PL186019B1

PL186019B1 - Polipeptydy zdolne do tworzenia struktur wiążących antygen o swoistości względem antygenów Rh D, sekwencje DNA kodujące te polipeptydy oraz sposób ich wytwarzania i stosowania

Info

Publication number: PL186019B1
Application number: PL97330794A
Authority: PL
Inventors: Sylwia Miescher; Monique Vogel; Beda Stadler; Andreas Morell; Martin Imboden; Hanspeter Amstutz
Original assignee: Zlb Bioplasma Ag
Priority date: 1996-06-24
Filing date: 1997-06-20
Publication date: 2003-09-30
Also published as: IS2220B; ATE272116T1; US7038020B1; EP0920509B1; BG64534B1; CA2258494A1; PL330794A1; HUP9902605A2; ES2224255T3; US20050266013A1; WO1997049809A1; HUP9902605A3; DE69730031D1; KR20000022530A; SK284879B6; DE69730031T2; IL127595A; DK0920509T3; TR199802692T2; EP0920509A1

Abstract

1. Polipetydy zdolne do tworzenia struktur wiazacych antygeny, o swoistosci wzgledem antygenów Rh D, obejmujace swoiste wzgledem Rh D regiony CDR 1, CDR 2 i CDR 3 par sekwencji aminokwasów VH i VL , o takich samych lub róznych numerach identyfikacyjnych, zgodnie z figurami wyszczególnionymi w tabeli......................................... 6. Sekwencje DNA kodujace polipeptydy zdolne do tworzenia struktur wiazacych antygen, o swoistosci wzgledem antygenów Rh D, obejmujace regiony ze swoistymi wzgledem Rh D odcinkami CDR 1, CDR 2 i CDR 3 par sekwencji DNA VH i VL , o tych samych lub róznych numerach identyfikacyjnych, zgodnie z figurami wyszczególnionymi w ponizszej tabeli, oraz ich funkcjonalne równowazniki. 14. Przeciwciala anty-Rh D, zawierajace zmienne regiony lancucha ciezkiego i lancucha lekkiego, obejmujace swoiste wzgledem Rh D sekwencje CDR 1, CDR 2 i CDR 3 par sekwencji aminokwasów VH i VL , o tych samych lub róznych numerach identyfika- cyjnych, zgodnie z numerami wyszczególnionymi w ponizszej tabeli. PL PL PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy polipetydów tworzących struktury wiążące antygen o swoistości względem antygenów Rh D, a w szczególności cząsteczek Fab o swoistości względem antygenu Rh D. Wynalazek dotyczy także zastosowania tych polipeptydów do otrzymywania kompozycji farmaceutycznych i diagnostycznych. Powyższe fragmenty Fab, po poddaniu obróbce metodami inżynierii genetycznej, w wyniku której stały się częścią kompletnych prze6

186 019 ciwciał, są użyteczne w profilaktyce choroby hemolitycznej noworodków (HDN). Wynalazek niniejszy dotyczy nowych sekwencji DNA i sekwencji aminokwasów powyższych polipeptydów.

Tak więc, przeciwciał można użyć do zabezpieczania kobiet Rh- przed, i bezpośrednio po urodzeniu dziecka Rh+, w celu zapobieżenia hDn w następnych ciążach.

Wynalazek obejmuje swym zakresem także zastosowanie wspomnianych cząsteczek Fab, albo jako takich, albo w kombinacji ze stałymi regionami FC, jako kompletnych przeciwciał w celu leczenia innych chorób, w którym to leczeniu można by było wykorzystywać stosowanie immunoglobuliny anty-Rh D, na przykład w leczeniu plamicy małopłytkowej idiopatycznej (ITP).

Oprócz tego, immunoglobulinę anty-Rh D można stosować po nieprawidłowych transfuzjach krwi Rh+ przeprowadzonych u biorców Rh- w celu zapobieżeniu uczulenia na antygen RhD. Następnie, wynalazek dotyczy zastosowania wspomnianych fragmentów Fab i przeciwciał jako odczynników diagnostycznych.

