DE3854673T2

DE3854673T2 - Menschliche anti-rh(d) monoklonale antikörper.

Info

Publication number: DE3854673T2
Application number: DE3854673T
Authority: DE
Inventors: Burgh Bradley Benjamin De; Alan Doyle; Belinda Kumpel
Original assignee: National Blood Authority
Current assignee: National Blood Authority
Priority date: 1987-09-18
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1996-04-18
Anticipated expiration: 2008-09-17
Also published as: GB8722018D0; DK69490D0; EP0393051B1; DK162721B; DE3854673D1; EP0393051A1; DK69490A; JPH03502877A; DK162721C; US5487891A; JP2583303B2; ATE130011T1; US5665356A; CA1303533C; WO1989002442A1

Description

Die Erfindung betrifft menschliche monoclonale Antikörper gegen das Rh(D)-Antigen menschlicher Erythrozyten. Insbesondere betrifft sie solche Antikörper der Subklasse IgG&sub1;, die verwendet werden können, nicht nur um das normale Rh(D)-Antigen auf entweder D-positiven oder "schwach D" oder Du-Zellen nachzuweisen, sondern auch, um wichtige Varianten des Rh(D)-Antigens nachzuweisen.
Von den Antigenen des sogenannten Rh-Blutgruppensystems ist das Rh(D)-Antigen für eine der schlimmsten Reaktionen auf eine Infusion bei einem Patienten mit dem entsprechenden Antikörper verantwortlich. Da ein Rh(D-)-Individuum mit anti-Rh(D) bei Erhalt von Rh(D+)-Blut dazu neigt, eine wesentliche Zerstörung der Erythrozyten (RBC) infolge der Imkompatibilitat des Rh(D)-Phänotyps zu erleiden, wird Blut von Spendern und von Empfängern einer Bluttransfusion routinemäßig als Rh(D+) und Rh(D-) durch Agglutinationstests mit anti-Rh(D)-Antikörper klassifiziert. Der Rh-Phänotyp von RBCs wird üblicherweise weiter unter Bezugnahme auf das Fisher-Race-System definiert, das auf der Annahme beruht, daß die Vererbung der Rh-Antigene von drei Paaren von allelischen Genen, C-c, D-d und E-e, die von sehr eng verknüpften Genorten aus wirken, bestimmt wird. Gemäß dieser Theorie kann ein Mensch einen Satz von drei Rh-Genen von jedem seiner Eltern (i) C oder c, (ii) D oder d, (iii) E oder e erben (kein d-Antigen wurde bis jetzt identifiziert, aber das Symbol "d" wird verwendet, um das Vorhandensein eines Gens, das ein Allel zu dem D-Gen ist, das kein D-Antigen erzeugt, zu bezeichnen). Beispielsweise kann ein Rh(D+)- Mensch CDe von einem Elternteil und cde von dem anderen Elternteil erben. Die Häufigkeiten der üblichsten Rh-Gen-Kombinationen, bestimmt unter Bezugnahme auf das Fisher-Race- System, für eine englische Population zusammen mit dem "Kurzsymbolen", die insbesondere beim Sprechen verwendet werden, sind in der nachstehenden Tabelle I angegeben. Tabelle I Häufigkeit der üblichen Rh-Gene für eine englische Population Kurzsymbol CDE-Nomenklatur Häufigkeit (%) seltener
Trotz der Ausdehnung über die Jahre war das Fisher-Race-System nicht adäquat, um alle Reaktionen, die mit dem Rh-System beobachtet wurden, zu erklären (Mollison, P.L. (1983) Blood Transfusion In Clinical Medicine, 7. Auflage, Blackwell-Scientific, Oxford). Trotzdem empfahl die Weltgesundheitsorganisation, daß im Interesse der Einfachheit und Gleichförmigkeit diese Nomenklatur universell angenommen werden sollte, und alle nachstehend angegebenen Rh-Genotypen sind auf der Grundlage des herkömmlichen Fisher-Race- Systems definiert.
Zusätzlich zu der Notwendigkeit eines anti-Rh(D)-Antikörpers für die Rh-Typisierung der RBCs wird ein solcher Antikörper auch unbedingt für die passive Immunisierung von Rh(D-)-Müttern benötigt, um die Hämolyse-Erkrankung des Neugeborenen (HDN) zu verhindern. Dieser Zustand tritt bei Neugeborenen Rh(D+)-Kindern von Rh(D-)-Müttern auf, die zuvor gegen das Rh(D)-Antigen als Ergebnis von anti-Rh(D)- IgG-Antikörpern, die die Plazenta während der Schwangerschaft durchqueren und eine Zerstörung der fötalen RBCs verursachen, sensibilisiert wurden. Die Sensibilisierung der Rh(D-)-Mutter gegenüber dem Rh(D)-Antigen kann bei der Geburt eines früheren Rh(D+)-Kindes als Folge der Tatsache, daß einige fötale RBCs in den mütterlichen Kreislauf eindringen und von dem mütterlichen Immunsystem erkannt werden, aufgetreten sein. Um das Auftreten von HDN zu verringern, ist es im Vereinigten Königreich und vielen anderen Ländern eine Routinepraxis, Rh(D-)-Müttern unmittelbar nach der Geburt eines Rh(D+)-Kindes anti-Rh(D)-Antikörper zu verabreichen, so daß alle Rh(D+)-RBCs, die in den mütterlichen Kreislauf eingetreten sind, rasch entfernt werden (Mollison, P.L. (1983) a.a.O.; Laros Jr., R.K. (1986), "Erythroblastosis Fetalis" in "Blood Group Disorders in Pregnancy", Kap. 7, S. 103).
Gegenwärtig wird ein anti-Rh(D)-Antikörper zur Verwendung sowohl zur Rh-Typisierung von RBCs als auch zur passiven Immunisierung von Rh(D-)-Müttern hauptsächlich direkt aus weiblichen Spendern, die während der Schwangerschaft immunisiert wurden, oder aus immunisierten männlichen Freiwilligen erhalten. Der Erfolg dieses Programmes der post-partalen prophylaktischen Verabreichung von menschlichem anti- Rh(D)-Immunglobulin an Rh(D-)-Frauen führte jedoch zu einer drastischen Verringerung der Anzahl natürlicherweise alloimmunisierter Frauen (Urbaniak, S.J., "RhD haemolytic disease of the newborn: the changing scene", Br. Med. J. (1985) 291, 4-6). Auch die vorsätzliche Immunisierung von Menschen mit Rh(D+)-RBCs trägt die Risiken mit sich, die mit dem Empfang jeder Transfusion von RBCs verbunden sind, beispielsweise das Risiko der Übertragung von Hepatitis-Viren und HIV. Daher besteht ein großes Interesse am Erhalt menschlicher monoclonaler anti-Rh(D)-Antikörper sowohl für diagnostische als auch therapeutische Zwecke.
Wie vorstehend ausgeführt, werden bei der routinemäßigen Blutuntersuchung Bluttypen in Rh(D+) und Rh(D-) auf der Grundlage des offensichtlichen Vorhandenseins oder Fehlens des Rh(D)-Antigens auf den RBCs, wie durch Agglutinationstests mit anti-Rh(D) angezeigt wird, eingeteilt. Jedoch besitzt eine kleine Anzahl von Personen mit offensichtlich Rh(D-)-Blut RBCs, die durch anti-Rh(D) während eines solchen Routinetests nicht direkt agglutiniert werden, die aber reagieren, wenn ein Test zur D-Typisierung unter Verwendung ausgewählter anti-Rh(D)-Reagentien nach dem indirekten Anti-Globulin-Test durchgeführt wird. Die so identifizierten Zellen werden als Du bezeichnet. Die Häufigkeit des Du-Phänotyps beträgt insgesamt etwa 0,2%, 0,6% unter Kaukasiern und etwa 1,5% aller schwangeren Rh(D-)-Frauen. Mindestens drei verschiedene Mechanismen können für die Expression des Du-Phänotyps verantwortlich sein: (1) erbliches Fehlen eines Teils des vollständigen Rh(D)-Antigens, (2) Gen-Interaktion unter Suppression des Rhesus-Gens D durch c in der trans-Position und (3) ein D-Gen, das ein schwaches Antigen produziert.
