投与する。これは、ＬＤＬの酸化を促進 するのに必要とされる動脈によるＬＤＬの不可逆的取込みを予防する。実施例１３ ：ＬＤＬの調製 この実施例は、ＬＤＬの調製を説明する。ＬＤＬを、ノルモ脂血症の(normoli pemic)ドナーの血漿から調製した(Chang等,Arterioscler.Thromb.12:1088-1098( 1992))。１００ｍｌの全血液を１００ｍＭ ＥＤＴＡナトリウムを含む管に入れ た。血漿を、赤血球から低速遠心分離(２，０００ｇ；３０分間；４℃)により調 製した。血漿の密度を、ＫＢｒ溶液を用いて１．０２５ｇ／ｍｌに調節して、１ ８〜２０時間にわたって、１００，０００×ｇで、１２℃で遠心分離した。超低 密度リポ蛋白質(ＶＬＤＬ)を、パスツールピペットを用いて遠心管の上部から取 り出した。浮遊物(infranate)の密度を、ＫＢｒ溶液を用いて１．０５０ｇ／ｍ ｌまで高め、２２〜２４時間、１００，０００×ｇで、１２℃で遠心分離した。 ＬＤＬを、遠心管の上部からパスツールピペットチップでの吸い出しにより取り 出した。このＬＤＬ標品の純度を、ヒトＬＤＬ、ヒトＨＤＬ、ヒト免疫グロブリ ン及びヒトアルブミンに対する抗体に対するオクタロニー二重免疫拡散法により チェ ックした。ＫＢｒをＬＤＬ溶液から、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１０μＭブチル化ヒ ドロキシトルエン(ＢＨＴ)(後者は、ＬＤＬの酸化を防止する)を含む０．９％塩 溶液、ｐＨ９．０に対する透析(１Ｌ、×２，≒１６時間)により除去した。透析 の後に、ＬＤＬ蛋白質をローリー法(Lowry等,J.Biol.Chem.193:265-275(1951)) によって測定し、このＬＤＬを、使用まで４℃で貯蔵した。ＬＤＬ標晶は、最長 で４〜６週間保存した。実施例１４ ：ＨＤＬの調製 この実施例は、ＨＤＬの調製を説明する。ＨＤＬをノルモ脂血症のドナーの血 漿から調製した。１００ｍｌの全血液を、１００ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウムを 含む管に入れ、血漿を遠心分離（２０００ｇ；３０分間；４℃)によって集めた 。次いで、血漿中に存在するアポリポ蛋白質Ｂ含有リポ蛋白質を、ヘパリンナト リウム(５，０００単位／ｍｌ)及びＭｎＣｌ₂(１Ｍ)の順次的添加（それぞれ、 ２００単位／ｍｌ及び０．４６Ｍの終濃度まで)によって沈殿させた(Warnick及 びAlbcrs,J.Lipid Res.19:65-76(1978))。次いで、試料を遠心分離した(２００ ０ｇ；１時間；４℃)。上清を集めて、密度を、固体のＫＢｒをゆっくり加える ことにより１．２１ｇ／ｍｌに調節した。ＨＤＬを、超遠心分離(１００，００ ｇ；＞４６時間；１２℃)により分離した。このＨＤＬ標品の純度を、ヒトＨＤ Ｌ、ヒトＬＤＬ、ヒト免疫グロブリン及びヒトアルブミンに対する抗体を用いる オクタロニー二重免疫拡散試験により評価した。ＨＤＬ試料を、塩溶液ｐＨ９． ０／１ｍＭＥＤＴＡ／１０μＭ ＢＨＴ(４Ｌ；２４時間／４℃)に対して透析し 、全蛋白質をローリーの蛋白質アッセイ(Lowry等,J.Biol.Chem.193:265-275(195 1))によって測定した。ＨＤＬを、使用まで４℃で貯蔵した。ＨＤＬ標品は、最 長で２週間保存した。実施例１５ ：ＢＨＦ−１の合成 この実施例は、ＢＨＦ−１、ヒト又はウサギのＬＢＰ−１の断片(アミノ酸残 基１４〜３３を含む)の合成を説する。ＢＨＦ−１を、Applied Biosystems Mode l 430Aペプチドシンセサイザー(標準的Ｔ−ＢｏｃＮＭＰ化学サイクルを使用)を 用いて合成した。ＢＨＦ−１の配列は、下記の通りである：合成後、このペプチドを、フッ化水素酸／アニソール(１０／１ ｖ／ｖ)により １０℃、３０分間で開裂させ、次いで、０℃で３０分間インキュベートした。次 いで、ＢＨＦ−１を沈殿させて３回洗った(冷ジエチルエーテル使用)。アミノ酸 カップリングをニンヒドリン試験(＞９９％）によりモニターした。 このＢＨＦ−１ペプチドを、均質になるまで、逆相Vydac Ｃ₄カラム(２．２４ ×２５ｃｍ)にて、直線的勾配分離(２〜９８％Ｂ；６０分間)と９ｍｌ／分の流 量を用いて、高性能液体クロマトグラフィーにより精製した。緩衝液Ａは、０． １％のトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)／Milli Q水よりなり、緩衝液Ｂは、０．０８ ５％ＴＦＡ／８０％アセトニトリルよりなった。この勾配を、室温で流し、吸光 度を２１０及び２７７ｎｍにてモニターした。 高速原子衝撃質量分析は、プロトン化分子イオンピーク(Ｍ＋Ｈ)⁺を、ｍ／ｚ ＝２２９０．２に与え、これは、計算値とよく一致した。アミノ酸分析において 、ペプチド中の比較的多い各アミノ酸についての実験値は、理論値とよく一致し た。凍結乾燥したペプチドを−２０℃で貯蔵した。実施例１６ ：ＬＤＬとＬＢＰとの間の結合を阻害する薬剤のイン・ビトロスクリ ーニング この実施例は、ＬＤＬとＬＢＰとの間の結合を阻害する薬剤のイン・ビトロス クリーニングを説明する。 薬剤であることについての候補のポリペプチドを選択する(例えば、ＬＢＰ− １、ＬＢＰ−２、ＬＢＰ−３、ＢＨＦ−１又は任意の他のポリペプチド)。ＬＤ ＬのＬＢＰへの結合をイン・ビトロで阻害するポリペプチドの最短の断片を決定 する。ペプチドを、ここに記載の標準的技術によって合成する。阻害アッセイを 、ス クリーニングのための標準的ＥＬＩＳＡ技術を用いて行い、ここに記載のように アフィニティー同時電気泳動(ＡＣＥ)アッセイを行ってＥＬＩＳＡの結果を確認 した。短いペプチド(例えば、２量体〜２０量体)を、候補のポリペプチドの配列 を横切って構築する(該配列の化学的特性は、それらをありそうなＬＤＬ結合部 位例えば酸性領域にする)。一層短い長さのこれらのペプチドのＬＤＬの結合及 び培養哺乳動物細胞に対する結合を阻害する能力を試験する。例えば、このペプ チドの、ＬＢＰ遺伝子を発現するようにトランスフェクトされた哺乳動物細胞に おけるＬＤＬ結合の阻害に対する効果を試験する。インヒビターとして同定され たこれらのペプチドの各々を、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３の各々を 用いて試験して、単一のインヒビターがすべての３つのＬＢＰに対して作用する かどうかを測定する。 一度最小活性配列が決定されれば、このペプチドの主鎖を、ここに記載のよう に、蛋白質分解を阻止するように改変する。例えば、改変を、カルボニルの代わ りにスルホキシドを代用することにより、ペプチド結合を逆にすることにより、 カルボニル基の代わりにメチレンを代用することにより、又は他の類似の標準的 方法によって達成する。