DE69333348T2

DE69333348T2 - Anti-idiotypischer Antikörper und seine Verwendung zur Diagnose und Therapie bei HIV-bezogenen Krankheiten

Info

Publication number: DE69333348T2
Application number: DE69333348T
Authority: DE
Inventors: Sybille Muller; Haitao Wang
Original assignee: San Diego Regional Cancer Center
Current assignee: San Diego Regional Cancer Center
Priority date: 1992-03-09
Filing date: 1993-03-09
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2013-03-10
Also published as: US20030129628A1; US6916475B2; EP0671920B1; ATE255902T1; EP0671920A4; US5849583A; US6465173B2; US20050221298A1; US6461612B2; EP0671920A1; US20010010901A1; US20020009442A1; US6146627A; DE69333348D1; WO1993017694A1; US6221580B1; CA2131692A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Diagnose und die Behandlung von AIDS und insbesondere einen anti-idiotypischen Antikörper der mit mehr als einer Art eines Anti-HIV-1 Antikörpers reagiert. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des anti-idiotypischen Antikörpers als diagnostischen und therapeutischen Wirkstoff.
Das Acquired Immune Deficiency Syndrome, oder AIDS, wurde als moderne Plage beschrieben. Im Jahrzehnt seit seiner ersten Beschreibung im Jahre 1981 hat es allein in Vereinigten Staaten 120.000 Opfer gefordert. Gegenwärtig ist von ungefähr 200.000 Personen bekannt, dass sie mit dem Virus infiziert sind. Jedoch wird das wahre Ausmaß der Krankheit noch zu spüren sein. Das Virus kann latent in infizierten Individuen über 5 bis mehrere Jahre verbleiben, bevor Symptome auftreten. Viele Amerikaner mögen daher unwissentlich infiziert sein und in der Lage sein, andere zu infizieren, die in Kontakt mit ihren Körperflüssigkeiten kommen. Nahezu jede Person, die von dem Virus befallen wird, wird AIDS entwickeln und als Konsequenz davon sterben. Daher wird das persönliche, das soziale und der wirtschaftliche Ausmaß von AIDS enorm sein, sofern es unentdeckt bleibt.
Der AIDS verursachende Wirkstoff ist der menschliche immundefizitäre Virus vom Typ 1 (HIV-1). Das intakte HIV-1 Virion ist ungefähr sphärisch und weist einen Durchmesser von 110 nm auf. Das Virion hat eine äußere Membran, die mit Erhöhungen oder Fortsätzen bedeckt ist, die aus Glykoprotein gp160/120 bestehen. Außerdem existiert ein transmembranes Protein, das als gp41 bezeichnet wird. Innerhalb des Virions befinden sich zwei strukturelle Proteine: eine äußere Hülle, die aus dem Phosphoprotein p17 zusammengesetzt ist und ein innerer Nukleoid oder Zentralkern der aus Phosphoprotein p24 besteht. Virale RNA ist innerhalb des Kerns zusammen zwei Kopien des reversen Transcriptaseenzyms RT oder p65 vorhanden, wobei letzteres für die Synthese viraler DNA vom RNA Templat benötigt wird. In einer infizierten Person werden Antikörper für jedes der vorerwähnten Proteinbestandteile hergestellt und existieren in charakteristischen Konzentrationen über den gesamten Verlauf der Krankheit hinweg.
AIDS schreitet über drei Stadien nach HIV-1 Infektion fort. Das erste ist ein asymptomatisches Stadium während der Gast das Virus beherbergt und auf HIV-1 Antikörper seropositiv getestet wird, jedoch weist er keine der Symptome von HIV bezogenen Krankheiten auf. Dieses Stadium kann über Zeiträume von 5 oder mehr Jahren andauern. Das zweite Stadium, der AIDS-bezogene Komplex (ARC) und das Endstadium, AIDS, sind symptomatisch und durch Tumore und eine Serie von damit einhergehenden Infektionen charakterisiert.
Kurz nach der HIV-1 Infektion wird eine starke humorale Antwort erzeugt. Diese Phase ist durch erhöhte Gehalte an zirkulierenden Antikörpern charakterisiert. Spezifische neutralisierende Antikörper werden gegen die verschiedenen Proteinkomponenten von HIV-1 gerichtet und das ursprüngliche Virus wird dramatisch auf Gehalte reduziert, bei denen es oft schwierig ist, es zu isolieren. Dieser Punkt markiert den Beginn der krankheitsfreien Phase der HIV-Infektion mit seinen kennzeichnenden Merkmalen normaler T4-Zählungen und einer hohen Antikörperaktivität gegen HIV-1-Komponentenproteine. Jedoch widersteht der Virus trotz des Vorhandenseins der zellulären und humoralen Immunität im infizierten Individuum und nach einigen Jahren von Latenzzeit wird er aktiv werden, oftmals in verschiedene Varianten mutieren und eventuell das Immunsystem zerstören, was zu einem voll ausgewachsenen AIDS führt.
Bei Menschen werden virale Infektionen typischerweise durch zwei Hauptklassen von Immunantwort geklärt, eine humorale Antwort wird durch B-Lymphozyten vermittelt, die Antikörper herstellen und eine zellvermittelte Immunantwort, die durch T-Lymphozyten gesteuert wird. Individuen, die positiv auf HIV-1 getestet wurden, sind jedoch unfähig, die Infektion über diese zwei Arten der Immunantwort zu beseitigen. Sie können positiv über einige Jahre hinweg bleiben, bis sie einer der Begleitinfektionen, die für AIDS charakteristisch sind, zum Opfer fallen. Bis jetzt wurde bisher wurde noch kein Fall von viraler Zerstörung berichtet. Das Versagen des Immunsystems, den AIDS-Virus nach Infektion zu zerstören, bleibt ein Mysterium bei HIV-Infektionen. Es wurde zuerst als das Versagen der zellvermittelten Antwort erklärt, aufgrund der Zerstörung der T-Helferzellen (T4) durch HIV-1. Jedoch ist es schwierig, diese Erklärung zu verteidigen, da die T4-Zählung normal bleibt und nur eine kleine Fraktion der T4-Zellen anscheinend während der langen latenten und asymptomatischen Phasen der Krankheit infiziert zu sein scheinen.
Es wird nunmehr als wahrscheinlich angenommen, dass Abnormalitäten bei der humoralen Antwort der B-Zellen gegen HIV-1 wenigstens teilweise für die Unzulänglichkeit des Immunsystems in Verbindung mit HIV-1 bezogenen Krankheiten verantwortlich ist. Anstelle der normalen polyklonalen Antwort, die bei anderen Infektionen beobachtet wird, scheint die Antikörperantwort bei HIV-1 infizierten Individuen in oligoklonalen oder monoklonalen Antikörperpopulationen zu resultieren. Briault, et al., Clinical and Experimental Immunology 74, 182 (1988).
Herkömmliche Methoden zur Diagnose von HIV-1 Infektionen umfassen serologische Tests, um die Gegenwart von HIV-1 Antikörpern nachzuweisen und Polymerasekettenreaktion zum Nachweis des Virus. Jedoch gibt es Nachteile bei diesen traditionellen Methoden. Obgleich diese die Abwesenheit und das Vorhandensein von HIV-1 bestätigen, können sie nicht das Stadium des Krankheitsfortschritts angeben. Personen, die in die symptomatischen Stadien der Krankheit eintreten, können oftmals nicht den Beginn der Symptome erkennen und verzögern damit nötige Hilfe. Gegenwärtig gibt es keine wirksame Behandlung für eine HIV-Infektion. Es gibt kein wirksames Impfmittel, das gegenwärtig erhältlich ist. AZT und andere pharmazeutische Verbindungen können zeitweise Symptome bei AIDS-Patienten zum Abklingen bringen, jedoch waren sie nicht in der Lage, das Immunsystem zu stimulieren, um den Virus zu entfernen.
Es besteht daher eine Notwendigkeit zum weiteren Verständnis der Faktoren, die das Fortschreiten von HIV-bezogener Krankheit bestimmen können, um Methoden zur Prävention und zur Behandlung des Immunsystems Abnormalitäten zur Verfügung zu stellen, die charakteristisch für ARC und AIDS sind. Die vorliegende Erfindung kommt diesen Bedürfnissen nach und stellt ebenfalls damit verbundene Vorteile zur Verfügung.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung verwendet Verbindungen, die spezifisch reaktiv mit einem Idiotop sind, das wenigstens drei Arten des menschlichen Anti-HIV-1-Antikörpers gemein ist. Insbesondere verwendet die Erfindung einen anti-idiotypischen monoklonalen Antikörper mit spezifischer Reaktivität für mindestens drei Arten menschlicher Anti-HIV-Antikörper und nichtspezifische Reaktivität auf menschliche Nicht-HIV-Antikörper. Ein bevorzugter anti-idiotypischer Antikörper, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist der als IF7 bezeichnete monoklonale Antikörper, der spezifisch reaktiv gegen mehrere menschliche Anti-HIV-1-Antikörper verschiedener Spezifitäten ist und nicht reaktiv für menschliche Nicht-HIV-Antikörper. Das durch den anti-idiotypischen Antikörper, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, erkannte Idiotop und insbesondere das Idiotop, das durch den IF7-Antikörper erkannt wird, zeigt, dass es bei der klonalen Unterdrückung von B-Zellen, die für HIV-Infektionen charakteristisch sind, involviert ist. Es wird ebenso gezeigt, dass der IF7-Antikörper die T-Zellen anti-idiotypische Regulierung beeinflusst. Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Regulierung der Immunantwort in HIV-infizierten Individuen zur Verfügung über die Behandlung mit dem anti-idiotypischen Antikörper. Es wird angenommen, dass dies über die selektive Bindung von Untersets von B- und T-Lymphozyten über den Antikörper der vorliegenden Erfindung erfolgt. Außerdem wird gefunden, dass die Gegenwart des Idiotops, das durch den anti-idiotopischen Antikörper der vorliegenden Erfindung erkannt wird, den Seren von HIV-infizierten Individuen mit HIV einhergehenden lymphomischen Pathologien korreliert, insbesondere HIV-bezogenen B-Zelllymphomen. Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose und zur Verfolgung von HIV von mit HIV einhergehenden Pathologien durch die Reaktion der HIV-infizierten Seren mit dem anti-idiotypischen Antikörpern, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, zur Verfügung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Wechselwirkung des IF7-Antikörpers mit verschiedenen HIV+ und HIV– Seren oder gereinigten Antikörpern.
2a zeigt die Bindung von IF7 Id+ und F6 Id+ Antikörper an gp120 und 2B zeigt die Bindung von IF71D+ Antikörper an p24, während 2c die Bindung von IF7 an menschliche Antikörper mit verschiedenen Spezifitäten zeigt.
3a zeigt die Inhibierung der Bindung von IF7 Id+ Antikörper an gp120 durch IF7 und 3b zeigt die Inhibierung von IF7 Id+ Antikörper an p24 durch IF7.
4a zeigt den Nachweis von IF7 Id, das auf Antikörper gegen gp120 in HIV+ Seren exprimiert wurde und 4b zeigt den Nachweis von IF7 Id exprimiert auf Antikörpern gegen p24 in HIV+ Seren.
5 zeigt das Kappa/Lambda-Verhältnis von Anti-HIV-Antikörpern, wobei die Probennummer entlang der y-Achse aufgetragen ist und das Verhältnis verschiedener Antikörper bei jedem Patienten entlang der x-Achse.
6 zeigt das Kappa/Lambda-Verhältnis der Affinität von gereinigten anti-p24-Antikörpern, die über p24 ELISA oder IF7 ELISA für den Patienten 3-P14 (6a) und den Patienten 3-P49 (6b) einfangen wurden.
7 zeigt das IEF-Muster gereinigter anti-p24- und anti-gp120-Antikörper.
8 zeigt Histogramme des DNA-Gehalts bei HIV (8A und 8C) und HIV+ (8B und 8D) Donor-PBMC-Zellen, die mit IF7 oder einem Kontrollantikörper kultiviert wurden.
