DE69730031T2

DE69730031T2 - Polypeptide mit der möglichkeit rhesus d antigenspezifische bindungsstrukturen aus zu bilden, dafür kodierende dna und deren prozess der herstellung und anwendung

Info

Publication number: DE69730031T2
Application number: DE69730031T
Authority: DE
Inventors: Sylvia Miescher; Monique Vogel; Beda Stadler; Andreas Morell; Martin Imboden; Hanspeter Amstutz
Original assignee: ZLB Bioplasma AG; ZLB Behring AG
Current assignee: CSL Behring AG
Priority date: 1996-06-24
Filing date: 1997-06-20
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2017-06-21
Also published as: WO1997049809A1; HUP9902605A2; RU2204602C2; DE69730031D1; CZ395998A3; CA2258494C; EP0920509A1; ATE272116T1; NZ333329A; US20050266013A1; KR100361449B1; NO986088D0; PL186019B1; AU3342397A; EP0920509B1; TR199802692T2; CA2258494A1; ES2224255T3; BG64534B1; IS2220B

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Polypeptide, die antigenbindende Strukturen bilden, mit einer Spezifität für Rhesus D Antigene und insbesondere für Fab-Moleküle mit einer Spezifität für das Rhesus D-Antigen. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ihre Anwendung für die Bereitstellung von pharmazeutischen und diagnostischen Zusammensetzungen. Die obigen Fab-Fragmente sind, wenn sie genetisch als Teil in einen vollständigen Antikörpers eingebaut werden, nützlich für die Prophylaxe von hämolytischen Leiden von Neugeborenen (HDN). Diese Erfindung stellt neue DNA- und Aminosäuresequenzen der oben genannten Polypeptide zur Verfügung.
Die Antikörper können demnach für den Schutz von Rhesus-negativen Frauen vor oder unmittelbar nach der Geburt eines Rhesus-positiven Kindes verwendet werden um die HDN in nachfolgenden Schwangerschaften zu verhüten.
Die Erfindung schliesst die Anwendung der genannten Fab-Moleküle ein, allein oder in Kombination mit Fc-konstanten Regionen, als vollständige Antikörper zum Zwecke der Behandlung anderer Krankheiten, welche durch eine Anti-Rhesus D-Immunglobulinbehandlung gelindert werden könnten, z.B. die Behandlung der idiopathischen thrombozytopenischen Purpura (ITP).
Zusätzlich kann das Anti-D-Rhesus-Immunglobulin nach Fehltransfusionen von Rhesus-positivem Blut für Rhesus-negative Empfänger verwendet werden, damit die Sensibilisierung auf das Rhesus D Antigen verhindert wird. Die Erfindung bezieht sich weiter auf die Anwendung dieser Fab-Fragmente und Antikörper als diagnostische Reagenzien.
HDN ist die allgemeine Bezeichnung für die hämolytische Anämie von Föten und Neugeborenen, welche durch Antikörper der Mutter verursacht wird. Diese Antikörper sind gegen Antigene auf der Oberfläche der fötalen Erythrozyten gerichtet. Diese Antigene können zu den Rhesus-, AB0- oder andern Blutgruppensystemen gehören.
Das Rhesus Blutgruppensystem umfasst 5 Hauptantigene: D, C, c, E und e (Issit P.D., Med. Lab. Sci. 45:395, 1988). Das D-Antigen ist das wichtigste dieser Antigene, da es während Rhesus-inkompatiblen Schwangerschaften und nach einer Transfusion von Rhesus-inkompatiblem Blut stark immunogene Anti-Rhesus-D-Antikörper hervorruft. Das D-Antigen wird bei ungefähr 85 % hellhäutigen Menschen in Europa gefunden und diese Individuen gelten als Rhesus positiv. Individuen, denen das D-Antigen fehlt werden Rhesus negativ bezeichnet. Die Expression des D-Antigens kann variieren, entweder wegen der tiefen Antigendichte, nachstehend als schwach D oder D^ubezeichnet, oder wegen einer partiellen Antigenizität, nachstehend als partielle D-Antigene bezeichnet.
Das Rhesus D-Antigen, ein Membranprotein der Erythrozyte, wurde kürzlich geklont und seine Primärstruktur beschrieben (Le Van Kim, C., et al, PNAS 89: 10925, 1992). Modelierungsstudien schlagen vor, dass das Rhesus D-Antigen 12 Transmembranenbereiche besitzt, die nur sehr kurze verbindende Regionen besitzen, die sich von der Zelle nach aussen ausdehnen oder aus dem Cytoplasma herausragen.
Die partiellen D-Phänotypen wurden erstmals bei Personen festgestellt, die das D-Antigen auf ihren roten Blutzellen trugen, die jedoch ein Alloanti-D in ihrem Serum besassen (Ros, R. R. und Sanger, R., Blood groops in man, Blackwell Scientific. Oxford, U.K. 1975; Tippelt, P., et al., Vox Sanguinis 70:123, 1996). Dies kann dadurch erklärt werden, indem das D-Antigen als mosaikartige Struktur mit mindestens 9 verschiedenen Eitopen (epD1 bisD9) betrachtet wird. Somit fehlt bei einigen D-Varianten-Personen bei den roten Blutzellen ein Teil dieses Mosaiks und es werden Antikörper auf die fehlenden D-Epitope gemacht. Rhesus-positive Personen, welche Antikörper gegen partielle D-Antgene bilden, werden in sechs verschiede Hauptkategorien eingeteilt (D^II bis D^VII), von welchen jede eine unterschiedliche Abnormität beim D-Antigen besitzt. Kürzlich wurde gezeigt, dass diese D-Kategorien verschiedene Reaktionsmuster ergaben, wenn sie gegen Platten (Panels) mit humanen monoklonalen Anti-D-Antikörpern getestet wurden (Tippelt, P., et al., Vox Sanguinis 70:123, 1996). Die unterschiedlichen Reaktionsmuster identifizierten die 9 Epitope und definierten somit die verschieden Anti-D- Kategorien. Die Anzahl der auf dem D-Antigen vorhandenen Epitope variiert von einer partiellen D-Kategorie zur andern, wobei die D^VI Kategorie wenigstens epD3, 4 und 9 exprimiert. Die D^VI-Kategorie ist klinisch von Wichtigkeit, da eine D^VI-Frau stark genug immunisiert werden kann um beim Neugeborenen ein hämolytisches Leiden zu verursachen.
Die prophylaktische Effizienz eines Anti-RhD IgG für die Prävention von hämolytischen Leiden der Neugeborenen ist gut etabliert und wurde während vielen Jahren routinemässig eingesetzt. Als Resultat wurde diese schwere Krankheit sehr selten. Dessen ungeachtet bleibt die Ursache des Leidens, d.h. die RhD-Inkompatibilität zwischen einer RhD negativen Mutter und ihrem getragenen RhD positiven Kind bleibt und erfordert eine kontinuierliche Versorgung an therapeutischen Anti-RhD IgG.
In den letzten Jahren wurde die Sicherstellung einer kontinuierlichen Versorgung von Anti-RhD IgG zu einem zunehmenden Problem. Der Pool von erhältlichem Hyperimmunserum von alloimmunisierten Rhesus negativen Multipara-Frauen hat sich wegen dem Erfolg des prophylaktischen antiRhD drastisch erhöht. Die geläufigen Herstellungsverfahren erfordern eine wiederholte Immunisierung eines zunehmend widerstrebenden Pools von Spendern für die Herstellung eines Hochtiter-Antiserums (Selinger, M., Br. J. Obstet. Gynaaecol. 98:509, 1991). Es bestehen ebenfalls damit verbundene Risikofaktoren und technische Probleme, wie die Verwendung von Rhesuspositiven roten Blutzellen für eine wiederholte Immunisierung, sie tragen das Risiko der Übertragung von viralen Krankheiten, wie Hepatitis B, AIDS oder anderen noch unbekannten Viren (Hughes-Jones, N.C., Br. J. Haematol. 70:263, 1988). Demzufolge ist eine alternative Methode für die Herstellung von anti-D-Antikörpern erforderlich.
