KR20020012279A - 인간 유전자 에이비씨1에 상응하는 핵산 및 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아테롬성동맥경화증과 같은 질환, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤 역수송의 교란 및 좀더 구체적으로는 탠지어병과 같은 FHD를 일으키는 콜레스테롤 대사 기능장애와 연관된 병리를 일으키는 유전자인 것으로 보이는 ABC1 유전자의 상이한 엑손 및 인트론에 상응하는 핵산에 관한 것이다.

Description

인간 유전자 에이비씨1에 상응하는 핵산 및 단백질{NUCLEIC AND PROTEINIC ACIDS CORRESPONDING TO HUMAN GENE ABC1}

고밀도 지방단백질 (HDL)은 혈장에서 순환하는 지방단백질의 4종의 주요 부류중의 하나이다.

이들 지방단백질은 지질 수송, 담즙산의 형성, 스테로이드화, 세포 증식과 같은 다양한 대사 경로에 관여하며, 더 나아가 혈장 단백질분해효소 시스템을 방해한다.

HDL은 완벽한 유리 콜레스테롤 수용체이며, 콜레스테롤 에스테르 운반 단백질 (CETP), 지방단백질 리파아제 (LPL), 간 리파아제 (HL) 및 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제 (LCAT)와 병행하여 콜레스테롤의 역수송, 다시 말해, 담즙산 형태로 체내로부터 콜레스테롤을 제거하기 위해 말초 세포에 있는 과량의 콜레스테롤을 간으로 수송하는 데 주요한 역할을 한다.

HDL은 말초 조직으로부터 간으로 콜레스테롤을 수송함에 있어 중추 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다.

HDL 결핍과 관련된 다양한 질환이 보고되어 왔는데, 이는 탠지어병, HDL 결핍 및 LCAT 결핍을 포함한다.

탠지어병에 수반된 결핍은 HDL의 분해를 야기하는 세포상 콜레스테롤의 전좌(translocation)에 있어서의 세포상 결함과 관련되어 있다. 그럼에도 불구하고, 탠지어병의 경우, 결함의 정확한 특성은 아직까지 확실하게 규명되어 있지 않다.

탠지어병에서, 세포상 결함은 지방단백질 대사의 붕괴를 초래한다. 콜레스테롤을 말초 세포로부터 혼입하지 않고 정확하게 대사될 수 없는 HDL 입자는 체내로부터 신속하게 제거된다. 따라서, 이들 환자에서 혈장 HDL 농도는 급격히 감소되며, HDL은 더 이상 콜레스테롤의 간으로의 복귀를 보장하지 않는다. 이 콜레스테롤은 이들 말초 세포에서 축적되고 오렌지색 편도선의 형성과 같은 특징적인 임상적 징후를 야기한다. 더군다나, 트리글리세라이드의 과생산 및 인지질의 증가된 합성 및 세포내 이화작용과 같은 다른 지방단백질 파괴도 또한 관찰된다.

증후군이 상기 기재된 바와 같은 탠지어병은 관상동맥 질환에 걸린 환자에서 가장 잘 검출되는 것인 HDL의 대사작용과 연관된 가족성 질환으로 분류된다.

수많은 연구는 HDL 콜레스테롤의 감소된 수준이 관상동맥 질환을 감지할 수 있게 하는 탁월한 위험 인자임을 나타낸다.

이러한 맥락에서, HDL 결핍과 연관된 증후군에 대한 관심이 지난 십년간 증가하였는데, 그 이유는 아테로제네시스(atherogenesis)에서 HDL의 역할에 대한 이해를 증가시키는 것을 가능케하기 때문이다.

apo A-I 유전자에서의 여러 개의 돌연변이가 규명되었다. 이들 돌연변이는 드물고 apo A-I의 생산 결핍을 초래할 수 있다.

지방단백질 리파아제 (LPL) 또는 이의 활성제 apo C-II를 암호화하는 유전자에서의 돌연변이는 중증의 고트리글리세라이드혈증 및 상당히 감소된 HDL-c 수준과 관련된다.

레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제 (LCAT) 효소를 암호화하는 유전자에서의 돌연변이는 심각한 HDL 결핍과 관련된다.

더군다나, 콜레스테롤의 역수송에서의 기능장애는 저장된 콜레스테롤을 세포내 비히클로부터 HDL에 의해 이를 수용시키는 막 표면으로의 수송에서 하나 이상의단계에 영향을 미치는 생리학적 결핍에 의해 유도될 수 있다.

따라서, 콜레스테롤 및/또는 지방단백질의 대사작용 중 임의 단계에 수반되는 유전자, 및 특히 말초 세포로부터 간으로 콜레스테롤을 역수송하는데 있어서의 기능장애와 관련된 특정 유전자를 확인할 최신기술의 필요가 증가하고 있다.

최근에, 전체 게놈에 걸쳐서 분포되어 있고 평균적으로 10.3 cM 서로 떨어진 343개의 초부수체 마커의 상이한 대립유전자 형태를 분리하는 연구가 수행되었다.

11세대에 걸쳐서 잘 규명된 한 가족에 대해 연관(linkage) 연구가 행해졌는데, 여기에서 많은 구성원이 탠지어병에 걸렸으며 가족은 다섯의 혈족계를 포함하였다.

이 연구는 통계적으로 증후군과 관련된 인간 9번 염색체의 9q31 좌위에 위치한 영역을 확인하는 것을 가능케하였다(Rust S. et al., Nature Genetics, vol. 20, September 1998, pages 96-98).

그러나, RUST 등의 연구는 단지 손상이 탠지어병과 관련됨직한 게놈의 광범위한 영역을 규명하는데 그쳤다. 이는 관련된 9q31-34 영역이 EST를 함유한다고 단순히 규명했을 뿐, 아무런 유전자도 밝히지 못하였다.

본 발명은 ABC1 유전자의 다양한 엑손과 인트론에 상응하는 핵산에 관한 것으로, 상기 ABC1 유전자에 대해 현재 이 유전자는 아테롬성동맥경화증과 같은 질환을 포함하는 콜레스테롤 대사 기능장애, 보다 특히 콜레스테롤 역수송의 붕괴, 및 보다 특히 탠지어(Tangier)병과 같은 가족성 HDL 결핍(FHD)과 관련된 병리학적 증상에 대한 원인 유전자로서 알려져 있다. 본 발명은 또한 일반적인 다형성의 검출을 위한 수단, 및 특히, ABC1 유전자의 대립유전자(allelic) 형태에 의해 생산된 상응하는 단백질 또는 ABC1 유전자에서 돌연변이의 검출을 위한 수단에 관한 것이다. 본 발명은 또한 ABC1 유전자의 암호화 영역을 함유하는 핵산을 포함하는 약학 조성물 및 탠지어병과 같은 콜레스테롤 역수송에서의 결핍과 연관된 질환의 치료를 위한 ABC1 단백질을 함유하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 콜레스테롤 역수송에 작용하는 산물을 그 자체로 구성할 수 있는 ABC1 단백질에 작용하는 작은 분자를 스크리닝하는 방법을 제공하는데, 이는 치료적 관점에서 아테롬성동맥경화증에 효과적으로 싸울 수 있게 한다.

도 1은 ABC1 유전자의 엑손 중으로 Alu 서열을 삽입함에 의한 돌연변이의 분리를 설명한다. ABC1 유전자의 엑손 12에서의 삽입-결실은 도 1a에 나타낸 바와 같이 14 뉴클레오타이드의 결실 및 110 뉴클레오타이드의 삽입을 구성한다. 도 1b는 엑손 12의 PCR 증폭 후 환자 각각에 대해 수득된 Nu 계통 및 DNA 단편의 크기를 나타낸다. 레인 M은 이동성 마커(Gibco BRL)에 상응한다. 레인 C는 대조 DNA에 상응한다.

도 2는 ABC1 유전자의 엑손 13에서의 단일 뉴클레오타이드 결실에 의한 돌연변이를 나타낸다. 상보 본쇄의 서열이 수득되며 3′→5′로 나타낸다. ABC1 폴리펩타이드의 아미노산 546 내지 552를 암호화하는 서열은 각각 동형접합성(도 2a), 이형접합성(도 2b) 및 병에 걸리지 않은 (도 2c) 개체에 대해 연구된 가족의 상이한 환자에 대해 나타낸다. 도 2a의 서열은 3명의 동형접합성 개체에서 발견되고, 도 2b의 서열은 5명의 이형접합성 개체에서 발견되며 도 2c의 서열은 4명의 병에 걸리지 않은 개체에서 발견된다.

본 발명에 따라 인간에서 9q31 좌위에 위치한 약 1 cM의 영역이 가족성 HDL 결핍과 통상 관련되어 있음이 밝혀지게 되었다.

보다 자세히, 9q31 좌위의 1 cM 영역에 정확하게 위치하는 ABC 트랜스포터의 계열의 단백질을 암호화하는 유전자가 콜레스테롤의 역수송에서의 결핍과 연관된병리에 관련되어 있음이 밝혀졌다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따라, 콜레스테롤 역수송이 손상된 환자, 및 가장 구체적으로 탠지어병을 앓고 있는 환자에게서 ABC-1 트랜스포터를 암호화하는 유전자가 돌연변이되어 있음이 밝혀졌다.

ABC("ATP-결합 카세트") 수송 단백질은 박테리아에서부터 인간에 이르기까지 진화과정 동안 극도로 잘 보존되어온 계열의 단백질을 구성한다.

ABC 수송 단백질은 예를 들면, 이온, 아미노산, 펩타이드, 당, 비타민 또는 스테로이드 호르몬과 같은 다양한 기질의 막수송에 관련되어 있다.

일부 ABC 트랜스포터의 완전한 아미노산 서열의 특징규명은 이들 단백질이 공통의 일반 구조, 특히 워커(Walker) A 및 B형 단위와 각각이 여섯개의 나선으로 이루어진 두 개의 막횡단 도메인을 가진 두 개의 뉴클레오타이드 결합 폴드 (NBF) 를 가졌음을 결정하는 것을 가능케 하였다. 다양한 수송된 분자에 대한 ABC 트랜스포터의 특이성은 막횡단 도메인의 구조에 의해 결정되는 것으로 보임에 반해, 수송 활성에 필요한 에너지는 NBF 폴드의 수준에서 ATP의 분해에 의해 제공된다.

인간에게서 규명된 여러개의 ABC 수송 단백질은 다양한 질환과 연관되어 있다.

예를 들면, 낭포성 섬유증은 CFTR(낭포성 섬유증 막횡단 전도성 조절자) 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된다.

더군다나, 종양 세포에서 몇몇 다중 내약성 표현형은 MDR (다중-내약성) 단백질을 암호화하는 유전자에서의 돌연변이와 연관되어 있는데, 상기 단백질도 ABC트랜스포터 구조를 갖는다.

ABC-3 단백질과 같은 다른 ABC 트랜스포터도 신경 내지 종양 증후군과 연관되어 있거나(미국 특허 제 5,858,719 호) 금속의 생체항상성의 손상에 의해 야기되는 질환과 잠재적으로 관련되어 있다.

마찬가지로, PFIC2로 명명된 또다른 수송 ABC는 진행성인 가족성 간내 담즙분비정지 형태에 관련된 것으로 보이는데, 이 단백질은 인간에서 담즙산 염의 배출수송을 잠재적으로 담당한다.

1994년에 새로운 마우스 ABC 트랜스포터를 암호화하는 cDNA가 확인되어 ABC1으로 명명되었다(Luciani et al., 1994). 이 단백질은 고도의 소수성 단편에 연결된 두 개의 막횡단 도메인과 두 개의 NBF 단위를 포함하는 대칭적인 구조를 가진다는 점에서 ABC 트랜스포터의 특징을 가진다.

인간에서, 인간 ABC1 트랜스포터의 전체 개방 판독 프레임을 포함하는 부분 cDNA가 규명되었다(Langmann et al., 1999).

또한, 인간 ABC1 단백질을 암호화하는 유전자가 다양한 조직에서 발현되고, 보다 특히 태반, 간, 폐, 부신 및 태아의 조직에서 높은 수준으로 발현되는 것으로 밝혀졌다.

이들 저자는 또한 인간 ABC1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 시험관내에서 단핵구의 대식세포로의 분화과정 동안에 유도되었다고 밝히고 있다. 더군다나, ABC1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현은 인간 대식세포가 아세틸화된 저밀도 지방단백질(AcLDL)의 존재하에서 배양될 때 증가되었다.

그러나, 지질 수송 시스템에서 인간 ABC1 단백질의 정확한 역할이 완전하게 알려져 있지는 않다. 단지 ABC1 단백질이 인지질에 대한 트랜스로카제 활성을 갖는 것으로 추측될 뿐이다.

본 발명에 이르러, 탠지어병을 앓고 있는 환자가 돌연변이된 ABC1 유전자를 가졌다는 것이 밝혀졌다. ABC1 유전자의 상이한 엑손에 분포된 여러 돌연변이가 다양한 환자, 특히 관상동맥 장애와 관련된 중증 형태의 질환을 앓고 있는 환자의 게놈에서 확인되었다. 더군다나, 다양한 다형성이 온화한 형태의 질환을 앓고 있는 환자의 ABC1 유전자의 엑손과 인트론 모두에서 발견되었는데, 이는 이들 환자가 "야생형" 대립유전자와 구별되는 특정 유전자 대립유전자를 지님을 나타낸다. 이들 다형성에 의해 부분적으로 특징규명될 수 있는 그러한 대립유전자는 각각 유전자의 첫번째 엑손의 5' 측상이거나 대안적으로 마지막 엑손의 3' 측상, 특히, ABC1 폴리펩타이드의 합성에서 증가 또는 감소로서 결함을 유도하는 유형의 조절 영역, 예를 들면, 프로모터 서열에 또는 인핸서 서열에 위치한 비-암호화 영역에서 뉴클레오타이드의 치환, 첨가 또는 결실을 또한 아마도 함유할 것이다.

따라서, 첫번째 특정 돌연변이는 탠지어병을 앓고 있는 환자에서 ABC-1 유전자에서 확인되었는데, 이는 13번 엑손에 위치하고 개방 판독 프레임 내로 해독의 조기 종결 코돈을 도입하는 것을 야기하는 뉴클레오타이드의 치환으로 구성되며, 탠지어병에 걸리지 않은 환자에서 합성되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 약 1/4을 포함하는 절두된 폴리펩타이드의 합성을 야기한다.

ABC1 유전자에서의 두번째 특정 돌연변이가 발견되었는데, 이는 12번 엑손으로의 100개의 뉴클레오타이드 단편의 삽입으로 구성되며, 단백질 서열의 468번 위치에서 38개의 아미노산을 삽입하고 6개 잔기의 결실을 함유한다는 점에서 비정상적인 폴리펩타이드의 합성을 야기한다.

덧붙여, ABC1 유전자가 아세틸화된 저밀도 지방단백질(AcLDL)에 의해 양(+)적으로 조절되었다는 것도 확인되었다.

일반적인 정의

본 발명의 목적상 "분리된"이란 용어는 본래의 환경(자연적으로 존재하는 환경)으로부터 제거되어진 생물학적 물질(핵산 또는 단백질)을 지칭한다.

예를 들면, 식물 또는 동물 내에 자연상태로 존재하는 폴리뉴클레오타이드는 분리되어 있지 않다. 식물 또는 동물의 게놈에 자연적으로 삽입되어 인접 핵산으로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드는 "분리된"으로 간주된다.

그러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터에 포함될 수도 있거나 그러한 폴리뉴클레오타이드는 조성물에 포함될 수도 있으나, 그럼에도 불구하고 벡터나 조성물이 자연 환경을 구성하지 않는다는 사실 때문에 분리된 상태로 남아있다.

"정제된"이란 용어는 다른 성분의 존재를 배제하여 전적으로 순수함을 보이는 형태로 물질이 존재할 것을 요하지는 않는다. 이것은 오히려 상대적 정의이다.

폴리뉴클레오타이드는 적어도 1, 바람직하게는 2 또는 3 및 바람직하게는 4 또는 5회의 크기 순서에 의해 출발 물질 또는 자연 물질의 정제 후에 "정제된" 상태로 있다.

본 발명의 목적상, "뉴클레오타이드 서열"이란 표현은 폴리뉴클레오타이드또는 핵산을 지칭하는 데 사용될 수 있다. "뉴클레오타이드 서열"이란 표현은 유전 물질 자체를 일컬으므로, 이의 서열에 관한 정보에 국한되지 않는다.

"핵산", "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드 서열"이란 용어는 RNA, DNA 또는 cDNA 서열, 또는 대안적으로 한 종류의 뉴클레오타이드가 아닌 RNA/DNA 하이브리드 서열을 일컬으며, 단일쇄 형태이거나 이중나선 형태일 수 있다.

"뉴클레오타이드"란 용어는 천연 뉴클레오타이드 (A, T, G, C) 뿐만 아니라, (1) 퓨린의 유사체, (2) 피리미딘의 유사체, 또는 (3) 유사 당과 같은 적어도 하나의 변형을 포함하는 변형된 뉴클레오타이드도 지칭하며, 상기 변형된 뉴클레오타이드의 실례는, 예를 들면, PCT 출원번호 제 WO95/04 064 호에 기술되어 있다.

본 발명의 목적상, 첫번째 폴리뉴클레오타이드는, 첫번째 뉴클레오타이드의 각 염기가 반대의 배향을 가진 두번째 폴리뉴클레오타이드의 상보적 염기와 쌍을 이룰 때, 두번째 폴리뉴클레오타이드에 "상보적"이라고 간주된다. 상보적 염기는 A 및 T (또는 A 및 U), 또는 C 및 G 이다.

본 발명에 따른 핵산의 "변이체" 기준(reference) 폴리뉴클레오타이드에 대하여 하나 이상의 염기가 다른 핵산을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 변이체 핵산은 자연적으로 존재하는 대립유전자 변이체와 같이 자연산일 수도 있거나, 예를 들면 돌연변이 기술에 의해 수득되는 비-자연적 변이체일 수도 있다.

일반적으로, 기준 핵산과 변이체 핵산간의 차이는, 기준 핵산과 변이체 핵산의 뉴클레오타이드 서열이 거의 유사하고 많은 영역에서 동일할 정도로 작다. 변이체 핵산에 존재하는 뉴클레오타이드 변형은 상기 변이체 핵산에 의해 암호화된 아미노산 서열을 바꾸지 않는 것을 의미하는 "사일런트"일 수도 있다.

그러나, 변이체 핵산에서의 뉴클레오타이드의 변화가, 기준 핵산에 의해 암호화된 펩타이드에 대하여 변이체 핵산에 의해 암호화된 폴리뉴클레오타이드에서의 치환, 첨가 또는 결실을 야기할 수도 있다. 덧붙여, 암호화 영역에서의 뉴클레오타이드 변형은 아미노산 서열의 보존적 또는 비보존적 치환을 일으킬 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 변이체 핵산은 기준 핵산의 폴리펩타이드와 마찬가지로 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 실질적으로 보존하거나 또는 본래의 핵산에 의해 암호화된 폴리뉴클레오타이드에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 성능을 보존하는 폴리펩타이드를 암호화한다.

이렇게 해서 몇몇 변이체 핵산은 이의 구조적 연구가 당해 단백질의 구조-활성 관계를 추론할 수 있게끔 하는 폴리펩타이드의 변이된 형태를 암호화할 것이다. 연구된 질환에 대하여 이들 변이체에 관한 지식은, 병리의 분자적 원인을 이해할 수 있게 하므로 중요하다.

"단편"은 본 발명에 따른 기준 핵산, 기준 핵산에 비해 감소된 길이의 뉴클레오타이드 서열 및 공통 부분에 걸쳐서 기준 핵산과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것으로 이해될 것이다.

본 발명에 따른 그러한 핵산 "단편"은 경우에 따라 그것이 구성성분이 되는 보다 더 큰 폴리뉴클레오타이드에 포함될 수도 있다.

그러한 단편은 본 발명에 따른 핵산의 보존적 뉴클레오타이드를 8, 10, 12,15, 18, 20에서부터 25, 30, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000 또는 1500개까지의 길이에 이르는 올리고뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 이로 구성된다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드의 "변이체"는 기준 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 대하여, 이의 아미노산 서열이 적어도 하나의 아미노산 잔기에서의 하나 이상의 치환, 첨가 또는 결실을 함유하는 폴리펩타이드를 주로 의미하는 것으로 이해될 것이며, 이때, 아미노산 치환은 보존적이거나 비보존적일 수 있다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드의 "단편"은 기준 폴리펩타이드의 아미노산 서열보다 짧은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 전체 부분에 걸쳐서 이들 기준 폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 의미하는 것으로 이해될 것이다.

그러한 단편은 경우에 따라 그것이 부분인 보다 더 큰 폴리펩타이드 내에 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드의 그러한 단편은 10, 15, 20, 30 내지 40, 50, 100, 200 또는 300개의 아미노산 길이를 가질 수 있다.

본 발명의 목적을 위해 두 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 간의 "퍼센트 동일성"은 비교용 윈도우를 통해 최적으로 정렬된 두 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다.

이렇게 해서, 비교용 윈도우에서 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 부분은 두 서열의 최적의 정렬을 수득하기 위해 기준 서열에 대하여 첨가 또는 결실(예를 들면, "갭")을 포함할 수 있다(상기 기준 서열은 이러한 첨가 또는 결실을 포함하지 않는다).

퍼센트는 비교된 두 서열에 대해 동일한 핵산 염기 또는 동일한 아미노산 잔기가 관찰된 지점의 수를 측정한 다음, 두 염기 또는 아미노산 잔기 사이의 동일성이 있는 지점의 수를 비교용 윈도우에서 총 지점의 수로 나누고 퍼센트 서열 동일성을 수득하기 위해 나온 결과를 100배 함으로써 계산된다.

비교용 최적 서열 정렬은 WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN사로부터의 패키지에 함유된 공지된 알고리듬의 도움으로 컴퓨터를 이용하여 수득될 수 있다.

예시로써, BLAST 소프트웨어(version BLAST 1.4.9 of March 1996, BALST 2.0.4 of February 1998 and BLAST 2.0.6 of September 1998)의 도움으로, 전적으로 디폴트 파라미터(S. F. Altschul et al. J. Mol. Biol. 1990 215: 403-410, S. F Altschul et al, Nucleic Acids Res. 1997 25: 3389-3402)를 사용하여 퍼센트 서열 동일성을 산출하는 것이 가능할 수 있다. 블라스트는 Altschul et al. 알고리듬의 도움으로 기준 "청구" 서열에 대한 유사/상동 서열을 검색한다. 청구 서열과 사용된 데이터베이스는 펩타이드이거나 핵산 유형일 수 있으며, 임의 조합도 또한 가능하다.

본 발명의 목적상 "고 엄격 하이브리드화 조건"은 하기 조건을 의미하는 것으로 이해될 것이다:

1-막 경쟁 및 예비하이브리드화(PREHYBRIDIZATION):

- 혼합: 40㎕ 연어 정충 DNA (10㎎/㎖)

+ 40㎕ 인간 태반 DNA (10㎎/㎖)

- 96℃에서 5분간 변성한 다음 혼합물을 얼음에 침지.

- 2X SSC를 제거하고 막을 함유한 하이브리드화 튜브에 포름아마이드 혼합물 4 ㎖ 붓기.

- 두 개의 변성된 DNA의 혼합물 첨가.

- 회전하면서 5 내지 6 시간 동안 42℃에서 배양.

2-표지된 탐침 경쟁:

- 반복량에 따라, 표지되고 정제된 탐침에 10 내지 50 ㎕ Cot 1 DNA 첨가.

