DE69726734T2 - Menschliche monoklonale antikörper gegen das hepatitis b oberflächenantigen - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Hybridomzelllinien, die menschliche Antikörper bilden, welche in der Lage sind, an das Oberflächenantigen des Hepatitis B Virus zu binden, Antikörper, die von den Zelllinien hergestellt werden und verschiedene Verwendungen derselben.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Infektion mit dem Hepatitis B Virus (HBV) ist weltweit ein schweres Gesundheitsproblem. Schätzungsweise 5% der Weltbevölkerung sind mit HBV infiziert und bei chronisch infizierten Patienten besteht ein hohes Risiko, dass sie eine Zirrhose und ein Leberzellkarzinom entwickeln (Crivelli, O., Hrg.: Progress in Hepatitis Research: Hepatitis B virus (HBV), Hepatitis C virus (HCV) and Hepatitis Delta virus (HDV), Sorin Biomedica, 1991).
  • Die Immunantwort auf HBV-codierte Antigene umfasst sowohl eine zelluläre Immunantwort, die bei der Eliminierung von HBV-infizierten Zellen aktiv ist, als auch eine humorale Antikörperantwort gegen virale Envelope-Antigene, die zur Beseitigung zirkulierender Viruspatikel beiträgt. Die entscheidende Ursache der viralen Persistenz während einer HBV-Infektion ist die Entstehung einer schwachen antiviralen Immunantwort.
  • Rekombinante HBV-Impfstoffe stellen ein sicheres und effektives Mittel zur aktiven Immunisierung gegen HBV bereit, obwohl sie nicht immer eine ausreichende und schnelle Antikörperantwort induzieren.
  • Interferon-α wurde bei der Behandlung der Hepatitis B-Infektion verwendet und zeigte eine Wirksamkeit von nur 30–40% bei sehr ausgewählten Patienten. Außerdem wurde gezeigt, dass die passive Immunisierung mit menschlichen polyclonalen anti-Hepatitis B Antiseren wirksam ist beim Verzögern und sogar Vorbeugen einer wiederkehrenden HBV-Infektion (Wright, T. L. & Lau, J. Y. N, Lancet (1993), 342: 1340–1344). Derartige menschliche polyclonale Antiseren werden aus gepooltem Plasma immunisierter Spender hergestellt. Diese Herstellungen sind sehr teuer und nur in relativ geringen Mengen erhältlich. Außerdem kann gepooltes Plasma kontaminierte Blutproben enthalten und deshalb erhöht die Behandlung mit derartigen Antiseren das Risiko der Patienten, sich andere virale Infektionen, wie Hepatitis C oder HIV, zuzuziehen.
  • Ein alternativer Ansatz zur Behandlung der HBV-Infektion ist die Verwendung monoclonaler Antikörper (MoAb).
  • Die PCT Patentanmeldung PCT/NL94/00102 offenbart menschliche monoclonale Antikörper gegen das Hepatitis B-Oberfächenantigen, die von den Hybridomzelllinien Mab 4-7B und Mab 9H9 sezerniert werden. Der von der Zelllinie Mab 4-7B sezernierte monoclonale Antikörper erkennt ein lineares Epitop des HBVsAg und unterscheidet sich von dem monoclonalen Mab 9H9 Antikörper, der ein strukturelles Epitop erkennt. Die Antikörper werden zur gleichzeitigen Verwendung bei der Behandlung chronischer Hepatitis B-Infektionen beansprucht.
  • Die PCT Patentanmeldung PCT/US92/09749 offenbart menschliche monoclonale Antikörper gegen HBVsAg, die von den Hybridomzelllinien PE1-1, ZM1-1, ZM1-2, MD3-4 und L03-3 sezerniert werden. Die Antikörper binden an verschiedene HBV Epitope und werden verwendet zum Verringern des Spiegels an zirkulierendem HBVsAg.
  • Die japanische Patentanmeldung JP 93066104 offenbart ein Hybridom aus einem menschlichen Lymphozytenzellstamm TAW-925 und einem menschlichen Lymphozyten, der mit dem Epstein-Barr Virus transformiert wurde. Das Hybridom bildet einen menschlichen monoclonalen Antikörper gegen HBVsAg.
  • Die US-Patentanmeldung Nr. 4,883,752 offenbart die Herstellung eines menschlichen monoclonalen Antikörpers gegen HBVsAg, durch Verabreichung von HBVsAg-Impfstoff an Menschen, Gewinnen von Lymphozyten, Stimulieren der Lymphozyten in vitro mit einem unspezifischen Stimulator, Fusionieren der Zellen mit einer Myelomzelle und Auswählen von Hybridomen, die Anti-HBVsAg-Antikörper sezernieren.
  • Ichimori et al., Biochim. Biophys. Res. Comm. (1985), 129 (1): 26–33, offenbart ein Hybridom, das menschliche monoclonale anti-HBVsAg-Antikörper sezerniert, die die a-Determinante von HBVsAg erkennen. Später offenbarte Ichimori et al., supra (1987), 142 (3): 805–812 ein anderes Hybridom, das stabil einen menschlichen monoclonalen Antikörper gegen HBVsAg sezerniert.
  • Die vorstehend erwähnten Antikörper wurden alle entwickelt durch in vitro-Immortalisation von Antikörper-bildenden Zellen aus Personen, die anti-HBV-Antikörper positiv waren.
  • Ein neuer Ansatz, der die adaptive Übertragung von menschlichen mononucleären Blutzellen („peripheral blood mononucleated cells", PBMC) in letal bestrahlte normale Mausstämme, die mit SCID („severe combined immune deficiency")-Knochenmark vor der Bestrahlung geschützt waren, ermöglicht, wurde kürzlich beschrieben (Lubin et al., Blood (1994), 83: 2368). Es wurde gezeigt, dass in derartigen Mensch/Maus-Chimären wirkungsvoll sekundäre humorale Antworten gegen verschiedene Erinnerungsantigene („recall antigens") sowie eine primäre Immunantwort gegen andere Antigene erzeugt werden können (Marcus et al., Blood (1995), 86: 398–406).