In den letzten paar Jahren wurden verschiedene alternative Hyperimmunglobulinquellen ausprobiert, die jedoch alle mit Nachteilen verbunden waren. Die Epstein-Barr-Virus-(EBV) Transformation von Lymphozyten schuf B-Lymphoplastoid-Zelllinien, welche spezifische Antikörper, einschliesslich solche gegen das Rhesus D-Antigen ausschieden, waren instabil (Crawford et al., Lancet, 386; 19 Feb. 1983 ) und erfordern extensives Klonen. Auch wegen der tiefen Transformationseffizienz (1–3% B-Zellen) konnte nur ein eingeschränkter Bereich an Antikörper-Spezifitäten des potentiellen Repertoires erhalten werden. Zusätzlich scheint es, dass Mäuse nicht auf das Rhesus D-Antigen reagieren und somit sind keine murinen monoklonalen Antikörper erhältlich, die für die Produktion von chimären oder humanisierten Antikörper verwendet werden könnten. Bis vor Kurzem war die einzige Alternative für die Produktion von humanen Antikörpern die Hybridomtechnik, die jedoch ebenfalls eingeschränkt war, wegen dem Fehlen eines zweckmässigen humanen Myelom-Zellfusionspartners (Kozbor, D. und Roder J.C. Immunol Today, 4:72, 1983).
Es ist demzufolge das Ziel der vorliegenden Erfindung Fab-Fragmente zur Verfügung zu stellen, welche eine Reaktivität gegen das Rhesus D-Antigen aufweisen, ebenso wie vollständige Antikörper, die die Fab-Fragmente enthalten, und welche frei von den oben erwähnten Nachteilen sind.
In den letzten paar Jahren öffnete die Technik des Repertoire-Klonens und der Konstruktion von Phage Display Libraries neue Möglichkeiten um humane Antikörper einer definierten Spezfität herzustellen (Williamsom, R.A. et al., PNAS 90:4141. 1993). Diese Methoden wurden somit appliziert um Polypeptide herzustellen, welche fähig sind Antigen bildende Strukturen mit einer Spezifität auf Rhesus D-Antigene, insbesondere Fab-Fragmente, welche eine Aktivität gegen Rhesus D-Antigene und partielle D-Antigene besitzen, zu erzeugen.
Die Erzeugung von humanen Antikörpern durch Repertoire-Klonen, wie in den letzten Jahren beschrieben (Barbas III, C.F. und Lerner R.A. Companion Methods Enzymol. 2:119, 1991), basiert auf der Isolierung von mRNA aus peripheren B-Zellen. Diese Methode stellt Werkzeuge zur Verfügung um natürliche Antikörper, Autoantikörper oder Antikörper, die während dem Ablauf der Immunantwort gebildet werden, zu isolieren (Zebedee, S.L., et al., PHAS 89:3115, 1992; Vogel, M. et al., Eur J. Imunol. 24:1200, 1994). Diese Methode beruht auf der Konstruktion einer rekombinanten Antikörper-Library von einem bestimmten Spender, ausgehend von der mRNA-Codierung für Immunglobulin- (Ig) Moleküle. Da nur die peripheren Blut-Lymphozyten (PBL) von einem Spender isoliert werden können, nehmen die Chancen zu, dass ein spezifischer Antikörper, der in der Peripherie B-Zellen produziert, gefunden werden kann, wenn ein Individuum kurz vor der Ernte der PBL mit dem gewünschte Antigen geboostet wurde (Persson, M.A.A. et al., PNAS 88,2432, 1991). Die gesamt RNA wird dann isoliert und die mRNA des Ig Repertoires kann unter Verwendung eines spezifischen Primers (Startermolekül) mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geklont werden, gefolgt durch die Co-expression der schweren und leichten Ketten des Ig-Moleküls auf der Oberfläche des filamentartigen Phagenpartikels, wobei ein „Organismus" gebildet wird, der in Analogie zu den B-Zellen an ein Antigen gebunden werden kann. In der Literatur ist diese Methode ebenfalls als kombinatorischer Weg bekannt, da er unabhängig schwere und leichte Ketten kombinieren kann, um ein funktionelles Fab-Antikörperfragment zu erzeugen, das am einen der endstänigen Proteine, genannt pIII, des filamentartigen Phagen gebunden ist. Fab-Moleküle tragende Phagen (nachstehend als Phab-Partikel bezeichnet) werden für die gewünschte Antigen-Spezifität ausgewählt, durch ein Verfahren, das als „Bio-Panning" bekannt wurde. Das Antigen kann auf einen festen Träger appliziert werden, wobei spezifische Phab das Antigen binden, während die nicht-spezifischen Antigene weggewaschen werden und schliesslich die spezifischen Phab vom festen Träger eluiert werden. Die spezifischen Phab werden dann in Bakterien verstärkt, wobei man das Antigen wieder an den festen Träger binden lässt und der gesamte Prozess des Bio-Pannings wiederholt wird.
Die aufeinander folgenden Runden des Panning und der Verstärkung von selektierten Phab in Bakterien führen zu einer Anreicherung von spezifischen Phab, welche durch einen Anstieg des Titers von Kolonien bildenden Einheiten (cfu) festgestellt werden können, der nach jeder Runde des Pannings abflacht. Unsere früheren Erfahrungen und publizierten Daten zeigen dass spezifische Phagen gewöhnlich nach 4 – 6 Panning-Runden nachgewiesen werden können (Vogel m. et al., Eur. J. Immunol. 24:1200. 1994). Im den oben zitierten Dokumenten des Fachgebiets gibt es jedoch keinen Hinweis, dass die angegebenen Verfahrensschritte erfolgreich für die Herstellung von Fab-Fragmenten von anti-Rh D-Antikörpern verwendet werden können.
In den beigelegten 1a bis 16b sind DNA-Sequenzen, welche für variable Regionen (V-Regionen) von Anti-Rh D Fab-Fragmenten codieren, und die entsprechenden Polypeptid-Sequenzen offenbart.
17 zeigt das pComb3-Expressionssystem, welches gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
18 und 19 zeigt die separate Herstellung von Genen der schweren und leichten Ketten des vollständigen Antikörpers gemäss der Beschreibung im Beispiel 6.
Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind Polypeptide, die fähig sind Antigen bindende Strukturen zu bilden, welche eine Spezifität auf Rhesus D-Antigene besitzen, gemäss der Definition im Anspruch 1. Die Tabelle im Anspruch 1 bezieht sich auf die beiliegenden Figuren. Die Identifikationsnummer ist für jede Sequenz angegeben. Die lokale Lage der Rhesus D spezifischen CDR1 (Komplementärität bestimmende Region 1), CDR2 und CDR3 Regionen sind in den Figuren angegeben, entsprechend den Basenpaar-Nummern in der Tabelle im Anspruch 1. Bevorzugte Polypeptide gemäss der Erfindung sind Anti-Rhesus D-Antikörper, die variable Regionen der schweren und leichten Ketten umfassen, entsprechend den Sequenzen, die in den 1a bis 16b angegeben sind. Die 1b, 2b,... 16b beziehen sich auf die variablen Regionen in der leichten Kette.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind die DNA-Sequenzen, welche für Antigen bindende Strukturen codieren, gemäss der Definition im Anspruch 6. Bevorzugte DNA-Sequenzen sind diejenigen die für variable Regionen von Fab-Fragmenten von Anti-Rh D-Antikörpern codieren, gemäss den 1a – 16b. Die 1a , 2a,... 16a beziehen sich auf die schwere Kette und die 1b , 2b,... 16b beziehen sich auf die leichte Kette.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für die Selektion von rekombinanten Polypeptiden gemäss Anspruch 11.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind Anti-Rh-D-Antikörper gemäss der Definition im Anspruch 13, vorzugsweise Anti-D-Immunglobulinmoleküle, welche die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten enthalten, gemäss den 1a bis 16b, in Kombination mit konstanten Regionen von bekannten schweren und leichten Ketten.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzungen, welch Polypeptide, Anti-Rh D-Antikörper oder Fab-Fragmente gemäss der Erfindung enthalten.
