JP2002523472A

JP2002523472A - 自己抗体抑制剤

Info

Publication number: JP2002523472A
Application number: JP2000567238A
Authority: JP
Inventors: ジェナイン，クロード，ピー．; ハウザー，ステファン，エル．
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1998-08-26
Filing date: 1999-08-26
Publication date: 2002-07-30
Also published as: CA2341240A1; DE69935603T2; EP1115425A1; EP1115425A4; AU6240299A; US6573236B2; WO2000012126A1; ATE357247T1; DE69935603D1; US20020068058A1; US6333033B1; CA2341240C; EP1115425B1

Abstract

(57)【要約】本発明はミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）自己抗原への病原性自己抗体の病原性結合を抑制し、ＭＯＧ自己抗原への自己抗体の病原性結合の抑制剤をスクリーニングする方法と組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】この発明は国立保険研究所により与えられる助成金番号ＡＩ４３０７３での政
府の支援下でなされた。政府はこの発明に一定の権利を有している。（緒言）関連出願この出願は１９９８年８月２６日に出願された米国仮出願６０／０９７，９５
３に基づく優先権を主張するものである。発明の分野この発明の分野は、ポリペプチド自己抗体抑制剤及びその使用方法である。

【０００２】背景多発性硬化症（ＭＳ）は３５０，０００人のアメリカ人を蝕み、外傷の次に、
若い成人の能力障害の主な原因となっている中枢神経系の慢性再発性緩解性障害
疾患である。ＭＳはマクロファージと単核細胞からなる小静脈周囲の白質浸潤（
炎症）と、神経線維を遮蔽する髄鞘の破壊（脱髄）により病理学的に特徴づけら
れる免疫媒介障害である。

【０００３】齧歯類における実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、ヒトのＭＳに対す
る治療法を試験するために最も広く用いられているモデルである。ＭＳに対する
かかる伝統的な疾患モデルは一般にＭＳがＴ細胞媒介障害であるという概念を助
長した。しかしながら、免疫攻撃の標的となる自己抗原は同定されておらず、ミ
エリン損傷を生じている分子メカニズムは分からないままである。ＥＡＥにおけ
るＣＮＳの炎症はクラスＩＩ-ＭＨＣ分子という意味でミエリン抗原を認識する
自己攻撃的Ｔ細胞により惹起されることが明らかであるところ、多くのモデルは
ＭＳ破壊の早期の脱髄成因を欠いている。Ｂ細胞活性化と抗体応答がＥＡＥの完
全な発達に必要であると思われ、ＣＮＳ組織のミエリン化培養物を用いる免疫媒
介脱髄に関する初期の研究はエフェクター機構として体液性因子を関連づけた。
従って、臨床過程、症状、及びミエリンタンパク質に対する免疫応答において基
本的な差異があり齧歯類ＥＡＥとヒトＭＳは区別されるので、齧歯類ＥＡＥがヒ
トにおける効能の強力な予知者ではなかったことは驚くべきことではない。

【０００４】最近、非近交系非ヒト霊長類である、普通のマモセットCallithrix jacchusに
おける新規なＭＳ様疾患が明らかにされた。マモセットＥＡＥは、ミエリン特異
的自己抗体の存在を必要とする卓越したＭＳ様早期脱髄成因を有しており、これ
らの抗体とミエリン上のその標的抗原の間の相互作用を理解する機会を提供した
。そのモデルの特徴には次のものが含まれる：ａ．穏やかな臨床徴候とＭＳに類
似した再発性緩解性過程；ｂ．ＭＳ破壊と区別できない早期のグリオーシスを示
す原発生脱髄症状（脱髄プラーク）；ｃ．脳炎惹起性（例えば疾患誘発性）Ｔ細
胞クローン及び株の成功裡の養子移入を許容する自然の骨髄キメラ化；ｄ．主要
ミエリンタンパク質ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に対して反応性のＴ細
胞の脳炎惹起性レパートリーの多様性；ｅ．異なったミエリン成分での免疫によ
り生じる異なった疾患表現型：全ミエリンに対して、ＭＢＰでの免疫はＥＡＥの
非脱髄形態をつくりだす；ｆ．脱髄が抗体媒介であるがまた脳炎惹起性Ｔ細胞応
答を必要とし、神経系への自己抗体の接近を容易にするという証明；及びｇ．プ
ラーク形成におけるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）の重
要な役割：非脱髄ＭＢＰ-ＥＡＥにおける抗ＭＯＧ抗体の養子移入は完全に発達
したＭＳ様症状を再現する。

【０００５】ＭＯＧの高度に免疫原生の性質（全ミエリンタンパク質の０．０５％未満）は
髄鞘の最外ラメラ上のその細胞外位置に関連しており、そこでは、脳炎惹起性Ｔ
細胞による血液脳関門の破壊の意味で病原性抗体に到達できる。マモセットモデ
ルは、ヒトに対して９０−９５％相同性である免疫及び神経系遺伝子を持つ種に
おいてＭＳ様破壊を生じる細胞性及び体液性免疫応答の正確な同定を可能にする
。ヒトＭＳとのこのモデルの関連性は、ＭＳ患者におけるＭＯＧに対する強いＴ
細胞及び抗体応答の最近の発見により更にはっきりとした。

【０００６】 (発明の概要) 本発明は自己抗体抑制剤とその使用方法に関する。従って、本発明は、自己抗
原への自己抗体の病原性結合を抑制し、自己抗原に対する自己抗体の病原性結合
の抑制剤をスクリーニングする方法と組成物を提供する。一側面では、本発明は、ラット、ヒト又はマモセットＭＯＧの残基２８−３６
、１３−２１、６２−７４、２７−３４又は４０−４５からなるペプチドを含ん
でなる組成物を提供する。好適な実施態様では、ＭＯＧポリペプチドは天然のヒ
ト又はマモセットＭＯＧフランキング残基以外のものとそのＮ及びＣ末端におい
て直接結合する。

【０００７】他の側面では、本発明はＭＯＧ又はその免疫優性エピトープに対するＭＯＧ特
異的自己抗体の病原性結合を抑制する方法を提供する。更に他の側面では、本発明は組織試料中の自己抗体を検出する方法を提供する
。好適な実施態様では、ヒトＭＳ及びマモセットＥＡＥの破壊内のミエリン／オ
リゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）に対する自己抗体を同定する方法が
提供され、そこではこれらが髄鞘分解の直接的な原因であると思われる。更なる側面では、本発明は自己抗原に結合可能で、よって自己抗体の結合を抑
制する小分子又は候補薬剤をスクリーニングする方法を提供する。本方法は自己
抗原と自己抗体を含んでなる溶液を接触させ、反応を平衡に達せしめるのに十分
な条件下でインキュベートし、その小分子抑制剤又は候補薬剤の存在下での自己
抗体の結合と、小分子抑制剤又は候補薬剤の不存在下での自己抗体の結合を比較
することを含んでなる。好適な実施態様では、小分子は自己抗原の少なくとも一
つの免疫優性エピトープに特異的に結合する。