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass Hybridomzelllinien, die menschliche Antikörper sezernieren, die in der Lage sind, an das Hepatitis B Oberflächenantigen (HBVsAg) zu binden, erhalten werden können durch Verwendung der vorstehend erwähnten Mensch/Maus-Chimären. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden menschliche Blutlymphozyten („peripheral blood lymphocytes", PBL) von menschlichen Spendern die Anti-HBVsAg-Antikörper positiv sind, in normale Mausstämme, die letal bestrahlt und mit SCID-Knochenmark vor der Bestrahlung geschützt wurden, eingebracht. Nach der Immunisierung derartiger chimärer Mäuse mit HBVsAg werden menschliche Zellen aus den Milzen der Mäuse erhalten und in vitro mit Heteromyelomzellen fusioniert, um Hybridome zu erzeugen, die menschliche Antikörper mit hoher Affinität und Spezifität gegenüber HBVsAg sezernieren.
  • Die erfindungsgemäßen Antikörper werden erzeugt durch ein Verfahren zum Erhalten menschlicher monoclonaler Antikörper (hMoAb), die in der Lage sind, an das Hepatitis B Virus Oberflächenantigen (HBVsAg) zu binden, umfassend:
    • (a) Immunisieren eines chimären Nagers M4, der xenogene hämatopoetische Zellen aufweist, mit Hepatitis B Oberflächenantigen (HBVsAg), so dass im Nager xenogene Antikörper-bildende Zellen hergestellt werden, wobei der Nager M4 ein Nager M1 ist, dessen hämatopoetische Zellen im wesentlichen zerstört wurden und diesem Nager M1 wurden hämatopoetische Zellen aus einer Maus M2, die eine hämatopoetische Defizienz aufwies, und xenogene hämatopoetische Zellen aus einem Mensch M3 transplantiert;
    • (b) Entfernen und Immortalisieren dieser Antikörper-bildenden Zellen;
    • (c) Auswählen und Clonieren der immortalisierten Antikörper-bildenden Zellen, die die Antikörper bilden, die in der Lage sind an HBVsAg zu binden; und
    • (d) Isolieren der Antikörper, die von den ausgewählten, clonierten und immortalisierten Antikörper-bildenden Zellen gebildet werden.
  • Die Milzen der immunisierten chimären Nager M4 werden entfernt zwischen 12 und 20 Tage nach Transplantation menschlicher PBL, vorzugsweise am Tag 14 nach deren Transplantation. Aus den Milzen werden Zellsuspensionen hergestellt und die aus den chimären Nagern M4 erhaltenen Antikörper-bildenden Zellen werden vorzugsweise mit einem Mensch-Maus Fusionspartner, wie einem Heteromyelom, durch auf dem Fachgebiet wohlbekannte Techniken fusioniert (z. B. Köhler & Milstein, Nature (1975), 256: 495–497). Um die von den ausgewählten Hybridomzelllinien gebildeten Antikörper zu isolieren, werden die Hybridomzelllinien entweder in vitro in einem geeigneten Medium kultiviert, wobei der gewünschte monoclonale Antikörper aus dem Überstand gewonnen wird, oder alternativ können die Hybridomzelllinien intraperitoneal in Mäuse injiziert werden und die Antikörper aus dem malignen Ascites oder dem Serum dieser Mäuse geerntet werden. Die Überstände der Hybridomzelllinien werden zuerst anhand von irgendeinem auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren, wie dem „Enzym gebundenen Immunsorbitionstest" (ELISA) oder dem Radioimmunassay (RIA), auf die Bildung von menschlichen IgG-Antikörpern untersucht. Hybridome, die positiv für menschliches IgG getestet werden, werden anschließend anhand ihrer Fähigkeit HBVsAg zu binden auf die Bildung von anti-HBVsAg-Anikörpern weiter untersucht.
  • Der M1 Nager ist ein Nager, der gewöhnlich als Labortier verwendet wird, wie eine Ratte oder eine Maus.
  • Die Maus M2 kann irgendeine hämatopoetische Defizienz aufweisen, einschließlich genetische hämatopoetische Defizienzen sowie induzierte hämatopoetische Defizienzen. Nicht-beschränkende Beispiele hämatopoetischer Defizienzen umfassen SCID, Bg, Nu, Xid oder Mäuse, die irgendeine Kombination der vorstehend erwähnten hämatopoetischen Defizienzen aufweisen. Zusätzlich kann die hämatopoetische Defizienz auch das Ergebnis einer Gendeletion sein oder transgene Mäuse können verwendet werden.
  • Die aus der Spendermaus M2 erhaltenen hämatopoetischen Zellen sind Knochenmarkzellen, entweder unbehandelt oder T-Zell-depletiert. Andere geeignete Quellen hämatopoetischer Zellen, die auch verwendet werden können, umfassen zum Beispiel Milzzellen, fötale Leberzellen oder Blutzellen.
  • Die aus dem Mensch M3 erhaltenen xenogenen hämatopoetischen Zellen sind PBL, können aber auch aus jeder geeigneten Quelle menschlicher hämatopoetischer Zellen, wie Knochenmarkzellen, Nabelschnurblutzellen, Thymus-, Milz- oder Lymphknotenzellen etc. erhalten werden.
  • Der Nager M1 kann eine Maus oder Ratte sein, die Maus M2 kann eine SCID-Maus sein und die aus dem Mensch M3 erhaltenen xenogenen hämatopoetischen Zellen können PBL aus einem Mensch M3 sein, der schon mit dem HBVsAg in Kontakt gekommen ist, entweder spontan als Ergebnis einer früheren Infektion oder induziert nach Impfung. Solche Menschen werden einen sehr hohen anti-HBVsAg-Antikörper Titer aufweisen, verglichen mit Personen, die nie mit HBV infiziert wurden, und daher wird, wenn PBL solcher Personen als M3 Donorzellen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die Immunisierung der M4 chimären Maus mit HBVsAg in der M4 chimären Maus als Antwort auf die transplantierten menschlichen PBL eine sekundäre Immunantwort hervorrufen. Ein menschlicher Donor M3 ist zum Beispiel jemand, der HBV negativ getestet wurde aber einen hohen Titer an Antikörpern gegen HBVsAG zeigt. Derartige PBL aus dem menschlichen Donor M3 können erhalten werden entweder durch die Spende von Vollblut oder durch Leukopherese.