Die gesamte erhaltene re-amplifizierte Phab-Population kann nach jedem Panning auf seine Spezifität getestet werden, wobei verschiedene Methoden, wie ELISA und Immunodot-Assay, verwendet werden. Sie wird ebenfalls definiert durch die Natur des Antigens, d.h. Rhesus D-Phabs werden durch indirekte Haemagglutination nachgewiesen, wobei ein Kaninchen-Anti-Phagen-Antikörper oder ein äquivalentes Coombs-Reagenz als vernetzender Antikörper verwendet wird. Wenn einmal die gesamte Phab-Population als positiv für das gewünschte Antigen identifiziert ist, werden individuelle Phab-Klone isoliert und die DNA, welche für die gewünschten Fab-Moleküle codiert, wird sequeniert. Individuelle Fab können dann unter Verwendung des pCom3-Expressionssystems hergestellt werden, das in 16 erläutert ist. In diesem System wird das gIII-Gen, das für das Schwanz-Protein pIII codiert, vom Phagemid-Vektor pCom3 heraus geschnitten. Dies erlaubt die Herstellung von löslichen Fab im bakteriellen Periplasma. Solche individuellen Fab-Fragmente können dann auf Antigen-Spezifität getestet werden.
Das Phagen Display-Verfahren wurde ebenfalls als Mittel zum Retten von monoklonalen Antikörpern aus unstabilen Hybridoma-Zelllinien verwendet. Dies wurde für Anti-Rhesus D Antikörper geschildert (Siegel, D.L. und Silberstein, L.E., Blood 83:2334, 1994; Dziegel, M. et al., J. Immunol. Methods 182:7, 1995). Eine Phagen-Display-Library, die von nicht immunisierten Spenderen konstruiert wurde, wurde zur Selektion von Fv-Fragmenten verwendet (d.h. variable Regionen von schweren und leichten Ketten V_H und V_L), die spezifisch auf humane Blutgruppenantigene sind, welche ein einziges F_V-Fragment, das gegen das Rhesus D-Antigen reagiert, enthalten (Marks, J.D. et al., Biotechnology 11:1145, 1963).
Wichtige Betrachtungen bei der Konstruktion von kombinatorischen Bibliotheken sind die Quelle von Zellen, die für die DNA-Extraktion verwendet wurden, und die Natur des beim Panning verwendeten Antigens. Diese Erfindung verwendet demzufolge einen Hyperimmun-Spender, der i.v mit Rhesus D⁺ roten Blutzellen rbc geboostet wurde. Die PBL des Spenders wurden +15 und +18 Tage nach dem i.v. Boost geerntet und wurden zur Konstruktion von 2 kombinatorischen Bibliotheken verwendet, die nachstehend als Library D1 (LD1) bzw. Library D2 (LD2) bezeichnet sind. Eine doppelte Immunfluoreszenz-Analyse der geernteten PBL, unter Verwendung der Marker CD20 und CD38 für die Pan B-Zellen bzw. die Lymphoplastoid-Zellen zeigten einen höheren Prozentsatz Lymphoplastoid-Zellen der Plasmazell-Morphologie als normal. Die grosse Anzahl der Plasmazellen, die im peripheren Blut gefunden wurde, ist höchst ungewöhnlich, da normalerweise weniger als 1 % in der Peripherie vorhanden sind und zeigt wahrscheinlich, dass der Spender einen hohen Prozentsatz zirkulierender B-Zellen mit einer Spezifität auf Rhesus D Antigen aufwies.
Nach der Konstruktion der Bibliothek (Library) wurde die Selektion der Phabs, die spezifisch auf Rhesus D-Antigene sind, vorgenommen, was durch Bio-Panning von frischen ganzen rbc des Phänotyps R1R2(DCe/CDe), d.h. die Referenzzellen, die für die Rhesus D-Bestimmung verwendet wurden, erreicht wurde. Dies war erforderlich, da das Rhesus D Antigen, ein integrales Membranprotein mit 417 Aminosäuren (Le Van Kim, C. et al, PNAS 89:10925, 1992), während der Reinigung seine Immunogenizität verliert (Paradis, G. et al., J. Immunol. 137:240, 1986) und demzufolge ein chemisch gereinigtes D-Antigen nicht an eine feste Phase für die Selektion von immunreaktiven Phabs, wie sie für andere Antigen-Spezifitäten in diesem System vorher selektiert wurden, gebunden werden kann (Vogel, M. et al., Eur. J. Immunol. 24:1200, 1994). Modellstudien lassen schliessen, dass nur sehr kurze Verbindungsregionen des Rhesus D-Antigens sich über die Zellmembrane hinaus ausdehnen oder ins Cytoplasma hineinragen (Chérif, Zahar, B. et al., PNAS 87:6243, 1990). Die RhD-Antigenteile, die für die Antikörper sichtbar sind, sind somit relativ eingeschränkt und können durch die Konfiguration beschränkt sein. Dieser Aspekt des Rhesus D Antigens wird sogar noch wichtiger, wenn die Selektion von Phabs mit einer Reaktivität gegen die partiellen D-Phänotypen, welchen im Wesentlichen gewisse definierte Epitope des D-Membranproteins fehlen, in Betracht gezogen wird (Mouro, I. et al., Blood 83:1129, 1994).
Da im Weiteren ganze rbc nicht nur das D-Antigen exprimieren, musste auf den Rhesus D negativen rbc eine Anzahl von negativen Absorptionen durchgeführt werden um diejenigen Phabs zu absorbieren, welche mit andern antigenischen Proteinen, die auf den rbc gefunden werden, reagieren.
Dieses Panning-Verfahren, das auf Phabs durchgeführt wird, welche sowohl von LD1 als auch von LD2 kommen, führte zur Isolierung von 6 verschiedenen Fab produzierenden Klonen aus der Bibliothek LD1, 8 verschiedenen Fab produzierenden Klonen aus den Bibliothek LD2 und 2 Fab produzierenden Klone aus der Bibliothek LD1 und LD2.
Die Nomenklatur und die Figuren, auf welchen die Sequenzen aufgelistet sind, sind in der Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Die obigen Fab-Klone zeigen ausschliesslich eine Reaktivität gegen das Rhesus D-Antigen, 3 von 5 getesteten D^U rbc und Agglutinierungsaktivität gegen die partiellen D-Phänotypen wie folgt: Rh33, DIII, DIVa, DIVb, DVa DVII.
Wenn jedoch die oben erwähnten R1 R1 rbc für das Panning der Phabs verwendet wurden, wurden keine Klone isoliert, welche gegen den partiellen PVI Phänotyp reagierten. Da vom Serum des ursprünglichen Hyperimmun-Spenders, das zur Zeit der Konstruktion der rekombinanten Library getestet wurde, bekannt war, dass es gegen den DVI-Phänotyp reagierte, sollte die rekombinante Libray ebenfalls die Anti-DVI-Spezifität enthalten.
Um die DVI-Reaktivität zu selektieren wurden die Panning-Bedingungen so geändert, indem verschiedene Zellen verwendet wurden. Ein spezieller Spender, dessen rbc bestimmt wurden, und von welchen bekannt war den Partiellen DVI-Phänotyp zu exprimieren, wurde als Quelle für Zellen zum Re-Panning der LD1 und LD2 Libraries verwendet. Diese zweiten Panning-Serien wurden im Wesentlichen in gleicher Weise durchgeführt wie die ersten Serien, mit der Ausnahme eines Ersatzes der DVI rbc durch R1 R1 rbc und einer zusätzlichen Bromelase-Behandlung der DVI rbc. Der DVI Phänotyp exprimierte die kleinste Anzahl von Rhesus D-Epitopen und es ist demzufolge schwierig Antikörper dagegen zu produzieren. Es wurde berichtet, dass nur 15% von unselektierten polyklonalen Anti-D und 35% von selektierten anti-D, erzeugt durch Rhesus D negative Personen, mit DVI+ Zellen reagierten (Mouro, I. et al., Blood 83:1129, 1994). Eine Bromelase-Behandlung, welche N-Acetylneuraminsäure (Sialsäure) aus der rbc-Membrane entfernt, wurde durchgeführt um die Rhesus DVI-Epitope während dem Panning mit den vorgängig absorbierten Phabs zugänglicher zu machen.
