DE4224357C2 - Arzneimittel zur Prophylaxe von HDN, enthaltend menschliche monoclonale anti-Rhesus (D)-Antikörper - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Arzneimittel, enthaltend menschliche monoclonale Antikörper gegen das Rhesus(D)-Antigen, das auf der Oberfläche von roten Blutzellen exprimiert wird. Diese Antikörper werden durch Hybridom-Zellinien produziert, die man entweder durch die Fusion einer Maus-Myelom- oder einer menschlichen/Maus- Heteromyelom-Zellinie mit menschlichen B-Lymphocyten erzeugt, die man von Rhesus (D)-negativen Spendern, die gegen Rhesus(D)-positive Zellen immunisiert sind, erhält. Die erfindungsgemäßen Antikörper können prophylaktisch zur passiven Immunisierung von Rhesus-negativen Frauen vor oder unmittelbar nach der Geburt eines Rhesus-positiven Kindes verwendet werden, um eine hämolytische Erkrankung des Neugeborenen (hemolytic disease of the newborn; HDN) während nachfolgender Schwangerschaften zu verhindern.

Rhesus-Antigene stellen eine Gruppe verwandter auf der Oberflächenmembran von roten Blutzellen exprimierter Moleküle dar. Das wichtigste Mitglied dieser Gruppe ist das D-Antigen, das hochimmunogen ist und zu schweren hämolytischen Reaktionen im Fall einer Inkompatibilität von übertragenem Blut führen. Verschiedene Kombinationen dieser Antigene legen die Blutgruppen fest, die nach dem Fisher- Race-System (Issitt, 1988) klassifiziert werden.

Das D-Antigen unterteilt man in eine Anzahl von Kategorien, die sogenannten Partial-Ds. Das D-Antigen enthält mindestens 7 überlappende Epitope. Den D-Kategorien fehlt/fehlen mindestens eines oder mehrere dieser Epitope (Lomas et al., 1989).

Diese Varianten des D-Antigens, die serologisch definiert sind, sind selten (Tippett, 1988). Weltweit ist über mehr als 100 Fälle berichtet worden, und für einige Kategorien sind nur eine Handvoll Fälle bekannt.

Antikörper gegen das D-Antigen sind von großer Wichtigkeit. Erstens können sie für diagnostische Zwecke und Hämagglutinationstest zur Blutbestimmung und zum Nachweis seltener D-Varianten verwendet werden. Zweitens können sie therapeutisch zur Beseitigung potentiell immunogener D-posi­ tiver (D+) roter Blutzellen verwendet werden. Die letztere Verwendung beinhaltet die passive Immunisierung von D-negativen (D-)-Frauen, die ein (D+)-Kind tragen, um die Sensibilisierung solcher Mütter zu verhindern, die, wenn sie stattfindet, in nachfolgenden Schwangerschaften zu HDN führen könnte.

Es sind monoclonale anti-D-Antikörper entwickelt worden, um polyclonale Antikörper zu ersetzen, die aus einem einzelnen Blutserum oder vereinigten Blutseren erhalten wurden. Sowohl Maus- als auch menschliche monoclonale Antikörper, sowohl IgG als auch IgM sind für die Diagnose entwickelt worden, aber menschliche monoclonale IgG-Antikörper für die Routinetherapie (Rhesus-Prophylaxe) werden noch nicht verwendet. Solche monoclonalen Antikörper bieten eine Reihe von Vorteilen. Sie sind bei vernünftigen Kosten in großen Mengen erhältlich. Es läßt sich sicherstellen, daß das Produkt vor viraler Kontamination geschützt ist. Man vermeidet die Abhängigkeit von Blutspenden mit dem Risiko einer viralen Kontamination. Es ist sichergestellt, daß die Qualität der monoclonalen Antikörper aufrechterhalten wird.

Es gibt eine Reihe von vorveröffentlichten Berichten über die Etablierung von Zellinien, die menschliche monoclonale IgG-Antikörper gegen das Rhesus(D)-Antigen produzieren (Boylston et al., 1980; Koskimies, 1980; Crawford et al., 1983; Bron et al., 1984; Doyle et al., 1985; Melamed et al., 1985; Thompson et al., 1986; Foung et al., 1987; Goosens et al., 1987; Kumpel et al., 1989a). Bei dem angewandten Verfahren wird eine Transformation von B-Lymphocyten mit Epstein-Barr-Virus mit oder ohne eine nachfolgende Fusion mit einer Myelom- oder Lymphoblastoid-Zellinie vorgenommen. Auf solche monoclonalen Antikörper und die Zellinien bezugnehmende Patentanmeldungen sind eingereicht oder erteilt worden (Roder, 1981; Crawford, 1982; Kaplan et al., 1984; Ono et al., 1983; Hughes-Jones et al., 1986 (a, b); De Burgh Bradley et al., 1987 (a, b, c); Saito et al., 1988).