In den frühen 50er Jahren erschienen erstmalig Berichte zum Vorhandensein von anti-Rh(D) bei Individuen des Du-Phänotyps nach Bluttransfusion mit Rh(D+)-Blut oder nach einer Schwangerschaft, die zur Geburt eines Rh(D+)-Kindes führte. Später wurde offensichtlich, daß bei einigen Menschen, deren Blut als Rh(D+) klassifiziert ist, den RBCs Teile des Rh(D)-Antigens fehlen. Bei Exposition gegenüber Rh(D+)- RBCs, die das vollständige Rh(D)-Antigen tragen, durch Transfusion oder Schwangerschaft, können Personen, die ein unvollständiges Rh(D)-Antigen auf ihren RBCs tragen, ein allo-anti-D gegen den Rh(D)-Antigenteil, der ihnen fehlt, bilden. Das Blut solcher Menschen wird als D-Variante bezeichnet, wenn die RBCs direkt mit den routinemäßigen anti- Rh(D)-Reagentien reagieren, oder als Du-Variante, wenn die Zellen nur gemäß der indirekten Antiglobulin-Technik reagieren.
Die Beobachtung, daß allo-anti-Rh(D) bei Patienten, die Rh(D+)-RBCs bilden, produziert werden können, führte zum allgemeinen Gebrauch des Ausdrucks "D-Mosaik", um das Rh(D)-Antigen in seiner vollständigen nativen Form zu beschreiben. Routinemäßige anti-Rh(D)-Reagentien können im allgemeinen zwischen denjenigen RBCs, denen ein Teil des D- Mosaiks fehlt, und denjenigen, die alle D-Komponenten besitzen, nicht unterscheiden.
Die Phänotypen der D-Variante wurden von Tippett und Sanger (Vox. Sang. (1962) 7, 9-13) kategorisiert. Dieses System beruht auf der Wechselwirkung von RBCs und dem Serum aus Individuen mit der D- und der Du-Variante. Die sieben Kategorien (siehe nachstehende Tabelle II) besitzen Raum zur Erweiterung. Unterteilungen sind bereits in den Kategorien III, IV und V anerkannt. Es wurde gefunden, daß die Kategorien I und II soviele Ähnlichkeiten besitzen, daß sie nun allgemein als eine einzige Untergruppe gelten können. Tabelle II Tippett-und-Sanger-Kategorien für D- oder Du-positives Blut mit anti-Rh(D) Kategorie Rassenursprung Üblicher Haplotyp Weiß Schwarz Üblicherweise Schwarz Meistens Schwarz, einige Weiß Schwarz und Weiß Fast alle Weiß
Eine alternative, aber weniger verwendete Klassifizierung nach Wiener verwendete die Buchstaben A, B, C, D anstelle der römischen Ziffern. Obwohl keine direkte Korrelation zwischen den beiden Systemen besteht, wird oft angenommen, daß DB und DVI untereinander austauschbar sind.
Obwohl die Häufigkeiten der Individuen mit der D- und Du- Variante in der menschlichen Population relativ gering ist, ist die Gesamtzahl der Personen mit diesen Bluttypen, die ein gewisses potentielles Risiko einer effektiven anti- Rh(D)-Bildung als Ergebnis der Exposition über Bluttransfusion oder Schwangerschaft gegenüber Nicht-Varianten-Rh(D+)- Zellen besitzen, keineswegs unbedeutend. Ferner profitieren zusätzlich zu den Rh(D-)-Frauen, die Rh(D+)- oder Du-Kinder zur Welt bringen, Frauen der Du-Variante, die ein Rh(D+)- Kind zur Welt bringen, auch von einer postpartalen anti- Rh(D)-Behandlung, um das HDN-Risiko zu verringern (White, C.A. et al. (1983) Am. J. Obstet. Gynecol. 145, 1069-1073). Antiseren mit der Fähigkeit, RBCs der D- und Du-Variante zu unterscheiden, sind nicht weiter verfügbar. Daher gilt die Bereitstellung von monoclonalen anti-Rh(D)-Antikörpern mit einem Bereich von Bindungsspezifitäten für RBCs der D- und Du-Variante als nützlich bei der Etablierung einer leichteren Identifizierung und Kategorisierung von Individuen, die solche Zellen besitzen (insbesondere schwangere Frauen der D- oder Du-Variante, die geeignete Kandidaten für eine prophylaktische anti-Rh(D)-Behandlung sind) sowie für die Bereitstellung weiterer Strukturinformation über den Rh(D)- Antigenkomplex.
Die Produktion menschlicher monoclonaler anti-Rh(D)-Antikörper wurde zuvor erzielt durch:
(a) direkte Clonierung von mit dem Epstein-Barr-Virus transformierten B-Lymphozyten-Zellinien (nachstehend als EBV-transformierte LCL bezeichnet), abgeleitet von B- Lymphozyten von anti-Rh(D)-positiven Spendern (vergleiche GB-A-2 127 434; Crawford et al. (1983) Lancet 1, 386-388 und Paire et al (1986) Immunol. Lett. 13, 137-141).
(b) Clonierung von Hybridomazellinien, die durch Fusion von anti-Rh(D)-produzierenden, EBV-transformierten LCL mit Maus-, Maus-Mensch- oder Mensch-Myeloma-Zellinien gebildet wurden (vergleiche die gleichzeitig anhängige britische Anmeldung Nr. 8 709 748, Thompson et al. (1986) Immunol. 58, 157-160 und die EP-A-0 162 918) oder
(c) durch Fusion einer menschlichen LCL mit B-Immunzellen (Lowe et al (1986) Vox. Sang. 51, 212-216).
Durch Clonierung von EBV-transformierten LCLs aus drei anti-Rh(D)-positiven Spendern konnten jedoch monoclonale anti-Rh(D)-Antikörper der IgG-Klasse erhalten werden, die ein besonders nützliches Bindungsspezifitätsspektrum zeigen, das für kein zuvor offenbartes monoclonales anti- Rh(D)-Antikörperreagens gezeigt wurde.
Erfindungsgemäß werden menschliche monoclonale Antikörper mit den folgenden wesentlichen Eigenschaften bereitgestellt:
(a) sie zeigen Aktivität gegen Rh(D)-Antigene, aber nicht gegen C-, c-, E- oder e-Antigene des Rh-Blutgruppensystems;
(b) sie sind IgG&sub1;-Proteine;
(c) sie besitzen leichte kappa-Ketten;
(d) sie sind vom Glm-(3)- oder Glm-(1, 17)-Allotyp;
(e) sie zeigen Aktivität gegen Du-Zellen in einem indirekten Antiglobulintest;
(f) sie zeigen Aktivität gegen Antigene der Variante DIV, DV und DVII; und
(g) sie sind gegen Antigene der Variante DVI oder DB inaktiv,
und antigenbindende Fragmente davon.
Solche monoclonalen Antikörper können als Routine-anti- Rh(D)-Reagentien verwendet werden, um RBCs als Rh(D+), Du oder Rh(D-) zu klassifizieren.