Diese zweiten Serien von Panning auf der LD1 Library führte zum 1 Fab produzierenden Klon LD1-6-17. Die Nomenklatur ist in der Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2
Dieser Klon reagierte jedoch mit den Rhesus-Allelen C und E und zeigte eine falsche Positivreaktion mit DVI positiven rbc. Dies kam auch daher, dass der Phänotyp des DVI Spenders (Cc DVI ee), der das C-Allele exprimierte, durch das Rhesus negative rbc nicht heraus absorbiert wurde (ccddee).
Die dritte Serie von Pannings an einem Pool von LD1 und LD2 Libraries wurde unter Verwendung verschiedener rbc für die Absorptionsphase durchgeführt. Nach 6 Runden Panning unter Verwendung von sowohl Bromelase behandelten als auch nicht behandelten rbc für beide Absorptionsschritte und Elution von DVI positiven rbc, wurde eine totale Popopulation von Phabs erhalten, welche ausschliesslich mit rbc des Phänotypen R1R+(CCDDee) und 2 verschiedenen Spendern, welche die DVI-Varianten exprimierten, reagierte.
Diese dritte Serie von Pannings an den LD1 und LD2 Libraries führte zu 2 Fab produzierenden Konen, die mit VI+ rbc reagieren. Die Nomenklatur ist in der Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3
Es wurden somit gesamthaft 16 verschiedene anti-Rhesus D Klone isoliert. Die DNA von diesen Klonen wurde isoliert und sequeniert unter Verwendung der Fluoreszenz-Zyklus-Sequenierung auf einem ABI 373 Sequenierungssystem. Die Nucleotid- und entsprechenden Aminosäuresequenzen der genannten Fab-Klone bilden die Basis dieser Erfindung.
Die Sequenzanalyse ergab, dass verschieden Klone isoliert wurden, welche das gleiche V_H-Gensegment, jedoch verschiedene V_L-Segmente trugen. Dies ist für die beiden Klone LD2-1 und LD2-10, die beiden Klone LD2-4 und LD2-11, und für die drei Klone LD2-13, LD1/2-6-3 bzw. LD1/2-6-33 der Fall.
Die erhaltenen DNA-Sequenzen und die Fab-Fragmente sind nützlich für die Herstellung von vollständigen Antikörpern, welche eine Aktivität gegen das Rhesus D-Antigen besitzen. Zweckmässige Expressionssysteme für solche Antikörper sind Mäuse-Myelom-Zellen oder Ovariumszellen von chinesischen Hamstern.
Die folgenden Beispiele erklären die Erfindung im einzelnen, ohne Einschränkung des Schutzbereichs der Erfindung.
Beispiel 1 beschreibt die Konstruktion von 2 kombinatorischen Libraries; insbesondere die oben genannten LD1 und LD2 Libraries.
Beispiel 2 beschreibt eine Serie von Pannings unter Verwendung sowohl von Bromelase behandelten als auch von nicht behandelten rbc für die Absorption und Bromelase behandelte DVI positive rbc unter Verwendung eines Pools der genannten LD1 und LD2 Libraries.
Beispiel 4 beschreibt einen indirekten Hämagglutinationstest unter Verwendung eines Kaninchen-Anti-Phagen-Antikörpers, als äquivalente Cooms-Reagenzien, um die Anreicherung und die Spezifität von Rhesus D-spezifischen Phabs nach dem Panning zu verfolgen.
Beispiel 5 beschreibt die Herstellung und Reinigung von Fab-Antikörperfragmenten für die Anwendung als diagnostische Reagenzien.
Beispiel 6 beschreibt die Herstellung von kompletten Anti-Rhesus D-Immunglobulinen unter Verwendung der Sequenzen der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1
Konstruktionen der LD1 und LD2 Libraries
a) Lymphozytenquelle
Einem erwachsenen Mann, der ein Mitglied einer freiwilligen Gruppe (Pool) von Hyperimmun-Spendern war, wurde i.v. mit 2 ml gepackten rbc eines bekannten männlichen Spenders der Blutgruppe 0 RhD+ einer Auffrischungsimpfung (boosting) unterworfen. Die PBLs wurden –5 und +18 Tage nach dem Boosting geerntet und die mononuklearen Zellen (MNC) wurden durch eine Ficoll-Gradientenzentrifugation (Lymphoprep, Pharmacia, Milwaukee, WI) isoliert. Die Resultate der Spender-Lymphozytenanalyse des Tages +5 sind in der Tabelle 4 angegeben. Die MNC am Tag +5 wurden direkt für die RNA-Herstellung verwndet, wobei das Phenol-Chloroform-Guanidinium Isocyanat-Verfahren (Chomczynski, P. und Sacchi, N., Anal. Biochem. 162:156, 1987) verwendet wurde. Die MNC des Tages +18 wurden zuerst während drei Tagen in RPMI-1640-Medium (Seromed, Basel), das 10³ U/ml IL-2 (Sandoz Research Center, Wien, Österreich) und 10 μg/ml Kermesbeeren (pokeweed)-Mitogen (PWM; Sigma L9379, Buchs, Schweiz) enthielt, kultiviert, bevor die RNA extrahiert wurde.
Tabelle 4 Immunfluoreszenzanalyse von Spender-Lymphozyten +5 Tage nach dem rbc i.v. Boosting
b) Konstruktion der Library
Es wurden zwei getrennte Libraries konstruiert, die LD1 und LD2 bezeichnet wurden (wie oben im Einzelnen angegeben) entsprechend den Zellen, die am Tag +5 bzw. am Tag +18 geerntet wurden (abschliessend +21 Tage, einschliesslich der +3 Tage der PWM-Stimulation) nach dem i.v. Boosting. Die gesamte RNA wurde dann aus diesen Zellen unter Verwendung des Phenol-Chloroform-Guanidinium Isocyanat-Verfahrens. Aus dieser RNA wurden 10 μg verwendet um cDNA herzustellen, unter Verwendung eines Oligo(dT)-Primers (400 ng) und reverse Transkription mit M-MuILV reverser Transkriptase gemäss den Bedingungen nach den Herstellerangaben (Boehringer Mannheim, Deutschland). Die PCR-Verstärkung wurde durchgeführt gemäss der Beschreibung in Vogel, M., et al., E.J. of Immunol. 24:1200, 1994. Kurz enthielt 100 μl PCR Perkin-Elmer-Puffer 10 mM MgCl₂, 5 μl cDNA, 150 ng des jeweils zweckmässigen 5' und 3' Primers, alle vier dNTP von je 200 μM und 2 U/ml Taq Polymerase (Perkin Elmer, NJ). Die PCR-Verstärkung der schweren und leichten Kette der Fab-Mollüle wurde separat mit einem Primer-Satz von Statacyte durchgeführt (Einzelheiten sind unten angegeben). Für die schwere Kette wurden sechs Stromaufwärts-Primer verwendet, welche jede der sechs Familien der V_H-Gene hybridisierten, während ein Kapp- und ein Lmbda-Ketten-Primer für die leichte Kette verwendet wurden. Die Stromabwärts-Primer wurden so aufgebaut, dass sie in die Scharnier-Region der konstanten Bereiche γ1 und γ3 für die schwere Kette passten. Für die leichte Kette wurden die Stromabwärts-Primer an das 3'-Ende der konstanten kappa- und lambda-Bereiche angepasst. Die PCR-Produkte der schweren und leichten Kette wurden separat gepoolt, Gel-gereinigt und mit Xho/Spe1 bzw. mit Sac1/Xba1 Restrktionsenzymen geschnitten (Boehringer Mannheim). nach der Verdauung der PCR-Produkte wurde einmal mit Phenol Chloroform : Isoamylalkohol extrahiert und durch Gelausschluss gereinigt. Die Insertion des Sac1/Xba1 verdauten Fd-Fragments und die anschliessende Ligation der Sac1/Xba1 verdauten leichten Kette in den Comb3-Vektor, wurde die Transformation in XL1-Blue-Zellen und die Produktion von Phagen durchgeführt, wie beschrieben durch (Barbas III, C.F. und Lerner, R.A., Companion Methods Enzymol. 2:119, 1991).