【０００８】本発明の更に他の側面では、病原性自己抗原-自己抗体結合媒介症状に罹って
いる宿主に、自己抗原に特異的に結合し自己抗原に対する自己抗原特異的自己抗
体の結合を競合的に抑制するのに十分な自己抗原に対して特異的な抗体の断片を
含んでなる有効量の組成物を投与することを含んでなる自己抗原に対する自己抗
体の病原性結合を抑制する方法が提供され、ここで、断片は自己抗原特異的抗体
の機能的Ｆｃ部分を含まない。好適な実施態様では、自己抗原-自己抗体結合は
中枢又は末梢神経系の脱髄疾患に関連している。特定の実施態様では、疾患は、
病原性自己抗体結合、例えばＭＳ、ループス、関節炎又は糖尿病に関連している
。より特定の実施態様では、自己抗原はＭＯＧ自己抗原であり、断片はＦ(ａｂ'
)_２断片である。

【０００９】更に他の側面では、本発明はまた自己抗原に対する自己抗体の結合を変調する
薬剤をスクリーニングする方法を提供する。かかる方法は一般には、候補薬剤が
存在しない場合に自己抗体又はその断片が基準親和性を以て自己抗原に特異的に
結合する条件下で、自己抗体又は自己抗体に特異的に結合するその断片、自己抗
原、及び候補薬剤を含んでなる混合物をインキュベートし；自己抗体又はその断
片の自己抗原に対する結合親和性を検出して薬剤誘導(薬剤バイアス)親和性を決
定することを含み、ここで、薬剤誘導親和性と基準親和性の差により、上記薬剤
が自己抗原に対する自己抗体又はその断片の結合を変調することが示される。特
定の実施態様では、自己抗体又はその断片はＦ(ａｂ')_２断片であり；自己抗原
はＭＯＧエピトープを含み；及び／又は自己抗原はラット、ヒト又はマモセット
ＭＯＧの残基２８−３６、１３−２１、６２−７４、２７−３４又は４０−４５
からなるＭＯＧエピトープを含む。

【００１０】（発明の詳細な記載）次の記載と実施例は例証のために提供されるもので、発明を限定するものでは
ない。本発明は、例えばＭＳにおいて生じるような、ＭＯＧポリペプチドに対する自
己抗体の結合に関連した症状を抑制するための方法と組成物を提供する。一般的
な方法は、病原性のＭＯＧポリペプチド-自己抗体結合に罹っている宿主に、機
能性Ｆｃ部分を有さず、ＭＯＧポリペプチドに特異的に結合し、ＭＯＧポリペプ
チドに対する自己抗体の結合を競合的に抑制するのに十分なＭＯＧポリペプチド
特異的抗体断片を含んでなる有効量の組成物を投与する工程を含み、それにより
症状を抑制する。特定の実施態様では、断片はＦｖ、Ｆ(ａｂ')_２、Ｆ(ａｂ)、
Ｆ(ａｂ)_２又はその断片からなる群から選択される。

【００１１】組成物は、天然のＭＯＧポリペプチドに特異的に結合しＭＯＧポリペプチドに
対する自己抗体の結合を競合的に抑制するのに十分なＭＯＧポリペプチド特異的
抗体断片であって、機能的Ｆｃ部分を含まない断片と、製薬的に許容可能な担体
とを含有してなる製薬組成物を含む。組成物はまた寛容を誘発し抗体断片と相乗
的に作用して症状を抑制するＭＯＧ寛容原性Ｔ細胞エピトープを含んでいてもよ
い。他の実施態様では、本発明は組織中の第１の自己抗原に結合した自己抗体の存
在を検出する方法と組成物を提供する。これらの方法は一般的には、組織を第２
の標識された自己抗原と、自己抗体が第２の自己抗原に結合して第１の自己抗原
-自己抗体-第２の自己抗原の標識複合体を形成する条件下で接触させ、標識複合
体を特異的に検出する工程を含んでなる。第１及び第２の自己抗原は一般的には
同じであるか、少なくとも同じ自己抗原のエピトープを含む。好適な自己抗原は
、これに限定されるものではないが、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク
質（ＭＯＧ）、ミエリン随伴糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン／オリゴデンド
ロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、オリゴデンドロサイト特異的タンパク
質（Ｏｓｐ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドアポタン
パク質（ＰＬＰ）、ガラクトースセレブロシド（ＧａｌＣ）、糖脂質、スフィン
ゴ脂質、リン脂質、ガングリオシド及び他の神経細胞抗原を含む。

【００１２】更に他の実施態様では、本発明はＭＯＧポリペプチド特異的Ｂ細胞を検出する
方法と組成物を提供する。かかる方法は、一般に、血液を分画して希なＭＯＧポ
リペプチド特異的Ｂ細胞を含んでなるＢ細胞の非選択性集団を得て、該集団を標
識ＭＯＧポリペプチドと、標識ＭＯＧポリペプチドが希なＭＯＧポリペプチド特
異的Ｂ細胞に結合して標識ＭＯＧポリペプチドと希なＭＯＧポリペプチド特異的
Ｂ細胞の標識複合体を形成する条件下で接触させ、複合体を特異的に検出する工
程を含んでなる。更に他の実施態様では、本発明は、ＭＯＧポリペプチドに結合するＭＯＧポリ
ペプチド特異的抗体と関連する症状を抑制する候補薬剤をスクリーニングする方
法と組成物を提供する。これらの方法は一般的に、抗体又はそのＭＯＧ特異的断片、ＭＯＧポリペプチド、及び候補薬剤を含んで
なる混合物を、上記薬剤が存在しなかった場合に抗体又はその断片が基準親和性
でＭＯＧポリペプチドに特異的に結合する条件下で、インキュベートし；ＭＯＧポリペプチドに対する抗体又はその断片の結合親和性を決定して、薬剤
誘導親和性を決定する工程を含んでなり、基準親和性に対する薬剤誘導親和性の減少により、上記薬剤がＭＯＧポリペプ
チドに対する抗体又はその断片の結合を抑制することが示され、ＭＯＧポリペプ
チドへのＭＯＧポリペプチド特異的抗体の結合に関連する症状を抑制する候補薬
剤が提供される。

【００１３】更に他の実施態様では、本発明は、Ｎ及びＣ末端を有する断片を含み、ヒト、
ラット又はマモセットＭＯＧの残基２８−３６、１３−２１、６７−７３、２７
−３４又は４０−４５からなるポリペプチドであって、断片が天然のヒト又はマ
モセットＭＯＧフランキング残基以外とＮ及びＣ末端の少なくとも一つで直接結
合したポリペプチドを提供する。かかるポリペプチドは、例えば、ＭＯＧと抗体
の混合物をポリペプチドと接触させる工程を含み、それによってＭＯＧ抗体結合
を抑制するもののような、ＭＯＧポリペプチド-自己抗体結合を抑制する方法に
おいて、有用である。

【００１４】本明細書において、「抗体」なる用語は、組み換え免疫タンパク質、例えばＴ
細胞抗原レセプター及び免疫グロブリン、並びにキメラ、ヒト化又は他の組み換
え抗体を意味する。本明細書において、「抗体断片」なる用語は抗体断片、例え
ばＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ)_２、Ｆ(ａｂ')_２及びＦｖ又はその任意の組み合わ
せを意味する。Ｆｖとその断片は一価でも二価でもよい。Ｆｖはまた最小の抗体
断片として当該分野において知られている。抗体断片、特にＦ(ａｂ')を製造す
る方法は当該分野で知られている。（例えば、Harlow及びLane, Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1998)を参照
されたい。これはここに出典明示により取り込まれる）。例えば、Ｆ(ａｂ)、Ｆ
ｖ等々はまた組み換え技術によっても製造することができる。