9 zeigt IF7-induzierte Apoptose bei PBML-Zellkulturen von HIV+ Spendern, verglichen mit Apoptose, die mit einem Kontrollantikörper induziert wird.
10 zeigt im Vergleich spontane Apoptose mit IF7-induzierte Apoptose auf PBML-Zellkulturen von HIV+ Spendern.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Abkürzungen

HIV, menschlicher immundiffizitärer Virus
HIV-1, HIV Typ 1 Virus
HIVIG, menschlicher polyklonales Anti-HIV-Immunoglobin
IVIG, gepoltes menschliches polyklones Immunoglobin
Id, Idiotop
Ab, Antikörper
Id+ Ab, Idiotyp positive Antikörper
V, variable Regionen eines Antikörpers
VH, variable schwere Kette
Vk, variable kappa-leichte Kette
Vl, variable lambda-leichte Kette
gp120, HIV-1-Hüllglkoprotein
p24, HIV-Kernprotein (gag)
RT, p65, HIV-assoziierte reverse Transcriptase
gp160, HIV-1 gesamtes Hüllglykoprotein
gp41, transmembranes HIV assoziiertes Protein

Wie vorliegend verwendet, bezieht sich der Ausdruck "mit HIV einhergehende Krankheit" sowohl auf die asymptomatischen und symptomatischen Phasen, das ist die ARC und AIDS-Phase, die auf die HIV-1-Infektion folgen. Die Begriffe "AIDS" und "ARC" beziehen sich auf das Acquired Immune Deficiency Syndrome und AIDS-Related complex, wie sie von Adler, British Medicine, 294:1145 (1987) beschrieben wurden. Sie sind für Tumore und eine Serie von opportunistischen Infektionen charakteristisch. Der Begriff "Antikörper", wie er vorliegend verwendet wird, bezieht sich auf jedes Molekül, das eine spezifische immunreaktive Aktivität aufweist, sowohl wenn es mit einer anderen Verbindung wie ein Zielwirkstoff, ein Träger, ein Label, ein Toxin oder ein Wirkstoff gekoppelt ist oder nicht. Obgleich ein Antikörper gewöhnlicherweise zwei leichte und zwei schwere Ketten umfasst, die in einer "Y"-Konfiguration aggregiert sind, sowohl mit oder ohne kovalenter Bindung zwischen ihnen, wird der Term ebenso verstanden, dass er jedes reaktive Fragment oder Fragmente der üblichen Zusammensetzung, wie beispielsweise Fab-Moleküle, Fab-Proteine oder Einzelkettenpolypeptide, die eine Bindungsaffinität für ein Antigen aufweisen, bedeutet. Fab bezieht sich auf antigenbindende Fragmente. Der Begriff "Fab-Moleküle", wie er vorliegend verwendet wird, bezieht sich auf Regionen von Antikörpermolekülen, die die variablen Anteile der schweren Kette und/oder leichten Kette umfassen und die eine Bindungsaktivität aufweisen. "FAB-Protein" umfasst Aggregate aus einer schweren und einer leichten Kette (üblicherweise als FAB bekannt), sowohl die Tetramere, die den Zweizweigsegmenten des Antikörpers Y entsprechen (üblicherweise bekannt als F(ab)₂), sowohl wenn jedes der vorstehenden kovalent oder nicht kovalent aggregiert sind, solange als die Aggregation in der Lage ist, selektiv mit einem speziellen Antigen oder einer Familie von Antigenen zu reagieren.
Der Begriff "Idiotop" oder idiotypische Determinante, wie er vorliegend verwendet wird, bezieht sich auf eine antigenische Determinante oder ein Epitop, das für das Immunoglobulinprodukt eines einzelnen Klons von Zellen einzigartig ist. Das Idiotop wird in der variablen Region des Antikörpers gefunden und bildet üblicherweise die Antigenbindungsstelle. Der Begriff "Epitop" bezieht sich allgemein gesprochen auf eine antigenische Determinante auf einem Molekül, die von Antikörpern erkannt wird. Der Begriff "anti-idiotypisch" oder "anti-idiotypische Antikörper" bezieht sich auf einen Antikörper, der gegen einen ersten Antikörper erzeugt wird, der spezifisch an ein Idiotop des ersten Antikörpers bindet.
Der Begriff "Spezifität", wie er vorliegend verwendet wird, wird austauschbar mit den Begriffen "spezifische Reaktivität", "spezifisch reaktiv" und "Immunreaktivität" verwendet. Jeder Begriff bezieht sich auf die Bindungsaffinität, die größer ist als die Hintergrundbindung. Beispielsweise wird eine Bindungsaffinität, die über die optische Dichte, die größer ist als die Standardabweichung der durchschnittlichen optischen Dichte einer Kontrolle wie sie über herkömmliche ELISA-Techniken bestimmt wird, angesehen, dass sie eine spezifische Reaktivität darstellt. Andere Assays, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, können ebenfalls verwendet werden, um die spezifische Reaktivität zu bestimmen. Der Begriff "nicht signifikant reaktiv" ist eine Bindungsaffinität, die nicht größer ist als die Hintergrundbindung.
Der Begriff "Klonotyp", wie er vorliegend verwendet wird, bezieht sich auf das homologe Produkt eines Zellklons oder das Phenotyp eines Zellklons. Idiotypische Determinanten, die von Populationen von antigenspezifischen B-Zellen oder T-Zellen exprimiert werden, dienen als klonotypische Marker für Immunzellen, die auf eine gegebene antigenische Herausforderung antworten. Klonotypische Spezifitäten kön nen an eine einzelne epitopische Spezifität verknüpft sein oder können von Antikörpern verschiedener Spezifitäten geteilt werden (Zhou et al. J. Immun. 145, 2554 (1990)).
Die vorliegende Erfindung verwendet einen anti-idiotypischen monoklonalen Antikörper mit spezifischer Reaktivität für ein Idiotop, welches für mindestens drei Arten menschlicher Anti-HIV-Antikörper und nicht spezifisch reaktiv für menschliche Nicht-HIV-Antikörper ist. Ein bevorzugter anti-idiotopischer monoklonaler Antikörper ist der monoklonale Antikörper 1F7, der spezifisch reaktiv mit einem gemeinsamen Klonotyp ist, der von den Anti-HIV-1-Antikörpern geteilt wird, die verschiedene Spezifitäten haben.
Der anti-idiotypische Antikörper, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist als diagnostischer oder prognostischer Marker nützlich, um den Gehalt von reaktiven HIV-1-Antikörpern in Proben von HIV-infizierten Patienten zu messen. Die Analyse dieser Gehalte erlaubt die frühe Charakterisierung von mit HIV einhergehendem Krankheitsverlauf, und erlaubt die frühe Diagnose und die Behandlung von mit HIV einhergehenden Pathologien. Außerdem ist der anti-idiotypische Antikörper therapeutisch nützlich, um die virale Entfernung zu erleichtern. Dominante B-Zellklone, die Antikörper herstellen, die das Idiotop exprimieren, gegen das der Antikörper reaktiv ist und die nicht länger wirksam gegen HIV-1 sind, werden unterdrückt, so dass damit die normale polyklonale Immunantwort wiederhergestellt wird, die wirksam den Virus aus dem System des infizierten Individuums entfernt.
Der anti-idiotypische Antikörper, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird gegen die HIV-infizierte Seren produziert und anschließend auf seine spezifische Reaktivität gegenüber Antikörpern gescreent, die gegen verschiedene HIV-Antigene reaktiv sind und auf seine Abwesenheit an Reaktivität gegen menschliche Nicht-HIV-Antikörper. Der anti-idiotypische Antikörper ist spezifisch reaktiv mit Antikörpern, die gegen verschiedene HIV-Antigene reaktiv sind, wie anti-p24-Antikörper, anti-gp120-Antikörper und anti-RT-Antikörper (Id+ Antikörper).
Der Antikörper, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann mittels aus dem Stand der Technik gut bekannter Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise sind Fab's und Verfahren zu deren Herstellung bei Harlow and Lande, Antibodies, A. Laboratory Manual, 626–631 (1988) beschrieben. Beispiele von reaktiven Einzelkettenpolypeptiden und ein Verfahren zu ihrer Herstellung werden von Ladner, US-Patent Nr. 4,946,778 gelehrt. Antikörper können mittels monoklonaler Techniken wie beispielsweise das Verfahren von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975) hergestellt werden, das modifiziert werden kann wie von Gerhard, Monoclonal Antibodies, Kennett et al., Eds., 370–371 (1980) beispielsweise beschrieben wurde. Alternativ dazu können Antikörper aus polyklonalen Sektionen über gut bekannte Assayverfahren gescreent werden. Antikörper können ebenfalls durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden, wie sie von Cabilly et al., US-Patent Nr. 4,816,567 beispielsweise gelehrt werden oder aus Immunoglobulin kombinatorischen Bibliotheken, wie es von Huse, et al., Science 246, 1275 (1989) gelehrt wird, ausgewählt werden. CDR-Pfropfen wie es von Cabilly et al., siehe oben, gelehrt wird, kann ebenfalls verwendet werden, um Fragmente herzustellen, die mit dem Idiotop reaktiv sind.
Außerdem stellt die Erfindung ein isoliertes Idiotop zur Verfügung, welches für einige Typen von HIV-1-Antikörpern (Id+ Antikörper) gemein ist, insbesondere bei denjenigen, die über dominante beschränkte B-Zellklone hergestellt werden und insbesondere mit dem anti-idiotypischen Antikörper der vorliegenden Erfindung reaktiv sind. Wenn es erkannt und von einem Id+ Antikörper isoliert ist oder anderweitig synthetisch oder rekombinant hergestellt wird, ist dieses Idiotop bei der Herstellung von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern für die Diagnose, Prognose und therapeutischen Anwendung unter Verwendung von gut bekannten Techniken nützlich. Beispielsweise kann das isolierte Isotop dazu verwendet werden, Tiere zu immunisieren, um Hybridome zu erzeugen, die monoklonale Antikörper exprimieren, die für das Idiotop spezifisch sind. In anderen Fällen kann das Idiotop verwendet werden, um eine Immunantwort in einem Kaninchen, einer Ziege oder nichtmenschlichen Primaten oder anderen Tieren zu erzeugen, von denen Serum polyklonale Antikörper über gut bekannte Verfahren erhalten werden können. Außerdem kann das Idiotop zur Reinigung oder zur Charakterisierung von anti-idiotypischen Antikörpern von Interesse verwendet werden, beispielsweise für monoklonale Antikörper oder Antikörper, die im menschlichen Gewebe oder in Körperflüssigkeiten vorhanden sind.
Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, um die Oligoklonalität in der Antikörperantwort auf eine HIV-Infektion durch die Verabreichung des anti-idiotypischen Antikörpers oder andere reaktive Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, an ein HIV-positives Individuum herzustellen. Die anti-idiotypische Regulierung kann Oligoklonalität herbeiführen, entweder über die Unterdrückung der dominanten B-Zellenantwort gegenüber HIV oder durch die Verstärkung des Wachstums anderer Klone. Dieser Zugang zur Behandlung basiert auf den speziellen Eigenschaften der HIV-Infektion.
Während der Zeit in der HIV-1 den Wirt bewohnt, sind die hauptsächlichen neutralisierenden Epitope, insbesondere pg120 Gegenstand zahlreiche Mutationen, die neutralisationsfliehende Varianten ergeben. Nara, et al., Journal of Virology 64, 3779 (1990); Nara, et al., FASEB Journal 5, 2437 (1991). Es wird angenommen, dass die Antikörper, die bei der Antwort auf die ursprüngliche HIV-1-Infektion erzeugt wurden, nicht gegen die neuen Fluchtvarianten wirksam sind, und dass da Wirtimmunsystem es nicht schafft, neue Antikörper für diese Varianten zu erzeugen. Montefiori et al., Virology 182, 635 (199 ); Nara et al., Journal of Virology 64, 3779 (1990); Nara et al., PNAS USA 84, 797 (1987). Das Unvermögen des Immunsystems, diese neu auftretenden Virenisolate zu erkennen, wird auf das Auftreten einer dominanten klonalen Population von B-Zellen zurückgeführt, die in der Lage sind oder darauf beschränkt sind, Antikörper für die ursprüngliche HIV-1-Variante herzustellen. Die dominanten Klone verhindern Rekrutierung und die Expansion anderer B-Zellenpopulationen, die in der Lage wären, eine effiziente Antwort auf neue HIV-1-Varianten zu liefern und andere opportunistische Viren. Bei anderen Untersuchungen wurde gefunden, dass dominant etablierte B-Zellen einen Unterdrückungseffekt auf geringfügige B-Zellen ausüben, die gegen das gleiche oder kreuzreaktive Epitope gerichtet sind. Askonas und Williamson, Nature 238, 339 (1972); Briles und Davie J. Exp. Med. 152, 151 (1980).