Es ist offensichtlich geworden, daß die IgG-Untergruppe bezüglich ihrer Verwendung bei der Rhesus-Prophylaxe eine wichtige Rolle bei der Auswahl eines wirksamen monoclonalen Antikörpers spielt. Es ist bekannt, daß wirksame polyclonale anti-D-Präparationen sowohl IgG1- als auch IgG3-Untergruppen enthalten (Shaw et al., 1988). Es gibt eine Reihe von Berichten, die zeigen, daß ein monoclonaler IgG3-Antikörper in vitro wirksamer als ein monoclonaler IgG1-Antikörper als Vermittler bei der Bindung von Monocyten und Macrophagen ist, die zur Phagocytose von sensibilisierten roten Zellen führt (Urbaniak und Greiss, 1980; Wiener et al., 1987; Zupanska et al., 1987; Rozusnyay et al., 1989; Brojer et al., 1989; Hadley und Kumpel, 1989). Im Gegensatz dazu wurde berichtet, daß IgG1 in einigen Fällen wirksamer als IgG3 für die Vermittlung von Antikörper-abhängiger Zell-vermittelter Cytotoxizität (antibody dependent cell cytotoxicity; ADCC) in vitro ist (Kumpel et al., 1989b). Es gibt eine Reihe von Berichten über eine in vivo Beziehung zwischen der Untergruppe maternaler anti-D-Antikörper und der Schwere von HDN , d. h. der Fähigkeit, (D+)-rote Zellen zu zerstören. Die Schwere dieser Krankheit scheint mit der Anwesenheit von IgG1 zu korrelieren (Parinaud et al., 1985; Zupanska et al., 1989; Pollock und Bowman, 1990). Fälle von IgG3 alleine standen in keiner Beziehung zu einer schweren Erkrankung. Es wurde ein Fall berichtet, bei dem der einzige maternale anti-D-Antikörper IgG1 war. Es wurden aber keine Symptome der Krankheit gefunden (Eklund et al., 1988). Kürzlich wurde berichtet, daß ein monoclonaler anti-D-Antikörper der Untergruppe IgG3 der wirksamste für die in vivo-Zerstörtung von (D+)-roten Zellen war (Thomson et al., 1990).

Obwohl eine Reihe von Faktoren, die die Wirksamkeit einer Rhesus-Prophylaxe beeinflussen, bekannt ist, und obwohl eine Reihe monoclonale Antikörper produzierender Hybridome etabliert worden sind, gibt es dennoch Bedarf für eine Verbesserung der Art und Weise einer Rhesus-Prophylaxe und -Diagnose.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, monoclonale Antikörper und Kombinationen dieser monoclonalen Antikörper zur verbesserten und verläßlichen Rhesus- Prophylaxe und zum Nachweis von Rhesus-D-Antigen bereitzustellen. Die Lösung dieser technischen Aufgabe wird erzielt durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit Arzneimittel zur Prophylaxe von Hämolyse-Erkrankung Neu­ geborener (hemolytic disease of the newborn; HDN), die ein Gemisch aus mindestens zwei menschlichen, aus nicht EBV-transformierten Heterohybridomen stammenden monoclo­ nalen Antikörpern enthalten, wobei

• (a) jeder der monoclonalen menschlichen Antikörper das D-, nicht aber das C-, c-, E- und e-Rhesus-Antigen erkennt;
• (b) die Kombination der monoclonalen menschlichen Anti­ körper die Partial-D-Antigen-Kategorien IIIa, IIIc, IVa, Va und Vc, nicht aber die Kategorie VI erkennt; und wobei
• (c) mindestens einer der monoclonalen menschlichen Anti­ körper zur Untergruppe IgG3 gehört.

In einer bevorzugten Ausführungsform gehört mindestens einer dieser monoclonalen menschlichen Antikörper der Untergruppe IgG1 an.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform gehören diese monoclonalen Antikörper der Untergruppe IgG3 an, wobei ihre leichte Kette vom Typ κ ist.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Arzneimittel, wobei die leichte Kette des monoclonalen menschlichen Antikörpers der Untergruppe IgG1 vom κ-Typ ist.

Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Arzneimittel, wobei der monoclonale menschliche Antikörper der Untergruppe IgG1 zum Allotyp Glm(3) gehört.

Diese monoclonalen Antikörper sind gegenüber denen aus dem Stand der Technik dadurch vorteilhaft, daß sie nicht aus Blutplasma mit einer möglichen viralen Kontamination abgeleitet sind. Die betreffenden Zellinien sind stabil und produzieren große Mengen Antikörper mit gleichbleibender Qualität ohne Virus-Kontamination. Diese monoclonalen Antikörper besitzen eine hohe Affinität für das D-Antigen. Sie erkennen (D+)-rote Zellen von mehr als 15 000 getesteten Blutspendern. Sie erkennen die D-Kategorien mit Ausnahme der Kategorie VI.

Maus-/menschliche Heterohybridome, die die genannten monoclonalen Antikörper produzieren, wurden bei der "Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen" unter den Hinterlegungsnummern ACC 2039 und ACC 2040 hinterlegt.

In einem bevorzugten Verfahren werden die Maus-/menschlichen Heterohybridome, welche die in den erfin­ dungsgemäßen Arzneimitteln enthaltenen monoclonaten menschlichen Antikörper produzieren, durch Fusion menschlicher B-Lymphocyten mit Myelomzellen hergestellt, ohne eine vorherige Immortalisierung durch EBV-Infektion vorzunehmen. Alle Veröffentlichungen über das Etablieren stabiler anti-D-IgG-produzierenden Hybridome betreffen eine Transformation durch EBV. Das Verfahren zur Produktion monoclonaler anti-Rhesus-D-Antigen-Antikörper ist deshalb besonders vorteilhaft, weil es monoclonale Antikörper bereitstellt, die frei von jeder potentiellen mit der durch EBV-transformierten Zellinien assoziierten Gefahr sind. Eine potentielle Gefahr ist die Kontamination des den Antikörper enthaltenden Überstandes durch Viruspartikel während des Züchtens.