【００１５】本明細書において、「天然のヒト又はマモセットＭＯＧフランキング残基以外
」とは、未変性のタンパク質における当該ペプチドに天然に隣接する残基以外の
もの全てを意味する。例えば、天然のフランキング残基以外とは、フランキング
残基又は当該ペプチドに天然に隣接するものとは異なったフランキング残基を含
まない。ＭＯＧはラット小脳糖タンパク質に対して産生されたマウスモノクローナル抗
体8.18.C5により元々は同定された。それは、全ミエリンタンパク質の僅か０．
０１〜０．０５％を占める定量的には少ないタンパク質であり、ＣＮＳ内におい
て知られた機能は有していない。ＭＯＧは免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファ
ミリーのメンバーであり、２２４アミノ酸の全長に対して、１つのグリコシル化
部位（３１位のＡｓｎ）と膜貫通ドメインを提示しうる二つの高度に疎水性の領
域を含む１２１のアミノ酸からなる免疫グロブリン様細胞外ドメインを持つ。Ｍ
ＯＧはオリゴデンドロサイト細胞体に広く発現され、特に髄鞘の最外層上でプロ
セシングされ、細胞質内ＭＢＰ、又は膜内及び膜間プロテオリピドアポタンパク
質（ＰＬＰ）よりもより速やかに抗体攻撃に近づける。マモセットを含む全ての
種において、高度に保存されているＭＯＧ（ｒＭＯＧ）の非グリコシル化組み換
え細胞外ドメインが動物をＥＡＥに感作させるのに十分である。本発明の一側面
では、我々は、残基２８−３６、１３−２１、６２−７４、２７−３４又は４０
−４５を含む最小のＴ細胞及びＢ細胞エピトープを同定した；天然のヒト及びラ
ットＭＯＧ配列は当該分野で知られている；天然のマモセットＭＯＧは次の置換
を除いてヒトと同一である：９Ｓ、１３Ｑ、１９Ａ、２０Ａ、４２Ｓ、６０Ｅ、
７５Ｄ、８４Ｋ、９１Ｐ、１１２Ｑ、１３７Ｆ、１４８Ｙ及び１５１Ｈ。

【００１６】自己免疫疾患における免疫応答は細胞性及び体液性成因の双方を持ちうる。我
々のデータは、次の連続したイベントがＣＮＳ自己免疫脱髄におけるミエリン破
壊に導くことを示している：１）可溶性メディエータ（サイトカイン、抗体、フリーラジカル）により引き
起こされるミエリン空胞化及び／又は細胞障害活性。これに類似した髄鞘内浮腫
のパターンはまたトリエチル硫酸スズで中毒にしたラットのＣＮＳ中で過去に観
察されており、興味深いことに、これらの変化は可逆的であった。２）低減した周期現象（５−６ｎｍ）での２−３層の変質ミエリンにより分離
させられた小胞体ネットワークへの空胞化ミエリンの変換。この劇的な変換はＭ
ＯＧ特異的ＩｇＧの沈着に関連しており、おそらくは補体活性化により、抗体媒
介損傷、又は小胞体ミエリン破壊に常に伴うマクロファージにより媒介される抗
体依存性細胞障害活性を反映しているように思われる。おそらくは、初期の空胞
破壊によりミエリン膜が自己抗体による攻撃に近づけるようになる。３）小胞化ミエリン片のレセプター媒介ファゴサイトーシスを生じるマクロフ
ァージ活性化。この機構はＭＳとＥＡＥにおいて過去に証明されており、ＩｇＧ
がマクロファージ表面上のクラスリン被覆ピットのＦｃレセプターとミエリン片
の間のリガンドとなる。この破壊病態の段階は、抗体媒介であるが、抗体特異性
とは独立でありうる。

【００１７】これまで概観してきたように、例えば、ＭＳにおいて、炎症性成因はＴ細胞媒
介性であり、脱髄成因はＢ細胞媒介性であると思われる。従って、効果的な治療
法は両方の成因に対して処置を行うものである。本発明はＭＯＧの免疫優性エピトープを含んでなる組成物を提供する。組み換
えＭＯＧ（ａａ１−１２５）（ｒＭＯＧ；ｒＭＯＧはＮＨ_２末端がＭＲＧＳに
より、ＣＯＯＨ末端がＡＳＥＳ(Ｈ)_６により伸長されたＭＯＧの細胞外アミノ末
端の残基１−１２５からなる）の細胞外部分に対する寛容化プロトコールによる
末梢Ｔ細胞応答の消滅が、本発明のエピトープ誘導ペプチド組成物の基礎を提供
した。（２６−３８及び６４−７２を含む）重要なＭＯＧエピトープのマッピン
グは、ｒＭＯＧ免疫化動物からＴ細胞をクローニングし、ｒＭＯＧ免疫化マモセ
ットのＭＯＧの短いペプチドに対するＴ細胞及び抗体応答を分析することにより
達成された。

【００１８】マモセットにおけるＭＯＧに対する抗体応答のマッピングは自己抗体によるエ
ピトープ認識の異質性が限られていることを示している。我々は線状ペプチドを
使用して脱髄抗体が標的としているＭＯＧの領域を同定した。ｒＭＯＧ免疫化マ
モセットにおける未変性の血清ポリクローナル抗体は、アミノ酸配列、ａａ１３
−２１、２８−３４、４０−４５、６５−７４、又はより短い配列に沿った４つ
の離散したエピトープに対して作られ、その配列の殆どは種にわたって保存され
た配列である。これらのペプチドは齧歯類の抗体エピトープ（ａａ３５−５５）
としてこれまでに同定されたものとは異なるが、それらは以下の実施例に示され
るようにヒトＭＳの急性病変の小胞化ミエリンのネットワーク内に存在する抗体
に結合する。大抵の抗体は一般にタンパク質上の不連続なエピトープを認識する
ので、我々の分析方法はマモセット及びヒトにおける脱髄抗体の抗原性レパート
リーを完全に定めるのに必要であるＭＯＧの構造の詳細な知識を提供する。つい
で、病原性ＩｇＧと競合し補体媒介及び抗体依存性細胞障害活性を抑制すること
が可能なＭＯＧに対して高親和性を持つＦ(ａｂ')_２断片を産生するためにコン
ビナトリアルライブラリを作成した。これらのＦ(ａｂ')_２断片を単独で及びＴ
細胞寛容原性ペプチドと組み合わせてマモセットにおける疾患を防止し治療する
その能力について試験した。

【００１９】ＭＯＧに対して反応性のＩｇＧモノクローナル免疫グロブリン血症と関連した
進行性脊髄障害を持つ最近特定された患者は自然の実験における抗ＭＯＧ抗体応
答の病理生理学的な結果のユニークな例を提供した。ヒトモノクローナル抗体が
非脱髄ＥＡＥを持つマモセットに養子性に移入された。養子性移入に続いてマモ
セットは脱髄を生じた。この種におけるヒトＩｇＧの移入は良好な耐容性で、Ｆ
(ａｂ')_２断片の阻止能力が養子性移入系において実証される。抗体断片は抗原
性エピトープを認識するその能力を保持するが補体を活性化し又はマクロファー
ジを結合する能力を欠き、それらは、内因性自己抗体が病理的レベルを結合でき
ないように自己抗原を被覆する。