Es scheint, als ob HIV-1 Neutralisationsfluchtvarianten erzeugt, wobei die mutierten Epitope hinreichende Kreuzreaktivität beibehalten, um weiterhin frühe, klonal expandierte B-Zellklone auszulösen. Der Nachweis für diese Kreuzreaktivität mit Hüllepitopen wurde in verschiedenen Isolaten beobachtet. Kang et al., PNAS USA 88, 6171 (1991). Daher können B-Zellen mit einer potentiell höheren Affinität für mutierte Epi topen in ihrer Fähigkeit begrenzt sein, zu antworten und proliferieren, um eine wirksame Klongröße zu erreichen. Stattdessen fährt die Cross-Stimulierung durch mutierte HIV-1-Epitope fort, das Original und nun unwirksame Klone auszulösen und expandieren zu lassen. Kürzliche Berichte über IEF-Profile über die Zeit in infizierten Individuen dokumentieren die Persistenz von anti-gp120 spezifischen B-Zellklonen. Matricardi, et al., Seventh International Conference for AIDS 2, 167, (1991). Mittels dieses Mechanismus kann sich eine Situation entwickeln, bei der das infizierte Individuum menschliche neutralisierende Antikörper produziert, die gegen Laborstränge wirksam sind und isoliert von verschiedenen seropositiven Individuen, aber weniger wirksam gegen autologe HIV-1-Varianten. Montefiori et al., supra, (1991); Nara, et al., supra (1990).
Der durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellte Zugang zur Behandlung HIV-Infektion basiert auf der überraschenden Entdeckung, dass Idiotope, die für mehr als eine Art des HIV-1-Antikörpers gleich sind, durch beschränkte B-Zellklone hergestellt wird. Klonale Restriktion von B-Zellen, die diese Antikörper herstellen, wurde über Kappa/Lambda leichte Kettenanalyse gezeigt, isoelektrische Konzentration und Immunoblotanalyse von variablen Regionunterschiede von B-Zellkolonien, die auf HIV-1-Infektion antworten, wie es im nachstehenden Beispiel III gezeigt ist.
Ein bevorzugter anti-idiotypischer Antikörper ist der monoklonale 1F7-Antikörper. Die Herstellung und das Screening von 1F7 ist im nachstehenden Beispiel I beschrieben. Eine Hybridomazelllinie, die in der Lage ist, den 1F7-Antikörper zu exprimieren, wurde bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, hinterlegt und ihr wurde die Zugangsnummer SD 1506 zugeteilt.
Es wurde gefunden, dass 1F7 spezifisch reaktiv mit wenigstens drei Anti-HIV-Antikörpern ist, die verschiedene Spezifitäten aufweisen. Es wird im nachstehenden Beispiel II gezeigt, dass 1F7 Id ein Klonotypmarker für Anti-HIV-Antikörper ist. Eine Klonotypenanalyse von HIV+ und HIV– Seren zeigt, dass es für das 1F7 Id Klonotyp üblich ist, dass er von verschiedenen Anti-HIV-1-Antikörpern, die vom gleichen HIV+ Individuum erzeugt wurden, geteilt wird (siehe den Western Blot, 1 und TABELLE 2). Weil ein geteilter klonotypischer Marker auf B-Zellen, die auf eine HIV-Infektion antworten, normalerweise das Ziel der Regulierung und der Aufrecherhal tung der Immunantwort auf den HIV-Virus wäre, wird 1F7 Id angenommen, dass es bei der anti-idiotypischen Regulierung des Immunsystems bei HIV-infizierten Personen involviert ist. Dies wird durch den Befund unterstützt, dass 70% einer untersuchten Population 1F7 Id als gemeinsame Determinante von Antikörpern teilen, die die oligoklonale Anti-HIV-Antwort ausmachen (Wang et al., Eur. J. Immunol. 22, 1749 (1992).
Es wird der Nachweis erbracht, dass Anti-HIV+ Antikörper und 1F7 Id+ Antikörper insbesondere von beschränkten klonalen Ursprung sind. Dies wird durch die Daten, die in den nachstehenden Beispielen IIIA, B und C gezeigt sind, nachgewiesen.
Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung, um die Dominanz von nicht wirksamen Klonen zu ersetzen, indem das Idiotop blockiert wird, das vom anti-idiotypischen Antikörper der vorliegenden Erfindung erkannt wird. Die Behandlung eines Patienten mit der Verbindung der Erfindung wird in der spezifischen Bindung des Antikörpers oder verwandter Verbindungen an das Idiotop auf Zellen in den dominanten Klonen resultieren. Dies resultiert in der Inhibierung ihrer Proliferation und Einschränkung der Produktion von Antikörpern der ursprünglichen HIV-1-Variante. Als ein Resultat davon, dass die dominanten Zellen blockiert sind, sind andere B-Zellen in der Lage, auf die neuen HIV-1-Varianten zu antworten. Eine normale polyklonale Immunantwort wird wiederhergestellt und Antikörper für die neuen HIV-1-Varianten sind wirksam bei der Entfernung des Virus aus dem Wirtsystem.
Es wird weiter gezeigt, dass T-Zellen in HIV+ infizierten Personen Gegenstand einer anti-idiotypischen Regulierung über das von 1F7 erkannte Idiotop sind. T-Zellen aus HIV+ Serenproben wurden darauf analysiert, ob anti-idiotypische Regulierung über das 1F7 anti-idiotypischen Antikörpers, wie es in Beispiel V nachstehend beschrieben wurde, auftritt. Periphere mononukleare Blutzellen (PMBC) wurden aus Seren von HIV+ Individuen und HIV– normalen Kontrollindividuen entnommen und in einer Kultur gemäß den Verfahren, wie sie im nachstehenden Beispiel V beschrieben wurden, kultiviert. Diese Zellen wurden dem 1F7 Antikörper ausgesetzt und einem isotypen Kontrollantikörper. Es wurden gefunden, dass der 1F7 Antikörper Apoptose bei 16 der 20 HIV+ Proben induzierte und keine bei den HIV– Kontrollproben. Flusszytometrische Analysen und Lymphozytensubset-Verarmungsexperimente, wie sie im nachstehenden Beispiel 5 beschrieben sind, zeigten, dass Zellen, die einer Apoptose unterzogen wurden, das T-Zellensubset CD8+ Zellen waren. Diese Befunde zusammen mit weiteren Experimenten, wie sie in Beispiel 5 beschrieben wurden, zeigen an, dass 1F7 ein Subset von CD8 Lymphozyten bindet, das selektiv bei HIV-Infektion über Rezeptormoleküle, die expandierte und der zellvermittelten Zytotoxizität und Apoptose verbunden ist. Indem 1F7 selektiv an die Untersets von B- und T-Lymphozyten, die während der HIV-Infektion vergrößert wurden, bindet, wird erwartet, dass es die Immunantwort bei der HIV-Infektion vorteilhaft ändert.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass die Gegenwart des Idiotops, das über die Antikörper der vorliegenden Erfindung einer Probe von menschlichen Serum erkannt wird, mit Auftreten von mit HIV einhergehenden Pathologien bei Individuen korreliert. Wie es in Beispiel IV beschrieben wurde, korreliert die Erkennung eines 1F7-Idiotops auf IgG und IgM mit der HIV+ Bedingung und insbesondere korreliert es mit dem Auftreten von mit HIV-1 einhergehenden Lymphom. Studien zeigen, dass 93% von mit HIV-1 infizierten Patienten mit Lymphomatests positiv auf 1F7-Exprimierung sind. Daher ist der Nachweis des 1F7-Idiotops durch die Reaktion mit dem 1F7-Antikörper ein Verfahren zum Nachweis, zur Diagnose und zum Verfolgen des Auftretens von mit HIV-1 einhergehenden Lymphom bei HIV+ Patienten. Dies ist insbesondere nützlich, weil der Nachweis des malginen Lymphoms bei HIV-1 infizierten Patienten schwierig ist, da seine Symptome ähnlich denjenigen von opportunistischen Infektionen sind und der AIDS-Zustand per se. Die Diagnose in einem frühen Stadium des Lymphoms ermöglicht eine aggressivere und genauere Behandlung.
Die Erfindung betrifft weiter die Verwendung des Antikörpers der vorliegenden Erfindung, um verschiedene Arten von HIV-1-Antikörpern einer Probe nachzuweisen. Dies kann nützlich sein zur Identifikation von HIV-1-Antikörpern in Zellen oder anderen Proben, die für Laborzwecke hergestellt wurden oder in Proben von Patienten, die möglicherweise eine mit HIV einhergehende Krankheit aufweisen. Eine Ausführungsform beinhaltet das Inkontaktbringen der Probe mit möglicherweise enthaltenden HIV-1-Antikörpern mit der Verbindung der Erfindung und des Bestimmens, ob Bindung auftritt. Beispielsweise kann eine Probe eines Patienten Serum sein, Sehnen, Urin, Gewebe, Zellen oder jede andere Probe, von dem allgemein bekannt oder vermutet wird, dass sie Antikörper enthält. Eine Probe kann ebenso eine Kultur von Zelllinien sein, die auf HIV-1-Antikörperproduktion getestet wurden. Die Verbindung ist am einfachsten mit der Probe in Kontakt gebracht, indem sie zusammen in einem Reagensgläschen oder in der Vertiefung eines Plättchens zusammengemischt werden. Nachfolgende Bestimmung der Bindung kann durch jede bekannte Mittel durchgeführt werden, beispielsweise Radioimmunassay, Färben der markierten Verbindung oder Immunofällung. Die Bindungsaffinität oberhalb des Hintergrunds weist die Gegenwart von HIV-1-Antikörpern nach und ist ein diagnostisches Mittel für mit HIV einhergehenden Krankheiten.
Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung der Verbindung, um eine quantitative Bestimmung des HIV-1-Antikörpergehalts zu erhalten, um das Fortschreiten einer Krankheit einer mit HIV einhergehenden Krankheit eines Patienten zu prognostizieren, so dass eine wirksame Therapie begonnen werden kann. Der Begriff "Prognose" oder "Prognostizieren" wie er vorliegend verwendet wird, bezieht sich auf das Verfolgen des Fortschreitens, des Bestimmens der Prognose oder der Vorschau des Auftretens von Symptom von mit HIV einhergehenden Krankheiten. Frühere Methoden des Plottens von T4 und anderer Antikörpergehalte wurden als unbefriedigend empfunden als Prognosewerkzeuge, weil es keine verlässliche Variation in ihren Gehalten gibt. Die Gehalte des HIV-1-Antikörpers, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung erhalten werden, sind das Ergebnis der verlässlichen, progressiven Entwicklung der klonalen Dominanz von B-Zellkolonien. Die Antikörper, die durch diese Kolonien hergestellt werden, zeigen das neue Idiotop und binden an die erfindungsgemäße Verbindung. Quantitative Resultate in Bezug auf die Bindung können wie vorstehend beschrieben erhalten werden. Das Ausmaß der Bindung wird durch das Verfahren bestimmt und wird mit einem Standard für die verschiedenen Stadien von mit HIV einhergehenden Krankheiten bestimmt. Damit ist es möglich, das Stadium der Krankheit des Patienten zu bestimmen und die Entwicklung weiterer Symptome zu prognostizieren. Der Standard könnte beispielsweise über die vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden, unter Verwendung von flüssigen Proben von Patienten mit Symptomen, von denen bekannt ist, dass sie spezifische Stadien von mit HIV einhergehenden Krankheiten charakterisieren und der Bestimmung der Menge des HIV-1-Antikörpers der spezifisch reaktiv mit der erfindungsgemäßen Verbindung ist. Die erhaltenen Gehalte es Antikörpers werden gegen die Zeit aufge tragen und korrelieren mit dem Stadium des Fortschreitens. Das resultierende Schaubild dient als Standard, die gegenüber den Ergebnissen von Patienten mit unbekannter Diagnose und Prognose aufgetragen werden. Das Stadium des Fortschreitens und der Prognose der Krankheit des Patienten wird über den Vergleich seines Gehalts an HIV-1-Antikörpern bestimmt, die mit der Verbindung reagieren, verglichen mit dem Standard. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass der erfindungsgemäße 1F7-Antikörper insbesondere sehr genau bei der Diagnose von mit HIV einhergehenden Lymphomen ist.