Die monoclonale Antikörper enthaltenden erfindungsgemäßen Arzneimittel lassen sich in der Rhesus-Prophylaxe, z. B. bei der Prophylaxe von HDN, verwenden. Diese die anti-D-IgG1- und IgG3-Antikörper enthaltenden erfindungsgemäßen Arzneimittel stellen ein Mittel zur Rhesus- Prophylaxe bereit, das sowohl pharmazeutisch verträglich und auch hoch wirksam in der Lyse (D+)-roter Blutzellen ist. Dieses erfindungsgemäße Arzneimittel ist den Arzneimitteln aus dem Stand der Technik überlegen. Plasma-abgeleitete anti-D-Zusammensetzungen sind IgG-Gemische verschiedener Spezifitäten, und die meisten können nur intramuskulär verabreicht werden. Ein monoclonaler anti-D dagegen ist eine reine monospezifische IgG-Präparation für die intravenöse Verabreichung. Die in-vitro Wirksamkeit von monoclonalem anti-D-Antikörper ist gleich groß oder größer wie/als die von polyclonalen Präparationen.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Arzneimittel gleiche Mengen IgG1- und IgG3-Antikörper. Zusammensetzungen, bei denen der IgG3-Gehalt 100% oder geringer als 50% war, waren weniger wirksam (Tabelle I).

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Arzneimittel, wobei der monoclonale menschliche Antikörper der Untergruppe IgG1 der durch das Hybridom 190/31 (Hinterlegungsnummer DSM ACC 2039) produzierte Antikörper ist.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft Arzneimittel, wobei der monoclonale menschliche Antikörper der Untergruppe IgG3 der durch das Hybridom P3x229 14G4 (Hinterlegungsnummer DSM ACC 2040) produzierte Antikörper ist.

B-Lymphocyten wurden aus peripheren Blutzellen von gesunden D-Spendern erhalten, die mit (D+)-roten Blutzellen immunisiert worden waren. Die Lymphocyten wurden unter Anwendung des Polyethylenglycol-Verfahrens (Gefter et al., 1977) direkt entweder mit einer Maus-Myelom- oder einer menschlich/Maus-Heteromyelom-Zellinie fusioniert. Die erhaltenen Hybridome wurden mit Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) enthaltendem Kulturmedium selektioniert und durch Agglutination von Papain-behandelten (D+)-roten Zellen auf die Produktion von spezifischen Antikörpern hin abgesucht. Von positiven Clonen wurden sowohl Antikörper des IgG- als auch des IgM-Typs produziert. Für die weiteren Experimente waren aber wegen der Wirksamkeit des aus Hyperimmunserum abgeleiteten IgGs zur Rhesus-Prophylaxe nur IgG-produzierende Clone von Interesse. Die Clone wurden in einem Medium, das 10% fötales Kälberserum enthielt, kultiviert. Es wurde festgestellt, daß sie bezüglich Wachstum und Antikörperproduktion unstabil waren. Sie wurden deshalb einige Male nach dem Grenz-Verdünnungsverfahren (Lefkovits et al., 1979) subcloniert. Die Antikörpersekretion wurde mit einem für den Nachweis von menschlichem IgG spezifischen ELISA gemessen. Um in den die anti-D-Antikörper enthaltenden Zellüberständen Rinderproteine, einschließlich Rinder-IgG zu beseitigen, wurden die Zellinien an serumfreies Kulturmedium angepaßt. Angepaßte Zellinien wurden weiter re-cloniert, bis stabile Zellinien etabliert waren. Das Kulturmedium wurde so an die speziellen Zellinien angepaßt, daß optimale Wachstums- und Produktionsbedingungen gesichert waren. Es wurden Grammengen hergestellt und mit etablierten chromatographischen Verfahren gereinigt.

Die Eigenschaften der anti-D-Antikörper sind in Tabelle I zusammengefaßt. Die Charakterisierung wurde wie folgt durchgeführt:

Die IgG-Untergruppe wurde durch Untergruppen-spezifische anti-Globulin-Tests ermittelt. Es wurden nur IgG1- und IgG3- Untergruppen gefunden. Der Allotyp wurde bestimmt (Grubb, 1970). Die Erkennung einer Gruppe von (D+)-roten Zellen, einschließlich seltener Varianten wie D^u und Partial-Ds (Tippett, 1988) wurde untersucht. Die Fähigkeit, Komplement zu binden und Zellyse zu vermitteln, wurde geprüft. Nach dem Verfahren von Rochna und Hughes-Jones (1965) wurde die Bindungsaffinität der Antikörper (K_a) bestimmt. Es wurden funktionelle Tests durchgeführt, um die Fähigkeit der Antikörper zu bestimmen, (D+)-rote Zellen nach den Mechanismen von ADCC (Samdal et al., 1988) oder Phagocytose durch Monocyten oder Makrophagen (Brojer et al., 1989) zu vermitteln.

Die Auswahl von Antikörpern zur in vivo Prophylaxe beruhte auf den folgenden Kriterien. Die sie produzierenden Zellinien müssen stabil sein und eine hohe Produktionsrate aufweisen. Ihr Erkennungsspektrum von D-Antigen-Varianten muß so breit wie möglich sein. Ihre Bindungsaffinitäten müssen hoch sein. Sie müssen alleine oder in Kombination in der Lage sein, die Beseitigung roter Zellen zu vermitteln. Die Beziehung zwischen IgG-Untergruppe und Wirksamkeit und pharmazeutischer Akzeptanz muß genau untersucht sein.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1: Produktion monoclonaler anti-D-Antigen-Antikörper durch die Hybridome 190/31 und P3x229 14G4. Menschliches IgG wurde durch einen ELISA bestimmt und die tägliche Produktionsrate über eine Dauer von 6 Wochen wurde ausgedrückt als die Menge IgG in Mikrogramm, die von 10⁵ Zellen produziert werden.