【００２０】この発明の製薬組成物の調製においては、当業者には明らかなように、様々な
ビヒクルと賦形剤及び投与経路を使用することができる。代表的な製剤技術はと
りわけRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed., Mack Pu
blishing Co., Easton, PA, 1995; 例えばGoodman & Gilman's The Pharmacolo
gical Basis of Therapeutics, 9th Ed., 1996, McGraw-Hillに教示されている
。

【００２１】（実施例）次の実施例はこの発明を例証するために提供されるもので、如何なる場合にで
もこの発明の範囲を限定することを意味するものではない。我々は、マモセットにおいて脱髄を引き起こすＭＯＧに対する抗体を化学的に
修飾でき、実在する病原性抗体の結合を競合的に阻止する治療ツールとして使用
できることを示す。これは、酵素的消化、例えば、標的抗原（ＭＯＧ）に結合す
る部位を含む大きな断片（Ｆ[ａｂ']_２）と、補体及びマクロファージ（抗体の
多くの病原性又は細胞毒性を媒介することがまた知られている）のような系に対
するレセプターを含むことが知られている抗体の部分であるＦｃ部分を含むより
小さな断片に無傷の抗体を切断するペプシンにより達成される。よって、Ｆ(ａ
ｂ')_２は、脳においてＭＯＧに結合する能力を保持するが、Ｆｃ補体に対する能
力を欠いており又はマクロファージを活性化し、病原性抗体により認識等される
ＭＯＧを保護／マスクする。特定の例では、一対のマモセットが最初にＭＢＰ（
非脱髄）を伴うＥＡＥに感作され、ついで両方にＭＯＧに対する脱髄抗体（マウ
スモノクローナル8.18.C5）が静脈内で与えられた。同時に、一方の動物（対照
）がプラシーボＦ(ａｂ')_２注射を受け、他方が同じ脱髄抗体から調製したＦ(ａ
ｂ')_２を受けた。対照動物はＥＡＥの臨床的徴候である憎悪を示したが、実験動
物は示さなかった。動物は３−５日後に屠殺し、脳と脊髄の組織像を得た。対照
動物は脱髄病巣の証拠を有しており、実験動物は炎症（細胞浸潤）はあるが脱髄
のない（ミエリン破壊のない）病巣を有していた。この実験は、マモセットをＭ
ＯＧ特異的Ｆ(ａｂ')_２断片により抗体媒介脱髄から保護することができること
を示している。

【００２２】上記の相補的な実験は、Ｆ(ａｂ')_２又はＦ(ａｂ')断片のかかる治療原理がヒ
トＭＳ又は関連した疾患に対して有用であり得ることを示している：ＭＯＧに対
する抗体は、ミエリンの進行中の崩壊に対する形態学的な証拠があるＭＳの活性
な病巣に本質的に関連している（以下の「多発性硬化症における脱髄に関連した
自己抗体の同定」を参照されたい）。この研究において、マモセットによって認
識されるＭＯＧのエピトープがまた初めて開示され、この情報は、霊長類とヒト
組織の両方においてＭＯＧ特異的自己抗体の存在を同定する免疫プローブとして
金-コンジュゲートを作成するために使用される。

【００２３】マモセットＥＡＥの誘発。 Genain等(1999) Nature Medicine 5, 170-175に記
載されたようにしてマモセットにおいてＥＡＥを誘発させた。６匹のマモセット
を、１００μｌのリン酸緩衝食塩水に溶解し、３ｍｇ／ｍｌの殺した結核菌(Myc
obacterium tuberculosis)（ｈ３７Ｒａ；ＤＩＦＣＯ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）
を含む等容量のフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）で乳化した５０〜１００
μｇの組み換えラットＭＯＧで活発に感作した。ＭＯＧ／ＣＦＡエマルションは
０．２ｍｌの全容量にて肩胛及び臀部領域の４箇所の注射部位に皮内的に与えた
。ＭＯＧ／ＣＦＡで免疫化した日に、２．５ｍｌの等張食塩水に入れた１ｘ１０ ^１０の不活性化百日咳菌(Bordetella pertussis)を静脈内投与し、その投与を２
日後に繰り返した。比較のために、４匹のマモセットを２００ｍｇの全白質(Ｗ
Ｍ)／ＣＦＡで感作し、百日咳菌を免疫化後１８〜３９日の間で調べた。ＭＯＧ
感作化マモセットは免疫化後９３日まで維持した。ＷＭかＭＯＧの何れかで感作
した動物は免疫化後から２１日以内にＥＡＥの徴候を示した。動物を免疫化後１
８〜９３日で深い麻酔下で心臓内灌流により屠殺した。

【００２４】ヒトからのＭＳ組織。ヒトＣＮＳ組織を組織診又は死体解剖により３人のＭＳ
患者から得た（診断後８週、１１年及び１７年）。患者１は１８歳の白人女性で
、３ヶ月の病歴の急性右半身不随、知覚喪失、及び痙縮を持っていた。コンピュ
ータ断層撮影走査により、左頭頂後頭領域に低密度ＷＮが明らかになった。脳の
組織診を神経病理学的評価のために実施した。得られた診断は、急性ＭＳに一貫
した劇症性炎症性脱髄病状に典型的な、活発に脱髄する炎症性の浮腫状病変であ
った。患者２は３１歳の白人女性で、肢の弱さと知覚麻痺、歩行運動障害、尿失禁、
振戦、眼振、及びかすみ目により特徴づけられる慢性進行性ＭＳの８年の病歴を
持つ。末期には、患者は車椅子に拘束され、発作と吸引肺炎を起こし、死亡した
。死体解剖を死亡から１．５時間以内に実施した。神経病理学的検査の結果、圧
倒的な小さく（３−５ｍｍ）散在性で最近の強い炎症性で浮腫状の脱随病巣並び
により大きな線維アストログリオーシスとよく区別できる端を持つよりはっきり
したプラークが明らかになった。患者３は３４歳の白人女性で、２０歳のときの最初の診断後１０年の間再発し
緩解するＭＳの病歴を持っていた。疾患は彼女の人生の最後の７年の間に慢性的
な進行性過程に入った。死亡時には、患者は、両側の視神経萎縮、核間眼筋麻痺
、痙性不全対麻痺、及び中程度の肢運動失調を呈した。死因は呼吸不全であった
。死体解剖を死亡４時間後に行った。この事例の神経病理学的検査の結果、最近
の起源の強い炎症性、浮腫状の活発な脱随病巣、並びに活性な慢性的脱随病巣が
明らかになった。