Zu diesem Zweck kann ein erfindungsgemäßer monoclonaler Antikörper entweder alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren weiteren anti-Rh(D)-Antikörpern, bevorzugt monoclonalen Antikörpern, mit einer oder mehreren weiteren Bindunsspezifitäten verwendet werden. So kann beispielsweise ein erfindungsgemäßer monoclonaler Antikörper vorteilhafterweise mit einem weiteren monoclonalen Antikörper mit der Fähigkeit, die DVI-Variante zu binden, vermischt werden, um ein anti-Rh(D)-Reagens breiterer Spezifität mit der Fähigkeit, RBCs der Variante DVI als D-positiv zu klassifizieren, bereitzustellen. In einem solchen anti-Rh(D)- Reagens kann ein erfindungsgemäßer IgG&sub1;-Antikörper, beispielsweise mit einem monoclonalen IgG&sub1;-Antikörper des in der gleichzeitig anhängigen Internationalen Anmeldung der genannten Erfinder (Publikationsnr. WO89/02443) des gleichen Datums mit den folgenden Bindungseigenschaften
(a) zeigt Aktivität gegen das Rh(D)-Antigen, aber nicht gegen die C-, c-, E- oder e-Antigene des Rh-Blutgruppensystems;
(b) zeigt Aktivität gegen Antigene der Variante DV, DVII, DVI und DB; und
(c) reagiert im wesentlichen nicht mit Nicht-Papain-behandelten CIV-Zellen in einem IAG-Test;
kombiniert werden.
Unter solchen Antikörpern ist für die Verwendung in Kombination mit einem erfindungsgemäßen monoclonalen anti-Rh(D)- Antikörper der monoclonale Antikörper mit der Bezeichnung B7, der bei der European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, U.K. unter der Hinterlegungsnr. ECACC 87091603 am 16. September 1987 hinterlegt wurde, bevorzugt.
Wenn die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper für die Rh-Typisierung parallel mit einem anti-Rh(D)-Reagens gegen die DVI-Variante, z.B. einem geeigneten polyclonalen anti- Rh(D)-Serum verwendet werden, kann vorhergesagt werden, daß diejenigen Blutproben, die ein positives Ergebnis in einem Agglutinationstest mit dem zuletzt genannten, aber negative Ergebnisse mit einem erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper ergeben, hauptsächlich oder vollständig der DVI-Kategorie angehören (da dies in der Tat das einzige Antigen der D-Variante ist, gegen das die neuen monoclonalen Antikörper nicht aktiv sind). Es wurde festgestellt, daß unter Individuen, die durch einen herkömmlichen Agglutinationstest als Rh(D+) oder Du klassifiziert wurden, die aber anti-Rh(D) bilden können, ein hoher Prozentsatz das Antigen der DVI-Variante besitzt (Mollison, P.L. (1983) in "Blood Transfusion In Clinical Medicine", Kap. 8, S. 339). Eine Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper ist in der Tat das Auftreten von Individuen des DVI-Typs in der Population zu untersuchen.
Ein erfindungsgemäßer monoclonaler Antikörper kann auch von speziellem Wert zur Verwendung in einem Reagens zu anti- Rh(D)-Typisierung sein, um die Spezifität eines anti-Rh(D) mit keiner oder nur schwacher anti-Du-Aktivität, d.h. eine nicht ausreichende Aktivität gegen Du-Zellen, um zuverlässig solche Zellen von D-negativen Zellen in einem herkömmlichen Agglutinationstest unterscheiden zu können, zu ergänzen. In der Tat ist es gemäß den FDA-Bestimmungen in den USA, die die handelsüblichen Reagentien zur anti-Rh(D)-Typisierung bestimmen, obligatorisch, daß ein solches Reagens Du-RBCs von echt D-negativen RBCs unterscheiden kann. Unter den erfindungsgemäßen anti-Rh(D)-Kombinationsreagentien sind solche Reagentien besonders bevorzugt, die die vorstehende Bedingung erfüllen, bei denen ein erfindungsgemäßes anti-Rh(D)-IgG zusammen mit anti-Rh(D)-IgM mit keiner oder nur schwacher Du-Aktivität verwendet wird, beispielsweise ein monoclonaler anti-Rh(D)-IgM, ausgewählt aus den monoclonalen IgMs der hinterlegten Hybridoma-Zellinien MAD-2 (ECACC 86041803) und FOM-1 (ECACC 87021301), die unter anderem Gegenstand der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung 0 251 440 sind. Ein solches Reagens wird vorteilhafterweise mit mindestens einem weiteren monoclonalen anti-Rh(D)-IgG-Antikörper komplettiert, der individuell Aktivität gegenüber den Du-Erythrozyten durch den indirekten Antiglobulintest zeigt, so, daß das Mischreagens im gleichen Test mit Du-, DIV-, DV- und DVI-Zellen reagiert. Wenn die Rh-Typisierung mit einem solchen Reagens durchgeführt wird, werden D-positive Zellen zuerst direkt durch das anti-Rh(D)-IgM agglutiniert. Die verbleibenden nicht-agglutinierten Zellen (offensichtlich D-negativ) können dann anschließend in echte D-negative und Du-Zellen durch Zugabe eines herkömmlichen Coomb's-Reagens für einen indirekten Antiglobulintest geteilt werden, wonach die Du-Zellen, die den IgG-Antikörper binden, agglutiniert und somit unterschieden werden.
Die erfindungsgemäßen monoclonalen anti-Rh(D)-Antikörper können nach herkömmlichen Methoden, die für die Produktion von monoclonalen Antikörpern bekannt sind und insbesondere durch die Züchtung von EBV-transformierten menschlichen B- Lymphozyten, ausgewählt auf der Basis der Sekretion eines anti-Rh(D)-Immunglobulins mit den vorstehend für die benötigten Antikörper dargelegten Eigenschaften, hergestellt werden. Die so erzeugten Kulturüberstände stellen einen weiteren Gesichtspunkt der Erfindung dar.
Es wurden nun ausführlich 9 clonierte EBV-transformierte LCLs untersucht, die monoclonale anti-Rh(D)-IgG&sub1;-Antikörper, wie vorstehend definiert, produzieren. All diese clonierten Zellinien wurden dadurch erhalten, daß mit peripheren B-Lymphozyten aus zwei ausgewählten anti-Rh(D)-Spendern begonnen und das in der GB-A-2 145 113 beschriebene Verfahren oder ein im wesentlichen ähnliches Verfahren verwendet wurde, um EBV-transformierte LCLs, die einen monoclonalen Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren, zu etablieren und zu clonieren (vergleiche Beispiel 1). Es wurde gefunden, daß sie in einer kontinuierlichen Kultur unter Verwendung von RPMI-1640-Medium, das mit 10% (Vol./Vol.) mykoplasmenfreiem fötalem Kälberserum, 0,2 mg/ml Arginin und Antibiotika zur Verhinderung des Mykoplasmenwachstums supplementiert war, überaus stabil sind und einen Kulturüberstand mit einem anti-Rh(D)-Titer, bestimmt durch einen indirekten Antiglobulin-(IAG-)Assay in einer Kochsalzlösung mit niedriger Ionenstärke gegenüber R&sub1;R&sub1;-(CDe/CDe)-RBCs, im Bereich von 2000-8000 ergeben. Ein solcher Kulturüberstand eignet sich zur Verwendung zur Rh-Typisierung ohne die Notwendigkeit der Konzentrierung und kann in der Tat für die Verwendung verdünnt werden. Es wurde gezeigt, daß vier der ausgewählten Zellinien (A1, A2 und A3, abgeleitet von einem Spender A) einen stabilen anti-Rh(D)-Titer in einer kontinuierlichen Kultur für über 2 Jahre aufrechterhalten. Vier weitere Zellinien, die den vorstehenden Kulturüberstand ergeben können (B1, B2, B3 und B11, abgeleitet von einem Spender B) wurden in einer kontinuierlichen Kultur über 8 Monate ohne wesentliche Abnahme des anti-Rh(D)-Titers gehalten. Die Eigenschaften der Antikörper-Produktion der vorstehend erwähnten spezifischen Clone in einer kontinuierlichen Kultur sind in den nachstehenden Tabellen IIIa und IIIb zusammengefaßt. Tabelle IIIa IAG-Titer (3% RBCs in Kochsalzlösung mit niedriger Ionenstärke) Zellen Mikrotiter bei Bromelain-behandelten Anti-Rh (D) Tabelle IIIb Kulturüberstand IAG-Reaktivität des Überstands mit 3% RBCs in Kochsalzlösung niedriger Ionenstärke. (Stufe 0 bis 6) RBC-Phänotyp
