ES2258798T3

ES2258798T3 - Nuevas proteinas de union a hipoproteinas de baja densidad y su uso para el diagnostico y el tratamiento de la arterosclerosis.

Info

Publication number: ES2258798T3
Application number: ES97949680T
Authority: ES
Inventors: Ann M. Lees; Robert S. Lees; Simon W. Law; Anibal A. Arjona
Original assignee: Boston Heart Foundation Inc
Current assignee: Boston Heart Foundation Inc
Priority date: 1996-11-27
Filing date: 1997-11-26
Publication date: 2006-09-01
Anticipated expiration: 2017-11-26
Also published as: JP2001506983A; JP4184437B2; US20020052033A1; DE69735243T2; US6355451B1; AU7408898A; WO1998023282A1; IL129910A0; ATE317264T1; CA2272243A1; EP0969855A4; AU736142B2; EP0969855B1; EP0969855A1; DE69735243D1

Abstract

Se describen polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos capaces de unirse a LDL (lipoproteínas de baja densidad) en estado nativo y metiladas, los polipéptidos aislados, llamados LBPs (proteínas de unión a LDL) y fragmentos con actividad biológica y análogos. También se describen procedimientos para determinar si un animal sufre riesgo de arterioesclerosis, procedimientos para la evaluación de un agente para su utilización en el tratamiento de la arterioesclerosis, procedimientos para el tratamiento de la arterioesclerosis y procedimientos para el tratamiento de células que tengan una anormalidad en su estructura o en el metabolismo de LBP. También se proporciona la composición de los fármacos y de las vacunas.

Description

Nuevas proteínas de unión a hipoproteínas de baja densidad y su uso para el diagnóstico y el tratamiento de la arterosclerosis.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a nuevos polipéptidos (LBPs) que se unen a lipoproteínas de baja densidad (LDL), a polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, y a agentes terapéuticos para la arteriosclerosis.

Antecedentes de la invención

La arteriosclerosis es la causa principal de ataques cardíacos y apoplejías. Se ha descrito que aproximadamente el 50% de todas las muertes en los Estados Unidos, Europa y Japón son debidas a la arterosclerosis. La arterosclerosis se caracteriza por las lesiones arteroescleróticas en la pared arterial. Los ésteres de colesterilo (CE) están presentes en estas lesiones arteroscleróticas. Se ha observado que la lipoproteína de baja densidad (LDL) es el principal soporte de los CE en plasma y ha estado implicada como el agente por el que los CE entran en las lesiones arteroscleróticas.

Grupos dispersos de macrófagos llenos de lípidos, llamados células espuma, son los primeros signos visibles de arterosclerosis y se han descrito como lesiones de tipo 1. Se ha descrito que estos macrófagos contienen CE derivado de la LDL. Los macrófagos reconocen la LDL oxidada, pero no la LDL originaria, y se convierten en células espuma mediante fagocitosis de la LDL oxidada, pero no de la LDL originaria. Grupos mayores, más organizados de células espuma, franjas de grasa, representan las lesiones de tipo II. Estas lesiones se desarrollan además en lesiones complejas llamadas placas, que pueden dar lugar a impedir el flujo de sangre en la arteria.

Se cree de forma generalizada que la acumulación de LDL en la arteria depende de la presencia de células endoteliales funcionalmente modificadas en la pared arterial. Se ha descrito en modelos animales de arterosclerosis que la LDL, tanto la LDL originaria como la LDL metilada, se acumulan de forma focalizada e irreversible sólo en los bordes de las islas endoteliales regenerantes en las lesiones aórticas, en donde está presente la funcionalidad de las células endoteliales modificadas, pero no en los centros de estas islas en donde la regeneración endotelial es completa. De forma similar, la LDL se acumula en las lesiones arterioscleróticas humanas. El mecanismo por el que la LDL se acumula de forma focalizada e irreversible en las lesiones arteriales no ha sido comprendido hasta este momento.

La base de datos WPI Sección Ch, (Semana 198542 Derwent Publications Limited, London), GB; Clase A96, AN 1985-008837 XP002169497) y la patente JP 59 206046 (ASAHI CHEM IND CO LTD), del 21 de Noviembre de 1984 se refieren a los polianiones ácidos de peso molecular de al menos 600 (incluyendo Poli-L-Glu y Poli-Asp) como adsorbentes para eliminar la LDL del suero en pacientes con arterosclerosis.

A. M. Lees y col. (Journal of Lipid Research, vol. 32, no. 1, 1991, páginas 1-8) hacen referencia a las imágenes en cámara Gamma in vivo de la LDL marcada para estudiar el reconocimiento del receptor del secuestro celular en la arterosclerosis.

La patente EP 0391629 (Universidad de Alabama del Sur) hace referencia al uso de péptidos polianiónicos para el tratamiento de la deposición mineral patológica, incluyendo la arterosclerosis.

Resumen de la invención

Es un objeto de la invención el proporcionar polipéptidos que se unen a la LDL. Los métodos descritos en la presente invención pueden ser útiles para determinar si un animal tiene riesgo de arterosclerosis.

También es un objeto de la invención el proporcionar un método para evaluar un agente para uso en el tratamiento de la arterosclerosis.

Los métodos descritos en la presente invención pueden ser útiles para el tratamiento de la arterosclerosis. Los genes de la LBP (proteína unida a la lipoproteína de baja densidad) y/o polipéptidos, o fragmentos, análogos y variantes del mismo, tal como se han descrito en el presente documento pueden ser útiles para ayudar en el tratamiento, el diagnosis y/o la identificación de agentes terapéuticos para la arteriosclerosis.

En un aspecto, la invención pone de relieve un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se ha establecido en la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 9; o un polinucleótido capaz de hibridarse y que es idéntico en al menos un 95% a cualquiera de los anteriores polinucleótidos y en donde el polipéptido codificado es capaz de unirse a la LDL; o un fragmento biológicamente activo de cualquiera de los anteriores polinucleótidos en donde el polipéptido codificado es capaz de unirse a la LDL.

En ciertas realizaciones, el polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico tal como se ha establecido en la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17 o SEC ID NO: 18.

Otro aspecto de la invención es un polilpéptido aislado que comprende un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos tal como se ha establecido en la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 9; o un polipéptido que es idéntico en al menos un 95% a cualquiera de los anteriores polipéptidos y en donde el polipéptido es capaz de unirse a la LDL; o un fragmento biológicamente activo de cualquiera de los anteriores polipéptidos en donde el fragmento es capaz de unirse a la LDL.

Los métodos descritos en la presente invención pueden ser útiles para la determinación de si un animal tiene riesgo de arterosclerosis. Se proporciona un animal. Se evalúa en el animal un aspecto del metabolismo o de la estructura de la LBP. Una anormalidad en el aspecto del metabolismo o de la estructura de la LBP es diagnosticada como de tener riesgo de arterosclerosis.

Otro aspecto de la invención es un método para la evaluación de un agente para uso en el tratamiento de la arterosclerosis. Se proporciona un sistema de células de prueba o un sistema libre de células. Se proporciona un agente. Se administra el agente en el sistema de células de prueba o en el sistema libre de células en una cantidad terapéuticamente efectiva. Se evalúa el efecto del agente en un aspecto del metabolismo o de la estructura de la LBP. Un cambio en el aspecto del metabolismo o de la estructura de la LBP es indicativo de la utilidad del agente en el tratamiento de la arterosclerosis.

Otro aspecto de la invención es un método para la evaluación de un agente para la capacidad de alterar la unión del polipétido LBP a una molécula de unión, por ej., la LDL originaria, la LDL modificada, por ej., la LDL metilada o la LDL oxidada, o un componente estructural de la matriz extracelular. Se proporciona un agente. Se proporciona un polipéptido de LBP. Se proporciona una molécula de unión. Se combinan el agente, el polipéptido de la LBP y la molécula de unión. Se detecta la formación de un complejo que comprende el polipéptido de la LBP y la molécula de unión. Una alteración en la formación del complejo en presencia del agente comparada con la producida en ausencia del agente es indicativa de la alteración del agente por unión del polipéptido de la LBP a la molécula de unión.

Otro aspecto de la invención es un método para la evaluación de la capacidad de unión de un agente al ácido nucleico que codifica una secuencia reguladora de la LBP. Se proporciona un agente. Se proporciona un ácido nucleico que codifica una secuencia reguladora de la LBP. El agente se pone en contacto con el ácido nucleico. Se evalúa la capacidad del agente para unirse al ácido nucleico.

Los métodos descritos en la presente invención pueden ser útiles para el tratamiento de la arterosclerosis en un animal. Se proporciona un animal que precise del tratamiento para la arterosclerosis. Se proporciona un agente capaz de alterar un aspecto de la estructura o del metabolismo de la LBP. El agente es administrado al animal en una cantidad terapéuticamente efectiva de modo que se produzca el tratamiento de la arterosclerosis. El agente puede ser un polipéptido de la LBP, por ej., LBP-1, LBP-2 o LBP-3, o un fragmento o un análogo biológicamente activo del mismo. El agente puede ser un polipéptido de una longitud de no más de aproximadamente 100, 50, 30, 20, 10, 5, 4, 3 ó 2 residuos de aminoácidos. El agente puede ser un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos que incluya al menos aproximadamente un 20%, 40%, 60%, 80%, 90%, 95% o 98% de residuos de aminoácidos.

Los métodos descritos en la presente invención pueden ser útiles para tratar un animal con riesgo de arterosclerosis. Se proporciona un animal con riesgo de arterosclerosis. Se proporciona un agente capaz de alterar un aspecto de la estructura o del metabolismo de la LBP. El agente es administrado al animal en una cantidad terapéuticamente efectiva de modo que se produzca el tratamiento en el animal.

Otro aspecto de la invención es un método para el tratamiento de una célula que tenga una anormalidad en la estructura o el metabolismo de la LBP. Se proporciona una célula que tenga una anormalidad en la estructura o el metabolismo de la LBP. Se proporciona un agente capaz de alterar un aspecto de la estructura o del metabolismo de la LBP. El agente es administrado en cantidades tales como para que se produzca el tratamiento de las células.

Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica para el tratamiento de la arterosclerosis en un animal que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente, siendo capaz el agente de alterar un aspecto del metabolismo o la estructura de la LBP en el animal de modo que de lugar al tratamiento de la arterosclerosis, y a un soporte farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención es una composición de tipo vacuna para el tratamiento de la arterosclerosis en un animal que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente, siendo capaz, el agente, de alterar un aspecto del metabolismo o la estructura de la LBP en el animal de modo que produzca el tratamiento de la arterosclerosis y a un soporte farmacéuticamente aceptable.

Los métodos descritos en la presente invención pueden ser útiles para el diagnóstico de las lesiones arteroescleróticas en un animal. Se proporciona un animal. Se proporciona un agente marcado capaz de unirse a la LBP, por ej., LBP-1, LBP-2 o LBP-3, presentes en las lesiones arteroscleróticas. El agente marcado es administrado al animal bajo condiciones que permitan que el agente marcado interaccione con la LBP de modo que se produzca LBP marcada. La localización o la cuantificación de la LBP marcada es determinada por toma de imágenes para diagnosticar la presencia de lesiones arteroscleróticas en el animal.

Los métodos descritos en la presente invención pueden ser útiles para inmunizar un animal contra una LBP, por ej., LBP-1, LBP-2 o LBP-3 o un fragmento o análogo de la misma. Se proporciona un animal que tenga la LDL. Se administra la LBP al fragmento o el análogo del mismo de modo que estimule la producción de anticuerpo por el animal a la LBP al fragmento o análogo de la misma de modo que se altere la unión de la LBP a la LDL, por ej., disminuyendo o aumentando.

Otro aspecto de la invención es un método de preparar un fragmento o análogo del polipéptido de la LBP, teniendo el fragmento o análogo la capacidad de unirse a la LDL originaria y a la LDL modificada, por ej., la LDL metilada, la LDL oxidada, la LDL acetilada, o la LDL tratada con ciclohexandiona. Se proporciona un polipéptido de LBP. La secuencia del polipéptido de la LBP está alterada. Se analiza la capacidad del polipéptido de la LBP según la capacidad para unirse a la LDL modificada y a la LDL originaria.

Todavía otro aspecto de la invención es un método para el aislamiento de un cDNA que codifica una LBP. Se proporciona una biblioteca de cDNA. Se selecciona la biblioteca de cDNA para el cDNA que codifica un polipéptido que se une a la LDL originaria y a la LDL modificada, por ej., la LDL metilada o la LDL oxidada. Se aísla el cDNA que codifica el polipéptido, el cDNA que codifica una LBP.

Las anteriores y otras características, objetos y ventajas de la presente invención serán mejor comprendidas mediante la lectura de la siguiente especificación conjuntamente con los dibujos.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 representa la secuencia de aminoácidos de la LBP-1 del conejo (SEC ID NO: 1). Las diferencias de aminoácidos entre la LBP-1 de conejo y humana se representan en letra negrilla.

La Fig. 2 representa la secuencia de aminoácidos de la LBP-2 del conejo (SEC ID NO: 2). Las diferencias de aminoácidos entre la LBP-2 de conejo y humana se representan en letra negrilla.

La Fig. 3 representa la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 86 a 317 de la LBP-2 del conejo (SEC ID NO: 3).

La Fig. 4 representa la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 66 a 317 de la LBP-2 del conejo (SEC ID NO: 4).

La Fig. 5 representa la secuencia de aminoácidos de la LBP-3 del conejo (SEC ID NO: 5). Las diferencias de aminoácidos entre la LBP-3 de conejo y humana se representan en letra negrilla.

La Fig. 6 representa la secuencia de aminoácidos de la LBP-1 humana (SEC ID NO: 6). Las diferencias de aminoácidos entre la LBP-1 de conejo y humana se representan en letra negrilla.

La Fig. 7 representa la secuencia de aminoácidos de la LBP-2 humana (SEC ID NO: 7). Las diferencias de aminoácidos entre la LBP-2 de conejo y humana se representan en letra negrilla.

La Fig. 8 representa la secuencia de aminoácidos de la LBP-3 humana (SEC ID NO: 8). Las diferencias de aminoácidos entre la LBP-3 de conejo y humana se representan en letra negrilla.

La Fig. 9 representa la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 14 a 33 de la LBP-1 humana o de conejo, llamada BHF-1 (SEC ID NO: 9).

La Fig. 10 representa la secuencia de cDNA que codifica la LBP-1 del conejo (SEC ID NO: 10) y la correspondiente secuencia de aminoácidos. Las diferencias de aminoácidos entre la LBP-1 de conejo y humana se representan en letra negrilla.

La Fig. 11 representa la secuencia de cDNA que codifica la LBP-2 del conejo (SEC ID NO: 11) y la correspondiente secuencia de aminoácidos. Las diferencias de aminoácidos entre la LBP-2 de conejo y humana se representan en letra negrilla.

La Fig. 12 representa la secuencia 256 a 1617 de cDNA de la LBP-2 del conejo (SEC ID NO: 12) y la correspondiente secuencia de aminoácidos.

La Fig. 13 representa la secuencia 196 a 1617 de cDNA de la LBP-2 del conejo (SEC ID NO: 13) y la correspondiente secuencia de aminoácidos.

La Fig. 14 representa la secuencia de cDNA que codifica la LBP-3 del conejo (SEC ID NO: 14) y la correspondiente secuencia de aminoácidos. Las diferencias de aminoácidos entre la LBP-3 de conejo y humana se representan en letra negrilla.

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La Fig. 15 representa la secuencia de cDNA que codifica la LBP-1 humano (SEC ID NO: 15) y la correspondiente secuencia de aminoácidos. Las diferencias de aminoácidos entre la LBP-1 de conejo y humana se representan en letra negrilla.

La Fig. 16 representa la secuencia de cDNA que codifica la LBP-2 humana (SEC ID NO: 16) y la correspondiente secuencia de aminoácidos. Las diferencias de aminoácidos entre la LBP-2 de conejo y humana se representan en letra negrilla.

La Fig. 17 representa la secuencia de cDNA que codifica la LBP-3 humana (SEC ID NO: 17) y la correspondiente secuencia de aminoácidos. Las diferencias de aminoácidos entre la LBP-3 de conejo y humana se representan en letra negrilla.

La Fig. 18 representa la secuencia de cDNA que codifica la BHF-1 (SEC ID NO: 18).

La Fig. 19 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la LBP-1 del conejo (secuencia superior) en alineación con la secuencia de aminoácidos de la LBP-1 humana (secuencia inferior).

La Fig. 20 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la LBP-2 del conejo (secuencia superior) en alineación con la secuencia de aminoácidos de la LBP-2 humana (secuencia inferior).

La Fig. 21 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la LBP-3 del conejo (secuencia superior) en alineación con la secuencia de aminoácidos de la LBP-3 humana (secuencia inferior).

Descripción detallada

De acuerdo con aspectos de la presente invención, se proporcionan nuevos polipéptidos humanos y de conejo completos, LBP-1, LBP-2 y LBP-3, y análogos y fragmentos biológicamente activos de los mismos, y se proporcionan polinucleótidos aislados que codifican dichos polipéptidos. LBP es una abreviatura para una proteína de unión a la lipoproteína de baja densidad (LDL). Los términos polinucleótido, nucleótido y oligonucleótido se utilizan en la presente invención de forma intercambiable, y los términos polipéptidos, proteínas y péptidos se utilizan en la presente invención de forma intercambiable.

Esta invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la LBP-1 de conejo tal como se ha establecido en la Fig. 1 (SEC ID NO: 1); la LBP-2 de conejo tal como se ha establecido en la Fig. 2 (SEC ID NO: 2); 86 a 317 de la LBP-2 de conejo tal como se ha establecido en la Fig. 3 (SEC ID NO: 3); 66 a 317 de la LBP-2 de conejo tal como se ha establecido en la Fig. 4 (SEC ID NO: 4); la LBP-3 de conejo tal como se ha establecido en la Fig. 5 (SEC ID NO: 5); la LBP-1 humana tal como se ha establecido en la Fig. 6 (SEC ID NO: 6); la LBP-2 humana tal como se ha establecido en la Fig. 7 (SEC ID NO: 7); la LBP-3 humana tal como se ha establecido en la Fig. 8 (SEC ID NO: 8); 14 a 33 de la LBP-1 humana o de conejo, llamada BHF-1, tal como se ha establecido en la Fig. 9 (SEC ID NO: 9); un polinucleótido capaz de hibridar a y que es al menos idéntico en aproximadamente un 80%, más preferiblemente al menos idéntico en aproximadamente un 90%, todavía más preferiblemente idéntico en aproximadamente un 95%, y más preferiblemente idéntico en aproximadamente un 98% a cualquiera de los anteriores polinucleótidos, y en el que el polipéptido codificado es capaz de unirse a la LDL; o un fragmento biológicamente activo de cualquiera de los anteriores polinucleótidos en donde el polipéptido codificado es capaz de unirse a la LDL.

Esta invención también incluye un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido que tienen de 8-22 residuos de aminoácidos (SEC ID NO: 19), 8-33 (SEC ID NO: 20), 23-33 (SEC ID NO: 21) o 208-217 (SEC ID NO: 22) de la LBP-2 humana tal como se ha establecido en la Fig. 7 (SEC ID NO: 7); residuos de aminoácidos 14-43 (SEC ID NO: 23) o 38-43 (SEC ID NO: 24) de la LBP-1 de conejo o humana tal como se ha establecido en la Fig. 1 (SEC ID NO: 1) y en la Fig. 6 (SEC ID NO: 6); residuos de aminoácidos 105-120 (SEC ID NO: 25), 105-132 (SEC ID NO: 26), 121-132 (SEC ID NO: 27) o 211-220 (SEC ID NO: 28) de la LBP-2 de conejo tal como se ha establecido en la Fig. 2 (SEC ID NO: 2); residuos de aminoácidos 96-110 (SEC ID NO: 29) de la LBP-3 de conejo tal como se ha establecido en la Fig. 5 (SEC ID NO: 5); residuos de aminoácidos 53-59 (SEC ID NO: 41) de la LBP-3 humana tal como se ha establecido en la Fig. 8 (SEC ID NO: 8); un polinucleótido capaz de hibridar a y que es al menos idéntico en aproximadamente un 80%, más preferiblemente al menos idéntico en aproximadamente un 90%, todavía más preferiblemente idéntico en aproximadamente un 95%, y más preferiblemente idéntico en aproximadamente un 98% a cualquiera de los anteriores polinucleótidos, y en el que el polipéptido codificado es capaz de unirse a la LDL; o un fragmento biológicamente activo de cualquiera de los anteriores polinucleótidos en donde el polipéptido codificado es capaz de unirse a la LDL.