- 95℃에서 7 내지 10분 동안 변성.

- 2 내지 5시간 동안 65℃에서 배양.

3-하이브리드화

- 예비하이브리드화 믹스 제거.

- 40㎕ 연어 정충 DNA + 40㎕ 인간 태반 DNA 혼합; 96℃에서 5분간 변성; 그리고 나서 얼음에 침지.

- 하이브리드화 튜브에 포름아마이드 믹스, 두 DNA 혼합물 및 변성되고 표지된 탐침/Cot 1 DNA 첨가.

- 회전하면서 15 내지 20 시간 동안 42℃에서 배양.

4-세척:

- 세정하기 위해 2X SSC에서 실온에서 1회 세척.

- 실온에서 2X SSC와 65℃에서 0.1% SDS로 5분간 2회.

- 65℃에서 1X SSC 및 65℃에서 0.1% SDS로 15분간 2회.

막을 사란(Saran)에 봉하여 노출하기.

상기 기술된 하이브리드화는 20개의 뉴클레오타이드에서부터 수백개의 뉴클레오타이드의 길이에 이르는 한 분자의 핵산과, 고 엄격 조건 하에서, 하이브리드화되도록 조정되어졌다.

상기 기술된 하이브리드화 조건이 당업자에게 알려진 기술에 따라 하이브리드화를 원하는 핵산의 길이 또는 선택된 표지 유형의 함수로서 조정될 것임은 더 말할 나위가 없다.

적합한 하이브리드화 조건은, 예를 들면 HAMES 및 HIGGINS (1985)에 의한 매뉴얼 또는 F.AUSUBEL 등 (1999)에 의한 매뉴얼에 들어 있는 지시내용에 따라 조정될 수 있다.

ABC1 유전자의 핵산

게놈 서열

마우스의 정규위치(orthologous) ABC1 유전자의 구조를 특히 참고한다면. 인간 ABC1 유전자는 48개의 엑손과 47개의 인트론을 포함하는 것으로 여겨진다.

ABC1 유전자의 여러개의 부분적 게놈 뉴클레오타이드 서열은 본 발명에 따라 분리되고 규명되었는데, 이들 게놈 서열은 샘플내 ABC1 유전자 또는 이의 뉴클레오타이드 발현 산물의 다양한 검출 수단의 생산을 위해 특히 사용될 수 있는 신규한 엑손 서열과 인트론 서열 모두를 포함하고 있다. 이들 부분 게놈 서열은 하기 표 1에 나타나 있다.

인간 ABC1 유전자의 부분 게놈 서열

서열번호	지정
1	인트론 10(p), 엑손 11(p)
2	인트론 11(p), 엑손 12, 인트론 12, 엑손 13, 인트론 13, 엑손 14, 인트론 14,엑손 15, 인트론 15, 엑손 16, 인트론 16, 엑손 17(p)
3	엑손 17(p), 인트론 17(p)
4	인트론 18(p), 엑손 19, 인트론 19(p)
5	인트론 19(p), 엑손 20, 인트론 20, 엑손 21, 인트론 21, 엑손 22, 인트론 22,엑손 23, 인트론 23, 엑손 24, 인트론 24, 엑손 25, 인트론 25, 엑손 26, 인트론 26(p)
6	인트론 26(p), 엑손 27, 인트론 27, 엑손 28, 인트론 28, 엑손 29, 인트론 29,엑손 30, 인트론 30(p)
7	인트론 30(p), 엑손 31, 인트론 31, 엑손 32, 인트론 32, 엑손 33, 인트론 33,엑손 34, 인트론 34(p)
8	인트론 34(p), 엑손 35, 인트론 35(p)
9	인트론 35(p), 엑손 36, 인트론 36(p)
10	인트론 36(p), 엑손 37, 인트론 37, 엑손 38, 인트론 38(p)
11	인트론 39(p), 엑손 40, 인트론 40, 엑손 41, 인트론 41(p)
12	인트론 41(p), 엑손 42, 인트론 42(p)
13	인트론 46(p), 엑손 47, 인트론 47(p)
14	최종 엑손(p), 최종 엑손의 3' 서열

따라서, 본 발명의 제 1 주제는 서열번호 1 내지 14의 뉴클레오타이드 서열 또는 상보 서열을 갖는 핵산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드의 적어도 245개의 보존적 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산에 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 14의 뉴클레오타이드 서열 또는 상보 서열을 갖는 핵산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드의 적어도 245개의 보존적 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산과 적어도 80%, 유리하게는 90%, 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산에 관한 것이다.

ABC1 유전자의 32개 엑손이 적어도 부분적으로 이의 뉴클레오타이드 서열에의해 확인되었으며, 이는 하기 표 2에 나타나 있다.

엑손 번호	서열번호	서열번호내소재	5'내의뉴클레오타이드의 위치	3'내의뉴클레오타이드의 위치
11(5' 말단)	15	1	3003	3153
12	16	2	398	603
13	17	2	1124	1300
14	18	2	3087	3309
15	19	2	5055	5276
16	20	2	6337	6541
17(5' 말단)	21	2	7646	7660
17(3' 말단)	22	3	1	105
19	23	4	904	1035
20	24	5	284	426
21	25	5	630	767
22	26	5	1470	1690
23	27	5	2949	3021
24	28	5	4008	4210
25	29	5	5878	5926
26	30	5	6122	6235
27	31	6	561	709
28	32	6	2359	2483
29	33	6	3714	3812
30	34	6	6848	7036
31	35	7	1183	1277
32	36	7	2587	2619
33	37	7	3744	3849
34	38	7	5323	5397
35	39	8	236	405
36	40	9	989	1166
37	41	10	545	660
38	42	10	772	916
40	43	11	435	564
41	44	11	829	949
42	45	12	589	651
47	46	13	377	620
최종 엑손(3' 말단)	47	14	1	1237

따라서, 본 발명은 서열번호 15 내지 47의 뉴클레오타이드 서열 또는 상보 서열을 갖는 핵산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산에 관한 것이기도 하다.

더 나아가, ABC1 유전자의 35개 인트론이 분리되고 적어도 부분적으로 확인되었다. ABC1 유전자의 인트론의 뉴클레오타이드 서열과 이의 단편 및 변이체도 또한 샘플내 ABC1 유전자의 적어도 하나의 카피의 존재를 검출하거나 ABC1 유전자내 주어진 표적 서열을 증폭하기 위한 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머로서 사용될 수 있다.

ABC1 유전자의 인트론 서열에 대한 참고가 하기 표 3에 나타난다.

인트론 번호	서열번호	서열번호내소재	5'내의뉴클레오타이드의 위치	3'내의뉴클레오타이드의 위치
10(3' 말단)	48	1	1	3002
11(3' 말단)	49	2	1	397
12	50	2	604	1123
13	51	2	1301	3086
14	52	2	3310	5054
15	53	2	5277	6336
16	54	2	6542	7645
17(3' 말단)	55	3	106	1285
18(3' 말단)	56	4	1	903
19(5' 말단)	57	4	1036	1521
19(3' 말단)	58	5	1	283
20	59	5	427	629
21	60	5	768	1469
22	61	5	1691	2948
23	62	5	3022	4007
24	63	5	4211	5877
25	64	5	5927	6121
26(5' 말단)	65	5	6236	6519
26(5' 말단)	66	6	1	560
27	67	6	710	2358
28	68	6	2484	3713
29	69	6	3813	6847
30(5' 말단)	70	6	7037	7378
30(3' 말단)	71	7	1	1182

31	72	7	1278	2586
32	73	7	2620	3743
33	74	7	3850	5322
34(5' 말단)	75	7	5398	5689
34(3' 말단)	76	8	1	235
35(5' 말단)	77	8	406	645
35(3' 말단)	78	9	1	988
36(5' 말단)	79	9	1167	1664
36(3' 말단)	80	10	1	544
37	81	10	661	771
38(5' 말단)	82	10	917	1279
39(3' 말단)	83	11	1	434
40	84	11	565	828
41(5' 말단)	85	11	950	1124
41(3' 말단)	86	12	1	588
42(5' 말단)	87	12	652	729
46(3' 말단)	88	13	1	376
47(5' 말단)	89	13	621	731
최종 엑손의 3'내의 원거리 서열	90	14	1238	3501

본 발명은 또한 서열번호 48 내지 89의 뉴클레오타이드 서열 또는 상보 서열을 갖는 핵산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드의 적어도 8개의 보존적 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산에 관한 것이다.

더 나아가, 본 발명의 주제는 서열번호 48 내지 89의 뉴클레오타이드 서열 또는 상보 서열을 갖는 핵산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드와 적어도 80%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산이다.

본 발명은 또한 서열번호 48 내지 89의 뉴클레오타이드 서열 또는 상보 서열을 갖는 핵산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드와 고 엄격 조건하에서 하이브리드화하는 핵산에 관한 것이기도 하다.

더 나아가, ABC1 유전자의 최종 엑손의 3' 말단의 하류에 위치한 잠재적 조절 게놈 뉴클레오타이드 서열도 분리되었다. 이는 서열번호 90의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드이다. 이 잠재적 조절 서열("인핸서" 유형의 조절 서열의 가능한 존재)에서의 다형성의 특징규명, 특히 콜레스테롤 역수송에서의 온화한 형태의 결핍증, 특히 온화한 형태의 탠지어병을 앓고 있는 환자에서의 상기의 규명은 ABC1 유전자의 발현을 조절하는데 있어서의 결함을 유도할 수 있는 이들 다형성의 일부에 특이적인 적절한 검출 수단, 탐침 또는 프라이머의 생산을 허용하는 유형일 것이다.

서열번호 90 서열의 생물학적 활성 폴리뉴클레오타이드 단편을 확인하기 위해서, 당업자는 Sambrook 등(1989)의 저서를 유리하게 참고할 수 있을 것이며, 이 저서는 마커 유전자(예를 들면, β-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제 등)를 나르는 재조합 벡터의 사용을 기술하는데, 상기 마커 유전자는 적절한 프로모터와 서열번호 90의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 활성 단편의 통제하에 놓여졌을 때 이의 발현이 검출될 수 있다. 서열번호 90의 서열을 갖는 그러한 생물학적 활성 단편은 Clontech사에 의해 시판되는 pSEAP-Basic, pSEAP-Enhancer, pβgal-Enhancer, 또는 pEGFP-1 벡터중의 하나와 같이 조절 서열을 갖는 적절한 선별 벡터내로 특히 클로닝될 수 있다.

또한, 본 발명의 주제는 서열번호 90의 뉴클레오타이드 서열 또는 상보 서열을 갖는 핵산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드와 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산이다.

본 발명은 또한 서열번호 90의 뉴클레오타이드 서열 또는 상보 서열을 갖는 핵산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열과 고 엄격 조건하에 하이브리드화하는 핵산에 관한 것이기도 하다.

완전한 cDNA

전술한 바와 같이, ABC1 유전자의 발현에 상응하는 부분 cDNA 서열은 Langman 등(1999)에 의해 규명되었다. 이 ABC1의 부분 cDNA 서열은 6880개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 콜레스테로롤 역수송에 관련된 질환에 걸리지 않은 환자에서 생산된 ABC1 단백질에 상응하는 전체 개방 판독 프레임을 함유한다. 또한, Langmann 등(1999)에 의해 기술된 cDNA 서열은 5'-UTR 영역(뉴클레오타이드 1부터 120)의 일부와 3'-UTR 영역(뉴클레오타이드 6727부터 6880)의 일부를 포함한다.

신규 3'-UTR 영역에 상응하고 주요 핵산 영역, 특히 세포 내에서 메신저 RNA의 안정성 면에 있어서의 주요 핵산 영역을 구성하는, ABC1 유전자에 상응하는 전체 완전한 cDNA가 본 발명에 따라 분리되고 규명되었다.

서열번호 91의 서열을 갖는 전사체의 발현 분석은 실시예 1에 기술된 바와 같이 RT-PCR에 의해 수행되었다. 다양한 조직의 polyA+RNA를 가지고 수행되는 이들 분석은 ABC1 유전자가 태아 뇌, 뇌, 심장, 태반 및 자궁에서 발현되었음을 입증케한다.

결과적으로, 본 발명은 인간 ABC1 유전자의 cDNA의 서열번호 91의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 상보 서열을 갖는 핵산을 포함하는 핵산에 관한 것이다.

서열번호 91의 서열을 갖는 인간 ABC1 유전자의 cDNA는 서열번호 91의 서열의 121번 위치에서의 뉴클레오타이드(전사 개시를 위한 ATG 코돈의 염기 A)에서부터 6723번 위치에서의 뉴클레오타이드에 이르는 개방 판독 프레임을 포함한다. 폴리아데닐화 시그널(서열 ATTAAA를 갖음)도 존재하며, 서열번호 91의 서열의 9454번 뉴클레오타이드에서 시작한다.

서열번호 91의 서열의 cDNA는 길이상으로 2201개의 아미노산의 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하며 서열번호 139의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명은 또한, 서열번호 92의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 이의 생물학적 활성 단편 또는 상보 서열을 갖는 핵산의 적어도 8개의 보존적 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명의 주제는 또한 서열번호 92의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 이의 생물학적 활성 단편 또는 상보 서열을 갖는 핵산과 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산이다.

본 발명의 또 다른 주제는 서열번호 92의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 이의 생물학적 활성 단편 또는 상보 서열을 갖는 핵산과 고 엄격 조건하에서 하이브리드화하는 핵산으로 구성된다.

ABC1 유전자내의 다형성

돌연변이

본 발명에 따라 여러 개의 돌연변이가 ABC1 유전자의 서열에서 확인되었는데, 이들 돌연변이는 돌연변이된 서열에 의해 암호화된 ABC1 폴리펩타이드의 주요 구조적 손상을 야기한다.

이들 돌연변이는 심각한 관상동맥 질환과 결부된 중증 형태의 탠지어병을 앓고 있는 환자에서 특히 발견된다. 두 개의 특히 해로운 돌연변이가 하기에 기술된다.

1. 엑손 12에서의 돌연변이

이 돌연변이는 서열번호 2의 서열을 갖는 정상 게놈 DAN의 472번 뉴클레오타이드에서부터 485번 뉴클레오타이드까지의 14개의 뉴클레오타이드("TGAGAGGAAGTTCT")의 국재화된 단편의 결실과 서열번호 2의 서열을 갖는 정상 게놈 DNA의 486번 뉴클레오타이드의 상류로 ABC1 유전자의 엑손 12의 서열내로 110개의 Alu-유형 서열의 뉴클레오타이드의 삽입으로 구성된다.

이 결실/삽입 돌연변이를 나르는 엑손 12는 서열번호 93의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

상응하는 변이된 cDNA는 서열번호 94의 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 서열번호 140의 서열을 갖는 길이상으로 2233개의 아미노산의 변이된 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는데, 이의 구조는 서열번호 139의 서열을 갖는 정상 ABC1 폴리펩타이드와 비교시 실질적으로 변형되어 있다.

서열번호 93 및 94의 뉴클레오타이드 서열과 서열번호 140의 폴리펩타이드 서열은 본 발명의 일부를 구성한다.

2. 엑손 13에서의 돌연변이

이 돌연변이는 서열번호 2의 게놈 서열의 1232번 뉴클레오타이드(G)의 결실로 구성되는데, 이는 엑손 13내에 소재한다(서열번호 17의 엑손 13의 서열에서 106번 위치에서의 뉴클레오타이드 G). 이러한 1 염기의 포인트 결실은 ABC1 유전자의 mRNA의 정상적인 판독 프레임에 종결 코돈을 도입한다.

이 돌연변이를 나르는 ABC1 유전자의 엑손 13의 서열은 서열번호 95의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드이다.

ABC1 유전자의 엑손 13에서의 이러한 돌연변이에 상응하는 cDNA는 서열번호 96의 뉴클레오타이드 서열에 나타나있다.

변이된 ABC1 유전자에 의해 암호화된 변이 단백질은 574개의 아미노산의 길이를 갖는데, 이는 다시 말해, 정상 단백질의 아미노산의 면에서 약 1/4 길이이다. 절두된 폴리펩타이드는 서열번호 141의 아미노산 서열을 갖는다.

정상 서열을 ABC1의 변이된 서열(게놈 서열, 메신저 RNA, cDNA)과 구분시키게끔 하는 구조적 특징은, 샘플내 변이된 ABC1 서열의 검출 수단, 특히, 변이된 ABC1 서열과 특이적으로 하이브리드화하는 탐침 또는 상기 기술된 바와 같은 돌연변이를 나르는 ABC1 유전자의 영역을 선택적으로 증폭할 수 있게 하는 프라이머 쌍을 생산하기 위해서 이용될 수 있으며, 이는 특히, 증폭된 핵산 단편의 길이를 구별함으로써, 상기 기술된 바와 같은 특정 탐침의 도움으로 증폭된 단편의 하이브리드화에 의해, 또는 이들 증폭된 단편의 직접 서열분석에 의해 이들 돌연변이의 존재의 검출을 가능케한다.

따라서, 본 발명의 주제는 또한, 서열번호 93 내지 96의 뉴클레오타이드 서열 또는 상보 서열을 갖는 핵산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드의 적어도 8개의 보존적 뉴클레오타이드를 갖는 핵산이다.

바람직하게는, 그러한 핵산은 하기를 포함한다:

a) 서열번호 93 및 94의 서열에 위치한 Alu 서열의 적어도 2개의 보존적 뉴클레오타이드, 바람직하게는 서열번호 93 및 94의 서열에 위치한 Alu 서열의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 또는 100개의 보존적 뉴클레오타이드이거나; 또는

b) 서열번호 94 및 95의 서열에 있는 결실된 G 염기의 어느 편에 위치한 적어도 두 개의 "CT" 뉴클레오타이드.

상기에서 기술된 바와 같은 두 개의 돌연변이 중 하나를 나르는 ABC1 서열(게놈 서열, 메신저 RNA)의 영역에 위치한 핵산 서열과 하이브리드화하는 프라이머도 본 발명의 일부를 구성한다.

또한, 본 발명은 서열번호 93 내지 96의 뉴클레오타이드 서열 또는 상보 서열을 갖는 핵산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드와 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산에 관한 것이기도 하다.

본 발명은 또한 서열번호 93 내지 96의 뉴클레오타이드 서열 또는 상보 서열을 갖는 핵산 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드와 고 엄격 조건하에서 하이브리드화하는 핵산에 관한 것이기도 하다.

기타 다형성

기타 다형성이 ABC1 유전자 서열내에서 발견 되었으며, 특히 뉴클레오타이드의 치환은 암호화 영역(엑손)과 비-암호화 영역 둘 모두에 위치했다.

암호화 영역에서 발견되는 다형성에 관해서는, 필수적으로 ABC1의 개방 판독 프레임의 코돈 세 개 염기상에 위치하는 단일 뉴클레오타이드의 치환이 있는데, 당업자에게 잘 알려져 있는 인간의 유전자 축퇴 법칙을 고려하면, 암호화된 아미노산의 성질과 관련하여, 이러한 치환은 어떠한 변형도 유발하지 않는다.

본 명세서에서는 이들 다형성을 41 염기 길이의 뉴클레오타이드 서열 형태로 나타내었는데, 다형성 염기는 다형성 단편의 중앙에 위치한다. 따라서, 확인된 다형성 각각에 대한, 각각의 대립 유전자는 41 염기 길이의 서열로서 나타내었으며, 다형성 자체는 각 형태에 대응하는 2 개의 뉴클레오타이드 서열로 나타내고 있다. ABC1 유전자에서 확인된 다형성을 아래 표 4에 나타내었다.

지정번호	서열번호 2의서열에서의 위치	대립 유전자 1서열번호	대립 유전자 2서열번호	다형성 염기대립 유전자 1/대립유전자 2
1	397	97	98	G/A
2	1324	99	100	T/A
3	3028	101	102	C/T
4	3234	103	104	C/A
5	3390	105	106	A/G
6	6854	107	108	G/A

피검자로부터 수득한 DNA 샘플내 이들 다형성의 검출은, 예를 들어, ABC1의 다형성 염기를 함유하는 뉴클레오타이드 영역을 특이적으로 증폭한 후, 증폭된 단편의 서열을 분석하여 상기 피검자에 의해 운반되는 대립 유전자의 성질을 결정함으로써 수행될 수 있다.

피검자로부터 수득한 DNA 샘플내 이들 다형성의 검출은, 또한, 본 발명에 따른 ABC1 유전자의 다형성의 다형성 염기들 중 하나를 포함하는, 주어진 대립 유전자와 특이적으로 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머를 이용하여 수행될 수 있다.

실례로서, 적합한 뉴클레오타이드 프라이머는 예를 들면, 3' 말단의 염기가상기 다형성을 포함하는 단편의 다형성 염기 5'쪽에 접하여 위치한 염기와 하이브리드화하는 프라이머이다. 특이적 프라이머의 하이브리드화 단계 후, 상기 다형성의 다형성 염기에 상보적인, 예를 들어 차등적으로 형광 표지된, 두 개의 디데옥시뉴클레오타이드의 혼합물에 의한 연장 단계, 그 다음 수득된 형광 시그널의 검출 단계를 통해, 상기 두 개의 차등적으로 표지된 형광 디데옥시뉴클레오타이드 중 어느 것이 혼입 되었는지를 결정할 수 있고 상기 다형성 수준에서 존재하는 다형성 염기의 성질을 직접적으로 추론할 수 있다.

디데옥시뉴클레오타이드의 표지 및 검출을 위해 다양한 접근법이 이용될 수 있다. FRET(형광 공명 에너지 전이, "Fluorescence resonance energy transfer")에 기초를 둔 균질상 내에서의 방법이 Chen과 Kwok에 의해 기술되었다(1997). 본 방법에 따르면, 다형성을 함유한 게놈 DNA의 증폭된 단편을, 표지된 디데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 및 변형된 Taq 폴리머라제 존재 하에서, 5' 말단이 형광물질로 표지된 프라이머와 함께 배양한다. 상기 표지된 프라이머는 상보적 게놈 DNA 서열상에 존재하는 대립 유전자에 특이성을 갖는, 표지된 디데옥시뉴클레오타이드의 결합으로 염기 하나만큼 연장된다. 이러한 유전자형 결정 반응 말미에, 디데옥시뉴클레오타이드에 표지된 두가지의 표지 화합물에 대한 형광 강도를 분리 또는 정제 없이 직접 분석한다. 이들 모든 단계는 동일한 튜브내에서 수행될 수 있고 실시간으로 형광 시그널의 변형이 모니터링될 수 있다. 또다른 구체적인 예에 따르면, 연장된 프라이머를 MALDI-TOF형 질량 분석법으로 분석할 수 있다. 다형성 부위의 수준에 위치된 염기를 마이크로서열분석 프라이머에 부가된 질량을 측정함으로써 결정한다(Haff와 Smimov, 1997).

그러한 뉴클레오타이드 프라이머는 예를 들어 지지체 상에서 해체될 수도 있다. 더욱이, 상기한 바와 같은 다수의 특이적 프라이머를 지지체 상에, 예를 들어 순서대로, 고정시켜, 프라이머 각각이 본 발명에 따른 ABC1 유전자의 다형성 중 하나의 검출에 적합하도록 할 수 있다.

본 발명에 따른 ABC1 유전자의 다형성은 특히 피검자내의 주어진 대립유전자의 존재와 주어진 병리, 특히 염색체 영역 9q31과 이미 연관된 병리 중 하나, 바람직하게는 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 관련된 병리에 대한 상기 피검자의 성향의 관계에 대한 연구에서 유전자 마커로서 유용하다.