Nach der Transformation der XL1-Blue-E.coli wurden Zellproben genommen und auf Platten titriert um die Grösse der Library zu bestimmen. Diese Resultate ergaben Expressions-Libraries von 7,5×10⁶ und 7,7×10⁶ cfu (colony forming units) für LD1 bzw. LD2.
c9 PCR-Primer
c) Vektoren und Bakterienstämme
Der pComb3-Vektor, der für das Klonen der Fd- und der leichten Kette verwendet wurde, wurde erhalten vom Scripps Research Institute La Jolla, CA; (Barbas II, C.F. und Lerner, R.A., Companion Methods Enzymol. 2:119,1991). Der Escherichia Coli-Stamm XL1-Blue wurDe für die Transformation des pComb3-Vektors und des VCSM13 Helfer-Phagen wurden von Stratacyte (La Jolla CA) gekauft.
Beispiel 2
Auswahl von Rhesus D-Phabs von LD1 und LD2-Libraries am R1 R1 rbc
a) Absorption und Bio-Panning
Es wurde eine Serie von drei negativen Absorptionen an rbc der Gruppe 0 Rh negativ für jede Panning-Runde vor der positiven Sektion an rbc der Gruppe 0 Rh positive (R1 R1) durchgeführt. Frische rbc wurden in ACD (Zitronensäure Dextrose) Antikoagulans gesammelt und 3 mal in 0.9 % NaCl gewaschen. Die rbc wurden in Hayems-Lösung gezählt und auf 40×10⁶/ml eingestellt. Absorption: 1 ml Phagenzubereitung in PBS/3%BSA wurde zur rbc-Gruppe 0 Rh negative-Pille (16×10⁶ rbc) in 12 Röhrchen (Greiner 187261, Reinach, Schweiz) und bei RT (Raumtemperatur) während 30 Min. unter sorgfältigem Schütteln inkubiert. Alle Röhrchen wurden in PBS/3% während mindestens 1 h bei RT vorblockiert. Die rbc wurden durch Zentrifugieren während 5 min bei 300 × g bei 4 °C pelletisiert. Der resultierende Phagen-Übertstände wurde sorgfältig geerntet, und das Verfahren wurde weiter zwei mal wiederholt. Nach der abschliessenden Absorption wurde der Phagen-Überstand zur Pille der rbc mit der Gruppe ORh positiv (16×10⁶ rbc) gegeben und wiederum bei RT während 30 min. unter mässigem Schütteln inkubiert. Dann wurden die rbc mindestens 5 mal in 10 ml eiskalter PBS gewaschen, 5 min. bei 300 × g bei 4 °C zentrifugiert, gefolgt durch Elution mit 200 μl 76 mM Zitronensäure pH 2.8 während 6 min. bei RT und Neutralisation mit 200 μl 1M Tris. Die rbc wurden mit 300× g 5 min bei 4 °C zentrifugiert und der resultierende Überstand, welcher die eluierten Phagen enthielt, wurde sorgfältig entfernt und mit Trägerprotein (0,3 % BSA) bei 4 °C, bereit für die Wiederverstärkung aufbewahrt. Die Anzahl der Rhesus D-spezifischen Phabs für jede Panning-Runde sind in der Tabelle 5 angegeben.
Tabelle 5 Auswahl von Rhesus D+ Phabs aus den LD1 und LD2 Libraries an R1R1 rbc
a) Für jede Runde wurden 10² Phabs in Röhrchen mit rbc der Gruppe 0 Rhesus negativ (Absorptionsphase) inkubiert, gefolgt durch Elution von rbc der Gruppe 0 Rhesus positiv (R1 R1).

nd = nicht durchgeführt
cfu = Kolonien bildende Einheiten

Beispiel 3
Auswahl von Rhesus D+ Phabs aus gepoolten LD1 und LD2 Libraries an DVI+ rbc
a) Absorption an rbc der Gruppe 0 Rh negativ, Phänotypen 1 (r'r, Ccccee) und (ryry, CCddEE)
Es wurde eine Serie von drei negativen Absorptionen an rbc der Gruppe 0 Rh negativ für jede Panning-Runde vor der positiven Selrktion an rbc der Gruppe 0 Rh DVI positiv durchgeführt. Die negativen Absorptionen wurden in der folgenden Reihenfolge durchgeführt: Schritt 1) Phänotyp 1 wird mit Bromelase behandelt; Schritt 2) Phänotyp 1 keine Bromelase, 3) Phänotyp 2 wird mit Bromelase behandelt; Schritt 4) Phänotyp 2 keine Bromelase. Gefrorene rbc werden in einer Mischung von Sorbit und phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufgetaut, stehen gelassen in dieser Lösung während mindestens 10 min und dann 5 – 6 mal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und schliesslich in Stabilisierungslösung (DiaMed EC-Lösung) aufbewahrt. Vor dem Panning wurden die rbc 3 mal mit 0,9 % NaCl gewaschen, gefolgt vom Zählen in Hayems-Lösung. Absorption: 1 ml Phagen-Präparat in PBS/3%BSA wurde zur rbc-Pille (2×10⁸) gegeben, wie in Schritt 1 in 12 Röhrchen (Greiner 187261, Reinach, Schweiz) und bei RT während 30 Min. unter sorgfältigem Schütteln inkubiert. Alle Röhrchen wurden in PBS/3% während mindestens 1 h bei RT vorblockiert. Die rbc wurden durch Zentrifugieren währen 5 min bei 300 × g bei 4 °C pelletisiert. Der resultierende Phagen-Übertstand wurde sorgfältig geerntet und das Verfahren wurde unter Verwendung von rbc weiter, wie oben in den Schritten 2, 3 und 4 im Einzelnen angegeben, wiederholt.
b) Behandlung von rbc Rhesus negativ r'r und ryry und Rhesus CVI+ mit Bromelase
Bromelase 30 (Baxter Düdingen, Schweiz) wurde zur Behandlung von rbc Rhesus DVI+ in den gleichen Verhältnissen wie in Routine-Hämagglutinationstests verwendet, d.h 10 μl Bromelase 2×10⁶ rbc. Bromelase wurde daher in zur erforderlichen Menge rbc und bei 37 °C während 30 min inkubiert und anschliessend 3 mal mit 0,9 % NaCl gewaschen, in Hayems-Lösung wieder gezählt und auf die erforderlich Konzentration in PBS/3% BSA eingestellt, bereit für das Phab-Panning.
c) Bio-Paning an Bromelase behandelten Rhesus DVI+ rbc
Nach der finalen Absorption an rbc ryry wurde der Phagen-Überstand in zwei gleiche Teile geteilt und zu jeder der enzymbehandelten bzw. nicht enzymbehandelten Gruppe 0 Rh DVI+ Pille (40×10⁶) zugegeben und wiederum bei RT während 30 min inkubiert unter mässigem Schütteln. Dann wurden die 15 Populationen von rbc mindestens 5 mal in 10 ml eiskalter PBS gewaschen, während 5 min 300×g bei 4 °C zentrifugiert, gefolgt durch Elution mit 200 μl 76 mM Zitronensäure, pH 2,8 während 6 min bei RT und Neutralisation mit 200 μl 1M Tris. Die rbc werden zentrifugiert 300×g, 5 min bei 4 °C und die resultierenden Überstände, welche die eluierten Phagen sowohl vom den Bromelase- und nicht Bromelase behandelten DVI+ rbc enthielten, wurden sorgfältig entfernt und mit Trägerprotein gelagert (0,3 % BSA) bei 4 °C, bereit für die weitere Verstärkung. In weiteren Runden des Panning wurden die eluierten Phagen sowohl von der Bromelase behandelten als auch von den nichtbromelase behandelten DVI rbc separat aufbewahrt wobei jedem die Schritte des Absorptionsprotokolls 1 – 4 folgten. Der Elutionsschritte waren leicht schwieriger im Vergleich mit der Panning-Runde 1, da die Phagenpopulationen nicht wieder in 2 Teile aufgeteilt wurden. Nur diejenigen Phagen, die aus den Bromelase behandelten DVI+ rbc eluiert wurden, wurden ebenfalls wieder aus den Bromelase behandeltenDVl+ rbc eluiert. Die Anzahl der spezifischen Phabs nach jedem Panning-Runde sind in Tabelle 6 angegeben.