Spatola,A.F.,「Peptide Backbone Modifications:A St ructure-Activity Analysis of Peptides Containing Amide Bond Surrogates,C onformational Constraints,and Related Backbone Replacements,」{Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides and Proteins,Vol.7,p.267-357,B .Weinstein(編),Marcel Dekker,Inc.,New York(1983)}を参照されたい。これら のアナログのＬＤＬのＬＢＰへの結合をイン・ビトロで阻害する能力を、ＥＬＩ ＳＡ及びＡＣＥアッセイにより、上記の天然のペプチドに対するのと同じ仕方で 試験する。実施例１７ ：培養哺乳動物細胞を用いるＬＤＬとＬＰＢとの間の結合を阻害する 薬剤のイン・ビトロスクリーニング この実施例は、ＡＣＥアッセイ及びＥＬＩＳＡ等のイン・ビトロ試験によりＬ ＤＬとＬＢＰとの間の結合の潜在的インヒビターであることが示された薬剤の細 胞ベースのイン・ビトロスクリーニングを説明する。 組換え遺伝子構築物の発現のために一般に用いられる哺乳動物細胞例えば２９ ３細胞を用いて、ＬＢＰを細胞表面で発現する細胞株を開発する。これは、ＬＢ Ｐのオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を哺乳動物用発現プラスミドベクタ ーｐＤｉｓｐｌａｙ(Invitrogen,CA,Carlsbad在)(これは、細胞表面上に関心あ る遺伝子を発現するようにデザインされている)中にサブクローン化することに より行う。ＬＢＰを生成するために哺乳動物細胞を利用することは、機能的に活 性なネイティブなコンホメーションでのそれらの発現を与える。それ故、ＬＢＰ の表面発現を有する安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞は、個々に又は 組み合わせて、細胞培養中のＬＤＬ結合をブロックするインヒビターをアッセイ し及びスクリーニングするのに並びにこれらの化合物の細胞毒性を評価するのに 特に適している。 特に、ＬＢＰＯＲＦは、ｃＤＮＡテンプレートから、Ｔａｑポリメラーゼ(Pcr kin Elmer)及び適当なプライマーを用いて、ＰＣＲ(Perkin Elmer,CA,Foster Ci ty在)により増幅される。これらの増幅されたＬＢＰＯＲＦを、アガロースゲル 電気泳動により精製し、ゲルスライスからBio-Rad ＤＮＡ精製キット(Bio-Rad,C A,Hercules在)を用いて抽出する。次いで、これらの精製したＤＮＡを、制限酵 素ＢｇｌII及びＳａｌＩ(New England Biolabs,MA,Beverly在)で切断して粘着末 端を生成し、上記のアガロースゲル電気泳動とＤＮＡ抽出により再精製する。次 いで、これらのＬＢＰＯＲＦを、哺乳動物用発現ベクターｐＤｉｓｐｌａｙ(Inv itrogen)のＢｇｌII／ＳａｌＩ部位に、ライゲーションによりサブクローン化す る。組換えプラスミドを、大腸菌株ＴＯＰ１０(Invitrogen)又はＤＨ５α(Life Technologies,NY,Grand Island在)におけるトランスフォーメーションにより樹 立する。組換えｐＤｉｓｐｌａｙ／ＬＢＰプラスミドＤＮＡを、大腸菌一晩培養 物からBio-Radプラスミドミニプレプキットを用いて単離し、ＢｇｌII／Ｓａｌ Ｉで切断して、アガロースゲル電気泳動により分析する。上首尾にトランスフォ ームされたクローン中のＬＢＰＯＲＦを、自動化ジデオキシＤＮＡ配列決定によ り確認する。ヒトの腎臓の２９３細胞をトランスフェクトするために、１〜２μ ｇのＤＮＡを、６μｌのリポフェクタミン試薬(Life Technologies)と混合して 、Life Technologiesのプロトコールに記載されたように細胞とインキュベート する。トランスフェクトされた細胞におけるＬＢＰ発現を、トランスフェクショ ンの４８時間 後に得られた細胞抽出物のウエスタンブロット分析により確認する。安定にトラ ンスフェクトされた２９３細胞を選択するために、抗生物質Ｇ４１８(Life Tech nologies)を成長培地に８００μｇ／ｍｌの濃度で加える。Ｇ４１８に耐性のコ ロニーをウエスタンブロットにより組換えＬＢＰ発現について試験し、ＬＢＰを 発現している組換えクローンを拡大してＬＤＬ結合についてアッセイし、化合物 をＬＤＬ結合を阻害するそれらの能力について試験するのに用いる。実施例１８ ：ＬＤＬとＬＢＰとの間の結合を阻害する薬剤のイン・ビボスクリー ニング この実施例は、イン・ビトロ試験によりＬＤＬとＬＢＰとの間の結合の有望な 候補のインヒビターであることが示された薬剤のイン・ビボスクリーニングを説 明する。 治癒しつつあるバルーンカテーテルにより内皮剥奪されたウサギ大動脈の動脈 病変モデルにおいて、イン・ビボ阻害活性を先ず試験する(Roberts等,J.Lipid R es.24:1160-1167(1983)；Chang等,Arterioscler.Thomb.12:1088-1098(1992))。 このモデルは、ヒトのアテローム性動脈硬化症病変の優れた類似物であることが 示された。各候補のインヒビターを、５〜１０匹のバルーン処理したウサギで試 験すると同時に、同数のウサギに対照用ペプチド又は偽薬を与える。大動脈の内 皮剥奪の４週間後に、再内皮形成(治癒)が部分的に完了するときに、これらのペ プチド及びアナログの毎日の非経口投与(静脈又は皮下投与)又は胃内投与を体重 １ｋｇ当たり１０ｍｇの初期濃度で開始し、結果に応じて最大１００ｍｇ／ｋｇ 以内で増減させる。３０分後に、一塊の¹²⁵Ｉ(又は^99mＴｃ)標識したＬＤＬの静 脈注射をして候補のインヒビターの治癒しつつある動脈病変におけるＬＤＬ封鎖 を阻止する能力を短期間の研究で試験する。もし¹²⁵Ｉ−ＬＤＬを用いるならば 、前に記載されたように(Roberts等,J.Lipid Res.24:1160-1167(1983)；Chang等 ,Arterioscler.Thomb.12:1088-1098(1992))、これらの動物を８〜２４時間後に 犠牲にして大動脈を切り出し、洗浄して定量的オートラジオグラフィーにかける 。もし^99mＴｃ−ＬＤＬを用いるならば、分析は、前に記載されたように(Lee及 びLees,Syndromes of Atherosclerosis,in Fuster,編、Futura Publishing Co., NY,Armonk,p385-401(19 96))、２〜２４時間目に、生きている麻酔した動物の外部ガンマーカメライメー ジングにより、その後、犠牲にして大動脈を切り出してそのイメージングを行う 。