Es wurde weiter gefunden, daß die erfindungsgemäßen getesteten monoclonalen Antikörper nach dem IAG mit RBCs der Phänotypen R&sub2;rG-, hrs-, R&sub1;Rz und R&sub2;Rz reagierten, aber gegenüber r"Gr, rm, rG, r'sr, hrB-, r'wr und Rh33+ negativ sind.
Die Gm-Allotypisierung der Antikörper der Clone A1, A2, A3, B1, B2, B3, B11, B12 und B13 zeigte, daß sie in zwei Allotypgruppen fallen. Unter Verwendung der WHO-(1974)-Feststellung wurde gefunden, daß die anti-Rh(D)-IgG&sub1;-Antikörper der Clone A1, A2 und A3 dem Glm-(1, 17)-Allotyp angehören, wohingegen die Antikörper der verbleibenden vorstehend erwähnten Clone, die von dem Spender B abgeleitet sind, dem Allotyp Glm(3) angehören. Die zuletzt genannten Antikörper sind angesichts der Tatsache, daß sie ein monoclonales Antikörperpräparat zur Verwendung zur postpartalen Immunisierung von Rh(D-)-Müttern ergeben, besonders interessant. Im allgemeinen waren die Antikörper der Glm-(1, 17)-Allotypgruppe gegen das RN-Antigen aktiv, wohingegen diejenigen des Glm(3)-Allotyps nicht aktiv waren.
Anti-Rh(D)-IgG&sub1;-Antikörper sind im allgemeinen schlechte Promotoren der Phagozytose von Rh(D+)-RBCs durch Monozyten und Makrophagen. Es wurde jedoch gefunden, daß die anti- Rh(D)-IgG&sub1;-Antikörper des Glm(3)-Allotyps, zum Beispiel die IgG&sub1;-Antikörper der Clone B1, B2, B3, B11, B12 und B13, im Gegensatz zu den anti-Rh(D)-IgG&sub1;-Antikörpern des Glm(1,17)- Allotyps sehr effektiv bezüglich der Lyse sensibilisierter RBCs durch K-Lymphozyten in einem Antikörper-vermittelten Zellzytotoxizitäts-(ADCC)-Assay sind. Dies entspricht früher von Parinaud et al. berichteten Beobachtungen, daß die fötale Hämolyse bei mütterlichen IgG&sub1;-Antikörpern des Glm(4)-Allotyps, d.h. des Glm(3)-Allotyps gemäß der WHO- (1974)-Nomenklatur (Am. J. Obstet. Gynecol. (1985) 1111- 1115) schwerer ist.
So wird gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ein erfindungsgemäßer monoclonaler IgG&sub1;-Antikörper, bevorzugt ein erfindungsgemäßer monoclonaler Antikörper mit dem Allotyp Glm(3), zur Verwendung zur passiven Immunisierung einer Mutter der Rh(D)- oder D- oder Du-Vari ante nach der Geburt eines Rh(D+)-Kindes zur Verhinderung der Sensibilisierung der Mutter gegen das Rh(D)-Antigen bereitgestellt. Eine sterile Lösung eines solchen Antikörpers für die menschliche Injektion kann in jedem physiologisch verträglichen wäßrigen Medium, beispielsweise isotoner phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder Serum, formuliert werden. Alternativ kann der Antikörper in einer gefriergetrockneten Formulierung, die vor Gebrauch rekonstituiert wird, bereitgestellt werden. Um ein hocheffizientes prophylaktisches Präparat zur Verwendung zur Verhütung von HDN bereitzustellen, kann ein erfindungsgemäßer monoclonal anti-Rh(D)-Antikörper, insbesondere ein Antikörper des Glm(3)-Allotyps, zweckdienlicherweise mit einem oder mehreren weiteren anti-Rh(D)-Antikörper(n), beispielsweise einem oder mehreren weiteren anti-Rh(D)-Antikörper(n), die die Phagozytose von Rh(D+)-RBCs in vivo fördern, z.B. einen monoclonalen anti-Rh(D)-Antikörper der Subklasse IgG&sub3;, wie einem monoclonalen anti-Rh(D)-IgG&sub3;-Antikörper der gleichzeitig anhängigen Internationalen Anmeldung der Anmelder vom gleichen Datum (Publikationsnr. WO89/02600), auf deren Inhalt hiermit Bezug genommen wird, verwendet werden. Die vorstehend erwähnten anti-Rh(D)-IgG&sub3;-Antikörper sind beispielsweise der monoclonale Antikörper der hinterlegten Zellinie ECACC 87091606. Für die routinemäßige Verwendung umfaßt idealerweise ein erfindungsgemäßes prophylaktisches pharmazeutisches Präparat einen anti-DVI-Antikörper.
Gemäß einem noch weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Rh-Typisierung von RBCs bereitgestellt, bei dem ein erfindungsgemäßes monoclonales anti-Rh(D)-Immunglobulin verwendet wird. Das monoclonale Immunglobulin ist bevorzugt in einem Kulturüberstand vorhanden, der direkt oder üblicherweise nach Verdünnung verwendet werden kann. Besonders bevorzugt zur Verwendung zur Rh-Typisierung sind Kulturüberstände, die ein erfindungsgemäßes monoclonales anti-Rh(D)-Immunglobulin enthalten, das bei hoher Verdünnung, z.B. Verdünnung 1:1000, enzymbehandelte RBCs, die das Rh(D)-Antigen tragen, agglutiniert und im IAG-Test Du-RBCs, beispielsweise nach Verdünnung von 1:10, agglutiniert.
Wie vorstehend angegeben kann es zweckdienlich sein, einen erfindungsgemäßen IgG&sub1;-Antikörper mit einem oder mehreren weiteren monoclonalen anti-Rh(D)-Antikörper unterschiedlicher Spezifität, z.B. einem weiteren IgG&sub1;-Antikörper mit anti-DVI-Aktivität, zu vermischen. Geeignete Verdünnungsmittel umfassen physiologische Kochsalzlösung oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung, welche vorteilhafterweise Rinderserumalbumin und ein grenzflächenaktives Mittel oder Suspendiermittel, wie Tween 80 oder Methylcellulose enthält.
Die Zellinien A3 und B2 werden am 16. September 1987 bei der European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, U.K. unter der Hinterlegungsnr. ECACC 8709160 bzw. ECACC 87091604 hinterlegt.
Weitere Einzelheiten bezüglich der Herstellung der vorstehend genannten hinterlegten Zellinien der Erfindung und der identifizierenden Eigenschaft der Kulturüberstände, die durch kontinuierliche Kultur dieser erhalten werden, sind in Beispiel 1 der folgenden nicht-beschränkenden Beispiele angegeben.