Die Erfindung betrifft weiter allgemein Verfahren zur Prävention, Immunisierung der Behandlung von mit HIV einhergehenden Krankheiten durch Verabreichung einer wirksamen Menge der Verbindung an einen Patienten, bei dem eine mit HIV einhergehende Krankheit diagnostiziert wurde. Eine wirksame Menge des Antikörpers zur Behandlung von mit HIV einhergehender Krankheit ist die Menge, die notwendig ist, um den Effekt der Zerstörung der klonalen Dominanz von beschränkten B-Zellen oder beschränkten oder infizierten T-Zellen zu erzeugen, und so eine polyklonale Immunantwort im Patienten wiederherzustellen. Die Verbindung kann als pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung gestellt werden, die die wirksame Menge der Verbindung zusammen mit einem physiologisch akzeptablen Träger enthält. Diese Zusammensetzung kann mittels jeglicher bekannter Mittel verabreicht werden, beispielsweise intravenös, intramuskulär, subkutan, intradermal, intraperitoneal oder mittels einer Infusion. Die Verbindung kann ebenso an einen geeigneten therapeutischen Wirkstoff gebunden sein, wie beispielsweise ein Toxin, ein Hormon, einem Arzneimittel oder anderen Verbindungen, die die Zerstörung der dominanten B-Zellen erleichtern. Wirkstoffe umfassen im Allgemeinen Alkylierungswirkstoffe, antiproliferative Wirkstoffe, Tubulin bindende Wirkstoffe, Zytotoxine und dergleichen. Toxine, die als therapeutische Wirkstoffe geeignet sind, umfassen Podophyophyllotoxine, Ricin, Trichothecine, Colchicine und Pseudomonas Endotoxin.
Die nachstehenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu veranschaulichen aber nicht dazu, sie zu beschränken. Während sie für denjenigen, die verwendet werden können, typisch sind, können andere Verfahren, die einem Durchschnittsfachmann bekannt sind, alternativ dazu verwendet werden.
BEISPIEL 1
Isolierung und Charakterisierung von anti-idiotypischen Antikörper
1. Materialien
Menschliches polyklonales Anti-HIV-Immunoglobulin (HIVIG), Lot VH 102 wurde von NIAID AIDS Research Reference Reagent Program (ERC Bioservices Corporation, Rockville, MD) erhalten. Menschliches gepooltes IgG (IVIG) wurde von Cutter Biological, Elkhart, IN bezogen. Normales menschliches HIV-Serum wurde von der San Diego Regional Blutbank erhalten. HIV positive (HIV+) Seren von gesunden, seropositiven Individuen wurden von North American Biological Inc. (NABI), Miami, FL erhalten.
Rekombinantes p24 (HTLV-IIIB) und das p24/gp41 Fusionsprotein wurden von Dr. Torsten Helting, Pharmacia Genetic Engineering, La Jolla, CA erhalten. Rekombinantes gp120 (HTLV IIIB) oder gp120 (MN) V3 Schleifenpeptide und rekombinante HIV-1 reverse Transkriptase (RT, p65) wurden von American Biotechnologies, Inc., Cambridge, MA bezogen. Rekombinantes gp120 (SF2) wurde von der Chiron Corporation, Emeryville, CA erhalten. Die Antigenbezeichnungen IIIB, MN, SF2, etc. beziehen sich auf die Laborstränge von HIV-1.
Menschliche monoklonale Anti-HIV-1-Antikörper wurden schon vorher in den Veröffentlichungen von Gorny et al., PNAS USA 88, 3228 (1991), und Gorny et al., PNSA USA 86, 1624 (1989) beschrieben. Diese umfassen menschliche monoklonale Anti-24-Antikörper, 71-31, 91-5 und 241-D (alle IgG1, Lambda), Anti-gp120-Antikörper, 257-D, 268-D und 453-D (alle IgG1, Lambda) und Anti-gp41-Antikörper 98-6 (IgG2, Kappa).
2. Verfahren
1. Produktion von Maus monoklonalen Antikörper gegen die menschliche polyklonale HIVIG1
Monoklonale Antikörper wurden gemäß dem Verfahren von Müller, J. Immun. 147, 933 (1991) hergestellt. BALB/c Mäuse (MTS Laboratories, San Diego, CA) erhielten drei subkutane Injektionen von 50 μg menschlichen HIVIG in Freund's vollständigen und unvollständigen Adjuvans (Sigma Chemial Co., St. Louis, MO) an den Tagen 1, 10 und 20. Am Tag 45 wurden die Mäuse mit 50 μg HIVIG intravenös gespritzt. Mäusesplicezellen wurden anschließend mit Sp2/0 Zellen gemäß Standardprotokollen verschmolzen. Das Überstehen der Kulturen wurde wie nachstehend beschrieben gescreent.
Mikrotiterplättchen wurden mit 100 μl/Vertiefung von 2 μg/ml von entweder gp120 oder p24 in Hydrogencarbonatpuffer (pH 9,6) bei 4°C über Nacht beschichtet und mit 2% BSA über zwei Stunden blockiert, gefolgt von der Zugabe von 100 μl/Vertiefung von 100 μg/ml von HIVIG und für zwei Stunden inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit 0,01 M PBS enthaltend 0,1% Tween-20 (PBS-T), wurden 100 μl des überstehenden einer Hybridomakultur zugegeben und für zwei Stunden inkubiert. Nachdem weitere drei Male gewaschen wurde, wurden 100 μl von 10⁵ cpm ¹²⁵I-markierten Ziegen-Antimaus in jede Vertiefung zugegeben und bei 37°C für 1,5 Stunden inkubiert. Die Plättchen wurden anschließend dreimal gewaschen und geschnitten, um mittels Zählens im Gammazähler das cpm, das in jede Vertiefung gebunden wurde, zu bestimmen (Nuclear-Medical Laboratories, Inc.).
Alternativ dazu wurden Kopien der Mikrotiterplättchen mit 100 μl/Vertiefung mit 2 μl/ml an IVIG beschichtet (Cutter Biological, Elkhart, IN) bei 4°C über Nacht belassen und anschließend mit 2% BSA blockiert. IVIG, das sich auf das menschliche gepoolte IgG von menschlichen Seren, die keine HIV-Antikörper enthalten, bezieht und welches im Allgemeinen von einem großen Donorpool von mehr als 10000 Donoren ableitet. Das nachfolgende Verfahren des Zugebens des Überstehenden von Kulturen und ¹²⁵I-markierten Ziegen-Antimaus Ig war das gleiche wie vorstehend beschrieben. Hybridomaantikörper, die an die Antikörper, die durch die HIV-Antigene gefangen wurden, binden, aber nicht an IVIG, wurden ausgewählt.
Positive Klone wurden viermal subkloniert und in Gewebekulturgefäßen expandiert oder amplifiziert über Ascites in BALB/c Mäusen. Monoklonale Antikörper vom IgM-Isotyp, welche aus den Überstehenden abgeleitet wurden, und Ascites wurden über eine Ziegen-Antimaus IgM Sepharose 4B Kolonne gereinigt (Pharmacia LKB, Biotechnology AB, Uppsala, Schweden).
3Cl, ein anderer IgM Kappa-Klon der gleichen Fusion wie diejenige, die 1F7 produzierte, wird als negative Kontrolle in verschiedenen Experimenten verwendet.
2. Western Blot Analyse
Es wurde eine Western Blot Analyse durchgeführt, unter Verwendung von handelsüblichen HIV-1 Immunoblot Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Bio-Rad, Hercules, CA). Zum Nachweis menschlicher Anti-HIV-Antikörper, wurden menschliche Seren oder 1F7-gereinigte menschliche Antikörper mit Mikrocellulosestreifen, die HIV-1-Antigene enthalten, für 30 Minuten inkubiert. Nach Waschen, wurden die Antikörper, die an die HIV-Antigene gebunden hatten, unter Verwendung von alkalischer Phosphatase die an Ziegen anti-menschlicher IgG konjugiert war, nachgewiesen. Zum Nachweis von 1F7-positiven Anti-HIV-Antikörpern, die von HIV-Antigenen gefangen wurden, wurden die Mikrocellulosestreifen zuerst mit menschlichen Seren für 30 Minuten inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wurden 3 ml von 1F7 überstehenden Lösungen zu jedem Streifen zugegeben und für 2 Stunden inkubiert. Nach wiederholtem Waschen wurde jeder Streifen für eine Stunde mit 3 ml von Peroxidase konjugiertem Ziegen-Antimaus IgM (1 : 200 Verdünnung, Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) inkubiert. Die Entwicklung der Streifen wurde unter Verwendung von 3 ml von 600 μg/ml von Diaminobenzidin (DAB) (Sigma Chemical Co., St. Louis) durchgeführt.
3. Affinitätsreinigung von menschlichen Serumantikörpern
Die Immunoaffinitätsreinigung von menschlichen Serumantikörpern wurde über die Kopplung von rekombinanten p24 Protein, rekombinanten p24/gp41 Fusionsprotein und Maus anti-idiotypischem Antikörper, 1F7 an die CNBr-aktivierter Sepharose 4B (Pharmacia LKB, Biotechnology AB, Uppsala, Schweden) gemäß dem Hersteller durchgeführt. Die Reinigung von Anti-Phosphorycholin (PC) und F6 Id+ Antikörpern (F6 Idiotop positive Antikörper) wurde durchgeführt, wie es bei Halpern er al, J. Clin. Invest. 88, 476 (1991) beschrieben wurde. F6 ist ein nicht korrelierter anti-idiotypischer Antikörper, der mit natürlichen menschlichen Anti-PC-Antikörpern rea giert und wird als Kontrolle bei Experimenten, die 1F7 verwenden, benutzt. Um Anti-gp41-Antikörper auf einer p24/gp41 Affinitätssäule zu erhalten, wird zuerst das HIV+ Serum wiederholt auf die p24 Affinitätssäule absorbiert, um Anti-p24-Antikörper vollkommen zu entfernen. Der Durchfluss wurde anschließend über das p24/pg21 Immunoadsorbens geleitet.
Seren von HIV+ Individuen wurden mit 0,01 M PBS, pH 7,0 verdünnt und auf Immunoadsorbenzien aufgetragen. Nach ausführlichem Waschen mit PBS, wurden die gebundenen Antikörper mit 0,1 M Glycinpuffer eluiert (pH 2,5), gegen PBS dialysiert und aufkonzentriert.
4. ELISA zum Nachweis menschlicher Antikörper auf pg120 und p24
Die rekombinanten gp120, RT oder p24 wurden auf Mikrotiterplättchen mit 100 μl/Vertiefung mit 2 μg/ml über Nacht beschichtet und bei 4°C und anschließend mit 2 BSA blockiert. Menschliches Serum oder gereinigte menschliche Antikörper, die in 0,01 M PBS, enthaltend 0,1% Tween-20 (PBS-T), verdünnt war und für 2 Stunden inkubiert. Die Vertiefungen wurden anschließend mit Peroxidase konjugiertem Ziegen-antimenschlichem IgG (1 : 5000, TAGO, Inc., Burlingame, CA) für eine Stunde inkubiert. Alle Inkubierungen wurden von fünfmaligem Waschen mit PBS-T gefolgt. Die gebundenen Antikörper wurden sichtbar gemacht unter Verwendung von O-Phenylendiamin (OPD) (Sigma Chemical, St. Louis) und die Reaktion wurde mit 3N H₂SO₄ abgebrochen. Die optische Dichte (OD) wurde bei einer Absorbanz von 490 nm ausgelesen (Molecular Devices Corporation, Menlo Park, CA).