  • Das zur Immunisierung des chimären Nagers M4 in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendete HBVsAg ist zum Beispiel ein Hepatitis B Virusimpfstoff, der das gereinigte Hauptoberflächenantigen des Virus enthält, das durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt wurde (EngerixTM-B, SIB Biological, Rixensart, Belgien).
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Hybridomzelllinien, wie in Anspruch 2 definiert, die menschliche monoclonale Antikörper bilden, die in der Lage sind, an HBVsAg zu binden, sowie auf menschliche monoclonale Antikörper, die in der Lage sind, an HBVsAg zu binden, wie in Anspruch 1 definiert, und deren Fragmente, in denen im wesentlichen die Antigenbindungseigenschaften des vollständigen Antikörpers erhalten sind. Solche Fragmente können zum Beispiel Fab- oder F(ab)2-Fragmente sein, die durch Verdau des vollständigen Antikörpers mit verschiedenen Enzymen, wie auf dem Fachgebiet bekannt und ausführlich beschrieben, erhalten wurden. Die antigenen Eigenschaften eines Antikörpers bestimmt werden durch Untersuchung der Bindung eines Antikörpers an eine bestimmte antigene Determinante unter Verwendung von Standardassays, wie RIA, ELISA oder FACS-Analyse.
  • Typischerweise haben die erfindungsgemäßen menschlichen monoclonalen Antikörper eine relativ hohe Affinität zu HBVsAg, die im Bereich von etwa 10–9 M bis etwa 10–10 M liegt, wie in einem kompetitiven ELISA bestimmt.
  • In Übereinstimmung mit einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Hybridomzelllinie bereitgestellt, die hier als „19.79.5" bezeichnet wird und die am 22. Mai 1996 bei der Europäischen Sammlung für Zellkulturen (European Collection of Cell Cultures, ECACC, CAMR, Sailsbury, Wiltshire, SP40JG, UK) unter der Hinterlegungsnummer 96052168 hinterlegt wurde. Menschliche monoclonale anti-HBVsAg-Antikörper, die von der vorstehenden Hybridomzelllinie sezerniert werden und hier als „Ak 19.79.5" bezeichnet werden, werden auch bereitgestellt, ebenso wie deren Fragmente, in denen die Antigenbindungseigenschaften der Antikörper erhalten sind.
  • Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind verschiedene diagnostische, prophylaktische und therapeutische Verwendungen der menschlichen monoclonalen Anti-HBVsAg-Antikörper. In Übereinstimmung mit diesem Aspekt der Erfindung können Arzneimittel, die die menschlichen monoclonalen anti-HBVsAg-Antikörper umfassen, für die Behandlung von Patienten mit chronischer Hepatitis B verwendet werden, wobei einem solchen Patienten eine therapeutisch wirksame Menge des Antikörpers oder dessen Teils, der in der Lage ist, an das HBVsAg zu binden, verabreicht wird, die eine Menge ist, die wirksam ist zum Vermindern der Symptome der HBV-Infektion oder zum Reduzieren der Anzahl der zirkulierenden viralen Partikel in einer Person.
  • Derartige Arzneimittel können einen oder mehrere erfindungsgemäße Antikörper umfassen. Zusätzlich zu den erfindungsgemäßen Antikörpern können die Arzneimittel gegebenenfalls auch einen Träger, ausgewählt aus allen auf dem Fachgebiet bekannten Trägern, umfassen. Ein Beispiel für einen derartigen Träger ist ein Liposom. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können auch verschiedene an sich bekannte Lösungsmittel oder Adjuvantien umfassen.
  • Die erfindungsgemäßen Mittel können durch eine Reihe von Verabreichungsmethoden einschließlich parenteral, oral etc. verabreicht werden.
  • Mittel, die, wie vorstehend beschrieben, die erfindungsgemäßen Antikörper umfassen, können zusammen mit anderen antiviralen Wirkstoffen verabreicht werden. Derartige Wirkstoffe können als nicht beschränkende Beispiele Interferone, monoclonale anti-HB-Antikörper, polyclonale anti-HB-Antikörper, Nucleosidanaloga und DNA-Polymerase Inhibitoren beinhalten. Im Falle einer derartigen Kombinationstherapie können die Antikörper gleichzeitig mit dem antiviralen Wirkstoff gegeben werden oder vor oder nach Behandlung mit dem antiviralen Wirkstoff.
  • Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können zum Beispiel auch zur Immunisierung von Neugeborenen gegen HBV-Infektionen verwendet werden oder zur Immunisierung von Patienten mit Lebertransplantationen, um mögliche wiederkehrende HBV-Infektionen bei derartigen Patienten auszusschließen.
  • Nach einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Antikörper auch in einem Verfahren zur Diagnose von HBV-Infektionen in einer Person verwendet werden, durch Erhalten einer Probe aus Körperflüssigkeit der getesteten Person, was eine Blutprobe, eine Lymphprobe oder jede andere Probe aus Körperflüssigkeit sein kann, und Inkontaktbringen der Probe aus Körperflüssigkeit mit einem erfindungsgemäßen menschlichen anti-HBVsAg-Antikörper unter Bedingungen, die die Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen ermöglichen. Der Spiegel an derartigen Komplexen wird dann anhand von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren bestimmt, wobei ein Spiegel, der wesentlich höher ist als der, der sich in einer Kontrollprobe gebildet hat, eine HBV-Infektion der getesteten Person anzeigt. In gleicher Weise kann auch das von den erfindungsgemäßen Antikörpern gebundene spezifische Antigen für die Diagnose verwendet werden.
  • Kurze Beschreibung der Abbildungen
  • 1 ist eine graphische Darstellung, die die Menge an menschlichem Gesamt-Ig (mg/ml) und die Menge spezifischer anti-HBs-Antikörper (mU/ml) in den Seren bestrahlter Mäuse, die mit SCID-Knochenmark vor der Bestrahlung geschützt wurden (chimäre Mäuse), zeigt.
  • PBL + Engerix: die chimären Mäuse wurden außerdem mit menschlichen PBL von anti-HBs Antikörper-positiven Spendern transplantiert und geimpft mit Engerix-B in einem Aluminiumhydroxid-Adjuvans (Alaun).