HDN jest to ogólne skrótowe oznaczenie niedokrwistości hemolitycznej płodów i noworodków spowodowanej działaniem przeciwciał matki. Przeciwciała te skierowane są przeciw antygenom znajdującym się na powierzchni erytrocytów płodowych. Antygeny te mogą należeć do układów grupowych krwi Rh, ABO lub innych.

Układ grupowy Rh obejmuje 5 głównych antygenów: D, C, c, E i e [P.D. Issit, Med. Lab. Sci., 45, 395 (1988)]. Wśród tych antygenów najważniejszy jest antygen D, ponieważ jest on w wysokim stopniu immonogenny, wywołując wytwarzanie przeciwciał przeciw Rh D w trakcie ciąży niezgodnej w zakresie układu grupowego Rh i po transfuzji krwi niezgodnej pod względem układu grupowego Rh. Obecność antygenu D stwierdza się u około 85% ludzi rasy kaukaskiej w Europie i o osobnikach tych mówi się, że są Rh+. O osobnikach, u których stwierdza się brak antygenu D mówi się, że są Rh-. Ekspresja antygenu D może być różna, w wyniku albo małego zagęszczenia antygenu, co określa się w dalszej części niniejszego opisu jako słabe antygeny D lub D^u, albo częściowej antygenowości, co określa się w dalszej części niniejszego opisu jako częściowe antygeny D.

Ostatnio, sklonowano antygen Rh D, będący białkiem błony erytrocytu i opisano jego strukturę pierwszorzędową [C. Le Van Kim i in., PNAS, 89, 10925 (1992)]. Wyniki badań z modelowaniem sugerują, że antygen Rh D posiada 12 domen transmembranowych z bardzo krótkimi tylko regionami łączącymi, wystającymi poza błonę komórkową lub eksponowanymi do cytoplazmy.

Fenotypy częściowego D zidentyfikowano wpierw u łudzi, będących nosicielami antygenu D na swych krwinkach czerwonych, ale którzy w swych surowicach wykazywali obecność przeciwciała alloanty-D [R.R. Rose i R. Sanger: „Blood Groups in man”, Blackwell Scientific, Oxford, U.K., 1975; P. Tippet i in., Vox Sanguinis, 70, 123 (1996)]. Można to wytłumaczyć przez przyjęcie mozaikowej struktury antygenu D z co najmniej 9 różnymi epitopami (epD1 do epD9). Toteż, w przypadku niektórych ludzi z wariantowym antygenem D, erytrocytom brak części tej mozaiki i tworzą się przeciwciała przeciw nieobecnym epitopom antygenu D. Osobników Rh+, mogących wytwarzać przeciwciała przeciw częściowym antygenom D, klasyfikuje się na sześć głównych, różnych kategorii (D ⁿ do D^vu), z których każda odznacza się odmienną nienormalnością w antygenie D. Ostatnio wykazano, że te kategorie D dają różne schematy reakcji przy testowaniu wobec paneli ludzkich monoklonalnych przeciwciał anty-D [P. Tipetti i in., Vox Sanguinis, 70, 123 (1996)]. Te różne schematy reakcji pozwalały identyfikować 9 epitopów i tak też się definiuje różne kategorie częściowego D. Poszczególne kategorie częściowego D różnią się między sobą liczbą epitopów występujących na antygenie D, przy czym w przypadku kategorii DV ma się do czynienia z ekspresją najmniejszej ilości, epD3, 4 i 9. Kategoria D jest klinicznie ważna, ponieważ kobieta D⁷¹ może być na tyle silnie uodporniona, że może to nawet spowodować u noworodka chorobę hemolityczną.

Skuteczność profilaktyczna IgG anty-Rh D w zapobieganiu choroby hemolitycznej noworodków jest dobrze ugruntowana i od wielu lat wykorzystuje się ją rutynowo. W wyniku takiego postępowania, ta poważna choroba stała się obecnie rzadkością. Tym niemniej jednak, podstawowa przyczyna tej choroby, to znaczy niezgodność Rh D występująca między matką

186 019

Rh(D)- w ciąży z dzieckiem Rh(D)+ nadal pozostaje, a tym samym wymaga ciągłego dostarczania terapeutycznej IgG anty-Rh D.