試験の終了の直前に、これらの動物に、ＣＢＣ、肝臓酵素及び尿検査を含む標 準的な毒性試験を施す。 最も有効で且つ最も低毒性の化合物を、次いで、２％コレステロール食餌を与 えられたウサギの短期間の研究で試験する(Schwenke及びCarew,Arteriosclerosi s 9:895-907(1989))。各候補のインヒビターを５〜１０匹のウサギで試験すると 同時に、同数のウサギに対照用ペプチド又は偽薬を投与する。１日当たり１投与 以上の候補のインヒビター又は偽薬を最長で２週間にわたって動物に与える。毎 日の投与回数は、投与経路によって決定する。もし活性な薬物又は偽薬を非経口 投与するならば、それらを、毎日１〜３回与え、２％コレステロール食餌を継続 する。もし薬物又は偽薬を経口投与するならば、それらを、２％コレステロール 食餌と混合する。Schwenke及びCarew(Arteriosclerosis 9:895-907(1989))は、 ウサギ大動脈の病変を受けやすい領域内のＬＤＬ濃度が、２％コレステロール食 餌を１６日間与えたウサギにおいて、正常の２２倍に増大すること及び増大した ＬＤＬ含量が初期アテローム性動脈硬化症の組織学的証拠に先行することを示し た。それ故に、候補のインヒビターの効果の分析を、コレステロール給餌の開始 から２週間後に、¹²⁵Ｉ−ＬＤＬを注射し、その後に８〜２４時間循環させ、次 いで、試験動物及び対照用動物の両方の切り出した大動脈について定量的オート ラジオグラフィーを行うことによって試験する。もし適当であれば、大動脈のコ レステロール含量の定量も行う(Schwenke及びCarew,Arteriosclerosis 9:895-90 7(1989；Schwenke及びCarew,Arteriosclerosis 9:908-918(1989))。 上記の手順は、最も有望な候補のインヒビター、並びに最良の経路及びそれら の投与回数を同定する。こうして同定されたインヒビターを、次いで、コレステ ロール給餌されたウサギの長期間の研究において試験する。これらの試験を、短 期間のコレステロール給餌研究と同じ方法で行うが、但し、インヒビターの有効 性を、コレステロール給餌の開始後の¹²⁵Ｉ−ＬＤＬの一層長い間隔での注射に より試験し、大動脈の病変を受けやすい領域をアテローム性動脈硬化症の証拠に ついて組織学的に調べる。試験期間は、２、４及び６ヶ月である。主要な動脈を 、 アテローム性動脈硬化症の証拠及び程度について、肉眼的に及び組織学的に調べ る。もし必要であれば、他の許容し得る動物モデル例えばアテローム性動脈硬化 症にかかり易い霊長類(Williams等,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.15:827-836 (1995))及び／又はWatanabeウサギを、短期及び長期のコレステロール給餌を用 いて試験する。実施例１９ ：バルーン処理で内皮剥奪したウサギ大動脈における放射性標識した ＬＤＬの蓄積の、ＬＢＰ蛋白質に対する活性な免疫の誘導によるイン・ビボでの 阻止 この実施例は、ＬＢＰ蛋白質に対する免疫の誘導が、バルーン処理により内皮 剥奪されたウサギの大動脈のアテローム性動脈硬化症モデルにおいて、放射性標 識したＬＤＬの蓄積に対して有する効果を説明する。 免疫を雄のニュージーランド白ウサギ(Hazelton Research Products,PA,Denve r在)において、次のようにして誘導した：精製したヒト組換えＬＢＰ−２又はＢ ＨＦ−１ペプチド(１ｍｌ；１ｍｇ)とＲＩＢＩアジュバント(RIBI ImmunoChem R esearch,Inc.,MT,Hamilton在)との混合物を、ウサギの背側の胸部及び腹部領域 に沿って２〜５カ所に皮下注射した。血液を静脈穿刺により、１日目(免疫化前) 、３５日目、６３日目及び９１日目に採血した。追加抗原を、２８日目(５００ μｇ；ＳＣ)、５６日目(２５０μｇ；ＳＣ)及び８４日目(１２５μｇ；ＳＣ)に 注射した。 これらのウサギの力価を、一連の希釈物により、ＥＬＩＳＡプレート形式を用 いて評価した。免疫化前血清を同時に評価した。ＬＢＰ蛋白質又はペプチドの第 三回目の追加免疫の後に、力価は、１５６ｐｇのＥＬＩＳＡプレート上の検出可 能な比色応答にて最大レベルに達した。力価は、３０分以内に対照を超える０． ５の吸光度の読みを生じる抗体の最大希釈として定義される。ポリクローナル抗 体の特異性を、実施例６に記載のようにしてウエスタンブロット分析を用いて示 した。 ９３日目に、免疫化したウサギ及び対照用のウサギの腹大動脈を、Fogarty４ 番塞栓摘出用カテーテル(Chang等,Arteriosclerosis and Thrombosis 12:1088-1 098( 1992))を用いて内皮剥奪した。バルーン処理の４週間後に、ウサギに一塊の¹²⁵ Ｉ標識したＬＤＬを注射した(１ｍｌ；ｉ．ｖ．）。血液試料を、１時間間隔で 、注射後８時間にわたって及び２４時間にて採取した。血液試料を３０分間にわ たって２０００ｒｐｍ(４０℃)で遠心分離し、血清中に存在するすべての活性を 、ガンマーカウンターを用いて測定した。全ＴＣＡ沈降性のカウントを、ＴＣＡ をこの血清に１０％の終濃度まで加え、その後４℃で１０分間インキュベートす ることにより測定した。次いで、血清試料を遠心分離し(２０００ｒｐｍ；３０ 分間；４０℃)、上清に存在する全活性を測定した。ＴＣＡ沈降性カウントを減 算により計算した(全可溶性カウント−ＴＣＡ沈殿後の上清中に存在するカウン ト)。抗体力価の測定のための血液試料を、放射性標識したＬＤＬの注射前に集 めた。 ２４時間後に、これらのウサギに、５％エバンス青染料を静脈注射して１５分 間循環させた。内皮の被覆が存在しない大動脈の領域は、青く染まるが、内皮に よる被覆が残っている領域は染まらない。インキュベーション期間の最後に、こ れらのウサギを麻酔して腹部及び胸部の大動脈を切開してすすぎ、一晩１０％Ｔ ＣＡ中で室温で固定した。これらの大動脈を、次いで、生理的塩溶液で徹底的に すすぎ、重さを量り、計数し、吸い取って乾燥させ、内皮剥奪したウサギの腹大 動脈中の放射性標識したＬＤＬ蓄積のパターンを可視化するためにＸ線フィルム 上に置いた。 組換えのヒトＬＢＰ−２又はＢＨＦ−１ペプチドに対するウサギの免疫化は、 バルーン処理した内皮剥奪した腹大動脈中の放射性標識したＬＤＬ蓄積のパター ンを変化させた。投薬量及び内皮再生パーセントを補正すると、免疫化したバル ーン処理したウサギは、免疫化してないバルーン処理したウサギに比較して一層 低い放射性標識ＬＤＬの蓄積を有した。