Por un polinucleótido que codifica un polipéptido se entiende un polinucleótido que incluye solo la secuencia de codificación para el polipéptido, así como un polinucleótido que incluye secuencias de codificación y de no-codificación adicionales. De este modo, por ej., los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos completos de las Figs. 1-9 (SEC ID NOS: 1-9) pueden incluir sólo la secuencia de codificación para el polipéptido completo; la secuencia de codificación para el polipéptido completo y la secuencia de codificación adicional tal como un líder o una secuencia secretora o una secuencia de proteína; la secuencia de codificación para el polipéptido completo (y opcionalmente la secuencia de codificación adicional) y la secuencia de no-codificación, tales como intrones o secuencias de no-codificación 5' y/o 3' de la secuencia de codificación para el polipéptido completo. El polipéptido de la invención también pretende incluir polinucleótidos en los que la secuencia de codificación para el polipéptido completo está fusionada en el mismo bloque de lectura a una secuencia de polinucleótido que ayuda en expresión y/o secreción de un polipéptido a partir de una célula huésped, por ej., una secuencia líder. Los polinucleótidos también pretenden incluir polinucleótidos en los que la secuencia de codificación está fusionada en bloque a una secuencia de marcador que permite, por ej., la purificación del polipéptido.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden estar en forma de RNA, DNA o PNA, por ej., cRNA, cDNA, DNA genómico, o DNA, RNA o PNA sintéticos. El DNA puede ser de doble hebra o de hebra única, y si es de hebra única puede ser hebra de codificación o hebra de no-codificación (antisentido).

En las realizaciones preferidas, el polinucleótido comprende el ácido nucleico de la LBP-1 de conejo tal como se ha establecido en la Fig. 10 (SEC ID NO: 10); LBP-2 de conejo tal como se ha establecido en la Fig. 11 (SEC ID NO: 11); nucleótido 256 a 1617 de la LBP-2 de conejo tal como se ha establecido en la Fig. 12 (SEC ID NO: 12); nucleótidos 196 a 1617 de la LBP-2 de conejo tal como se ha establecido en la Fig. 13 (SEC ID NO: 13); la LBP-3 de conejo tal como se ha establecido en la Fig. 14 (SEC ID NO: 14); la LBP-1 humana tal como se ha establecido en la Fig. 15 (SEC ID NO: 15); la LBP-2 humana tal como se ha establecido en la Fig. 16 (SEC ID NO: 16); la LBP-3 humana tal como se ha establecido en la Fig. 17 (SEC ID NO: 17); o los nucleótidos 97 a 156 de la LBP-1 de conejo o los nucleótidos 157 a 216 de la LBP-1 humana, (BHF-1), tal como se ha establecido en la Fig. 18 (SEC ID
NO: 18).

En otras realizaciones preferidas, el polinucleótido comprende el ácido nucleico tal como se ha establecido en la SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 33, SEC ID NO: 34, SEC ID NO: 35, SEC ID NO: 36, SEC ID NO: 37, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 40 o SEC ID NO: 42.

La secuencia de codificación que codifica el polipéptido completo puede ser idéntica a las secuencias de codificación que se muestran en las Figs. 10-18 (SEC ID NO: 10-18) o SEC ID NO: 30-40 o 42, o puede ser una secuencia de codificación diferente de la secuencia de codificación, como resultado de la redundancia o la degeneración del código genético, que codifica los mismos polipétidos completos que el DNA de las Figs. 10-18 (SEC ID NO: 10-18) y la SEC ID NO: 30-40 y 42.

Esta invención también incluye vectores recombinantes que comprenden los polinucleótidos descritos anteriormente. El vector puede ser, por ej., un plásmido, una partícula viral o un fago. En ciertas realizaciones, el vector recombinante es un vector de expresión. Los vectores también pueden incluir varios genes marcadores que son útiles in identificar las células que contienen dichos vectores.

Esta invención también incluye una célula que comprende dicho vector recombinante. Los vectores recombinantes descritos en la presente invención pueden ser introducidos en una célula huésped, por ej., por transformación, transfección o infección.

Esta invención también incluye un método para la producción de una LBP que comprende el cultivo de dicha célula bajo condiciones que permitan la expresión de la LBP.

Esta invención también incluye un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se ha establecido en la Fig. 1 (SEC ID NO: 1); Fig. 2 (SEC ID NO: 2); Fig. 3 (SEC ID NO: 3); Fig. 4 (SEC ID NO: 4); Fig. 5 (SEC ID NO: 5); Fig. 6 (SEC ID NO: 6); Fig. 7 (SEC ID NO: 7); Fig. 8 (SEC ID NO: 8) o Fig. 9 (SEC ID NO: 9); o un polipéptido que sea al menos idéntico en aproximadamente un 80%, más preferiblemente al menos idéntico en aproximadamente un 90%, todavía más preferiblemente idéntico en aproximadamente un 95%, y más preferiblemente idéntico en aproximadamente un 98% a cualquiera de los anteriores polipéptidos, y en donde dicho polipéptido sea capaz de unirse a la LDL; o un fragmento biológicamente activo de cualquiera de los anteriores polipéptidos en donde el fragmento sea capaz de unirse a la LDL. Las diferencias en los aminoácidos entre los genes de la LBP-1, LBP-2 y LBP-3 de conejo y humana están representados en las figuras en negrilla. Las diferencias en las secuencias de aminoácidos entre la LBP-1, la LBP-2 y la LBP-3 de conejo y humana también se muestran de forma específica en las Figs. 19, 20 y 21, respectivamente.

Esta invención también incluye un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene los residuos de aminoácidos 8-22 (SEC ID NO: 19); 8-33 (SEC ID NO: 20), 23-33 (SEC ID NO: 21) o 208-217 (SEC ID NO: 22) tal como se ha establecido en la Fig. 7 (SEC ID NO: 7); residuos de aminoácidos 14-43 (SEC ID NO: 23) o 38-43 (SEC ID NO: 24) tal como se ha establecido en la Fig. 1 (SEC ID NO: 1) y en la Fig. 6 (SEC ID NO: 6); residuos de aminoácidos 105-120 (SEC ID NO: 25), 105-132 (SEC ID NO: 26), 121-132 (SEC ID NO: 27) o 211-220 (SEC ID NO: 28) tal como se ha establecido en la Fig. 2 (SEC ID NO: 2); residuos de aminoácidos 96-110 (SEC ID NO: 29) tal como se ha establecido en la Fig. 5 (SEC ID NO: 5); y residuos de aminoácidos 53-59 (SEC ID NO: 41) tal como se ha establecido en la Fig. 8 (SEC ID NO: 8); o un polipéptido que sea al menos idéntico en aproximadamente un 80%, más preferiblemente al menos idéntico en aproximadamente un 90%, todavía más preferiblemente idéntico en aproximadamente un 95%, y más preferiblemente idéntico en aproximadamente un 98% a cualquiera de los anteriores polipéptidos, y en donde dicho polipéptido sea capaz de unirse a la LDL; o un fragmento biológicamente activo de cualquiera de los anteriores polipéptidos en donde el fragmento sea capaz de unirse a la LDL.

Los polipéptidos de la invención pretenden incluir, por ej., un producto purificado de forma natural, un producto sintetizado químicamente, y un producto derivado de tecnología recombinante.

Los polipéptidos pueden ser utilizados, por ej., para unirse a la LDL, con lo que inhiben la formación de placas arteroscleróticas. Los polipéptidos también pueden ser utilizados, por ej., en terapia génica, por expresión de dichos polipéptidos in vivo. Los polipéptidos también pueden ser utilizados en composiciones de fármacos o de vacunas. Los polipéptidos también pueden ser utilizados como inmunogenes para producir anticuerpos de los mismos, que a su vez, pueden ser utilizados como antagonistas de los polipéptidos de la LBP.

Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que las LBPs proporcionan el mecanismo por el que se favorece la arterosclerosis a través de la oxidación de la LDL. Se cree que las LBP's son requeridas para que la unión de la LDL irreversible, focal, se produzca en la pared arterial, y que dicha unión sea un suceso temprano crítico en la arterosclerosis ya que permite el tiempo necesario para que la LDL cambie de su estado innato a un estado completamente oxidado. Cuando la LDL está oxidada, pero no en su estado innato, es una proteína extraña, los macrófagos la ingieren, haciendo primero las células espuma de las lesiones de tipo I, y formado subsecuentemente las líneas de grasa de las lesiones de tipo II.

Los métodos descritos en la presente invención pueden ser útiles para la determinación de si un animal tiene riesgo de arterosclerosis. Se proporciona un animal. Se evalúa en el animal un aspecto del metabolismo o de la estructura de la LBP. Una anormalidad en el aspecto del metabolismo o de la estructura de la LBP es diagnosticada como riesgo de arterosclerosis. Por arterosclerosis se quiere significar una enfermedad o estado que comprende varios estadios que se mezclan de forma imperceptible entre sí, incluyendo la unión irreversible de la LDL, la oxidación de la LDL, el reclutamiento de macrófagos, el bloqueo de la muerte de la arteria y del tejido (infarto).

Por animal se quiere significar tanto seres humanos como animales no-humanos. Animales no humanos incluyen, por ej., mamíferos, pájaros, reptiles, anfibios, peces, insectos y protozoos. Preferiblemente, el animal no-humano es un mamífero, por ej., un conejo, un roedor, por ej., un ratón, rata o cobaya, un primate, por ej., un mono, o un cerdo. Un animal también incluye animales transgénicos no-humanos. El término animal transgénico pretende incluir un animal que haya ganado nueva información genética a partir de la introducción del DNA extraño, es decir, DNA parcialmente o enteramente heterólogo, en el DNA de sus células; o introducción de una lesión, por ej., una mutación inducida in vitro, por ej., una supresión u otro reordenamiento cromosómico en el DNA de sus células; o introducción del DNA homólogo en el DNA de sus células de modo que altere el genoma de la célula en el que el DNA está insertado, por ej., está insertado en una posición que difiere de la del gen natural o su inserción resulta en una eliminación o sustitución del gen huésped homólogo o da lugar a una expresión y/o metabolismo del gen alterado y/o regulable. El animal puede incluir un transgen en todas sus células incluyendo células de la línea germen, o en sólo una de algunas de sus células. Los animales transgénicos pueden servir como un modelo para estudiar la arterosclerosis o para evaluar los agentes para tratar la arterosclerosis.

La determinación de estar en riesgo de arterosclerosis puede hacerse en un animal prenatal.

Por LBP se quiere significar una proteína de unión a una lipoproteína de baja densidad (LDL) que sea capaz de unirse a la LDL y mutilar a la LDL. Por LDL metilada se quiere significar que entre aproximadamente un 50% y aproximadamente un 90% de los residuos de lisina de la LDL tienen un grupo metilo unido químicamente. La LDL metilada no está reconocida por los receptores de superficie de células previamente descritos. Ver, por ej., Weisgraber y col., J. Biol. Chem. 253: 9053-9062 (1978). En ciertas realizaciones, la LBP también es capaz de unirse a la LDL oxidada. En ciertas realizaciones preferidas, la unión de la LDL a una LBP es irreversible. En ciertas realizaciones preferidas, la LBP no transporta la LDL a ningún compartimiento intracelular. Ejemplos de LBPs son la LBP-1, la LBP-2 y la LBP-3 descritas en la presente invención.

Por metabolismo de la LBP se quiere significar cualquier aspecto de la producción, liberación, expresión, función, acción, interacción o regulación de la LBP. El metabolismo de la LBP incluye modificaciones, por ej., modificaciones covalentes o no-covalentes, del polipéptido de la LBP. El metabolismo de la LBP incluye modificaciones, por ej., modificaciones covalentes o no-covalentes, que la LBP induce en otras sustancias. El metabolismo de la LBP también incluye cambios en la distribución del polipéptido de la LBP, y cambios que la LBP induce en la distribución de otras sustancias.

Puede evaluarse cualquier aspecto del metabolismo de la LBP. Los métodos utilizados son técnicas estándar conocidas por los expertos en la materia y pueden ser encontrados en referencias estándar, por ej., Ausubel y col., ed., Current Protocols in Mol. Biology, New Cork: John Wiley & Sons, 1990; M. Kriegler, ed., Gene Transfer and Expression, Stockton Press, New York, NY, 1989; sistema de expresión del gen pDisplay (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ejemplos preferidos del metabolismo de la LBP que pueden ser evaluados incluyen la actividad de unión del polipéptido de la LBP a una molécula de unión, por ej., la LDL; la actividad de transactivación del polipéptido de la LBP en un gen objetivo; el nivel de la proteína de la LBP; el nivel de la LBP mRNA; el nivel de modificaciones de la LBP, por ej., fosforilación, glicosilación o acilación; o el efecto de la expresión de la LBP en la unión de células de mamíferos transfectadas de la LDL.

Por molécula de unión se quiere significar cualquier molécula a la que pueda unirse la LBP, por ej., un ácido nucleico, por ej., una región reguladora del DNA, una proteína, por ej., la LDL, un metabolito, un péptido mimético, un péptido no-mimético, un anticuerpo, o cualquier otro tipo de ligando. En ciertas realizaciones preferidas, el aspecto del metabolismo de la LBP que se evalúa es la capacidad de la LBP a unirse a la LDL originaria y/o a la LDL metilada, y/o a la LDL oxidada. La unión a la LDL, puede ser mostrada, por ej., por ensayos de anticuerpos frente a la LDL, cromatografía de afinidad, coelectroforesis de afinidad (ACE), o ensayos ELISA. Ver Ejemplos. En otras realizaciones, lo que se evalúa es la capacidad de la LBP a unirse a un componente estructural de la matriz extracelular arterial. Ejemplos de dichos componentes incluyen proteoglicanos, por ej., proteoglicanos de sulfato de condroitin y proteoglicanos de sulfato de heparina; elastina; colágeno; fibronectina; vitronectina; integrinas; y moléculas de la matriz extracelular. La unión a componentes estructurales de la matriz extracelular arterial puede mostrarse por métodos estándar conocidos por los expertos en el estado de la técnica, por ej., ensayos ELISA. A continuación se añaden los anticuerpos primarios a la LBP, seguido por un anticuerpo secundario conjugado por enzima al anticuerpo primario, que produce un color estable en presencia de un sustrato apropiado, y se mide el color desarrollado en las placas en un lector de placas microvalorador.

Puede determinarse la transactivación de un gen objetivo por la LBP, por ej., en un ensayo de transfección transitorio en el que el promotor del gen objetivo está unido a un gen reportero, por ej., la \beta-galacto-sidasa o luciferasa, y co-transfectado con un vector de expresión de la LBP. Dichas evaluaciones pueden ser realizadas in vitro. Pueden medirse los niveles de proteína de la LBP, mRNA o de fosforilación, por ej., en una muestra, por ej., una muestra de tejido, por ej., una pared arterial, por métodos estándar conocidos por los expertos en la materia.

En ciertas realizaciones, se evalúa un aspecto de la estructura de la LBP, por ej., la estructura del gen de la LBP o la estructura de la proteína de la LBP. Por ejemplo, pueden evaluarse las estructuras primaria, secundaria o terciaria. Por ejemplo, se determina la secuencia de DNA del gen y/o se determina la secuencia del aminoácido de la proteína. Pueden utilizarse los métodos de clonación y de secuenciación estándar ya que son conocidos por los expertos en la materia. En ciertas realizaciones, se determina la actividad de unión de un ácido nucleico antisentido con el mRNA de la LBP celular y/o el DNA genómico utilizando métodos estándar conocidos por los expertos en la materia para detectar la presencia o ausencia de las secuencias de mRNA o de DNA objetivo al que el ácido nucleico antisentido se uniría normalmente de forma específica.

El riesgo de arterosclerosis que es determinado puede ser un riesgo reducido o un riesgo incrementado en comparación con un animal normal. Por ejemplo, una anormalidad que daría un riesgo reducido sería un polipéptido de la LBP inactivo. Una anormalidad que daría un riesgo incrementado sería, por ej., un polipéptido de la LBP que tenga una mayor actividad, por ej., la actividad de unión a la LDL, que el polipéptido de la LBP original.

La invención también incluye un método para la evaluación de un agente para uso en el tratamiento de la arterosclerosis. Se proporciona un sistema de ensayo de células o un sistema libre de células. Se proporciona un agente. Se administra el agente en el sistema de células de prueba o en el sistema libre de células en una cantidad terapéuticamente efectiva. Se evalúa el efecto del agente en un aspecto del metabolismo o de la estructura de la LBP. Un cambio en el aspecto del metabolismo o la estructura de la LBP es indicativo de la utilidad del agente en el tratamiento de la arterosclerosis.

Por célula se pretende significar una célula o grupo de células, o una célula que es parte de un animal. La célula puede ser una célula humana o no humana. Célula también pretende incluir una célula transgénica. La célula puede ser obtenida, por ej., a partir de un cultivo o a partir de un animal. En el término animales se pretenden incluir, por ej., animales naturales y animales transgénicos no-humanos. En ciertas realizaciones, la célula transgénica o el animal transgénico no-humano tiene un transgen de la LBP, o un fragmento o análogo del mismo. En ciertas realizaciones, la célula transgénica o el animal transgénico no-humano tiene una eliminación para el gen de la LBP.

El sistema del ensayo de células o libre de células puede tener un modelo de metabolismo de la LBP de tipo natural o un modelo de tipo no natural. Un modelo de metabolismo de la LBP de tipo no natural puede dar lugar, por ejemplo a una menor expresión, a una sobre expresión, a no expresión, o a un cambio temporal, del sitio o de la distribución. Dicho modelo de tipo no natural puede dar lugar, por ej., entre una y más mutaciones en el gen, en un gen de la molécula de unión, un gen regulador, o en cualquier otro gen que afecte de manera directa o indirecta al metabolismo de la LBP. Por mutación se pretende incluir, por ej., la estructura en bruto o en fino, en un ácido nucleico. Ejemplos de la misma incluyen alteraciones de pares de bases únicas, por ej., mutaciones con sentido o sin-sentido, cambios del marco de lectura, supresiones, inserciones y trans-localizaciones. Las mutaciones pueden ser dominantes o recesivas. Las mutaciones pueden ser homocigóticas o heterozigóticas. Preferiblemente, se evalúa un aspecto del metabolismo de la LBP-1, LBP-2 o LBP-3.

Por agente se pretende incluir, por ej., cualquier sustancia, por ej., un fármaco anti-arterosclerosis. El agente de esta invención puede cambiar preferiblemente un aspecto del metabolismo de la LBP. Dicho cambio puede ser el resultado de cualquier variedad de eventos, incluyendo, por ej., la prevención o la reducción de la interacción entre la LBP y una molécula de unión, por ej., la LDL o un componente estructural de la matriz extracelular; inactivando la LBP y/o la molécula de unión, por ej., por rotura u otra modificación; alterando la afinidad de la LBP y la molécula de unión para cada otra, diluyendo la LBP y/o la molécula de unión; previniendo la expresión de la LBP y/o la molécula de unión; reduciendo la síntesis de la LBP y/o la molécula de unión; sintetizando una LBP anormal y/o una molécula de unión; sintetizando una LBP empalmada de forma alternativa y/o una molécula de unión; previniendo o reduciendo el plegamiento conformacional adecuado de la LBP y/o la molécula de unión; modulando las propiedades de unión de la LBP y/o la molécula de unión; interfiriendo con señales que se requieren para activar o desactivar la LBP y/o la molécula de unión; activar o desactivar la LBP y/o la molécula de unión de modo que se prevenga la unión; o interfiriendo con otros receptores, ligandos u otras moléculas que se requieren para la síntesis o el funcionamiento normal de la LBP y/o la molécula de unión. Por ejemplo, el agente puede bloquear el sitio de unión de la LDL para LBPs expresadas focalmente en la matriz extracelular de la pared arterial, o puede bloquear el sitio de unión de una LBP para la LDL, o puede ser bifuncional, es decir, puede bloquear ambos sitios de unión.