【００２５】分析のための組織の調製。試料採取時にペントバルビタール麻酔下で２００ｍ
ｌのリン酸緩衝食塩水と続いて１５０から２００ｍｌの冷ＰＯ_４で緩衝した２．
５％グルタルアルデヒドでの心臓内灌流により動物を堵殺した。２匹のＭＯＧ感
作マモセットを死亡の急性期（免疫化後１４−１６日）の間に採取し、３匹を再
発か緩解の何れかの間に（免疫化の２３、２５及び２７日後）急性期の後にとり
、１匹を免疫後９３日で２回の再発後に検査した。４匹の全ＷＭ感作動物を急性
の発症後で再発の前に免疫後１８、３０、３０及び３９日に検査した。グルタル
アルデヒド灌流動物から、ＣＮＳを取り除き、ヘマトキシリン及びエオシン、Lu
sol Fast Blue （ミエリンに対して）及びBodian銀法（軸索に対して）で染色し
たホルマリン後固定パラフィン包埋材料について常套的な神経病理検査を実施し
た。マモセット組織の微細構造分析のために、１-ｍｍのスライスを、Ｃ７、Ｔ３
、Ｌ２、Ｌ５、Ｌ６、及びＬ７の視神経、大脳半球、小脳、脳幹、髄質、及び脊
髄から取り出した。また、試料を脊髄神経根及び座骨神経から取り出した。グル
タルアルデヒド固定脳組織のスライスを平たい矩形（〜４ｘ６ｍｍ）として切り
取り、脊髄を全スライスとして残した。実施例２に記載のＭＳの３つの場合から
、３〜５ｍｍ厚の、組織診組織の小片又は死体解剖したＣＮＳ材料のスライスを
４℃で４ないし２４時間、浸漬固定し、ついで薄い１-ｍｍのスライスから直径
３〜５ｍｍに切断した。次に、グルタルアルデヒド固定組織を、ＰＯ_４で緩衝し
た１％ＯｓＯ_４中で氷上で１時間、後固定した。試料を脱水しプロピレンオキシ
ドで清澄にし、エポキシ樹脂に平らに包埋した。エポキシ包埋組織の薄（１μｍ
）切片を光学顕微鏡検査（ＬＭ）のために調製し、免疫細胞化学のためにトルイ
ジンブルーで染色するか反応させた。電子顕微鏡検査（ＥＭ）のために、切片を
銅グリッド上に配し、鉛とウラン塩（クエン酸鉛及び酢酸ウラニル）で対比させ
、炭素コートし、Siemens 101又はHitachi H 600-Sでスキャンした。

【００２６】脱随の超微細パターンはマモセットＥＡＥと急性ＭＳプラークにおいて同一であ
る。全てが急性病変を示しているＭＯＧ誘発ＥＡＥを持つ６匹のマモセットと
ＭＳの３人のヒトの患者からのＣＮＳ組織を電子顕微鏡検査（ＥＭ）によって試
験した。マモセットＥＡＥにおいては、直径が数ｍｍまでの大きな脱随プラーク
がＣＮＳ全体に散在し、小静脈上に常に集中し、多くの有髄化神経線維がそれに
沿って空胞化髄鞘を示す突出縁と血管周囲の炎症により特徴づけられる。ミエリ
ン空胞化のこの典型的なパターンは、層間剥離と膨潤のために個々の髄鞘の拡大
から生じ、軸索は数層の無傷のミエリンにより囲まれた一側にずれている。アジ
ュバントに入れた５０μｇの組み換えラットＭＯＧでの免疫化により誘発し、臨
床徴候の発症の３日後に堵殺した急性ＥＡＥの動物からの視神経を示す顕微鏡は
、脱髄病巣の周囲に大きな髄内空胞が存在し、軸索は他のどこかに通常現れる髄
鞘により囲まれていることを証明した。病巣の中心と縁の間にはミエリン片が載ったマクロファージを含む広い脱髄領
域があった。最も印象的な発見は、広がったネットワークとして再配置された破
壊ミエリンが凝集物により囲まれた多数の軸索の脱髄領域内に存在することであ
った。これらの軸索は、膜ネットワークが軸索から徐々に分離し隣接するマクロ
ファージにより取り上げられるので、側方にずれていた。急性ＭＳにおける線維の脱髄は構造的にはマモセットＥＡＥにみられるものと
同一であり、脱髄軸索はミエリンの膜ネットワーク内にある。浮腫状実質組織の
他の場所では、ミエリン片の遊離して浮遊する凝集物が一般的であった。神経性
徴候の８週の病歴を持つ１８歳の女性患者からの皮質下白質から取り出した組織
の電子顕微鏡検査、ＭＲＩスキャンでの白質低密度及び急性ＭＳの診断は上述の
ものと類似した小胞ネットワークに軸索の周りのミエリンが変換したことを示し
ていた。線維性アストログリア突起、裸軸索及び反応性アメーバ様ミクログリア
細胞（下記）をまた同定した。マモセットＥＡＥとヒトＭＳの双方におけるミエ
リンネットワークの高解像度分析により、正常な組織における無傷のミエリンと
比較したとき周期現象が低減した（５−６ｎｍ）２から３層の緩く詰まった膜に
より囲まれたベシクルが明らかになった。

【００２７】ＭＯＧ特異的自己抗体はマモセットＥＡＥ病巣におけるミエリン空胞化と関連し
ている。ＭＯＧは定量的には少ないタンパク質であり（全ミエリンタンパク質
の０．０５％未満）、髄鞘の最外層に豊富に発現される免疫グロブリン（Ｉｇ）
様細胞外ドメインを持ち、それが抗体攻撃へ近づけるようにする。ＭＯＧに対す
る自己抗体は幾つかのＥＡＥモデルにおける脱髄を亢進することが示されている
が、これらの抗体とミエリン膜の間の詳細な相互作用は研究されていない。脱髄
病巣内の自己抗体結合部位を特定するために、我々は、凍結したエポキシ包埋マ
モセットＣＮＳ組織について金標識抗ヒトＩｇＧ抗体（マモセットＩｇＧと交差
反応性）と続いての銀増強により免疫細胞化学検査を実施した。インサイツでのマモセット及びヒトＭＳ組織における抗原特異的事故抗原の実
証に対しては、ミエリン関連及び対照ペプチドの選択物を免疫金に直接カップリ
ングさせ、組織切片に塗布した。免疫金標識を凍結又は固定組織の超薄切片に対
して実施した。（１）マモセットにおいて既知の脳炎惹起活性を持つ３種のＭＯ
Ｇペプチド（ヒトＭＯＧのアミノ酸[ａａ]１−２０、ａａ２１−４０、及びａａ
４１−６０）；（２）マモセットにおいて脳炎惹起性ではないことが示されてい
る１種のＭＯＧペプチド（ａａ１０１−１２０）；（３）マモセットにおいて脳
炎惹起性でＤＲ２ハプロタイプを持つヒトにおいて免疫優性である１種のヒトミ
エリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチド（ａａ８２−１０１）；及び対照と
して（４）マウス血清アルブミンのペプチド（ＭＳＡ；ａａ５６０−５７４）か
ら金コンジュゲートを調製した。ヒトＭＯＧサブシーケンスを持つペプチドを標
準的なＦｍｏｃ科学により合成し、ＨＰＬＣ（Research Genetics Inc., Huntsv
ille, AL）により精製した（＞９５％）：ＭＯＧ１−２０、ＭＯＧ２１−４０、
ＭＯＧ６１−８０、ＭＢＰ８２−１０１、及びＭＳＡ５６０−５７４。製造者の
指示に従って（Naonoprobes, Stonybrook, NY）、モノスルホ-Ｎ-ヒドロキシス
クシンイミド-Nanogold標識試薬（粒子径、１．４ｎｍ）を使用して金コンジュ
ゲートを合成し、続いて十分な透析により未反応ペプチドを除去した。マモセッ
ト脊髄組織と活性なＭＳ病巣の１μｍのエポキシ切片について免疫反応性を検出
した。このために、切片をナトリウムエトキシドでエッチングし、０．０５％の
TritonＸ-１００を含むＰＯ_４緩衝食塩水で平衡にし、１０％の正常なウサギ血
清で阻止した。切片を室温で２時間の間、ペプチド-免疫金コンジュゲート（バ
ッファー中１：１００）と共にインキュベートした。洗浄後、銀増強（Nanoprob
es）を使用して検出を行った。切片をトルイジンブルーで対比染色した。ＩｇＧ
の検出のために、切片を１：１００の金標識抗サル又は抗ヒトＩｇＧ（Nanoprob
es）反応させた。