  • PBL + Alaun: die chimären Mäuse wurden außerdem mit menschlichen PBL von anti-HBs Antikörper-positiven Spendern transplantiert und geimpft mit nur Alaun (kein Engerix-B).
  • SCID + KM + Engerix: die chimären Mäuse wurden geimpft mit Engerix-B (keine Transplantation menschlicher PBL).
  • SCID – KM + Alaun: die chimären Mäuse wurden geimpft mit Alaun (keine menschlichen PBL und kein Engerix-B).
  • Die schwarze Linie stellt den anfänglichen Spiegel an anti-HBs-Antikörpern im Serum des menschlichen PBL-Spenders dar.
  • 2 ist eine graphische Darstellung, die die spezifische Aktivität, d. h. die Spiegel an anti-HBVs-Antikörpern pro mg menschlichem Ig, in den Seren menschlicher Spender zeigt (A–D, schwarze Säulen) und die spezifische Aktivität in den Seren chimärer Mäuse, die mit menschlichen PBL dieser Spender transplantiert wurden (A–D, gestreifte Säulen).
  • 3 ist eine graphische Darstellung, die die Zeitabhängigkeitskurve der spezifischen Aktivität von anti-HBs-Antikörpern (mU/mg) in Seren von chimären Mäusen zeigt (gepunktete Linie). Die schwarzen Säulen stellen den Spiegel an menschlichem Gesamt-Ig (mg/ml) dar und die gestreiften Säulen stellen den Spiegel an spezifischen anti-HBs-Antikörpern (mU/ml) dar.
  • 4 ist eine graphische Darstellung, die die kompetitive Inhibition der Bindung von anti-HBs-Antikörpern an HBs-Partikel zeigt. Das Ausmaß der Bindung wurde in einem ELISA unter Verwendung eines Meerettichperoxidase-markierten anti-Mensch-IgG Zweitantikörpers gemessen. Die anti-HBs-Antikörper wurden, wie in der Darstellung gezeigt, in Medium verdünnt (leere Quadrate) oder in 0,5 μg/ml HBs-Partikeln (schwarze Quadrate).
  • 5 ist ein Foto, das Hepatitis B-infizierte Leberschnitte zeigt, die mit anti-HBVs-Antikörpern gefärbt wurden. Alle Schnitte wurden mit einem Zweitantikörper, d. h. Ziege-anti-Mensch Ig, Biotin-konjugiert, gefärbt.
    • A Negativkontrolle. Kein Erstantikörper.
    • B Positivkontrolle. Erstantikörper: Maus-anti-HB Antikörper und Zweitantikörper: anti-Maus Ig.
    • C Färbung mit anti-HBs-Antikörper Nr. 19.79.5.
    • D Färbung mit anti-HBs-Antikörper Nr. 18.5.1013.
  • 6 ist eine schematische Darstellung der Bindung von Ak 19.79.5 an einen Satz von 15 gut charakterisierte HBsAg-Typen. Die y-Achse stellt optische Dichte-Einheiten dar. Die x-Achse stellt unterschiedliche HBsAg-Typen dar.
  • 7 ist eine graphische Darstellung des Prozentsatzes HBV-infizierter Tiere an den Tagen 11 und 18 in der unbehandelten Gruppe und der Ak 18.5.1013-behandelten Gruppe (im Inhibitionsmodell).
  • 8 ist eine graphische Darstellung des Prozentsatzes HBV-infizierter Tiere an den Tagen 10 und 17 in der unbehandelten Gruppe und der Ak 19.79.5-behandelten Gruppe (im kombinierten Prophylaxe-/Hemmungsmodell).
  • 9 ist eine graphische Darstellung des prozentualen Anteils HBV-infizierter Tiere an den Tagen 11 und 19 in der unbehandelten Gruppe und der Ak 19.79.5-behandelten Gruppe (im kombinierten Inhibition/Behandlung-Modell).
  • 10 Nucleinsäuresequenz und entsprechende Aminosäuresequenz der leichten Kette der variablen Domäne von Ak 19.79.5.
  • 11 Nucleinsäuresequenz und entsprechende Aminosäuresequenz der schweren Kette der variablen Domäne von Ak 19.79.5.
  • Hier seien nun die folgenden Beispiele erwähnt, die zur Illustration bereitgestellt werden, die aber die vorliegende Erfindung nicht einschränken sollen.
  • BEISPIELE
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Mäuse
  • Die verwendeten Tiere waren 6–10 Wochen alt. BALB/c Mäuse wurden von Harlan (Weizmann Institut, Zentrum für Tieraufzucht, Rehovot, Irael), SCID/NOD Mäuse vom Weizmann Institut, Zentrum für Tieraufzucht (Rehovot, Israel) erhalten. Allen Mäusen wurde steriles Futter und saures Wasser, das Cyprofloxacin (20 μg/ml; Bayer, Leverkusen, Deutschland) enthielt, gefüttert. Wann immer nötig, wurde den Mäusen nach der KMT für fünf Tage täglich 1 mg Fortum (Glaxo Operations UK, Greenford, England) i. p. injiziert.
  • Vorbehandlung
  • BALB/c Mäuse wurden einer Ganzkörperbestrahlung („total body irradiation", TBI) ausgesetzt, mit 4 Gy, drei Tage später gefolgt von 10–11 Gy (Teildosis), aus einer 150-A 60Co Gammastrahl-Quelle (erzeugt von Atomic Energy of Canada, Kanada, Ontario) mit einer F.S.D. von 75 cm und einer Dosisrate von 0,7 Gy/min.
  • Präparation und Transplantation von Knochenmarkzellen
  • Die femoralen und tibialen Knochen wurden aus den Mäusen entnommen und in einem sterilen 50 ml Omni-Mixer Edelstahl-Behälter (Omi-Mixer Homogenisator, Modell Nr. 17106, OMNI International, Waterbury, CT, USA) homogenisiert. Empfängermäusen wurden 4–6 × 106 SCID/NOD Kochenmarkzellen (in 0,2 ml PBS) direkt nach Bestrahlung i. v. injiziert.