Fig. 2: Die Bindung von monoclonalem anti-D-Antikörper an Rh(D)-positive rote Blutzellen. Eine 0,2%ige Suspension roter Zellen in 500 µl wurde mit verschiedenen Konzentrationen IgG3 (P3x229 14G4 oder mit einer sättigenden Konzentration von IgG3, zusammen mit unterschiedlichen Konzentrationen von IgG1 (190/31) inkubiert. Die Menge von gebundenem IgG wurde durch die Bindung von ¹²⁵J-markiertem Ziegen-anti-Human-IgG bestimmt. Die Menge des gebundenen anti-D-Antikörpers wurde gegen die Konzentration von IgG3 oder IgG1 aufgetragen. Es gab eine partielle additive Wirkung, wenn IgG1 zu einer Sättigungskonzentration von IgG3 zugefügt wurde. An die roten Blutzellen wurden 18% mehr Antikörper gebunden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

Beispiel 1 a) Quelle für die B-Lymphocyten

Periphere Blut-Lymphocyten (PBL) wurden aus Blutzellen eines 42 Jahre alten normalen gesunden Rhesus(D)-negativen männlichen Spenders isoliert, der 14 Tage zuvor mit Rhesus(D)-positiven roten Zellen immunisiert worden war. Die roten Zellen wurden von einem normalen gesunden männlichen Spender erhalten.

Die PBL wurden durch Zentrifugation der Blutzellen durch ein jodiniertes Dichtegradientenmedium mit der Dichte 1,077 g/ml (Lymphoflot, Biotest) isoliert.

b) Etablieren der Antikörper-produzierenden Zellinien

7,5 × 10⁷ PBL wurden mit einer gleichen Anzahl einer menschlichen/Maus-Heteromyelom-Zellinie (HM22) vermischt und in Anwesenheit von Polyethylenglycol (PEG) fusioniert. Zellen wurden im Kulturmedium (Hybridominedium, Biochrom, Berlin), das 20% fötales Kälberserum und zur Selektion des Hybridom-Wachstums Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) enthielt, auf Mikrotiterplatten mit 1 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung verteilt. Kulturen wurden bei 37°C in einer feuchtigkeitsgesättigten Atmosphäre mit 7,5% CO₂ in der Luft inkubiert. Nach 2 Wochen wurden die Vertiefungen mit wachsenden Clonen auf die Produktion von spezifischen Antikörper gegen das Rhesus(D)-Antigen hin abgesucht.

Von solch einer Fusion wurden 43 IgG-produzierende und 21 IgM-produzierende Hybridom-Zellinien etabliert. Nach 12 Monaten kontinuierlicher Kultur zeigten 8 der IgG- Produzenten ein hohes Niveau einer anti-D-Antikörper- Produktion. Eine dieser Linien war ein IgG3-Untergruppen- Produzent, der Rest waren IgG1-Produzenten.

c) Absuchen auf anti-D-Antikörperproduktion

Zum Nachweis von anti-D-Antikörpern in titrierten Proben wurde ein Hämagglutinationstest angewendet. Zellkulturüberstände wurden seriell verdünnt und mit einer 5%igen Suspension von roten Zellen aus (D+)-Spenderblut umgesetzt. IgM- und IgG-Gruppen konnten durch die Verwendung unbehandelter bzw. mit Papain-behandelter roter Zellen unterschieden werden. Durch Bezugnahme auf eine anti-D- Antikörper-Standard-Präparation konnte der Titer des Überstandes zur anti-D-Antikörper-Konzentration in kg/ml in Bezug gesetzt werden.

Zur Quantifizierung des monoclonalen anti-D-Antikörpers wurde ein Enzym-vermittelter Immunadsorptions-Test (Enzyme Linked Immunosorbent Assay; ELISA) für menschliches IgG angewandt. Zur Bestimmung der Immunglobulin-Untergruppe wurden Untergruppen-spezifische anti-Immunglobulin-Tests durchgeführt.

d) Zellclonierung

Es wurde das Grenzverdünnungsverfahren angewandt. In Mikrotiterplatten, die eine Versorgungsschicht aus Maus- Thymocyten enthielten, wurden Hybridome mit 100, 10 Zellen und einer Zelle pro Vertiefung ausgesät. Die Versorgungsschichten wurden aus einer Einzelzell-Suspension aus Thymusgewebe von spezifisch pathogenfreien (SPF)-BALB/c- Mäusen hergestellt. 1 × 10⁵ Zellen pro 100 µl wurden pro Vertiefung ausgesät. Die Versorgungsschichten wurden innerhalb von 3 Wochen nach ihrer Herstellung verwendet. Vertiefungen, die wachsende Clone enthielten, wurden nach 2 Wochen auf Antikörperproduktion hin abgesucht. Zellen aus positiven Vertiefungen wurden in größere Vertiefungen transferiert und gezüchtet. Die Stabilität von Wachstum und Antikörperproduktion wurde überprüft.