Ejemplos de agentes incluyen polipéptido de la LBP, por ej., la LBP-1, LBP-2 o LBP-3, o un fragmento o análogo biológicamente activo del mismo; un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la LBP o un fragmento o análogo biológicamente activo del mismo; un ácido nucleico que codifica una secuencia reguladora de la LBP o un fragmento o análogo del mismo biológicamente activo; una molécula de unión para el polipéptido de la LBP; una molécula de unión para el ácido nucleico de la LBP, el ácido nucleico de la LBP siendo, por ej., un ácido nucleico que comprende una región reguladora para la LBP; un ácido nucleico que comprende una región estructural para la LBP; un fragmento biológicamente activo de la LBP; un ácido nucleico antisentido; un mimético de la LBP, una molécula de unión, un anticuerpo para la LBP o una molécula de unión; un metabolito, o un carbohidrato inhibitorio o una glicoproteína. En ciertas realizaciones, el agente es un antagonista, un agonista o un super agonista.

El conocimiento de la existencia de la secuencia de las LBP's permite una búsqueda de ligandos naturales o artificiales para regular los niveles de la LDL en el tratamiento de la arterosclerosis. En ciertas realizaciones, el agente es un ligando natural para la LBP. En ciertas realizaciones, el agente es un ligando artificial para la LBP.

Por análogo se pretende significar un compuesto que difiere de la LBP que se encuentra de forma natural en la secuencia de amino ácidos o en modos que no implican secuencia, o ambos. Análogos de la invención muestran de forma general al menos aproximadamente un 80% de homología, preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de homología, más preferiblemente todavía al menos aproximadamente un 95% de homología, y más preferiblemente al menos aproximadamente un 98% de homología, con la secuencia sustancialmente entera de una secuencia de la LBP que se encuentra de forma natural, preferiblemente con un segmento de aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, más preferiblemente con un segmento de aproximadamente 50 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía con un segmento de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía con un segmento de aproximadamente 20 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía con un segmento de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía con un segmento de aproximadamente 5 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía con un segmento de aproximadamente 4 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía con un segmento de aproximadamente 3 residuos de aminoácidos, y más preferiblemente con un segmento de aproximadamente 2 residuos de aminoácidos. Las modificaciones de no secuencia incluyen derivatizaciones químicas in vitro de la LBP. Las modificaciones de no secuencia incluyen, por ej., cambios en la fosforilación, acetilación, metilación, carboxilación o glicosilación. Los métodos para hacer dichas modificaciones son conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, la fosforilación puede modificarse por exposición de la LBP a las enzimas que alteran la fosforilación, por ej., las quinasas o las fosfatasas.

Los análogos preferidos incluyen la LBP o fragmentos biológicamente activos de los mismos cuyas secuencias difieren de la secuencia de tipo irregular en una o más sustituciones de aminoácidos conservativos o por una o más sustituciones de aminoácidos no conservativas, eliminaciones, o inserciones que no suprimen la actividad biológica de la LBP. Las sustituciones conservativas incluyen de forma típica la sustitución de un aminoácido por otro con características similares, por ej., sustituciones en los grupos siguientes: valina, glicina; glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Otros ejemplos de sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1 Sustituciones de aminoácidos conservativos

Para el aminoácido	Código	Sustituido por cualquiera de
Alanina	A	D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginina	R	D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, Ile, D-Met, D-Ile, Orn, D-Orn,
		L-NMMA, L-NAME
Asparagina	N	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
Ácido Aspártico	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
Cisteína	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamina	Q	D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Ácido Glutámico	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln

TABLA 1 (continuación)

Para el aminoácido	Código	Sustituido por cualquiera de
Glicina	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, \beta-Ala, Acp
Histidina	H	D-His
Isoleucina	I	D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucina	L	D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Lisina	K	D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
Metionina	M	D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val
Fenilalanina	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans-3,4, o 5-fenilprolina,
		cis-3,4, o 5-fenilprolina
Prolina	P	D-Pro, ácido L-I-tiazolidin-4-carboxílico, ácido D- o L-I-oxazolidin-4-carboxílico
Serina	S	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), L-Cys, D-Cys
Treonina	T	D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
Triptófano	W	D-Trp, Phe, D-Phe, Tyr, D-Tyr
Tirosina	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Valina	V	D-Val, Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met

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Pueden prepararse variantes de la secuencia de aminoácidos de una proteína por cualquiera de una variedad de métodos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, puede utilizarse la mutagénesis al azar de DNA que codifica una proteína o un dominio o una región particular de una proteína, por ej., la mutagénesis de la PCR (utilizando, por ej., la fidelidad de la polimerasa Taq para introducir mutaciones al azar en un fragmento clonado de DNA; Leung y col., BioTechnique 1: 11-15 (1989)), o mutagénesis de saturación (por, por eje., tratamiento químico o irradiación del DNA de hebra única in vitro, y síntesis de una hebra de DNA complementaria; Mayers y col., Science 229: 242 (1985)). La mutagénesis al azar también puede conseguirse por, por ej., generación de oligonucleótidos degenerada (utilizando, por ej., un sintetizador automático de DNA para sintetizar químicamente secuencias degeneradas; Narang, Tetrahedron 39: 3 (1983); Itakura y col., Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. A. G. Walton, Ámsterdam: Elsevier, págs. 273-289 (1981)). La mutagénesis dirigida o no al azar puede utilizarse para proporcionar secuencias o mutaciones específicas en regiones específicas. Estas técnicas pueden ser utilizadas para crear variantes que incluyen, por ej., eliminaciones, inserciones, o sustituciones, de residuos de la secuencia de aminoácidos conocida de una proteína. Los sitios para la mutación pueden ser modificados de forma individual o en series, por ej., por (i) sustituyendo primero los aminoácidos conservados y a continuación selecciones más radicales dependiendo de los resultados conseguidos, (ii) eliminación del residuo objetivo, (iii) inserción de residuos de la misma clase o de una clase diferente adyacente al sitio localizado, o (iv) combinaciones de los anteriores. Por ejemplo, pueden prepararse análogos por modificaciones de la secuencia de DNA in vitro de las secuencias de las Figs. 10-18 (SEC ID NOS: 10-18). Por ejemplo, puede utilizarse la mutagénesis in vitro para convertir cualquiera de estas secuencias de DNA en una secuencia que codifique un análogo en el que uno o más residuos de aminoácidos hayan sufrido una sustitución, por ej., una sustitución conservativa tal como se ha descrito en la Tabla 1.

Los métodos para identificar las mutaciones deseables incluyen, por ej., la mutagénesis de selección de alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)), la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (Adelman y col., DNA 2: 183 (1983)); la mutagénesis de casete (Wells y col., Gene 34: 315 (1985)), la mutagénesis combinatoria, y las bibliotecas de exposición de fagos (Ladner y col., Solicitud de patente internacional PCT No. WO 88/06630). Los análogos de la LBP pueden ser ensayados, por ej., para su capacidad para unirse a la LDL y/o a un componente de la matriz extracelular, tal como se ha descrito en la presente invención.

Otros análogos dentro de la invención incluyen, por ej., aquellos con modificaciones que incrementan la estabilidad del péptido. Dichos análogos pueden contener, por ej., uno o más uniones de no-péptidos (que sustituyen los enlaces de péptidos) en la secuencia de péptidos. También se encuentran incluidos, por ej., análogos que incluyen residuos diferentes de los L-aminoácidos que se encuentran de forma natural, por ej., D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos que no se encuentran de forma natural, por ej., \beta o \gamma aminoácidos; y análogos cíclicos.

Análogos también pretende incluir péptidos en los que las modificaciones estructurales han sido introducidas en el esqueleto del péptido para hacer que el péptido sea no hidrolizable. Dichos péptidos son particularmente útiles para la administración oral, ya que no son digeridos. Las modificaciones del esqueleto del péptido incluyen, por ej., modificaciones del nitrógeno de la amida, el carbono \alpha, el carbonilo amida, o el enlace amida, y modificaciones que implican extensiones, eliminaciones o reticulaciones del esqueleto. Por ejemplo, el esqueleto puede ser modificado por sustitución de un sulfóxido por el carbonilo, por inversión del enlace peptídico, o por sustitución de un metileno por el grupo carbonilo. Dichas modificaciones pueden ser realizadas por procedimientos estándar conocidos por los expertos en la materia. Ver, por ej., A. F. Spatola, "Peptide Backbone Modifications: A Structure-Activity Analysis of Peptides Containing Amide Bond Surrogates, Conformational Constrains, and Related Backbone Replacements", en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, págs. 267-357, B. Weinstein (ed), Marcel Dekker, Inc., New York (1983).

Un análogo también pretende incluir polipéptidos en los que uno o más de los residuos de aminoácidos incluyen un grupo sustituyente, o polipéptidos que están fusionados con otro compuesto, por ej., un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido, por ej., polietilen glicol.

Por fragmento se pretende significar alguna porción de un polipéptido de la LBP que se produzca de forma natural. Preferiblemente, el fragmento es de al menos 100 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de al menos aproximadamente 50 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía de al menos aproximadamente 30 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía de al menos aproximadamente 20 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía de al menos aproximadamente 5 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía de al menos aproximadamente 4 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía de al menos aproximadamente 3 residuos de aminoácidos, y más preferiblemente de al menos aproximadamente 2 residuos de aminoácidos de longitud. Los fragmentos incluyen, por ej., formas secretadas truncadas, fragmentos proteolíticos, fragmentos empalmados, otros fragmentos, y construcciones quiméricas entre al menos una parte del gen relevante, por ej., LBP-1, LBP-2 o LBP-3, y otra molécula. Los fragmentos de la LBP pueden ser generados por métodos conocidos por los expertos en la materia. En ciertas realizaciones, el fragmento es biológicamente activo. La capacidad de un fragmento candidato para exhibir una actividad biológica de la LBP puede ser valorada por métodos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, los fragmentos de la LBP pueden ser ensayados para determinar su capacidad para unirse a la LDL y/o a un componente estructural de la matriz extracelular, tal como se describe en la presente invención. También se incluyen fragmentos de la LBP que contienen residuos que no son requeridos para la actividad biológica del fragmento o que resultan de un empalme del mRNA alternativo o de sucesos de procesamiento de la proteína alternativos.

Pueden producirse fragmentos de una proteína por cualquiera de una variedad de métodos conocidos por los expertos en la materia, por ej., de forma recombinante, por digestión proteolítica, o por síntesis química. Los fragmentos internos o terminales de un polipéptido pueden ser generados por eliminación de uno o más nucleótidos de un extremo (para un fragmento terminal) o de ambos extremos (para un fragmento interno) de un ácido nucleico que codifica el polipéptido. La expresión del DNA mutagenizado produce fragmentos de polipéptido. La digestión con endonucleasas "de extremo recortado" puede generar de este modo DNAs que codifican una selección de fragmentos. También pueden ser generados los DNAs que codifican los fragmentos de una proteína, por ej., por corte al azar, digestión de restricción o una combinación de los métodos anteriormente discutidos. Por ejemplo, los fragmentos de la LBP pueden ser obtenidos por expresión de LBP DNA que ha sido manipulado in vitro para codificar el fragmento deseado, por ej., por digestión por restricción de cualquiera de las secuencias de DNA de las Figs. 10-18 (SEC ID NOS:
10-18).

Los fragmentos también pueden ser sintetizados químicamente utilizando técnicas conocidas en el estado de la técnica, por ej., la química convencional de Merrifield en fase sólida del f-Moc o del t-Boc. Por ejemplo, los péptidos de la presente invención pueden ser divididos de forma arbitraria en fragmentos de longitud deseada sin ningún solapamiento de fragmentos, o dividido en fragmentos de solapamiento de longitud deseada.

Una LBP, o un fragmento o análogo biológicamente activo del mismo, o una molécula de unión o un fragmento o análogo biológicamente activo del mismo, pueden, por ej., competir con su molécula cognado para el sitio de unión en la molécula complementaria, y por consiguiente reducir o eliminar la unión entre la LBP y la molécula de unión celular. Pueden obtenerse la LBP o la molécula de unión, por ej., a partir de la purificación o la secreción de la LBP o de la molécula de unión que se obtienen de forma natural, a partir de la LBP o de la molécula de unión que se obtienen de forma recombinante, o a partir de la LBP o de la molécula de unión sintetizadas.

Por consiguiente, los métodos para generar análogos y fragmentos y ensayos de los mismos para determinar su actividad son conocidos por los expertos en la materia.

Un agente también puede ser un ácido nucleico utilizado como una molécula antisentido. Terapia antisentido pretende incluir, por ej., la administración o la generación in situ de oligonucleótidos o sus derivados que se hibridan de forma específica, por ej., unión, bajo condiciones celulares, con el mRNA celular y/o el DNA genómico que codifica un polipéptido de la LBP, o un mutante del mismo, de modo que se inhiba la expresión de la proteína codificada, por ej., por inhibición de la transcripción y/o traducción. La unión puede ser por complementariedad del par de bases convencionales, o, por ejemplo, en el caso de la unión al doble DNA, a través de interacciones específicas en el hueco principal de la doble hélice.

En ciertas realizaciones, la construcción antisentido se une a una secuencia que de origen natural de un gen de la LBP que, por ej., está implicada en la expresión del gen. Estas secuencias incluyen, por ej., promotor, codones de inicio, codones de terminación, y sitios de unión de la polimerasa del RNA.

En otras realizaciones, la construcción antisentido une una secuencia de nucleótido que no está presente en el gen de tipo irregular. Por ejemplo, la construcción antisentido puede unirse a una región de un gen de la LBP que contiene una inserción de una secuencia exógena, no irregular. De forma alternativa, la construcción antisentido puede unirse a una región de un gen de la LBP que ha sufrido una eliminación con lo que tiene dos regiones del gen juntas, lo cual no es la posición normal de estar juntas y que, estando juntas, crean una secuencia de tipo no irregular. De forma alternativa, la construcción antisentido puede unirse a una región de un gen de la LBP que ha sufrido una eliminación, con lo que trae dos regiones del gen juntas las cuales normalmente no se encuentran posicionadas juntas, creando una secuencia de tipo no irregular.

Una construcción antisentido de la presente invención puede ser liberada, por ej., como un plásmido de expresión que, cuando se transcribe en la célula, produce RNA que es complementario a al menos una única porción del mRNA celular que codifica un polipéptido de la LBP. Una alternativa es que la construcción antisentido sea un oligonucleótido que sea generado ex vivo y que, cuando se introduce en la célula causa inhibición de la expresión por hibridación con el mRNA (duplicado) y/o las secuencias genómicas (triplicadas) de un gen de la LBP. Dichos oligonucleótidos son preferiblemente oligonucleótidos modificados que son resistentes a las nucleasas endógenas, por ej., las exonucleasas y/o endonucleasas, y son por consiguiente estables in vivo. Ejemplos de moléculas del tipo ácido nucleico para uso como oligonicleótidos antisentido son los análogos de DNA y de ácidos nucleicos de péptidos (PNA) fosforamidato, fosfotioato, fosforoditioatos y metilfosfonato. (Ver también Patentes US 5.176.996; 5.264.564; y 5.256.775).

De forma adicional, se ha hecho una revisión de las aproximaciones generales para construir oligonucleótidos útiles en la terapia antisentido (Ver, por ej., Van der Krol y col., Biotechniques 6: 958-976 (1988); Stein y col., Cancer Res. 48: 2659-2668 (1988).

Por mimético se pretende significar una molécula que se parezca en forma y/o distribución de carga a la LBP o a una molécula de unión. El mimético puede ser un péptido o un no péptido. Los miméticos pueden actuar como agentes terapéuticos debido a que pueden, por ej., inhibir de forma competitiva la unión de la LBP a una molécula de unión. Por utilización, por ej., de la mutagénesis de selección, por ej., la mutagénesis de selección de alanina, la mutagénesis de selección de grupo de unión o la mutagénesis de saturación, para trazar un mapa de los residuos de aminoácidos de un polipéptido de la LBP particular implicada en la unión de una molécula de unión, péptido miméticos, por ej., derivados de diazepina o de isoquinolina, pueden ser generados de modo que mimeticen aquellos residuos en la unión a una molécula de unión, y que por consiguiente puedan inhibir la unión de la LBP a una molécula de unión y por consiguiente interfieran con la función de la LBP. Los análogos peptídicos de dichos residuos pueden ser generados utilizando, por ej., benzodiazepina (ver, por ej., Freidinger y col., en Peptides; Chemistry and Biology, G. R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands (1988); azepina (ver, por ej., Huffman y col., en Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Mashall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands (1988)); anillos gamma-lactámicos sustituidos (ver, por ej., Garvey y col., en Peptides, Chemistry and Biology, G. R. Mashall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands (1988)); pseudopéptidos de ceto-metileno (ver, por ej., Ewenson y col., J. Med. Chem. 29: 295 (1986); Ewenson y col., en Peptides: Structure and Function, (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL (1985)); núcleos de dipéptidos \beta-invertidos (ver, por ej., Nagai y col., Tetrahedron Lett. 26: 647 (1985); Sato y col., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1: 1231 (1986)); o \beta-aminoalcoholes (ver por ej., Gordon y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 126: 419 (1985); Dann y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 134: 71 (1986)).

Anticuerpos pretenden incluir anticuerpos frente a cualquier mitad que directamente o indirectamente afecten al metabolismo de la LBP. Los anticuerpos pueden ser dirigidos contra, por ej., la LBP o una molécula de unión, o una subunidad o un fragmento del mismo. Por ejemplo, los anticuerpos incluyen anticuerpos anti-LBP-1, LBP-2 o LBP-3; y anticuerpos de moléculas anti-unión. Fragmentos anticuerpo pretenden incluir, por ej., fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')_{2}, fragmentos F(v), cadenas pesadas, monómeros, dímeros de cadenas pesadas, trímeros de cadenas pesadas, monómeros de cadenas ligeras, dímeros de cadenas ligeras, trímeros de cadenas ligeras, dímeros que consisten en una cadena pesada y una cadena ligera, y péptidos que mimetizan la actividad de los anticuerpos de las moléculas anti-LBP o anti-unión. Por ejemplo, los fragmentos Fab_{2}' del anticuerpo inhibitorio pueden ser generados a través, por ej., de rotura enzimática. Tanto los anticuerpos monoclonales como policlonales pueden ser utilizados en esta invención. Preferiblemente, son utilizados los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos naturales, los anticuerpos recombinantes o los anticuerpos quiméricos, por ej., los anticuerpos humanizados, están incluidos en esta invención. Preferiblemente, los anticuerpos humanizados son utilizados cuando el sujeto es un humano. Más preferiblemente, los anticuerpos tienen una región constante derivada de un anticuerpo humano y una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de ratón inhibitorio. La producción de los anticuerpos policlonales a LBP está descrita en el Ejemplo 6. Los anticuerpos monoclonales y humanizados son generados por métodos estándar conocidos por los expertos en la materia. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos, por ej., por cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuas. Ejemplos de las mismas incluyen la técnica del hibridoma (Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975), la técnica del trioma, la técnica de hibridoma de células \beta humanas (Kozbor y col., Immunology Today 4: 72 (1983)), y la técnica del hibridoma-EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, A. R. Liss, Inc., págs 77-96 (1985)). Preferiblemente, los anticuerpos humanizados son incrementados a través de técnicas de producción y recogida convencionales (I. Berkower, Curr. Opin. Biotechnol. 7: 622-628 (1996); Ramharayan y Skaletsky, Am. Biotechnol. Lab. 13: 26-28 (1995)). En ciertas realizaciones preferidas, los anticuerpos son incrementados frente a la LBP, preferiblemente el sitio de unión de la LDL, y se producen los fragmentos Fab. Estos anticuerpos, o fragmentos derivados de los mismos, pueden ser utilizados, por ej., para bloquear los sitios de unión de la LDL en las moléculas de la LBP.

Los agentes también incluyen inhibidores de una molécula que sea requerida para la síntesis, la modificación post-traduccional, o el funcionamiento de la LBP y/o la molécula de unión, o activadores de una molécula que inhibe la síntesis o el funcionamiento de la LBP y/o la molécula de unión. Los agentes incluyen, por ej., citoquinas, quimoquinas, factores del crecimiento, hormonas, componentes de señalización, quinasas, fosfatasas, proteínas homeobox, factores de transcripción, factores de edición, factores de traducción, y factores de post-traducción o enzimas. Agentes también pretenden incluir radiación ionizante, radiación no ionizante, ultrasonidos y agentes tóxicos que pueden, por ej., inactivar al menos parcialmente o destruir la LBP y/o la molécula de unión.

Un agente también pretende incluir un agente que no sea enteramente específico de la LBP. Por ejemplo, un agente puede alterar otros genes o proteínas relacionadas con la formación de la placa arterial. Dicha especificidad del solapamiento puede proporcionar una ventaja terapéutica adicional.

La invención también incluye el agente así identificado como útil en el tratamiento de la arterosclerosis.