복합 형질(표현형)을 유전적으로 분석하는 방법에는 다양한 유형이 있다(Lander와 Schork, 1994). 일반적으로, 본 발명에 따른 이중 대립유전자 다형성은, 유전자형과 표현형 간에 통계적으로 상당한 상관관계의 증명을 목적으로 하는 기술분야에서 서술되고 있는 어떤 방법에 대해서든 유용하게 이용가능하다. 이중 대립유전자 다형성은 연관분석 및 대립유전자 분배방법에 사용된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이중 대립유전자적 다형성은 연관(association)에 대한 연구에 이용되는 검출 가능한 형질(표현형)과 관련된 유전자를 확인하는 데 사용되는데, 그 형질이 나타난 과(family)를 이용할 것을 요구하지 않는 접근방법이며, 이는 또한 복합 형질 및 산발성 형질과 연관된 유전자의 확인을 가능하게 한다.

본 발명에 따른 이중 대립유전자적 다형성을 사용하는 그외 다른 통계적 방법으로서는, 예를 들면 Forsell et al. (1997), Xiong et al. (1999), Horvath etal. (1998), Sham et al. (1995) 또는 Nickerson et al. (1992)에 의해 서술된 것이 있다.

또다른 측면에 의하면, 본 발명은 또한 상기한 바와 같이 하나 이상의 이중 대립유전자적 다형성을 함유하는 ABC1 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.

그러므로, 또한 본 발명은 서열번호 97 내지 108의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 중 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 가지며 다형성 염기를 함유하는 핵산, 또는 그에 대한 상보 서열을 갖는 핵산에 관한 것이다.

뉴클레오타이드 탐침 및 프라이머

서열번호 1-4, 15-47, 48-89, 90, 92, 94-96 및 97-108의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나로부터 유도된 핵산 단편은 샘플 내의 ABC1 유전자 또는 단편 또는 그의 (돌연변이 또는 다형성을 함유하는) 변이체의 뉴클레오타이드 서열에 대한 적어도 1 카피의 존재를 검출하는 데 유용하다.

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 서열번호 1-4, 15-47, 48-89, 90, 92, 94-96 및 97-108의 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 또는 상보 서열을 갖는 핵산의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 본 발명에 따른 핵산 특히, 서열번호 1-4, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 및 97-108의 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 또는 상보 서열을 갖는 핵산의 10, 12,15, 18 또는 20 내지 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 1500 길이의 연속 뉴클레오타이드를 포함할 것이다.

선택적으로, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 본 발명데 따른 핵산, 보다 구체적으로, 서열번호 1-4, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 및 97-108의 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 또는 상보 서열을 갖는 핵산의 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500 길이의 연속 뉴클레오타이드로 구성되거나 및/또는 포함할 것이다.

그러므로, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머의 정의는 앞서 정의된 고 엄격 하이브리드화 조건하에서, 서열번호 1-4, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 및 97-108의 서열 중에서 선택되는 핵산 또는 이들에 대한 상보 서열과 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드까지를 포함한다.

ABC1 유전자의 다양한 영역을 증폭시킬 수 있는 프라이머 및 프라이머 쌍의 예시를 하기 표 5에 나타내었다.

프라이머 번호	서열내 위치	서열 중 위치	프라이머의 서열	하이브리드화되는부위
1	2	313-335	109	인트론 11
2	2	Comp 640-663	110	인트론 12
3	2	1005-1029	111	인트론 12
4	2	Comp 1472-1496	112	인트론 13
5	2	2930-2954	113	인트론 13
6	2	Comp 3444-3468	114	인트론 14
7	2	4988-5012	115	인트론 14
8	2	Comp 5338-5362	116	인트론 15
9	2	6240-6262	117	인트론 15
10	2	Comp 6581-6603	118	인트론 16
11	5	1369-1391	119	인트론 21
12	5	Comp 1748-1770	120	인트론 22
13	5	3868-3890	121	인트론 23
14	5	Comp 4240-4262	122	인트론 24
15	6	3587-3610	123	인트론 28
16	6	Comp 3881-3903	124	인트론 29
17	6	6753-6775	125	인트론 29
18	6	Comp 7112-7134	126	인트론 30
19	7	1060-1082	127	인트론 30
20	7	Comp 1377-1399	128	인트론 31
21	7	3574-3596	129	인트론 32
22	7	Comp 3909-3931	130	인트론 33
23	7	5161-5183	131	인트론 33
24	7	Comp 5463-5485	132	인트론 34
25	8	100-122	133	인트론 34
26	8	Comp 475-497	134	인트론 35
27	9	841-861	135	인트론 35
28	9	Comp 1249-1271	136	인트론 36
29	10	455-477	137	인트론 36
30	10	Comp 966-988	138	인트론 38

본 발명에 따른 바람직한 탐침 및 프라이머의 첫번째 양태에 따르면, 서열번호 109-138의 뉴클레오타이드 서열 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부, 또는 상보 서열을 갖는 핵산이 포함된다.

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 프라이머 또는 탐침은 당업자에 잘 알려져 있는 어떠한 적당한 방법에 의해서든 제조될 수 있는데, 이러한 방법에는 제한효소의 클로닝 및 작용에 의하거나, Narang et al. (1979) 또는 Brown et al. (1979)이제시한 포스포디에스테르 방법, Beaucage et al. (1980)에 의해 제시된 디에틸포스포아미다이트 방법 또는 유럽 특허 제 0 707 592 호에 기재된 고체 지지체상의 기술과 같은 기술에 따른 직접적인 화학합성에 의하는 방법이 포함된다.

상기에 기술된 올리고뉴클레오타이드 탐침 및 프라이머를 비롯한, 본 발명에 따른 핵산 각각은, 필요하다면, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 검출 가능한 마커를 혼입시킴으로써 표지할 수 있다.

예를 들어, 그러한 마커는 방사능 동위원소(³²P,³³P,³H,³⁵S), 형광 분자(5-브로모데옥시우리딘, 플루오레신, 아세틸아미노플루오렌, 디곡시게닌), 또는 바이오틴과 같은 리간드로 이루어진다.

탐침의 표지는 바람직하게는 프라이머 연장에 의해, 또는 대안적으로 5' 또는 3' 말단에 첨가함으로써 폴리뉴클레오타이드에 표지된 분자를 결합시켜 수행한다.

핵산 단편의 비-방사능성 표지의 예는 특히 프랑스 특허 제 78 109 75 호에 또는 Urdea et al. (1988) 또는 Sanchez-pescador et al. (1988)의 논문에 기재되어 있다.

유리하게는, 본 발명에 따른 탐침은 Urdea et al. (1991)의 논문 또는 대안적으로 유럽 특허 제 0 225 807 호(CHIRON)에 기재된 탐침과 같이, 상기 시그널의 증폭을 가능하게 하는 유형의 구조적 특징을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 탐침은 특히 게놈 DNA와의 서던형 하이브리드화 또는, 대안적으로 대응 전사체의 발현이 샘플내에서 이루어질 때 대응하는 mRNA와의 하이브리드화에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 탐침은 또한 PCR 증폭산물의 검출 또는 대안적으로 부적당한 (염기)쌍의 검출에 사용가능하다.

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 그러한 고정 지지체는 당업자에게 잘 알려져 있으며 미소역가 플레이트, 폴리스티렌 베드, 마그네틱 베드, 니트로셀룰로스 밴드, 또는 라텍스 입자와 같은 미세입자의 웰 표면을 포함한다.

결국, 본 발명은 또한 샘플내 상기와 같은 핵산의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이며, 본 방법은 다음의 단계를 포함한다:

1)본 발명에 따른 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 탐침을 시험될 샘플과 접촉하도록 유도;

2)탐침과 샘플에 존재하는 핵산 간에 형성될 수 있는 복합체의 검출.

본 발명에 따른 검출방법에 대한 구체적인 양태에 따르면, 올리고뉴클레오타이드 탐침은 지지체 상에 고정된다.

또다른 측면에 따르면, 올리고뉴클레오타이드 탐침은 검출 가능한 마커를 포함한다.

본 발명은, 또한, 샘플내 본 발명에 따른 핵산의 존재를 검출하는 박스 또는 키트에 관한 것으로서, 상기 박스는 다음을 포함한다:

a)하나 또는 그 이상의 상기 뉴클레오타이드 탐침;

b)경우에 따라, 하이브리드화 반응에 필요한 시약.

제 1 측면에 따라, 검출 박스 또는 키트는 탐침이 지지체상에 고정됨을 특징으로 한다.

제 2 측면에 따라, 검출 박스 또는 키트는 올리고뉴클레오타이드 탐침이 검출 가능한 마커를 포함함을 특징으로 한다.

상기한 검출 키트의 구체적 양태에 따르면, 그러한 키트는 해당 표적 서열을 검출하기 위해 또는 대안적으로 본 발명에 따른 핵산, 보다 구체적으로는 서열번호 1-14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 및 97-108의 서열을 갖는 핵산 또는 상보 서열을 갖는 핵산의 암호화 영역 또는 비-암호화 영역에 존재하는 돌연변이를 검출하기 위해 사용될 수 있는, 본 발명에 따른 복수개의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 것이다.

그러므로, 지지체 상에 고정된, 본 발명에 따른 탐침은 "DNA 칩"과 같은 매트릭스 내에 배열될 수 있다. 그렇게 배열된 매트릭스는 구체적으로는 미국 특허 제 5,143,854 호, PCT 출원번호 제 WO 90/15070 및 92/10092 호에 기재된 바 있다.

올리고뉴클레오타이드 탐침이 고밀도로 고정되어 있는 지지체 매트릭스는 예를 들어 미국 특허 제 5,412,087 호 및 PCT 출원번호 제 WO 95/11995 호에 기술되어 있다.

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 프라이머는 본 발명에 따른 핵산, 즉 보다 구체적으로는 서열번호 1-14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 및 97-108의 서열을 갖는 핵산의 전부 또는 일부, 또는 대안적으로 이들의 변이체 중 어느 하나를 증폭하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 또다른 주제는 본 발명에 따른 핵산, 보다 구체적으로는 샘플내에 포함된 서열번호 1-14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 및 97-108의 서열을 갖는 핵산 또는 단편 또는 이들의 변이체를 증폭하는 방법에 관한 것인데, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:

a)표적 핵산의 존재가 추정되는 샘플을 하이브리드화 위치가 각각 증폭하고자 하는 표적 핵산 영역의 5' 쪽과 3' 쪽에 위치되는 한쌍의 뉴클레오타이드 프라이머와, 증폭반응에 필요한 시약의 존재하에 접촉시킴;

b)증폭된 핵산을 검출.

상기의 증폭 방법을 실행하게 위해서는 상기한 뉴클레오타이드 프라이머 중 어느 하나를 이용하여야 할 것이다.

본 발명의 주제는 또한, 본 발명에 따른 핵산 즉, 보다 구체적으로는 서열번호 1-14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 및 97-108의 서열을 갖는 핵산의 전부 또는 일부를 증폭시키는 박스 또는 키트인데, 상기 박스 또는 키트는 다음을 포함한다:

a)하이브리드화 위치가 증폭시키고자 하는 표적 핵산의 5' 쪽 및 3' 쪽에 각각 위치하는, 본 발명에 따른 한쌍의 뉴클레오타이드 프라이머;

b)경우에 따라, 증폭반응에 필요한 반응물.

그러한 증폭 박스 또는 키트는 유리하게는, 적어도 한 쌍의 상기 뉴클레오타이드 프라이머를 포함할 것이다.

첫번째 바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따른 프라이머는 상기한 최초의돌연변이(결실/삽입)를 포함하는 ABC1 유전자 엑손 12 영역의 증폭을 가능하게 하는 뉴클레오타이드 서열번호 109 및 110의 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부, 또는 상보 서열을 갖는 핵산을 포함한다.

두번째 바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따른 프라이머는 상기 두번째 돌연변이(G 염기의 결실)를 포함하는 ABC1 유전자 엑손 13 영역의 증폭을 가능하게 하는 뉴클레오타이드 서열번호 111 및 112의 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부, 또는 상보 서열을 갖는 핵산을 포함한다.

세번째 바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따른 프라이머는, 일반적으로, 뉴클레오타이드 서열번호 109-138의 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부, 또는 상보 서열을 갖는 핵산을 포함한다.

네번째 바람직한 양태에 따르면, 또한 본 발명은 서열번호 97-108의 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 또는 상보 서열을 갖는 핵산의 적어도 15 개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 프라이머에 관한 것인데, 프라이머의 3' 말단 염기는 서열번호 97-108의 서열 또는 이들의 상보 서열 중 하나의 다형성 염기의 5' 쪽에 바로 인접하여 위치한 뉴클레오타이드에 상보적이다.

또다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 서열번호 97-108의 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 또는 상보 서열을 갖는 핵산의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 프라이머에 관한 것인데, 프라이머의 3' 말단 염기는 서열번호 97-108의 서열 또는 이들의 상보 서열의 중 하나의 다형성 염기의 5' 쪽의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20 뉴클레오타이드 또는 그 이상에 위치하거나 바로 인접하여 위치한 뉴클레오타이드에 상보적이다. 3' 말단의 뉴클레오타이드가 서열번호 97-108의 서열 중 하나의 다형성 염기의 5' 쪽의 20개 이상의 뉴클레오타이드에 위치한 뉴클레오타이드에 상보적인 프라이머를 작제하기 위해, 당업자라면 유리하게 서열번호 1-14 또는 서열번호 15-47 및 48-90의 서열 가운데 대립유전자 성질을 알고자 하는 다형성을 포함하는 대응하는 게놈 서열을 참고할 것이다.

그러한 프라이머는 특히 피검자의 유전자형을 밝히는 방법 및/또는 집단의 유전자형을 밝히는 방법의 수행과정에서 유용하며, 특히 피검자내의 특정 대립 유전자형 또는 대립유전자 그룹의 특정 형태(반수형)와 그 피검자내의 특정 표현형 (형질), 예를 들면 그 피검자가 콜레스테롤의 역수송에 있어서의 결핍에 관련된 질환을 발생시키는 경향, 또는 대안적으로 그 피검자가, 어떠한 병리의 원인이 되는 염색체 영역이 9번 염색체 상에, 보다 정확하게는 9q 아암 상에 그리고 보다 더 정확하게는 9q31 좌위에 위치하는 병리를 발생시키는 경향과의 연관성에 대한 연구과정에서 유용하다.

재조합 벡터

또한 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

유리하게는, 그러한 재조합 벡터는 하기의 핵산으로부터 선택되는 핵산을 포함할 것이다:

a)서열번호 92의 서열 또는 이의 생물학적 활성 단편을 갖는 핵산;

b)서열번호 91, 94 또는 96의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산;

c)서열번호 15-47 및 48-90의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산;

d)서열번호 15-47 및 48-90의 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 또는 단편 또는 이들의 변이체와 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산;

e)서열번호 15-47 및 48-90의 서열을 갖는 핵산 또는 단편 또는 이들의 변이체와 고 엄격 하이브리드화 조건하에서 하이브리드화하는 핵산.

본 발명의 목적을 위한 "벡터"는 일본쇄 또는 이본쇄 중 어느 한 형태인 환형 또는 선형 DNA 또는 RNA 분자를 의미하는 것으로 이해될 것이다.

첫번째 양태에 따르면, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 바람직한 세포숙주의 형질전환 또는 형질감염 후 그에 삽입된 핵산을 증폭하는 데 사용된다.

두번째 양태에 따르면, 본 발명에 따른 핵산 외에도, 전사 및/또는 해독을 지시할 수 있는 조절 서열을 포함하는 발현벡터에 해당한다.

유리한 양태에 따르면, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 특히 하기 성분을 포함할 것이다:

(1)프로모터 및 인핸서 서열과 같은, 삽입될 핵산의 발현을 조절하는 성분;

(2)본 발명에 따라서 벡터내로 삽입될 핵산에 함유된 암호화 서열(상기 암호화 서열은 (1)에 기재된 조절 시그널과 동일상으로 위치된다);

(3)전사의 개시 및 종결을 위한 적당한 서열.

또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 증폭 또는 발현을 원하는 세포 숙주내에서의 하나 이상의 복제 기원, 마커 또는 선별 마커를 포함할 수 있다.

예로서, 박테리아 프로모터는 LacI 또는 LacZ 프로모터, T3 또는 T7 박테리오파아지 RNA 폴리머라제 프로모터, 람다 파아지 PR 또는 PL 프로모터일 수 있다.

진핵세포 프로모터는 HSV 바이러스 티미딘 키나제 프로모터 또는 대안적으로 마우스 메탈로티오네인-L 프로모터를 포함할 것이다.

일반적으로, 적합한 프로모터의 선택을 위해서, 당업자라면 유리하게 위에서 언급한 Sambrook et al. (1989)의 저서 또는 Fuller et al. (1996)의 기술을 참고할 수 있다.

ABC1 유전자의 게놈 서열을 발현시키고자 하는 때에는, 거대한 삽입 서열을 함유할 수 있는 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 양태로는, Sternberg (1992, 1994)에 기재된 벡터 p158 또는 벡터 p158/neo8 등의 P1 박테리오파아지 벡터와 같은 박테리오파아지 벡터가 바람직하게 사용될 것이다.

본 발명에 따른 바람직한 박테리아 벡터는 예를 들면, 벡터 pBR322(ATCC37017) 또는 대안적으로 pAA223-3(Pharmacia, Uppsala, Sweden), 및 pGEM1(Promega Biotech, Madison, WI, UNITED STATES)과 같은 벡터이다.

또한, 그외 시판 벡터로는 벡터 pQE70, pQE60, pQE9(Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG(Stratagene)과 같은 벡터가 언급될 수 있다.

또한, 스포돕테라 프루지페르다 유래의 Sf9 세포주(ATCC No. CRL 1711)의 세포를 형질감염시키는 데 사용된 벡터 pVL1392/1393(Pharmingen)과 같은 바큘로바이러스형의 벡터일 수 있다.

또한, 유형 2 또는 5의 인간 아데노바이러스와 같은 아데노바이러스 벡터일 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 또한, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노-수반 벡터(AAV)일 수 있다. 그러한 아데노-수반 벡터는 예를 들면 Flotte et al. (1992), Samulski et al. (1989), 또는 McLaughlin BA et al. (1996)에 기재된 것이다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드의 발현이 가능하려면, 숙주세포내로 도입되어야 한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드의 숙주세포내로의 도입은 시험관내에서, 프라이머 배양에서 또는 세포주의 형태로, 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 당업자에 널리 알려져 있는 기술에 따라 수행될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 콜레스테롤의 역수송에 있어서의 결핍과 연관된 질환의 예방 또는 치료를 위해 생체내 또는 생체외에서 도입시키는 것이 가능하다.

숙주세포내로 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 도입하기 위해, 당업자라면 유리하게 칼슘 포스페이트 침전 기술(Graham et al., 1973; Chen et al., 1987), DEAE 덱스트란(Gopal, 1985), 전기투공(Tur-Kaspa, 1896; Potter et al., 1984), 직접 미세주사(Harland et al., 1985), DNA가 채워진 리포솜(Nicolau et al., 1982; Fraley et al., 1979)와 같은 다양한 기술을 참고할 수 있다.

일단 폴리뉴클레오타이드가 숙주세포에 도입되면, 세포의 게놈내로 안정하게통합될 수 있다. 통합은 게놈의 상동 재조합에 의해 정확한 위치에서 이루어질 수 있으며, 또는 랜덤하게 통합될 수도 있다. 몇몇 양태에서는, 폴리뉴클레오타이드가 에피솜 단편의 형태로 숙주세포내에 안정하게 유지될 수 있는데, 에피솜은 독립적으로 또는 세포주기와 동시적으로 후자의 보존 및 복제를 가능하게 하는 서열이 포함되어 있다.

구체적인 양태에 따르면, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포, 특히 포유동물로부터 수득된 숙주세포로, 생체내에서, 도입하는 방법은 약학적으로 허용가능한 벡터 및 적합한 조절 서열의 통제하에 위치된 "네이키드" 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제제가 선택된 조직, 예를 들어, 평활근 조직의 수준에서 국소 주사함으로써 도입하여, 상기 "네이키드" 폴리뉴클레오타이드가 상기 조직의 세포에 의해 흡수되도록 하는 단계를 포함한다.

생체외 및 생체내 용도의 "네이키드" 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 예를 들어 Tacson et al. (1996) 및 Huygen et al. (1996)의 논문 뿐만 아니라 PCT 출원번호 제 WO 95/11307 호(Institut Pasteur, Inserm, University of Ottawa)에 기재되어 있다.

본 발명의 양태에 따르면, 조성물이 ABC1 단백질의 생체내 생산을 위해 제공된다. 이러한 조성물은 적합한 조절 서열의 통제하에 위치된 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 생리학적으로 허용되는 벡터내에 용액으로서 포함한다.

선택된 숙주 기관에 주입되는 벡터량은 주입되는 위치에 따라 달라진다. 하나의 가이드로서, ABC1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 약 0.1 내지 약 100 ㎍을 동물의 체내에, 바람직하게는 콜레스테롤 역수송 이상과 연관된 질환 발병 경향이 있거나 이미 그러한 질환이 발병한 환자, 특히 탠지어병의 발병 가능성을 갖거나 이미 그러한 질환이 발병한 환자의 몸에 주사할 수 있다.

궁극적으로, 본 발명은 또한 콜레스테롤 역수송 기능장애에 걸린 피검자의 예방 또는 치료를 목적으로 하는, ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 하나 이상의 생리학적으로 상용성인 부형제와 함께 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

유리하게는, 그러한 조성물은 적합한 조절 서열의 통제하에 놓인 서열번호 91의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 것이다.

본 발명의 과제는, 또한, 콜레스테롤 역수송 기능장애에 걸린 피검자의 예방 또는 치료를 목적으로 하는, 본 발명에 따른 재조합 벡터를 하나 이상의 생리학적으로 상용성인 부형제와 함께 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증을 예방하는, 보다 구체적으로는 콜레스테롤 역수송 기능장애에 걸린 피검자를 치료하는 약제를 제조하는 데에 사용하는 것에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증을 예방하는, 보다 구체적으로는 콜레스테롤 역수송 기능장애에 걸린 피검자를 치료하는 약제를 제조하는 데에 사용하는 것에 관한 것이다.

체세포 유전자 요법에 유용한 벡터 및 그러한 벡터를 함유하는 조성물

본 발명은 또한 콜레스테롤의 수송과 관련된 병리의 치료를 위한 신규한 치료적 접근방법에 관한 것이다. 콜레스테롤의 수송과 관련된 병리의 유전자 요법에 의한, 즉 상기 콜레스테롤의 수송 및 대사에 관련된 ABC1 단백질을 암호화하는 유전자의 생체내 수송 및 발현에 의해 치료가능함을 입증함으로써 선행기술의 문제점에 대한 해법을 제공하고 있다. 본 발명은 그러므로 예를 들면, 아테롬성동맥경화증과 같은 관련 병리의 특이적이고 효과적인 치료를 위한 간단한 수단을 제공하고 있다.