BEISPIEL 1

(i) Etablierung und Clonierung einer anti-Rh(D)-produzierenden EBV-transformierten LCL

(a) Quellen der B-Lymphozyten

Spender A:

weiblich, immunisiert während ihrer ersten und einzigen Schwangerschaft (die zur Geburt eines normalen Rh(D+)-Kindes führte), aufgefrischt mit 0,5 ml gepackten Rh(D+)-(R&sub2;r)-RBCs 4 Jahre nach der Entbindung und eine Probe peripheren Bluts, erhalten 8 Tage nach der Auffrischung, als ihr Serum-anti D-Spiegel 60 I.E./ml betrug.

Spender B:

männlich, immunisiert zuerst durch Transfusion 1966, aufgefrischt 6mal seitdem und zuletzt aufgefrischt 13 Tage vor Spenden einer Leukozyten-Manschettenfraktion ("buffy coat"-Fraktion) (Leukozyten) 1985, als sein Serumanti-D-Spiegel 318 I.E./ml betrug.

(b) Etablierung der Zellinien

Mononukleäre Zellen aus peripherem Blut von Spender B wurden auf einem Lymphoprep (Nyegaard und Co.) getrennt, in Gegenwart von EBV (1 ml Kulturüberstand aus der filtrierten mykoplasmenfreien Zellinie B95-8 pro 10&sup7; Zellen) bei 37ºC 1 Stunde lang inkubiert und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Aliquote wurden entweder
(a) in Konzentrationen von 0,5 x 10&sup6; Zellen/ml in 2 ml Kavitäten unter Verwendung eines lymphoblastoiden Zellkulturmediums (RPMI-1640-Medium, das 10% (Vol./Vol.) mykoplasmenfreies fötales Kälberserum (FCS), 0,2 mg/ml Arginin, 100 I.E./ml Penicillin (Glaxo), 50 ug/ml Streptomycin (Glaxo), 25 I.E./ml Polymixin (Glaxo), 25 ug/ml Kanamycin (Gibco), 20 u1/ml Fungizon (Squibb), 25 ug/ml Gentamycinsulfat (Sigma) und 20 ug/ml Trobicin (UpJohn), supplementiert mit entweder 1% (Vol./Vol.) Phytohämagglutinin (PHA) oder 0,5 ug/ml Cyclosporin A (CsA) enthielt) plattiert; oder
(b) bezüglich Oberflächen-anti-D-positiver Lymphozyten durch Rosettenbildung mit Bromelain-behandelten OR&sub1;R&sub2; (CDe/cDE) RBCs vor der Ausplattierung, wie vorstehend, angereichert.
Vier Zellinien aus Spender B wurden etabliert: LCL und angereicherte LCL mit entweder anfänglicher PHA oder CsA-Supplementierung.
Die isolierten peripheren mononukleären Blutzellen aus Spender A wurden in ähnlicher Weise mit EBV infiziert. Nach Waschen mit PBS wurden die Zellen in Lymphoblastoid-Zellkultur-Medium, das mit 1% (Vol./Vol.) PHA supplementiert war, resuspendiert und in 2 ml Kavitäten über eine Feeder- Schicht aus peritonealen Mausmakrophagen verteilt.
Alle Kulturen wurden anschließend bei 37ºC in 5% CO&sub2;, 95% befeuchtete Luft, inkubiert. Das Medium wurde alle 3 bis 4 Tage gewechselt und nach 3wöchiger Kultur wurden die Zellen in 50-ml-Kolben überführt. Alle Zellinien (außer sie führten zu Clon B3) wurden durch Rosettenbildung in 3- 4wöchentlichen Intervallen angereichert.

(c) Clonierung

Die Zellen wurden in Grenzverdünnung zu 5 und 10 Zellen pro Kavität in Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten und flachem Boden über einer Feeder-Schicht aus peritonealen Mausmakrophagen (Doyle et al. (1985) Human Immunology 13, 199-209) ausplattiert. Die Kulturen wurden einmal wöchentlich eingespeist und nach 3-4 Wochen wuchsen anti-D-positive clonierte Zellen.