La invención también incluye un método para la evaluación de un agente respecto a su capacidad para alterar la unión del polipéptido de la LBP a una molécula de unión. Se proporciona un agente. Se proporciona un polipéptido de la LBP. Se proporciona una molécula de unión. El agente, el polipéptido de la LBP y la molécula de unión están combinados. Se detecta la formación de un complejo que comprende el polipéptido de la LBP y la molécula de unión. Una alteración en la formación del complejo en presencia del agente en comparación con la producida en ausencia del agente es indicativa del agente que altera la unión del polipéptido de la LBP a la molécula de unión.

En realizaciones preferidas, el polipéptido de la LBP es LBP-1, LBP-2 o LBP-3. Ejemplos de una molécula de unión incluyen LDL originaria, LDL modificada, por ej., LDL metilada o LDL oxidada, y componentes estructurales de la matriz extracelular.

La alteración de la unión incluye, por ej., la inhibición o la promoción de la unión. Puede ser valorada la eficacia del agente, por ej., por generación de curvas de respuesta a la dosis a partir de los datos obtenidos utilizando varias concentraciones del agente. Los métodos para determinar la formación de un complejo son estándar y son conocidos por los expertos en la materia, por ej., ensayos de coelectroforesis de afinidad (ACE) o ensayos ELISA tal como se han descrito en la presente invención.

La invención también incluye el agente así identificado como capaz de alterar la unión del polipéptido de la LBP a una molécula de unión.

La invención también incluye un método para la evaluación de un agente respecto a su capacidad para unirse a un polipéptido de la LBP. Se proporciona un agente. Se proporciona un polipéptido de la LBP. El agente es puesto en contacto con el polipéptido de la LBP. Se evalúa la capacidad del agente para unirse al polipéptido de la LBP. Preferiblemente, el polipéptido de la LBP es LBP-1, LBP-2 o LBP-3. La unión puede ser determinada, por ej., midiendo la formación de un complejo por métodos estándar conocidos por los expertos en la materia, por ej., ensayos de electroforesis de afinidad (ACE), ensayos ELISA tal como se ha descrito anteriormente.

La invención también incluye un método para la evaluación de un agente respecto a su capacidad para unirse al ácido nucleico que codifica una secuencia reguladora de la LBP. Se proporciona un agente. Se proporciona un ácido nucleico que codifica una secuencia reguladora de la LBP. El agente es puesto en contacto con el ácido nucleico. Se evalúa la capacidad del agente para unirse al ácido nucleico. Preferiblemente, la secuencia reguladora de la LBP es una secuencia reguladora LBP-1, LBP-2 o LBP-3. Puede determinarse la unión, por ej., por medición de la formación de un complejo por métodos estándar conocidos por los expertos en la materia, por ej., ensayos del cambio de movilidad del DNA, análisis de la huella de la DNasa I (Ausubel y col., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, (1989)).

La invención también incluye el agente así identificado como capaz de unirse a un ácido nucleico que codifica una secuencia reguladora de la LBP.

Los métodos descritos en la presente invención pueden ser útiles para el tratamiento de la arterosclerosis en un animal. Se precisa un animal de tratamiento para la arterosclerosis. Se proporciona un agente capaz de alterar un aspecto de la estructura o el metabolismo de la LBP. El agente es administrado al animal en una cantidad terapéuticamente efectiva de modo que se produzca el tratamiento de la arterosclerosis.

El agente puede ser un polipéptido de la LBP, por ej., LBP-1, LBP-2 o LBP-3, o un fragmento o análogo biológicamente activo del mismo. El agente puede ser, por ej., el polipéptido tal como se ha establecido en la SEC ID NOS: 1-9. Preferiblemente, el agente es un polipéptido de una longitud de no más de aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de no más de aproximadamente 50 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía de no más de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía de no más de aproximadamente 20 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía de no más de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía de no más de aproximadamente 5 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía de no más de aproximadamente 4 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía de no más de aproximadamente 3 residuos de aminoácidos, y más preferiblemente de no más de aproximadamente 2 residuos de aminoácidos. Preferiblemente, el polipéptido incluye al menos aproximadamente un 20% de residuos aminoácidos de tipo ácido, más preferiblemente todavía al menos aproximadamente un 40% de residuos aminoácidos de tipo ácido, más preferiblemente todavía al menos aproximadamente un 60% de residuos aminoácidos de tipo ácido, más preferiblemente todavía al menos aproximadamente un 80% de residuos aminoácidos de tipo ácido, más preferiblemente todavía al menos aproximadamente un 90% de residuos aminoácidos de tipo ácido, más preferiblemente todavía al menos aproximadamente un 95% de residuos aminoácidos de tipo ácido, y más preferiblemente al menos aproximadamente un 98% de residuos aminoácidos de tipo ácido. Los residuos aminoácidos de tipo ácido incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Un ejemplo de dicho polipéptido de la LBP es la BHF-1, que tiene un fragmento de una longitud de 20 aminoácidos de la LBP-1 humana o de conejo que contiene residuos aminoácidos 14 hasta 33. Ver Fig. 9 (SEC ID NO: 9). El 45% de los residuos aminoácidos de la BHF-1 son de tipo ácido. La invención también incluye fragmentos y análogos biológicamente activos de la BHF-1.

Otras regiones de tipo ácido preferidas de las LBPs son los residuos aminoácidos 8 a 22 (SEC ID NO: 19), 8 a 33 (SEC ID NO: 20), 23 a 33 (SEC ID NO: 21), y 208 a 217 (SEC ID NO: 22) de la LBP-2 humana tal como se representa en la Fig. 7 (SEC ID NO: 7); residuos de aminoácidos 14 a 43 (SEC ID NO: 23) y 38 a 43 (SEC ID NO: 24) de la LBP-1 de conejo o humano tal como se ha representado en la Fig. 1 (SEC ID NO: 1) y Fig. 6 (SEC ID NO: 6); residuos de aminoácidos 105 a 120 (SEC ID NO: 25), 105 a 132 (SEC ID NO: 26), 121 a 132 (SEC ID NO: 27), y 211 a 220 (SEC ID NO: 28) de la LBP-2 de conejo tal como se ha representado en la Fig 2 (SEC ID NO: 2); residuos de aminoácidos 96 a 110 (SEC ID NO: 29) de la LBP-3 de conejo tal como se ha representado en la Fig. 5 (SEC ID NO: 5); y residuos de aminoácidos 53 a 59 (SEC ID NO: 41) de la LBP-3 humana tal como se ha representado en la Fig. 8 (SEC ID NO: 8). La invención también pretende incluir fragmentos y análogos biológicamente activos de cualquiera de estos polipéptidos.

Otros ejemplos de agentes incluyen homopolímeros y heteropolímeros de cualquier aminoácido o análogo de aminoácido. En ciertas realizaciones preferidas, el agente es un homopolímero de un aminoácido de tipo ácido o análogo del mismo. En ciertas realizaciones, el agente es un heteropolímero de uno o más aminoácidos de tipo ácido y uno o más otros aminoácidos o análogos del mismo. Por ejemplo, los agentes incluyen poly(glu), poly(asp), poly(glu asp), poly(glu N), poly(asp N) y poly(glu asp N). Por N se pretende significar cualquier aminoácido, o análogo del mismo, diferente de glu o asp. Por poly(glu asp) se pretende significar cualquier permutación de glu y asp para un péptido de longitud dada. Un péptido preferido es poly(glu) de una longitud de no más de aproximadamente 10 aminoácidos, preferiblemente de una longitud de aproximadamente 7 aminoácidos.

El agente puede ser un ácido nucleico de la LBP o un fragmento o análogo biológicamente activo del mismo, por ej., un ácido nucleico que codifique el polipéptido de la LBP-1, LBP-2 o LBP-3, o un fragmento o análogo biológicamente activo del mismo. El agente puede ser, por ej., un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se ha establecido en la SEC ID NOS: 10-18. En otras realizaciones, el agente es una molécula antisentido, por ej., una que pueda unirse a una secuencia de gen de la LBP.

Tratamiento pretende incluir, por ej., la prevención, el tratamiento, la reducción de los síntomas de, o la curación de la arterosclerosis. La administración del agente puede conseguirse por cualquier método que permita que el agente alcance las células objetivo. Estos métodos incluyen, por ej., inyección, deposición, implantación, supositorios, ingestión oral, inhalación, administración tópica, o cualquier otro método de administración por el que se obtenga el acceso a las células objetivo. Las inyecciones pueden ser, por ej., intravenosas, intradérmicas, subcutáneas, intramusculares o intraperitoneales. La implantación incluye insertar sistemas de liberación de fármacos implantables, por ej., microesferas, hidrogeles, reservorios poliméricos, matrices de colesterol, sistemas poliméricos, por ej, erosión de la matriz y/o sistemas de difusión y sistemas no poliméricos, por ej., pellets comprimidos, fusionados o parcialmente fusionados. Los supositorios incluyen supositorios de glicerina. Las dosis de ingestión oral pueden ser recubiertas entéricamente. La inhalación incluye la administración del agente con un aerosol en un inhalador, tanto sólo como unido a un soporte que pueda ser absorbido.

La administración del agente puede ser solo o en combinación con otros agentes terapéuticos. El agente puede ser combinado con un soporte adecuado, incorporado en un liposoma, o incorporado en un sistema de liberación de polímero.

La administración puede ser diseñada de modo que de lugar a exposiciones secuenciales al agente durante un cierto periodo de tiempo, por ej., horas, días, semanas, meses o años. Esto puede conseguirse por la administración repetida del agente por uno de los métodos descritos anteriormente, o de forma alternativa, por un sistema de liberación controlada en el que el agente se administra al animal durante un periodo prolongado sin administraciones repetidas. Por sistema de liberación controlada se quiere significar que la liberación total del agente no se produce de forma inmediata con la administración, sino que más bien se libere durante algún tiempo. La liberación puede producirse de golpe o puede tener lugar de forma gradual y continua. La administración de dicho sistema puede ser, por ej., por formas de dosis orales de larga acción, inyección de bolus, parches transdérmicos o implantes subcutáneos.

Ejemplos de los sistemas en que puede tener lugar la liberación incluyen, por ej., sistemas en los que el agente está atrapado en liposomas que están encapsulados en una matriz polimérica, siendo los liposomas sensibles a un estímulo específico, por ej., la temperatura, el pH, la luz, el campo magnético, o a una enzima de degradación, y sistemas en los que el agente es encapsulado por una microcápsula recubierta iónicamente con una núcleo de la microcápsula degradado por la enzima. Ejemplos de sistemas en los que la liberación del agente es gradual y continua incluyen, por ej., sistemas erosionales en los que el agente es contenido en una forma dentro de una matriz, y sistemas difusionales en los que el agente es permeabilizado a una velocidad controlada, por ej., a través de un polímero. Dichos sistemas de liberación pueden ser, por ej., en la forma de pellets o de cápsulas.

El agente puede ser suspendido en un líquido, por ej., en forma disuelta o en forma coloidal. El líquido puede ser un disolvente, un disolvente parcial o un no disolvente. En muchos casos pueden utilizarse agua o un líquido orgánico.

El agente puede ser administrado antes o después de que aparezcan los síntomas de arterosclerosis. El agente puede ser administrado a pacientes con historias familiares de arterosclerosis, o que tengan fenotipos que puedan indicar una predisposición a la arterosclerosis, o a los que se haya diagnosticado como que poseen un genotipo que predispone al paciente a la arterosclerosis, o que tengan otros factores de riesgo, por ej., hipercolesterolemia, hipertensión o fumadores.

El agente puede ser administrado al animal en una cantidad terapéuticamente efectiva. Por cantidad terapéuticamente efectiva se quiere significar la cantidad que sea capaz de prevenir o revertir, al menos parcialmente, la arterosclerosis. Puede determinarse una cantidad terapéuticamente efectiva sobre una base individual y estará basada, al menos en parte, en consideraciones de la especie de animal, el tamaño del animal, la edad del animal, el agente utilizado, el tipo de sistema de liberación utilizado, el tiempo de administración con relación al inicio de los síntomas de la arterosclerosis, y si se utiliza un régimen de liberación de dosis único, múltiple o controlado. Puede determinarse una cantidad terapéuticamente efectiva por uno de los normalmente expertos en la materia empleando dichos factores y utilizando sólo experimentos de rutina.

Preferiblemente, la concentración del agente está en una dosis de aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal/día, más preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 500 mg/kg/día, más preferiblemente todavía entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 100 mg/kg/día, y más preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 5 mg/kg/día. La concentración específica depende parcialmente del agente particular utilizado, ya que unos son más efectivos que otros. La concentración de la dosis del agente que es realmente administrado depende al menos en parte de la concentración final que se desee en el sitio de acción, del método de administración, la eficacia del agente en particular, la longevidad del agente en particular, y el tiempo de administración en relación con el inicio de los síntomas de la arterosclerosis. Preferiblemente, la forma de dosis es tal que sustancialmente no afecta de forma negativa al animal. La dosis puede ser determinada por cualquiera de los expertos en la materia que utilizan dichos factores y utilizando sólo experimentación de rutina.

En ciertas realizaciones, pueden utilizarse varias construcciones de genes como parte de un protocolo de terapia génica para liberar ácidos nucleicos que codifican un agente, por ej., tanto una forma agonística como antagonística de un polipéptido de la LBP. Por ejemplo, pueden utilizarse vectores de expresión para la transfección in vivo y la expresión de un polipéptido de la LBP en tipos particulares de células de modo que reconstituyan la función de, o alternativamente, anulen la función de, el polipéptido de la LBP en una célula en la que se exprese la LBP de tipo no irregular. Las construcciones de expresión del polipéptido de la LBP, y los mutantes de las mismas, pueden ser administradas en cualquier soporte biológicamente efectivo, por ej., cualquier formulación o composición capaz de liberar de forma efectiva el gen de la LBP a las células in vivo. Las aproximaciones incluyen, por ej., la inserción del gen sujeto en vectores virales incluyendo, por ej., retrovirus recombinantes, adenovirus, virus adeno-asociados, y virus-1 de herpes simplex, o bacterias recombinantes o plásmidos eucarióticos. Los vectores virales infectan o translucen células directamente; el DNA del plásmido puede ser liberado con la ayuda de, por ejemplo, liposomas catiónicos (lipofectin® (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) o derivatizados (por ej., anticuerpos conjugados), conjugados de polilisina, gramicidina S, cubiertas virales artificiales u otros de dichos soportes intracelulares, así como la inyección directa de la construcción del gen o la precipitación de Ca_{3}(PO_{4})_{2} llevada a cabo in vivo. Los métodos anteriormente descritos son conocidos por los expertos en la materia y pueden ser llevados a cabo sin experimentación indebida. Ya que la transducción de las células objetivo apropiadas representan la primera etapa crítica en la terapia génica, la selección del particular sistema de liberación del gen dependerá de factores tales como el fenotipo del objetivo pretendido y la ruta de administración, por ej., de forma local o sistémica. La administración puede ser dirigida a uno o más tipos de células, y a una o más células dentro de un tipo de células, de modo que sea terapéuticamente efectiva, por métodos que son conocidos por los expertos en la materia. El agente puede ser administrado a las células de la pared arterial. La administración puede ser llevada a cabo a través de las células embriónicas o del animal prenatal. Se reconocerá que el gen particular construido que proporciona una baja expresión de la LBP transduccional in vivo es también útil para la transducción de células in vitro, tal como para uso en los ensayos de diagnóstico descritos en la presente invención.

La terapia de la arterosclerosis puede ser llevada a cabo con análogos nucleótidos antisentido de los genes que codifican para las LBPs. Preferiblemente, los nucleótidos antisentido tienen "esqueletos" no hidrolizables, por ej., fosforotioatos, fosforoditioatos o metilfosfonatos. La secuencia de base nucleósida es complementaria a la secuencia de una parte del gen que codifica para, por ej., la LBP-1, 2 ó 3. Dicha secuencia puede ser, por ej., ATTGGC si la secuencia del gen para la LBP es TAACCG. Una realización de dicha terapia sería por incorporación de un análogo antisentido de una parte de uno de los genes de la LBP en un medio de liberación lenta, por ej., alcohol polivinílico, que es administrado, por ej., por inyección subcutánea, de modo que se libere el análogo nucleótido antisentido durante un periodo de semanas o meses. En otra realización, el análogo antisentido es incorporado en una matriz polimérica, por ej., alcohol polivinílico, de modo que el gel pueda ser aplicado de forma local a una pared de la arteria dañada para inhibir la síntesis de la LBP y prevenir la acumulación de la LDL, por ej., después de la angioplastia o la aterectomía.

Los métodos descritos en la presente invención pueden ser útiles para el tratamiento de un animal con riesgo de arterosclerosis. Se proporciona un animal con riesgo de arterosclerosis. Se proporciona un agente capaz de alterar un aspecto de la estructura o del metabolismo de la LBP. El agente es administrado al animal en una cantidad terapéuticamente efectiva de modo que se produzca el tratamiento del animal. El riesgo de arterosclerosis puede ser resultado de, por ej., una historia familiar de arterosclerosis, un genotipo que predisponga a la arterosclerosis, o síntomas fenotípicos que predispongan a la arterosclerosis, por ej., tener hipercolesterolemia, hipertensión o fumar.

También se incluye un método para tratar una célula que tenga una anormalidad en la estructura o el metabolismo de la LBP. Se proporciona una célula que tenga una anormalidad en la estructura o el metabolismo de la LBP. Se proporciona un agente capaz de alterar un aspecto de la estructura o del metabolismo de la LBP. El agente es administrado a la célula en una cantidad terapéuticamente efectiva de modo que se produzca el tratamiento de la célula.

En ciertas realizaciones, se obtiene la célula de un cultivo de células o de un cultivo de tejidos o de fibroblastos de embriones no humanos. La célula puede ser, por ej., parte de un animal, por ej., un animal natural o un animal transgénico no humano. Preferiblemente, la LBP es la LBP-1, la LBP-2 o la LBP-3.

La invención también incluye una composición farmacéutica para el tratamiento de la arterosclerosis en un animal que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente, siendo el agente capaz de alterar un aspecto del metabolismo o la estructura de la LBP en el animal de modo que resulte en el tratamiento de la arterosclerosis, y un soporte farmacéuticamente aceptable. Los soportes farmacéuticamente aceptables incluyen, por ej., solución salina, liposomas y emulsiones de lípidos.

En ciertas realizaciones preferidas, el agente de la composición farmacéutica es un polipéptido de la LBP, por ej., la LBP-1, LBP-2 o LBP-3, o un fragmento o análogo biológicamente activo del mismo. El agente puede ser, por ej., el polipéptido tal como se ha establecido en la SEC ID NOS: 1-9. Preferiblemente, el agente es un polipéptido de una longitud de no más de aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de no más de aproximadamente 50 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía de no más de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía de no más de aproximadamente 20 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía de no más de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía de no más de aproximadamente 5 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía de no más de aproximadamente 4 residuos de aminoácidos, más preferiblemente todavía de no más de aproximadamente 3 residuos de aminoácidos, y más preferiblemente de no más de aproximadamente 2 residuos de aminoácidos. Preferiblemente, el polipéptido incluye al menos aproximadamente un 20% de residuos aminoácidos de tipo ácido, más preferiblemente todavía al menos aproximadamente un 40% de residuos aminoácidos de tipo ácido, más preferiblemente todavía al menos aproximadamente un 60% de residuos aminoácidos de tipo ácido, más preferiblemente todavía al menos aproximadamente un 80% de residuos aminoácidos de tipo ácido, más preferiblemente todavía al menos aproximadamente un 90% de residuos aminoácidos de tipo ácido, más preferiblemente todavía al menos aproximadamente un 95% de residuos aminoácidos de tipo ácido, y más preferiblemente al menos aproximadamente un 98% de residuos aminoácidos de tipo ácido.

En ciertas realizaciones preferidas, el agente es un ácido nucleico de la LBP, por ej., un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la LBP-1, LBP-2 o LBP-3, o un fragmento o análogo del mismo biológicamente activo. El agente puede ser, por ej., un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se ha establecido en las SEC ID NOS: 10-18.

La invención también incluye una composición de vacuna para el tratamiento de la arterosclerosis en un animal que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente, siendo capaz el agente de alterar un aspecto del metabolismo o la estructura de la LBP en el animal de modo que de lugar al tratamiento de la arterosclerosis, y un soporte farmacéuticamente aceptable.