유전자 요법은 결함 또는 이상(돌연변이, 비정상적 발현 등)을 교정하는 것이며 세포나 기관 내로 유전정보를 도입시킴으로써 치료적 관심대상인 단백질을 발현시키는 것이다. 이러한 유전정보는 생체외에서 기관으로부터 추출된 세포내로 도입하고 변형된 세포를 그후 체내로 재도입하거나, 직접 생체내에서 적합한 조직으로 도입시킨다. 두번째 경우에는, 다양한 기술이 존재하는데, DNA와 DEAE 덱스트란의 복합체(Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), DNA와 핵 단백질의 복합체(Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), DNA와 지방의 복합체(Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), 리포솜의 이용(Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431) 등과 관련된 다양한 기술이 있다. 보다 최근에는, 유전자 전달에 벡터와 같이 바이러스를 이들 물리적 형질감염 기술에 대한 신뢰할만한 대안으로 사용하는 예가 나타나고 있다. 이와 관련하여, 다양한 바이러스에 대해 특정 세포 집단을 감염시킬 수 있는 능력이 시험되고 있다. 특히 레트로바이러스(RSV, HMS,MMS, 등), HSV 바이러스, 아데노-수반 바이러스 및 아데노바이러스들이 그것이다.

그러므로, 본 발명은 또한 ABC1을 암호화하는 유전자를 생체내로 수송하여 생체내 발현시키는 것으로 구성되는, 콜레스테롤의 수송과 관련된 병리의 치료를 위한 새로운 치료법적 접근에 관한 것이다. 특히 유리한 방식으로, 본 출원인은 콜레스테롤 대사에 관련된 ABC1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 재조합 바이러스를 작제하고 이 재조합 바이러스를 생체내 투여하는 것이 가능하며, 이러한 투여로 어떠한 세포병리 효과도 없이 생체내에서 생물학적 활성을 가진 ABC1 단백질을 안정적이고 효과적으로 발현되도록 할 수 있음을 이제 확인하였다.

본 발명은 또한 아데노바이러스가 ABC1 유전자의 수송 및 발현에 있어 특별히 효율적인 벡터를 구성함을 입증함으로부터 이루어진 것이다. 구체적으로, 본 발명은 벡터로 재조합 아데노바이러스를 사용함으로써 바람직한 치료효과를 수득하기에 충분하게 높은 수준으로 상기 유전자가 발현되는 것이 가능하게 됨을 보여주고 있다. 상기 유전자의 안정한 발현을 가능하게 하는, 레트로바이러스 또는 아데노-수반 바이러스(AAV)와 같은 그외 다른 바이러스 벡터 역시 청구하는 바이다.

그러므로, 본 발명은 콜레스테롤 수송의 이상에 관련된 심혈관성 및 신경학적 병리의 치료 및 예방에 있어 새로운 접근을 제공한다.

그러므로, 본 발명의 주제는 또한 콜레스테롤 대사에 관련된 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산서열을 함유하는 결손 재조합 바이러스이다.

또한 본 발명은 심혈관성 질환의 치료 및/또는 예방을 목적으로 하는 약학 조성물의 제조에 있어 그러한 결손 재조합 바이러스의 용도에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 바이러스에 의해 생체외에서 유전자 변형 세포 또는 바이러스와 같은 생산 세포의, 체내에 이식되어 생물학적 활성을 갖는 ABC1 유전자를 지속적이고 효과적으로 생체내에서 발현하도록 하는 용도에 관한 것이다.

본 발명은 ABC1을 암호화하는 DNA 서열을 바이러스 벡터에 통합시킬 수 있으며, 이들 벡터는 생물학적 활성을 갖는 성숙한 형태를 효과적으로 발현시킬 수 있음을 보여주고 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은 아데노바이러스의 직접 투여 또는 생산 세포 또는 아데노바이러스나 그러한 DNA를 혼입하는 레트로바이러스에 의해 유전자 변형된 세포의 이식에 의해 ABC1의 생체내 발현이 수득될 수 있음을 보여주고 있다.

본 발명은 ABC1 단백질의 발현에 정상적으로 관여되지 않는 기관내에서 ABC1의 조절된 발현을 어떠한 유해한 효과도 없이 유도할 수 있다는 점에서 특히 유리하다. 구체적으로, 본 발명의 벡터를 생산하는 세포의 이식 또는 본 발명의 벡터로 생체외에서 감염된 세포의 이식에 의해 ABC1 단백질이 현저하게 방출된다.

본 발명의 맥락에서 생산되는 콜레스테롤 수송의 활성은 인간 또는 동물 ABC1 유형의 활성일 것이다. 본 발명에서 사용되는 핵산 서열은 cDNA, 게놈 DNA(gDNA), RNA(레트로바이러스의 경우임) 또는, 예를 들어, 하나 이상의 인트론이 삽입될 cDNA로 구성되는 하이브리드 작제물일 수 있다. 또한, 합성 또는 반합성 서열을 수반할 수 있다. 특히 유리한 방식으로서, cDNA 또는 gDNA가 사용된다. 구체적으로, gDNA를 사용하면 인간 세포내에서 보다 양호한 발현이 이루어진다. 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 혼입시키기 위해, 이들 서열을 특히 적합한 제한효소부위의 혼입을 위해 유리하게 변형시키는데, 예를 들면 부위-지향성 돌연변이유발에 의해 변형시킨다. 선행기술에 기술된 상기 서열은 본 발명에 따른 용도를 위해 작제된 것이 아니며, 실질적인 발현을 수득하기 위해서는 사전 변용이 필요할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 인간 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 이용함이 바람직하다. 더욱이, 이러한 ABC1 단백질의 유도체를 암호화하는 작제물을 이용하는 것이 가능하다. 이러한 ABC1 단백질의 유도체는, 예를 들면, 네이티브 서열에 대해 돌연변이, 결실 및/또는 첨가로 수득되고, 콜레스테롤 수송 활성을 갖는 산물을 암호화하는 서열이라면 어떠한 서열이든 포함한다. 이러한 변형은 당업자에게 알려진 기술에 의해 이루어질 수 있다(하기 일반 분자 생물학 기술 참고). 그러므로, 유도체의 생물학적 활성은 그후 세포로부터의 콜레스테롤 유출을 측정하는 실시예를 통해 구체적으로 언급되었듯이, 쉽게 측정될 수 있다. 본 발명의 목적에 따른 유도체는 또한 네이티브 서열 또는 그의 단편을 탐침으로 사용하여, 핵산 라이브러리로부터 하이브리드화를 통해 수득할 수 있다.

이러한 유도체는 구체적으로 이들이 결합 부위에 대한 높은 친화성을 갖는 분자, 프로테아제에 대한 보다 높은 내성을 보이는 분자, 보다 높은 치료 효과 또는 보다 적은 부작용, 또는 임의적으로 새로운 생물학적 성질을 갖는 분자이다. 또한 유도체에는 생체내에서 발현이 향상되도록 변형된 DNA 서열이 포함된다.

첫번째 양태에서, 본 발명은 콜레스테롤의 수송과 대사에 관련된 ABC1 단백질을 암호화하는 cDNA 서열을 포함하는 결손 재조합 바이러스에 관한 것이다. 또다른 바람직한 양태에서, DNA 서열은 gDNA 서열이다.

본 발명의 벡터는 다양한 유형의 바이러스로부터 제조될 수 있다. 바람직하게는, 아데노바이러스, 아데노-수반 바이러스(AAV), 허피스바이러스(HSV) 또는 레트로바이러스 유래 벡터가 사용된다. 직접 투여 또는 이식하고자 하는 세포의 생체외 변형을 위해서는 아데노바이러스를, 또는 생산 세포의 이식을 위해서는 레트로바이러스를 이용하는 것이 가장 특히 유리하다.

본 발명에 따른 바이러스는 결손, 즉 표적세포내에서 자가 복제 할 수 없는 결손 바이러스이다. 일반적으로, 본 발명에서 사용된 결손 바이러스의 게놈은 따라서, 적어도 감염된 세포내에서의 상기 바이러스의 복제에 필수적인 서열이 결핍되어 있다. 이들 영역은 (완전히 또는 부분적으로) 제거되거나, 비기능성으로 되거나, 다른 서열 특히, ABC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열로 치환될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 바람직하게는, 결손 바이러스는 바이러스 입자의 캡시드화에 필수적인 게놈 서열은 보유한다.

보다 구체적으로 아데노바이러스에 대해서는, 구조와 성질이 다소 다양한, 여러가지의 혈청형으로 특징지어졌다. 이들 혈청형중, 유형 2 또는 5의 인간 아데노바이러스(Ad 2 또는 Ad 5) 또는 동물기원의 아데노바이러스(출원번호 제 WO 94/ 26914 참고)가 본 발명에 바람직하게 사용된다. 본 발명에 사용될 수 있는 동물기원의 아데노바이러스에는, 개, 소, 쥐(예: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 조류 또는 원숭이(예: SAV) 기원의 아데노바이러스를 언급할 수 있다. 바람직하게는, 동물기원의 아데노바이러스는 개 유래의 아데노바이러스이며, 보다 바람직하게는, CAV2 아데노바이러스이다[예: Manhattan 또는 A26/61스트레인(ATCC VR-800)]. 바람직하게는, 인간 또는 개 또는 혼합 기원의 아데노바이러스가 본 발명에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 결손 아데노바이러스에는 ITR, 캡시드화 서열 및 ABC1 단백질을 암호화하는 서열이 포함된다. 유리하게는, 본 발명의 아데노바이러스의 게놈내에서, 적어도 E1 영역이 비기능성이 된다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명의 아데노바이러스의 게놈내에서, E1 유전자 및 E2, E4 및 L1-L5 유전자 중 적어도 하나가 비기능성이 된다. 상기 고려된 바이러스 유전자는 당업자에게 잘 알려진 기술 어느 것에 의해서든 비기능성으로 만들 수 있는데, 특히, 전체 억제, 치환, 부분 결실 또는 상기 유전자내 하나 이상의 염기의 삽입에 의해 비기능화시킬 수 있다. 그러한 변형은 시험관내(분리된 DNA 상) 또는 현장에서, 예를 들어, 유전공학 기술을 이용하거나, 돌연변이 유발 물질에 의한 처리로 이루어질 수 있다. 그외 다른 영역이 또한 변형될 수 있는데, 특히 E3(WO95/02697), E2(WO94/28938), E4(WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) 및 L5(WO95/02697) 부위가 그것이다. 바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따른 아데노바이러스는 E1 및 E4 부위에서의 결실을 갖고 있으며, ABC1 암호화 서열이 불활성화된 E1 부위 수준에서 삽입된다. 또다른 바람직한 양태에 따르면, E1 영역에서의 결실을 가지며, E4 부위 수준에서 ABC1 암호화 서열이 삽입된다(프랑스 특허 출원번호 제 FR94 13355 호).

본 발명에 따른 결손 재조합 아데노바이러스는 당업자에 알려져 있는 어떤 기술에 의해서든 제조될 수 있다(Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). 구체적으로, 아데노바이러스와 특히 ABC1단백질을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 간의 상동 재조합에 의해 제조될 수 있다. 상동 재조합은 상기 아데노바이러스와 플라스미드를 적당한 세포주에 함께 형질감염시킨 후 일어난다. 사용되는 세포주는 바람직하게는 (i) 상기 성분들에 의해 형질전환 가능해야 하며, (ii) 결손 아데노바이러스 게놈부분을 상보할 수 있는 서열을, 바람직하게는 재조합의 위험을 회피할 수 있도록 통합된 형태로 함유하고 있어야 한다. 세포주의 예로는, Ad5 아데노바이러스의 게놈의 좌측 부분(12%)을 게놈내에 통합된 형태로 포함하는 인간 배 신장 세포주 293(Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1997) 59) 또는 특히 출원번호 제 WO 94/26914 및 WO 95/02697 호에 기재된 바와 같은 E1 및 E4 기능을 상보할 수 있는 세포주가 언급될 수 있다.

다음으로, 증식된 아데노바이러스를 실시예에 기재된 바와 같이, 보편적인 분자생물학적 기술에 따라 회수 및 정제한다.

아데노-수반 바이러스(AAV)와 관련하여, 이들은 상대적으로 작은 크기의 DNA 바이러스이며, 이들이 감염시키는 세포의 게놈 중으로 안정하고 부위-특이적 방식으로 통합된다. 이들은 세포 생장, 형태 또는 분화에 영향을 미침이 없이 광범위한 세포를 감염시킬 수 있다. 또한, 이는 인간의 병리와는 관련이 없는 것 같다. AAV의 게놈이 클로닝되어, 서열분석된 다음 특징규명되었다. 이는 약 4700개 염기를 포함하고, 각 말단에 약 145개 염기의 역 반복 영역(ITR)을 함유하고 있어, 바이러스에 대한 복제 기원으로서 작용한다. 게놈의 나머지 부위는 캡시드화 기능을 운반하는 2개의 필수 영역으로 나눠진다: rep 유전자를 함유한 게놈의 좌측 부위는 바이러스 복제 및 바이러스 유전자의 발현과 관련되고; cap 유전자를 함유한 게놈의 우측 부위는 바이러스 캡시드 단백질을 암호화한다.

시험관내 및 생체내에서 유전자의 전달을 위해 AAV에서 유도된 벡터의 사용에 관해 문헌에 공지되어 있다(특히 WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528 참조). 이들 출원은 rep 및/또는 cap 유전자가 결실되고 해당 유전자에 의해 대체된 AAV에서 유도된 다양한 작제물과, 시험관내(배양액내 세포상에서) 또는 생체내(유기체 안으로 직접)에서 해당 유전자의 전달을 위한 이의 용도에 관해 기술하고 있다. 그러나, 이들 문헌 중 어느 곳에도 ABC1 단백질의 생체내 또는 생체외 전달 및 발현을 위한 재조합 AAV의 용도, 또는 이러한 전달의 이점에 관해 기재하거나 암시하고 있지 않다. 본 발명에 따른 결손 재조합 AAV는 인간 헬퍼 바이러스(예, 아데노바이러스)로 감염된 세포주 안으로, 두 개의 AAV 역 반복 영역(ITR)에 의해 구분된 ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 함유한 플라스미드와 AAV 캡시드화 유전자(rep 및 cap 유전자)를 운반하는 플라스미드의 동시 형질감염에 의해 제조될 수 있다. 생성된 재조합 AAV는 통상적인 기술에 의해 정제된다.

허피스바이러스와 레트로바이러스의 경우, 재조합 벡터의 작제는 문헌에 광범위하게 기재되어 있다: 특히 Breakfield et al., New Biologist 3(1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7(1985) 235; McCormick, BioTechnology 3(1985) 689 등 참조.

특히, 레트로바이러스는 분열중인 세포를 감염시키는 통합성 바이러스이다.레트로바이러스의 게놈은 필수적으로 두 개의 LTR, 하나의 캡시드화 서열 및 세 개의 암호화 영역(gag, pol 및 env)을 포함한다. 레트로바이러스에서 유도된 재조합 벡터에서, gag, pol 및 env 유전자는 일반적으로 완전히 또는 부분적으로 결실되어, 해당 이종 핵산 서열로 대체된다. 이러한 벡터는 다양한 종류의 레트로바이러스, 예를 들어 특히 MoMuLV("쥐 몰로니 백혈병 바이러스"; 소위 MoMLV), MSV("쥐 몰로니 육종 바이러스"), HaSV("하비 육종 바이러스"), SNV("비장 괴사 바이러스"), RSV("라우스 육종 바이러스") 또는 프렌드 바이러스로부터 생성될 수 있다.

본 발명에 따른 ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 함유하고 있는 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위해, 특히 LTR, 캡시드화 서열 및 암호화 서열을 함유한 플라스미드를 일반적으로 작제한 다음, 이를 이용하여 소위 캡시드화 세포주를 형질감염시켜, 플라스미드에서 결여된 레트로바이러스 기능을 트랜스로 제공할 수 있다. 일반적으로, 캡시드화 계통은 gag, pol 및 env 유전자를 발현시킬 수 있다. 이러한 캡시드화 계통, 특히 PA317 계통(US 4,861,719), PsiCRIP 계통(WO 90/02806) 및 GP+envAm-12 계통(WO 89/07150)은 선행 기술에 공지되어 있다. 또한, 재조합 레트로바이러스는 전사 활성을 억제하기 위해 LTR 수준에서 변형과, gag 유전자의 일부를 함유한 연장된 캡시드화 서열을 함유할 수 있다(Bender et al., J. Virol. 61(1987) 1639). 생성된 재조합 레트로바이러스는 통상적인 기술에 의해 정제된다.

본 발명을 수행하기 위해, 결손 재조합 아데노바이러스를 이용함이 가장 유리하다. 하기에 주어진 결과는 콜레스테롤 수송 활성을 가진 단백질의 생체내 발현을 위한 아데노바이러스의 특히 유리한 성질을 입증해 준다. 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 정제된 현탁액의 생체내 직접 투여, 또는 이식 측면에서 세포, 특히 자기유래 세포의 생체외 형질전환에 특히 유리하다. 또한, 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 부가적으로 특히 매우 높은 감염 효율과 같은 상당한 이점을 나타내어, 적은 분량의 바이러스 현탁액을 이용하여 감염을 수행할 수 있다.

본 발명의 또다른 특히 유리한 양태에 따르면, ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 함유한 레트로바이러스 벡터를 생성하는 계통은 생체내에서 이식에 이용된다. 이러한 목적에 이용될 수 있는 계통은 특히 본 발명에 따른 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 함유한 레트로바이러스를 생산할 수 있도록 변형된 PA317(US 4,861,719), PsiCrip(WO 90/02806) 및 GP+envAm-12(US 5,278,056) 세포이다. 예를 들어, 혈구 계통의 전구체인 분화전능성 줄기 세포를 피검자로부터 수집하여 분리할 수 있다. 이들 세포는 배양될 경우 바이러스, 비-바이러스 또는 대식세포에 특이적인 비-바이러스 프로모터의 통제하에 또는 자신의 프로모터의 통제하에 ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 함유한 레트로바이러스 벡터로 형질감염될 수 있다. 이러한 세포는 피검자 안으로 재도입된다. 이들 세포의 분화가 ABC1 단백질을 발현시키는 혈구, 특히 대식세포로 형질전환될 때 동맥 벽에서 콜레스테롤의 제거에 참여하는 단핵구에 의해 일어날 것이다. ABC1 단백질을 발현시키는 이러한 대식세포는 과량의 콜레스테롤을 대사하는 증가된 능력을 가질 것이고 막 콜레스테롤의 1차 수용체에 의해 제거되기 위해 세포 표면에 접근할 것이다.

유리하게는, 본 발명의 벡터에서, ABC1 단백질을 암호화하는 서열은 감염된세포에서 발현을 허용하는 시그널의 통제하에 놓이게 된다. 이는 상동성 또는 이종성인 발현 시그널, 즉, 본래 ABC1 단백질의 발현을 담당하는 시그널과는 다른 시그널일 수 있다. 이는 또한 특별히 다른 단백질의 발현을 담당하는 서열, 또는 합성 서열일 수 있다. 특히, 이는 특이적 방식으로 또는 비특이적 방식으로, 유도식으로 또는 비유도식으로 유전자의 전사를 자극하거나 억제시키는 진핵생물 또는 바이러스 유전자의 서열 또는 유도 서열일 수 있다. 예를 들면, 이는 감염을 원하는 세포의 게놈, 또는 바이러스의 게놈에서 유도된 프로모터 서열, 특히 아데노바이러스의 E1A 또는 MLP 유전자의 프로모터, CMV 프로모터, RSV-LTR 등일 수 있다. 진핵생물 프로모터 중에서, 편재성 프로모터(HPRT, 비멘틴, α-액틴, 튜불린 등), 중간 필라멘트의 프로모터(데스민, 뉴로필라멘트, 케라틴, GFAP 등), 치료 유전자의 프로모터(MDR, CFTR 또는 인자 VIII형 등), 조직-특이성 프로모터(피루베이트 키나제, 빌린, 지방산 결합 장 단백질의 프로모터, 평활근 세포 α-액틴의 프로모터, 간에 특이적인 프로모터; Apo Al, Apo All, 인간 알부민 등) 또는 자극에 상응하는 프로모터(스테로이드 호르몬 수용체, 레티노산 수용체 등)이 언급될 수 있다. 부가적으로, 이러한 발현 서열은 인핸서 또는 조절 서열 등의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 또한, 삽입된 유전자가 발현 서열을 함유하지 않을 경우, 이는 이러한 서열의 하류에 놓인 결손 바이러스의 게놈 안으로 삽입될 수 있다.

특정 양태에서, 본 발명은 RSV-LTR 또는 CMV 초기 프로모터 중에서 선택된 프로모터의 통제하에 콜레스테롤의 대사에 관여하는 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 결손 재조합 바이러스에 관한 것이다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 또한 콜레스테롤의 수송과 연관된 병리의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물의 제조를 위한 앞서 기재된 바이러스의 사용에 관한 것이다.

본 발명은 또한 앞서 기재된 1 이상의 결손 재조합 바이러스를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이러한 약학 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안구내 또는 경피 경로 등에 의한 투여용으로 제형될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 특히 환자의 문정맥 안으로의 경우처럼 정맥내 주사의 경우에 주사가능한 제형을 위해 약학적으로 허용가능한 비히클을 함유한다. 이는 특히 등장성 멸균액, 또는 건조, 특히 동결-건조된 조성물과 관계되며, 후자의 경우, 멸균수 또는 생리 식염수의 경우에 따른 첨가시 주사액을 제조할 수 있다. 환자의 문정맥으로 직접 주사가 유리한데 그 이유는 간 수준에서 감염을 표적화하여 이러한 기관 수준에서 치료 효과를 집중시킬 수 있기 때문이다.

주사용으로 이용된 결손 재조합 바이러스의 투여량은 각종 파라미터, 특히 바이러스 벡터, 사용된 투여방식, 관련 병리 또는 원하는 치료 기간에 따라 조절될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 10⁴내지 10¹⁴pfu/ml, 바람직하게는 10⁶내지 10¹⁰pfu/ml의 투여량으로 제형되어 투여된다. 용어 pfu("플라크 형성 단위")는 바이러스 용액의 감염도에 상응하고, 적절한 세포 배양액을 감염시킨 다음 일반적으로 48시간 후에 감염된 세포의 플라크 수를 측정하여 결정된다. 바이러스 용액의 pfu 역가를 측정하는 기술은 문헌에 자세히 수록되어있다.

레트로바이러스의 경우에, 본 발명에 따른 조성물은 이식의 측면에서 생산 세포를 직접 함유할 수 있다.

이러한 관점에서, 본 발명의 또다른 주제는 앞서 기재된 1 이상의 결손 재조합 바이러스로 감염된 임의의 포유동물 세포에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 이러한 바이러스로 감염된 인간 세포 집단에 관한 것이다. 이는 특히 혈액 기원의 세포(분화 전능성 줄기 세포 또는 전구체), 섬유아세포, 근육세포, 간세포, 피부 세포, 평활근 및 내피 세포, 신경교 세포 등일 수 있다.

본 발명에 따른 세포는 1차 배양액에서 유도될 수 있다. 이는 당업자에게 공지된 기술에 의해 수집된 다음 증식 허용 조건하에 배양된다. 좀더 구체적으로 섬유아세포의 경우, 이는 예를 들면 문헌[참조: Ham, Methods Cell. Biol. 21a (1980) 255]에 기재된 기술에 따라 생체 검사를 통해 쉽게 수득할 수 있다. 이러한 세포는 바이러스를 이용한 감염에 직접 이용되거나, 차후 사용의 관점에서 자기유래 라이브러리의 확립을 위해 동결건조에 의해 보관될 수 있다. 본 발명에 따른 세포는 미리확립된 라이브러리에서 수득된 2차 배양액일 수 있다(예를 들어 EP 228458, EP 289034, EP 400047, EP 456640 참조).