(d) Ableitung der Clone

Drei Clone, die einen anti-Rh(D)-Antikörper der IgG&sub1;-Subklasse (mit den Bezeichnungen A1, A2 und A3) ergaben, wurden aus den B-Lymphozyten des Spenders A abgeleitet. Die polyclonale Zellinie, die zu diesen Clonen führte, wurde mit PHA initiiert und anschließend bezüglich anti-Rh(D)-positiver Zellen durch 13malige Rosettenbildung vor der Clonierung angereichert.
Fünf weitere Clone, die einen anti-Rh(D)-Antikörper der Subklasse IgG&sub1; (mit der Bezeichnung B&sub1;, B&sub2;, B&sub3;, B11 und B12) ergaben, wurden von den B-Lymphozyten des Spenders B über eine mit PHA initiierte polyclonale Zellinie abgeleitet. B1 und B2 wurden von wiederholt (6x) durch Rosettenbildung ausgewählten Zellinien nach Etablierung einer LCL abgeleitet. B11 und B12 wurden von einer Zellinie nach nur zweifacher Rosettenbildung abgeleitet, und B3 wurde von einer ein Jahr lang ohne Rosettenbildung vor der Clonierung aufrechterhaltenen LCL erzeugt [es sollte darauf hingewiesen werden, daß B11 irrtümlicherweise in der Prioritätsanmeldung (GB-A-8 722 018) als C1 bezeichnet wurde].
Ein weiterer anti-Rh(D) -IgG&sub1;-produzierender Clon (B13) wurde über eine mit CsA supplementierte polyclonale Zellinie des Spenders B abgeleitet. Diese Zellinie wurde aus Lymphozyten, die bezüglich anti-Rh(D) unmittelbar nach der Transformation durch EBV ausgewählt worden waren, etabliert und anschließend wurde viermal eine erneute Rosettenbildung vorgenommen.
Die Ergebnisse der Analyse des Gewebstyps und des Karyotyps der vorstehend ausgewählten Zellinien sind in der nachstehenden Tabelle IV angegeben. Tabelle IV Zellinie Spender Geschlecht Gewebstyp Karyotyp Geschlechtschromosomen Ploidie Weiblich die meisten Zellen diploid Männlich

(e) Quantitative Bestimmung der anti-Rh(D)-Aktivität und von IgG in den Kulturüberständen

Die anti-Rh(D)-Aktivität in den Überständen wurde gegen British National Standards durch einen Autoanylasator quantitativ bestimmt. Der Mittelwert aus mindestens zwei Bestimmungen wurde berechnet. Die quantitative Abschätzung von IgG wurde durch einen ELISA (Modifikation des Verfahrens nach Wakefield et al. in Clin. Chim. Acta. (1982) 123, 303-310) mit mindestens acht Bestimmungen für jeden Überstand durchgeführt. Der beschichtende Antikörper (affinitätsgereinigtes Ziege-anti-menschliches IgG (Sigma)) wurde in einer Konzentration 1/200 in 0,05M Carbonatpuffer pH 9,6 verwendet. Die Überstände und der Standard (gereinigtes menschliches IgG (Sigma)) wurden in RPMI-1640 und 10% FCS verdünnt. Peroxidasekonjugiertes Ziege-anti- Mensch-IgG (Sigma) wurde 1/500 in PBS + 0,05% Tween 20 verdünnt, und das Substrat war TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin).
Nicht alle unter den verschiedenen Versuchsbedingungen etablierten Zellinien zeigten eine stabile Antikörperproduktion. Jedoch behielten alle Zellinien, die anschließend cloniert wurden, hohe Titer (über 1/33.000 gemäß Mikrotiter) an anti-D für über 6 Monate. Alle Clone aus diesen Zellinien waren bezüglich anti-D positiv und hielten ihre Titer über die Dauer der kontinuierlichen Kultur (A1, A2 und A3 - über 2 Jahre; B1, B2, B3 und B11 - über 8 Monate). Die Verdoppelungszeit betrug 3-7 Tage. Die Zellen wuchsen gut in der Suspensionskultur ohne Verlust der Antikörperproduktion.

(f) Bestimmung der Immunglobulinklasse und -subklasse

Ein Immundotassay (McDougal et al. (1983) J. IMM. Meth. 63, 281-290) wurde verwendet, um die Reaktion der an Nitrocellulose absorbierten monoclonalen anti-Rh(D)-Antikörper mit anti-IgG-, anti-IgM-, anti-kappa- und anti-lambda-Antiserum (Serotec) zu bestimmen; positive Reaktionen wurden mit Peroxidase-konjugiertem anti-Schaf-IgG (Serotec), gefolgt von einer Farbentwicklung mit 4-Chlor-1-naphthol, detektiert. Die IgG-Subklasse wurde durch Agglutination von anti-D-beschichteten RBCs durch polyclonale anti-Subklassen-Antikörper (Unipath) bewertet.
Das Vorhandensein einzelner getrennter Banden für Antikörper, abgeleitet aus den ausgewählten Zellinien, nach SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese war ein Nachweis für die Monoclonalität.

(g) SDS-Page und Western-Blotting

Iscov's-Überstände (serumfrei) wurden unter reduzierenden Bedingungen auf 15%igen Polyacrylamidgelen elektrophoretisch untersucht (Laemmli, Nature (1970) 227, 680-685). Die getrennten Proteine wurden dann elektrophoretisch auf Nitrocellulosemembranen (Burnette, Annals Biochem. (1981) 112, 195-203) überführt, die mit anti-IgG-Serum (Serotec) abgesucht wurden und wie vorstehend detektiert wurden.

h) Protein-A-Absorption

2 ml Volumina der Überstände wurden zweimal entlang einer 25-mm-(1 ml)-Säule aus Protein-A-Sepharose CL-4B (Sigma) laufengelassen, und die Absorption von anti-Rh(D) wurde durch Titration bewertet.

(i) Gm-Allotypisierung

Die RBCs wurden mit monoclonalen anti-(D)-Antikörpern beschichtet, und die Agglutination wurde unter Verwendung von Aufstellungen von Gm-Allotypisierungsreagentien (Birmingham oder Amsterdam) bewertet.
Die Gm-Allotypen der monoclonalen Antikörper der Clone A1, A2, A3, B1, B2, B3, B11, B12 und B13 zusammen mit anderen Eigenschaften sind in der nachstehenden Tabelle V angegeben. Tabelle V Identifizierung der Immunglobulinklasse, -subklasse und des Gm-Allotyps Monoclonaler Antikörper: Anti-IgG: anti-IgM: anti-kappa: anti-lambda: Schwere Kette Protein-A-Absorption: Gm-Allotyp: * nicht bestimmt