Los métodos descritos en la presente invención pueden ser útiles para el diagnóstico de las lesiones arteroscleróticas en un animal. Se proporciona un animal. Se proporciona un agente marcado capaz de unirse a la LBP presente en las lesiones arteroscleróticas. El agente marcado es administrado al animal bajo condiciones que permitan que el agente marcado interaccione con la LBP de modo que de lugar a la LBp marcada. La localización o la cuantificación de la LBP marcada es determinada por la toma de imágenes así como para diagnosticar la presencia de las lesiones arteroscleróticas en el animal.

Preferiblemente, la LBP es LBP-1, LBP-2 o LBP-3. La toma de imágenes puede llevarse a cabo por métodos estándar conocidos por los expertos en la materia, incluyendo, por ej., imágenes de resonancia magnética, imágenes de cámara gamma, imágenes topográficas computerizadas de emisión de fotón único (SPECT) o tomografía de emisión de positrón (PET).

Preferiblemente, para el diagnóstico y la toma de imágenes arteroscleróticas se utilizan los agentes que se unen fuertemente a las LBPs en las lesiones arteroscleróticas. El agente es radiomarcado con, por ej., Tc^{99m} u otro isótopo adecuado para la toma de imágenes clínica por cámara gamma, SPECT, escaneado PET u otro tipo de tecnología similar. Debido a que las LBPs se producen en lesiones muy tempranas, dicha toma de imágenes es más sensible que la angiografía o los ultrasonidos para la localización de lesiones muy iniciales que todavía no afectan al lumen arterial para causar una protuberancia visible o un flujo alterado. Además de localizar tanto las lesiones tempranas como las más desarrolladas, los agentes de toma de imágenes que se unen a las LBPs pueden ser utilizados para seguir el progreso de la arterosclerosis, como un medio de evaluar la efectividad tanto de los tratamientos dietéticos como farmacológicos.

De este modo, una realización de diagnóstico de la invención es la adaptación de, por ej., un péptido complementario a una de las LBP's, por marcaje radioactivo del mismo y utilizándolo como un agente inyectable para la toma de imágenes para la detección de arterosclerosis oculta. El péptido es seleccionado entre aquellos de los que se conoce que se unen a las LBPs, por ej., RRRRRR o KKLKLXX, o cualquier otro péptido policatiónico que se une a los dominios altamente electronegativos de las LBPs. Para la detección extracorporal con una cámara de centelleo gamma (Anger), los ligandos de unión a tecnecio, por ej., CGC, GGCGC, o GGCGCF, pueden ser incorporados en los péptidos en el N terminal o en el C terminal para el marcaje con Tc 99m. Para la toma de imágenes externas por imágenes de resonancia magnética (MRI), por ej., el quelador que se une al gadolinio, el ácido dietilen triamina-penta-acético (DTPA), es unido de forma covalente al N o al C teminal de los péptidos. En todavía otras realizaciones, los péptidos que se unen a la LBP son unidos de forma covalente, por ej., a las partículas de ión óxido magnético por métodos estándar conocidos por los expertos en la materia, por ej., por conjugación de los péptidos con gránulos de resina de poliestireno activado que contienen un animal contra una LBP, por ejemplo.

Los métodos descritos en la presente invención pueden ser útiles para inmunizar un animal contra una LBP, por ej., la LBP-1, LBP-2 o la LBP-3, o un fragmento o un análogo de la misma. Se proporciona un animal que tenga LDL. Se proporciona una LBP o un fragmento o un análogo de la misma. La LBP o el fragmento o el análogo de la misma son administrados al animal de modo que estimulen la producción de anticuerpos por el animal a la LBP o al fragmento o análogo de la misma de modo que la unión de la LBP a la LDL sea alterada, por ej., disminuida o incrementada.

La invención también incluye un método de preparar un fragmento o análogo del polipéptido de la LBP, el fragmento o análogo que tenga la capacidad de unirse a la LDL modificada y a la LDL originaria. Se proporciona un polipéptido de la LBP. La secuencia del polipétido de la LBP es alterada. El polipéptido de la LBP alterado es ensayado para determinar la capacidad de unirse a la LDL modificada, por ej., a la LDL metilada, a la LDL oxidada, a la LDL acetilada, a la LDL tratada con ciclohexanediona (CHD-LDL), y a la LDL originaria.

Los fragmentos o análogos pueden ser generados y ensayados para determinar su capacidad para unirse a estas LDL's modificadas y a la LDL originaria, por métodos conocidos por los expertos en la materia, por ej., tal como se describe en la presente invención. Preferiblemente, son ensayados para determinar su capacidad para unirse a la LDL metilada y a la LDL originaria. La actividad de unión del fragmento o análogo puede ser mayor o menor que la actividad de unión de la LBP originaria. Preferiblemente, es mayor. En realizaciones preferidas, la LBP es la LBP-1, LBP-2 o la LBP-3.

La invención también incluye un método para el aislamiento de un cDNA que codifica una LBP. Se proporciona una biblioteca de cDNA. La biblioteca de cDNA es seleccionada para un cDNA que codifique un polipéptido que se una a la LDL originaria y a la LDL modificada, por ej., la LDL metilada o la LDL oxidada. Se aísla el cDNA que codifica este polipéptido, el cDNA que codifica una LBP.

Los siguientes ejemplos no limitativos ilustran además la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de una Biblioteca de cDNA de Conejo

Este ejemplo ilustra la construcción de una biblioteca de cDNA de conejo utilizando mRNA de aorta abdominal de conejo cicatrizada de forma deendotelializada con globo. La aorta de conejo deendotelializada con un catéter de globo ha demostrado ser un modelo válido para la arterosclerosis (Minick y col., Am. J. Pathol. 95: 131-158 (1979).

Se obtuvo el mRNA cuatro semanas después de la introducción del globo para maximizar la unión de la LDL focal en la aorta de conejo con el globo. Se llevó a cabo la síntesis del cDNA de la primera hebra en una mezcla de reacción de 50 \mul conteniendo 4 \mug de mRNA; 2 \mug de prímero oligo d(T); mezcla de metilación dNTP (10 mM de cada); 10 mM de DTT; 800 unidades de exponente II RT (Life Technologies, Gaithersburg, MD); tampón de síntesis de cDNA de 1 X primera hebra (50 mM de Tris-HCl, pH 8,3; 75 mM de KCl; 5 mM de MgCl_{2}), que se incubaron durante 1 h a 37ºC. A continuación se ajustó la mezcla de reacción a 250 \mul mediante la adición de un tampón de 1 X segunda hebra (30 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 105 mM de KCl; 5,2 mM de MgCl_{2}); 0,1 mM de DTT; mezcla de metilación dNTP (10 mM cada una); 50 unidades de polimerasa I del DNA de la E. coli, 3 unidades de RNasa H; 15 unidades de ligasa de DNA de la E. coli (todas las enzimas se obtuvieron de Life Technologies), que se incubaron durante 2,5 horas adicionales a 15ºC. Los cDNAs de doble hebra resultantes (dscDNA) se trataron a continuación con 1,5 unidades de polimerasa de DNA T4 (Novagen Inc., Madison, WI) durante 20 min a 11ºC para preparar dscDNA de extremos romos. A continuación éstos se concentraron por precipitación en etanol y se unieron los conectores EcoRI/Hind III a los extremos mediante la ligasa de DNA T4 (Novagen Inc.). Se trataron los cDNAs ligados con el enlazador con las enzimas de restricción para producir las secuencias de reconocimiento EcoRI y HindIII en sus extremos 5' y 3', respectivamente. Después de la eliminación del conector de DNA por cromatografía de exclusión de gel, se insertaron los dscDNAs en los brazos del fago \lambdaEXlox (Novagen Inc.) de un modo unidireccional mediante la ligasa DNA T4 y se empaquetaron en partículas de fago de acuerdo con el protocolo del fabricante (Novagen Inc.). Se estableció una biblioteca de fagos de cDNAs conteniendo 2 x 10^{6} clones independientes a partir de 4 \mug de mRNA.

Ejemplo 2 Identificación de los cDNAs de Conejo que Codifican las Proteínas de Unión de la LDL (LBPs)

Este ejemplo ilustra un método de selección funcional de una biblioteca de cDNA de conejo de modo que se identifiquen los cDNAs que codifican las LBPs que se unen tanto a la LDL originaria como a la metil LDL. La metil LDL no es reconocida por los receptores de la superficie de las células previamente descritas. Ver, por ej., Weisgraber y col., J. Biol. Chem. 253: 9053-9062 (1978).

Se infectó un cultivo recién preparado de la noche anterior de células de E. coli ER1647 (Novagen Inc.) con el fago de cDNA obtenido a partir del Ejemplo 1, y se colocó en placas a una densidad de 2 x 10^{4} unidades de formación de placas (pfu) en placas de 150 mm de diámetro conteniendo agar 2 X YT. Se prepararon e incubaron a 37ºC un total de 50 placas, equivalente a 1 x 10^{6} fagos, hasta que las placas alcanzaron 1 mm de diámetro (5-6 horas). Se cubrió la superficie de cada placa con una capa de membrana de nitrocelulosa seca, que había sido previamente saturada con una solución de IPTG 10 mM, para inducir la producción de proteína recombinante, así como para inmovilizar las proteínas en las membranas. Las placas se incubaron a 37ºC durante un periodo adicional de 3-4 horas, y a continuación durante toda la noche a 4ºC.

El siguiente día, se levantaron las membranas de cada placa y se procedió del modo siguiente. Varios enjuagues breves en una solución de TBST (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20), dos enjuagues de 10 min con guanidina 6 M-HCl en HBB (20 mM de HEPES, pH 7,5; 5 mM de MgCl_{2}, 1 mM de DTT, y 5 mM de KCl); dos enjuagues de 5 min en guanidina 3 M-HCl en HBB; un breve enjuague final en TBSEN (TBS, 1 mM de EDTA, 0,02% de NaN_{3}).

A continuación se bloquearon las membranas durante 30 min a temperatura ambiente en una solución de TBSEN con un 5% de leches en polvo no grasa, seguido por 10 min en TBSEN con un 1% de leche en polvo no grasa. Después del bloqueo, se incubaron las membranas con LDL humana originaria (obtenida tal como se ha descrito en el Ejemplo 11 o LDL humana metilada (meLDL) (ver Weisgraber y col., J. Biol. Chem. 253: 9053-9062 (1978)), a una concentración de 4 \mug/ml, en una solución conteniendo 1 X TBSEN, un 1% de leche en polvo no grasa, 1 mM de PMSF, una solución del inhibidor 0,5 X proteasa (1 mM de ácido \varepsilon-aminocaproico/1 mM de benzamidina). La incubación fue durante 4 horas a temperatura ambiente en una placa de Petri de vidrio con una suave agitación en una mesa de agitación, seguido por toda la noche a 4ºC sin agitación.

Se detectó la unión específica de la meLDL y la LDL originaria en las membranas de nitrocelulosa por anticuerpos contra la LDL humana. Se absorbieron anticuerpos policlonales de la LDL anti-humana de cordero (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) con extractos de células E de capas de E. coli para eliminar el origen. Para la adsorción, se hicieron crecer células E de capas de E. coli hasta una fase log, giradas y suspendidas de nuevo en PBS conteniendo 1 mM de PMSF, 2 mM de ácido \varepsilon-aminocaproico, y 1 mM de benzamidina. A continuación la suspensión de células se sometió a 8 ciclos de congelación-descongelación por medio de la inmersión en nitrógeno líquido y bajo corriente de agua del grifo fría, respectivamente. Se incubó la solución de anticuerpos de anti LDL/extracto de células con agitación suave durante 1 hora a 4ºC. (1 ml de solución del anticuerpo/3 mg del extracto de células crudo). Después de la incubación, se centrifugó la mezcla (10.000 x g; 10 min; 4ºC) y se guardó el sobrenadante a 4ºC en presencia de NaN_{3} 0,02% hasta su uso. Se procesaron las membranas para inmunoselección del modo siguiente: (i) tres lavados de 5 min a temperatura ambiente en TBSEN conteniendo gelatina al 1%; (ii) 30 min de incubación en PBS, pH 7,4 con gelatina al 1%; (iii) dos horas de incubación a temperatura ambiente con agitación suave en PBS recién preparado/solución de gelatina conteniendo anticuerpos de la LDL anti-humanos de cordero absorbidos (Boehringer Manheim, Indianápolis, IN) (dilución 1:1000); (iv) tres lavados breves en TBS, pH 7,4; (v) incubación a temperatura ambiente durante una hora con agitación suave en PBS/solución de gelatina conteniendo anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina de anticordero de burro (Sigma, St. Louis, MO) (dilución 1:10.000); (vi) tres breves lavados con TBS, pH 7,4; y (vii) desarrollo de acuerdo a las instrucciones del fabricante, utilizando un kit de desarrollo de sustrato fosfatasa alcalina (Novagen Inc.). Las placas de fago que produjeron LBPs aparecieron como "donuts" coloreados de azul en las membranas.

Se purificó el fago del Ejemplo 1 conteniendo los cDNAs de la LBP por placa y se convirtió en subclones de plásmido siguiendo un protocolo llamado "Autosubcloning by Cre-mediated Plasmad Escisión" proporcionado por Novagen Inc. Se obtuvieron las secuencias de DNA por el método de terminación de cadena de dideoxinucleótido (Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74: 5463-5467 (1977), y se analizaron por un secuenciador automatizado de Applied Biosystems. Se determinó el marco de lectura (ORF) de cada cDNA a partir de secuencias de consenso obtenidas tanto de hebras con sentido como de hebras antisentido de los cDNAs. La secuenciación confirmó que se habían aislado tres genes previamente desconocidos. Ya que los genes se seleccionaron por selección funcional para la unión de la LDL, las proteínas que codificaron por estos genes fueron calificadas como proteínas de unión de la LDL (LBPs), específicamente, LBP-1, LBP-2 y LBP-3. Las secuencias de cDNA para LBP-1, LBP-2 y LBP-3 de conejo y las correspondientes proteínas se han establecido en la SEC ID NOS: 10-14.

En base a sus respectivas secuencias de codificación de cDNA, se determinaron los tamaños de las proteínas recombinantes que fueron 16,2 kDa para la LBP-1, 40 kDa para la LBP-2, y 62,7 kDa para la LBP-3.

Ejemplo 3 Análisis de Manchas Northern de RNA de Conejo Utilizando cDNA o cRNA de la LBP

Este ejemplo ilustra el tamaño y la distribución de tejido de los mRNAs de la LBP. Se aisló el RNA total de diferentes tejidos de conejo: adrenales, aorta torácica, aorta abdominal, aorta abdominal hinchada y reendotelializada, corazón, riñón células de músculo liso, pulmón e hígado, por el reactivo Trizol (Life Technologies) y se concentró por precipitación con etanol. Se llevó a cabo la electroforesis de gel de RNA en agarosa al 1,2% conteniendo tampón 1 X MOPS (0,2 M de MOPS, pH 7,0; acetato sódico 50 mM; EDTA 5 mM, pH 8,0) y formaldehído 0,37 M. Se cargaron los geles con 20 \mug de RNA total a partir de cada tejido examinado y se sometieron a electroforesis a 100 voltios durante 2 horas en tampón de 1 X MOPS. Se hicieron las manchas de los RNAs en membranas de nitrocelulosa soportada (Schleicher & Schuell, Keene, NH) y se inmovilizaron por calentamiento a 80ºC durante 2 horas. Se llevó a cabo la hibridación a las sondas de cDNA o cRNA de LBP-1, LBP-2 y LBP-3 por procedimientos estándar conocidos por los expertos en la materia (ver, por ej., Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology; John Wiley & Sons (1989)); se detectaron las señales por autoradiografía.

Los resultados fueron los siguientes: los tamaños de los mRNAs fueron de aproximadamente 1,3 kb para la LBP-1, de aproximadamente 2,3-2,5 kb para la LBP-2, y de aproximadamente 4,7 kb para la LBP-3. Se encontró mRNA de LBP-1, LBP-2 y LBP-3 en todos los tejidos ensayados, pero la mayor cantidad fue en la aorta abdominal hinchada.

Ejemplo 4 Aislamiento de los cDNAs de la LBP Humanos

Este ejemplo ilustra el aislamiento de los cDNAs de la LBP de humano. Se aislaron los clones de cDNA de la LBP a partir de tres bibliotecas de cDNA. Se obtuvo una biblioteca de cDNA de cerebro de feto humano de Stratagene, LaJolla, CA, se obtuvo una biblioteca de cDNA de hígado humano y de aorta humana de Clontech, Palo Alto, CA, y se seleccionaron con una sonda de cDNA radiomarcada derivada de LBP-1, LBP-2 o LBP-3 de conejo, de acuerdo con el método descrito en Law y col., Gene Expresión 4: 77-84 (1994). Se identificaron varios clones fuertemente hibridantes y se purificaron por placa. Se confirmó que los clones eran las LBP-1, LBP-2 y LBP-3 humanas por secuenciación de DNA utilizando el método de terminación de cadena de dideoxinucleótido y el análisis por un secuenciador automatizado de Applied Biosystems. Las secuencias de cDNA y las correspondientes proteínas para la LBP-1, LBP-2 y LBP-3 se han establecido en la SEC ID NOS: 15, 16 y 17 respectivamente. En las Figs. 19, 20 y 21 se muestra una comparación entre las correspondientes secuencias de proteína de LBP-1, LBP-2 y LBP-3 para conejo y humano.

Ejemplo 5 Aislamiento de las Proteínas Recombinantes de Conejo LBP-1, LBP-2 y LBP-3 a partir de E. coli

Se aisló el cDNA de LBP a partir de los plásmidos originales pEXlox obtenidos tal como se ha descrito en los Ejemplos 1 y 2, y se subclonaron en el vector pProEX-HT (Life Technologies) para la expresión de la proteína recombinante. La inducción de la proteína recombinante por adición de IPTG a los cultivos DH10B de E. coli transformada dieron lugar a la expresión de proteína recombinante conteniendo la marca de la 6-histidina (N-terminal). A continuación se purificó esta proteína marcada para determinar las proteínas de la célula totales por unión a Ni-NTA (nitrilo de níquel-ácido triacético) tal como se ha descrito en el protocolo proporcionado por el fabricante (Qiagen, Inc., Santa Clara, CA). La preparación obtenida después de la etapa de cromatografía fue aproximadamente un 90% pura; se llevó a cabo la SDS-PAGE preparativa como etapa de purificación final.

Cuando se requirió por el procedimiento de caracterización, se llevó a cabo la iodinación de las LBPs utilizando gotas de yodo (Pierce, Rockford, IL). Las gotas de yodo se incubaron con 500 \muCi de una solución de Na^{125}I (17 Ci/mg) (New England Nuclear, Boston, MA) en un tubo de microfuga cerrado con tapón durante 5 min a temperatura ambiente. Se añadió la solución de proteína a las gotas de yodo-Na^{125}I del tubo de microfuga y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. Al final de esta incubación, se separaron alícuotas para la determinación del contaje del soluble total y del TCA precipitable. A continuación se precipitó la proteína radiomarcada con acetona fría (2,5 vol; -20ºC; 2,5 hr). Después de esta incubación, se recogió la proteína precipitada por centrifugación (14.000 g; 1 hr; temperatura ambiente) y se suspendió de nuevo en una muestra de tampón (urea 6 M/50 mM de Tris, pH 8,0/2 mM de EDTA). Se valoró la integridad de la preparación de la proteína por SDS-PAGE.

Se confirmaron las identidades de las LBPs recombinantes utilizando protocolos de secuenciación de proteína estándar conocidos por los expertos en la materia (A Practical Guide for Protein and Peptide Purification for Microsequencing, Matsudaira, ed., Academic Press, Inc., 2ª edición (1993)). Se llevó a cabo el análisis utilizando un Secuenciador de Proteína de Applied Biosystems modelo 477A con un analizador de aminoácidos en línea Modelo 120 PHT.

Ejemplo 6 Producción de los Anticuerpos de la LBP-1, LBP-2 y LBP-3

Este ejemplo ilustra la producción de anticuerpos policlonales de la LBP-1, LBP-2 y LBP-3. Se inyectó una mezcla de proteína de la LBP recombinante purificada (0,5 ml; 200 \mug) y RIBI adyuvante (RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) de forma subcutánea en cobayas machos (Dunkin Hartley; Hazelton Research Products, Inc., Denver, PA) a 3-5 sitios a lo largo de las regiones torácica dorsal y abdominal del cobaya. Se tomaron muestras de sangre por punción en vena en los días 1 (sangría pre-inmune), 28, 49 y 70. Se administraron inyecciones suplementarias en los días 21 (100 \mug; SC), 42 (50 \mug; SC), y 63 (25 \mug; SC). Se evaluó el resultado de la valoración del antisuero del cobaya por dilución en serie "dot blotting". Al mismo tiempo se evaluó el antisuero preinmune. Después de un tercer suplemento de proteína de LBP, la valoración frente a la proteína recombinante alcanzó un nivel máximo con una respuesta colorimétrica detectable en un ensayo de manchas de puntos de 156 pg.