5. ELISA zur Bestimmung von 1F7 Id Expression auf Anti-p24, Anti-gp120-Antikörpern und Anti-RT-Antikörper
Dieses Verfahren war ähnlich zur HIV-Antigenfänger RIA zum Nachweis an Anti-HIV-Antikörpern wie vorstehend beschrieben. Mikrotiterplättchen wurden mit 200 ng/Vertiefung gp120 (IIIB oder SF), RT oder p24 bei 4°C über Nacht beschichtet und anschließend mit 2% BSA blockiert. Menschliches Serum (1 : 100 Verdünnung) oder affinitätsgereinigte menschliche Antikörper wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und für 2 Stunden inkubiert. Nach dem Waschen, wurden 100 ng/Vertiefung 1F7 Ü berstehende oder 3Cl ( ein Kontrollmaus monoklonaler IgM) Überstehende zugegeben und für 2 Stunden inkubiert, gefolgt von weiterem Waschen. 1F7 oder 3Cl die an Antikörper gebunden sind, die von gp120 gefangen wurden, RT oder p24 wurden mit Peroxidase konjugierter Ziegen-Antimaus IgM nachgewiesen.
6. ELISA für die kompetitive Inhibierung des Bindens von 1F7 Id+ Antikörpern an gp120 und p24 durch 1F7.
Das Verfahren des Beschichtens, des Waschens und der Entwicklung von Mikrotiterplättchen wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die 1F7 Id+ Antikörper, die über ein 1F7-Immunoadsorbens aus HIV+ Serum gereinigt wurden, vorinkubiert wurden mit Inhibitoren bei 4°C über Nacht, bevor sie zu den Plättchen, die mit gp120 oder p24 beschichtet sind, zugegeben wurden. Der Inhibitionsgrad wurde wie folgt berechnet:
7. ELISA zur Identifizierung von menschlichen Anti-HIV-Antikörpern, die mit 1F7 binden
Mikrotiterplättchen wurden mit 500 ng/Vertiefung von 1F7 bei 4°C über Nacht beschichtet und mit 2% BSA für 2 Stunden blockiert. 100 μl verdünnten menschlichen Serums oder menschlicher Antikörper, die über Affinitätschromatographie gereinigt wurden, wurden in jede Vertiefung zugegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen, wurden die Plättchen mit Peroxidase konjugierten Ziegen-Antimaus IgG für 1,5 Stunden inkubiert.
Alternativ dazu wurden 100 μl/Vertiefung von 1 μg/ml von Biotin-markierten 1F7 zugegeben und für eine Stunde inkubiert. Die Plättchen wurden weitere fünfmal gewaschen und anschließend wurden 100 μl/Vertiefung von Avidin-markierter Peroxidase (1 : 2000, Sigma Chemical, St. Louis) zugegeben und für 45 Stunden inkubiert. Die nachfolgende Prozedur dieses Assay wird wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die Biotinylierung von 1F7 wurde wie von Harlow und Lane, Eds. Antibodies, A Laboratory Manual (1988) beschrieben durchgeführt.
Verfahren
Mausmonoklonale anti-idiotypische Antikörper wurden wie vorstehend gegen HIVIG hergestellt. Die Antikörper gegen HIVIG wurden unter Verwendung von p24 und gp120 Fänger ELISA Assays nachgewiesen. Ein Hybridoma, 1F7 (IgM, Kappa), welches an Antikörper bindet, die von diesem HIV-1-Antigenen gefangen wurden aber nicht an IVIG bindet, wurde subkloniert und in einer Ascitesflüssigkeit wie vorstehend beschrieben kultiviert.
Das Testen unter Verwendung von HIVIG- und IVIG-Antikörperfänger ELISA unter Verwendung von p24- und p120-Antigenen, wie in TABELLE 1 gezeigt ist, zeigte, dass Seren von HIVIG immunisierten Mäusen, die an HIVIG binden, das über p24 oder pg120 gefangen wurde und ebenfalls an IVIG bindet, während das Präimmunserum nicht an HIV oder IVIG bindet. Die überstehende Lösung von 1F7 bindet jedoch nur an HIVIG, das von HIV-1-Antigenen gefangen wurde. Die Bindung von 3Cl wurde als negative Kontrolle verwendet.
TABELLE 1
Anschließend wurde eine Western Blot Analyse durchgeführt. Drei verschiedene Reaktivitätsprofile wurden unterschieden unter Verwendung von Seren von unterschiedlichen HIV+ Individuen, wie es in 1 gezeigt ist. Das #14 HIV+ Serum erzeugte einige Banden in den p18, p24, gp41 und p55, p65 und pg160 Positionen, wenn sie mit den Überstehenden von 1F7 zur Reaktion gebracht wurden. #14 HIV+ Serum Antikörper wurden über 1F7-Immunoadsorbens wie vorstehend beschrieben gereinigt und ebenfalls über Western Blots analysiert. Die Antikörper, die über 1F7-Immunoadsorbens gereinigt wurden, zeigten Bindungsmuster, die sehr ähnlich denjenigen sind, die von diesem Serum mit 1F7 produziert wurden. Das Serum und 1F7, das von einem #3 HIV+ Serum gereinigt wurde, zeigten Banden ausschließlich in der p2- und p55-Region. #16 HIV+ Serum zeigte keine Banden. Alle drei HIV+ Seren erzeugten Bänder mit multiplen HIV-1-Antigenen, wenn Nitrocellulosestreifen mit alkalischer Phosphatase konjugierter Ziegen-antimenschliche IgG entwickelt wurden. Die 1 zeigt wie folgt: Spur 1: HIV+ Patient #14 Serum, entwickelt mit Ziegen-Antimaus IgG; Spur 2: HIV+ Patient #14 Serum, inkubiert mit 1F7 und entwickelt mit Ziegen-Antimaus IgM; Spur 3: 5 μg von 1F7 affinitätsgereinigten Antikörper vom Patienten #14, entwickelt mit Ziegen-antimenschlichem IgG. Spur 4: HIV+ Patient #3 Serum, entwickelt mit Ziegen-antimenschlichem IgG; Spur 5: HIV+ Patient #3 Serum, inkubiert mit 1F7 und mit Ziegen-Antimaus IgM entwickelt; Spur 6: 5 μg von 1F7 affinitätsgereinigtem Antikörper vom Patienten #3, entwickelt über Ziegen-Antimaus IgG. Spur 7: HIV+ Patient #16 Serum, entwickelt mit Ziegen-antimenschlichem IgG; Spur 8: HIV+ Patient #16 Serum, inkubiert mit 1F7 und entwickelt mit Ziegen-Antimaus IgM; Spur 9: HIV-negatives Kontrollserum, entwickelt mit Ziegen-antimenschlichem IgG; Spur 10: HIV-positives Kontrollserum, entwickelt mit Ziegen-antimenschlichem IgG. Alle menschlichen Seren wurden auf 1 : 100 verdünnt.
Da die in 1 gezeigte Western Blot Analyse das Binden von 1F7 an Antikern und Anti-Hüllantikörper von #14 HIV+ Serum zeigte, wurden diese Antikörper aus #14 HIV+ Serum über 1F7-Immunoadsorbenzien wie vorstehend beschrieben gereinigt. Das adsorbierte Material auf der Säule wurde mit Säure eluiert, um 1F7 Id+ Material zu ergeben. Das eluierte Material wurde einkonzentriert und auf die Bindung an p24 und gp120 in einem ELISA-Test wie vorstehend beschrieben getestet. In 2a ist die Bindung von 1F7 Id+ Antikörpern an unlösliches gp120 gezeigt. Als Kontrolle wurde #14 HIV+ Serum auf einen nicht verbundenen Anti-ID, F6 adsorbiert. Die Bindung an unlösliches gp120 ist in 2b gezeigt. In 2c bindet eluiertes Ig aus der p24-Affinitätssäule stark an unlösliches 1F7. Der Durchfluss aus der p24-Säule wurde adsorbiert und von einer chimärischen Antigen-p24/gp41-Affinitätssäule eluiert. Nur restliche Bindung von Anti-gp41-Antikörpern an 1F7-beschichtete Plättchen wurden erhalten, was anzeigt, dass die Mehrzahl der 1F7 Id+ Antikörper in diesem Serum p24 spezifisch sind. Als Kontrolle wurden die Anti-PC-Antikörper, die aus HIV+ Serum an 1F7 gereinigt wurden, verwendet, wie es in 2c gezeigt ist. Um die Resultate, die in 2 gezeigt sind, zu erhalten, wurden Mikrotiterplättchen mit 200 ng/Vertiefung mit gp120 oder p24 beschichtet und anschließend mit menschlichen Antikörpern, die über 1F7- oder F6-Immunoadsorbensmitteln gereinigt wurden, inkubiert. 2c zeigt die Bindung von 1F7 an menschliche Antikörper verschiedenen Spezifitäten. 1F7-beschichtete Plättchen wurden mit menschlichen Antikörpern, die über eine HIV-Antigen oder PC-Affinitätssäule gereinigt wurden inkubiert. Die an 1F7 gebundenen Antikörper wurden mit biotinylierten 1F7 wie vorstehend beschrieben nachgewiesen. Alle menschlichen Antikörper wurden aus #14 HIV+ Serum gereinigt.
4 zeigt die Wechselwirkung von 1F7 Id+ Antikörpern mit gp120 und p24 und zeigte, dass diese Wechselwirkung durch die Zugabe von 1F7 inhibiert werden kann. Die Plättchen wurden mit entweder gp120 oder p24 beschichtet. 1F7 Id+ Antikörper wurden zusammen mit Verdünnungen von 1F7 oder einem Kontrollmaus IgM monoklonalen Antikörper, 3Cl, wie vorstehend beschrieben zugegeben. 3a zeigt die Inhibierung der Bindung von 1F7 Id+ Antikörpern an gp120 und 3b zeigt die Inhibierung der Bindung an p24.
BEISPIEL II
Klonotypische Analyse von menschlichen HIV+ und HIV– Seren
Gemäß dem Western Blot der in 1 wie vorstehend beschrieben ist, wurden drei 1F7-Reaktivitätsmuster mit HIV+ Seren beobachtet. In einer Gruppe, die durch das #14 HIV+ Serum dargestellt wird, reagiert der 1F7 mit Antikörpern zu mehr als einem HIV-Antigen. In der zweiten Gruppe, dargestellt durch #3 HIV+ Serum zeigte 1F7 nur eine Reaktivität mit dem Antikern (p24) Antikörper. Das Serum aus der dritten Gruppe zeigte keine 1F7-positive Anti-HIV-Antikörper. Zusammengefasst, unter 15 HIV+ Seren, zeigten 5 Anti-p24- und Anti-gp120-Antikörper. Bei zwei Seren waren nur Anti-p24-Antikörper 1F7 reaktiv und in weiteren zwei Seren waren Anti-gp120-Antikörper 177 positiv.
Die verbleibenden sechs HIV+ Seren sind auf 1F7 negativ. Diese Daten zeigen an, dass es nicht ungewöhnlich für den 1F7 Id Klonotyp ist, von verschiedenen Antigen-spezifischen Antikörpern geteilt zu werden.
Um weiter die Dominanz des Idiotops, das verschiedene Anti-HIV-1-Antikörper miteinander teilen zu verfolgen, wurde eine HIV-1-Antigenfänger ELISA wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet, um die Expression von 1F7 Id auf verschiedene Anti-HIV-1-Antigene in Seren von 40 HIV-1+ Individuen nachzuweisen. Dieses Verfahren ist bei Wang et al., Eur. J. Immunol. 22 1749 (1992) beschrieben.