In späteren Clonierungsexperimenten wurden keine Versorgungsschichten verwendet.

e) Anpassung von Hybridomen an serumfreies Kulturmedium

Zu Beginn wurden Hybridome mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) gezüchtet. Zur Beseitigung fremder Proteine, z. B. Rinder-IgG und Albumin, und um das Reinigungsverfahren für anti-D-Antikörper zu vereinfachen, wurden die Zellen an ein Medium angepaßt, das als einziges Protein menschliches Transferrin enthielt. Die FCS-Konzentration wurde schrittweise während des fortgesetzten Züchtens vermindert, bis eine Zellinie mit vorteilhaften Eigenschaften in serumfreier Kultur etabliert war.

f) Wachstum einer IgG1-produzierenden Zellinie und Rate der Antikörperproduktion

Das Wachstum der mit 190/31 bezeichneten IgG1-produzierenden Zellinie in serumfreiem Kulturmedium ist in Fig. 1 gezeigt.

Die durch ELISA gemessene Produktionsgeschwindigkeit von IgG1 ist über einen Zeitraum von 6 Wochen fortlaufender Züchtung gezeigt. Die mittlere Produktionsrate belief sich auf 1,5 µg pro 1 × 10⁵ lebender Zellen pro Tag.

g) Eigenschaften des monoclonalen anti-D-Antikörpers 1. Erkennung von D- und Partial-D-Antigenen auf menschlichen roten Zellen

Die monoclonalen Antikörper wurden gegen rote Zellen einer Gruppe von 15 000 Spendern roter Zellen einschließlich von D^u und Partial-D-Antigen-Varianten getestet. Die Antikörper erkennen D, nicht aber C-, c-, E- oder e-Rhesus-Antigene. Im Hinblick auf die Erkennung der Partial-D-Kategorien erkennt der anti-D-Antikörper aus dem Clon 190/31 die Kategorien IIIa, IIIc, IVa, Va und Vc, nicht aber VI.

2. Biologische in vitro Wirkungen

Die Grundlage seiner therapeutischen Verwendung stellt die Bindung des anti-D-Antikörpers an das D-Antigen auf der Oberfläche roter Blutzellen dar, was zu deren Beseitigung führt. Zwei mögliche Mechanismen spielen dabei eine Rolle. Erstens ADCC, wobei Effektor- Lymphocyten an den Fc-Teil von mit anti-D-Antikörper bedeckten roten Zellen binden und deren Lyse vermitteln. Zweitens werden mit anti-D-Antikörper bedeckte rote Zellen nach der Bindung an Monocyten oder Macrophagen über Fc-Rezeptoren durch Phagocytose beseitigt.

ADCC wurde mit ⁵¹Cr-markierten roten Zellen ausgeführt, die mit monoclonalen und polyclonalen anti-D-Antikörper sensibilisiert waren (IgG-Fraktion von vereinigtem Blutplasma), und die Freisetzung von ⁵¹Cr wurde nach Inkubation mit Effektorzellen gemessen (Samdal et al., 1988). Die Phagocytose sensibilisierter roter Zellen wurde durch Messung der Aktivierung von Macrophagen und Monocyten durch Bindung, Einbau oder Rosettenbildung gezeigt (Brojer et al., 1989).

Tabelle I zeigt sowohl die Ergebnisse bezüglich der biologischen Aktivität der anti-D-Antikörper dieses und des anderen Beispiels als auch die Wirkungen der Kombinationen der Untergruppen IgG1 und IgG3. In den drei Tests wurde gefunden, daß IgG3 wirksamer als IgG1 ist. Wenn aber äquimolare Kombinationen verwendet wurden, konnten sogar bessere Ergebnisse erzielt werden. Wenn der Gehalt an IgG3 unter 50% vermindert wurde, war die Zusammensetzung weniger wirksam.

3. Bindungsaffinität

Die Bindungsaffinitäten der monoclonalen anti-D- Antikörper wurden durch Messung der Menge von an das Zelloberflächen-D-Antigen gebundenen anti-D-Antikörper abgeschätzt, wobei ¹²⁵J-markierte anti-Mensch-IgG- Antikörper verwendet wurden. Bei verschiedenen Konzentrationen roter Zellen wurden gebundene und freie anti-D-Antikörper gemessen und nach dem Verfahren von Scatchard (1949) aufgetragen. Die sich ergebenden Affinitätskonstanten von vier monoclonalen anti-D- Antikörpern sind in Tabelle I gezeigt.

Beispiel 2

Zum Etablieren der Zellinien und zum Charakterisieren der produzierten Antikörper wurden in diesem Beispiel ähnliche Prozeduren wie in Beispiel 1 angewandt. Die Hauptunterschiede bestanden in der Verwendung einer Maus- Myelom-Zellinie als Fusionspartner und in der Verwendung von peritonealen Maus-Macrophagen als Versorgungsschicht in den frühen Clonierungsprozeduren.

a) Quelle für die B-Lymphocyten

Die Blutzellen, aus denen die peripheren Blutlymphocyten isoliert wurden, wurden von einem gesunden (D-)-Spender erhalten, der mit (D+)-roten Zellen immunisiert worden war.

b) Etablieren der Antikörper produzierenden Zellinien

Die PBL wurden mit einer gleich großen Anzahl von Zellen aus einer Maus-Myelom-Zellinie (P3X63 Ag8X653) vermischt und, wie im einzelnen in Beispiel 1 ausgeführt, fusioniert. 25 anti-D-Antigen produzierende Hybridome wurden zu Beginn isoliert. 6 von ihnen waren nach einigen Wochen stabil. 3 waren IgG1-Produzenten, und 3 produzierten IgG3.