Se demostró la especificidad del anticuerpo policlonal por la LBP-1, LBP-2 o la LBP-3 recombinante utilizando el análisis de manchas Western (Towbin y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76: 4350 (1979)). Se visualizó el complejo proteína-anticuerpo de forma inmunoquímica con IgG de cobaya-anti cabra conjugado con fosfatasa alcalina, seguido por tinción con azul de nitro tetrazolio (BioRad Laboratorios, Hercules, CA). Se bloqueó la unión no específica utilizando leche en polvo no grasa al 3% en solución salina tamponada con Tris (100 mM de Tris; 0,9% de NaCl, pH 7,4).

Ejemplo 7 Caracterización Inmunohistoquímica

Este ejemplo ilustra la presencia de las LBPs en o sobre placas que cubren las células endoteliales en o sobre células de músculo liso adyacente, y en la matriz extracelular. Además, se demostró la co-localización de la LDL y las LBPs. Se obtuvieron estos resultados por examen de las lesiones de las arterias de conejo hinchadas y las placas arteroscleróticas humanas por métodos inmunohistoquímicos.

Se obtuvo aorta deendotelializada hinchada de conejos que habían recibido una inyección de bolus de LDL humana (3 mg; i.v.) 24 horas antes de la toma de tejidos. Se obtuvieron las aortas humanas conteniendo placas arteroscleróticas de especimenes de autopsias de rutina. Se fijaron los tejidos en un 10% de formalina tamponada (\leq 24 horas) y se encajaron en parafina utilizando una máquina de encaje de tejido automatizada. Se cortaron secciones de tejido (5-7 \mu) y se montaron en portaobjetos de vidrio para su incubación durante 1 hora a 60ºC. Se desparafinizaron las secciones. Después de un lavado final con H_{2}O desionizada, se eliminó la actividad de la peroxidasa por incubación de las secciones con tampón de 1% de H_{2}O_{2}/H_{2}O durante 5 min a temperatura ambiente. Se enjuagaron las secciones con solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 min a temperatura ambiente y se bloqueó la unión no específica con suero de cabra normal al 5% o suero de conejo normal al 5% dependiendo de la fuente de anticuerpo secundario (Sigma, St. Louis, MO) (1 hora; temperatura ambiente). A continuación se incubaron las secciones con una dilución 1:50 (en suero de cabra normal al 5%/PBS) de un anticuerpo policlonal de cobaya frente la forma de conejo de la LBP-1, LBP-2 o LBP-3 recombinante. Los controles incluyeron suero preinmune así como antisuero específico para la LBP-1, LBP-2 o LBP-3 en los que el anticuerpo primario fue completamente adsorbido y eliminado por incubación con LBP-1, LBP-2 o LBP-3 recombinante seguido por centrifugación antes de la incubación con las secciones de tejido. Se utilizó un anticuerpo policlonal de conejo purificado por afinidad contra a apolipoproteína B humana (Polysciences Inc.; Warrington, PA) a una dilución de 1:100 (en suero de conejo normal al 5%/PBS). Se incubaron las secciones durante 2 horas a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Al final de la incubación, se enjuagaron las secciones con PBS y se incubaron con una dilución 1:200 (en suero de cabra normal al 5%/PBS) del conjugado IgG biotinilado de cobaya-anti cabra (Vector Laboratories, Burlingame, CA) o a una dilución 1:250 (en suero de conejo normal al 5%/PBS) de conjugado IgG biotinilado de cabra-anti conejo (Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara humidificadora. A continuación se enjuagaron las secciones con PBS y se amplificó la señal antígeno-anticuerpo utilizando el conjugado avidina/biotina HRP (kit Vectastain ABC; Vector Laboratories, Burlingame, CA). Se desarrollaron secciones utilizando sustrato DAB (4-6 min; temperatura ambiente) y se contratiñó con hematoxilina.

En la arteria de conejo hinchada, la inmunohistoquímica con los anticuerpos anti-LBP-1, LBP-2 y LBP-3 mostró que las LBP-1, LBP-2 y LBP-3 estaban localizadas en o sobre células endoteliales funcionalmente modificadas en los bordes de las islas endoteliales regenerantes, la misma situación en que se ha demostrado la unión de la LDL irreversible (Chang y col., Arteriosclerosis and Thrombosis, 12: 1088-1098 (1992)). También se encontraron LBP-1, LBP-2 y LBP-3 en o sobre las células de músculo liso íntimo por debajo de las células endoteliales funcionalmente modificadas, y a una menor extensión, en la matriz extracelular. No se detectó ninguna LBP-1, LBP-2 o LBP-3 en las áreas aún desendotelializadas, en donde la unión de la LDL había demostrado ser reversible (Chang y col., Arteriosclerosis and Thrombosis 12: 1088-1098 (1992)). La inmunohistoquímica de la aorta de conejo hinchada con anticuerpos de apoliproteína B anti-humana mostró la presencia de la LDL en las mismas localizaciones que se encontraron para la LBP-1, LBP-2 y LBP-3.

En las placas arteroscleróticas humanas tomadas en autopsias de rutina, la inmunohistoquímica con los anticuerpos de anti-LBP-1, anti-LBP-2 y anti-LBP-3 mostraron que también se encontraba LBP-1, LBP-2 y LBP-3 en o sobre las placas que cubrían las células y en o sobre las células del músculo liso adyacente. En el tejido humano, hubo una mayor evidencia de LBP-1, LBP-2 y LBP-3 en la matriz extracelular.

Los resultados obtenidos con las secciones de parafina fueron idénticos a los de las secciones congeladas.

Ejemplo 8 Ensayos de Coelectroforesis de Afinidad (ACE) de las LBPs y la LDL o HDL

Este ejemplo ilustra que la unión se produce entre la LBP-1, LBP-2 o LBP-3 y la LDL, y que esta unión es específica, tal como se ilustra por el hecho de que la unión no se produce entre la LBP-1, LBP-2 o LBP-3 y la HDL (lipoproteína de alta densidad).

Se llevó a cabo el análisis de afinidad y de especificidad de la unión de la LDL a la LBP-1, LBP-2 o LBP-3 de conejo recombinante utilizando el principio de la electroforesis de afinidad (Lee y Lander, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2768-2772 (1991)). Se preparó agarosa fundida (1%, 65ºC) en MOPS de sodio 50 mM, pH 7,0; 125 mM de acetato sódico, 0,5% de CHAPS. Se colocó un peine de teflón consistente en nueve barras paralelas (45 x 4 x 4 mm/3 mm de espaciado entre las barras) en una película GelBond (FMC Bioproducts, Rockland, ME) unido a una bandeja de reparto de plexiglás con el eje largo de las barras paralelo al eje largo de la bandeja de reparto. Se colocó una tira de teflón (66 x 1 x 1 mm) en el borde con el eje largo paralelo al eje corto de la bandeja de reparto, a una distancia de 4 mm del eje del peine de teflón. A continuación se introdujo la agarosa fundida (> 65ºC) para conseguir una altura de aproximadamente 4 mm. La separación del peine y de la tira dio lugar a un gel conteniendo nueve pocillos rectangulares de 45 x 4 x 4 mm adyacentes a una ranura de 66 x 1 mm. Se prepararon muestras de LDL o de HDL en un tampón de gel (50 mM de MOPS de sodio, pH 7,0, 125 mM de acetato sódico) a una concentración doble de la deseada. A continuación se mezclaron las muestras con un volumen igual de agarosa fundida (en 50 mM de MOPS de sodio, pH 7,0; 125 mM de acetato sódico; 50ºC), se pipetearon en los pocillos rectangulares apropiados y se dejaron melificar. Se ensayó la afinidad y la especificidad de la unión de la LBP-1 y LBP-3 utilizando varias concentraciones de LDL (540 a 14 nM) y de HDL (2840-177 nM). Se cargó la ranura una cantidad constante (0,003 nM-0,016 nM) de LBP-1, LBP-2 o LBP-3 marcadas con I^{125} (suspendida en 50 mM de MOPS de sodio, pH 7,0; 125 mM de acetato sódico; 0,5% de azul de bromofenol; 6% (peso/volumen) de sacarosa). Se sometieron los geles a electroforesis a 70 v/2 horas/20ºC. Al final del recorrido los geles se secaron al aire y se visualizaron los perfiles de retardo por exposición a películas de rayos X a los geles durante toda la noche a -70ºC, con pantallas intensificantes).

La LDL retardó la migración de la LBP-1, LBP-2 y la LBP-3 a través del gel de un modo dependiente de la concentración, y de un modo saturable, indicando que la unión de la LBP-1, LBP-2 y LBP-3 a la LDL fue altamente específica. Esta conclusión está soportada por el hecho de que la HDL no retardó la LBP-1, LBP-2 o al LBP-3. Una curva de unión generada a partir del ensayo de coelectroforesis de afinidad indicó que la LBP-1 se une a la LDL con una K_{d} de 25,6 nM, que la LBP-2 (clon 26 de conejo) se une a la LDL con una K_{d} de 100 nM, y que la LBP-3 (fragmento de 80 kDa) se une a la LDL con una K_{d} de 333 nM.

Además para ensayar la afinidad y la especificidad de la unión de la LBP-1, la LBP-2 y la LBP-3 a la LDL, se ensayó la capacidad de la LBP-1, LBP-2 o LBP-3 "fría" (es decir, no-radiomarcada) a inhibir de forma competitiva la unión de la LBP-1, la LBP-2 y la LBP-3 radiomarcadas a la LDL, respectivamente. Se llevaron a cabo estudios de competición utilizando concentraciones fijas a de LDL fría y LBP-1 radiomarcada y cantidades incrementadas de LBP-1 recombinante fría (6-31 \muM). Se prepararon las muestras de ensayo de ACE y el gel tal como se ha descrito en el presente documento. La LBP-1 fría inhibió la unión de la LBP-1 radiomarcada a la LDL de un modo dependiente de la concentración, la LBP-2 fría inhibió la unión de la LBP-2 radiomarcada a la LDL de un modo dependiente de la concentración, y la LBP-3 fría inhibió la unión de la LBP-3 radiomarcada a la LDL de un modo dependiente de la concentración.

La LBP-2 de conejo y humana contiene una larga extensión de aminoácidos de tipo ácido en la terminal amino (residuos aminoácidos 105 a 132 de la LBP-2 de conejo y residuos aminoácidos 8 a 33 de la LBP-2 humana). Se ensayó la posibilidad de que este segmento de la LBP-2 fuera el dominio de unión de la LDL por subclonación de dos clones LBP-2 de conejo que difieren entre sí por la presencia o ausencia de esta región ácida (clon 26 y clon 45, respectivamente) en los vectores de expresión, por métodos estándar conocidos por los expertos en la materia. A continuación se llevaron a cabo los ensayos de ACE con el fin de valorar la afinidad y la especificidad de la unión de estos dos clones a la LDL. La LDL retardó el clon 26 derivado de la migración de la LBP-2 radiomarcada a través del gel de un modo dependiente de la concentración, y saturable, mientras que no se retardó la migración de la LBP-2 radiomarcada derivada del clon 45.

Se llevaron a cabo los estudios de competición utilizando concentraciones fijadas de LDL fría y clon 26 derivado de la LBP-2 radiomarcada y concentraciones incrementadas de LBP-2 recombinante frío/clon 26 y LBP-2/clon 45. El clon 26 frío derivado de la LBP-2 inhibió la unión del clon 26 derivado de la unión de la LBP-2 radiomarcada a la LDL de un modo dependiente de la concentración. Por el contrario, el clon 25 derivado de la LBP-2 no afectó la unión del clon 26 derivado de la LBP-2 radiomarcada a la LDL. Estos resultados indican que la larga extensión de aminoácidos de tipo ácido contiene un dominio de unión de la LBP-2 a la LDL.

Ejemplo 9 Ensayos de Coelectroforesis de Afinidad (ACE) de la LBP-1 o la LBP-2 y la LDL en la Presencia de Inhibidores

Este ejemplo ilustra que la unión entre la LBP-1 o la LBP-2 y la LDL es inhibida por el ácido poliglutámico o la BHF-1. Se ensayó la capacidad de un tercer componente de inhibir la unión entre dos proteínas que previamente mostraron interacción mediante una modificación de los ensayos de ACE descritos en el Ejemplo 8. Se añadió un tercer compuesto a la parte superior de los pocillos junto con la proteína radiomarcada. Si el tercer compuesto inhibía la unión, la proteína radiomarcada correría a través del gel. Si el tercer compuesto no inhibía la unión, la migración de la proteína radiomarcada sería retardada por la proteína molde en el gel.

Se mostró la inhibición de la unión de la LBP-1/LDL o LBP-2/LDL por el ácido poliglutámico (peso molecular promedio de aproximadamente 7500, correspondiente a aproximadamente 7 monómeros) por reparto de una cantidad constantes de LDL (148 nM) en todas los carriles rectangulares. Se cargó una cantidad constante (1 \mul) de LBP-1 o de LBP-2 marcada con I^{125} (0,003 nM-0,016 nM) en los pocillos en la parte superior del gel, junto con concentraciones incrementadas de ácido poliglutámico (obtenido de Sigma) (0-0,4 nM). Se sometió el gel a electroforesis a 70 voltios durante 2 horas, se secó y se colocó en una película de rayos X, con pantallas intensificantes, durante toda la noche a -70ºC antes de que se desarrollara la película para determinar el perfil de retardo de la LBP-1 y la LBP-2. A medida que se incrementaron las concentraciones de ácido poliglutámico, disminuía el retardo de la migración de la LBP-1 y la LBP-2 por la LDL de un modo dependiente de la concentración, que mostró que el ácido poliglutámico inhibió la unión entre la LBP-1, la LBP-2 y la LDL.

Se mostró la inhibición de la unión de la LBP-1/LDL por la BHF-1 por reparto de una cantidad constante de LDL (148 nM) en todos los carriles rectangulares. Se cargó una cantidad constante de LBP-1 marcada con I^{125} (0,003 nM-0,016 nM) en los pocillos en la parte superior del gel, junto con concentraciones incrementadas de BHF-1 (0-10 nM), obtenida tal como se ha descrito en el Ejemplo 15. Se sometió el gel a electroforesis a 70 voltios durante 2 horas, se secó y se colocó en una película de rayos X, con pantallas intensificantes, durante toda la noche a -70ºC. A continuación se desarrolló la película para determinar el perfil de retardo de la LBP-1 marcada con I^{125}. A medida que se incrementó la concentración de BHF-1, disminuyó el retardo de la LBP-1 por la LDL de un modo dependiente de la concentración, lo cual demostró que la BHF-1 inhibió la unión entre la LBP-1 y la LDL.

Ejemplo 10 Ensayos de Coelectroforesis de Afinidad (ACE) para la Identificación de Fragmentos, Análogos y Miméticos de las LBPs que se Unen a la LDL

Este ejemplo ilustra un método para la identificación de fragmentos, análogos o miméticos de LBPs que se unen a la LDL, y que de este modo pueden ser utilizados como inhibidores de la unión de la LDL a la LBP en las paredes arteriales, por ocupación de los sitios de unión en moléculas de LDL, con lo que estos sitios se hacen inasequibles para la unión de la LBP en la pared arterial.

Se generaron fragmentos de la LBPs por rotura química o se sintetizaron a partir de secuencias conocidas de aminoácidos. Las muestras de estos fragmentos se añadieron (frío) de forma individual a la LBP radiomarcada tal como se ha descrito en el Ejemplo 8, para valorar la potencia inhibitoria de los diferentes fragmentos. Mediante la aplicación iterativa de este procedimiento en porciones progresivamente menores de fragmentos identificados como inhibitorios, se identificó el fragmento o fragmentos de polipéptido activo más pequeños. De un modo similar, se ensayaron los análogos de las LBPs para identificar análogos que puedan actuar como inhibidores por unión a la LDL. Y, de forma similar, se ensayaron los miméticos de la LBP (moléculas que se parecen en la conformación y/en las distribuciones de carga de los sitios de unión de la LDL en las moléculas de LBP) en un modo similar para identificar moléculas que muestren afinidades para los sitios de unión de la LDL en la LBP.

Las afinidades de los inhibidores así identificados son al menos tan fuertes como la afinidad de la propia LDL para los sitios de unión de la LDL en la LBP. Los inhibidores se unen al menos de forma competitiva, y algunos también de forma irreversible e preferencial, a los sitios de unión de la LDL, con lo que se hace que dichos sitios sean inaccesibles para la unión de la LDL humoral.

Ejemplo 11 Ensayos ELISA

Este ejemplo ilustra el uso de un ensayo de placa ELISA para la cuantificación de la capacidad de un compuesto del ensayo para inhibir la unión de la LDL a una LBP específica.

El ensayo se llevó a cabo del modo siguiente: se diluyó la LDL en 50 mM de Na_{2}HCO_{3}, pH 9,6/0,02% de NaN_{3} y se añadió a los pocillos de una placa de 96 pocillos (Placas de poliestireno EIA de Immuno Ware 96-Well Reacti-Bind; Pierce (Rockford, IL)) para conseguir una concentración final comprendida entre 0,1 y 1 \mug/pocillo. Se incubaron las placas durante 6 horas a temperatura ambiente. Al final del periodo de incubación, se lavaron los pocillos 3 veces con solución salina tamponada con Tris, pH 7,4 (TBS), y se bloquearon durante toda la noche con 200 \mul de albúmina de suero de bovino al 1% (BSA) en TBS/0,02% de NaN_{3} (Sigma; St. Louis MO) a temperatura ambiente. A continuación se incubaron los pocillos con 200 \mul de la proteína LBP (5-10 \mug/pocillo) en TBS a concentraciones variables del compuesto de ensayo. Se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación se lavaron los pocillos tres veces con TBS y se bloquearon durante 2 horas con 200 \mul de 1% BSA en TBS/0,02% de NaN_{3}, a temperatura ambiente. Al final del periodo de incubación, se lavaron los pocillos 3 veces con TBS y se añadieron a los pocillos una dilución de 1:1000 (en TBS/0,05% de Tween 20) del apropiado anticuerpo policlonal de la proteína anti-LBP de cobaya, y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación se lavaron los pocillos 3 veces con TBS/0,05% de Tween 20; se añadió a cada pocillo una dilución 1:30.000 de conjugado de fosfatasa alcalina IgG de anti-cobaya de cabra. Se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron 3 veces con TBS/0,05% de Tween 20 y se llevó a cabo una reacción colorimétrica por adición a los pocillos de 200 ml de sustrato de fosfato de p-nitrofenilo (Sigma; St. Louis MO). Se dejó que la reacción procediera durante 30 min a temperatura ambiente y se finalizó con 50 \mul de NaOH 3N. Se determinó la absorbancia a 405 nm utilizando un lector de placas ELISA. Se valoró la efectividad del compuesto de ensayo en bloquear la unión de la LDL a la proteína recombinante por comparación de los valores de absorbancia de los grupos tratados con el grupo
control.

De forma alternativa, las LBPs, mejor que la LDL, se unieron a la placa. Se determinó la unión de la proteína de la LBP recombinante a la LDL y el efecto de variar la concentración del inhibidor en la unión LBP-LDL mediante el uso de anticuerpos contra la LDL. Esta interacción fue visualizada a través del uso de un conjugado de un anticuerpo secundario a una enzima reportera (por ej., la fosfatasa alcalina).

Se utilizaron ensayos de placas ELISA para seleccionar agentes que pueden afectar la unión de las proteínas de la LBP a la LDL. Por ejemplo, se sintetizaron los péptidos derivados de las secuencias de proteína LBP-1 y LBP-3 humana (BHF-1 y BHF-2, respectivamente) y se ha demostrado que reducen la unión de la LDL a la LBP-1 y LBP-2 recombinante en este formato. Estos resultados estuvieron de acuerdo con los obtenidos con los ensayos de
ACE.