【００２８】対照として、切片を、未標識脳炎惹起性ＭＯＧペプチド又はＭＢＰで前処理し
て反応を阻止するか、金コンジュゲートの適用前に未標識非脳炎惹起性ＭＯＧペ
プチド（ａａ１０１−１２０）と反応させるか、又は金標識された無関係な抗原
（ヒストン又はＭＳＡ）あるいは無関係なＩｇＧ（抗ヤギ）で処理した。脳炎惹
起性ＭＯＧペプチドの金コンジュゲートでの標識の特異性もまたウェスタンブロ
ットで評価し、そこではＭＯＧタンパク質を免疫マモセット血清と最初に反応さ
せた。免疫反応性の特異性を決定するために使用した試験及び対照試薬の完全な
詳細はGenain等, Nature Med. 5:170-175 (1999)に見いだすことができる。動物の脊髄の腰部からの切片を得た。軸索（矢印）の周りの小胞化ミエリンの
陽性の反応性（褐色に着色）はＩｇＧの存在を示していた。非脱髄軸索は染色し
なかった。ＩｇＧの陽性の反応性は軸索を囲んでいる破壊されたミエリンの小胞
化ネットワークにわたって特に見いだされた。我々は次にミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）とＭＯＧの分泌ペプチドの免
疫金標識コンジュゲートの利用により、これらの免疫グロブリンが結合した標的
抗原を特定した。これらのミエリン抗原はその一次ＮＨ_２残基上の金粒子で直接
に標識され、抗原特異的自己抗体をインサイツで検出するために使用された。こ
の技術では、３種の金コンジュゲートＭＯＧペプチドが金コンジュゲート抗Ｉｇ
Ｇに対して観察されたものと同様のパターンで崩壊する髄鞘のネットワークにわ
たって共存していた。

【００２９】これらのペプチドはＭＯＧ免疫化マモセットの血清において生じる脱髄抗体に
より認識されるＭＯＧのアミノ酸配列を含んでいた（ａａ１−２０、ａａ２１−
４０及びａａ６１−８０）。使用した金コンジュゲートＭＯＧペプチド（ａａ２
１−４０）は種にわたって保存された配列を有している。ＭＯＧ反応性液滴がま
た周囲のマクロファージに見られ、抗ＭＯＧ抗体が結合している内部移行化ミエ
リン片の存在を示している。標識抗原との陽性の反応性は、軸索のまわりの小胞
ミエリン上及び細胞外空間及びマクロファージ内のミエリン片にインサイツでＭ
ＯＧ特異的抗体が存在していることを示している。（多くの線維のまわりの）正
常なミエリンは染色されなかった。これに対して、ヒトＭＢＰの免疫優性エピトープを含むペプチド（ａａ８２−
１０１、霊長類の種にわたって保存）とマウス血清アルブミンの対照ペプチド（
ＭＳＡ、ａａ５６０−５７４）の金標識コンジュゲートは、ミエリン膜又はマク
ロファージを標識できなかった。よって、小胞化ミエリンネットワークはＭＢＰ
の金コンジュゲートペプチドでもＭＳＡの金コンジュゲートペプチドでも染色さ
れていない（矢印）。これらの観察は、ＥＡＥのこの非ヒト霊長類モデルにおいて、ＭＯＧに対して
特異的な抗体が崩壊しているミエリン膜と直接接触し、小胞化膜ネットワークの
形成がこれらの自己抗体による溶菌攻撃から生じることを示している。

【００３０】ＭＯＧ特異的自己抗体は急性ヒトＭＳの病巣のミエリン小胞化に関連している。
我々は次にＭＳ患者から組織診又は死体解剖により得られたＣＮＳ組織内のＭＯ
Ｇ及びＭＢＰ特異的自己抗体の存在を同様の免疫金標識で調べた。マモセットＥ
ＡＥにおけるように、金コンジュゲート抗ＩｇＧは、実質組織中に分散したミエ
リン片の液滴と共に、単一の脱髄軸索の周りの膜ミエリンネットワークを標識し
た。ＩｇＧは長手方向断面で切断された軸索（矢印）；肥大星状細胞の細胞質（
ａｓ）；オリゴデンドロサイト（ｏｌ）の接線方向切片の崩壊した髄鞘に沿って
局在化している。濃く染色されたＩｇＧコートミエリン片は実質組織と３つのマ
クロファージ（おそらくはアメーバ様ミクログリア）において可視できる。また
、時折の形質細胞は抗ＩｇＧによる陽性の染色を示した。免疫金標識ミエリン抗
原コンジュゲートによって、小胞化ミエリンネットワークは金コンジュゲートＭ
ＯＧペプチドによって強く、また金コンジュゲートＭＢＰによってよる少ない度
合いで染色されたが、ＭＳＡではされなかった。ＭＯＧとＭＢＰの金コンジュゲートで標識したＩｇＧ-ミエリン複合体がまた
マクロファージに存在したが、星状細胞又はオリゴデンドロサイトには存在しな
かった。ＭＯＧ又はＭＢＰ標識形質細胞は遭遇しなかった。金コンジュゲートと
の反応性は正常な現れるＭＳ白質内にも血管周囲の炎症性カフの回りにも観察さ
れなかった。全ミエリンに対して免疫化されたマモセットでは、抗ＭＯＧ及び抗
ＭＢＰのＩｇ沈着の双方の類似パターンが観察された。白質損傷とマクロファー
ジ活動を伴う他の神経性障害である筋萎縮性側索硬化症からのＣＮＳ組織はミエ
リン抗原特異的免疫金反応性を示さなかった。これらの発見はヒトＭＳにおける
活発な脱髄病変におけるＭＯＧ特異的抗体を直接特定し、ＭＯＧ誘発ＥＡＥにお
けるように、これらの自己抗体が破壊された髄鞘中での小胞体の形成の原因とな
る役割を果たしていることを示している。抗ＭＢＰ特異性を持つ可溶性のＢ細胞
表面ＩｇはＭＳ脳組織において記述されており、現在の研究では、ＭＢＰ特異的
ＩｇはＭＳ病巣の小胞化ミエリンネットワーク内に局在化していた。抗ＭＢＰ抗
体は実験的には脱髄症状を開始することは示されていないが、これらの自己抗体
は、マクロファージによるレセプター媒介ファゴサイトーシス及び／又は特異的
Ｔ細胞へのミエリン自己抗原の提示のような別の病理的機構を媒介しうる。