c) Zellclonierung

Versorgungsschichten wurden aus einer Zellsuspension von peritonealen Macrophagen aus BALB/c-Mäusen hergestellt. 1 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung wurden in Mikrotiterplatten ausgesät.

d) Wachstum und Antikörper-Produktionsrate

Die Produktionseigenschaften eines mit P3x229 14G4 bezeichneten IgG3-Produzenten ist in Fig. 1 gezeigt. Die Produktionsrate ist als diejenige Menge (µg) von IgG ausgedrückt, die durch 1 × 10⁵ lebende Zellen pro Tag produziert wird. Die mittlere Rate betrug über einen Zeitraum von 6 Wochen 2,3 µg.

e) Eigenschaften des monoclonalen anti-D-Antikörpers

IgG3 aus dem Clon P3x229 14G4 erkennt die Kategorien IIIa, IIIc, IVa, Va und Vc, nicht aber die Kategorie VI.

Der biologische in vitro Effekt von P3x229 14G4 ist in Tabelle I gezeigt. Im Vergleich mit anderen monoclonalen Antikörpern weist P3x229 14G4 bezüglich seiner Affinitätskonstante, seiner Fähigkeit, die Lyse von roten Zellen durch ADCC und Macrophagenaktivierung zu vermitteln, überlegene Eigenschaften auf.

Beispiel 3

Gemische monoclonaler Antikörper wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, an rote Blutzellen zu binden und biologische in vitro Effekte zu bewirken.

a) Biologische in vitro Wirkungen

Tabelle I gibt die Ergebnisse wieder, die man bei Verwendung verschiedener Gemische von IgG3 und IgG1 erhielt. Dabei umfaßte IgG3 50%, 33% und 10% des Gemisches. Im ADCC-Test waren die IgG 3-Antikörper allein besser als die IgG1- Antikörper allein. Das Gemisch ergab jedoch ein viel besseres Ergebnis als die IgG3-Antikörper alleine, wenn der IgG3-Anteil 50% oder 33% betrug. Im Macrophagen- Bindungstest ergaben die IgG3-Antikörper allein die besten Ergebnisse. Das 50%-Gemisch war weniger wirksam, war aber besser, als das mit einer steigenden Menge von IgG1. Der Monocyten-Bindungstest zeigte, daß die IgG3 im Bereich von 100% bis 33% wirksamer waren.

b) Additive Wirkung bei der Bindung an rote Zellen

Fig. 2 zeigt die Wirkung einer Vermischung von IgG1 mit einer sättigenden Konzentration von IgG3 (2,5 µg/ml) auf die Bindung von Antikörper an das D-Antigen roter Zellen. Der zusätzlich an die Zellen gebundene Antikörper weist darauf hin, daß die Untergruppen unterschiedliche Epitope des D- Antigens erkennen. Im Bereich von 0,1 bis 2,5 kg/ml IgG1 wurden ungefähr 18% mehr Bindungsstellen nachgewiesen.

c) Vergleich mit Präparationen polyclonaler Antikörper

Tabelle II zeigt die Ergebnisse eines Vergleichs eines Gemisches von IgG1 aus der Zellinie 190/31 und IgG3 aus der Zellinie P3x2298 14G4 mit 5 verschiedenen polyclonalen, aus vereinigtem Blutplasma erhaltenen und für die Rhesusprophylaxe verwendeten anti-D-Präparationen. Die monoclonale Präparation besaß eine höhere Affinitätskonstante und bewirkte eine stärkere Lyse (in %) im ADCC-Test.

Es wurde die Wirkung einer Verminderung des IgG3-Gehaltes einer polyclonalen Präparation untersucht. Das IgG1 zu IgG3- Verhältnis war anfangs 10 : 1. Nach einer chromatographischen Behandlung war kein IgG3 mehr nachweisbar. Die Präparationen vor und nach der Behandlung wurden bei derselben anti-D- Konzentration verglichen. Die Affinitätskonstante für anti-D änderte sich nicht, die Lyse (in %) im ADCC-Test wurde jedoch um 24% vermindert. Die Bindung von Monocyten und Macrophagen wurde um 70 bzw. 77% vermindert. Dies weist auf eine Verstärkung der biologischen in vitro Funktion sogar bei einem IgG3-Gehalt von 10% hin. Die Ergebnisse mit verschiedenen Gemischen monoclonaler Antikörper in Tabelle I stützen diesen Befund. Bei einem IgG3-Gehalt von 10% lieferte das Gemisch bessere Ergebnisse als IgG1 alleine.