(ii) Serologie

Die anti-D-Titration wurde durch Zugabe von 50 ul einer 0, 1%igen Suspension Bromelain-behandelter OR&sub1;R&sub2;-(CDe/cDE)- Erythrozyten zu 50 ul Überstand, der im ganzen und zweifach reihenverdünnt verwendet wurde, in Mikrotiterplatten mit V- Kavitäten durchgeführt. Nach 6ominütiger Inkubation bei 37ºC und 3minütiger Zentrifugation bei 600 UpM wurden sie makroskopisch durch Neigen der Platte bei 70º und Ablaufenlassen der negativen Reaktion abgelesen. Der Grad der Agglutination wurde auf herkömmliche Weise eingeteilt, und die Titer sind als höchste Verdünnung, die die vollständige Agglutination ergibt, ausgedrückt (vergleiche Tabelle IIIa). Anti-D-Titer wurden auch durch den IAG-Test unter Verwendung von Kaninchen-anti-Mensch-IgG und 3% R&sub1;r-, R&sub1;R&sub1;-, R&sub1;ur- oder R&sub0;ur-Zellen in Kochsalzlösung mit niedriger Ionenstärke (LISS) bestimmt. Die anti-D-Aktivität der monoclonalen Antikörper gegen eine Aufstellung von Erythrozyten der D-Variante wurde auch unter Verwendung von Kochsalzlösung, Albumin, Papain und IAG-Tests (in LISS) bewertet. In einer getrennten Testreihe wurde die Reaktivität der monoclonalen anti-Ds von A1, A2, A3, B1, B3 und B11 mit Du-Erythrozyten (15 Sätze von R&sub1;ur-Zellen und 10 Sätze von R&sub2;ur-Zellen, wobei jeder Satz einem anderen Individuum entnommen wurde) durch den IAG (in LISS) unter Verwendung unbehandelter Überstände bewertet. Unter Verwendung des gleichen Verfahrens wurde der Kulturüberstand von B1 weiter mit dem Kulturüberstand von B2 gegen einen Satz von R&sub1;ur-Zellen und drei Sätze von R&sub0;ur-Zellen verglichen. Die Überstände wurden auf einem Technicon-Autogrouper 16c in Verdünnungen im Bereich zwischen 1:5 bis 1:10.000 getestet.
Tests gegen die Zellen "normaler" Rh(D)-positiver oder Rh(D)-negativer Phänotypen durch Albumin, Papain und indirekte Antiglobulintechniken zeigten, daß alle monoclonalen IgG&sub1;-Antikörper eine Spezifität für das D-Antigen zeigten (vergleiche die nachstehende Tabelle VI). Keiner der monoclonalen anti-D-Antikörper reagierte auf Kochsalzlösung. Bei Test mittels IAG gegen "Teil"-D-positive Zellen agglutinierten die Antikörper DIV-, DV- und DVII-Erythrozyten, aber nicht DVI oder DB (vergleiche die nachstehende Tabelle VII). Wie in der Tabelle VIII gezeigt, wurde gefunden, daß die Überstände von A1, A2, A3, B1, B3 und B11 alle eine stärkere Reaktivität durch die IAG-Tests mit 25 Du-Zellen (d.h. schwach D) zeigen, als das polyclonale Antiserum (das Routinereagens, das vom South Western Regional Transfusion Service im U.K. verwendet wird). Unter Verwendung des gleichen IAG-Testverfahrens wurde gefunden, daß der Kulturüberstand von B1 eine ähnliche oder identische Reaktivität mit dem Kulturüberstand von B2 gegen vier weitere Reihen von Du-Zellen zeigt (vergleiche Tabelle IX). Alle monoclonalen IgG&sub1;-Antikörper reagierten stärker mit R&sub1;r-(CDe/cde)- oder R&sub1;R&sub1;-(CDe/CDe)-Zellen als mit entweder Du- oder DV-Zellen, obwohl es einige Titerunterschiede zwischen den Überständen gab. Bei getrenntem Test auf einem Technicon Autogrouper 16C konnten Überstände von A2, B1 und B11 in einer Verdünnung von 1:1000 zur Verwendung als Routine-anti-D und in einer Verdünnung von 1:10 zur Unterscheidung von Du von den negativen Zellen verwendet werden. Tabelle VI Serologie der monoclonalen anti-Rh(D)-Antikörper RBC-Phänotyp Kochsalzlösung 37º: Albumin 37ºC: Papain 37ºC: IAG: (Stufen: 0 bis 5) Tabelle VII Reaktion monoclonaler anti-Rh(D)-Antikörper mit "Teil"-D-positiven RBCs durch IAG Monoclonaler Antikörper: (Stufen: 0 bis 5) Tabelle VIII Reaktivität monoclonaler und polyclonaler anti-Ds mit Du-RBCs durch IAG (15 R&sub1;ur und 10 R&sub2;ur) Monoclonaler Antikörper: Polyclonales anti-Rh(D)-Serum Anzahl mit Stufe Tabelle IX Monoclonaler Antikörper (Titer gemäß IAG)

(iii) Lymphozyten ADCC-Assay

Gleiche Volumina (50 ul) der Zielzellen (Chrom-51 markierte R&sub1;R&sub1;-RBC-Suspension), Effektor-Zellen (K-Lymphozyten) und anti-D-Kulturüberstand wurden über Nacht bei 37ºC in Mikrotiterplatten nach sanfter Zentrifugation inkubiert, und die Freisetzung von Chrom-51 wurde gemessen (Urbaniak (1979) Br. J. Haematol. 42, 303-314). Das Verhältnis von Effektor- Zelle zu Zielzelle betrug 15:1. Es wurde gefunden, daß die Kulturüberstande der Clone B1, B2, B3, B11, B12 und B13, die einen monoclonalen anti-Rh(D)-Antikörper des Glm(3)-Allotyps enthielten, im Gegensatz zu den anderen Kulturüberständen mit dem Antikörper des Glm(1,17)-Allotyps hochaktiv bezüglich der Vermittlung der Lyse sensibilisierter RBCS in Gegenwart von K-Zellen waren (vergleiche die nachstehende Tabelle X). Tabelle X Monoclonaler Antikörper: anti-Rh(D)-Serum % spezifische Lyse: Effektor * nicht bestimmt

(iv) Assay auf die Rosettenbildung von U937-Monozyten und Phagozytose-Assay

100 ul gepackte OR&sub1;R&sub2;-RBCs wurden mit 50 ul anti-Rh(D) (zuvor auf 1 ug/ml eingestellt) bei 37ºC 60 Minuten lang sensibilisiert, gewaschen und in einer Konzentration von 1 x 10&sup8; Zellen/ml in RPMI resuspendiert. Die U937-Zellen wurden in der log-Phase des Wachstums entnommen und zwei Tage lang entweder in Anwesenheit oder Abwesenheit von Interferon-γ (Amersham) in einer Konzentration von 50 E/ml gezüchtet. 45 x 10&sup6; RBCs wurden dann zu einem Pellet aus 1,5 x 10&sup6; U937-Zellen gegeben und vermischt, wodurch ein Verhältnis von 30:1 erhalten wurde. Für den Rosettenbildungsassay wurden die Zellen 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, 3 Minuten bei 600 UpM zentrifugiert und nach weiteren 5 bis 20 Minuten in einem Hämozytometer untersucht. Die Phagozytose wurde unmittelbar nach der Inkubation der Zellen bei 37ºC für 3 Stunden untersucht. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der Monozyten mit einem oder mehreren anhaftenden oder phagozytosierten RBCs ausgedrückt.
Ein Vergleich der mit Kulturüberständen der Clone A1, A2, A3, B1, B3 und B11 erhaltenen Ergebnisse und der Ergebnisse mit einem herkömmlichen polyclonalen anti-Rh(D)-Serum ist in den Figuren 1 und 2 gezeigt.