Auswahl von Rhesus D+ Phabs aus den LD1 und LD2 Libraries an Rhesus DVI+ roten Blutzellen
a) Für jede Runde wurden 10¹² Phabs inkubiert in Röhrchen mit 2 verschiedenen Phänotypen der rbc Gruppe 0 Rhesus negativ (Absorptionsphase), gefolgt durch Elution von rbc Gruppe 0 Rhesus DVI+.
Beispiel 4
Überwachung der Panning Runden und Bestimmen der Spezifität der angereicherten Phabs unter Verwendung eines Kaninchen-Antiphagen-Antikörpers
Indirekter Hämagglutinations-Assay
Frisch gesammelte rbc mit verschiedenen AB0- und Rhesus-Blutgruppen wurden 3 mal in 0,9 % NaCl gewaschen und auf eine 3–5% Lösung (45–10⁷/ml) eingestellt, entweder in 0,9 NaCl oder PBS/3% BSA gewaschen. Für jede Testbedingung wurden 50 μl rbc und 100 μl Test (ausgefällte und verstärkte Phagen oder Kontroll-Antikörper) zusammen in Glas-Blutbestimmungsröhrchen (Baxter, Düdingen, Schweiz) während 30 min bei 37°C inkubiert. Die rbc wurden 3 mal gewaschen in 0.9 % NaCl und dann inkubiert mit 2 Tropfen Coombs-Reagens (Baxter, Düdingen, Schweiz) für Positivkontrollen mit 100 μl mit 1/1000 verdünntem Kaninchen-Antiphagen-Antikörper (hergestellt durch Immunisierung von Kaninchen mit einer Phagen-VCSM13-Zuberreitung, gefolgt durch Reinigung auf einer Affi-Gel-Blue-Säule und Absorption an E.Coli um E.Coli-spezifische Antikörper zu entfernen). Die Röhrchen wurden während 20 min bei 37 °C inkubiert, während 1 min bei 125 g zentrifugiert und die rbc wurden auf Agglutination getestet, indem sorgfältig geschüttelt wird und ein Vergrösserungsglas verwendet wurde.
Beim Test der gereinigten Fab auf Agglutination wurde anstelle des Kaninchen-anti-Phagen-Antikörpers ein affinitätsgereinigter anti-Fab-Antikörper (The Binding Site, Birmingham, UK) verwendet.
Tabelle 7 zeigt die Resultate von Hämagglutinationstests von Phab-Proben nach verschiedene Panning-Runden auf R1R1 rbc.
Tabelle 8 zeigt die Resultate von Hämagglutinationstests von Phab-Proben nach verschiedene Panning-Runden auf DVI+ rbc.
Tabelle 9 zeigt die Reaktionsmuster von individuellen Fab-Klonen von den Libraries LD1 und LD2 mit partiellen D-Varianten.
Tabelle 7 Überwachung von Phabs von LD1 und LD2-Libraries durch indirekte Hämagglutination nach dem Panning auf R1R1 rbc
Tabelle 8 Überwachung von Phabs von gepoolten LD1 und LD2-Libraries durch indirekte Hämagglutination nach dem Panning auf DVI+ rbc
Tabelle 9 Klonale Analyse von Fab anti-Rhesus D-Klonen aus den Libraries D1 und LD2 gegen partielle D-Varianten
Beispiel 5
Herstellung und Reinigung von Fab-Antikörper-Fragmenten für die Anwendung als diagnostische Reagenzien
Nach den Bio-Panning-Verfahren, wie sie im Einzelnen in den Beispielen 1 und 2 angegeben sind, wurde eine Phagen-Population, welche eine spezifische agglutination auf Rhesus D+ rbc zeigte, ausgewählt und für die Herstellung von Phagimid-DNA verwendet. Genauer wurden Phabs, die an R1R1 rbc selektiert wurden, verwendet nach der 5. und 6. Runde des Biopannings für LD1 bzw. LD2 Libraries nach dem 5. Bio-Panning auf DVI+ rbc für die Isolierung des LD1-6-17-Klons. Um lösliche Fab herzustellen, muss die Sequenz gIII, die für das pIII-Schwanz-Protein des Phagen-Partikels codiert, deletiert werden.
Die Phagenimid-DNA wurde hergestellt unter Verwendung eines Nucleotrap-Kits (Machery-Nagel) und die gIII-Sequenz wurde durch Verdauung der so isolierten Phagenimid-DNA mit Nhe1/Spe1 entfernt, wie beschrieben (Burton, D.R., et al., PNAS, 1989). Nach der Transformation in XL1-Blue, wurden individuelle Klone selektiert (Nomenklatur in Tabelle 1 angegeben) und in LB (Luria-Brühe), die 50 μg/ml Carbenicillin enthielt, bei 37 °C auf eine OD von 0,6 bei 60mn gezüchtet. Die Kulturen wurden mit 2 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) (Biofinex, Praroman, Schweiz) induziert und bei 37 °C über Nacht wachsen gelassen. Die ganze Kultur wurde zentrifugiert bei 10 000 × g während 30 min bei 4 °C um die Bakterien zu pelletisieren. Die Bakterien-pille wurde mit einer Lysozym/DNase-lösung behandelt um die Fab-Fragmente innerhalb der Zelle zu befreien. Da einige Fab im Kulturüberstand freigesetzt wurden, wurden diese separat geerntet. Diese Fab-Zubereitungen wurden dann gepoolt und mit 60 % Ammoniumsulfat (Merck, Darmstadt, Deutschland) ausgefällt um die Fab zu konzentrieren und anschliessend einer extensiven Dialyse in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) unterworfen und durch Ultrazentrifugation bei 200 000×g wurden unlösliche Komplexe zu einem Pellet geformt. Die Fab-Zubereitungen wurden dann auf einer keramischen Hydroxyappatit-Säule (HTP Econo Cartridge, Bio-Rad, Glattbrugg, Schweiz) gereinigt, wobei eine Gradientenelution auf PBS (Puffer A) und PBS + 0.5 M NaCl (Puffer B) verwendet wurde. Der lineare Gradient wurde so programmiert dass eine Zunahme von 0–100 % in 40 min erfolgte. Fab wurde als einziger Peak zwischen 40–60 % Puffer B eluiert. Die positiven Fraktionen, die durch einen Immunodot Assay identifiziert wurden, unter Verwendung eines anti-Fab-Peroxidase-Konjugats (The Binding Site, Birmingham, UK), wurden gepoolt, unter Verwendung von Polyethylengkykol konzentriert und extensiv gegen PBS dialysiert. Die positiven Fraktionen aus der Hydroxyappatit-Säule wurden für jedes Klon in einem klassischen indirekten Hämagglutinations Test in Glasröhrchen verwendet mit dem Standart Coombs Reagenz (Baxter Diagnostic dade, Anti-Humanserum) oder einem Anti-Fab (The Binding Site, Birmingham, UK) als vernetzendes Reagenz. Diese Fab einer definierten Spezifität für partielle D-Varianten wie auf Seite 18 gezeigt, können für die Bestimmung von rbc von unbekannten partiellen D-Phänotypen verwendet werden.
Beispiel 6
Konstruktion von kompletten Immunglobulin-Genen
Das LD2-14 V-Gen der schweren Kette (V_H-Gen) wurde vom anti-Rhesus D-Fab codierenden Plasmid LD2-14 mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von spezifischen Primern verstärkt. Der5'-Primer hatte folgende Sequenz:
5'-GGGTCGACGCACAGGTGAAACTGCTCGAGTCTGG-3',
während der 5'-Primer die Sequenz hatte:
5'-GCCGATGTGTAAGGTGACCGTGGTCCCCTTG-3'.
Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung von Deep Vent DNA-Polymerase und von Pufferlösung (2mM Mg⁺⁺) von New England Biolabs durchgeführt, unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen, einschliesslich von je 100 pmol Primer und den vier Desoxynucleotiden mit einer Konzentration von je 250 μM. Die Reaktion wurde in 30 Zyklen mit den folgenden Temperaturschritten durchgeführt: 60 s bei 94 °C (ausgedehnt um 2 min während dem ersten Zyklus), 60 s bei 57°C und 60 s bei 72°C (ausgedehnt um 10 min während dem ersten Zyklus). Eine Zugabe nach der Verstärkung von 3'-A-Überhängen wurde durch eine anschliessende Inkubation während 10 min. bei 72°C in Gegenwart von einer Einheit Taq DNA.Polymerase (Boehringer; Mannheim, Deutschland). Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung eines QIAquick PCR-Reinigungskit (Qiagen, Schweiz) gereinigt und im Vektor pCRII geklont unter Verwendung Des TA-Klonierungs-Kits von Invitrogen (San Diego, USA). Nach der Verdauung des resultierenden Plasmids TAVH14 mit Sa/I und BstEII, wurde das V_H-gen durch eine präparative Agarose-Gelelektrophorese isoliert, unter Verwendung des QIAquick-Gel-Extraktionskit von Qiagen.
Der Vektor #150 (Sandoz Pharma Basel), welcher ein irrelevantes, jedoch intaktes humanes genomisches Immunglobulin V_H-Gen enthielt, wurde mit Sa/I und BstEII geschnitten und das Vektorfragment wurde durch eine präparative Agarose-Gelelektrophorese isoliert, wobei das QIAquick-Gel Extraktionskit von Qiagen verwendet wurde. Die Ligation des Vektors und des PCR-Produktes wurde bei 25 °C während 2 Stunden in einem Gesamtvolumen von 20 μl durchgeführt, wobei das Rapid Ligation Kit (Boehringer, Mannheim, Deutschland) verwendet wurde. Nach der Ligation wurde die Reaktionsmischung mit 20 μl H₂O verdünnt und mit 10 Volumen n-Butanol extrahiert um Salze zu entfernen. Die DNA wurde dann durch Zentrifugation pelletisiert, vakuumgetrocknet in 10 μl H₂O. Fünf ml dieser DNA-Lösung wurden elektroporiert (0,1 cm Küvetten, 1,9 kV, 200 Ω, 25 μFD) mit einem GenePulser (BioRad, Gaitherburg) in 40 μl elektroporationskompetenten E.Coli XL Blue MRF' (Stratagene, La Jolla), verdünnt mit SOC-Medium, inkubiert bei 37°C während einer Stunde und auf LB-Platten beschichtet die Ampicillin (50 μg/ml) enthielten. Plasmid-Micropreps (Qiagen, Basel) mit den resultierenden Kolonien wurden mit Restriktions-Verdauung auf die Gegenwart des zweckmässigen Inserts geprüft.
Mit diesem Verfahren wurde das irrelevante residente V_H-Gen im Vektor # 150 durch die verstärkte anti-Rhesus D-V_H-Sequenz von LD2-14 ersetzt, wobei das Plasmid cassVH14 erhalten wurde. Die Struktur des resultierenden Immuglobulins V_H-Genkonstrukt wurde durch Sequenierung bestätigt, durch Verdauung mit EcoRI und BamHI ausgeschnitten und wie oben beschrieben gelgereinigt. der Expressionsvektor # 10 (Sandoz Pharma Basel), welcher das das humane genomische Immunglobulin-Cγ1-Gensegment enthielt, wurde ebenfalls verdaut mit EcoRI und BamHI, isoliert durch präparative Agarose-Gelelektrophorese isoliert, verbunden mit dem EcoRI/ BamHI-V_H-Gensegment, welches vorher aus dem Plasmid cassVH14 erhalten wurde und inE.coli XL1-Blue MRF' wie oben angegeben elektroporiert. Dies resultierte in einem vollständigen Anti-Rhesus D-schwere-Ketten-Immunglobulin-Gen im Expressionsvektor 14IgG1 (Figur).
Das LD2-14-leichte-Ketten-V-Gen (V_L-Gen) wurde vom gleichen Anti-Rhesus-D-Fab-Plasmid LD2-14 durch PCR verstärkt, unter Verwendung von spezifischen Primern. Der 5'-Primerhatte folgende Sequenz:
5'-TACGCGTTGTGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAT-3',
während der 3'-Primer folgende Sequenz hatte:
5'-AGTCGCTCAGTTCGTTTGATTTCAAGCTTGGTCC-3'.
Die PCR-Reaktion, die Produktereinigung und die anschliessenden Klonierungsschritte waren analog zu den den Schritten, die für die V_H-Gene beschriben sind, mit der Ausnahme dass zweckmässige leichte Ketten-Vektoren verendet wurden. Kurz, das V_L-PCR-Produkt wurde in den pCRII-Vektor geklont, was das Plasmid TAVL14 ergab, daraus ausgeschnitten durch MIuI und HindIII und durch Gelextraktion isoliert. das VL-Gen wurde danach an den MIuI und HindIII-Stellen des Vektors # 151 (Sandoz Pharma, Basel) geklont, und damit das irrelevante residente VL-Gen durch die verstärkte Anti-Rhesus D VL-Sequenz von LD"-14 ersetzt. Nach der Bestätigung des resultierenden Plamids cassVL-14, wurde das EcoRI/XbaI-Fragment, welches das VL-Gen enthielt subgeklont an den Restriktionsstellen EcoRI und XbaI des Vektors # 98 (Sandoz Pharma, Schweiz), welcher das das humane genomische Immunglobulin-Cκ-Gensegment enthielt. Dieses Verfahren ersetzte das irrelevante residente VL-Gen im Plasmid # 98 und ergab den Expressionsvektor 14kappa, welcher das komplette Anti-Rhesus D-leichte-Ketten-Immunglobulin-Gen enthielt.
Die Mäuse-Myelom-Zelllinie SP2/0-AG 14 (ATTC CRL 1581) wurde durch Elektroporation mit den Expressionsvektoren 14IgG1 ko-transfektiert und 14kappa vorgängig linearisiert an der einzigen EcoRI bzw. NofI Spaltungsstelle. Die Elektroporation wurde wie folgt durchgeführt: exponentiell wachsende Zellen wurden zwei mal gewaschen und in phosphatgepufferter Saccharoselösung (270 mM Saccharose, 1 mM MgCl₂, 7 mM NaH₂PO₄, pH 7,4) mit einer Dichte von 2×10⁷ Zellen/ml suspendiert. 0,8 ml Zellen wurden in eine 0,4 cm Küvette gegeben, mit 15 μg linearisierten Plasmiden 14IgG1 und 14kappa gemischt, während 15 min auf dem Eis gehalten, mit 290 Volt, 200Ω, 25 μFD elektroporiert, zurückgestellt auf Eis während 15 min, in eine T75 Zellkulturflasche mit 20 ml kaltem RPIMI 1640-Medium (10% wärmeinaktiviertes fötales bovines Serum, 50 μM beta-Mercaptoethanol) transferiert, zwei h bei RT stehen gelassen und dann während 60 h bei 37°C inkubiert. nach dieser Periode wurden die Zellen in 50 ml eines Mediums gegeben, das 1 mg/ml G418 für die die Selektion enthielt. Stabile Transfektanten wurden dann in Gegenwart von zunehmenden Konzentrationen von Methotrexat gegeben um die integrierte DNA zu verstärken und demzufolge die Expression des entsprechenden Antikörpers rD2-14 zu erhöhen.
Die Expression von rD2-14 im Kulturüberstand (SrD2-14) wurde durch einen Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay (ELISA), der spezifisch auf humane γ1 und kappa-Ketten ist. Die quantitative Erfassung von Rhesusspezifischen Immunglobulinen im Anti-D-Assay gemäss Ph. Eur. ergab einen Wert zwischen 1,1 und 11,4 μg/ml agglutinierten Antikörpern in solchen Überständen. Sie testeten die Agglutination negativ für Rhesus negative rbc und zeigten das gleiche Agglutinationspotential gegen partielle D-Varianten wie das Fab LD2-14, das in E.coli exprimiert wurde. Die Daten sind in der Tabelle 10 dargestellt.
Tabelle 10 Vergleichende Analyse der Reaktivität von Fab Anti-Rhesus D-Klon LD"-14 und Antikörper rD2-14 gegen partielle D-Varianten
Die Agglutination wurde durch visuelle Auswertung bestimmt von+++ (alle Zellen in einem Klumpen Agglutiniert) absteigen nach – (keine Zellen agglutiniert).