Ejemplo 12 Administración de Anticuerpos Humanizados Contra LBPs para Bloquear los Sitios de Unión de la LDL en las LBPs

Este ejemplo ilustra la administración a pacientes de anticuerpos humanizados contra la LBP-1, LBP-2 o LBP-3 para bloquear los sitios de unión de la LDL en las moléculas de la LBP arterial. Los anticuerpos monoclonales de ratón son humanizados por técnicas de DNA recombinante y producidas por procedimientos estándar conocidos por los expertos en la materia (I. Berkower, Curr. Opin. Biotechnol. 7: 622-628 (1996); Ramharayan y Skaletsky, Am. Biotechnol. Lab. 13: 26-28 (1995)) contra las LBPs y/o los sitios de unión de la LDL en las LBPs. También se producen los fragmentos Fab, tal como se ha descrito en J. W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, New York, NY (1986). Estos anticuerpos son administrados de forma parenteral en cantidad suficiente como para bloquear los sitios de unión de la LDL en las moléculas de LBP, es decir, 1-10 mg/kg diariamente. Esto evita la captación arterial irreversible de LDL que se requiere para facilitar la oxidación de la LDL.

Ejemplo 13 Preparación de LDL

Este ejemplo ilustra la preparación de LDL. La LDL se preparó a partir del plasma de donantes normolipémicos (Chang y col., Arterioscler. Thromb. 12: 1088-1098 (1992)). Se colocaron 100 ml de sangre completa en tubos conteniendo 100 mM de EDTA disódico. Se separó el plasma de los glóbulos rojos por centrifugación de baja velocidad (2.000 g; 30 min; 4ºC). Se ajustó la densidad del plasma a 1,025 gm/ml con una solución de KBr y se centrifugó durante 18-20 horas, 100.000 x g, 12ºC. se separaron las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) de la parte superior de los tubos de centrífuga con una pipeta Pasteur. Se aumentó la densidad de la parte inferior hasta 1,050 gm/ml con una solución de KBr y se centrifugó durante 22-24 horas, 100.000 x g, 12ºC. Se eliminó la LDL de las partes superiores de los tubos de centrífuga con la punta de una pipeta Pasteur. Se determinó la pureza de la preparación de la LDL por una doble inmunodifusión de Ouchterlony contra anticuerpos para la LDL humana, la HDL humana, las inmunoglobulinas humanas, y la albúmina humana. Se separó el KBr de la solución de LDL por diálisis (1L, x 2, \approx 16 horas) contra solución salina del 0,9%, pH 9,0, conteniendo 1mM de EDTA y 10 \muM de hidroxitolueno butilado (BHT), este último para prevenir la oxidación de la LDL. Después de la diálisis, se midió la proteína de la LDL por el método de Lowry (Lowry y col., J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)), y se almacenó la LDL a 4ºC hasta su uso. Se mantuvieron las preparaciones de LDL durante no más de 4-6 semanas.

Ejemplo 14 Preparación de la HDL

Este ejemplo ilustra la preparación de la HDL. Se preparó la HDL a partir del plasma de donantes normolipémicos. Se colocaron 100 ml de sangre completa en tubos conteniendo 100 mM de EDTA disódico y se recogió el plasma por centrifugación (2000 g; 30 min; 4ºC). A continuación se precipitó la apolipoproteína B conteniendo lipoproteínas presentes en el plasma por la adición secuencial de heparina sódica (5.000 unidades/ml) y MnCl_{2} (1M) para conseguir una concentración final de 200 unidades/ml y 0,46 M respectivamente (Warnick y Albers, J. Lipid Res. 19: 65-76 (1978)). A continuación se centrifugaron las muestras (2000 g; 1 hora; 4ºC). Se recogió el sobrenadante y se ajustó la densidad a 1,21 g/ml mediante la adición lenta de KBr sólido. Se separó la HDL por ultracentrifugación (100.000 g; > 46 horas; 12ºC). Se valoró la pureza de la preparación de HDL por medio del ensayo de inmunodifusión doble de Ouchterlony utilizando anticuerpos contra la LDL humana, la LDL humana, inmunoglobulinas humanas, y albúmina humana. Se dializaron las muestras de HDL contra solución salina pH 9,0/1 mM de EDTA/10 \muM de BHT (4L; 24 horas/4ºC) y se determinó la proteína total por el ensayo de proteína de Lowry (Lowry y col.; J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)). Se guardó la HDL a 4ºC hasta su uso. Se mantuvieron las preparaciones de HDL durante no más de 2 semanas.

Ejemplo 15 Síntesis de la BHF-1

Este ejemplo ilustra la síntesis de la BHF-1, un fragmento de la LBP-1 de conejo o humana que contiene los residuos de aminoácidos 14 a 33. Se sintetizó la BHF-1 utilizando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems Modelo 430A con ciclos de química de T-Boc NMP estándar. La secuencia de la BHF-1 es la siguiente:

val-asp-val-asp-glu-tyr-asp-glu-asn-lys-phe-val-asp-glu-glu-asp-gly-gly-asp-gly (SEC ID NO: 9)

Después de la síntesis, se rompió el péptido con ácido fluorhídrico/anisol (10/1 v/v) durante 30 min a 10ºC y a continuación se incubó durante 30 min a 0ºC. A continuación se precipitó la BHF-1 y se lavó tres veces con éter dietílico frío. Se monitorizó el acoplamiento de aminoácidos con el ensayo de ninhidrina (> 99%).

Se purificó el péptido BHF-1 hasta homogeneidad por cromatografía líquida de alta resolución en una columna Vydac C_{4} de fase reversa (2,24 X 25 cm) utilizando una separación de gradiente lineal (2-98% B en 60 min) con un flujo de 9 ml/min. El tampón A consistió en ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%/agua Milli Q y Tampón B preparado con 0,085% de TFA/80% de acetonitrilo. El gradiente se realizó a temperatura ambiente y la absorbancia se monitorizó a 210 y 277 nm.

La espectrometría de masas por bombardeo atómico rápido dio un pico del ión molecular protonado (M + H)^{+} a m/z = 2290,2, en concordancia con el valor calculado. Los valores experimentales del análisis de aminoácidos para la abundancia relativa de cada aminoácido en el péptido estuvieron de acuerdo con los valores teóricos. Se guardó el péptido liofilizado a -20ºC.

Ejemplo 16 Selección In Vitro de Agentes que Inhiben la Unión Entre la LDL y las LBPs

Este ejemplo ilustra la selección in vitro de agentes que inhiben la unión entre la LDL y LBPs.

Se selecciona un polipéptido candidato para ser un agente, por ej., LBP-1, LBP-2, LBP-3, BHF-1 o cualquier otro polipéptido. Se determinó el fragmento más corto del polipéptido que inhibe la unión de la LDL a las LBPs in vitro. Se sintetizaron los péptidos por técnicas estándar descritas en la presente invención. Se llevaron a cabo los ensayos de inhibición utilizando técnicas ELISA estándar para selección, y ensayos de coelectroforesis de afinidad (ACE) para confirmar los resultados del ELISA, tal como se describe en la presente invención. Se construyen péptidos cortos, por ej., a partir de dímeros hasta 20-meros por medio de secuencias del polipéptido candidato cuyas características químicas los hacen probables sitios de unión de la LDL, por ej., regiones ácidas. Se valoró la capacidad de longitudes más cortas de los péptidos para inhibir la unión de la LDL in vitro a las células de mamíferos en cultivos. Por ejemplo, se ensayó el efecto del péptido en la inhibición de la unión a la LDL en células de mamífero transfectadas para expresar un gen de la LBP. Se ensayó cada uno de los péptidos así identificado como un inhibidor con cada uno de las LBP-1, LBP-2 y LBP-3, para determinar si un inhibidor único funciona contra las tres LBPs.

Una vez determinada la secuencia activa mínima, se modificó el esqueleto del péptido para inhibir la proteolisis, tal como se ha discutido en la presente invención. Por ejemplo, se consiguió la modificación por sustitución de un sulfóxido del carbonilo, por reversión del enlace péptídico, por sustitución de un metileno por el grupo carbonilo, o por otra metodología estándar similar. Ver A. F. Spatola, "Peptide Backbone Modifications: A Structure-Activity Analysis of Peptides Containing Amide Bond Surrogates, Conformational Constrains, and Related Backbone Replacements", en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, págs. 267-357, B. Weinstein (ed), Marcelo Dekker, Inc., New York (1983). Se ensayó la capacidad de estos análogos para inhibir la unión de la LDL a las LBPs in vitro mediante ensayos ELISA y ACE de un modo similar al descrito anteriormente para los péptidos naturales.

Ejemplo 17 Selección In Vitro Con Células de Mamíferos Cultivadas por Agentes Que Inhiben la Unión Entre la LDL y las LBPs

Este ejemplo ilustra la selección de agentes in vitro de base celular, de agentes que han mostrado, por ensayos in vitro tales como el ensayo ACE y ELISA, que son potenciales inhibidores de la unión entre la LDL y las LBPs.

Se utilizan células de mamíferos, tales como las células 293, que son utilizadas comúnmente para la expresión de las construcciones de genes recombinantes, para desarrollar líneas celulares que expresen las LBPs en la superficie de la célula. Esto se lleva a cabo por subclonación de los marcos de lectura abiertos de la LBP (ORFs) en un vector del plásmido de expresión de mamífero, pDisplay (Invitrogen, Carlsbad, CA), que es designado para expresar el gen de interés en la superficie de la célula. El uso de células de mamífero para producir las LBPs permite su expresión en una conformación originaria, funcionalmente activa. Por consiguiente, las líneas celulares de mamífero transfectadas de forma estable, con expresión de superficie de LBPs de forma individual, o en combinación, son particularmente adecuadas para ensayar y seleccionar inhibidores que bloquean la unión de la LDL en el cultivo celular, así como para evaluar la citotoxicidad de estos compuestos.

De forma específica, las ORFs de la LBP son amplificadas por PCR (Perkin Elmer, Foster City, CA) a partir de moldes de cDNA utilizando polimerasa Taq (Perkin Elmer) y prímeros apropiados. Se purifican los ORPs de la LBP por electroforesis en gel de agarosa y se extraen de tiras de gel con el kit de purificación de DNA Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). A continuación se cortan los DNAs purificados con las enzimas de restricción Bgl II y Sal I (New England Biolabs, Beverly, MA) para generar terminaciones cohesivas, y se purifican de nuevo por electroforesis en gel de agarosa y extracción del DNA tal como se ha descrito anteriormente. A continuación se subclonaron los ORFs de la LBP en los sitios Bgl II/Sal I en el vector de expresión del mamífero, por ligamiento pDisplay (Invitrogen). Se establecieron los plásmidos recombinantes por transformación en cepas de E. coli TOP10 (Invitrogen) o DH5\alpha (Life Technologies, Grand Island, NY). Se aisló el DNA de plásmido de la LBP/pDisplay recombinante a partir de cultivos de E. coli con el kit Bio-Rad Plasmad Miniprep, se cortó con Bgl II/Sal I, y se analizó por electroforesis sobre gel de agarosa. Los ORFs de la LBP se transformaron de forma exitosa en clones tal como se verificó por secuenciación de dideoxi DNA automatizada. Para transfectar las células 293 de riñón, se mezclaron 1-2 \mug de DNA con 6 \mul del reactivo lipofectamina (Life Technologies) y se incubó con las células tal como se ha descrito en el protocolo de Life Technologies. Se confirmó la expresión de la LBP en células transfectadas por análisis de manchas Western de extractos celulares obtenidos 48 horas después de la transfección. Para seleccionar células 293 transfectadas de forma estable, se añadió el antibiótico G418 (Life Technologies) al medio de crecimiento a una concentración de 800 \mug/ml. Se ensayaron las colonias resistentes a G418 para la expresión de la LBP recombinante por manchas Western, y se expandieron las LBPs que expresan los clones recombinantes, se ensayaron para la unión a la LDL y se utilizaron para compuestos de ensayos por su capacidad para inhibir la unión de la LDL.

Ejemplo 18 Selección In Vivo de Agentes Que Inhiben la Unión Entre la LDL y las LBPs

Este ejemplo ilustra la selección in vivo de agentes que han demostrado en ensayos in vitro que son inhibidores prometedores candidatos de la unión entre la LDL y las LBPs.

Se ensaya en primer lugar la actividad inhibitoria in vivo en el modelo de daño arterial en aorta de conejo deendotelializada con un catéter globo (Roberts y col., J. Lipid Res. 24: 1160-1167 (1983); Chang y col., Arterioscler. Thomb. 12: 1088-1098 (1992)). Este modelo ha demostrado ser un excelente análogo para las lesiones arteroscleróticas humanas. Se ensayó cada inhibidor candidato en cinco a diez conejos hinchados, mientras que un número igual de conejos recibió un péptido control, o placebo. Cuatro semanas después de la deendotelialización aórtica, cuando la reendotelialización (cicatrización) es parcialmente completa, se empezó la administración parenteral diaria (intravenosa o subcutánea) o intragástrica de los péptidos y de los análogos a una concentración inicial de 10 mg/kg de peso corporal, la cual varió por encima o por debajo de 100 mg/kg dependiendo de los resultados. Después de 30 min, se administró la LDL marcada con I^{125} (o Tc^{99m}) inyectada de forma intravenosa como un bolus, para ensayar la capacidad del inhibidor candidato en estudios a corto término para inhibir el secuestro de la LDL en lesiones arteriales cicatrizantes. En los casos en que se utilizó la LDL-I^{125}, los animales se sacrificaron entre 8-24 horas más tarde, se extirparon las aortas, se lavaron y se expusieron a autoradiografía cuantitativa de aortas extirpadas, tal como se ha descrito previamente (Roberts y col., J. Lipid Res. 24: 1160-1167 (1983); Chang y col., Arterioscler. Thromb. 12: 1088-1098 (1992)). Cuando se utilizó la LDL-Tc^{99m} el análisis es por toma de imágenes por cámara gamma externa del animal vivo anestesiado a las 2-24 horas, tal como se ha descrito previamente (Lees y Lees, Síndromes of Atherosclerosis, en Fuster, ed., Futura Publishing Co., Armonk, NY, págs. 385-401 (1996)), seguido por sacrificio, escisión y toma de imágenes de la aorta escindida. Inmediatamente antes del final del ensayo, los animales se someten a ensayos de toxicidad estándar, incluyendo CBC, enzimas del hígado, y análisis de orina.

Los compuestos que son más efectivos y menos tóxicos son ensayados a continuación en estudios a corto plazo en conejos alimentados con una dieta de colesterol al 2% (Schwenke y Carew, Arteriosclerosis 9: 895-907 (1989)). Se ensayó cada inhibidor candidato en cinco a diez conejos, mientras que un número igual de conejos recibió un péptido control, o placebo. Los animales recibieron una o más dosis por día del inhibidor candidato, o del placebo, durante hasta dos semanas. La frecuencia de dosis diaria se determinó por la vía de administración. En los casos en que el fármaco activo o el placebo se administraron de forma parenteral, éstos se dieron 1-3 veces al día y se continuó con la dieta de colesterol al 2%. En los casos en los que el fármaco o el placebo se administraron de forma oral, éstos se mezclaron con la dieta de colesterol al 2%. Schwenke y Carew (Arteriosclerosis 9: 895-907 (1989)) han mostrado que la concentración de la LDL en las áreas propensas a lesiones de la aorta de conejo se incrementa hasta 22 veces por encima de lo normal en conejos alimentados con una dieta de colesterol al 2% durante 16 días, y que el contenido de LDL incrementado precede la evidencia histológica de arterosclerosis temprana. Por consiguiente, se ensayó el análisis del efecto de los inhibidores candidatos dos semanas después del inicio de la alimentación de colesterol por inyección de LDL-I^{125}, permitiendo que éstos circularan durante 8-24 horas, y a continuación realizando una autoradiografía cuantitativa en las aortas extirpadas tanto de los animales de ensayo como de los animales control. En el caso en que fuera apropiado, también se llevó a cabo la cuantificación del contenido de colesterol aórtico (Schwenke y Carew, Arteriosclerosis 9: 895-907 (1989); Schwenke y Carew, Arteriosclerosis 9: 908-918 (1989).

Los procedimientos anteriores identificaron la mayoría de los inhibidores candidatos prometedores, así como la mejor vía y frecuencia para su administración. Los inhibidores así identificados son ensayados a continuación en estudios a largo término de alimentación con colesterol. Estos tests se realizan de la misma manera que los estudios a corto término de alimentación con colesterol, excepto para la efectividad del inhibidor que es ensayada por inyección de la LDL-I^{125} a intervalos mayores después de la iniciación de la alimentación con colesterol, y las áreas propensas a lesiones de la aorta que son examinadas histológicamente para determinar la evidencia de arterosclerosis. Los tiempos de ensayo son de dos, cuatro y seis meses. Las arterias principales son extremadamente e histológicamente examinadas para determinar la evidencia y la extensión de la arterosclerosis. En los casos en que sea necesario, se ensayaron otros modelos aceptados de animales, tales como los primates susceptibles de arterosclerosis (Williams y col., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 15: 827-836 (1995) y/o los conejos Watanabe se ensayaron con alimentación con colesterol a corto y largo término.

Ejemplo 19 Inhibición In Vivo de la Acumulación de LDL Radiomarcada en la Aorta de Conejo Deendotelializada Hinchada vía la Inducción de Inmunidad Activa Contra la Proteína LBP

Este ejemplo ilustra el efecto que la inducción de inmunidad contra la proteína LBP tiene en la acumulación de la LDL radiomarcada en el modelo de arterosclerosis de aorta de conejo deendotelializada hinchada.

Se indujo inmunidad en conejos machos New Zealand White (Hazelton Research Products, Denver, PA) del modo siguiente: Se inyectó de forma subcutánea una mezcla de LBP-2 recombinante humana purificada o de péptido BHF-1 (1 ml; 1 mg) y RIBI adyuvante (RIBI InmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) en 2-5 sitios a lo largo de las regiones torácica dorsal y abdominal de los conejos. Se recogió la sangre por punción en vena en los días 1 (sangría preinmune), 35, 63 y 91. Se administraron inyecciones repetidas en los días 28 (500 \mug; SC), 56 (250 \mug; SC), y 84 (125 \mug; SC).

Se evaluó la valoración de los conejos por una serie de diluciones utilizando un formato de placas ELISA. Se evaluó el suero preinmune al mismo tiempo. Después de una tercera repetición de proteína LBP o de péptido, la valoración alcanzó un nivel máximo con una respuesta colorimétrica detectable en una placa ELISA a 156 pg. La valoración es definida como la dilución máxima del anticuerpo que genera una lectura de absorbancia de 0,5 por encima del control en 30 min. Se demostró la especificidad de los anticuerpos policlonales utilizando el análisis de manchas western tal como se ha descrito en el Ejemplo 6.

En el día 93, se deendotelializó la aorta abdominal de los conejos inmunizados y control utilizando un catéter de embolectomía Fogarty del número 4 (Chang y col., Arteriosclerosis and Thrombosis 12: 1088-1098 (1992)). Cuatro semanas después del hinchamiento, los conejos recibieron una inyección de bolus de LDL marcada con I^{125} (1 ml; i.v.). Se tomaron muestras de sangre a intervalos de 1 hora durante 8 horas, y 24 horas después de la inyección. Se centrifugaron las muestras de sangre durante 30 min a 2000 rpm (40ºC) y se determinó la actividad total presente en el suero utilizando un contador gamma. Se determinaron los valores del TCA precipitable por adición de TCA al suero hasta una concentración final del 10% seguida por incubación durante 10 min a 4ºC. A continuación se centrifugaron las muestras de suero (2000 rpm; 30 min; 40ºC) y se determinó la actividad total presente en el sobrenadante. Se calcularon los valores del TCA precipitable por sustracción de los valores del total soluble menos los valores presentes en el sobrenadante después de la precipitación del TCA. Se recogieron las muestras de sangre para la determinación de las valoraciones de anticuerpos antes de la inyección de la LDL radiomarcada.

Después de 24 horas, se inyectó a los conejos de forma intravenosa colorante azul de Evan al 5% y se dejó circular durante 15 min. Las áreas de la aorta en las que está ausente la cubierta endotelial se tiñeron de azul mientras que las áreas cubiertas por endotelio permanecieron sin teñir. Al final del periodo de incubación, los conejos fueron eutanizados y se diseccionaron la aorta abdominal y torácica, se enjuagaron, y se fijaron durante toda la noche en TCA al 10% a temperatura ambiente. Se enjuagaron las aortas de forma exhaustiva con solución salina fisiológica, se pesaron, se contabilizaron, se secaron y se colocaron en una película de rayos X con el fin de visualizar el modelo de acumulación de LDL radiomarcada en la aorta abdominal de conejo deendotelializada.