  • Transplantation von Blutlymphozyten
  • Blutlymphozyten (PBL) wurden nach Aufklärung durch Leukopherese aus HBs Antikörper-positiven und gleichzeitig HBV-negativen Spendern gewonnen. Die PBL wurden zweimal gewaschen, gezählt und in PBS auf die gewünschte Konzentration verdünnt.
  • 100 × 106 menschliche PBL wurden intraperitoneal (i. p.) in Empfängermäuse injiziert, die wie vorstehend beschrieben behandelt waren. Kontrollmäuse erhielten keine menschlichen PBL.
  • Immunisierung der chimären Tiere
  • Die Mäuse wurden einmalig mit Hepatitis B-Impfstoff (EngerixTM-B; SB Biologicals; Rixensart, Belgien) immunisiert, der zusammen mit den PBL i. p. verabreicht wurde.
  • Zell- und Plasmasammlung aus den Mensch/Maus-Chimären
  • Die Tiere wurden aus der retro-orbitalen Vene unter Verwendung von Heparin-beschichteten Gaskapillaren ausgeblutet. Das Plasma wurde zur Bestimmung des Gehalts an menschlichem Ig aufbewahrt. Nachdem die Tiere durch zervikale Dislokation geopfert wurden, wurden die Milzen entfernt, in Stücke geschnitten und durch Edelstahlsiebe gepresst, um Zellsuspensionen in PBS herzustellen.
  • Zellfusion
  • Die Zellen wurden mit dem Mensch/Maus Heteromyelom HMMA2.11TG/0 (Posner et al., Hybridoma (1987), 6: 611–625) im Verhältnis 3 : 1 gemischt. Die Fusion wurde mit 50% (w/v) PEG 1500 (Boehringer Mannheim, Deutschland) in einem Standardverfahren durchgeführt. Fusionierte Zellen wurden in einer Konzentration von 30.000 Zellen/Vertiefung in 96-well U-Boden Mikrotiterplatten (Nunc, Roskilde, Dänemark) in Vollmedium mit HAT-Zusatz (1 ×, Biological Industries, Beit Haemek, Israel) ausgesät. Eine Woche später wurden die Zellen mit frischem HAT-Medium gefüttert. Zwei Wochen nach der Fusion wurden die Überstände für ELISA-Untersuchungen abgenommen und das Medium wurde durch frisches HAT-Medium ersetzt.
  • Hybridomkulturen, die spezifische anti-HBs-Ig sezernierten, wurden in 96-well U-Boden Mikrotiterplatten cloniert (1/2 Zelle/Vertiefung).
  • Bestimmung der menschlichen Immunglobuline
  • Die Seren wurden auf menschliche Antigen-spezifische Ig und menschliches Gesamt-Ig untersucht. Menschliches Gesamt-Ig wurde quantifiziert in einem Sandwich-ELISA unter Verwendung von F(ab)2-gereinigtem Ziege-anti-Mensch IgG + IgM + IgA (Zymed Laboratories, San Francisco, CA, USA) als Fängeragens („capture agent") und Peroxidase-konjugiertem gereinigtem Ziege-anti-Mensch-IgG (Zymed Laboratories) als Nachweisreagenz. Menschliches Serum mit bekannter Immunglobulinkonzentration (Sigma, Rehovot, Israel) wurde als Standard verwendet. Mit dem Fängeragens (2,5 μg/ml, 50 μl/well) vorbeschichtete und mit 1% BSA blockierte Mikrotiterplatten (Nunc, Roskilde, Dänemark) wurden über Nacht bei 4°C mit Plasmaverdünnungen von 1 : 20.000 bis 1 : 640.000 oder dem Standard von 0,2 bis 0,06 μg/ml inkubiert und dann fünfmal mit PBS-Tween Lösung gewaschen. Das Nachweisreagenz wurde zugegeben und die Platten wurden für 1 h bei 37°C inkubiert, dann wieder dreimal gewaschen. Frische Substratlösung (TMB, Sigma) wurde zugegeben und nach Peroxidase-katalysierter Farbentwicklung wurde die Reaktion durch Zugabe von 10% Schwefelsäure gestoppt. In einem ELISA-Reader (Dynatech, Port Guernsey, Channel Islands, UK) wurde die Absorption bei 450 nm gemessen.
  • Die Konzentration von Antigen-spezifischen menschlichen Antikörpern in Mäusen wurde bestimmt unter Verwendung eines HBsAb EIA Kits (ZER, Jerusalem, Israel).
  • Menschliche Antikörper in Hybridomüberständen wurden bestimmt durch Inkubation von Überständen über Nacht in mit Ziege-anti-Mensch IgG + A + M (Zymed) beschichteten Platten mit Ziege-anti-Mensch IgG Peroxidase-Konjugat als Zweitreagenz.
  • Antigen-spezifische Antikörper in Hybridomüberständen wurden wie vorstehend unter Verwendung von Platten, die mit HBs-Antigen beschichtet waren, bestimmt.
  • Bestimmung von menschlichen IgG-Subklassen
  • Menschliche IgG-Subklassen wurden durch Sandwich-ELISA unter Verwendung von mit F(ab)2-gereinigtem Ziege-anti-Mensch IgG + IgM + IgA (Zymed) beschichteten Platten und Platten, die mit HBs-Antigen beschichtet waren, bestimmt. Maus-anti-Mensch IgG-Subklassen (Sigma) wurden als Zweitantikörper verwendet und Peroxidase-konjugierter gereinigter Ziege-anti-Mensch Antikörper (Zymed Laboratories) wurde als Nachweisreagenz verwendet.
  • Statistische Auswertung
  • Die Statistische Auswertung wurde durchgeführt unter Verwendung des Stat View II Programms (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA, USA) auf einem Mackintosh Quadra 605 oder Microsoft Excel 5.0 (Microsoft) auf einem 486 DX2 kompatibelen PC. T-test, Anova-Korrelation und Regressionsanalyse wurden verwendet, um die Wahrscheinlichkeit (p) und die Werte für die Korrelationskoeffizienten (r) zu berechnen. Die Ergebnisse sind als mittlere Standardfehler dargestellt.