【００３１】自己抗体がミエリン膜の完全な崩壊の段階を特徴づける小胞と、細胞外間隙か
食細胞に存在するミエリン片に専ら結合されるようであることは注目すべきであ
る。興味深いことに、同様ではあるがより狭いミエリンの小胞化が齧歯類ＥＡＥ
の初期の研究で報告されており、そこでは一過性の初期の現象として認識された
。しかしながら、病巣形成が遅延し、ずっと拡大しているマモセットにおいては
、破壊されたミエリンが一貫して発見された。正常にミエリン化した線維の中の
病巣縁でのミエリンの大規模な空砲胞化は有意な局所的細胞浸潤又はＩｇＧ沈着
の不在下で生じ、活発なＭＳ病巣の縁でも報告されている。ミエリン構造のこの
変化は脱髄プラークの中心から、又は病巣の縁の活性化されたグリア細胞から拡
散する可溶性因子により媒介されている可能性がある。これらの大きな空胞に類
似した形態学的な変化はＴＮＦαに暴露されたミエリン化ＣＮＳ培養物において
、またより少ない度合いでは、ＥＡＥの動物及びＭＳの患者からの血清に暴露さ
れた培養物において報告されている。ＥＡＥモデルにおける病原性Ｔ細胞応答を標的とする多くの治療的アプローチ
法はヒトＭＳに対して成功裡の治療にまだ移されておらず、おそらく、免疫シス
テムの他の成因を考慮に入れる必要があることを示唆している。Ｂ細胞応答はマ
モセットＥＡＥにおける臨床的疾患及び症状の重症度に対するキー因子であると
思われる。現在の結果は、ＭＳ中でのミエリンの広範な破壊における自己抗体の
役割を強調し、Ｔ細胞応答によって惹起される疾患において標的器官の重要な抗
原に対する抗体が不可逆的な組織損傷の発達に対して必須であることを明確化し
ている。

【００３２】ＭＯＧ特異的Ｆ(ａｂ')_２断片のインビボ投与。マモセットに、百日咳菌を含
むＣＦＡ中に入れた１ｍｇのＭＢＰを投与したところ、０日で非脱髄ＥＡＥを誘
発した。２１日で動物にマウスモノクローナル抗ＭＯＧ抗体である8.18.C5か、
又は抗インフルエンザＡ（対照）抗体の何れかから、０．１７ｍｍｏｌ／ｋｇの
Ｆ(ａｂ')_２を静脈内投与し、ついで、０．１７ｍｍｏｌ／ｋｇの8.18.C5抗体を
投与し、続いて２時間の間に適切なＦ(ａｂ')_２の第２の静脈内投与を行った。
動物は３５日で安楽死させた。組織試料は実施例３に記載されているようにして
調製された。高解像度顕微鏡と抗原特異的抗体をインサイツで検出可能なミエリ
ン抗原の免疫金標識ペプチドを使用して、我々は、髄鞘の崩壊の直接の原因であ
ると思われる、ヒトＭＳとマモセットＥＡＥの双方の急性病巣における個々の脱
髄軸索のまわりのミエリン／オリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）に特
異的な自己抗体を同定した。対照Ｆ(ａｂ')_２断片、すなわちインフルエンザ抗
原に対して作られたもので治療された動物は、頸部脊髄に大きな脱髄プラークが
明らかになり、ＭＯＧ特異的Ｆ(ａｂ')_２断片で治療された動物は、ＭＯＧ特異
的Ｆ(ａｂ')_２断片の投与によりインビボで競合的に阻止されうるので、マモセ
ットにおける抗ＭＯＧ抗体の脱髄活性が無傷のＦｃ断片機能に依存していること
を示した。これらの知見はＭＳ中でのミエリンの広範な破壊におけるミエリン特
異的自己抗体の役割を明確化し、ＣＮＳ脱髄疾患における保護的治療法に対する
基礎を提供する。

【００３３】ＭＳ様マモセットＥＡＥにおける脳炎誘発性エピトープ決定（ＭＯＧ）。組み
換えラットＭＯＧ（ｒＭＯＧ：細胞外ドメインａａ１−１２５）で誘発した脱髄
ＥＡＥを持つマモセットにおいて、ＭＯＧに対するＴ細胞反応性（ＰＢＭＣ中で
の増殖応答）とＢ細胞反応性（血清抗体）の細密な特異性を、ラット及びヒトＭ
ＯＧの双方のアミノ酸配列に対応する（Chiron Mimotopes, San Diego, CA）オ
ーバーラップ１５-merＰＩＮ-ペプチド（１と３のオフセット）を使用して連続
的に研究した。結果：研究した全ての動物（ｎ＝６）は、種にわたって全体的に
保存された配列であるａａ２７−３６に制限された卓越し維持されたＴ細胞応答
を有していた。１匹のマモセットはａａ６２−７２内に位置した第２のＴ細胞エ
ピトープに応答した。血清抗体応答（ｎ＝１０）は２つの主要なエピトープ、ａ
ａ１３−２１及びａａ６２−７４（それぞれ動物の１００％と６０％）を含むＭ
ＯＧの４つの異なった領域にマッピングし、更なるエピトープが幾らかの動物で
同定された（ａａ２８−３６及び４０−４５）。エピトープ延展は９３日までモ
ニターされた再発性ＥＡＥの動物においてＴ細胞に対しても抗体に対しても観察
されなかった。結論：ＭＳ様マモセットＥＡＥにおけるＭＯＧに対する脳炎誘発
性応答は限られた数のＢ細胞及びＴ細胞エピトープに制限されているように思わ
れる。これらの知見はヒトＭＳにおける特異的免疫療法の可能性を実証している
。

【００３４】表面結合抗体でのＢ細胞の検出。免疫応答の初期には、Ｂ細胞はその表面に抗
原と特異的に反応しうる免疫グロブリンを有する。自己抗原と反応するＢ細胞免
疫グロブリンは自己免疫疾患の最初の段階であり得る。よって、Ｂリンパ球の表
面上の自己抗体の早期の検出は徴候の発症前の治療方法を設計する手段を提供し
うる。Ｂ細胞は約３−５％のリンパ球を構成し、ＭＯＧ誘発ＥＡＥのマモセットから
、ＭＳのヒトから、及び抗ＣＤ１９被覆ビードを使用する健康な対照から得られ
た新鮮に単離された末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）から陽性に選択された。任意
の他の適当なＢ細胞マーカーに対する抗体を使用してもよい。２ｘ１０^５のＢ細
胞（純度＞９８％）を含むスライドを１％のグルタルアルデヒドで固定し洗浄し
た。あるいは、未固定細胞を用いてもよい。ついで単離したＢ細胞を、ヒトＭＯ
Ｇ（１−１２０）のＮＨ_２末端の配列に対応する１１の２０-merオーバーラップ
ペプチドの混合物の標識した免疫金コンジュゲートと共にインキュベートした；
同一のＢ細胞調製物をヒストンの配列に対応する対照ポリペプチド又はＭＢＰペ
プチドで標識した。スライドを銀で増強し、標識Ｂ細胞を２人の異なった盲観察
者によりカウントした。