배양액내 세포는 재조합 바이러스로 감염되어, 생물학적으로 활성인 ABC1 단백질을 생산하는 능력을 부여한다. 감염은 당업자에게 공지된 기술에 따라 시험관내에서 수행된다. 특히, 사용된 세포 종류와 세포당 원하는 바이러스 카피 수에 따라, 당업자는 감염 중복도와 임의로는 생산되는 감염 사이클의 횟수를 조절할 수있다. 이러한 단계는 세포가 생체내 투여를 위한 경우에 적절한 멸균 조건하에 수행되어야 한다. 세포 감염에 이용된 재조합 바이러스의 투여량은 원하는 목적에 따라 당업자가 조절할 수 있다. 생체내 투여를 위한 앞서 기재된 조건은 시험관내 감염에 적용될 수 있다. 레트로바이러스를 이용한 감염의 경우에, 본 발명에 따른 재조합 레트로바이러스를 생산하는 세포로 감염되길 원하는 세포를 함께 배양할 수 있다. 이로 인해 레트로바이러스의 정제가 필요없을 수 있다.

본 발명의 또다른 주제는 앞서 기재된 1 이상의 결손 재조합 바이러스로 감염된 포유동물 세포 또는 재조합 바이러스를 생산하는 세포, 및 세포외 매트릭스를 포함하는 이식 조직편에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이식 조직편은 10⁵내지 10¹⁰세포를 포함하고, 좀더 바람직하게는, 10⁶내지 10⁸세포를 포함한다.

좀더 구체적으로 말하면, 본 발명의 이식 조직편에서, 세포외 매트릭스는 겔형성 화합물과, 임의적으로, 세포를 정박시키는 지지체를 포함한다.

본 발명에 따른 이식 조직편의 제조를 위해, 다양한 종류의 겔화제가 이용될 수 있다. 이러한 겔화제는 겔 구성을 지닌 매트릭스에 세포의 혼입, 및 적절한 경우에, 지지체상에 세포의 정박을 촉진시키는 데 사용된다. 다양한 세포 부착제, 특히 콜라겐, 젤라틴, 글리코사미노글리칸, 피브로넥틴, 렉틴 등이 겔화제로서 이용될 수 있다. 바람직하게는, 콜라겐이 본 발명의 맥락에서 이용된다. 이는 인간, 소 또는 쥐 기원의 콜라겐일 수 있다. 좀더 바람직하게는, I형 콜라겐이 이용된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 유리하게는 세포를 정박시킬 수 있는 지지체를 포함한다. 용어 정박은 지지체에 세포의 접착 및/또는 부착을 야기하는 생물학적 및/또는 화학적 및/또는 물리적 상호작용 형태를 말한다. 또한, 세포는 사용된 지지체를 덮거나, 이러한 지지체 내부를 통과하거나, 둘 모두의 경우일 수 있다. 본 발명의 문맥상 고체의, 무독성 및/또는 생체적합성 지지체를 사용함이 바람직하다. 특히, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 섬유 또는 생물학적 기원의 지지체를 사용할 수 있다.

본 발명은 콜레스테롤의 수송과 연관된 병리, 특히 비만, 고트리글리세라이드혈증, 또는 심장혈관 질환 영역에서, 심근 경색, 앙기나, 돌연사, 심장의 대상부전 및 뇌혈관 발작의 치료 또는 예방에 매우 효과적인 수단을 제공한다.

부가적으로, 이러한 치료법은 인간과 동물, 예를 들면 양, 소, 가축(개, 고양이 등), 말, 어류 등 모두에 적용될 수 있다.

재조합 숙주세포

본 발명은 또한 본 발명의 핵산, 좀더 구체적으로 말하면 서열번호 91, 94 또는 96을 지닌 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.

또다른 측면에 따르면, 본 발명은 상술된 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.

본 발명에 따른 바람직한 숙주세포는 예를 들면 하기와 같다:

a) 원핵생물 숙주세포: 에쉐리키아 콜라이(균주 DH5-α), 바실러스 서브틸리스, 살모넬라 티피무리움 균주, 또는 슈도모나스, 스트렙토마이세스 및 스타필로코커스와 같은 종의 균주;

b) 진핵생물 숙주세포: HeLa 세포(ATCC No. CCL2), Cv 1 세포(ATCC No. CCL70), COS 세포(ATCC No. CRL 1650), Sf-9 세포(ATCC No. CRL 1711), CHO 세포(ATCC No. CCL-61) 또는 3T3 세포(ATCC No. CRL-6361).

돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드

또다른 측면에 따르면, 본 발명은 콜레스테롤의 역수송에서 결핍을 겪고 있는 환자, 가장 구체적으로는 탠지어병을 앓고 있는 환자에게서 돌연변이된 ABC1 유전자, 좀더 구체적으로는 돌연변이된 ABC1 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 관한 것이다.

전술한 바와 같이, 탠지어병을 앓고 있는 환자에게서 두 가지 해로운 돌연변이가 확인되었다.

첫번째 돌연변이는 ABC1 유전자의 엑손 12 수준에서 약 백개의 염기쌍으로 된 단편을 암호화 서열에 삽입하는 것으로, 이로 인해 서열번호 140의 서열을 가진 2233개 아미노산의 생물학적 비활성 폴리펩타이드의 생성을 야기한다. 서열번호 140의 서열을 가진 돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드는 서열번호 139의 서열을 가진 정상 폴리펩타이드에 비해 하기의 차이점을 가진다:

a) 서열 "DERKFW"를 가진 펩타이드 단편의 결실 및 이러한 펩타이드 단편을 삽입된 Alu-형 뉴클레오타이드 단편에 의해 암호화되는 서열 "EYSGVTSAHCNLCLLSSSDSRASASQVAGITAPATTPG"로 교체.

두번째 돌연변이는 ABC1 유전자의 엑손 13 수준에서 암호화 서열의 처음 1/4영역 안으로 조기 종결 코돈의 도입과 관련되며, 서열번호 141의 서열을 가진 574개 아미노산을 가진 절두된 폴리펩타이드의 생성을 야기한다. 부가적으로, G 염기의 결실은 COOH-말단이 정상 ABC1 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 발견되지 않는 단백질을 야기하는 판독 프레임에서 변화를 유도한다. 이는 서열번호 141의 서열을 가진 돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드의 COOH-말단 서열 "RAPRRKLVSICNRCPIPVTLMTSFCG"이다.

이들 두 폴리펩타이드는 이들을 특이적으로 인식하는 항체의 제조에 유용하다. 이러한 항체는 시험되는 피검자, 바람직하게는 콜레스테롤의 역수송에서 결핍의 특징적인 증세를 가진 환자, 가장 바람직하게는 탠지어병의 특징적인 증세를 가진 환자로부터 수득된 샘플에서 이러한 돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드의 생성을 검출하는 수단을 구성한다.

또다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 140의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.

또다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 141의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 서열번호 140과 141의 서열을 가진 펩타이드, 또는 이들의 펩타이드 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.

첫번째 바람직한 펩타이드 단편은 서열번호 140의 서열을 가진 돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드에 함유된 서열 "EYSGVTSAHCNLCLLSSSDSRASASQVAGITAPATTPG"를 가진 펩타이드 단편의 적어도 5개의 연속 아미노산을 포함할 것이다.

두번째 바람직한 펩타이드 단편은 서열번호 141의 서열을 가진 돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드에 함유된 서열 "RAPRRKLVSICNRCPIPVTLMTSFCG"를 가진 펩타이드 단편의 적어도 5개의 연속 아미노산을 포함할 것이다.

유리하게는, 서열번호 140과 141의 서열을 가진 펩타이드, 또는 이들의 펩타이드 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99%의 아미노산 동일성을 가진 폴리펩타이드가 본 발명의 일부를 구성한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 특히 서열번호 140과 141의 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드는 본 발명에 따른 핵산의 15, 18 또는 20-25, 35, 40, 50, 70, 80, 100 또는 200개의 연속 아미노산 길이를 가질 것이다.

달리, 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 좀더 구체적으로 말해서 서열번호 140 및 141의 서열 중에서 선택된 폴리펩타이드는 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100 또는 200개의 연속 아미노산 길이를 가진 단편으로 이루어지고/이루어지거나 이를 포함할 것이다.

일반적으로, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 분리된 형태 또는 정제된 형태로 제공된다.

본 발명은 서열번호 140과 141의 서열을 가진 폴리펩타이드 중 하나, 또는 이의 펩타이드 단편 또는 변이체의 생성 방법에 관한 것으로,

a)폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 적절한 벡터에 삽입하고;

b)적절한 배양 배지에서 미리 형질전환된 숙주세포를 배양하거나 단계 a)의 재조합 벡터로 형질감염시키며;

c)조건화된 배양 배지를 회수하거나 예를 들어 초음파처리 또는 삼투압 쇼크에 의해 숙주세포를 용해시키고;

d)배양 배지로부터 또는 단계 c)에서 수득된 세포 용해물로부터 폴리펩타이드를 분리하여 정제한 다음;

e)경우에 따라, 생성된 재조합 폴리펩타이드를 특징규명하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 펩타이드는 면역친화성 크로마토그래피 칼럼에 결합하여 특징규명될 수 있으며, 칼럼상에서 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체에 대한 항체가 미리 고정된다.

또다른 측면에 따라, 본 발명에 따른 재조합 폴리펩타이드는 당업자에게 공지되어 있고 예를 들어 F.Ausubel et al(1989)에 공지된 방법에 따라 적절한 일련의 크로마토그래피 칼럼 위를 통과시켜 정제될 수 있다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는 균질 용액 또는 고체 상태로 통상적인 화학 합성 기술에 의해 제조될 수도 있다.

구체적으로 설명하면, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 균질 용액에서 Houben Weyl(1974)에 의해 기술된 균질 용액에서 또는, Merrifield(1965a; 1965b)에 의해 기술된 고체상 합성 기술로 제조될 수 있다.

서열번호 140과 141의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드 중 하나, 또는 이의 단편 또는 변이체에 "상동성"인 폴리펩타이드도 본 발명의 일부를 구성한다.

이러한 상동성 폴리펩타이드는 기준 폴리펩타이드에 대해 동등한 아미노산에 의해 아미노산의 1 이상의 치환을 보유한 아미노산 서열을 가진다.

본 발명에 따른 동등한 아미노산은 당업자에게 익히 공지된 기술에 따라 D 형태의 잔기로 L 형태의 잔기를 대체하거나 피로글루탐산에 의해 글루탐산(E)을 대체함을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 구체적으로 예를 들면, D 형태로 된 적어도 하나의 잔기를 함유한 펩타이드의 합성이 Koch(1977)에 의해 기술되어 있다.

또다른 측면에 따르면, 동일 부류에 속하는 두 개의 아미노산, 즉, 두 개의 전하를 띠지 않은 극성, 비극성, 염기성 또는 산성 아미노산도 등가 아미노산으로 간주된다.

레트로인버스 결합(NHCO), 카바 결합(CH₂CH₂) 또는 케토메틸렌 결합(CO-CH₂)과 같은 적어도 하나의 비-펩타이드 결합을 포함하는 폴리펩타이드도 본 발명의 일부를 구성한다.

바람직하게는, 적어도 하나의 아미노산의 1 이상의 첨가, 결실, 치환을 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 변형되지 않은 폴리펩타이드에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 능력을 보유할 것이다.

항체

본 발명에 따른 돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드, 특히 서열번호 140-141의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 및 상동성 펩타이드가 환자에게서 ABC1 폴리펩타이드의 변형된 형태의 생산을 검출해 내기 위한 항체의 제조에 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 첫번째 바람직한 항체는 서열번호 140의 서열을 가진 돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드에 함유된 서열 "EYSGVTSAHCNLCLLSSSDSRASASQVAGITAPATTPG"를 가진 펩타이드 단편의 적어도 5개의 연속 아미노산을 포함하는 펩타이드 단편에 대한 것이다.

본 발명에 따른 두번째 바람직한 항체는 서열번호 141의 서열을 가진 돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드에 함유된 서열 "RAPRRKLVSICNRCPIPVTLMTSFCG"를 가진 펩타이드 단편의 적어도 5개의 연속 아미노산을 포함하는 펩타이드 단편을 향한다.

본 발명의 목적상 "항체"는 특히 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 또는 단편(예, F(ab)'₂및 Fab 단편) 또는 본 발명에 따른 표적 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 단편을 인식하는 초기 항체의 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 의미하는 것으로 해석될 것이다.

모노클로날 항체는 Kohler과 Milstein(1975)에 공지된 기술에 따라 하이브리도마로부터 제조될 수 있다.

본 발명은 Kozbor et al.(1983)에 공지된 트리오마 기술 또는 하이브리도마 기술에서 생성된 바와 같이, 앞서 기재된 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체에 대한 항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 US 특허 제 4,946,778 호 또는 Martineau et al.(1998)에 기재된 단일쇄 Fv 항체 단편(ScFv)에 관한 것이다.

본 발명에 따른 항체는 또한 파아지 라이브러리 Ridder et al., (1995)에 의해 수득된 항체 단편 또는 인간화 항체 Reinmann et al.(1997); Leger et al.(1997)을 포함한다.

본 발명에 따른 항체 제조물은 샘플내 항원의 존재 및/또는 샘플내에 존재하는 항원의 양을 확인하기 위한 면역학적 검출 시험에 유용하다.

본 발명에 따른 항체는 방사능성 또는 비-방사능성, 예를 들어 형광성인 거물가능한 마커를 부가적으로 포함하거나, 당업자에게 익히 공지된 기술에 따라 바이오틴과 같은 분자에 커플링될 수 있다.

이에 따라, 본 발명의 주제는 부가적으로 샘플내 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 방법이며,

a)시험 샘플을 상술된 항체와 접촉시키고;

b)형성된 항원/항체 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 샘플내 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 존재를 진단하거나 검출하는 박스 또는 키트에 관한 것으로, 박스는:

a)앞서 정의된 항체;

b)형성된 항원/항체 복합체 검출을 허용하는 시약을 포함한다.

약학 조성물 및 치료방법

본 발명은 또한 유효량의 정상 ABC1 폴리펩타이드, 특히 서열번호 139의 서열을 가진 폴리펩타이드를 생산할 수 있는 치료 유효량의 폴리펩타이드를 포함함을 특징으로 하는, 아테롬성동맥경화증과 같은 콜레스테롤의 대사, 특히 콜레스테롤의 수송, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 결핍을 예방하거나 치료하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 주제는 부가적으로 치료 유효량의 정상 ABC1 폴리펩타이드, 특히 서열번호 139의 서열을 가진 폴리펩타이드를 포함함을 특징으로 하는, 아테롬성 동맥경화증과 같은 콜레스테롤의 대사, 특히 콜레스테롤의 수송, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 결핍을 예방하거나 치료하는 약학 조성물에 관한 것이다.

이러한 약학 조성물은 유리하게는 예를 들어 비경구 경로에 의해 1 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 바람직하게는 적어도 0.01 mg/kg/일, 가장 바람직하게는 0.01 내지 1 mg/kg/일 범위의 ABC1 폴리펩타이드를 투여하는 데 적합할 것이다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 경구, 직장, 비경구, 정맥내, 피하 또는 경피 경로에 의해 마찬가지로 투여될 수 있다.

본 발명은 각종 형태의 아테롬성동맥경화증을 예방하거나, 좀더 구체적으로, 콜레스테롤의 역수송에서의 기능장애를 겪는 피검자를 치료하는 약제의 제조를 위한 서열번호 139의 서열을 가진 ABC1 폴리펩타이드의 사용에 관한 것이다.

본 발명은 마지막으로 콜레스테롤의 역수송 기능장애를 예방하거나 이를 겪고 있는 피검자를 치료하기 위한, 서열번호 139의 서열을 가진 치료 유효량의 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

또다른 측면에 따르면, 본 발명의 주제는 콜레스테롤의 대사, 좀더 구체적으로 말하면 콜레스테롤의 수송, 더욱더 구체적으로 말하면 콜레스테롤의 역수송에서 결핍으로 인해 생긴 질환을 치료하는 예방적 또는 치료적 방법으로서, 본 방법은 환자에게서 ABC1 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 폴리뉴클레오타이드는 경우에 따라 1 이상의 생리학적으로 상용성인 비히클 및/또는 부형제와 배합된다.

바람직하게는, 앞서 정의된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물이 환자에 투여될 것이다.

또다른 측면에 따르면, 본 발명의 주제는 또한 환자에게서 치료 유효량의 ABC1 폴리펩타이드를 환자에 투여하는 단계를 포함하고, 콜레스테롤의 대사, 좀더 구체적으로 말해서 콜레스테롤의 수송, 더욱더 구체적으로 말해서 콜레스테롤의 역수송 결핍에 의해 야기된 질환을 치료하는 예방적 또는 치료적 방법으로서, 폴리펩타이드는 적절한 경우에 1 이상의 생리학적으로 상용성인 비히클 및/또는 부형제와 배합된다.

바람직하게는, 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물이 환자에 투여될 것이다.

ABC1 폴리펩타이드에 대한 효능제 또는 길항제 화합물을 스크리닝하는 방법

또다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 콜레스테롤의 대사, 특히 콜레스테롤의 수송, 더욱더 구체적으로 콜레스테롤의 역수송시 결핍으로 인한 질환, 예를 들어 탠지어병, 좀더 일반적으로는 FHD-형 질환의 치료에 유용한 치료 용도로서의 화합물을 스크리닝하는 다양한 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 콜레스테롤의 역수송에서의 기능장애로 인한 질환을 예방하거나 이로 인해 생긴 질환을 치료하는 활성성분을 스크리닝하기 위한, ABC1 폴리펩타이드, 또는 ABC1 폴리펩타이드를 발현시키는 세포의 용도에 관한 것이다.

ABC1 폴리펩타이드의 촉매 부위와 올리고펩타이드 또는 면역원성 단편은 기존 기술에 의해 산물 라이브러리를 스크리닝하는 작용을 할 수 있다. 이러한 종류의 스크리닝에 사용된 단편은 용액내에는 존재하지 않고, 세포 표면 또는 세포내의 고체 지지체에 부착될 수 있다. 뒤이어 ABC1 단편과 시험된 제제간의 결합 복합체의 형성을 측정할 수 있다.

해당 단백질에 대해 친화성을 가진 산물에 접근하는 하이-플럭스 스크리닝에 사용될 수 있는 또다른 산물 스크리닝 기술이 출원 제 WO84/03564 호에 기재되어 있다. 이 방법에서, ABC1 단백질에 적용할 경우, 다양한 산물이 고체 표면에서 합성된다. 이러한 산물은 ABC1 단백질 또는 이의 단편과 반응하고 복합체를 세척한다. ABC1 단백질에 결합하는 산물은 당업자에게 공지된 방법에 의해 검출된다. 비-중화 항체는 펩타이드를 포획하여 이를 지지체상에 고정시키는 데 사용될 수 있다.

또다른 가능성은 항체 경쟁을 중화시키는 ABC1, ABC1 단백질 및 ABC1 단백질에 잠재적으로 결합하는 산물을 이용한 산물 스크리닝을 이용하는 데 있다. 이러한 방식으로, 항체는 ABC1과 공통 항원 단위를 가진 펩타이드의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다.

ABC1 활성을 증가시키는 것으로 평가되고 이를 증가시킬 수 있는 산물 중에, 키나제로 인한 탈포스포릴화를 피할 수 있는 분자 및 포스파타제의 활성화에 관여하는 키나제-특이성 ATP 상동체가 특별히 언급될 수 있다. 특히 포스포디에스테라제(PDE) 테오필린 및 3-이소부틸-1-메틸잔틴형의 억제제 또는 아데닐사이클라제 포스콜린 활성제가 언급될 수 있다.

따라서, 본 출원인은 본 발명에서 인간 ABC1 서열을 선천적으로 발현시키거나 이를 포함하고 있는 포유동물, 곤충, 박테리아 또는 효모의 모든 합성 또는 세포 종에 존재하는 막 또는 소포간의 콜레스테롤 수송 방법에 기초한 산물을 스크리닝하는 방법의 용도를 청구하고 있다(실시예 17 참조). 이에 따라, 표지된 지질 유사체가 이용될 수 있다.

또한, ABC1 단백질은 음이온 수송을 허용하고(Becq et al. Journal of Biological Chemistry vol 272, No. 5 pages 2695-2699, 1997 and Yamon et al. Blood vol 90, No. 8 pages 2911-2915, 1997) 이러한 수송은 아카다이산과 오르토바나데이트와 같은 포스파타제 억제제에 의해 및, 부분적으로 포스콜린과 같은 제제에 의해 cAMP의 상승에 의해 활성화되는 것으로 기재되어 있다. 본 출원인은 ABC1 단백질의 활성을 조절하는 분자를 스크리닝하는 이러한 시스템의 용도를 청구한다(실시예 18 참조).

Yamon et al(Blood vol 90, No. 8 pages 2911-2915, 1997)은 마우스 ABC1 단백질이 마우스 복막 대식세포에서 프로염증성 사이토킨 IL-1 베타의 분비에 관련되었음을 입증하고 있다. 따라서 두 가지 단백질을 발현시키는 임의의 세포 종류로부터 IL-1 베타의 방출을 측정하여 ABC1 단백질의 활성을 조절하는 산물의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다(실시예 19 참조).

또한, 다수 트랜스포터의 파괴가 공지되어 있다는 사실을 숙지하면서(van, den Hazel. H., H. Pichler, V.M.M.do, E.Leitner, A. Goffeau, and G.Daum. 1999, PDR16 and PDR17, two homologous genes of Saccharomyces cerevisiae, affect lipid biosynthesis and resistance to multiple drugs. J. Biol Chem. 172(4):1934-41), 특징적인 표현형을 가진 세포 돌연변이체의 사용을 생각할 수 있으며 이의 기능을 ABC1으로 보충할 수 있고 전부를 스크리닝 목적으로 이용할 수 있다.

본 발명은 또한 콜레스테롤의 대사에 활성인 화합물, ABC1 폴리펩타이드의 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다:

a)ABC1 폴리펩타이드와, 검출 가능한 마커를 포함하는 지질 기질을 함유하고 있는 막 소포를 제조하고;

b)단계 a)에서 수득된 소포를 효능제 또는 길항제 후보 화합물과 함께 배양하며;

c)검출 가능한 마커를 포함하는 지질 기질의 방출을 정성적으로 및/또는 정량적으로 측정하며;

d)단계 b)에서 수득된 측정치를 효능제 또는 길항제 후보 화합물과 함께 미리 배양되지 않은 소포에 의한 표지된 지질 기질의 방출의 측정치와 비교한다.

상기 스크리닝법의 제 1 측면에 따르면, 막 소포는 합성 지질 소포이고, 이는 업계의 당업자에게 익히 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다. 특정 양태에 따르면, ABC1 단백질은 재조합 ABC1 단백질일 수 있다:

제 2 측면에 따르면, 막 소포는 ABC1 폴리펩타이드를 발현시키는 세포에서 유도된 원형질막의 소포이다. 이는 ABC1 폴리펩타이드를 선천적으로 발현시키는 세포 또는 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 벡터로 형질감엽된 세포일 수 있다.

상기 스크리닝법의 제 3 측면에 따르면, 지질 기질은 콜레스테롤 또는 포스파티딜콜린 중에서 선택된다.

제 4 측면에 따르면, 지질 기질은 예를 들어³H 또는¹²⁵I 중에서 선택된 동위 원소를 이용하여 방사능 표지된다.

제 5 측면에 따르면, 지질 기질은 NBD 또는 피렌과 같은 형광 화합물로 표지된다.

제 6 측면에 따르면, 표지된 지질 기질과 ABC1 폴리펩타이드를 포함하는 막 소포는 단계 b) 이전에 고체 지지체의 표면에 고정된다.