  • Messungen der Affinitätskonstante
  • Die Bestimmung der Affinitätskonstanten (KD) der verschiedenen anti-HBs-Antikörper zu ad-Antigen (Chemicon, Cat. No. AG 850) in Lösung wurden durchgeführt gemäß Friquet et al. (J. Immunol. Meth. (1985), 77: 305–319). Das Antigen in unterschiedlichen Konzentrationen (3,5 × 10–10 M bis 1,4 × 10–9 M) wurde zuerst mit einer konstanten Antikörpermenge (3,4 × 10–11 M) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, der 2 mM EDTA und 10 mg/ml BSA, pH 7,8, (Mediumpuffer) enthielt, inkubiert. Nach Inkubation ü. N. bei 20°C wurde die Konzentration an freiem Antikörper über einen indirekten ELISA bestimmt. Volumen von 300 μl jeder Mischung wurden in Mikrotiterplatten (Nunc), die vorher mit ad beschichtet wurden (50 μl/Vertiefung bei 1 μg/ml in 0,1 M NaHCO3-Puffer, pH 9,6 für 2 h bei 37°C), überführt und für 2 h bei 20°C inkubiert. Nach Waschen mit PBS mit 0,04% Tween 20 wurden die gebundenen Antikörper durch Zugeben von HRP-F(ab')2 Ziege-anti-Mensch IgG (Zymed), 1 : 3000 verdünnt mit Mediumpuffer (50 μl/Vertiefung) und Inkubation 2 h bei 20°C nachgewiesen. Die Platte wurde entwickelt mit TMB-Chromogen (50 μl/Vertiefung, Sigma T-3405 Tabletten), die Reaktion wurde gestoppt mit 10% H2SO4 (50 μl/Vertiefung) und die Platte wurde in einem ELISA-Reader bei 450 nm gelesen. Die Bedingungen wurden so gewählt, dass die resultierenden f-Werte (siehe Friquet et al.) bei etwa 0,1 lagen. Die verwendete Antikörperkonzentration wurde abgeleitet aus einer ELISA-Kalibrierung, die mit der gleichen Platte durchgeführt wurde. Die Affinitätskonstante KD wurde berechnet aus dem relevanten Scatchard Plot.
  • Inhibitionsassays
  • Der Inhibitionsassay wurde in Microtiterplatten, die mit HBs-Partikeln (2 μg/ml in PBS) beschichtet waren durchgeführt. Die Platte wurde mit 3% BSA in PBS blockiert. Hybridomüberstände, die anti-HBs-Antikörper enthielten, wurden seriell verdünnt. 50 μl jeder Verdünnung wurden in die beschichteten Microtitervertiefungen gegeben. Anschließend wurden 50 μl HBs-Partikel (ad/ay, 0,5 μl/ml in PBS) oder nur PBS in jede Vertiefung gegeben. Die Platten wurden über Nacht bei Zimmertemperatur in einer feuchten Kammer inkubiert und dann fünfmal mit PBS-Tween gewaschen. Als Nächstes wurden 50 μl Ziege-anti-Mensch IgG konjugiert an HRP (verdünnt 1 : 5000 in PBS) in jede Vertiefung gegeben. Nach einer Inkubation von 4 Stunden bei Zimmertemperatur in einer feuchten Kammer wurden die Platten fünfmal mit PBS-Tween gewaschen und in jede Vertiefung wurde TMB gegeben. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung eines ELISA-Readers bei einer Wellenlänge von 450 nm ermittelt.
  • Immunhistofärbung
  • Ein Stück einer HBV positiven Leber wurde in 4% neutral-gepuffertem Formaldehyd 24 Stunden fixiert und dann unter Verwendung von Routineverfahren in Paraffin eingebettet. Schnitte von 4 μm Dicke wurden von Paraffinblöcken geschnitten und auf Polylysin-beschichtete Objektträger aufgebracht. Nach Entparaffinierung und Peroxidase-Quenching wurde die Färbung durchgeführt unter Verwendung unseres Protein A-gereinigten monoclonalen menschlichen anti-HBs-Antikörpers gefolgt von biotinyliertem Ziege-anti-Mensch IgG (H + L) (Zymed) und unter Verwendung eines Histostain-SPTM Kits (Zymed) gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Kontrollobjektträger ohne Verwendung des menschlichen anti-HBs-Erstantikörpers wurden parallel gefärbt.
  • Sequenzanalyse
  • Gesamt-RNA wurde aus 10 × 106 Hybridomzellen mit RNAsol B-Reagenz (TELTEX, Inc., Frienswood, Texas, USA) isoliert. cDNA wurde aus 10 μg Gesamt-RNA mit Reverser Transkriptase und oligo-dT (Promega, Madison, WI, USA), nach Standardverfahren hergestellt. PCR wurde durchgeführt mit 1/50 der RT-Reaktionsmischung mit VH-, Vλ- oder Vκ-5'-Leadersequenz-Primern und 3'-Primern komplementär zur menschlichen konstanten Region. Die PCR-Fragmente wurden in den pGEM T-Vector (Promega) cloniert. Die Insertionen wurden sequenziert unter Verwendung eines ABI 377 Sequencers. Die Sequenzen wurden analysiert durch Vergleich mit GenBank und durch Alignment mit Kabatsequenzen (Kabat et al. (1991), Sequences of proteins of immunological interest (5th Ed.), Dept. of Health and Human Services, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
  • Beispiel 1: Bildung von menschlichen anti-HBs-Antikörpern in chimären Mäusen
  • Menschliche Blutlymphozyten (PBL) von anti-HBs-Antikörper positiven Spendern wurden intraperitoneal implantiert in bestrahlte BALB/c-Mäuse, die durch Transplantation von Knochenmark von SCID-Mäusen vor der Bestrahlung geschützt waren. Diese chimären Mäuse wurden mit Hepatitis B-Impfstoff (Engerix-B) immunisiert, um eine sekundäre Immunantwort hervorzurufen. Die Bildung von spezifischen anti-HBs-Antikörpern, zusammen mit der Sekretion von menschlichem Gesamt-Ig, wurde in Mausseren gemessen. 1 zeigt Spiegel an menschlichem Gesamt-Ig und spezifischen anti-HBs-Antikörpern in Mausseren 14 Tage nach Transplantation von menschlichen PBL. Obwohl die Spiegel an sezernierten menschlichen Ig in immunisierten Tieren und Kontrollmäusen ähnlich sind, entwickelt sich eine starke spezifische Immunantwort in den mit Hepatitis B-Impfstoff geimpften Mäusen, verglichen mit der Kontrollgruppe. Der Vergleich der Spiegel an spezifischen menschlichen Antikörpern, die als Antwort auf das Antigen in immunisierten Mäusen gebildet werden, mit den Spiegeln dieser Antikörper in den Spenderseren zeigt einen 5–10fachen Anstieg in den Mäusen. Zudem ist die in Mausseren gemessene spezifische Aktivität, d. h. die Spiegel an spezifischen anti-HBs-Antikörpern pro mg an sezernierten menschlichen Ig, 102–104fach höher als die im Spender beobachtete spezifische Aktivität. Dieser Anstieg verdeutlicht eine sehr hohe Vervielfältigung der anti-HBs-Antikörper Bildung als Antwort auf das Antigen in den chimären Mäusen (2). Die Bildung von menschlichen Antikörpern ist nachweisbar 10 Tage nach Immunisierung und erreicht ein Plateau nach drei Wochen. Die spezifische Aktivität ist hoch an Tag 13 nach Immunisierung und nimmt danach ab (wegen Anstieg der menschlichen Gesamt-Ig Sekretion) (3).