Tabelle II

Vergleich monoclonaler und polyclonaler anti-D-Präparationen

Literaturverzeichnis

Boylson, J.M., Gardner, B., Anderson, R.L. und Hughes- Jonmes, N.C.
Production of human IgM anti-D in tissue culture by EB virus-transformed lymphocytes
Scand. J. Immunol. 12 (1980), 355-358
Brojer,. E., Merry, A.H. und Zupansky, B.
Rate of Interaction of IgG1 and IgG3 sensitized Red Cells with Monocytes in the Phagocytosis Assay
Vox. Sang. 56 (1989), 101-103
Brom, D., Feinberg, M.B., Teng, N.N.H. und Kaplan, H.S.
Production of Human Monoclonal IgG Antibodies against Rhesus(D) Antigen
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 3214-3217
Crawford, D.
University College London, GB.
Human Monoclonal Antibody against Rhesus D Antigen
GB 82-26513 (17.09.82)
Crawford, D.H., Barlow, M.J., Harrison, J.F., Winger, L. und Huehns, E.R.
Production of human monoclonal antibody to rhesus D antigen Lancet, 1 (1983), 386-388
De Burgh Bradley, B.A., Doyle, A. und Kumpel, B.M. (a)
Central Blood Laboratories Authority, Elstree, GB
Human Anti-Rh(D) Monoclonal Antibodies
PCT/GB88/00755 WO 89/02442 (18.09.87)
De Burgh Bradley, B.A., Doyle, A. und Kumpel, B.M. (b)
Central Blood Laboratories Authority, Elstree, GB
Human Anti-Rh(D) Monoclonal Antibodies
PCT/GB88/00756 WO 89/02600 (18.09.87)
De Burgh Bradley, B.A., Doyle, A. und Kumpel, B.M. (c)
Central Blood Laboratories Authority, Elstree, GB
Human Anti-Rh(D) Monoclonal Antibodies
PCT/GB88/00757 WO 89/02443 (18.09.87)
Doyle, A., Jones, T.J., Bidwell, J.L. und Bradley, B.A.
In vitro development of human monoclonal antibody secreting plasmacytomas
Hum. Immunol. 13 (1985), 199-209
Eklund, J., Jouppila, P. und Seppala, I.J.T.
IgG subclasses of Anti-Rh(D) and hemolytic desease of the Newborn
Vox. Sang. 55 (1988), 51-52
Foung, S.K.H., Blunt, J.A., Wu, P.S., Ahearn, P., Winn, L.C., Engelman, E.G. und Grumet, F.c.
Human Monoclonal Antibodies to Rho(D)
Vox. Sang. 53 (1987), 44-47
Gefter, M.L., Margulies, D.H. und Scharff, M.D.,
A simple method for polyethylene glycol-promoted hybridization of mouse myeloma cells
Somat. Cell. Genet. 3 (1977), 231-236
Goossens, D., Champomier, F., Rouger, P. und Salmon, C.
Human Monoclonal Antibodies against Blood Group Antigens. Preparation of a series of stable EBV immortalized B clones producing high levels of antibody of different isotypes and specificities
J. Immunol. Methods 101 (1987), 193-200
Grubb, R.
Molecular Biology, Biochemistry and Biophysics, 9
The genmetic markers of human immunoglobulin
Springer Verlag, Berlin (1979)
Hadley, A.G. und Kumpel, B.M.
Phagocytosis by Human Monocytes of Red Cells Sensitized with Monoclonal IgG1 and IgG3 Anti-D
Vox. Sang. 57 (1989) , 150-151
Hughes-Jones, N.C., Thompson, K.M. und Melamed, M.D. (a)
Central Blood Laboratories Authority, Elstree, GB
Production of heterohybridomas for manuifacture of human monoclonal antibodies to Rhesus D antigen
GB 86-10106 (25.04.86)
Hughes-Jones, N.C., Thompson, K.M. und Melamed, M.D. (b)
Central Blood Laboratories Authority, Elstree, GB
Human Anti-Rhesus D Producing Heterohybridomas
EP 0 251 440 (25.04.86)
Issitt, P.D.
Genetics of the Rh Blood Group System: Some Current Concepts
Med. Lab. Sci. 45 (1988), 395-404
Kaplan, H.S., Teng, N.H., und Bron, D.G.
Board of Trustees of the Leland Stanford Jr. University, Stanford, CA 94305
Human Monoclonal Antibody against Rh(D) Antigen and its Uses.
PCT/US84/01939 WO 85/02413 (26.11.84)
Koskimes, S.
Human Lymphoblastoid Cell Line Producing Specific Antibody against Rh-Antigen D.
Scand. J. Immunol. 11 (1980), 73-77
Kumpel, B.M. Poole, G.D. und Bradley, B.A.
Human Monoclonal Anti-D Antibodies
I. their Production, Serology, Quantitation and Potential Use as Blood Grouping Reagents.
Brit. J. Haemat. 71 (1989a), 125-129
Kumpel, B.M. Wiener, E., Urbaniak, S.J. und Bradley B.A.
Human Monoclonal Anti-D Antibodies,
II. The Realtionship between IgG Subclass, Gm Allotype and Fc mediated Function
Brit. J. Haemat. 71 (1989b), 415-420
Lefkovits, I. und Waldmann, H.
Limiting dilution analysis of cells in the immune system
Cambridge University Press (1979)
Lomas, C., Tippett, P., Thompson, K.M., Melamed, M.D. und Hughes-Jones, N. C.
Demonstration of seven epitopes on the Rh antigen D using human monoclonal anti-D antibodies and red cells from D categories.
Vox. Sang. 57 (1989), 261-264
Melamed, M.D., Gordon, J., Ley, S.J., Edgar, D. and Hughes- Jones, N.C.
Senescence of a human lymphoblastoid clone producing anti- Rhesus (D)
Eur. J. Immunol. 115 (1985), 742-746
Ono, I., Uno, M., Yugi, T. und Uchikawa, M.
Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd., Japan
Preparation of Monoclonal Antibody to Rh(D)-positive Antigen
JP 83-248865 (26.12.83)
Parinaud, J., Blanc, M., Grandjean, H., m Fournie, m A.-, Bierme, S. und Pontonnier, G.
IgH subclasses and Gm Allotypes of Anti-D Antibodies during Pregnancy: Correlation with the Gravity of the Fetal Disease
Am. J. Obstet. Gynecol. 151 (1985), 1111-1115
Pollock, J.M. und Bowman, J.M.
Anti-Rh(D) IgG subclasses and severity of Rh hemolytic disease of the newborn
Vox. Sang. 59 (1990), 176-179
Rochna, E. und Hughes-Jones, N.C.
The use of purified 125I-labelled anti-gamma-globulin in the determination of the number of D antigen sites on red cells of different phenotypes
Vox. Sang. 10 (1965), 675-686
Roder, J.C.
Queens University at Kingston, Kanada
Human Monoclonal Antibodies
CA 82-406033 (29.06.81)
Rozsnyay, Z., Sarmay, G., Walker, M., Maslanka, K., Valasek, z., Jeffries, R. und Gergely, J.
Distinctive Role of IgG1 and IgG3 isotypes in FcyR-mediated functions
Immunology 66 (1989), 491-498
Saito, T. und Kobayashi, M.
International Reagents Corp., Japan
Reagents for Determination of Blood Group Substance Rh(D) Factor
JP 88-50710 (03.03.88)
Samdal, H.H., Michaelsen, T.E., Heier, H.E. und Nordhagen, R.
Antibody Dependent Cell medated Cytotoxicity against Anti-D sensitized Human Erythrocytes
APMIS 96 (1988), 250-256
Scatchard, G.
The attractions of proteins from small molecules and ions
Ann. N.Y. Acad. Sci. 51 (1949), 660
Shaw, D.R., Conley, M.E., Knox, F.J., Khazaeli, M.B. und LoBuglio, A.F.
Direct quantitation of IgG subclasses 1, 2 and 3 bound to red cells by Rh1 (D) antibodies
Transfusion 28 (1988), 127-131
Thompson, K.M., Hough, D.W., Maddison, P.J., Melamed, M.D. und Hughes-Jones, N.C.
Production of human monoclonal IgG and IgM anmtibodies with anti-D (rhesus) specificity using heterohybridomas
Immunology 58 (1986), 157-160
Thomson, A., Contreras, M., Gorick, B., Kumpel, B., Chapman, G.E., Lane, R.S., Teesdale, P., Hughes-Jones, N.C. und Mollison, P.L.
Clearance of Rh D-positive red cells with monoclonal anti-D
Lancet 336 (1990), 1147-1150
Tippett, P.
Sub-divisions of the Rh(D) antigen
Med. Lab. Sci. 45 (1988), 88-93
Urbaniak, S.J. und Greiss, M.A.
ADCC(K Cell) Lysis of Human Erythrocytes Sensitized with Rhesus Alloantibodies. III. Comparison of IgG Anti-D agglutination and Lytic (ADCC) activity and the Role of IgG Subclass
Brit. J. Haemat. 46 (1980), 447-453
Wiener, E., Atwal, A., Thompson, K.N., Melamed, M.D., Gorick, B. und Hughes-Jones, N.C.
Differences between the activities of Human Nonoclonal IgG1 and IgG3 Subclasses of Anti-D(Rh) Antibody in their Ability to Mediate Red Cell-Bindung to Macrophages
Immunology 62 (1987), 401-404
Zupanska, B., Brojer, E., Richards, Y., Lenkiewicz, B., Seyfried, H. und Howell, P.
Serological and Immunological Characteristics of Maternal Anti-Rh(D) Antibodies in predicting the Severity of Hemolytic Disease of the Newborn
Vox. Sang. 56 (1989), 247-253
Zupanska, B., Thompson, E., Brojer, E. und Merry, A.H.
Phagocytosis of Erythrocytes sensitized with Known Amounts of IgG1 and IgG3 anti-Rh Antibodies
Vox. Sang. 53 (1987), 96-101