(v) Makrophagen-Bindungsassay

RBCs (R&sub2;r) (1 Volumen) wurden mit monoclonalem anti-Rh(D) (2 Volumina unbehandelter Kulturüberstand) sensibilisiert und mit von Monozyten abgeleiteten gezüchteten Makrophagen inkubiert. Die Makrophagen wurden mit 500 E/ml rekombinantem Immuninterferon (Biogen, Genf) während der 48 Stunden vor ihrer Verwendung bei dem Assay stimuliert. Die Bindung der RBCs an die Makrophagen wurde mikroskopisch bewertet und als Makrophagen-Bindungsindex (= Anzahl der an 100 Makrophagen befestigte oder davon verdaute Erythrozyten) ausgedrückt.
Die nachstehende Tabelle XI zeigt die mit Kulturüberständen der Clone A1, A2, A3, B1, B3 und B11 erhaltenen Ergebnisse. Die Fähigkeit dieser Überstände, eine RBC-Makrophagen-Wechselwirkung herbeizuführen, war sehr schlecht, verglichen mit der des polyclonalen anti-Rh(D)-Serums (anti-Rh(D) - 43 I.E./ml), das als positive Kontrolle diente. Tabelle XI Quelle von anti-Rh(D) polyclonales anti-Rh(D)-Serum Makrophagen-Bindungsindex

BEISPIEL 2

Lösung für die Rh(D)-Phänotypisierung von RBCs

Im allgemeinen ist es für den vorstehenden Zweck bevorzugt, ein Gemisch eines erfindungsgemäßen monoclonalen anti- Rh(D)-Antikörpers (z.B. B11) zusammen mit einem weiteren monoclonalen IgG-Antikörper mit anti-DVI-Aktivität, beispielsweise dem monoclonalen Antikörper der Zellinie B7 (ECACC 87091603) der gleichzeitig anhängigen Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB88/00757 (Publikationsnr. W089/02443) des gleichen Datums der genannten Erfinder, auf deren Inhalt hiermit Bezug genommen wird, zu verwenden.

Lösung für die manuelle Verwendung

Das abschließende Gemisch beträgt 1:1:1 B11:B7: Verdünnungsmittel

Verdünnungsmittel

100 ml 30%iges Rinderserumalbumin
2,42 g KH&sub2;PO&sub4;
2,77 g Na&sub2;HPO&sub4; 2H&sub2;O
4,50 g NaCl
0,2 ml Tween 20
1,00 g NaN&sub3;
auf 1,0 1 mit destilliertem Wasser: pH 6,8
Diese Gemisch kann in allen manuellen Tests zur D- und Du-Typisierung, z.B. Mikrotiter, Mikroplatte, IAG, verwendet werden.
Ein Gemisch aus 1:1:2 B11:B7:Verdünnungsmittel kann auch verwendet werden.

Gemisch für die maschinelle Verwendung

Dieses Gemisch kann beispielsweise in einem Technicon-Autogrouper 16C verwendet werden.
Vorgemischte Reagentien B11:B7 1:1
Für die D-Phänotypisierung (D-positiv gegenüber D-negativ) umfaßt die Lösung 1:1000 Gemisch:Verdünnungsmittel und für die Du-Bestimmungen (Du gegen D-negativ) umfaßt die Lösung 1: 5 Gemisch:Verdünnungsmittel.

Verdünnungsmittel:

2% Rinderserumalbumin in einer 1,3%igen physiologischen Kochsalzlösung, die 13,5% Methylcellulose enthält
Der monoclonale Antikörper B7 kann auf ähnliche Weise mit anderen erfindungsgemäßen Antikörpern vermischt werden, beispielsweise den monoclonalen Antikörpern der hinterlegten Zellinien A3 (ECACC 87091605) und B2 (ECACC 87091604), wodurch ein anti-Rh(D)-Reagens mit breiter Spezifität auf die Antigene der verschiedenen D-Variante, einschließlich DVI, und mit Aktivität gegen Du-Zellen in einem IAG-Test erhalten wird.

Claims

1. Menschlicher monoclonaler Antikörper mit den folgenden wesentlichen Eigenschaften:

(a) er zeigt Aktivität gegen das Rh(D)-Antigen, aber nicht gegen die C-, c-, E- oder e-Antigene des Rh-Blutgruppensystems;

(b) er ist ein IgG&sub1;-Protein;

(c) er besitzt leichte kappa-Ketten;

(d) er gehört dem Glm (3)- oder Glm (1, 17)-Allotyp an;

(e) er zeigt in einem indirekten Antiglobulintest Aktivität gegen Du-Zellen;

(f) er zeigt Aktivität gegen die Antigene der Variante DIV, DV und DVII; und

(g) er ist gegen die Antigene der Variante DVI oder DB inaktiv,

und antigenbindende Fragmente davon.

2. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1, ausgewählt aus den monoclonalen Antikörpern der Zellinien ECACC 87091605 und ECACC 87091604.

3. Anti-Rh(D)-Reagens, wobei ein monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder 2 mit einem oder mehreren weiteren anti-Rh(D)-Antikörper(n) mit einer oder mehreren zusätzlichen Bindunsspezifität/spezifitäten kombiniert ist.

4. Anti-Rh(D)-Reagens nach Anspruch 3, wobei ein monoclonaler Antikörper mit der Fähigkeit, die DVI-Variante zu binden, vorhanden ist.

5. Anti-Rh(D)-Reagens nach Anspruch 3, wobei die Antikörperkomponente umfaßt:

(a) einen monoclonalen Antikörper nach Anspruch 1, und

(b) ein anti-Rh(D)-IgM mit keiner oder nur schwacher anti-Du-Aktivität.

6. Anti-Rh(D)-Reagens nach Anspruch 5, wobei die Antikörperkomponente zusätzlich ein monoclonales anti-Rh(D)-IgG mit der Fähigkeit, Aktivität gegen die DVI-Zellen in einem indirekten Antiglobulintest zu zeigen, umfaßt.

7. Anti-Rh(D)-Reagens nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Komponente (b) aus den monoclonalen IgMs der hinterlegten Hybridomazellinien MAD-2 (ECACC 86041803) und FOM-1 (ECACC 87021301) ausgewählt ist.

8. Menschliche Lymphozyten-abgeleitete Zellinie mit der Fähigkeit, einen monoclonalen Antikörper nach Anspruch 1 zu produzieren.

9. Zellinie nach Anspruch 8, ausgewählt aus ECACC 87091605 und ECACC 87091604.

10. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung zur passiven Immunisierung zur Verhütung der Hämolysekrankheit des Neugeborenen.

11. Kulturüberstand, erhalten durch Züchten einer Zellinie nach Anspruch 8 oder 9.

12. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 10 des Glm(3)- Allotyps.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung zur passiven Immunisierung zur Verhütung der Hämolysekrankheit des Neugeborenen, umfassend einen monoclonalen Antikörper nach Anspruch 1 oder 2 zusammen mit einem physiologisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel

14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei der monoclonale Antikörper dem Glm(3)-Allotyp angehört.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Antikörperkomponente zusätzlich einen monoclonalen Antikörper mit der Fähigkeit, die DVI-Variante zu binden, umfaßt.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei die Antikörperkomponente einen oder mehrere anti-Rh(D)-Antikörper der IgG&sub3;-Subklasse umfaßt.

17. Verfahren zur Rh-Typisierung, wobei ein monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder 2 oder ein anti-Rh(D)-Reagens nach einem der Ansprüche 3 bis 7 verwendet wird, wobei der monoclonale Antikörper oder das Reagens in Form einer wäßrigen Lösung vorliegt.

18. Zusammensetzung, umfassend einen monoclonalen Antikörper nach Anspruch 1 zusammen mit einem monoclonalen anti-Rh(D)-Antikörper der IgG&sub3;-Subklasse.