  • Beispiel 2: Gewinnung und Charakterisierung menschlicher monoclonaler Antikörper gegen HBs
  • Menschliche B-Zellen, die aus Mausmilzen zwei Wochen nach Immunisierung gewonnen wurden, wurden fusioniert mit Mensch/Maus-Heteromyelomzellen (Posner et al., supra). Die Hybridomzellen wurden getestet bezüglich ihrer Wachstumsrate, Gesamt-Ig Sekretion und Bildung spezifischer Antikörper. Kontroll-Fusionsexperimente wurden an Spender-PBL durchgeführt, die in vitro mit PWM und HBVsAg aktiviert wurden. Die Fusionshäufigkeiten in verschiedenen Experimenten reichten von 0,9–5 × 105. Die meisten der wachsenden Hybridomclone sezernierten menschliches Ig, von diesen bildeten 0,1–4% spezifische menschliche anti-HBs-Antikörper, Aus chimären Mausmilzen erhaltene anti-HBs sezernierende Hybridomzellen wurden hinsichtlich Ig-Typ und Stabilität verglichen mit denen, die aus der Fusion von in vitro-aktivierten PBL des Spenders erhalten wurden, wie nachstehend in Tabelle 1 zu sehen ist. Die Mehrzahl der Hybridome aus chimären Mäusen waren, wie sich zeigte vom IgG-Typ und alle waren für mehr als 12 Monate stabil. Dagegen waren Hybridome, die aus Spender-PBL erhalten wurden, zumeist instabil, nur ein Clon war für mehr als 12 Monate stabil. Zwei stabile Hybridomclone, die spezifische menschliche monoclonale anti-HBs-Antikörper sezernierten, wurden charakterisiert. Wie in Tabelle 2 nachstehend zu sehen ist, wurden diese Antikörper über eine Protein A-Säule gereinigt, sowie über eine anti-Mensch Ig Agarosesäule, und es zeigte sich, dass beide der IgG1-Subklasse angehörten. Die Affinitätskonstanten reichten von 1,3 × 10–9 M bis 6 × 10–9 M, wie im kompetitiven ELISA getestet. Die Spezifität wurde getestet im kompetitiven Inhibitionsassay unter Verwendung des HBV Oberflächenantigens vom ad-ay (1 : 1) Subtyp (4). 5 zeigt die spezifische Bindung von erfindungsgemäßen menschlichen MoAbs an HBV durch Färbung menschlicher HBV-infizierter Leberfragmente.
  • Das Gen, das die variable Region von Ak 19.79.5 codiert, wurde isoliert, vollständig sequenziert und seine Subgruppen und CDRs wurden bestimmt.
  • Der Antikörper hat eine vollständige menschliche Ig Gensequenz, wie durch Alignment mit GenBank Sequenzen und Kabat Proteinsequenzen bestimmt. 10 zeigt die Nucleotidsequenz der cDNA, die die leichte Kette der variablen Region von Ak 19.79.5 codiert, und die entsprechende Aminosäuresequenz (Sequenzidentifizierungsnummern 1 und 3) 11 zeigt die Nucleotidsequenz der cDNA, die die schwere Kette der variablen Region von Ak 19.79.5 codiert, und die entsprechende Aminosäuresequenz (Sequenzidentifizierungsnummern 2 und 4).
  • Die Sequenzdaten offenbarten, dass die variable Region von Ak 19.79.5 aus den Subgruppen VH3, JH2, Vλ3 und Jλ3 besteht.
  • HBV Genome werden in sechs Gruppen, A–F, eingeteilt, basierend auf dem Grad der Ähnlichkeit in ihren Nucleotidsequenzen. Die genetische Variabilität von HBV wird außerdem im Auftreten von verschiedenen Serotypen von HBsAg wiedergespiegelt. Die gemeinsame Determinante „a" und zwei Paare von sich gegenseitig ausschließenden Determinanten „d/y" und „w/r" ermöglichen die Unterscheidung von vier Haupt-Subtypen von HBsAg: adw, adr, ayw und ayr. Zusätzliche als Subdeterminanten von w (w1 bis w4) bezeichnete Determinanten haben die Definition von vier Serotypen von ayw (ayw1–4) und zwei Serotypen von adw, d. h. adw2 und adw4, erlaubt. Zusätzliche Subtypenvariation wird durch die q-Determinante erreicht, die in fast allen Subtypen vorhanden ist. Ihre Abwesenheit wird durch ein „q-"-Zeichen markiert.
  • Die Art von HBV Serotypen, die von Ak 19.79.5 erkannt werden, wurde untersucht unter Verwendung eines Sets von 15 verschiedenen HBsAg-Typen (Norder et al., J. General Virol. (1992), 73: 3141; Magnius und Norder, Intervirology (1995), 38: 24–34. Wie in 6 zu sehen ist, verfügt Ak 19.79.5 ein komplexes Erkennungsmuster für die verschiedenen HBsAg Serotypen.