제 7 측면에 따르면, 소포에 의해 방출된 형광 또는 방사능의 측정치는 ABC1 폴리펩타이드에 의한 지질 기질 수송의 활성을 직접적으로 반영한다.

본 발명은 또한 콜레스테롤의 대사시 활성인 화합물, ABC1 폴리펩타이드의 효능제 또는 길항제를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:

a)세포, 예를 들어 선천적으로 또는 형질감염 후에 ABC1 폴리펩타이드를 발현하는 세포주를 수득하고;

b)검출 가능한 마커로 표지된 음이온의 존재하에 단계 a)의 세포를 배양하며;

c)단계 b)의 세포를 세척하여 이들 세포로 침투하지 않은 과량의 표지된 음이온을 제거하며;

d)단계 c)에서 수득된 세포를 ABC1 폴리펩타이드에 대한 효능제 또는 길항제 후보 화합물과 함께 배양하며;

e)표지된 음이온의 유출을 측정하고;

f)단계 e)에서 측정된 표지된 음이온 유출치를 ABC1 폴리펩타이드에 대한 효능제 또는 길항제 후보 화합물의 존재하에 미리 배양되지 않은 세포를 이용하여 측정된 표지된 음이온의 유출치와 비교한다.

상기 스크리닝법의 제 1 측면에 따르면, 사용된 세포는 ABC1 폴리펩타이드를 선천적으로 발현하는 세포이다. 이는 인간의 단핵구 집단에서 정제된 1차 배양액내 인간 단핵구일 수 있다. 이는 또한 인간 단핵구 세포주, 예를 들면 단핵구성 백혈병 계통 THP1일 수 있다.

제 2 측면에 따르면, 상술된 스크리닝법에 사용된 세포는 ABC1 폴리펩타이드를 본래 발현시키지 않거나, 낮은 수준으로 발현시키는 세포일 수 있으며, 세포는 ABC1 폴리펩타이드의 발현을 지시할 수 있는 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질감염된다.

제 3 측면에 따르면, 세포는 음이온 수송에 선천적 결함을 가진 세포이거나,Verapamil^TM또는 테트라에틸암모늄과 같은 1 이상의 음이온 채널 억제제로 전처리된 세포일 수 있다.

스크리닝법의 제 4 측면에 따르면, 음이온은 염 K¹²⁵I 또는 Na¹²⁵I와 같은 방사능 표지된 아이오다이드이다.

제 5 측면에 따르면, 표지된 음이온의 유출치는 실험도중 시간에 따라 주기적으로 측정되며, 이로 인해 이러한 유출의 역학 측정치를 정할 수 있다.

제 6 측면에 따르면, 표지된 음이온의 유출치는 정해진 시간에 세포 배양액 상등액에 존재하는 표지된 음이온의 양을 측정하여 결정된다.

제 7 측면에 따라, 표지된 음이온의 유출치는 세포 용해물에서 발견된 방사능과 세포 배양 상등액에서 발견된 방사능의 합에 상응하는 총 방사능에 대한 세포 배양 상등액에서 발견된 방사능의 비율로서 측정된다.

본 발명의 주제는 또한 콜레스테롤의 대사에 활성인 화합물, ABC1 폴리펩타이드의 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법으로서, 다음의 단계를 포함한다:

a)정제된 인간 알부민의 존재하에 적당한 배양 배지에서 인간 단핵구 세포주의 세포 배양;

b)IL-1 베타의 생성을 자극하는 화합물 및 효능제 또는 길항제 후보 화합물의 동시 존재하에 단계 a)의 세포 배양;

c)적당한 농도의 ATP 존재하에 단계 b)에서 수득한 세포의 배양;

d)세포 배양 상등액 중으로 방출된 IL-1 베타의 측정;

e)효능제 또는 길항제 후보 화합물의 존재하에서 사전에 배양하지 않은 세포의 배양 상등액 중으로 방출된 IL-1 베타의 값과 단계 d)에서 수득한 IL-1 베타의 방출 값의 비교.

전술한 스크리닝 방법의 제 1 측면에 따라, 사용된 세포는 인간 백혈병 단핵구 세포주 THP1에 속한다.

스크리닝 방법의 제 2 측면에 따라, IL-1 베타의 생성을 촉진하는 화합물은 리포폴리사카라이드이다.

상기 방법의 제 3 측면에 따라, 이들 세포에 의한 IL-1 알파, IL-6 및 TNF 알파의 생성도 정성적으로 및/또는 정량적으로 측정된다.

제 4 측면에 따라, IL-1 베타를 암호화하는 메신저 RNA의 발현 수준도 측정된다.

본 발명은 결과적으로 하기 도면과 실시예에 의해 제한됨이 없이 설명된다.

실시예 1: 본 발명에 따른 ABC1 유전자의 전사체의 조직 분포

본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드의 발현 프로필을 특히 Sambrook 등(참조:CSH Sambrook, J., Fritsch,E.F., and Maniatis, T.(1989). "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.)에 의해 기술된 PCR-커플링 역전사 및 노던 블롯 분석 프로토콜에 따라 측정된다.

예를 들면, 역전사에 의한 분석의 경우, 서열번호 91의 서열을 갖는 인간 ABC1 유전자의 완전한 DNA로부터 합성된 한 쌍의 프라이머를 사용하여 상응하는 cDNA를 검출한다.

폴리머라제 연쇄 반응(PCR)은 역전사된 polyA⁺mRNA(Clontech)에 상응하는 cDNA 주형상에서 수행된다. cDNA로의 역전사는 제조업자에 의해 기술된 조건에 따라 효소 SUPERSCRIPT II(GibcoBRL, Life Technologies)를 사용하여 수행된다. 폴리머라제 연쇄 반응은 표준 조건에 따라, cDNA 제제 25 ng과의 반응 혼합물 20 ㎕에서 수행된다. 반응 혼합물은 각각의 dNTP 400 μM, Thermus aquaticus(Taq) DNA 폴리머라제(Ampli Taq Gold; Perkin Elmer) 2 단위, 각각의 프라이머 0.5 μM, 2.5 mM MgCl₂, 및 PCR 완충제로 구성된다. 34 PCR 사이클(94℃에서 변성 30초, 34 사이클 동안 다음과 같이 나누어 30초간 어닐링:64℃ 2 사이클, 61℃ 2 사이클, 58℃ 2사이클과 55℃ 28 사이클 및 72℃ 에서 킬로 베이스당 1분간의 연장)을 Perkin Elmer 9700 써모사이클러에서 10분간 94℃ 에서 변성 제 1 단계 후 수행한다. PCR 반응은 전기영동에 의해 아가로스 겔 상에 가시화된다. 수득된 cDNA 단편은 노던 블롯 분석을 위한 탐침으로 사용될 수 있고 또한 폴리뉴클레오타이드 서열의 정확한 결정을 위해서도 사용될 수 있다.

노던 블롯 분석의 경우에, 전술한 바와 같이 생성된 cDNA 탐침을 제조업자가 표시한 지시에 따라 DNA 표지 시스템 High Prime(Boehringer)에 의해³²P로 표지한다. 표지 후에, 탐침을 제조업자에 의해 표시된 지시에 따라 세파덱스 G50 마이크로칼럼(Pharmacia) 상에서 정제한다. 표지되고 정제된 탐침을 이어서 다양한 조직에서 mRNA의 발현 검출에 사용한다.

상이한 인간 조직의 RNA 샘플을 함유하는 노던 블롯(Multiple Tissue Northern, MTN, Clontech) Blot 2, 참조 77759-1)을 표지된 탐침과 하이브리드화 시킨다.

하이브리드화 및 세척을 위해 수행된 프로토콜은 제조업자에 의해 기술된 바와 같이 직접(사용 설명 매뉴얼 PT1200-1) 또는 당업자에 공지되고 예를 들면 F.Ausubel 등(1999)에 기술된 방법을 사용하여 상기 프로토콜을 변형하여 수행할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 포름아마이드의 존재하에 예비하이브리드화 및 하이브리드화 온도를 변화시킬 수 있다.

예를 들면, 하기 프로토콜을 사용할 수도 있다.

1 -막 경쟁 및 예비하이브리드화:

- 혼합: 연어 정충 DNA 40 ㎕ (10 mg/ml)

+ 인간 태반 DNA 40 ㎕ (10 mg/ml)

- 96℃에서 5분간 변성시킨 다음 혼합물을 얼음에 침지.

- 2X SSC 제거하고 막을 함유한 하이브리드화 튜브에 4 ml 포름알데하이드 믹스를 붓는다.

- 변성된 두 DNA의 혼합물 첨가.

- 회전하면서 42℃에서 5 내지 6시간 동안 배양.

2 -표지된 탐침 경쟁:

- 반복 서열의 양에 따라, 표지되고 정제된 탐침에 10 내지 50 ㎕ Cot I DNA 첨가.

- 95℃에서 7 내지 10분간 변성.

- 65℃에서 2 내지 5시간 동안 배양.

3 -하이브리드화:

- 예비하이브리드화 믹스 제거.

- 연어 정충 DNA 40 ㎕ + 인간 태반 DNA 40 ㎕ 혼합; 96℃에서 5분간 변성한 다음 얼음에 침지.

- 하이브리드화 튜브에 4 ml 포름알데하이드 믹스, 두 DNA의 혼합물 및 변성된 표지 탐침/Cot I DNA 첨가.

- 회전하면서 42℃에서 15 내지 20시간 동안 배양.

4 -세척:

- 2X SSC중 실온에서 1회 세척하여 세정.

- 실온에서 2X SSC 및 65℃에서 0.1% SDS로 5분간 2회.

- 65℃에서 1x SSC 및 65℃에서 0.1% SDS로 15분간 2회.

하이브리드화 및 세척 후, 블롯을 Storm(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)의 도움으로 드러난 인 스크린과의 접촉하에 밤새 노출시킨 후 분석한다.

실시예 2: ABC1 유전자의 완전한 cDNA의 생성

인간 ABC1 유전자의 cDNA의 3′-UTR 영역의 서열은 데이터베이스에서 조사함으로써 확인되었다.

EST 서열("Genbank 마우스 인간 서브디비전 EST, v.111")의 데이터베이스의 반복 스크리닝을 BLAST 소프트웨어의 도움하에 수행한다.

올리고뉴클레오타이드 프라이머를 EST 서열로부터 유도된 부분 컨센서스 서열로부터 합성하여 RT-PCR 반응에 의해 인간 ABC1 유전자의 cDNA의 3′말단을 증폭한 다음, 이의 서열을 결정한다.

사용된 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 다음과 같다:

1. 5′-AAACCAGACAGTAGTGGACG-3′(서열번호 142)

2. 5′-GTTACTGCCACCAGAACAGC-3′(서열번호 143)

3. 5′-TGATAAGCTGTTCTGGTGGC-3′(서열번호 144)

4. 5′-CTTGGCTTTTGCATTGTTGC-3′(서열번호 145)

5. 5′-CAATGCAAAAGCCAAGAAAG-3′(서열번호 146)

6. 5′-TGCAACGATGCCATATCAC-3′(서열번호 147)

7. 5′-CAACTCCTTACTTCGGTTCCTC-3′(서열번호 148)

8. 5′-GTTTTCTGAGGTGTCCCAAAG-3′(서열번호 149)

뇌, 태아의 뇌, 심장, 자궁 및 태반 조직으로부터의 폴리(A)⁺mRNA(Clontech사에 의해 판매되는 라이브러리)의 역전사를 제조업자의 지시에 따라 Superscript^TM키트(Life Technologies Inc.사 판매)를 사용하여 oligodT 프라이머의 도움하에 연장시켜 수행한다.

각각의 실험에서, 역전사효소를 함유하지 않는 샘플에는 PCR-증폭 폴리뉴클레오타이드가 부재하기 때문에 오염 DNA의 존재를 배제시킬 수 있다.

PCR 반응을 하기 조건하에서 역전사의 제 1 단계에 투입하거나 하지 않은 산물에 대해 수행한다:

- 400 μM dNTP, Taq DNA 폴리머라제(Thermus aquaticus, Ampli Taq Gold, Perkin Elmer사 판매) 2 단위, 각각의 프라이머 0.5 μM, MgCl₂2.5 mM(전체는 또한 DNA 50 ng 및 cDNA 약 25 ng을 함유하는 PCR 완충제에 존재한다).

- PCR 반응을 96-웰 마이크로플레이트에서 써모사이클러 장치("Perkin Elmer 9700 Thermal Cycler")에서 30 사이클 동안 수행한다.

- 94℃에서 10분간 초기 변성 후, 각각의 사이클을 다음의 방식으로 수행한다;

94℃에서 30초간의 변성 단계; 30초간 어닐링 단계(64℃에서 2 사이클 동안, 61℃에서 2 사이클 동안, 58℃에서 2 사이클 동안 및 55℃에서 28 사이클 동안).

- 킬로 베이스당 1분에 상당하는 기간 동안 연장 단계.

- 7분간의 최종 연장 단계로 PCR 반응을 종지한다.

다양한 다른 방법을 사용하여 ABC1의 완전한 cDNA에 상응하는 cDNA를 분리할 수 있다.

예를 들면, 완전한 클론은 해당 유전자의 서열에 특이적인 폴리뉴클레오타이드 탐침에 의해 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 하이브리드화에 의해 직접 분리할 수 있다.

특히, 30-40 뉴클레오타이드의 특이적 탐침은 선택된 서열에 따라 Applied Biosystem/Perkin Elmer 상표의 합성기를 사용하여 합성된다.

수득된 올리고뉴클레오타이드는 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 예를 들면 [γ-³²P]ATP로 방사능 표지되고 통상의 방법(예를 들면, Maniatis et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY 1982 또는 F. Ausubel et al.(Current Protocols in MolecularBiology, J.Wiley and Sons Eds, 1989)에 따라 정제된다.

스크리닝을 원하는 cDNA를 함유하는 클론 라이브러리를 전술한 통상의 방법(F.Ausubel 등)에 따라 적당한 항생물질을 함유하는 페트리 디시(1.5% 아가) 내의 배양 배지 상에 설정한다. 통상의 방법에 따라, 배양 후 생성된 콜로니를 니트로셀룰로스 필터에 옮기고 방사능 표지된 뉴클레오타이드 탐침에 의해 스크리닝하여 탐침과 하이브리드화하는 콜로니를 분리하여 서브클로닝한다.

확인된 클론의 DNA를 제조하여 서열분석에 의해 분석한다. 완전한 dDNA에 상응하는 단편을 함유하는 클론을 정제하고 당업자에 공지되고 예를 들면, F. Ausubel 등(1989)에 제시된 프로토콜에 따라 벡터 pcDNA3 중으로 재클로닝한다.

다양한 방법이 본 출원에 기재된 유전자에 상응하는 cDNA의 5′및 3′말단 동정에 공지되어 있다. 이러한 방법에는 하이브리드화 클로닝, 당업자에게 공지되어 있는 3′또는 5′RACE-PCR(cDNA End-PCR의 고속 증폭)과 유사하거나 동일한 프로토콜을 사용하는 클로닝이 포함되며 이에 한정되지 않는다.

예를 들면, Clontech사가 판매하고 있는 키트(Marathon Ready^TMcDNA 키트, 참조 PT1156-1로 확인되는 프로토콜)를 사용할 수 있거나 5′RACE와 유사한 방법이 cDNA의 부재하는 5′말단을 특징규명하는 데 이용될 수 있다(Fromont-Racine et al., Nucleic Acid Res. 21(7):1683-1684(1993)). 간단히 말해서, RNA 올리고뉴클레오타이드를 mRNA 집단의 5′말단에 연결시킨다. cDNA로 역전사한 후, 각각 해당 유전자의 5′에 연결된 아답터 및 3′에 위치한 서열에 대해 특이성을 띠는 프라이머 세트를 PCR에 사용하여 목적 cDNA의 5′부분을 증폭시킨다. 이어서, 증폭된 단편을 사용하여 완전한 cDNA를 재작제한다.

실시예 3: 탠지어병에 대한 유전자 발현 프로필의 분석

탠지어 세포 표현형을 일으키는 ABC1 유전자의 발현 수준의 손상 입증은 이들 서열을 후술하는 방법에 따라, 그 질환에 걸리거나 걸리지 않은 피검자의 섬유아세포로부터 수득된 mRNA에 상응하는 탐침과 하이브리드화시킴으로써 측정될 수 있다:

1.폴리(A) ⁺ mRNA 및 cDNA 탐침의 전체 RNA의 제조

전체 RNA는 구아니딘 이소티오시아네이트법(Chomczynski & Sacchi, 1987)에 의해 정상 피검자 또는 탠지어병에 걸린 피검자의 섬유아세포의 세포 배양액으로부터 수득된다. 폴리(A)⁺mRNA는 올리고(dT)-셀룰로스 칼럼(Sambrook et al., 1989) 상에서 친화성 크로마토그래피로 수득되고 탐침으로 사용되는 cDNA는 형광물(Amersham Pharmacia Biotech; CyDye^TM)로 표지된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 RT-PCR(DeRisi et al., 1997)에 의해 수득된다.

2.하이브리드화 및 발현 수준의 검출

탠지어 유전자에 상응하는, 본원에 제시된 서열을 함유하는 유리막을 섬유아세포로부터 수득한 cDNA 탐침과 하이브리드화시킨다(Iyer et al., 1999). Amersham/molecular Dynamics 시스템(Avalanche Microscanner^TM)의 사용은 건강하거나 병에 걸린 세포형에서 서열의 산물의 발현 정량을 허용한다.

실시예 4: 포유동물 세포에서 ABC1의 완전한 cDNA를 함유하는 발현벡터의 작제

ABC1 유전자는 포유동물 세포에서 발현시킬 수 있다. 전형적인 진핵세포 발현벡터는 mRNA, 단백질을 암호화하는 서열, 및 전사의 종결 및 전사체의 폴리아데닐화에 요구되는 시그널의 전사 개시를 허용하는 프로모터를 함유한다. 이는 또한, 인핸서, 코작 서열 및 mRNA의 스플라이싱에 필요한 서열과 같은 부수적인 시그널도 함유한다. 효과적인 전사는 SV40 바이러스 프로모터의 초기 및 후기 요소, 레트로바이러스 LTR 또는 CMV 바이러스 초기 프로모터로 수득된다. 그러나, 액틴 프로모터와 같은 세포 요소도 사용될 수 있다. 벡터 pcDNA3와 같은 다수의 발현벡터를 사용하여 본 발명을 수행할 수 있다.

실시예 5: 정상 및 돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드의 생성

분리방법이 실시예 2(완전한 cDNA의 클로닝)에 기술되어 있는 ABC1의 완전한 cDNA에 의해 암호화된 정상 ABC1 폴리펩타이드, 또는 완전한 cDNA가 또한 실시예 2에 기재된 기술에 따라 수득될 수 있는 돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드도 바큘로바이러스 벡터를 사용하는 박테리아 또는 곤충 세포 발현 시스템에서 또는 백시니아 바이러스 벡터를 사용하거나 사용하지 않는 포유동물 세포에서 용이하게 생성될 수 있다. 모든 방법이 현재 널리 기재되어 있고 당업자에 공지되어 있다. 이들의 상세한 설명은 예를 들면, F.Ausubel 등(1989)에서 찾아볼 수 있다.

실시예 6: 돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드 중 하나에 대한 항체의 생성

본 발명에서의 항체는 다양한 방법으로 제조될 수 있다(Current Protocols In Molecular Biology Volume 1 edited by Frederick M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl - Massachusetts General Hospital Harvard Medical School, chapter 11). 예를 들면, 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 동물에 주사하여 항체를 함유하는 혈청의 생성을 유도한다. 기재된 방법 중 하나에서, 단백질을 제조하고 정제하여 오염을 피한다. 이러한 제제를 이어서 고 활성을 띠는 폴리클로날 항혈청의 생성을 위해 동물에 도입한다.

바람직한 방법에서, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체이다. 이러한 모노클로날 항체는 하이브리도마 기술(Kohler et al., Nature 256:495(1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammeling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 51981)을 이용하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 동물을(바람직하게는 마우스를) 폴리펩타이드, 또는 더 양호하게는 폴리펩타이드 발현 세포로 면역시키는 과정을 수반한다. 이러한 세포는 적당한 조직 배양 배지에서 배양시킬 수 있다. 그러나, 10% 태 소 혈청(56℃에서 불활성화시킴)으로 보충되고 비-필수 아미노산 약 10 g/l, 페닐실린 1000 U/ml 및 스트렙토마이신 약 100 ㎍/ml로 보충한 이글 배지(변형된 Earle)에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다.

이러한 마우스의 비장세포를 추출하여 적당한 골수종 세포주와 융합시킨다. 그러나, ATCC로부터 이용 가능한 친주 골수종 세포주(SP20)를 사용하는 것이 바람직하다. 융합 후, Wands 등(Gastroenterology 80:225-232 (1981))에 의해 기재된 바와 같이 생성 하이브리도마 세포를 HAT 배지에서 선택적으로 유지시킨 다음 제한 희석에 의해 클로닝시킨다. 이러한 스크리닝 후 수득된 하이브리도마 세포를 시험하여 폴리펩타이드와 결합할 수 있는 항체를 분비하는 클론을 동정한다.

또한, 폴리펩타이드와 결합할 수 있는 타 항체도 안티-이디오타입 항체를 사용하여 2 단계 절차에 따라 생성될 수 있으며; 이러한 방법은 항체 자신이 항원이고 결과적으로 다른 항체를 인식하는 항체를 수득할 수 있다는 사실에 근거한다. 이러한 방법에 따라, 단백질에 특이성인 항체를 사용하여 동물, 바람직하게는 마우스를 면역시킨다. 이어서, 이 동물의 비장 세포를 사용하여 하이브리도마 세포를 생성하고, 후자를 스크리닝하여 특이성 항체-단백질 복합체와의 결합능이 폴리펩타이드에 의해 차단될 수 있는 항체를 생성하는 클론을 동정한다. 이들 항체를 사용하여 동물을 면역시켜 단백질 특이성 항체의 다량 형성을 유도할 수 있다.

본 발명 항체의 Fab 및 F(ab′)2 및 타 단편이 여기에서 기재된 방법에 따라 사용될 수 있으면 유리할 것이다. 이러한 단편은 전형적으로 파파인(Fab 단편 생성) 또는 펩신(F(ab′)2 단편 생성) 같은 효소의 도움하에 단백질분해 절단에 의해 생성된다. 이와 달리, 단백질을 인식하는 분비된 단편은 재조합 DNA 또는 합성 화학 기술을 적용하여 생성될 수 있다.

인간에서 항체의 생체내 사용을 위해, "인간화된" 키메릭 모노클로날 항체를사용하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 항체는 전술한 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포로부터 유도된 유전자 작제물을 사용하여 생성될 수 있다. 키메릭 항체 생성방법은 당업자에 공지되어 있다(검토를 위해, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., Biotechnique 4:214 (1986); Cabilly et al., US 특허 No. 4,816,567; Taniguchi et al., EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger et al., WO 8601533; Robinson et al., WO 8702671, Boulianne et al.,; Nature 312:643 (1984); Neuberger et al., Nature 314:268 (1985) 참조).

실시예 7: 탠지어병의 세포 표현형의 교정

탠지어병은 고밀도 지방단백질(HDL) 입자의 촉진된 이화작용 및 조직내 콜레스테롤 축적을 특징으로 한다. 특히, 탠지어병에 걸린 환자의 피부의 섬유아세포는 주요 HDL 단백질인 아포지방단백질 A-I(apoA-I)에 의해 수행된 콜레스테롤 유출 과정에 의한 콜레스테롤 함량 제거능이 감소되어 있다(Francis et al., 1995). 기능의 상실에 상응하는 이러한 특징은 가족성 HDL 결핍증에 걸린 환자의 다른 섬유아세포에서도 발견된다(Marcil et al., 1999).