【００３５】ＭＯＧ特異的表面免疫グロブリンを発現するＢ細胞はＭＯＧ免疫化マモセット
からのＰＢＭＣ中の金コンジュゲートＭＯＧペプチドで簡単に検出された（ｎ＝
８）。血清抗ＭＯＧ抗原を生じることが知られているこれらの動物において、循
環ＭＯＧ特異的Ｂ細胞は約１：５００から約１：２０００の頻度で生じ、健康で
未免疫のマモセットにおいて０−１：１００００に増加した（ｎ＝８）。過剰に
加えられた未標識ＭＯＧペプチドは標識化を完全に抑制し、金コンジュゲート対
照タンパク質は如何なるＢ細胞も標識できなかった。ヒトでは、循環するＭＯＧ
特異的Ｂ細胞は１７人のＭＳ患者の８人で（４７％）、また１８人の健康な対照
の９人で（５０％）検出することができた。これらの自己反応性Ｂ細胞の頻度は
約１：１１０００から約１：２０００００Ｂ細胞の範囲で、最も高い頻度は再発
性-緩解性ＭＳの２人の患者で観察された（それぞれ１：１６０００と１：１１
０００）。この免疫金アッセイは末梢血液中のＭＯＧ特異的Ｂ細胞を感度よく検出する。
このアッセイは約１：５００、好ましくは約１：２０００、より好ましくは約１
：１００００，更により好ましくは約１：１５０００、そして最も好ましくは約
１：２０００００の感度を有する。ヒトでは、自己反応性Ｂ細胞はおよそ５０％
の個人で検出することができ、ＭＳ患者と対照に等しく存在している。これは、
ＭＳを持つ個人の神経系中の抗ＭＯＧ抗体の存在が末梢血液中のＭＯＧ反応性Ｂ
細胞の主要な増殖に関連していないことを示唆している。ＰＢＭＣにおいて観察
されたＭＯＧ反応性Ｂ細胞の高い頻度はＭＯＧがヒトにおける重要な自己抗原で
あるという仮説に対する新しい裏付けを提供する。

【００３６】上記の実施例では、ＭＯＧ特異的抗体は、単一の脱髄軸索の周りの小胞体への
緻密なミエリンの転換が生じ、ＣＮＳ実質組織中に浮遊し又は食細胞（マクロフ
ァージとミクログリア）により内部移行されたミエリン片に転換する領域に専ら
局在化された。よって、ミエリンとオリゴデンドロサイトへの直接の溶菌攻撃に
加えて、これらの抗体はマクロファージによるレセプター媒介ファーゴサイトー
シス、又は抗体依存性細胞障害性の原因であり得、後者はミエリン損傷の可能な
エフェクター機構として長く認識されてきた。マモセットにおける抗体の受動移
送を使用する我々の実験は、精製された8.18.C5-Ｆ（ａｂ'）_２断片のインビボ
投与によりモノクローナル抗ＭＯＧ抗体8.18.C5の病原の効果を競合的に阻止す
ることができることを示し、ＭＯＧ特異的ＣＤＲ３配列自体ではなく無傷のＦｃ
断片がミエリンに対する損傷を媒介することを示している。これらの知見に基づ
いて、ミエリンに対する毒性効果のない抗体結合の類似体又は競合的抑制剤がＥ
ＡＥと関連する脱髄障害における治療のための合理的なアプローチ法を提供する
。よって、本発明は、自己抗原エピトープ、自己抗原抗体断片又はその組み合わ
せを使用して脱髄自己免疫疾患の治療を達成する。

【００３７】この明細書中に引用した全ての刊行物及び特許出願を、あたかも各個々の刊行
物又は特許出願が出典明示によりここに取り込まれることが示されているかのよ
うに、出典明示によりここに取り込む。上記の発明は理解を容易にするための実
施例と例証によりある程度の詳細さで説明したが、特許請求の範囲の精神又は範
囲から逸脱しない限りそれに所定の変化と変更を加えても良いことは本発明の教
唆から当業者にとって明らかであろう。従って、本発明の範囲は、均等物を含む
、次の請求の範囲によってのみ限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/53 33/53 Ｄ 33/566 33/566 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ハウザー，ステファン，エル．アメリカ合衆国カリフォルニア 94143 −0114，サンフランシスコ，パーナッサスアヴェニュー 513，ユニバーシティオブカリフォルニア，サンフランシスコ，デプト．ニューロロジー，アールエム．エムエヌ−791 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CA18 CA19 DA36 DA77 FB03 FB07 4C085 AA11 BB11 CC22 EE01 EE05 KA03 KA05 4H045 AA11 AA30 BA41 CA40 DA86 EA21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＭＯＧポリペプチドに対する自己抗体の結合に関連した症状
を抑制する方法において、病原のＭＯＧポリペプチド-自己抗体結合に罹ってい
る宿主に、機能性Ｆｃ部分を有さず、ＭＯＧポリペプチドに特異的に結合し、Ｍ
ＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合を競合的に抑制するのに十分なＭＯＧポリ
ペプチド特異的抗体断片を含んでなる有効量の組成物を投与する工程を含み、そ
れにより症状を抑制する方法。
【請求項２】断片がＦｖ、Ｆ(ａｂ')_２、Ｆ(ａｂ)、Ｆ(ａｂ)_２又はその
断片からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】天然のＭＯＧポリペプチドに特異的に結合し、ＭＯＧポリペ
プチドへの自己抗体の結合を競合的に抑制するのに十分なＭＯＧポリペプチド特
異的抗体断片であって、機能的Ｆｃ部分を含まない断片と、製薬的に許容可能な
担体とを含有してなる製薬組成物。
【請求項４】ＭＯＧ寛容原性Ｔ細胞エピトープを更に含んでなる請求項３
に記載の製薬組成物。
【請求項５】組織中の第１の自己抗原に結合した自己抗体の存在を検出す
る方法であって、該組織を第２の標識された自己抗原と、自己抗体が第２の自己
抗原に結合して第１の自己抗原-自己抗体-第２の自己抗原の標識複合体を形成す
る条件下で接触させ、標識複合体を特異的に検出する工程を含んでなる方法。
【請求項６】第１及び第２の自己抗原がＭＯＧポリペプチドである請求項
５に記載の方法。
【請求項７】血液を分画して希なＭＯＧポリペプチド特異的Ｂ細胞を含ん
でなるＢ細胞の非選択性集団を得て、該集団を標識ＭＯＧポリペプチドと、標識
ＭＯＧポリペプチドが希なＭＯＧポリペプチド特異的Ｂ細胞に結合して標識ＭＯ
Ｇポリペプチドと希なＭＯＧポリペプチド特異的Ｂ細胞の標識複合体を形成する
条件下で接触させ、複合体を特異的に検出する工程を含んでなるＭＯＧポリペプ
チド特異的Ｂ細胞の検出方法。
【請求項８】ＭＯＧポリペプチドへのＭＯＧポリペプチド特異的抗体の結
合に関連した症状を抑制する候補薬剤をスクリーニングする方法において、抗体又はそのＭＯＧ特異的断片、ＭＯＧポリペプチド、及び候補薬剤を含んで
なる混合物を、上記薬剤が存在しなかった場合に抗体又はその断片が基準親和性
を以てＭＯＧポリペプチドに特異的に結合する条件下で、インキュベートし；ＭＯＧポリペプチドへの抗体又はその断片の結合親和性を検出して、薬剤誘導
親和性を決定し、基準親和性に対する薬剤誘導親和性の減少により、上記薬剤がＭＯＧポリペプ
チドへの抗体又はその断片の結合を抑制することが示され、ＭＯＧポリペプチド
へのＭＯＧポリペプチド特異的抗体の結合に関連した症状を抑制する候補薬剤が
提供される方法。
【請求項９】Ｎ及びＣ末端を有する断片を含み、ヒト、ラット又はマモセ
ットＭＯＧの残基２８−３６、１３−２１、６７−７３、２７−３４又は４０−
４５からなるポリペプチドであって、断片が天然のヒト又はマモセットＭＯＧフ
ランキング残基以外とＮ及びＣ末端の少なくとも一つにおいて直接結合したポリ
ペプチド。
【請求項１０】請求項１に記載のポリペプチドにＭＯＧと抗体の混合物を
接触させる工程を含み、ＭＯＧ抗体結合を抑制する、ＭＯＧ抗体結合の抑制方法
。