  • Beispiel 3: Biologische Aktivität von menschlichen monoclonalen Antikörpern gegen HBs
  • Die biologische Aktivität von Ak 19.79.5 und Ak 18.5.1013 (der letztgenannte Antikörper ist nicht Bestandteil der beanspruchten Erfindung) wurde charakterisiert unter Verwendung des folgenden HBV Tiermodells: Eine Maus wurde so behandelt, dass die stabile Transplantation menschlicher Leberfragmente möglich wurde. Die Behandlung umfasste intensive Bestrahlung gefolgt von der Transplantation von SCID (Severe Combined Immunodeficiency)-Maus-Knochenmark. Die virale Infektion menschlicher Leberfragmente wurde ex vivo unter Verwendung von HBV-positivem menschlichen Serum durchgeführt ( EP 699 235 ).
  • Das Tiermodell wurde auf drei verschiedene Arten verwendet, was die unterschiedlichen möglichen Verwendungen der Antikörper repräsentiert: Inhibition der Infektion, kombinierte Prophylaxe/Inhibition, kombinierten Inhibition/Behandlung.
    • 1. Inhibitionsmodell – Dieses Modell verdeutlicht die Fähigkeit, den Antikörper zu verwenden, um Leberinfektionen durch HBV zu hemmen. Das in 7 gezeigte Experiment ist nur zu Anschauungszwecken gedacht. HBV positives menschliches Serum wurde mit Ak 18.5.1013 vorinkubiert, es folgte eine Standard ex vivo Leberinfektion. Auf HBV-DNA in Mausseren wurde 11 und 18 Tage nach Transplantation getestet. Wie in 7 zu sehen ist, gab es eine signifikante Reduktion des Prozentsatzes infizierter Tiere in der Antikörper-behandelten Gruppe, verglichen mit der unbehandelten Gruppe.
    • 2. Kombiniertes Prophylaxe/Inhibition-Modell – Dieses Modell entspricht der Lebertransplantation. In diesem Modell wurden Mäuse drei Tage vor der Lebertransplantation mit Ak 19.79.5 (10 I. U./Maus) behandelt, es folgte die Transplantation menschlicher Leberfragmente, die ex vivo mit HBV in Anwesenheit von Ak 19.79.5 (100 I. U.) infiziert wurden. Auf HBV-DNA in Mausseren wurde 10 und 17 Tage nach Transplantation getestet. Wie in 8 zu sehen ist, gab es eine signifikante Reduktion des Prozentsatzes infizierter Tiere in der behandelten Gruppe, verglichen mit der Kontrollgruppe.
    • 3. Kombiniertes Inhibition/Behandlung-Modell – a) HBV positives menschliches Serum wurde mit Ak 19.79.5 vorinkubiert, es folgte eine Standard ex vivo Leberinfektion. B) Mäuse wurden behandelt mit Ab 19.79.5 an den Tagen 0 und 7 nach Transplantation. Auf HBV-DNA in Mausseren wurde an den Tagen 11 und 19 getestet. Wie in 9 zu sehen ist, war der Prozentsatz infizierter Tiere in der mit Ak 19.79.5 behandelten Gruppe signifikant reduziert aber nahm etwa zwei Wochen nachdem die Behandlung gestoppt wurde wieder zu.
  • Beispiel 4: Kombinationstherapie mit menschlichen monoclonalen Antikörper gegen HBs und einem antiviralen Mittel
  • Unter Verwendung der oben beschriebenen HBV-Modelle wurden Mäuse an den Tagen 17–20 nach Transplantation mit einem antiviralen Mittel (einem Nucleosidanalogon, 0,5 mg/Maus/Tag) behandelt. Eine Gruppe von Mäusen wurde außerdem an den Tagen 19 und 20 mit den erfindungsgemäßen menschlichen monoclonalen Antikörpern behandelt. Das Vorhandensein von HBV-DNA in Mausseren wurde an den Tagen 21 und 27 getestet.
  • Tabelle 1
    Figure 00180001
  • Tabelle 2
    Figure 00180002

Claims (8)

  1. Menschlicher monoclonaler Antikörper, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) dem monoclonalen Antikörper, der von der Hybridomzelllinie sezerniert wird, die bei der Europäischen Sammlung von Zellkulturen (European Collection of Cell Cultures (ECACC)) unter der Hinterlegungsnummer 96052168 hinterlegt wurde; (b) Fragmenten des Antikörpers aus (a), die im Wesentlichen die Antigenbindungsmerkmale des gesamten Antikörpers beibehalten; (c) einem monoclonalen Antiköper, codiert von den Nucleinsäuresequenzen, die die in den 10 und 11 gezeigten Nuleinsäuresequenzen umfassen; und (d) einem monoclonalen Antikörper, der die in den 10 und 11 gezeigten Aminosäuresequenzen umfasst.
  2. Hybridomzelllinie, die bei der ECACC unter der Hinterlegungsnummer 96052168 hinterlegt wurde.
  3. Arzneimittel, das mindestens einen Antikörper nach Anspruch 1 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
  4. Arzneimittel nach Anspruch 3, das weiterhin mindestens einen weiteren Wirkstoff umfasst, der ein antiviraler Stoff ist.
  5. Verwendung des Antiköpers nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Infektionen mit HBV.
  6. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 1 in Verbindung mit einem antiviralen Stoff für die Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung und/oder Behandlung einer Infektion mit HBV.
  7. Arzneimittel nach Anspruch 4 oder Verwendung nach Anspruch 6, wobei der antivirale Stoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Interferonen, polyclonalen Anti-HB-Antikörpern, Nucleosidanaloga und Inhibitoren von DNA-Polymerase.
  8. Verfahren zur Diagnose von Infektionen mit HBV in einer Probe aus Körperflüssigkeit, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Probe mit dem Antikörper nach Anspruch 1 unter Bedingungen, die die Bildung von Antikörper-Antigen-Komplexen ermöglichen; (b) Bestimmen des Spiegels der gebildeten Antikörper-Antigen-Komplexe; wobei ein Spiegel, der wesentlich höher ist als der, der sich in einer Kontrollprobe gebildet hat, anzeigt, daß die untersuchte Probe aus Körperflüssigkeit mit HBV infiziert ist.
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