탠지어 섬유아세포의 표현형의 교정은 본 발명에 따른 ABC1의 완전한 cDNA을 세포 중으로 형질감염시킴으로써 수행될 수 있다. cDNA를 발현벡터에 삽입한 다음 후술되는 방법에 따라 형질감염시킨다:

1.정상 피검자 및 탠지어병에 걸린 피검자의 섬유아세포 배양액의 제조

인간 피부의 1차 섬유아세포는 팔뚝으로부터 수득한 피부 생검을 배양함으로써 수득된다. 이러한 생검은 "동형접합체"의 임상적 및 생화학적 특징, 즉 오렌지색 편도선, 제 5 퍼센틸 이하의 apo-I 및 콜레스테롤-HDL의 혈장 농도를 지닌 탠지어병 환자에서 수행된다. 정상 섬유아세포주는 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션(Rockville, MD)로부터 수득한다. 섬유아세포를 10% 태 송아지 혈청, 2 mM 글루타민, 페니실린 100 IU/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml로 보충된(EMMEM10으로 명명된 배지) EMMEM 배지(이글 변형 최소 필수 배지;GIBCO)에서 배양한다. 콜레스테롤 유출 연구를 수행하기 위해, 이들 세포를 송아지 혈청은 없지만 소 알부민(BSA, 분획 V) 2 mg/ml를 함유하는 전술한 배지에서 콜레스테롤 50 ㎍/ml와 24시간 동안 배양함으로써 콜레스테롤로 예비 로딩한다.

2.콜레스테롤의 유출 연구

24-웰 플레이트에 유착상태로 콜레스테롤로 예비 로딩한 섬유아세포를 EMMEM10 배지 및 1 μCi/ml의 1,2-³H-콜레스테롤(50 Ci/mmol; Dupont; Wilmington, DE)에서 48시간 배양시킨다. 분당 약 100,000 카운트가 웰당 또는 분당 및 세포 단백질 ㎍당 1000 카운트가 수득되었다. 세포를 EMMEM/BSA 배지로 3회 세척한 다음, 해당 유전자를 형질감염시키고 EMMEM/BSA 배지에 apoA-I를 함유하는 프로테오리포솜 10 ㎍/ml를 첨가함으로써 유출을 개시하기 전에 이 배지와 24시간 동안 배양한다. 이들 프로테오리포솜은 포스파티딜콜린 및 정제된 인간 apoA-I의 초음파처리에 의해 제조된다(Jonas, 1986). 세포 형질감염은 칼슘 포스페이트 침전 기술(Sambrook et al., 1989)에 의해 수행된다. 유출기 후, 일반적으로 20시간 후, 배지를 수집하여 원심분리한 다음(1000 g, 5분), 액체 신틸레이션 카운팅에 의해방사능을 측정한다. 세포내 잔류 방사능도 이소프로판올에서 지질의 추출 후에 밤새 측정한다. % 유출은 상등액 및 세포 추출물에서, 측정된 방사능의 합으로 상등액에서 측정된 방사능을 나눔으로써 계산된다. 내부 표준은 마커 유전자의 형질감염 및 apoA-I를 함유하는 프로테오리포솜 없이 EMMEM/BSA 배지와 24시간 동안의 배양에 의해 제조된다. 대조 유전자로 형질감염된 정상 섬유아세포로부터 세포 콜레스테롤의 유출은 6 ±2%에 상응하는 반면에, 탠지어병에 걸리고 이 대조 유전자로 형질감염된 섬유아세포로부터 수득된 것은 1% 이하이다. 한편, 본 발명에 따른 ABC1에 대한 완전한 cDNA 또는 게놈 DNA를 함유하는 플라스미드로 탠지어병에 걸린 섬유아세포를 형질감염시키면 정상 섬유아세포의 것에 상응하는 수준에서 콜레스테롤 과잉을 제거하는 이들 세포의 능력을 회복시킬 수 있을 것이다.

실시예 8: 인간 ABC1 유전자의 게놈 단편의 분리와 특징규명

인간 ABC1 cDNA의 약 3 kb의 단편을 ABC1의 제 1 ATP-결합 도메인을 함유하는 "pf10"으로 명명된 cDNA 클론으로부터 수득하며, 이 cDNA 클론은 Luciani et at.(1994)의 논문에 기재되어 있다.

제한 엔도뉴클레아제 EcoRI의 도움하에 클론 pf10의 분해로 수득된 상기 cDNA 단편을 전기영동 후에 아가로스 겔 상에 분리한 다음, 제조업자의 지시에 따라(Boehringer Mannheim, 참조 1 585 614) 디곡시게닌으로 표지한다.

표지된 cDNA 단편을 사용하여 Nylon^TM필터 상에 고정된, 9번 염색체의 LLNL(Lawrence Livermore National Labs) 코스미드 라이브러리를 스크리닝한다.

6개의 양성 클론이 동정된다. 이들 6개의 코스미드에 대해, 탐침은 단일 콜로니와 하이브리드화 되었다.

대표적인 클론을 각각의 이들 콜로니로부터 분리한다.

클론 LLNLC 131J087 Q2(본원에서 cos3a로 명명) 및 LLNLc 131O1165 Q2(본원에서 cos6f로 명명)를 좀더 상세히 분석한다.

클론 cos3a를 EcoRI 단편 형태로 벡터 Gen3zf(-) 중으로 서브클로닝하고 AB1377형 서열분석기(Applied Biosystems, Perkin Elmer)상에서 Big Dye Terminator 기술을 이용하여 양 말단에서 서열분석한다.

지나치게 길어서 벡터의 서열과 하이브리드화하는 프라이머의 도움으로는 완전히 서열분석할 수 없었던 명백한 삽입체를 함유하는 클론(다양한 삽입체의 말단을 서열분석한 후 또는 이의 크기를 결정함으로써 측정)은 트랜스포손 삽입 기술에 이어서, 트랜스포손에 특이적인 프라이머(New England Biolabs사가 판매하는 "GPS" 시스템)의 도움하에 서열분석하는 기술로 사전에 더 분석하였다.

이러한 방법으로, 인간 ABC1 유전자에 상응하는 게놈 서열을 분리하고 특징규명한다. 이들 서열을 데이터베이스에서 참조로 확인된 인간 및 마우스 서열과 비교하면 인트론-엑손 연접부를 결정할 수 있다.

실시예 9: ABC1 유전자에서의 다형성/돌연변이 측정

전사체의 서열에서의 또는 ABC1 유전자의 게놈 서열에서의 다형성 및/또는 돌연변이의 검출은 다양한 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. 바람직한 방법은 직접 서열분석이다. mRNA 제제를 수득할 수 있는 환자의 경우, 바람직한 방법은 cDNA를제조한 다음 직접 서열분석함에 있다. DNA만이 이용가능한 환자의 경우, 및 상응하는 유전자의 구조가 알려져 있지 않거나 부분적으로 알려진 전사체의 경우에, 상응하는 유전자의 게놈 서열 뿐만 아니라 이의 인트론-엑손 구조를 정확히 결정하는 것이 필요하다. 따라서, 이러한 과정은 실시예 8에 기재된 방법에 따라 연구된 전사체에 상응하는 게놈 DNA BAC 또는 코스미드 클론을 분리하고, 상응하는 클론의 삽입체를 서열분석한 다음 수득된 게놈 DNA의 것과 cDNA 서열을 비교함으로써 인트론-엑손 구조를 결정하는 단계를 수반한다.

직접 서열분석에 의한 돌연변이 검출기술은 질환에 대한 동형접합체 또는 적어도 8 개체(검토된 병리에 감염된 4 개체 및 비-감염 4 개체)로부터 수득된 ABC1 유전자의 게놈 서열을 비교하는 것으로 이루어진다. 서열 상이는 다형성을 구성한다. 야생형 단백질의 아미노산 서열을 변형시키는 모든 것들은 가계에서 또는 산발성 사례의 분석을 위한 사례/대조 연합의 연구에서 특히 돌연변이의 동시분리 및 질환의 연구(유전자형-표현형 상관관계)에 대해 고려하는 것이 유리한 단백질의 기능에 영향을 줄 수 있는 돌연변이일 수 있다.

실시예 10: 원인 돌연변이 또는 전사 차이에 의한 콜레스테롤의 역수송 결핍과 연관된 질환에 대한 원인 유전자의 동정

실시예 9에 기재된 방법에 따라 동정된 돌연변이 가운데, 질환 표현형과 관련된 모든 것들은 원인성일 수 있다. 이러한 결과의 증명은 모든 병에 걸린 개체에서의 유전자 서열분석 및 이들의 관계(DNA가 이용 가능한 경우)에 의해 수행된다.

더욱이, 병에 걸리거나 병에 걸리지 않은 개체에 특이적인 RNA를 사용하여,실시예 1에 기재된 방법에 따라, 노던 블롯팅 또는 RT-PCR을 수행하면 연구된 유전자의 발현 수준에서 주목할 만한 변동, 특히 유전자의 전사 부재를 검출할 수 있다.

실시예 11: 탠지어병을 앓고 있는 환자에서 ABC1 유전자의 엑손 13에서 뉴클레오타이드 결실의 동정

ABC1 유전자의 돌연변이 분석이 다수의 구성원이 조기 관상동맥 질환과 함께 탠지어병을 앓고 있는 가족에 속하는 다수 개체로부터의 게놈 DNA로 수행된다.

1 뉴클레오타이드의 결실이 엑손 13(DG 1764: Leu548Leu; 575 End)에서 동정되었다. 이 결실은 돌연변이된 ABC1 유전자에 의해 암호화되는 ABC1 단백질의 절단을 예견할 수 있게 하는 575번 위치에 정지 코돈을 도입하고, 이 절단은 정상 아미노산 서열 대부분이 결실된 폴리펩타이드, 특히 ATP에 결합하기 위한 두 카세트의 합성을 유도한다.

질환 증상의 관찰과 1 뉴클레오타이드의 이러한 결실의 존재 사이의 완벽한 상호관계가 모든 가족에서 발견되었다(도 1).

실시예 12: 뉴클레오타이드 단편의 ABC1 유전자의 엑손 12로의 삽입 동정

다수의 구성원이 탠지어병을 앓고 있는 또다른 가족에서, 엑손 12에 14개 염기쌍의 결실과 함께, Alu-sq형의 반복 뉴클레오타이드 서열 구조를 가지는 110개 염기쌍의 삽입이 관찰되었다(도 2). 이 삽입/결실 돌연변이는 65개 아미노산(DERKFW)의 결실 및 38개 아미노산(EYSGVTSAHCNLCLLSSSDSRASASQVAGITAPATTPG)에 일치하는 삽입을 예견할 수있게 한다.

이 돌연변이는 정상 ABC1 수송 폴리펩타이드의 합성을 허용하지 않는다. 따라서 이 가족 각자에서, 탠지어병이 ABC1 유전자의 결핍으로 야기된다고 결론내릴 수 있다.

실시예 13: ABC1 유전자에서 이대립 유전자 다형성의 동정

환자의 DNA 증폭을 위한 프라이머가, 인트론-엑손 연접부 및 RNA 스플라이싱 단계 중에 2차 구조의 형성을 위해 필수적인 염기의 증폭이 증폭된 단편에 포함되도록 하는 방식으로, ABC1 유전자의 인트론 DNA의 비-반복 서열로부터 디자인되었다.

특이적으로 개발된 다양한 프라이머 쌍이 표 5에 나타나 있다.

관상동맥 합병증이 없는 탠지어병 환자를 포함하는 가족으로부터의 DNA로 밝혀진 결과는 표 4에 나타나 있다.

환자의 게놈 DNA는 제조업자가 권장한 하이브리드화 조건 및 증폭 사이클 조건을 사용하는, Qiagen사의 스타 택 키트(Star Taq kit) 또는 슈퍼택 키트(Supertaq kit)를 사용하여 전술한 프라이머를 통해 증폭된다.

증폭된 PCR 산물은 이어서 Qiagen사에 의해 시판되고 있는 키트를 사용하여 정제된 다음, ABI377 서열분석기(Applied Biosystems, Perkin Elmer)로 Big Dye Terminator 법으로 서열분석된다.

실시예 14: 탠지어병과 관련있는 9q31 유전자좌의 1 cM 영역의 동정

제 1 연관성 분석은 Rust et al.의 논문(1998)에 설명되어 있다.

이 논문은 탠지어병을 앓고 있는 환자의 3 가족에 대한 연관성 분석을 제시하였고 9q31의 8 cM의 후보 구간을 규정하였다.

본 출원인은 Genethon(Dib et al., 1996)에 의해 공개된 유전자 지도를 참조로, 후보 영역을 약 1 cM으로 정리하기 위해 추가로 4 가족과 공개 데이터베이스에서 참조로 동정된 추가의 표지를 포함함으로써 연관성 연구를 수행하였다.

하기에 제시된 연관성 분석의 결과는 본 출원인이 후보 영역에서 표지 D9S271 및 D9S1866에 대해 각각 중앙(동원체)과 말단(말단 소립)인 게놈 단편을 제외하게 하였다.

따라서 후보 영역은 이들 두 개의 제외된 마커 사이에 위치한다.

후보 영역을 정리하게 하는 중요한 정보는 Rust et al.의 논문(1998)에 설명되어 있는 E1 부분의 가계도로부터 수득된다. 실제로, 모 염색체로, E121m 부분의 기원에서, 이 특허기술의 도 2에 이미 설명된 재조합 사건(교차)(표지 D9S277과 D9S53 사이)이 사실, 표지 D9S271에 대해 말단에 위치해야 함이 나타났다. 후보 구간의 중앙 경계는 D9S271과 D9S277 사이에 위치한다.

새로운 두 가족, 각각 "S1" 가족과 "NU" 가족에서, 추가의 재조합 사건이 관찰되었다. 이러한 재조합 사건은 후보 구간의 말단 경계가, 마커 D9S1677(Rust et al의 논문(1998)에 설명)에서 마커 D9S1866으로 이동할 수 있게 한다.

첫번째 가계인 "S1"이 확대된다. 병에 걸린 사람이 8 cM 영역의 모든 마커와, 이 영역의 양측에 위치하는 더 먼 마커에 대해 동형접합성 유전자형을 보인다. 두 부모(이중 친족관계)에 의해 S1과 관련있는, S1 가족의 사촌 중 한명이 4 자녀가 있다. 이들 자녀중 2명은 부계 기원의 염색체에 병에 걸린 일배체형 대부분(규정된 8 cM 영역)의 보존을 보였다. 이들 두 자녀는 또한 탠지어병을 앓고 있는 가족의 이형접합성 부모의 전형적인 특징, 즉 질환에 걸리지 않은 부모에서 관찰되는 수준의 절반인 HDL 수준을 보인다.

그러나, 마커의 동형접합성 특징은 (이들 각자에게 이형접합성인) 마커 D9S1866부터 시작되는 염색체 영역에서 더이상 관찰되지 않고, 이는 후보 영역의 말단 경계로 D9S1866을 규정하도록 한다.

동일한 말단 경계가 친 사촌인 부모의 4 자녀중 한명이 동형접합성 탠지어병에 걸린 환자인, "Nu" 가족에서 관찰되었다.

전체 후보 영역의 마커에 대한 동형접합이 이 환자에서 관찰되었다.

이형접합성(표현형 수준)인, 그의 형제중 한명이 두 염색체중 하나에서 재조합 사건(교차)을 보여, 이 형제는 마커 D9S1866을 포함하는 모든 말단 마커에 대해 동형접합성(유전자 수준)이지만, 중앙 근처 영역에 위치하는 마커에 대해서는 이형접합성(유전자 수준)이다.

이 환자가 동형접합성 환자의 표현형을 보이지 않기 때문에, 마커 D9S1866을 포함하는 말단 영역을 제외할 수 있다.

실시예 15: 인간 ABC1 유전자의 분리 및 특징규명

인간 ABC1 cDNA의 약 3 kb 단편을 ABC1의 제 1 ATP-결합 도메인을 함유하는 "pf10"으로 명명된 cDNA 클론으로부터 수득하는데, 이 cDNA 클론은 Luciani et al.의 논문(1994)에 설명되어 있다.

제한 엔도뉴클레아제 EcoRI를 통한 클론 pf10의 분해에 의해 수득되는 이 cDNA 단편은, 전기영동 후에 아가로스 겔 상에 분리되고, 이어서 제조업자의 지시에 따라 디곡시게닌으로 표지된다(Boehringer Mannheim에 의해 시판되는 키트).

표지된 cDNA 단편은 Nylon^TM필터에 고정된, 9번 염색체의 LLNL 코스미드 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용된다.

6개의 양성 클론이 동정되었다. 이들 6 코스미드를 위해, 탐침은 단일 콜로니로 하이브리드화되었다.

대표적인 클론이 이들 콜로니 각각으로부터 분리되었다.

클론 LLNLC 131J087 Q2(본원에서 cos3a로 명명) 및 LLNLc 131O1165 Q2(본원에서 cos6f로 명명)이 더욱 상세히 분석되었다.

클론 cos3a는 EcoRI 단편 형태로 벡터 Gen3zf(-)로 아클로닝되고 ABI377형 서열분석기로 Big Dye Terminator 기술을 사용하여 양단에서 서열분석된다.

벡터의 서열과 하이브리드화하는 프라이머를 통해 완벽하게 서열분석하기에는 너무 긴 특이한 삽입물(다양한 삽입물의 말단을 서열분석한 후에 결정되거나 이의 크기를 측정)을 함유하는 클론은 트랜스포손 삽입에 이어서, 트랜스포손에 특이적인 프라이머를 통해 서열분석하는 기술(New Englnad Biolabs사에 의해 시판되는 "GPS" 시스템)로 훨씬 전에 분석되었다.

이 방법으로, 인간 ABC1 유전자에 상응하는 게놈 서열이 분리되고 특징규명되었다. 이들 서열은 데이터베이스에서 참조로 동정된 인간과 마우스 서열을 비교한다.

인트론-엑손 연접부 서열이 결정되었다.

환자의 DNA를 증폭시키기 위한 프라이머가 인트론-엑손 연접부 및 스플라이싱 단계 중에 2차 구조의 형성을 위해 필수적인 염기의 증폭이 증폭된 단편에 포함되도록 하는 방식으로, ABC1 유전자의 인트론 DNA의 비-반복 서열로부터 디자인되었다.

환자의 게놈 DNA는 제조업자가 권장하는 하이브리드화 조건 및 증폭 사이클 조건을 사용하는, Qiagen사의 스타 택 키트 또는 슈퍼택 키트를 사용하여 전술한 프라이머를 통해 증폭되었다.

증폭된 PCR 산물은 이어서 Qiagen사에 의해 시판되는 키트로 정제된 다음, ABI377 서열분석기로 Big Dye Terminator 법으로 서열분석되었다.

실시예 16: ABC1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 재조합 벡터의 작제

I. 인간 ABC1 유전자의 합성

인간 태반 조직에서 분리된 전체 RNA(500 ng)(미국 캘리포니아 팔로 알토 소재의 Clontech)가 시스템 Superscript 1 단계 RT-PCR(미국 메릴랜드 게이터스버그 소재의 Life Technologies) 및 하기의 ABC1(0.25 μM)에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는, 인간 ABC1 유전자의 cDNA의 합성을 위한 공급원으로 사용되었다:

- 전진 프라이머: 5'-CTACCCACCCTATGAACAAC-3'(ABC1 cDNA의 nt 75-94);

- 후진 프라이머: 5'-1GCCACCCCGTATGAACAGGG-3'(ABC1 cDNA의 nt 6731-6751).

이들 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 ABI 394형의 DNA 합성기(미국 캘리포니아 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems)로 포스포아미다이트 방법으로 합성된다.

제한효소 NotI에 의해 인식되는 부위는 디데옥시뉴클레오타이드 dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP 각각 200 μM 및 Pyrococcus furiosus DNA 폴리머라제(미국 캘리포니아 라 졸라 소재의 Stratagene, Inc.)의 존재하에 주형으로서 인간 ABC1 cDNA 50 ng과 5' 말단에 제한효소 NotI에 의해 인식되는 부위를 함유하는 전술한 올리고뉴클레오타이드 프라이머 0.25 μM을 사용하는 신규 증폭 단계에 의해 증폭된 6676개 염기쌍의 cDNA로 도입된다.

PCR 반응은 PCR용 써모사이클러 장치(미국 코네티컷 소재의 Cetus Perkin Elmer Norwalk)로 95℃에서 1분간의 변성 단계, 50℃에서 1분간의 재성 단계 및 72℃에서 2분간의 연장 단계를 각각 포함하는 30 사이클에 걸쳐서 수행된다.

II. 인간 ABC1 유전자의 cDNA의 발현벡터로의 클로닝:

인간 ABC1 cDNA의 6676개 염기쌍 삽입물이 pABC1으로 명명된 발현벡터를 생산하기 위해, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 및 인핸서 서열과 SV40 폴리아데닐화 시그널(Beg et al., 1990; Applebaum-Boden, 1996)을 함유하는 발현벡터 pCMV의 NotI 제한 부위로 클로닝된다.

클로닝된 cDNA의 서열은 ABI 310형 모세관 서열분석기(미국 캘리포니아 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems)로 반응 세트 "ABI Prism Big Dye TerminatorCycle Sequencing ready"(미국 캘리포니아 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems에 의해 시판)를 사용하여 이본쇄를 서열분석함으로써 확인된다.

III. 인간 ABC1 유전자의 cDNA를 함유하는 재조합 아데노바이러스 벡터의 작제

A- 발현벡터 pCMV-β의 변형

발현벡터 pCMV-β(미국 캘리포니아 팔로 알토 소재의 Clontech, 유전자 은행 수탁번호 UO2451)의 β-갈락토시다제 cDNA가 제한 엔도뉴클레아제 NotI로 분해됨으로써 결실되어 5' 말단부터 3' 말단으로 하기 부위를 함유하는 다중 클로닝 부위로 대체된다:

NotI, AscI, RsrII, AvrII, SwaI 및 NotI(다중 클로닝 부위의 서열):

5'-CGGCCGCGGCGCGCCCGGACCGCCTAGGATTTAAATCGCGGCCCGCG-3'

이 다중 클로닝 부위는 NotI 부위의 수준에서 클로닝되었다.

변형된 발현벡터 pCMV의 EcoRI과 SanI 부위 사이의 DNA 단편이 분리되고 셔틀 벡터 pXCXII(McKinnon et al., 1982; McGrory et al., 1988)의 변형된 Xbal 부위로 클로닝된다.

B- 셔틀 벡터 pXCXII의 변형

5' 말단에서 3' 말단 방향으로 XbaI, EcoRI, SfiI, PmeI, NheI, SrfI, PacI, SalI 및 Xbal 제한 부위(하기 서열)를 포함하는 다중 클로닝 부위가 벡터 pXCXII(McKinnon et al., 1982; McGrory et al., 1988)의 Xbal 부위(3329 위치의 뉴클레오타이드) 수준에서 삽입된다:

5'-GCTCTAGAATTCGGCCTCCGTGGCCGTTTAAACGCTAGCGCCCGGGCTTAATTAAGTCGACTCTAGAGC-3'

CMV 프로모터/인핸서, FV40의 공여자 및 수용자 스플라이싱 부위 및 FV40의 폴리아데닐화 시그널을 함유하는 변형된 벡터 pCMV-β에서 분리된 EciRI-SalI DNA 단편은 이어서 pCMV-11로 명명된, 변형된 셔틀 벡터 pXCX의 EcoRi-SalI 부위로 클로닝된다.