これらの結果は、ＬＢＰに対する活性な 免疫化が傷害された動脈壁内のＬＤＬの蓄積を変えることのできる有効な手段を 提供することを示している。実施例２０ ：ヒトにおけるＬＤＬとＬＢＰとの間の結合を阻止する薬剤のスクリ ーニング ヒトの研究を、新たな薬物の安全性(フェーズＩ)、効力(フェーズII)及び他の 治療剤と比較しての効力(フェーズIII)の試験に関する標準的ＦＤＡプロトコー ルに従って行う。インフォームドコンセント後に研究に登録された患者は、１８ 〜７０歳である。妊娠中若しくは妊娠しそうな女性又は初期アテローム性動脈硬 化症以外の病気例えば癌、肝臓病若しくは糖尿病を有する患者は、除外する。Ｆ ＤＡのフェーズII及びフェーズIII試験における研究のために選択する患者は、 標準的技術例えば超音波及び／又は血管造影法により以前に記録されたアテロー ム性動脈硬化症を有するか、又は少なくとも一人の記録されたアテローム性動脈 硬化症を有する一親等の親類を有することによりアテローム性動脈硬化症の高度 の危険にあることが知られている患者である。患者自身は、正常又は異常な血漿 脂質を有する。最初の試験には、活性薬物について２０〜５０人の患者が、偽薬 について２０〜５０人の患者(同じ年齢、性別及びアテローム青銅脈硬化症の状 態を有する)が含まれる。患者数を、予め、統計的有意性に必要な数により決定 する。インヒビターの効力についての終点には、高い危険にある患者並びに既知 の頸動脈又は冠状動脈疾患を有する患者の頸動脈の厚みの超音波測定；アテロー ム性動脈硬化事象；アテローム性動脈硬化症による死亡；及びすべての患者にお けるすべての原因による死亡が含まれる。Stadler(Med.and Biol.22:25-34(1996 ))による非侵襲的分析(超音波による頸動脈の厚みの測定)を、６〜１２ヶ月の間 隔で３年間にわたって行う。アテローム性動脈硬化事象及び死亡並びにすべての 原因による死亡を、３年目に表にする。 ＦＤＡフェーズＩ試験における薬物の経口投与量は、０．０１〜１０ｇ／日に わたり、動物研究の結果により決定する(ｋｇベースにて推定する)。フェーズＩ の研究から得られたデータに基づいて、投与量の範囲及び回数をフェーズII及び IIIの試験において狭める。もし薬物の非経口投与が、動物研究により、唯一の 有効な方法であると決定されたならば、ヒト患者における非経口投与を注射によ り並びに経皮的経路及び鼻吸入経路により試験する。非経口薬物の試験は、経口 投与についてのものと同じアウトラインに従う。 こうして、ヒトについての最適な治療スケジュール及び投薬量を確立する。実施例２１ ：アテローム性動脈硬化症を有する個人のＢＨＦ−１による治療 この実施例は、アテローム性動脈硬化症を有する個人を、その個人における動 脈に結合したＬＤＬのレベルを低下させるようにＬＢＰ断片例えばＢＨＦ−１を 用いて治療する方法を説明する。ＢＨＦ−１をここに記載したようにして得る。 そのＢＨＦ−１を動物に体重１ｋｇ当たり０．５〜１０ｍｇの濃度で一塊として 又は一回の注射にて静脈投与する。かかる投与を、アテローム性動脈硬化症の徴 候の発生又は進行を防止するために無期限に繰り返す(丁度、現在、コレステロ ール低下剤を用いて行われているように)。安定な患者を、年に２回調べて任意 のアテローム性動脈硬化症疾患の程度を物理的検査及び非侵襲的研究例えば頸動 脈の厚み、主要な動脈の超音波及び／又はガンマーカメライメージングにより評 価して、アテローム性動脈硬化症病変が存在するかどうか及び以前に存在した場 合には後戻り又は進行しているかどうかを測定する。 当業者は、ここに記載した発明の特定の具体例の多くの同等物を日常的実験を 用いて確認することができるであろう。これらの及び他のすべての同等物は、後 記の請求の範囲に包含されるべきものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 15/09 ＺＮＡ Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 33/92 Ｚ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/92 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 リーズ，ロバート エス. アメリカ合衆国 02146 マサチューセッ ツ，ブルックライン，クリントン ロード 203 (72)発明者 ロー，サイモン ダブリュー. アメリカ合衆国 02173 マサチューセッ ツ，レクシントン グリーンウッド スト リート 30 (72)発明者 アルホーナ，アニバル エイ. アメリカ合衆国 02134 マサチューセッ ツ，ボストン，コモンウエルス アベニュ ー 1238，アパートメント 22

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記よりなる群から選択するメンバーを含む単離されたポリヌクレオチド： (ａ)SEQ ID NO:１に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチド； (ｂ)SEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチド； (ｃ)SEQ ID NO:３に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチド； (ｄ)SEQ ID NO:４に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチド； (ｅ)SEQ ID NO:５に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチド； (ｆ)SEQ ID NO:６に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチド； (ｇ)SEQ ID NO:７に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチド； (ｈ)SEQ ID NO:８に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチド； (ｉ)SEQ ID NO:９に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチド； (ｊ)(ａ)〜(ｈ)又は(ｉ)のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができ 及び少なくとも約９５％同一であるポリヌクレオチド(ここに、コードされるポ リペプチドは、ＬＤＬに結合することができる)； (ｋ)生物学的に活性なポリペプチド(ａ)〜(ｉ)又は(ｊ)の断片(ここに、コー ドされるポリペプチドは、ＬＤＬに結合することができる)。 ２．前記のメンバーを下記よりなる群から選択する、請求項１に記載の単離され たポリヌクレオチド： (ａ)SEQ ID NO:７に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基８〜２２(SEQ ID NO :１９)、８〜３３(SEQ ID NO:２０)、２３〜３３(SEQ ID NO:２１)又は２０８〜 ２１７(SEQ ID NO:２２)を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (ｂ)SEQ ID NO:１及びSEQ ID NO:６に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基１４ 〜４３(SEQ ID NO:２３)又は３８〜４３(SEQ ID NO:２４)を含むポリペプチドを コードするポリヌクレオチド； (Ｃ)SEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基１０５〜１２０(SEQ I D NO:２５)、１０５〜１３２(SEQ ID NO:２６)、１２１〜１３２(SEQ ID NO:２ ７)又は２１１〜２２０(SEQ ID NO:２８)を含むポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチド； (ｄ)SEQ ID NO:５に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基９６〜１１０(SEQ ID NO:２９)を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (ｅ)SEQ ID NO:８に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基５３〜５９(SEQ ID NO :４１)を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (ｆ)(ａ)〜(ｄ)又は(ｅ)のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができ 及び少なくとも約９５％同一であるポリヌクレオチド(ここに、コードされるポ リペプチドは、ＬＤＬに結合することができる)；及び (ｇ)生物学的に活性なポリヌクレオチド(ａ)〜(ｅ)又は(ｆ)の断片(ここに、 コードされるポリペプチドは、ＬＤＬに結合することができる)。 ３．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:１０に示した核酸を含む、請求項１に 記載のポリヌクレオチド。 ４．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:１１に示した核酸を含む、請求項１に 記載のポリヌクレオチド。 ５．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:１２に示した核酸を含む、請求項１に 記載のポリヌクレオチド。 ６．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:１３に示した核酸を含む、請求項１に 記載のポリヌクレオチド。 ７．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:１４に示した核酸を含む、請求項１に 記載のポリヌクレオチド。 ８．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:１５に示した核酸を含む、請求項１に 記載のポリヌクレオチド。 ９．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:１６に示した核酸を含む、請求項１に 記載のポリヌクレオチド。 １０．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:１７に示した核酸を含む、請求項１ に記載のポリヌクレオチド。 １１．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:１８に示した核酸を含む、請求項１ に記載のポリヌクレオチド。 １２．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:３０に示した核酸を含む、請求項２ に記載のポリヌクレオチド。 １３．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:３１に示した核酸を含む、請求項２ に記載のポリヌクレオチド。 １４．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:３２に示した核酸を含む、請求項２ に記載のポリヌクレオチド。 １５．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:３３に示した核酸を含む、請求項２ に記載のポリヌクレオチド。 １６．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:３４に示した核酸を含む、請求項２ に記載のポリヌクレオチド。 １７．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:３５に示した核酸を含む、請求項２ に記載のポリヌクレオチド。 １８．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:３６に示した核酸を含む、請求項２ に記載のポリヌクレオチド。 １９．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:３７に示した核酸を含む、請求項２ に記載のポリヌクレオチド。 ２０．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:３８に示した核酸を含む、請求項２ に記載のポリヌクレオチド。 ２１．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:３９に示した核酸を含む、請求項２ に記載のポリヌクレオチド。 ２２．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:４０に示した核酸を含む、請求項 ２に記載のポリヌクレオチド。 ２３．前記のポリヌクレオチドがSEQ ID NO:４２に示した核酸を含む、請求項２ に記載のポリペプチド。 ２４．前記のポリヌクレオチドをＤＮＡ及びＲＮＡよりなる群から選択する、請 求項１に記載のポリヌクレオチド。 ２５．前記のポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌ クレオチド。 ２６．請求項１に記載の前記のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。 ２７．請求項２６に記載の前記の組換えベクターを含む細胞。 ２８．請求項２７に記載の細胞をＬＤＬ結合性蛋白質を発現させる条件下で培養 することを含むＬＤＬ結合性蛋白質の製造方法。 ２９．下記よりなる群から選択するメンバーを含む単離されたポリペプチド： (ａ)SEQ ID NO:１に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド； (ｂ)SEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド； (ｃ)SEQ ID NO:３に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド； (ｄ)SEQ ID NO:４に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド； (ｅ)SEQ ID NO:５に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド； (ｆ)SEQ ID NO:６に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド； (ｇ)SEQ ID NO:７に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド； (ｈ)SEQ ID NO:８に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド； (ｉ)SEQ ID NO:９に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド； (ｊ)(ａ)〜(ｈ)又は(ｉ)のポリペプチドと少なくとも約９５％同一であるポリ ペプチド(ここに、該ポリペプチドは、ＬＤＬと結合することができる)；及び (ｋ)生物学的に活性なポリペプチド(ａ)〜(ｉ)又は(ｊ)の断片(ここに、該断 片は、ＬＤＬに結合することができる)。 ３０．前記のメンバーを下記よりなる群から選択する、請求項２９に記載の単離 されたポリペプチド： (ａ)SEQ ID NO:７に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基８〜２２(SEQ ID NO: １９)、８〜３３(SEQ ID NO:２０)、２３〜３３(SEQ ID NO:２１)又は２０８ 〜２１７(SEQ ID NO:２２)を有するポリペプチド； (ｂ)SEQ ID NO:１及びSEQ ID NO:６に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基１４ 〜４３(SEQ ID NO:２３)又は３８〜４３(SEQ ID NO:２４)を有するポリペプチド ； (ｃ)SEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基１０５〜１２０(SEQ I D NO:２５)、１０５〜１３２(SEQ ID NO:２６)、１２１〜１３２(SEQ ID NO:２ ７)又は２１１〜２２０(SEQ ID NO:２８)を有するポリペプチド； (ｄ)SEQ ID NO:５に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基９６〜１１０(SEQ ID NO:２９)を有するポリペプチド； (ｅ)SEQ ID NO:８に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基５３〜５９(SEQ ID NO :４１）を有するポリペプチド； (ｆ)(ａ)〜(ｄ)又は(ｅ)のポリペプチドと少なくとも約９５％同一であるポリ ペプチド(ここに、該ポリペプチドは、ＬＤＬに結合することができる)；及び (ｇ)生物学的に活性なポリペプチド(ａ)〜(ｅ)又は(ｆ)の断片(ここに、該断 片は、ＬＤＬに結合することができる)。 ３１．動物がアテローム性動脈硬化症の危険にあるかどうかを測定する方法であ って、下記を含む当該方法： 一の動物を準備し；そして 該動物におけるＬＢＰ代謝又は構造の面を評価する(該ＬＢＰ代謝又は構造の面 における異常は、アテローム性動脈硬化症の危険にあることの診断となる)。 ３２．前記のＬＢＰをＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３よりなる群から選 択する、請求項３１に記載の方法。 ３３．前記のＬＢＰ代謝の面が該ＬＢＰのＬＤＬに結合する能力である、請求項 ３１に記載の方法。 ３４．前記のＬＢＰ代謝の面が該ＬＢＰの動脈細胞外マトリクス構造成分に結合 する能力である、請求項３１に記載の方法。 ３５．前記の成分を、プロテオグリカン、エラスチン、コラーゲン、フィブロネ クチン、ビトロネタチン及びインテグリンよりなる群から選択する、請求項３４ に記載の方法。 ３６．前記の危険が正常動物に比較して減少した危険である、請求項３１に記載 の方法。 ３７．前記の異常が不活性なＬＢＰポリペプチドを生じる、請求項３６に記載の 方法。 ３８．前記の危険が正常動物に比較して増大した危険である、請求項３１に記載 の方法。 ３９．前記の異常がネイティブなＬＢＰポリペプチドより一層高い活性を有する ＬＢＰポリペプチドを生じる、請求項３８に記載の方法。 ４０．前記の動物が出生前の動物である、請求項３１に記載の方法。 ４１．アテローム性動脈硬化症の治療に用いる薬剤を評価する方法であって、下 記を含む当該方法： 試験用の細胞、無細胞系又は動物を準備し； 薬剤を準備し； 該剤を該試験用細胞、無細胞系又は動物に治療上有効な量で投与し；そして該剤 のＬＢＰ代謝又は構造の面に対する効果を評価する(該ＬＢＰ代謝又は構造の面 における変化は、該剤のアテローム性動脈硬化症の治療における有用性を示す) 。 ４２．前記の試験用細胞、無細胞系又は動物がＬＢＰ代謝の野生型パターンを有 する、請求項４１に記載の方法。 ４３．前記の試験用細胞、無細胞系又は動物がＬＢＰ代謝の非野生型パターンを 有する、請求項４１に記載の方法。 ４４．前記のＬＢＰを、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３よりなる群から 選択する、請求項４１に記載の方法。 ４５．前記の薬剤がＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２若しくはＬＢＰ−３ポリペプチド又 は生物学的に活性なこれらの断片若しくはアナログを含む、請求項４１に記載の 方法。 ４６．前記の薬剤を、図１〜８及び９に示したアミノ酸配列(SEQ ID NO:１〜９) を含むポリペプチドよりなる群から選択する、請求項４１に記載の方法。 ４７．前記の薬剤がＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２若しくはＬＢＰ−３ポリペプチド又 は生物学的に活性なこれらの断片若しくはアナログをコードする核酸を含む、請 求項４１に記載の方法。 ４８．前記の薬剤を、図１０〜１７及び１８に示したヌクレオチド配列(SEQ ID NO:１０〜１８)を含む核酸よりなる群から選択する、請求項４１に記載の方法。 ４９．前記の薬剤がＬＢＰ調節配列をコードする核酸又は生物学的に活性なその 断片を含む、請求項４１に記載の方法。 ５０．前記の薬剤を、前記のＬＢＰポリペプチドに対する結合性分子及び前記の ＬＢＰ核酸に対する結合性分子よりなる群から選択する、請求項４１に記載の方 法。 ５１．前記の薬剤がアンチセンス核酸又はそのアナログである、請求項４１に記 載の方法。 ５２．前記の薬剤を、前記のＬＢＰの模倣物及び前記のＬＢＰの結合性分子の模 倣物よりなる群から選択する、請求項４１に記載の方法。 ５３．前記の薬剤が、ＬＢＰポリペプチドと免疫反応し得るポリクローナル若し くはモノクローナル抗体又はこれらの断片である、請求項４１に記載の方法。 ５４．前記の薬剤を、ＬＢＰポリペプチドと免疫反応し得る天然の抗体、組換え 抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体よりなる群から選択する、請求項４１に記載の 方法。 ５５．前記の薬剤が、前記のＬＢＰに対する天然のリガンドである、請求項４１ に記載の方法。 ５６．前記の薬剤が、前記のＬＢＰに対する人工のリガンドである、請求項４１ に記載の方法。 ５７．前記の薬剤を、アンタゴニスト、アゴニスト及びスーパーアゴニストより なる群から選択する、請求項４１に記載の方法。 ５８．前記の薬剤を、トランスジェニック細胞及びトランスジェニック動物より なる群から選択するメンバーに投与する、請求項４１に記載の方法。 ５９．前記の薬剤を、前記の試験用細胞又は無細胞系にイン・ビトロで投与し、 もし前記のＬＢＰ代謝の面に前記の変化が起きれば、該剤を更に試験用動物に治 療上有効な量で投与し、該剤のＬＢＰ代謝の面に対する効果をイン・ビボで評価 する、請求項４１に記載の方法。 ６０．請求項４１において同定された薬剤。 ６１．ＬＢＰポリペプチドの結合性分子に対する結合を変化させる能力について 薬剤を評価する方法であって、下記を含む当該方法： 一の薬剤を準備し； ＬＢＰポリペプチドを準備し； 結合性分子を準備し； 該薬剤、該ＬＢＰ及び該結合性分子を合わせ；そして 該ＬＢＰポリペプチドと該結合性分子とを含む複合体の形成を検出する(該薬 剤の不在時と比較しての該薬剤の存在下での該複合体の形成における変化は、該 薬剤が該ＬＢＰポリペプチドの該結合性分子への結合を変化させることを示す) 。 ６２．前記のＬＢＰポリペプチドを、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３ポ リペプチドよりなる群から選択する、請求項６１に記載の方法。 ６３．前記のＬＢＰポリペプチドの前記の結合性分子への結合を変化させること が、その結合を阻害することである、請求項６１に記載の方法。 ６４．前記のＬＢＰポリペプチドの前記の結合性分子への結合を変化させること が、その結合を促進することである、請求項６１に記載の方法。 ６５．前記の結合性分子を、ネイティブなＬＤＬ及び改変したＬＤＬよりなる群 から選択する、請求項６１に記載の方法。 ６６．前記の結合性分子が、動脈細胞外マトリクス構造成分である、請求項６１ に記載の方法。 ６７．請求項６１において同定された薬剤。 ６８．ＬＢＰポリペプチドに結合する能力について薬剤を評価する方法であって 、下記を含む当該方法： 一の薬剤を準備し； ＬＢＰポリペプチドを準備し； 該薬剤を該ＬＢＰポリペプチドと接触させ；そして 該薬剤の該ＬＢＰポリペプチドに結合する能力を評価する。 ６９．前記のＬＢＰポリペプチドを、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３ポ リペプチドよりなる群から選択する、請求項６８に記載の方法。 ７０．請求項６８において同定された薬剤。 ７１．ＬＢＰ調節配列をコードする核酸に結合する能力について薬剤を評価する 方法であって、下記を含む当該方法： 一の薬剤を準備し； ＬＢＰ調節配列をコードする核酸を準備し； 該薬剤を該核酸と接触させ；そして 該薬剤の該核酸に結合する能力を評価する。 ７２．前記のＬＢＰ調節配列を、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３よりな る群から選択する、請求項７１に記載の方法。 ７３．請求項７１において同定された薬剤。 ７４．下記を含む、動物におけるアテローム性動脈硬化症の治療方法： アテローム性動脈硬化症の治療の必要な動物を準備し； ＬＢＰ構造又は代謝の面を変えることのできる薬剤を準備し； 該薬剤を該動物に治療上有効な量で、該アテローム性動脈硬化症の治療を生じ るように投与する。 ７５．前記の薬剤がＬＢＰポリペプチドである、請求項７４に記載の方法。 ７６．前記のＬＢＰポリペプチドがＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２若しくはＬＢＰ−３ ポリペプチド又は生物学的に活性なその断片又はアナログである、請求項７５に 記載の方法。 ７７．前記の薬剤を、SEQ ID NO:１〜８及び９に示したアミノ酸配列を含むポリ ペプチドよりなる群から選択する、請求項７６に記載の方法。 ７８．前記の薬剤を、SEQ ID NO:７に描いたヒトＬＢＰ−２のアミノ酸残基８〜 ２２(SEQ ID NO:１９)、８〜３３(SEQ ID NO:２０)、２３〜３３(SEQ ID NO:２ １)又は２０８〜２１７(SEQ ID NO:２２)；SEQ ID NO:１及びSEQ ID NO:６に描 いたウサギ又はヒトのＬＢＰ−１のアミノ酸残基１４〜４３(SEQ ID NO:２３)又 は３８〜４３(SEQ ID NO:２４)；SEQ ID NO:２に描いたアミノ酸残基１０５〜１ ２０(SEQ ID NO:２５)、１０５〜１３２(SEQ ID NO:２６)、１２１ 〜１３２(SEQ ID NO:２７)又は２１１〜２２０(SEQ ID NO:２８)；SEQ ID NO:５ に描いたウサギＬＢＰ−３のアミノ酸残基９６〜１１０(SEQ ID NO:２９）；及 びSEQ ID NO:８に示したアミノ酸残基５３〜５９(SEQ ID NO:４１)を含むポリペ プチドよりなる群から選択する、請求項７６に記載の方法。 ７９．前記の薬剤が、約５０アミノ酸残基長以下である、請求項７４に記載の方 法。 ８０．前記の薬剤が、少なくとも約２０％の酸性アミノ酸残基を含むアミノ酸配 列を有するポリペプチドである、請求項７４に記載の方法。 ８１．前記の薬剤を、酸性アミノ酸のホモポリマー又はそのアナログ並びに一種 以上の酸性アミノ酸及び一種以上の他のアミノ酸のヘテロポリマー又はあそのア ナログよりなる群から選択する、請求項７４に記載の方法。 ８２．前記の薬剤を、ポリ(ｇｌｕ)、ポリ(ａｓｐ)及びポリ(ｇｌｕ ａｓｐ)よ りなる群から選択する、請求項７４に記載の方法。 ８３．前記の薬剤を、ポリ(ｇｌｕ Ｎ)、ポリ(ａｓｐ Ｎ)及びポリ(ｇｌｕ ａｓｐ Ｎ)よりなる群から選択する、請求項７４に記載の方法。 ８４．前記の薬剤が、約１０アミノ酸残基長以下のポリ(ｇｌｕ)である、請求項 ７４に記載の方法。 ８５．前記の薬剤が、ＬＢＰ核酸又は生物学的に活性なその断片若しくはアナロ グである、請求項７４に記載の方法。 ８６．前記のＬＢＰ核酸が、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２若しくはＬＢＰ−３ポリペ プチド又は生物学的に活性なその断片又はアナログをコードする核酸を含む、請 求項８５に記載の方法。 ８７．前記の薬剤を、SEQ ID NO:１０〜１７及び１８に示したヌクレオチド配列 を含む核酸よりなる群から選択する、請求項８６に記載の方法。 ８８．前記の薬剤がアンチセンス核酸又はそのアナログである、請求項７４に記 載の方法。 ８９．下記を含む、アテローム性動脈硬化症の危険にある動物の治療方法： アテローム性動脈硬化症の危険にある動物を準備し； ＬＢＰ構造又は代謝の面を変えることのできる薬剤を準備し；そして 該薬剤を該動物に治療上有効な量で、該動物の治療が生じるように投与する。 ９０．ＬＢＰの構造又は代謝に異常を有する細胞の治療方法であって、下記を含 む当該方法： ＬＢＰの構造又は代謝に異常を有する細胞を準備し； ＬＢＰ構造又は代謝の面を変えることのできる薬剤を準備し；そして 該薬剤を該細胞に治療上有効な量で、該細胞の治療が生じるように投与する。 ９１．前記のＬＢＰを、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３よりなる群から 選択する、請求項９０に記載の方法。 ９２．前記の細胞を、細胞培養又は組織培養から得る、請求項９０に記載の方法 。 ９３．前記の細胞を、胎児繊維芽細胞から得る、請求項９０に記載の方法。 ９４．前記の細胞が、動物の一部である、請求項９０に記載の方法。 ９５．前記の動物が、非ヒトトランスジェニック動物である、請求項９４に記載 の方法。 ９６．動物におけるアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬組成物であっ て、下記を含む当該医薬組成物： 治療上有効な量の薬剤(該薬剤は、該アテローム性動脈硬化症の治療を生じるよ うに該動物におけるＬＢＰ代謝又は構造の面を変えることができる)；及び 製薬上許容し得るキャリアー。 ９７．前記の薬剤が、ＬＢＰポリペプチド若しくは核酸であり、又は生物学的に 活性なその断片若しくはアナログである、請求項９６に記載の医薬組成物。 ９８．前記の薬剤が、約５０アミノ酸残基長以下のポリペプチドである、請求項 ９６に記載の医薬組成物。 ９９．前記の薬剤が、少なくとも約２０％の酸性アミノ酸残基を含むアミノ酸配 列を有するポリペプチドである、請求項９６に記載の医薬組成物。 １００．下記を含む、動物におけるアテローム性動脈硬化症を治療するためのワ クチン組成物：治療上有効な量の薬剤(該薬剤は、該アテローム性動脈硬化症の 治療を生じるように、該動物におけるＬＢＰ代謝又は構造の面を変えることがで きる)；及び 製薬上許容し得るキャリアー。 １０１．動物におけるアテローム性動脈硬化症病変の診断方法であって、下記を 含む当該方法： アテローム性動脈硬化症病変中に存在するＬＢＰに結合することのできる標識 した薬剤を準備し； 該標識した薬剤を該動物に、標識されたＬＢＰが生じるように、該標識した薬 剤が該ＬＢＰと相互作用する条件下で投与し；そして 該標識されたＬＢＰの位置決定及び定量を、該動物中のアテローム性動脈硬化 症病変の存在を診断するようにイメージングにより行う。 １０２．前記のＬＢＰを、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３よりなる群か ら選択する、請求項１０１に記載の方法。 １０３．前記のイメージングを、磁気共鳴イメージング、ガンマーカメライメー ジング、単一光子放出コンピュータートモグラフィー(ＳＰＥＣＴ)イメージング 及びポジトロン放出トモグラフィー(ＰＥＴ)よりなる群から選択する、請求項１ ０１に記載の方法。 １０４．ＬＢＰ又はその断片若しくはアナログに対して動物を免疫化する方法： ＬＤＬを有する動物を準備し； ＬＢＰ又はその断片若しくはアナログを準備し； 該ＬＢＰ又はその断片若しくはアナログを該動物に、該動物による該ＬＢＰ又 はその断片若しくはアナログに対する抗体産生を刺激するように、該ＬＢＰの該 ＬＤＬへの結合が変化するように投与する。 １０５．前記のＬＢＰの前記のＬＤＬへの結合が減少する、請求項１０４に記載 の方法。 １０６．改変したＬＤＬ及びネイティブなＬＤＬに結合する能力を有するＬＢＰ ポリペプチドの断片又はアナログの作製方法であって、下記を含む当該方法： ＬＢＰポリペプチドを準備し； 該ＬＢＰポリペプチドの配列を変化させ；そして 該変化させたＬＢＰポリペプチドを、改変したＬＤＬ及びネイティブなＬＤＬ に結合する能力について試験する。 １０７．前記のＬＢＰを、ＬＢＰ−１、ＬＢＰ−２及びＬＢＰ−３よりなる群か ら選択する、請求項１０６に記載の方法。 １０８．前記の変化させたＬＢＰポリペプチドを、アンタゴニスト、アゴニスト 及びスーパーアゴニストよりなる群から選択する、請求項１０６に記載の方法。 １０９．下記を含む、ＬＢＰをコードするｃＤＮＡを単離する方法： ｃＤＮＡライブラリーを準備し； 該ｃＤＮＡライブラリーをネイティブなＬＤＬ及び改変したＬＤＬに結合する ポリペプチドをコードするｃＤＮＡについてスクリーニングし；そして 該ポリペプチドをコードする該ＬＢＰをコードするｃＤＮＡを単離する。