Claims (8)

1. Arzneimittel zur Prophylaxe von Hämolyse-Erkrankung Neu­ geborener (hemolytic disease of the newborn; HDN), das ein Gemisch aus mindestens zwei menschlichen, aus nicht EBV-transformierten Heterohybridomen stammenden monoclo­ nalen Antikörpern enthält, wobei

• (a) jeder der monoclonalen menschlichen Antikörper das D-, nicht aber das C-, c-, E- und e-Rhesus-Antigen erkennt;
• (b) die Kombination der monoclonalen menschlichen Anti­ körper die Partial-D-Antigen-Kategorien IIIa, IIIc, IVa, Va und Vc, nicht aber die Kategorie VI er­ kennt; und wobei
• (c) mindestens einer der monoclonalen menschlichen Anti­ körper zur Untergruppe IgG3 gehört.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei mindestens einer der monoclonalen menschlichen Antikörper der Untergruppe IgG1 angehört.

3. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die leichte Kette des monoclonalen menschlichen Antikör­ pers der Untergruppe IgG3 vom κ-Typ ist.

4. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 2 oder 3, wobei die leichte Kette des monoclonalen menschlichen Antikör­ pers der Untergruppe IgG1 vom κ-Typ ist.

5. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei der monoclonale menschliche Antikörper der Untergruppe IgG1 zum Allotyp Glm (3) gehört.

6. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verhältnis des monoclonalen menschlichen Antikörpers der Untergruppe IgG3 zum anderen monoclonalen menschlichen Antikörper bzw. zu den anderen monoclonalen menschlichen Antikörpern äquimolar ist.

7. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei der monoclonale menschliche Antikörper der Untergruppe IgG1 der durch das Hybridom 190/31 (Hinterlegungsnummer DSM ACC 2039) produzierte Antikörper ist.

8. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der monoclonale menschliche Antikörper der Untergruppe IgG3 der durch das Hybridom P3x229 14G4 (Hinterlegungsnummer DSM ACC 2040) produzierte Antikörper ist.