Mikrotiterplättchen wurden mit p24, gp120 (IIIB oder SF2), RT und Tetanustoxoid (verwendet als Kontrolle, erhältlich von Pharmacia) beschichtet, wobei alle 200 ng/Vertiefung verwendet wurden und anschließend mit 2% BSA blockiert. HIV-1+ Seren, die auf 1 : 100 mit PBS verdünnt waren, wurden zugegeben und für zwei Stunden inkubiert. Nach dem Waschen der Plättchen wurden diese mit 1 : 5000 verdünnter Peroxidase konjugierter Ziegen-Antimaus IgG für 1,5 Stunden inkubiert. Gebundene Antikörper wurden unter Verwendung von OPD (o-Phenylendiamin) bei 490 nm sichtbar gemacht. Der ELISA für 1F7 Id war ähnlich. Nach Inkubierung mit HIV-1+ Seren (1 : 100) mit Plättchen, die mit HIV-1-Antigenen und Tetanustoxid beschichtet waren, 100 ng/Vertiefung von 1F7 wurden zugegeben und für weitere 2 Stunden inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Plättchen mit 1 : 2000 Peroxidase konjugierten Ziegen-Antimaus IgM für 1,5 Stunden inkubiert. Das nachfolgende Verfahren war das gleiche wie vorstehend.
Wie bei 40 HIV-1+ Seren gezeigt wurde, 9 (22,5%) zeigen Anti-p24-, Anti-gp120 und Anti-RT-Antikörper, wobei alle 1F7+ sind. Bei 3 (7,5%) Seren, wurden zwei von drei Arten von Anti-HIV-1-Antikörpern als 1F7 Id+ identifiziert und in 11 davon (27,5%) der Seren wurde nur eine Art von Antikörper als 1F7+ identifiziert. Insgesamt weisen wenigstens 57,5% der HIV-1+ Seren eine Art eines Anti-HIV-1-Antikörpers auf, der 1F7 Id exprimiert. Diese Daten bestätigen, dass es für den 1F7 Id Klonotyp üblich ist, von verschiedenen Anti-HIV-1-Antikörpern geteilt zu werden, die vom gleichen Individuum produziert werden.
TABELLE 2
BEISPIEL III
NACHWEIS, DASS ANTI-HIV-ANTIKÖRPERANTWORTEN BEI HIV+ INDIVIDUEN VON EINEM BESCHRÄNKTEN KLONALEN URSPRUNG STAMMEN
A. BESTIMMUNG DER KLONALEN RESTRIKTION VON B-ZELLKLONEN ÜBER KAPPA/LAMBDA-LEICHTKETTENANALYSE
1. Verfahren
Die Reinigung der menschlichen Serum-Antikörper wurde durchgeführt, indem rekombinantes p24 (HIV-1 IIIB) (Pharmacia Genetic Engineering, La Jolla, CA) und rekombinantes gp120 (SF-2) (Chiron Corporation, Emeryville, CA) an CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia LKB, Biotechnology AB, Uppsala, Schweden) gekoppelt wurde. Gemäß dem Hersteller wurde IgG aus HIV+ Seren (North American Biological, Inc., Miami, FL) über Protein G Sepharose gereinigt. Die Ig-Fraktion wurde über Affinitätssäulen bei 5 ml/Stunde durchgeführt. Nach dem Waschen wurden die Säulen eluiert unter Verwendung eines 0,1 M Glycinpuffers (pH 2,5) mit 0,01 M PBS (pH 7,0). Die Antikörper wurden dialysiert und für die weitere Verwendung einkonzentriert.
Der Nachweis der Antikörper-Leichtkettenisotypen in normalen (San Diego Regional Blood Bank, San Diego, CA) und unfraktionierten HIV+ menschlichen Seren (North American Biological, Inc., Miami, FL) wurde durchgeführt, indem Mikrotiterplättchen mit Ziegen-antimenschlichen IgG (TAGO, Inc. Burlingame, CA) mit 100 μl/Vertiefung bei 1 μg/ml in 0,05 M Hydrogencarbonatpuffer (pH 9,6) über Nacht bei 4°C beschichtet wurden und mit 2% BSA für drei Stunden bei Raumtemperatur blockiert wurden. Das Serum wurde mit 1 : 20000 in 0,01 M PBS, enthaltend 0,1% Tween-20 (PBS-T) verdünnt und für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-T wurden 100 μl von Peroxidase konjugierten Ziegen-Antimaus Kappa- oder Lambda-Antikörper (TAGO, Inc., Burlingame, CA) verdünnt auf 1 : 4000 und 1 : 3500 zugegeben und für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurden gebundene Antikörper unter Verwendung von O-Phenylendiamin (OPD) (Sigma Chemical, St. Louis) sichtbar gemacht und die Reaktion wurde mit 3N H₂SO₄ abgebrochen. Die optische Dichte (OD) wurde bei einer Absorbanz bei 490 nm (Molecular Devices Corporation, Menlo Park, CA) ausgelesen. Das Kappa/Lambda-Verhältnis wurde gemäß der Gleichung: Verhältnis = OD des Kappa/OD des Lambda berechnet.
Der Nachweis der Antikörper-Leichtkettenisotypen von gereinigten Anti-HIV-Antikörpern wurde durchgeführt, indem Mikrotiterplättchen mit 5 μg, 2 μg oder 1 μg von rekombinanten gp120 (SF-2), g120 (IIIB), p24 oder RT (IIIB) in 0,05 M Hydrogencarbonatpufter (pH 9,6) über Nacht bei 4°C beschichtet wurden und anschließend mit 2% BSA über drei Stunden bei Raumtemperatur blockiert wurden. Menschliche Seren, die auf 1 : 1000 in PBS-T verdünnt waren, wurden zugegeben und für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Die nachfolgenden Verfahren waren die gleichen wie vorstehend beschrieben.
Der Nachweis der Leichtkettenisotypen von Anti-id1F7 wurde durchgeführt, indem Mikrotiterplättchen mit 100 μl/Vertiefung von 5 μl/ml von 1F7-Hydrogencarbonatpuffer über Nacht bei 4°C beschichtet wurden und anschließend mit 2% BSA für drei Stunden bei Raumtemperatur blockiert wurden. 100 μl verdünnte menschliche Seren oder menschliche Antikörper, die über HIV-1-Antigen-Affinitätschromatographie gereinigt wurden, wurden zugegeben und für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die nachfolgenden Schritte sind die gleichen wie vorstehend beschrieben.
2. Resultate
In menschlichen Seren bestehend polyklonale Immunoglobine gewöhnlicherweise auf in etwa gleichen Mengen von Kappa und Lambda leichten Ketten. Das überhöhte Vorkommen von entweder des leichten Kettenisotyps ist charakteristisch für monoklonale oder oligoklonale Antikörperpopulationen. Vierzig zufällig ausgewählte Seren von HIV-1 infizierten Individuen und vierzig normale Seren wurden über ELISA auf die Bindung an den leichten Kettenisotypus spezifisches Antiserum wie vorstehend beschrieben getestet. Wenn das Kappa/Lambda-Verhältnis berechnet wurde, zeigte keines der nicht fraktionierten HIV+ Seren den Nachweis einer monoklonalen Gammopathie.
Die gleiche Kappa/Lambda-Verhältnisanalyse wurde anschließend mit Antikörpern durchgeführt, die von Seren von vierzig verschiedenen seropositiven Individuen, die spezifisch auf vier verschiedene HIV-1-Antigene sind, durchgeführt. Die Antikörper auf p24 (IIIB), gp120 (2SF), gp120 (IIIB) und RT (IIIB) wurden über die entsprechenden unlöslichen Antigene gefangen. Im Gegensatz zur äquivalenten Leichtkettenisotypendarstellung im gesamten Ig, zeigten diese entweder vorzugsweise Kappa- oder Lambda-Verwendung wie es in 5 dargestellt ist. 5 zeigt das Kappa/Lambda-Verhältnis für jeden Patienten und wurde wie vorstehend beschrieben berechnet und auf die y-Achse aufgetragen. 90% der HIV+ Seren hatten ein verändertes Kappa/Lambda-Verhältnis, und zeigten damit, dass oligoklonale oder monoklonale Anti-HIV-Antikörper üblicherweise in den Seren von HIV+ Individuen vorkommen.
Nachfolgend wurden die Plättchen mit dem 1F7-Antikörper belegt und Seren von HIV+ Individuen wurden zugegeben und mit entweder Anti-Kappa- oder Anti-Lambda-Serum reagieren gelassen. Kappa und Lamba leichte Isotypen wurden beide auf 1F7 gefangenen Antikörpern nachgewiesen. Um zu testen, ob 1F7 mit beschränkten Anti-HIV-Antikörpern assoziiert ist, wurden Anti-p24-Antikörper von verschiedenen Seren über Affinitätschromatographie wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt. Beide gereinigte Antikörper wurden anschließend ermöglicht, an p24 und 1F7 belegte Plättchen zu binden und das Verhältnis von Kappa zu Lambda wurde berechnet. Wie in 6a gezeigt ist, wurde gefunden, dass eine zehnfach höhere Kappa-Reaktivität als Lambda-Reaktivität besteht, wenn sie auf p24- Plättchen getestet wurden. Die Kappa/Lambda-Verhältnisse waren deutlich weniger unterschied lich, wenn sie auf 1F7 belegten Plättchen durchgeführt wurden. Dies wurde ebenfalls in der 6b gezeigt, unter Verwendung von Seren eines zweiten HIV+ Individuums. Insgesamt zeigten diese Daten, dass die Anti-p24-Antworten aus zwei ANtikörper-Populationen bestehen: die eine davon ist klonmäßig beschränkt und die andere ist polyklonal.
B. BESTIMMUNG DER KLONALEN BESCHRÄNKUNG VON B-ZELLKLONEN ÜBER ISOELEKTRISCHE KONZENTRATION
1. Verfahren
Die isoelektrische Konzentration wurde durchgeführt unter Verwendung von vorgefertigten pH 3–10 Gelen gemäß den Anweisungen des Herstellers (Novex, Novel Experimental Technology, San Diego, CA). Das Novex-System verwendete einen Kathodenpuffer, der zusammengesetzt ist aus 0,29% (w/v) Arginin und 0,35% (w/v) Lysin, wohingegen der Anodenpuffer aus 0,47% (w/v) Phosphorsäure (85%) besteht. Anti-p24 und gp120 (SF-2) Antikörper, die durch Affinitätschromatographie gereinigt wurden, wurden auf eine Endproteinkonzentration von 200 μg/ml eingestellt mit Probenpuffern, die von Novex geliefert wurden, davon wurden 20 μl auf das Gel aufgetragen. Das Novex-Modell 3540 Spannungsversorger wurde programmiert, um drei Phasen konstanter Spannung (d. h. 100 V für eine Stunde, gefolgt von 200 V für eine Stunde und schließlich 500 V für dreißig Minuten) zu erzeugen. Die gesamte Laufzeit betrug 2,5 Stunden. Der Strom pro Gel wurde auf ein Maximum von 8 mA eingestellt. Die Visualisierung der isoelektrischen konzentrationsgetrennten Proteine erfolgte über Silberfärbung (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).
2. Verfahren
Um weiterhin den beschränkten Charakter der Anti-HIV-Antikörperantworten zu zeigen, wurden die Anti-p24 und Anti-gp120-Antikörper mit eingeschränkten Leichtkettenisotypen über Affinitätschromatographie gereinigt und isoelektrischem Fokussieren ausgesetzt. Wie in 7 gezeigt ist, zeigen Anti-p24- und Anti-gp120-Antikörper IEF-Banden, die typisch für oligoklonale oder monoklonale Antikörper sind. Die Anti-p24-Antikörper enthalten zwei IEF beschränkte Bandencluster, den einen beim pH von 8,5 bis 9,6 und den anderen beim pH von 7,2 bis 7,4. Der Anti-gp120-Antikörper zeigt ein Cluster beim pH von 7,0 bis 7,5.
C. DIE BESTIMMUNG DER KLONALEN BESCHRÄNKUNG VON B-ZELLKLONEN ÜBER IMMUNOBLOT-ANALYSE DER VARIABLEN REGIONSVERSCHIEDENHEIT
1. Verfahren zur Identifizierung V_K und V_H
Immunodominante Teile der ersten Skelettregion von Ig Schwer- und Leichtketten wurden verwendet zur Erzeugung von Anti-Peptid-Antiseren, die für die V_K und V_H Genfamilien spezifisch sind, gemäß den Verfahren von Silverman et al., (Arthritis and Rheumatology 33, 1347 (1990), Journal of Immunological Methods 95, 249 (1986), Journal of Clinical Investigations 88, 911 (1991)).