LD2-14: Die Fab-Fragmente wurden wie im Beispiel 5 beschrieben hergestellt. SrD2-14: Der Zellkulturüberstand enthielt den Antikörper rD2-14; TCB: Zellkulturüberstand von untransfektierten Zellen.

Claims

Polypeptide, die fähig sind antigenbindende Strukturen mit einer Spezifizität für Rhesus D-Antigene zu bilden, umfassend die rhesusspezifischen CDR 1-, CDR 2- und CDR 3-Bereiche von Paaren von Aminosäuresequenzen V_H und V_L mit gleichen oder verschieden Identifikationsnummern entsprechend den in der nachstehenden Tabelle
angeführten Figuren:
Polypeptide gemäss Anspruch 1, welche rhesusspezifische CDR 1-, CDR 2- und CDR 3-Bereiche von Aminosäuresequenzen-Paaren V_H und V_L mit den gleichen Identifikationsnummer entsprechend den in der Tabelle gemäss Anspruch 1 angegebenen Figuren enthalten.
Polypeptide gemäss Anspruch 1, welche Bereiche mit Aminosäuresequenzen V_H und V_L umfassen und Identifikationsnummern entsprechend den Figuren, die in der Tabelle gemäss Anspruch 1 enthalten sind, aufweisen.
Polypeptide gemäss Anspruch 1, 2 oder 3, welche sich als antigenbindende Fragmente auszeichnen.
Polypeptide gemäss Anspruch 1, 2 oder 3 enthaltend schwere und leichte Immunglobulinketten, welche fähig sind vollständige anti-Rhesus D-Antikörper zu bilden.
DNA-Sequenzen, die Polypeptide codieren, die fähig sind antigenbindende Strukturen zu bilden mit einer Spezifizität für Rhesus D-Antigene, welche die Bereiche mit den Rhesus D-spezifischen CDR 1-, CDR 2- und CDR 3-Segmenten von Paaren von DNA-Sequenzen V_H und V_L mit gleichen oder einer verschieden Identifikationsnummern entsprechend den Figuren, die in der Tabelle gemäss Anspruch 1 angegeben sind.
DNA-Sequenzen gemäss Anspruch 6, die Polypeptide codieren, die fähig sind antigenbindende Strukturen zu bilden mit einer Spezifizität für Rhesus D-Antigene, umfassend die Bereiche mit den Rhesus D-spezifischen CDR 1-, CDR 2- und CDR 3-Segmenten von DNA-Sequenzen-Paaren V_H und V_L mit der gleichen Identifikationsnummer entsprechend den Figuren, die in Anspruch 6 erwähnt sind.
DNA-Sequenzen gemäss Anspruch 6, 7 oder 8, umfassend Bereiche mit den DNA-Sequenzen V_H und V_L mit den Identifikationsnummern entsprechend den Figuren, die in Anspruch 6 erwähnt sind.
DNA-Sequenzen gemäss Anspruch 6, 7 oder 8, die Polypeptide codieren, die fähig sind antigenbindende Fab-Fragmente zu bilden.
DNA-Sequenzen gemäss Anspruch 6, 7 oder 8, die Polypeptide codieren, die fähig sind vollständige anti-Rhesus D-Antikörper zu bilden.
Verfahren zum Selektieren von rekombinanten Polypeptiden, die fähig sind antigenbindende Strukturen zu bilden, mit einer Spezifizität für Rhesus D Antigene und die insbesondere eine Reaktivität mit der partiellen Rhesus DVI-Variante zeigen, und keine Reaktivität mit roten Blutzellen von Rhesus-negativen Phänotypen nachweisbar ist, insbesondere keine Reaktivität gegen Rhesus-Allele C, c, E, und welches Verfahren die folgenden sequenziellen Schritte umfasst: a) durchführen von verschiedenen negativen Absorptionen auf folgende rote Blutzellen: Phänotyp 1 (rr, Ccddee), der mit Bromelase behandelt ist, Phänotyp 1, der nicht mit Bromelase behandelt ist, Phänotyp 2 (ryry CCddEE), der mit Bromelase behandelt ist, und Phänotyp 2, der nicht mit Bromelase behandelt ist, b) durchführen einer positiven Absorption auf DVI+ roten Blutzellen, die mit Bromelase behandelt sind oder nicht mit Bromelase behandelt sind, c) bestimmen des Titers der Bindung von Phagen an die DVI+ roten Blutzellen, d) wiederholen der Schritte a), b) und c) bis der Titer der Bindung von Phagen an die DVI+ rote Blutzellen ein zufrieden stellendes Resultat erreicht hat.
Verfahren gemäss Anspruch 11, worin die rekombinanten Polypeptide, die fähig sind antigenbindende Strukturen zu bilden, Fab-Fragmente sind.
Anti-Rhesus D Antikörper, die variable Regionen der schweren und leichten Ketten besitzen, welche die Rhesus D-spezifischen CDR 1-, CDR 2 und CDR 3-Sequenzen von V_H- und V_L-Aminosäuresequenzen-Paaren besitzen, die gleiche oder verschiedene Identifikationsnummern gemäss der Tabelle im Anspruch 1 besitzen.
Anti-Rhesus D Antikörper, die variable Regionen der schweren und leichten Ketten besitzen, welche die Rhesus D-spezifische CDR 1-, CDR 2 und CDR 3-Sequenzen von Paaren von V_H- und V_L-Aminosäuresequenzen enthalten, die gleiche Identifikationsnummern der Figuren gemäss der Tabelle von Anspruch 1 besitzen.
Anti-Rhesus D Antikörper gemäss Anspruch 13 oder 14, die Paare von V_H- und V_L-Aminosäuresequenzen umfassen, die Identifikationsnummern der Figuren gemäss der im Anspruch 13 erwähnten Tabelle besitzen.
Anti-Rhesus D Antikörper gemäss Anspruch 13, 14, oder 15 worin die konstanten Immunglobulin-Regionen zumindest einen der definierten Isotypen IgG1, IgG2, IgG3 oder IgG4 sind.
Verfahren zur Herstellung von vollständigen anti-Rhesus D-Antikörpern gemäss einem der Ansprüche 13 bis 16, enthaltend in sequentieller Reihenfolge die Schritte: a) separates Verstärken der Mitglieder eines Paares eines V-Gensegments der schweren Kette und eines V-Gensegments der leichten Kette, enthaltend Rhesus D-spezifische CDR 1, CDR2 und CDR 3 Regionen, wie in den 1a – 16a bzw. 1b – 16b dargestellt, von einem anti-Rhesus D-Fab-codierenden Plasmid, indem die Polymerase-Ketten-Reaktion mit spezifischen Primern durchgeführt wird, b) separates Herstellen der Gene einer vollständigen schweren Kette des anti-Rhesus D-Immunglobulins und einer vollständigen leichten Kette des anti-Rhesus D-Immunglobulins in zweckmässigen Plasmiden, enthaltend die konstanten Immunglubulin-Gensegmente, die eine der humanen γ1, γ2, γ3 oder γ4 schweren Ketten oder der humanen κ oder λ leichten Ketten codieren, und separates Transformieren der erhaltenen Plasmide in zweckmässigen E.coli-Bakterien, und c) Cotransfektion der erhaltenen Plasmide in zweckmässigen eukaryontischen Wirtszellen, kultivieren der Zellen, abtrennen der nichttransformierten Zellen, klonen der Kulturen, selektieren der besten produzierenden Klone, deren Verwendung als Produktionskultur und isolieren der vollständigen Antikörper aus dem Überstand der Zellkultur.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend mindestens ein Polypeptid gemäss der Definition nach Anspruch 1, 2 oder 3 oder mindestens einen Antikörper nach einem der Ansprüche 13 bis 16 für die Prophylaxe von haemolytischen Leiden von Neugeborenen, für die Behandlung der idiopathischen thrombozytopenischen Purpura und von Fehltransfusionen mit Rhesus-inkompatiblem Blut.
Diagnostische Zusammensetzung für die Rhesus D-Bestimmung, enthaltend Fragmente gemäss Anspruch 4 oder anti-Rhesus D-Antikörper gemäss einem der Ansprüche 13 bis 16.