C- 셔틀 벡터 pAD12-ABC1의 제조

인간 ABC1 cDNA가 RT-PCR 반응에 의해 전술한 바와 같이 수득되고, 벡터 pCMV-12로 NotI 부위의 수준에서 클로닝되어, 벡터 pCMV-ABC1이 수득된다.

벡터 pCMV-ABC1에 함유되어 있는 ABC1 cDNA는 인간 ABC1 cDNA의 75번 위치의 뉴클레오타이드에서 6751번 위치의 뉴클로오타이드로 진행하는 서열을 포함하는 6676개 염기쌍의 DNA 단편으로 구성된다.

D- ABC1 재조합 아데노바이러스의 작제

인간 ABC1 cDNA를 함유하는 ABC1-rldV 재조합 아데노바이러스가 McGrory et al.(1988)에 의해 설명된 기술에 따라 작제되었다.

간단히 설명하면, 벡터 pAD12-ABC1이 CHEN 및 OKAYAMA(1987)의 기술에 따라 벡터 tGM17로 동시 형질감염되었다.

마찬가지로, 벡터 pAD12-루시퍼라제가 작제되었고 벡터 pJM17로 동시 형질감염되었다.

재조합 아데노바이러스는 PCR 증폭에 의해 동정되었고 태아 신장 세포주HEK293(미국 메릴랜드 록빌 소재의 American Type Culture Collection)의 대규모 증폭 전에 2회 정제 사이클에 가해졌다.

감염된 세포를 아데노바이러스 벡터로의 감염 48 내지 72시간 후에 수집하여 5회 동결-해동 용해 사이클에 가한다.

조 용해물을 Freon(미국 뉴저지 스카우쿠스 소재의 Halocarbone 113, Matheson Product)으로 추출하고, 0.2% 쥐 알부민(미국 미주리 세인트 루이스 소재의 Sigma Chemical Co.)이 보충된 세슘 클로라이드에서 2회 침강시킨 다음 150 nM NaCl, 10 mM Hepes(pH 7.4), 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂및 1 mM CaCl₂로 구성된 완충액으로 철저하게 투석한다.

재조합 아데노바이러스를 -70℃에서 저장하고 동물에 투여하거나 배양액에서 세포와 함께 배양하기 전에 적정한다.

야생형 오염 아데노바이러스의 부재는 결실된 영역의 구조적인 부분에 위치하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 PCR 증폭을 통해 스크리닝함으로써 확인된다.

IV 인간 ABC1 cDNA의 발현 확인

인간 ABC1 폴리펩타이드에 대해 특이적인 폴리클로날 항체가 ABC1 단백질로부터 유도된, 합성 폴리펩타이드 "LHKNQTVVDVAVLTSFLQDEKVKESYV"를 주입함으로써 토끼 및 닭에서 제조된다. 이들 폴리클로날 항체는 면역블롯팅 및/또는 면역검출에 의해 세포 및 동물 모델에서 인간 ABC1 유전자의 발현을 검출하고/하거나 정량하는데 사용된다.

ABC1의 생물학적 활성은 콜레스테롤이 로딩된 벡터 pCMV-ABC1으로 형질감염된 세포를 사용하여 apoA-I에 의해 유도된 콜레스테롤 플럭스를 정량함으로써 모니터될 수 있다(Ramaley et al., 1997).

V. 세포에서 인간 ABC1 cDNA의 시험관내 발현

HEK293 세포주와 COS-7 세포주의 세포(미국 메릴랜드 베테스다 소재의 American Tissue Culture Collection), 및 탠지어병 환자 또는 저알파지방단백혈증을 앓고 있는 환자로부터 유도된 1차 배양액 중의 섬유아세포가 리포펙타민(미국 메릴랜드 게이터스버그 소재의 BRL)을 사용하거나 칼슘 클로라이드를 통한 공침(Chen et al., 1987)에 의해 발현벡터 pCMV-ABC1(5-25 ㎍)로 형질감염된다.

이들 세포는 또한 벡터 pABC1-AdV(감염 지수, MOI=10)로 감염될 수 있다.

인간 ABC1의 발현은 면역블롯팅 및 형질감염 및/또는 감염된 세포를 사용하는 apoA-1에 의해 유도된 콜레스테롤의 유출량 정량에 의해 모니터될 수 있다.

탠지어병 환자 및 저알파지방단백혈증 환자에게 일어난 유전자 결함의 이들 환자의 섬유아세포를 사용하는 보상은 정상 ABC1 유전자의 발현 검출에 의해 확인될 수 있고, 이는 이 수용체의 기능적 중요성을 확립할 수 있게 한다.

VI. 각종 동물 모델에서 ABC1 유전자의 생체내 발현

용해물 10⁸내지 10⁹플라크-형성 단위(PFU)를 함유하는 정제된 재조합 아데노바이러스(pABC1-AdV 또는 pLucif-AdV)를 함유하는 배지 적당량(100 내지 300 ㎕)을 실험 0일에 마우스(대조 마우스와 트랜스제닉 또는 녹-아웃 마우스 모델 모두 C57BL/6)의 복재 정맥에 주입한다.

지방단백질의 대사에서 ABC1 단백질의 생리학적 역할 평가는 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 인지질 및 유리 콜레스테롤(미국 버지니아 리치몬드 소재의 Sigma and Wako Chemicals), 콜레스테롤-HDL(미국 오하이오 오베를린 소재의 CIBA-Corning) 및 마우스로부터의 아포지방단백질 A-I, A-II, E 및 B(Foger et al., 1997)의 전량을 아데노바이러스 투여 전(0일)후(2, 4, 7, 10, 14일)에 측정함으로써 수행된다.

ApoA-I-HDL, CE-HDL 및 apoB-LDL, CE-LDL과 같은 방사능 표지된 산물을 통한 역학 연구는 ABC1의 발현이 HDL과 LDL의 대사 및 콜레스테롤의 간으로의 분비에 끼치는 영향을 평가하기 위해 벡터 rLucif-Adv 및 rABC1-AdV의 투여 5일 후에 수행된다.

ABC1의 발현이 죽상경화 유발에 끼치는 영향은 벡터 rABC1-AdV의 투여 후에 apoE 마우스에서 대동맥 병리의 평균 표면적을 정량함으로써 평가될 수 있다.

추가로, ABC1 유전자를 과발현하는 트랜스제닉 마우스 및 토끼는 Waisman(1995) 및 Hoeg(1996)의 교시에 따라 인간 ABC1 cDNA를 함유하는 작제물을 사용하여 ABC1, CMV 또는 apoE와 같은 내생성 프로모터의 조절하에 생산될 수 있다.

ABC1 발현이 혈장 지질, 지방단백질 및 아포지방단백질의 역학과 죽상경화에 끼치는 장기 효과의 평가도 전술한 바와 같이 수행될 수 있다.

실시예 17: ABC1 단백질에 대한 효능제 및 길항제 분자의 스크리닝을 위한 소포의 사용

이 시험의 기초는 ABC1 단백질을 도입하였고 콜레스테롤 또는 인지질과 같은 기질을 함유하는 막의 재구성이다. ABC1 단백질은 이어서 해당 분자의 첨가로 활성화되거나 이의 기능이 저하될 수 있다. ABC1 단백질에 의해 형성된 채널을 통한 기질의 유출이 이어서 검출된다.

a)ABC1 단백질과 표지된 지질 기질을 함유하는 막의 재구성.

유기 용매를 사용하는 방법, 초음파처리와 같은 기계적 수단, "French press" 또는 동결-해동 사이클 또는 세제(콜레이트, Chaps, Chapso)를 사용하는, 다양한 전략이 이러한 막을 제조하기 위해 사용될 수 있다(참조문헌: Rigaud et al. Biochimica et Biophysica Acta 1231 (1995) 223-246). 더욱 자세히 설명하면, 인지질, 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 에스테르와 같은 지질 기질, 3H-콜레스테롤, 125-I-콜레스테롤 또는 3H-포스파티딜콜린형의 방사능 기질 또는 NBD 또는 피렌(분자 탐침: http://www.probes.com)으로의 형광성 기질 및 에그로부터의 포스파티딜에콜린(1 mM)이 유리 플라스크의 펠렛 상에서 건조된다. 나트륨 콜레이트와 ABC1 단백질이 이 플라스크에서 몰 대 몰의 비 0.3으로 혼합된다. 전체를 5분간 와동-혼합한 다음 25℃에서 30분간 배양하고, 이어서 식염수 완충액으로 투석한다. 이 프로토콜에 따라 생산된 프로테오리포솜이 이의 제조가 양호함을 입증하기 위해 탁도계로 모니터된다.

b)프로테오리포솜의 고체 표면 상에의 포획

이 단계는 인테그린형의 결합 단백질을 도입함으로써 수행될 수 있다. 이 프로토콜에서, ABC1 단백질에 대한 항체 및 96- 또는 384-웰 플레이트에 이미 흡착된 항체에 의한 포획이 사용된다. 이러한 항체를 100 ㎍/ℓ의 농도로 함유하는 용액이 밤새 4℃에서 배양됨으로써 이러한 다중 웰 플레이트에 흡수된다. 세척 후에, 플레이트는 이어서 2시간 동안 37℃에서 배양된 소 알부민 1 mg/㎖로 포화된다. 이어서 전체를 세척하여 2시간 동안 37℃에서 ABC1을 함유하는 프로테오리포솜과 함께 배양한다.

c)해당 분자에 결합

이 단계는 1시간 동안 37℃에서 산물을 배양함으로써 수행된다.

d) ABC1 단백질의 활성화 또는 억제 측정

기질이 형광성이면, 상등액의 형광성이 지질의 프로테오리포솜 외측으로의 수송을 유도하는 산물의 활성을 보여준다. 이와 달리, Confocal 시스템의 사용은 프로테오리포솜 내외의 기질량에 대한 정보를 제공한다. 기질이 방사능성이면, 섬광 액체를 바닥에 가지는 CytoStar형 플레이트의 사용이 프로테오리포솜에서 격리된 기질을 나타낼 수 있다.

실시예 18: ABC1 단백질에 대한 효능제 및 길항제 분자의 스크리닝을 위한 음이온 수송의 사용

이 시험 원리는 ABC1 단백질이 이의 활성화 중에 음이온을 수송하는 능력을 가진다는 성질에 있다.

a)THP-1 세포주의 대식세포(단핵구성 백혈병 인간 세포)는 분화 대식세포의모델이다. 이 세포가 48-다중 웰 플레이트의 10% 태 송아지 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 웰당 2105 세포의 밀도로 배양된다. 탠지어병을 앓고 있는 환자의 섬유아세포는 음성 대조로 사용될 수 있는데 그 이유는 이들의 ABC1 단백질이 기능적이지 않기 때문이다. 또다른 음성 대조는 항-ABC1 항체의 첨가에 의해 수득될 수 있다.

b)음이온 수송 결핍 세포 또는 음이온 채널 차단제(P-당단백질의 차단제인 베라파밀형 또는 칼륨 채널 차단제인 테트라에틸암모늄)로 처리된 세포 또한 사용될 수 있다.

c)실제 시험 자체를 위해, 세포는 이어서 이 ESS 배지에 30분간 37℃에서 1 μmol/ℓ(0.1 μCi/Nal125 ㎖)로 Kl 1 ㎖가 예비로딩된 얼스(Earles's) 변형된 염 용액(ESS) 배지로 세척된다. 산물은 이어서 세포외 배지에 첨가된다. 이어서 세포는 ESS 배지로 세척된다.

d)배지 중의 아이오다이드 양이 매분마다 11분간 검출된다. 처음 두 점은 기본 유출량에 해당한다. 배양 후반에, 배지를 취하고 세포에 잔류하는 요오드 양을 1몰 NaOH에 세포를 용해시킨 후에 측정한다.

e)0 시점에 방사능의 총량은 상등액에서 발견되는 방사능과 세포의 잔류 방사능의 총계에 해당한다. 유출량 곡선이 배지에 방출되는 방사능의 %를 시간의 함수로 플로팅함으로써 만들어진다.

실시예 19: ABC1 단백질에 대한 효능제 및 길항제 분자의 스크리닝을 위한 IL-1 베타를 발현하는 THP-1 대식세포의 사용

이 시험 원리는 ABC1 단백질의 활성을 조절하는 임의의 물질이 IL-1 베타의 합성에 영향을 끼친다는 것이다.

a)THP-1 세포주의 대식세포(단핵구성 백혈병 인간 세포)는 분화 대식세포의 모델이다. 세포는 다중 웰 플레이트의 10% 태 송아지 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 웰당 2105 세포의 밀도로 배양된다.

b)실제 시험 자체를 위해, 세포를 이어서 세척하고 1 mg/정제된 인간 알부민 분획 IV ㎖를 함유하는 RPMI 1640 배지에 둔다.

c)산물이 세포외 배지에 첨가된다. 동시에, 세포는 이어서 3시간에 걸쳐 1 ㎍/㎖로 리포폴리사카라이드(LPS)를 첨가함으로써 활성화된 다음 5 mmol/ℓ로 ATP의 존재하에 30분간 배양된다.

d)IL-1 베타 및 대조 IL-1 알파, 종양 괴사인자 알파(TNF 알파) 및 IL-6의 농도가 제조업자의 지시에 따라 ELISA 키트에 의해 측정된다(R&D System; 인간 IL-1 베타 화학발광 ELISA 참조 QLB00). 영향받지 않는 IL-1 베타에 대한 mRNA의 변화가 상응하는 탐침으로 노던 블롯팅 기술에 의해 평가된다.

참조문헌

Claims (51)

1. 서열번호 1 내지 14의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드의 적어도 245개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산, 또는 상보 서열을 갖는 핵산.
2. 서열번호 15 내지 47의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산, 또는 상보 서열을 갖는 핵산.
3. 서열번호 48 내지 90의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산, 또는 상보 서열을 갖는 핵산.
4. 서열번호 48 내지 90의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드와 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산, 또는 상보 서열을 갖는 핵산.
5. 고 엄격 조건하에서, 서열번호 48 내지 90의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 핵산, 또는 상보 서열을 갖는 핵산.
6. 서열번호 91의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산, 또는 상보 서열을 갖는 핵산.
7. 서열번호 92의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산, 이의 생물학적 활성 단편 또는 상보 서열을 갖는 핵산.
8. 서열번호 92의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드와 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산, 이의 생물학적 활성 단편 또는 상보 서열을 갖는 핵산.
9. 고 엄격 조건하에서, 서열번호 92의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 핵산, 이의 생물학적 활성 단편 또는 상보 서열을 갖는 핵산.
10. 서열번호 93 내지 96의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 핵산, 또는 상보 서열을 갖는 핵산.
11. 서열번호 93 내지 96의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드와 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산, 또는 상보 서열을 갖는 핵산.
12. 고 엄격 조건하에서, 서열번호 93 내지 96의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 핵산, 또는 상보 서열을 갖는 핵산.
13. 서열번호 97 내지 108의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 갖고 다형성 염기를 포함하는 핵산, 또는 상보 서열을 갖는 핵산.
14. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 중에서 선택된, 적어도 15개 뉴클레오타이드 길이를 갖는, ABC1 유전자에 특이성을 띠는 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머.
15. 제 14 항에 있어서, 서열번호 109 내지 138의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 탐침 또는 프라이머, 또는 상보 서열을 갖는 핵산.
16. 제 11 항 및 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 중에서 선택된, 적어도 15개 뉴클레오타이드 길이를 갖는, ABC1 유전자에서의 돌연변이 검출에 유용한 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머.
17. 제 16 항에 있어서, 서열번호 109 내지 112의 뉴클레오타이드 서열 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머, 또는 상보 서열을 갖는 핵산.
18. 제 13 항에 따른 핵산 중에서 선택된, 적어도 15개 뉴클레오타이드 길이를 갖는, ABC1 유전자에서의 다형성 검출에 유용한 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머.
19. 제 18 항에 있어서, 서열번호 142 내지 149의 뉴클레오타이드 서열 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 탐침 또는 프라이머, 또는 상보 서열을 갖는 핵산.
20. 서열번호 97 내지 108의 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 상보 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 이들 프라이머의 3′말단의 염기가 서열번호 97 내지 108의 서열또는 이들의 상보 서열 중 하나의 다형성 염기의 5′쪽에 바로 위치한 뉴클레오타이드와 상보성인 뉴클레오타이드 프라이머.
21. 서열번호 97 내지 108의 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 상보 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 이들 프라이머의 3′말단의 염기가 서열번호 97 내지 108의 서열 또는 이들의 상보 서열 중 하나의 다형성 염기의 5′쪽의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 뉴클레오타이드 또는 그 이상에서 위치된 뉴클레오타이드와 상보성인 뉴클레오타이드 프라이머.
22. a)증폭반응에 필요한 시약의 존재하에서, 표적 핵산의 존재가 추정되는 샘플을, 하이브리드화 위치가 증폭시키고자 하는 표적 핵산 영역의 5′쪽 및 3′쪽에 각각 위치하는 뉴클레오타이드 프라이머의 쌍과 접촉시킨 다음;

    b)증폭된 핵산을 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에 함유된 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 증폭방법.
23. 제 22 항에 있어서, 뉴클레오타이드 프라이머가 제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 중에서 선택됨을 특징으로 하는 증폭방법.
24. a)하이브리드화 위치가 증폭시키고자 하는 표적 핵산의 5′쪽 및 3′쪽에 각각 위치하는 뉴클레오타이드 프라이머의 쌍;

    b)경우에 따라, 증폭반응에 필요한 시약을 포함하는, 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 증폭 박스.
25. 뉴클레오타이드 프라이머가 제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로 하는, 제 22 항에 따른 핵산 증폭 박스.
26. 제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재가 검출 가능한 마커 화합물을 포함함을 특징으로 하는 뉴클레오타이드 탐침.
27. a)제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 핵산 탐침을 시험될 샘플과 접촉시킨 다음;

    b)탐침과 샘플에 존재하는 핵산간에 형성될 수 있는 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플내 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 존재 검출 방법.
28. 제 27 항에 있어서, 탐침이 지지체상에 고정됨을 특징으로 하는 검출방법.
29. a)제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 뉴클레오타이드 탐침;

    b)경우에 따라, 하이브리드화 반응에 필요한 시약을 포함하는, 샘플내 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 존재 검출 박스.
30. 제 29 항에 있어서, 탐침이 지지체상에 고정됨을 특징으로 하는 검출 박스.
31. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
32. 제 31 항에 있어서, 아데노바이러스임을 특징으로 하는 벡터.
33. 제 32 항 및 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, ABC1-rldV임을 특징으로 하는 벡터.
34. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포.
35. 서열번호 140의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드.
36. 서열번호 141의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드.
37. 제 35 항 및 제 36 항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드에 대한 항체, 또는 이의 펩타이드 단편.
38. 제 37 항에 있어서, 검출 가능한 화합물을 포함함을 특징으로 하는 항체.
39. a)샘플을 제 37 항 및 제 38 항 중 어느 한 항에 따른 항체와 접촉시킨 다음;

    b)형성된 항원/항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플내 제 35 항 및 제 36 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드의 존재 검출방법.
40. a)제 37 항 및 제 38 항 중 어느 한 항에 따른 항체;

    b)형성된 항원/항체 복합체의 검출을 허용하는 시약을 포함하는, 샘플내 제 35 항 및 제 36 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드의 존재 검출용 진단박스.
41. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 하나 이상의 생리학적으로 상용성인 부형제와 함께 포함하는, 콜레스테롤 역수송에서의 기능장애에 걸린 피검자의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
42. 제 31 항에 따른 재조합 벡터를 하나 이상의 생리학적으로 상용성인 부형제와 함께 포함하는, 콜레스테롤 역수송에서의 기능장애에 걸린 피검자의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
43. 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증의 예방 또는 특히 콜레스테롤 역수송에서의 기능장애에 걸린 피검자의 치료용 의약의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 용도.
44. 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증 예방 또는 특히 콜레스테롤 역수송에서의 기능장애에 걸린 피검자 치료용 의약의 제조를 위한 제 31 항에 따른 재조합 벡터의 용도.
45. 제 44 항에 있어서, 벡터가 ABC1-rldV임을 특징으로 하는 용도.
46. 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증 예방 또는 특히 콜레스테롤 역수송에서의 기능장애에 걸린 피검자 치료용 의약의 제조를 위한 서열번호 139의 서열을 갖는 ABC1 폴리펩타이드의 용도.
47. 서열번호 139의 서열을 갖는 치료 유효량의 폴리펩타이드를 포함하는, 콜레스테롤 역수송에서의 기능장애에 걸린 피검자의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
48. 콜레스테롤 역수송에서의 기능장애에 연유한 질환의 예방 또는 치료용 활성 성분의 스크리닝을 위한, ABC1 폴리펩타이드, 또는 ABC1 폴리펩타이드 발현 세포의 용도.
49. a)ABC1 폴리펩타이드 및 검출 가능한 마커를 포함하는 지질 기질을 함유하는 막 소포를 제조하고;

    b)단계 a)에서 수득한 소포를 효능제 또는 길항제 후보 화합물과 배양하며;

    c)검출 가능한 마커를 포함하는 지질 기질의 방출을 정성적으로 및/또는 정량적으로 측정한 다음;

    d)단계 b)에서 수득된 측정치를 효능제 또는 길항제 후보 화합물과 사전에 배양시키지 않은 소포에 의한 표지된 지질 기질의 방출 측정치와 비교하는 단계를 포함하는, 콜레스테롤의 대사에 활성인 화합물, ABC1 폴리펩타이드의 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법.
50. a)세포, 예를 들면, 선천적으로 또는 형질감염 후 ABC1 폴리펩타이드를 발현하는 세포주를 수득하고;

    b)단계 a)의 세포를 검출 가능한 마커로 표지한 음이온의 존재하에 배양하며;

    c)단계 b)의 세포를 세척하여 이들 세포 중으로 침투되지 않은 과량의 표지된 음이온을 제거하며;

    d)단계 c)에서 수득된 세포를 ABC1 폴리펩타이드에 대한 효능제 또는 길항제 후보 화합물과 배양하며;

    e)표지된 음이온의 유출을 측정한 다음;

    f)단계 e)에서 측정된 표지된 음이온의 유출치를 ABC1 폴리펩타이드에 대한 효능제 또는 길항제 후보 화합물의 존재하에 사전에 배양시키지 않은 세포로 측정된 표지된 음이온의 유출치와 비교하는 단계를 포함하는, 콜레스테롤의 대사에 활성인 화합물, ABC1 폴리펩타이드의 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법.
51. a)적당한 배양 배지에서, 정제된 인간 알부민의 존재하에 인간 단핵구 세포주의 세포를 배양하고;

    b)단계 a)의 세포를 IL-1 베타의 생성을 자극하는 화합물 및 효능제 또는 길항제 후보 화합물의 동시 존재하에 배양하며;

    c)단계 b)에서 수득된 세포를 적당한 농도의 ATP 존재하에 배양하며;

    d)세포 배양 상등액 중으로 방출된 IL-1 베타를 측정한 다음;

    e)단계 d)에서 수득된 IL-1 베타의 방출치를 효능제 또는 길항제 후보 화합물의 존재하에 사전에 배양시키지 않은 세포의 배양 상등액 중으로 방출된 IL-1 베타의 값과 비교하는 단계를 포함하는, 콜레스테롤의 대사에 활성인 화합물, ABC1 폴리펩타이드의 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법.