Es wurden ebenso Antiseren verwendet, die die Sequenzen der ersten Domänen von Schwer- und Leichtketten konstanten Regionen identifizieren.
Kurz gesagt wurden Peptide über ihre Carboxyl-endständigen Cysteine an den Träger konjugiert, Schlüsselloch-Limpethemocyanin vor der Immunisierung der Kaninchen. Um die Bindungsspezifität der peptidinduzierten Reagenzien zu zeigen, wurden Western Immunoblot Analysen mit 4 μg/Spur mit Ig-Protein durchgeführt.
2. Verfahren
Die Antigenkörper wurden affinitätsgereinigt auf p24 und gp120 Immunoadsorbenssäulen und dazu verwendet, um ihre variable Regionsexprimierung zu analyiseren. Die Kappa/Lambda-Analyse wurde an den Serenn, die für die Reinigung verwendet wurden, durchgeführt, die von vier HIV+ Patienten genommen wurden und als 3-P14, 3-P49, P14 und P15 identifiziert wurden. Die Ig-Ketten wurden elektrophoretisch getrennt, bevor sie auf die Membranen überführt wurden, die anschließend mit Anti-Peptidantikörpern, die auf Ig konstanten oder variabler Regionssequenz spezifisch waren. Für jeden Patienten wurde die gesamte nichtfraktionierte Ig mit dem affinitätsgereinigten Antikörpern auf HIV-1 gp120 und p24 verglichen, und diese mit den monoklonalen IgM-Protein KAS (V_H1 – V_K3) und HER (V_H3 – V_K3), die als Kontrolle für die Subgruppenspezifität dienen. Die Replikatpanels wurden mit einem Antiserum, das für die ersten Rahmensequenzen spezifisch ist, die für die vier V_K-Familien spezifisch sind und die hauptsählichen V_H-Familien, V_H1, V_H4 und V_H3. Diese Familien stellen die überwiegende Mehrheit der zirkulierenden Ig und B-Zellen bei normalen Erwachsenen gemäß Berman et al., Embo. J. 7, 727 (1988), Logtenberg et al. Int. Immunol. 1, 362 (1989), Guigou et al. Mol. Immunol. 27, 935 (1990) und Zouali et al J. Immunol. 146, 2855 (1991) dar. Das Antiserum auf die Ig konstanten Region (C_H, C_K und C_λ) werden als Kontrollen verwendet. Immunoblots zeigen, dass nichtfraktioniertes IgG aus normalen Kontrollen und den vier HIV-1 infizierten Individuen Subpopulationen von all dieser V-Region Familien enthält. Im Gegensatz dazu sind die Anti-p24-Antikörper an V_H3, das aus den H-Ketten abgeleitet ist und auf VH1 abgeleitete H-Ketten angereichert ist, verarmt.
Nur ein Individuum (3-P49) wie ebenfalls eine Anreicherung von Anti-p24-Antikörpern der VH4-Familie auf. Anti-gp120-Antikörper wurden ebenfalls bei drei dieser Individuen studiert (3-P14, 3-P49, P14). Eines dieser Individuen (p14) zeigte ebenfalls eine Anreicherung bei V_H1-abgeleiteten H-Ketten und verarmte an V_H4- und V_H3-Ketten, während ein zweites Individuum (3-P14) gefunden wurde, das das Anti-gp120-Antikörper mit einer Anreicherung von V_H1 und V_H4 H-Ketten aufwiest, mit einer Verarmung an V_H3 abgeleiteten H-Ketten. Der Patient 3-P49 hatte ebenfalls V_H3-Verarmung bei Anti-gp120-Antikörpern. Die Analyse der L-Ketten zeigte, dass sowohl Lambda- und Kappa-L-Ketten verwendet wurden, es wurde jedoch kein konsistentes Muster von V_K-Familienverwendung nachgewiesen. Die beeinflusste Leichtkettenisotypenexpression von Anti-p24-Antikörpern aus vier ausgewählten Seren wurde über Western Blots bestätigt, wie die V_K-Familien, die auf Antiseren spezifisch ist, verwenden. Drei von vier Antikörpern zeigten eine Anreicherung für V_KII und Verarmung in ihrer Lambda-Aktivität. Die Daten über die V-Genfamilienverwendung und Isotypenexprimierung sind in den TABELLEN 3 und 4 zusammengestellt. Die Kappa/Lambda- und 1F7Verhältnisse werden über ELISA bestimmt, wie es im vorstehenden Beispiel 1 beschrieben wurde. Die 1F7-Bindung wird über Ziegen-Antimaus IgM-HRPO bestimmt und das Substrat und O.D. bei 490 nm gemessen. Untergruppenanalyse wurde mit replizierten Immunoblots von isolierten H- und L-Ketten durchgeführt, unter Verwendung der variablen Regionsfamilien spezifischen, Antipeptid-Antikörpern wie vorstehend beschrieben. Die relative Beladung von H-Ketten und L- Ketten wurde mit Antiseren auf Gamma und Ck Konstantregiondeterminanten gezeigt.
Die Ergebnisse, die in den TABELLEN 3 und 4 gezeigt sind, zeigen eine klonale Restriktion bei Anti-HIV-Antikörpern und sind in Übereinstimmung mit den Resultaten, die über IEF auf gereinigten Anti-p24- und Anti-gp120-Antikörpern erhalten wurden. TABELLE 3 Immunoblot VH-Reaktivität von affinitätsgereinigten Anti-HIV-Anitkörpern

N.D.: Nicht durchgeführt
+, ++, +++, ++++,: zeigt die relative Bandintensität
–: zeigt an, dass es nicht nachgewiesen wurde

TABELLE 4 Immunoblot VL-Reaktivität von affinitätsgereinigten Anti-HIV-Antikörpern
Insgesamt zeigen die Daten auf der leichten Isotypexpression, IEF und V-Genverwendung und zeigen einen starken Nachweis, dass der Anti-HIV-Antikörper bei seropositiven Individuen antwortet, von einem beschränkten klonalen Ursprung ist.
BEISPIEL IV
Die Korrelation der Gegenwart von IF7-Idiotopen mit verschiedenen HIV-bezogenen Fehlfunktionen
Ein Vergleich der Expression des IF7-Idiotops in den Seren verschiedener HIV-infizierter und nichtinfizierter Patienten wurde durchgeführt. Die Menge an zirkulierendem IF7-positiven Immunoglobulin wurde bei den folgenden Gruppen gemessen: serumpositive Lymphoma-Patienten, asymptomatische seropositive Individuen, symptomatische seropositive Patienten (ARC und AIDS) und seronegative Individuen umfassend seronegative Lymphoma-Patienten.
A. MATERIAL UND VERFAHREN
1. Seren
Seren von Lymphoma-Patienten ohne HIV-1-Infektion wurden von San Diego Region Cancer Center zur Verfügung gestellt. Seren von HIV-1 viral infizierten Patienten, AIDS, ARC und HIV-1 einhergehenden Lymphomen wurden der AIDS-Studiengruppe des San Francisco General Hospital zur Verfügung gestellt. HIV-seronegative und seropositive Seren wurden bei der lokalen Blutbank erworben.
2. Produktion von Maus monoklonalen anti-idiotygischen Antikörper 1F7
Gesplicte Zellen von BALB/c Mäusen, die mit menschlichen polyklonalen Anti-HIV-1-IgG immunisiert wurden, wurden mit Sp2/0-Zellen gemäß den Standardprotokollen wie in Beispiel 1 vorstehend beschrieben, fusioniert. Die Antikörper, die an HIVIG binden, wurden unter Verwendung von p24 und gp120 (IIIB) Fänger ELISA nachgewiesen. Ein Hybridoma (1F7, IgM), das an Antikörper bindet, die von HIV-1-Antigenen gefangen wurden, jedoch nicht an IVIG und IVIG, die von Nicht-HIV-Antigenen gefangen wurden bindet, wurde subkloniert und als Ascites in BALB/c Mäusen kultiviert. Die Ascitesflüssigkeit wurde über Ziegen-Antimaus IgM Sepharose 4B Säule gereinigt (Pharmacia, LKB, Biotechnology, AB, Uppsala, Schweden).
3. ELISA zum Nachweis von 1F7 an humanen IgG und IgM
Mikrotiterplättchen wurden mit 100 ng/Vertiefung Ziegen-Antimaus IgM bei 4°C über Nacht beladen und mit 2% BSA blockiert. Es wurde 100 ng 1F7 in jede Vertiefung zugegeben und bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Nach dem Waschen wurde auf 1 : 1000 verdünnte HIV-1+ oder HIV-1– menschliche Seren in jede Vertiefung zugegeben und für weitere 2 Stunden inkubiert. Anschließend wurden entweder Peroxidase konjugierte Ziegen-Antimaus IgG (1 : 6000, Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) oder Peroxidase konjugierte Ziegen-antihumanes IgM (1 : 1000) über 1,5 Stunden zugegeben. Gebundene 1F7+ Antikörper wurden unter Verwendung von O-Phenylendiamin OPD (Sigma Chemical, St. Louis, MO) sichtbar gemacht und die Reaktion wurde mit 3 N H₂SO₄ abgebrochen. Die Absorbanz wurde spektrophotometrisch bei 490 nm ausgelesen (Molecular Devices Corporation, Menlo Park, CA).
4. Statistische Methoden
Es wurde eine statistische Analyse zur Berechnung der Signifikanz von Unterschieden zwischen den Gruppen durchgeführt, unter Verwendung eines t-Tests für nicht-gepaarte Variablen. Zur Berechnung der Vorhersagewerte, Sensitivität und Spezifität wurde der Newman-Keuls Multiple Comparison Test verwendet.
B. ERGEBNISSE
Die Exprimierung des 1F7-Idiotops in Seren aus HIV-infizierten und nichtinfizierten Patienten ist nachfolgend in TABELLE 5 gezeigt. Die Daten sind angegeben als der Durchschnitt des Logarithmus der optischen Dichte bei 490 nm × 1000, zusammen mit den berechneten Standardabweichungen in jeder Patientengruppe. Es ist ersichtlich, dass die höchste Korrelation bei HIV+ einhergehenden Lymphom auftritt.
TABELLE 5 EXREPSSION VON 1F7-IDOTOP AUF IgG UND IgM IN HIV-1+ und HIV-1– Seren
Es ist ersichtlich, dass die höchste Korrelation für die Expression von 1F7 von HIV+ Lymphomen erhalten wird.
Es wurde daher eine statistische Analyse der 1F7+ Idiotopexpression in Seren von Patienten mit HIV-1 einhergehenden Lymphomen durchgeführt. 1F7- Idiotopexpression bei HIV-1 einhergehenden Lyphom wurde allen andern HIV+ Gruppen (gepoolt) durchgeführt. Dies kann in der nachstehenden TABELLE 6 gesehen werden. 1F7-Idiotopexpression auf IgG-Antikörper ist hochspezifisch (95%) und hochempfindlich (90%) bei Patienten mit HIV einhergehenden Lymphomen. Die positiven Vorhersagewerte für Lymphomen bei HIV-1-infizierten Individuen würden zu 0,755 berechnet.
TABELLE 6 VORHERGESAGER WERT, EMPFINDLICHKEIT UND SPEZIFITÄT DER 1F7 ID EXPRESSION IN MIT HIV-1 EINERGEHENDEN LYMPHOMEN
In dem vorstehend beschriebenen Überblick und wie es in Tabelle 6 gezeigt wird, besteht ein starker Hinweis darauf, dass das beschriebene HIV-1 assoziierte Idiotop 1F7 als Marker für HIV-1 einhergehende B-Zelllymphome dient. 93% der HIV-1-infizierten Patienten mit Lymphomen, die auf 1F7-Expression positiv getestet wurden. Signifikant geringere Gehalte an 1F7 Idiotop wurden bei HIV-1 infizierten Patienten ohne Lymphome nachgewiesen.