La inmunización de conejos contra la LBP-2 o el péptido BHF-1 humano recombinante alteró el modelo de la acumulación de la LDL radiomarcada en la aorta abdominal deendotelializada hinchada. Cuando se corrigió la dosis, y el porcentaje de reendotelialización, los conejos inmunizados hinchados tuvieron una menor acumulación de LDL radiomarcada en comparación con los conejos hinchados no inmunes. Estos resultados indican que la inmunización activa contra la LBP proporciona un medio efectivo por el que puede modificarse la acumulación de LDL en la pared arterial dañada.

Ejemplo 20 Selección de Agentes en Humanos Que Inhiben la Unión entre la LDL y las LBPs

Se llevaron a cabo estudios en humanos de acuerdo con los protocolos estándar de la FDA para ensayar la seguridad de nuevos fármacos (Fase I), la eficacia (Fase II), y la eficacia comparada con otros tratamientos (Fase III). Los sujetos que participaron en los estudios después de dar su consentimiento informado, tenían edades comprendidas entre los 18 y los 70 años. Se excluyeron de los estudios las mujeres que estaban embarazadas, o que era posible que estuvieran embarazadas, o los sujetos con enfermedades diferentes de la arterosclerosis primaria, tales como cáncer, enfermedades del hígado, o diabetes. Los sujetos seleccionados para el estudio en los ensayos de Fase II y Fase III tenían enfermedad de arterosclerosis previamente documentada por técnicas estándar, tales como ultrasonidos y/o angiografía, o se conocía que tenían riesgo de arterosclerosis en virtud de tener al menos un primer grado relativo con arterosclerosis documentada. Los sujetos en sí mismos tenían lípidos en plasma normales o anormales. El ensayo inicial incluyó 20-50 sujetos con el fármaco activo y 20-50 sujetos, seleccionados por edad, sexo, y situación de arterosclerosis, con placebo. El número de sujetos es predeterminado por el número necesario para tener significación estadística. Los puntos finales de la eficacia inhibitoria incluyen medidas de ultrasonidos del espesor de la arteria carótida en sujetos con riesgo alto, así como en sujetos con enfermedad de carótida o coronaria conocida; sucesos arteroscleróticos; muertes arteroscleróticas; y todas las causas de muerte en todos los sujetos. Se llevó a cabo el análisis no invasivo (espesor de la arteria carótida por ultrasonidos) por Stadler (Med. And Biol. 22: 25-34 (1996)) a intervalos de 6- a 12-meses durante 3 años. Se tabularon los sucesos y muertes arteroscleróticas, así como todas las causas de muerte a los 3 años.

La dosis oral de fármaco para los ensayos de Fase I de la FDA osciló entre 0,01 y 10 gm/día, y se determinó por los resultados de los estudios en animales, extrapolados en una base por kg. En base a los datos obtenidos de los estudios en fase I, se estrechó el intervalo de dosis y la frecuencia en los ensayos en fase II y III. En los casos en que se determinó que la administración parenteral de fármaco por estudios en animales como el único método efectivo, se ensayó la administración parenteral por inyección en sujetos humanos, así como por las vías transdérmicas y de insuflación nasal. El ensayo para los fármacos parenterales siguió el mismo modelo que el seguido para la administración oral.

De este modo se estableció el régimen de tratamiento y de dosificación óptimo para humanos.

Ejemplo 21 Tratamiento de un Individuo con Arterosclerosis con BHF-1

Este ejemplo ilustra un método de tratamiento de un individuo que tiene arterosclerosis con un fragmento de la LBP, por ej., BHF-1, de modo que disminuyan los niveles de LDL unida de forma arterial en el individuo. Se obtuvo el BHF-1 tal como se ha descrito en la presente invención. Se administró el BHF-1 al mamífero de forma intravenosa como un bolus o como una inyección a una concentración de 0,5-10 mg/kg de peso corporal. Dichas administraciones se repitieron indefinidamente con el fin de prevenir el desarrollo o la progresión de la arterosclerosis sintomática, tal como se hace actualmente con los fármacos que disminuyen el colesterol. Se examinaron sujetos estables dos veces al año para evaluar la extensión de cualquier enfermedad arterosclerótica por examen físico y estudios no invasivos, tales como espesor de la arteria carótida, ultrasonidos, y/o imágenes de cámara gamma de las arterias mayores, para determinar si están presentes lesiones arteroscleróticas, y, en el caso en que estuvieran previamente presente, determinar si han progresado o disminuido. Dicho régimen da lugar al tratamiento de la arterosclerosis.

Los expertos en la materia serán capaces de encontrar muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descrita en el presente documento sin necesidad de utilizar más experimentación de rutina. Se pretende que todos estos otros equivalentes estén incluidos por las siguientes reivindicaciones.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Ann M. Lees

\hskip3.88cm

Robert S. Lees

\hskip3.88cm

Simon W. Law

\hskip3.88cm

Anibal A. Arjona

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVAS PROTEÍNAS DE UNIÓN A LIPOPROTEÍNAS DE BAJA DENSIDAD Y SU USO EN DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE LA ARTEROESCLEROSIS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 42

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Banner & Witcoff, Ltd.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: One Financial Center

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Boston

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Estado. MA

\vskip0.500000\baselineskip

(E): País: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F): ZIP: 02111

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO MEDIO: Floppy disk

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: compatible con PC de IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión # 1.30 y WordPerfect 6.1

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: No disponible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 26 de Noviembre de 1997

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN: No disponible

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): INFORMACIÓN DEL AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Helen Greer

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 36.816

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/SUMARIO: 3983/59819

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 617-345-9100

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 617-345-9111

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 151 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:

1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 317 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 232 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 252 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 557 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:

8

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 151 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 217 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 530 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Asp Val Asp Glu Tyr Asp Glu Asn Lys Phe Val Asp Glu Glu Asp}

\sac{Gly Gly Asp Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1404 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1617 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1362 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1422 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13:

24

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4722 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14:

27

28

29

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1928 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15:

32

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1207 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16:

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4697 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17:

36

37

38

39

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 60 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18:

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Glu Asp Glu Asp Glu Glu Asp Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Glu Asp Glu Asp Glu Glu Asp Asp Val}

\sac{Ser Glu Gly Ser Glu Val Pro Glu Ser Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Ser Glu Gly Ser Glu Val Pro Glu Ser Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Asp Asp Asp Pro Asp Gly Phe Leu Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Asp Val Asp Glu Tyr Asp Glu Asn Lys Phe Val Asp Glu Glu Asp}

\sac{Gly Gly Asp Gly Gln Ala Gly Pro Asp Glu Gly Glu Val Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Glu Gly Glu Val Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp}

\sac{Val Val Ser Glu Gly Ser Glu Val Pro Glu Ser Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Val Ser Glu Gly Ser Glu Val Pro Glu Ser Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.500000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Pro Gly Lys Pro Ala Leu Pro Glu Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Asp Gly Val Gln Gly Glu Pro Pro Glu Pro Glu Asp Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 30:

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 78 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 31:

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 32:

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 33:

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 90 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 34:

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 35:

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 36:

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 84 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 37:

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 38:

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 39:

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 40:

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Asp Val Ser Glu Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 42:

53

Claims

1. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada dentro del grupo constituido por:

una secuencia de aminoácidos que se une a una lipoproteína de baja densidad (LDL) y que es al menos idéntica en un 80% a la secuencia de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, o SEC ID NO: 8;

una secuencia de aminoácidos que se une a una LDL y que comprende la secuencia de SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, o SEC ID NO: 29;

una secuencia de aminoácidos que se une a une LDL y que es idéntica a un fragmento de al menos 20 residuos de aminoácidos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, o SEC ID NO: 8; y

una secuencia de aminoácidos que se une a una LDL, en la que la secuencia de nucleótidos se hibrida de forma específica a SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, o SEC ID NO: 17.

2. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos idéntica en un 90% a la secuencia de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 6.

3. El Polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos idéntica en un 95% a la secuencia de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 6.

4. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos idéntica en un 90% a la secuencia de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 7.

5. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos idéntica en un 95% a la secuencia de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 7.

6. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos idéntica en un 90% a la secuencia de SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 8.

7. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos idéntica en un 95% a la secuencia de SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 8.

8. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de SEC ID NO: 1.

9. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de SEC ID NO: 6.

10. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el polipéptido consiste en la secuencia de SEC ID NO: 1.

11. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el polipéptido consiste en la secuencia de SEC ID NO: 6.

12. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de SEC ID NO: 2.

13. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de SEC ID NO: 7.

14. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de SEC ID NO: 5.

15. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de SEC ID NO: 8.

16. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el polipéptido consiste en la secuencia de SEC ID NO: 5.

17. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, o SEC ID NO: 29.

18. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos es idéntica a un fragmento de al menos 30 residuos de aminoácidos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, o SEC ID NO: 8.

19. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos es idéntica a un fragmento de al menos 100 residuos de aminoácidos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, o SEC ID NO: 8.

20. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos es al menos idéntica en un 80% a la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, o SEC ID NO: 17.

21. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos es al menos idéntica en un 95% a la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, o SEC ID NO: 17.

22. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos comprende SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, o SEC ID NO: 17.

23. Un vector recombinante que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

24. Una célula que comprende el vector recombinante según la reivindicación 23.

25. Un método de producción de un polipéptido, que comprende el cultivo de una célula según la reivindicación 24 en condiciones que permitan una expresión del polipéptido.

26. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada dentro del grupo constituido por:

una secuencia de aminoácidos que se une a una LDL y que es al menos idéntica en un 80% a la secuencia de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, o SEC ID NO: 8;

una secuencia de aminoácidos que se une a una LDL y comprende la secuencia de SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, o SEC ID NO: 29; y

una secuencia de aminoácidos que se une a una LDL y que es idéntica a un fragmento de al menos 20 residuos de aminoácidos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, o SEC ID NO: 8.

27. El polipéptido según la reivindicación 26, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos idéntica en un 90% a la secuencia de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 6.

28. El polipéptido según la reivindicación 26, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos idéntica en un 95% a la secuencia de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 6.

29. El polipéptido según la reivindicación 26, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos idéntica en un 90% a la secuencia de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 7.

30. El polipéptido según la reivindicación 26, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos idéntica en un 95% a la secuencia de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 7.

31. El polipéptido según la reivindicación 26, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos idéntica en un 90% a la secuencia de SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 8.

32. El polipéptido según la reivindicación 26, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos idéntica en un 95% a la secuencia de SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 8.

33. El polipéptido según la reivindicación 26, en el que la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de SEC ID NO: 1.

34. El polipéptido según la reivindicación 26, en el que la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de SEC ID NO: 6.

35. El polipéptido según la reivindicación 26, en el que el polipéptido consiste en la secuencia de SEC ID NO: 1.

36. El polipéptido según la reivindicación 26, en el que el polipéptido consiste en la secuencia de SEC ID NO: 6.

37. El polipéptido según la reivindicación 26, en el que la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de SEC ID NO: 2.

38. El polipéptido según la reivindicación 26, en el que la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de SEC ID NO: 7.

39. El polipéptido según la reivindicación 26, en el que la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de SEC ID NO: 5.

40. El polipéptido según la reivindicación 26, en el que la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de SEC ID NO: 8.

41.El polipéptido según la reivindicación 26, en el que el polipéptido consiste en la secuencia de SEC ID NO: 5.

42. El polipéptido según la reivindicación 26, en el que la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, o SEC ID NO: 29.

43. El polipéptido según la reivindicación 26, en el que la secuencia de aminoácidos es idéntica a un fragmento de al menos 30 residuos de aminoácidos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, o SEC ID NO: 8.

44. El polipéptido según la reivindicación 26, en el que la secuencia de aminoácidos es idéntica a un fragmento de al menos 100 residuos de aminoácidos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, o SEC ID NO: 8.

45. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une de forma específica a un polipéptido consistente en la secuencia de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, o SEC ID NO: 8.

46. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 45, que comprende un fragmento de un anticuerpo seleccionado dentro del grupo constituido por un fragmento Fab, un fragmento Fab' y un fragmento F(ab')_{2}.

47. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 45, que comprende un fragmento de anticuerpo seleccionado dentro del grupo constituido por un fragmento F(v), un monómero de cadena pesada, un dímero de cadena pesada, un trímero de cadena pesada, un monómero de cadena ligera, un dímero de cadena ligera, un trímero de cadena ligera y un dímero consistente en una cadena pesada y en una cadena ligera.

48. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 45, que comprende un anticuerpo que es un anticuerpo monoclonal.

49. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 45, en el que el anticuerpo o el fragmento del mismo es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo.

50. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 45, en el que el anticuerpo o el fragmento del mismo es un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo.

51. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 50, en el que el anticuerpo quimérico o el fragmento del mismo contiene una región constante derivada de un anticuerpo humano y una región variable derivada de un anticuerpo de ratón.

52. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 45, en el que el anticuerpo o el fragmento del mismo es un anticuerpo humano o un anticuerpo o un fragmento del mismo.

53. El anticuerpo o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 45 a 52, en el que el anticuerpo o el fragmento del mismo bloquea la unión de la LDL al polipéptido.

54. El anticuerpo o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 45 a 53, en el que el anticuerpo o el fragmento del mismo comprende un marcador.

55. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 54, en el que el marcador es un marcador radioactivo.

56. El anticuerpo o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 45 a 53, en el que el anticuerpo o el fragmento del mismo comprende un ligando que se une al tecnecio.

57. El anticuerpo o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 45 a 53, en el que el anticuerpo o el fragmento del mismo comprende un quelador que se une al gadolinio.

58. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 57, en el que el quelador que se une al gadolinio es el ácido dietilen triamino penta-acético (DTPA).

59. Una preparación de un anticuerpo policlonal que se une de forma específica a un polipéptido constituido por las secuencias de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, o SEC ID NO: 8.

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60. La preparación según la reivindicación 59, en la que los anticuerpos bloquean una unión de la LDL al polipéptido.

61. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o el fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 45 a 58 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

62. Una línea celular que produce el anticuerpo según la reivindicación 61.

63. La línea celular según la reivindicación 62, en la que la línea celular es un hibridoma.

64. Un método para identificar un agente candidato que modula el metabolismo o la estructura de la LBP-1, LBP-2, o LBP-3, cuyo procedimiento comprende:

la puesta en contacto in vitro de un agente candidato y de un polipéptido LBP-1, LBP-2, o LBP-3; y

la evaluación del efecto del agente candidato sobre el metabolismo o la estructura de LBP-1, LBP-2, o LBP-3.

65. El método según la reivindicación 64, en el que el procedimiento comprende:

la puesta en contacto in vitro de un polipéptido LBP-1, LBP-2, o LBP-3, de una molécula que se une a LBP-1, LBP-2, o LBP-3 y de un agente candidato; y

la medición de la formación de un complejo que contiene el polipéptido LBP-1, LBP-2, o LBP-3, y la molécula que se une a LBP-1, LBP-2, o LBP-3, en la que una reducción en la formación del complejo en presencia del agente candidato en comparación con la que se produce en ausencia del agente candidato indica que el agente candidato inhibe la unión de LBP-1, LBP-2, o LBP-3 a la molécula que se une a LBP-1, LBP-2, o LBP-3.

66. El método según la reivindicación 64, en el que el procedimiento comprende:

la medición de la unión del agente candidato al polipéptido LBP-1, LBP-2, o LBP-3, para identificar de este modo un agente candidato que se une a un polipéptido LBP-1, LBP-2, o LBP-3.

67. El método según cualquiera de las reivindicaciones 64 a 66, en el que el polipéptido LBP-1, LBP-2, o LBP-3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada dentro del grupo constituido por:

una secuencia de aminoácidos que se une a una LDL y que comprende la secuencia de SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, o SEC ID NO: 29; y

una secuencia de aminoácidos que se une a una LDL y es idéntica a un fragmento de al menos 20 residuos de aminoácidos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, o SEC ID NO: 8.

68. El método según la reivindicación 67, en el que el polipéptido LBP-1, LBP-2, o LBP-3 comprende una secuencia de aminoácidos que se une a una LDL y es al menos idéntica en un 80% a la secuencia de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, o SEC ID NO: 8.

69. El método según la reivindicación 68, en el que el polipéptido LBP-1, LBP-2, o LBP-3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, o SEC ID NO: 8.

70. El método según cualquiera de las reivindicaciones 64 a 69, en el que el agente candidato es un fragmento, un análogo o un mimético de LBP-1, LBP-2, o LBP-3.

71. El método según cualquiera de las reivindicaciones 64 a 69, en el que el agente candidato es un ácido nucleico, un anticuerpo, un metabolito, un glúcido, una glicoproteína, un péptido, o una molécula mimética no peptídico.

72. El método según la reivindicación 65, en el que la molécula que se une a LBP-1, LBP-2, o LBP-3 es una LDL.

73. El método según la reivindicación 72, en el que la LDL es una LDL originaria.

74. El método según la reivindicación 72, en el que la LDL es una LDL modificada.

75. El método según la reivindicación 74, en el que la LDL modificada es una LDL metilada o oxidada.

76. El método según la reivindicación 65, en el que la molécula que se une a LBP-1, LBP-2, o LBP-3 es un compuesto de la matriz extracelular arterial.

77. El método según la reivindicación 76, en el que el componente de la matriz extracelular arterial es un proteoglicano.

78. El método según la reivindicación 64, en el que el procedimiento comprende la evaluación del efecto del agente candidato sobre la estructura primaria, secundaria o terciaria de LBP-1, LBP-2, o LBP-3.

79. El método según la reivindicación 64, en el que el procedimiento comprende la evaluación del efecto del agente candidato sobre el repliegue conformacional de LBP-1, LBP-2, o LBP-3.

80. El método según la reivindicación 64, en el que el procedimiento comprende la evaluación del efecto del agente candidato sobre la expresión de LBP-1, LBP-2, o LBP-3.

81. El método según la reivindicación 64, en el que el procedimiento comprende la evaluación del efecto del agente candidato sobre la liberación de LBP-1, LBP-2, o LBP-3.

82. El método según la reivindicación 64, en el que el procedimiento comprende la evaluación del efecto del agente candidato sobre la distribución de LBP-1, LBP-2, o LBP-3.

83. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 44, para un uso en un tratamiento de la arterosclerosis en un sujeto.

84. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 44, para un uso en un diagnóstico de la arteriosclerosis en un sujeto.

85. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 44, para un uso para inmunizar un sujeto contra un polipéptido LBP-1, LBP-2, o LBP-3.

86. Uso del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 44 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la arterosclerosis.

87. Uso del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 44 para la fabricación de un medicamento para el diagnóstico de la arterosclerosis.

88. Uso del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 44 para la fabricación de un medicamento para una utilización para inmunizar un sujeto contra un polipéptido LBP-1, LBP-2, o LBP-3.

89. El anticuerpo o fragmento del mismo o preparación de un anticuerpo policlonal según cualquiera de las reivindicaciones 45 a 60 para un uso en el tratamiento de la arterosclerosis en un sujeto.

90. El anticuerpo o fragmento del mismo o preparación de un anticuerpo policlonal según cualquiera de las reivindicaciones 45 a 60 para un uso en el diagnóstico de la arterosclerosis en un sujeto.

91. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 90, en el que el diagnóstico comprende:

la determinación de la localización o de la cuantificación de la LBP-1, LBP-2, o LBP-3 marcada interactuando con el anticuerpo o el fragmento del mismo administrado por toma de imágenes de modo para detectar la presencia de una lesión de arterosclerosis en el sujeto.

92. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 91, en el que la imagen está seleccionada dentro del grupo constituido por la imagen obtenida por resonancia magnética, la imagen obtenida por cámara gamma, la imagen obtenida por tomografía de emisión monofotónica por ordenador, y la tomografía por emisión de positrones.

93. Uso del anticuerpo o del fragmento del mismo o de la preparación del anticuerpo policlonal según cualquiera de las reivindicaciones 45 a 60 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la arterosclerosis.

94. Uso del anticuerpo o del fragmento del mismo o de la preparación del anticuerpo policlonal según cualquiera de las reivindicaciones 45 a 60 para la fabricación de un medicamento para el diagnóstico de la arterosclerosis.

95. Una molécula antisentido que se hibrida en las condiciones celulares al ácido nucleico de SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, o SEC ID NO: 17 de un modo que inhibe la expresión del polipéptido LBP-1, LBP-2, o LBP-3 codificado por el ácido nucleico.

96. La molécula antisentido según la reivindicación 95 para un uso en el tratamiento de la arterosclerosis en un sujeto.

97. Uso de la molécula antisentido según la reivindicación 95 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la arterosclerosis.