Gemäß den berechneten statistischen Parametern, wie sie in TABELLE 2 gezeigt sind, können hohe Gehalte an 1F7 Id Expression mit AIDS zusammenhängende Lymphome bei 75% aller Fälle vorhersagen. Dies lässt stark vermuten, dass das 1F7-Idiotop als Krankheitsmarker verwendet werden kann.
BEISPIEL V
1F7-EINFLUSS AUF DIE T-ZELLVERMITTELTE ZYTOTOXIZITÄT
A. MATERIALIEN UND VERFAHREN
1. 1F7-Stimulation auf PBML-Zellkultur
Blut von 20 HIV seropositiven Sendern wurden von der University of California San Francisco Hospital von Michael McGrath erhalten. Das Blut von 8 HIV seronegativen Spendern wurde von Labormitarbeitern gesammelt. Das ganze Blut von Spendern wurde in xxxxx Tuben gesammelt, zusammen.... verhindert über eine Behandlung mit Citrat gemäß aus dem Stand der Technik bekannter Methoden. Das Plasma wurde nach Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit gesammelt und in gefrorenem Zustand aufbewahrt, bis die Anti-1F7-Gehalte getestet wurden. Periphere blutmononukleare Lymphozyten (PBML) wurden aus dem ganzen Blut durch Zentrifugation auf "Lymphoprep" (Nycomed, Norwegen) isoliert, gemäß den Vorschlägen des herstellers. PBMLs wurden von dem Oberteil des Hypaken Kissens gesammelt und vom menschlichen Serum durch wiederholte Umdrehungen im "Grwoth Medium" (RPMI-1640 plus 10% (v/v) fötales Kalbserum (Hyclone, USA) umfassend 1 mM L-Glutamin, 1 mM Natrium-Pyrovat, 1/100 nichtessentielle Aminosäuren (alle von GIBCO), 50 mM HEPES (SIGMA), pH 7,4) gewaschen. Die Zellen wurden bei einer Konzentration von von 2,5 × 10⁶/ml für 2 ml/Vertiefung eines 24-Vertiefungsgewebekulturplättchen (Costar) gegeben. Die Zellen wurden in Wachstumsmedium in Gegenwart von 5 μg/ml Maus IgM Antikörper sowohl MOPC-104E (Kontrolle) oder 1F7 (spezifisch) kultiviert. Die Zellen wurden nach der Kultivierung für 1, 3, 7 oder 10 Tage zur Bestimmung der Apoptosegehalte gesammelt.
2. CD4⁺ und CD8⁺ Verarmung
CD4⁺ oder CD8+ zellfreie Fraktionen wurden über negative Selektion der PBMLs von HIV seropositiven Spendern erzeugt. Diese Spender wurden willkürlich unter den Spendern mit CD4⁺ Zellzählungen von über 500 ausgewählt. Magnetische Kügelchen, die kommerziell als Dynabeads (DYNAL) erhältlich sind und die mit sowohl entweder Anti-CD4-Antikörpern oder Anti-CD8-Antikörpern markiert sind, wurden mit PBMLs mit einem Verhältnis 3 : 1 inkubiert, die Kügelchen an Zielzellen bei 4°C für 30 Minuten unter leichtem Rotieren und am Ende gebunden. Die Kügelchen und die Zellen, die an die Kügelchen gebunden wurden, wurden durch Anziehungskräfte an einen starken Magnet gemäß den Vorschriften und Vorschlägen des Herstellers isoliert. Die verbleibenden Zellen wurden gesammelt. Der Erfolg der Extraktion wurde über Flusszytometrieanalyse der verbleibenden Population bestimmt. Die Extraktion war immer besser als 95%. Diese Population wurde anschließend kultiviert und einer Apoptosebestimmung unterzogen.
3. Doppelfärung mit FITC und PI
Die Zellen wurden aus der Kultur geerntet und mit Fluorescein (FITC) konjugierten Antikörpern an CD4 und CD8 (Gentrak, Plymouth Meeting, PA) gefärbt. FITC-konjugierte Murinisotypen (Gentrak) wurde als Färbekontrolle verwendet. Nach dem Färben wurden die Zellen in Proidiumiodid (20 μg/ml in 0,112% Natriumcitrat) resuspendiert (Sigma, St. Louis, MO) und für 30 Minuten bei Raumtemperatur vor der Zytometrieanalyse inkubiert.
Flusszytometrieanalyse wurde mittels eines FACScan (Becton, Dickinson, San Jose, CA) durchgeführt. Zwei Parameterzytogramme von roter Fluoreszenz (DNA Gehalt) gegen grüner Fluoreszenz (FITC) wurden erzeugt, um den Prozentsatz für die Zellen, die CD4 oder CDS positiv sind, zu bestimmen.
4. Quantifizierung des DNA-Abbaus (Apoptose) durch Propidiumiodid (PI)
Die Zellen wurden aus der Kultur geerntet und mit 70% ETOH für ein Minimum von 3 Stunden fixiert. Nach 2 Waschgängen wurden die Zellen in PI (50 μg/ml PI, 180 U/ml Rnase in PBS) (Sigma, St. Louis, MO) resuspendiert und für 30 Minuten bei Raumtemperatur vor der Flusszytometrieanalyse inkubiert.
Flusszytometrie wurde mittels eines Epics I (Coulter Electronics, Hialeah, FL) unter Verwendung einer Doublet-Diskriminierung bei der Messung von DNA durchgeführt, gefolgt von einem MULTICYCLE (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA) Softwareprogramm. Der Prozentsatz der DNA links der G₀/G₁-Peaks wurde genommen, um die DNA darzustellen, die von der ursprünglichen 2N Menge als Resultat des apoptotischen Abbaus verloren wurde.
B. ERGEBNISSE
1. 1F7-induzierte Apoptose von PBMLs von HIV+ Spendern
Ein typisches Beispiel von PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) von einem HIV seropositiven Spender eine 1F7-induzierte Apoptose leiden, ist in 8 gezeigt (Panel B und D) nach einer in vitro Inkubierung von PBMC für 7 Tage. 8 ist ein Histogramm des DNA-Gehalts auf HIV- (Histogramm A und C) und HIV+ (Histogramm B und D) Spender. PBMC nach einer 7-tägigen Kultur mit entweder MsIgM (M104E) oder IF7. Die Daten wurden nach der Fixierung und dem Färben mit PI wie vorstehend beschrieben, erzeugt. Die Histogramme A und B zeigen keine Apoptose bei den PBMC des HIV- gesunden Kontrollspenders wie es über dem Gehalt an abgebauter DNA gemessen wurde. Der Beginn der 1F7-induzierten Apoptose in PBMC, erhältlich von diesen Patienten, konnte nach 24 Stunden beobachtet werden (9). Der Gehalt der spontanen Apoptose war verglichen mit der 1F7-induzierten Apoptose durch PBMCs von 20 verschiedenen HIV⁺ Spendern nach 7 Kulturtagen (siehe 10). 1F7 erhöhte signifikant den Gehalt der Apoptose bei 16 Spendern (> 3% Zunahme), wohingegen Zellen von 4 Spendern nicht befallen waren. Die Durchschnittszahl von spontanen zu 1F7-induzierten Zellen bei der Apoptose beträgt 19% und 32%. Die Apoptose von PBMLs von 8 HIV^– Spendern wurde durch 1F7 nicht beeinflusst. Es gab keine signifikante Korrelation zwischen Spontanapoptosegehalten und dem Ausmaß der 1F7-induzierten Apoptose.
2. 1F7-induzierte Apoptose bei PBMLs, die an CD4⁺ oder CD8⁺ Zellen verarmt sind
Um zu bestimmen, ob die beobachtete Apoptose, die mit 1F7 induziert wird, mit Zellen eines speziellen Phenotyps assoziiert ist, wurden PBMLs von einem HIV+ Spender in eine CD4^– Population und einer CD8^– Population über negative Selektion getrennt. Der Effekt von 1F7 auf diese Populationen wurde mit einer Herstellung von nicht separierten PBMLs des gleichen Spenders verglichen (siehe TABELLE 5). PBMLs von einem HIV seropositiven Spender wurden in drei Pools getrennt: einer verblieb vollständig, der zweite wurde an CD4^– Zellen verarmt und der dritte wurde an CD8+ Zellen verarmt. Nachfolgend wurde jeder Pool für 3 oder 7 Tage mit entweder 5 μg/ml eines Kontrollantikörpers, MOPC104E oder 5 μg/ml 1F7 kultiviert, wobei an diesem Punkt der Apoptosegrad über Flusszytometrie bestimmt wurde. Die nachstehende Tabelle 5 zeigt das 1F7 induziert ungefähr 6-fache Kontrollgehalte von Apop tose in der CD4^– Population sehr früh nach dem Beginn der Kultur. Dies ist im Gegensatz zu 1F7-induzierter Apoptose in der CD8^– Population, die weniger streng war und langsamer war (2,5 Zeitkontrollgrade).
TABELLE 5
Zusammengefasst wurde gefunden, dass die 1F7-Antikörper induzierte Apoptose bei 16 der 20 HIV⁺ Proben und bei keiner der HIV^– Kontrollproben auftritt. Apoptotische Zellen scheinen in den A0-Regionen mit DNA unterhalb derer der GO/G1-Zellen aufzutreten. Flusszytometrieanalyse und Lymphozyten-Subsetverarmungsexperimente zeigten, dass die Zellen, die einer Apoptose untertielen, ein T-Zellen-Subset von CD8+ Zellen waren.
Außerdem wurden weitere vorläufige Experimente durchgeführt und wie folgt zusammengefasst. Die Zugabe von 1F7 am Beginn einer Zellkultur reduzierte die T-Zellvermittelte Zytotoxizität bei IL-2 stimulierten PBMC-Kulturen um 50% wie über es über anti-CD3 vermittelte Lyse von P815-Zellen gemessen wurde. Die Inkubierung von CTL (zytotoxischen T-Lymphozyten), die von HIV+ Individuen erhalten wurden, mit 1F7 direkt vor einem Standard ⁵¹Cr Freisetzungsassay, reduzierte ebenfalls die Lyse spezifischer Targets.
Obwohl die Erfindung in Bezug auf die gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, versteht es sich von selbst, dass verschiedene Modifizierungen durchgeführt werden können ohne von der Erfindung wegzuführen. Dementsprechend ist die Erfindung nur durch die nachstehenden Ansprüche beschränkt.

Claims

In vitro Verfahren zum Nachweis eines HIV-bezogenen Lymphoms in einer Probe eines HIV-infizierten Individuums, welches das Nachweisen der Expression eines Idiotops auf den Immunglobulinen eines HIV-infizierten Individuums umfaßt, wobei das Idiotop durch einen anti-idiotypischen, monoklonalen Antikörper mit spezifischer Reaktivität für ein Idiotop, welches für mindestens drei Arten menschlicher anti-HIV-Antikörper verschiedener Spezifitäten gleich ist, erkannt wird, wobei das Idiotop dasjenige ist, welches durch den IF7-Antikörper erkannt wird.
Verwendung eines anti-idiotypischen, monoklonalen Antikörpers mit spezifischer Reaktivität für ein Idiotop, welches für mindestens drei Arten menschlicher anti-HIV-Antikörper verschiedener Spezifitäten gleich ist, zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung HIV-bezogener Krankheiten durch Wiederherstellen der Fähigkeit zur Oligo-Klonbildung in der Immunantwort auf die HIV-1-Infektion, wobei das Idiotop dasjenige ist, welches durch den IF7-Antikörper erkannt wird.
Verwendung eines anti-idiotypischen, monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 2 zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung HIV-bezogener Krankheiten durch Regulieren der Zusammensetzung der T-Zell-Lymphocyten in einem HIV+-Individuum.
Verwendung eines anti-idiotypischen, monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 2 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung HIV-verbundener Krankheiten durch Erhöhen der Apoptose in HIV+-Seren.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Zellen, welche Apoptose erfahren, CD8+-Zellen sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei der Antikörper 1F7 ist.