Współcześnie, zapewnienie 'ciągłego dostarczania Igi anty-Rh D staje się wciąż narastającym problemem. Pula dostępnej surowicy hiperimmunoglobulinowej, pozyskiwanej od alloimunizowanych wieloródek Rh- drastycznie zmniejszyła się w wyniku postępu profilaktyki z udziałem anty-Rh D. Toteż, obecne metody produkcji wymagają powtarzanego uodporniania zespołu coraz bardziej niechętnych dawców dla produkcji surowicy odpornościowej o wysokim mianie [M. Sellnger, Br. J. Obstet. Gy^^^ł^ol., 98, 509 (1991)]. Towazyszą im także czynniki ryzyka i problemy techniczne, takie jak stosowanie do uodporniania czerwonych krwinek Rh+, powodujące powstawanie ryzyka przenoszenia chorób wirusowych, takich jak hepatitis B, AIDS i innych, dotychczas nieznanych, wirusów [N.C. Hughes-Jones, Br. J. Haematol., 70, 263 (1988)]. Stąd też wynika zapotrzebowanie na alternatywny sposób wytwarzania przeciwciał anty-Rh D.

W ciągu kilku ostatnich lat wypróbowano szereg różnych źródeł surowicy hiperimmunoglobulinowej, ale wszystkie one wykazują wady. I tak, okazało się, że dokonywana z udziałem wirusa Epsteina-Barra (EBV) transformacja limfocytów tworzących linie komórek limfoblastoidalnych B, które wydzielają swoiste przeciwciało, w tym przeciw antygenowi Rh D [Crawford i in., Lancet, 386 (19 lutego 1983)], jest niestabilna i wymaga wyczerpującego klonowania. Także, w wyniku niskiej wydajności tej transformacji (1 - 3 % komórek B) możliwe jest uzyskanie tą drogą tylko ograniczonej ilości swoistych przeciwciał z potencjalnej populacji. Oprócz tego, wydaje się, że myszy nie reagują na antygen Rh D, a przez to nie są dostępne żadne mysie przeciwciała monoklonalne, których można by użyć do wytwarzania przeciwciał chimerycznych lub humanizowanych. Jak dotychczas, jedyną alternatywę stanowiła produkcja przeciwciał ludzkich metodą z wykorzystaniem komórek hybrydoma, która jednakże również była ograniczona brakiem odpowiedniego partnera fuzji komórek ludzkiego szpiczaka [D. Kozbor i J.C. Roder, Immunol. Today, 4, 72 (1983)].

Toteż, celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie fragmentów Fab wykazujących reaktywność wobec antygenu Rh D, jak również kompletnych przeciwciał obejmujących fragmenty Fab, nie posiadających wad powyżej wspomnianych.

W ciągu kilku ostatnich lat technika klonowania repertuarowego (ang. „repertoire cloning”) i konstrukcji fagowych bibliotek prezentacyjnych otwarła nowe możliwości wytwarzania ludzkich przeciwciał o określonej swoistości [R.A. Williamson i in., PNAS 90, 4141 (1993)]. Toteż, te właśnie metody zastosowano do wytwarzania polipetydów zdolnych do tworzenia struktur wiążących antygeny swoistych względem antygenów Rh D, a zwłaszcza fragmentów Fab o aktywności skierowanej przeciw antygenom Rh D i częściowym antygenom Rh D.

Tworzenie ludzkich przeciwciał na drodze klonowania repertuarowego sposobem opisanym w ostatnich latach [C.F. Barbas nI i R.A. Lemer, Companion Methods Enzymol., 2, 119 (1991)] opiera się na izolowaniu mRNA z peryferyjnych komórek B. Sposób ten dostarcza środka do izolowania przeciwciał naturalnych, autoprzeciwciał lub autoprzeciwciał wytwarzanych w trakcie odpowiedzi immunologicznej [S.L. Zebedee i in., PNAS, 89, 3175 (1992); M. Vogel i in., Eur. J. Immunol., 24, 1200 (1994)]. Metoda ta polega na konstruowaniu biblioteki przeciwciał rekombinantowych od konkretnego dawcy, wychodząc z mRNA kodującego cząsteczki immunoglobuliny (Ig). Ponieważ od dawcy daje się wyizolować jedynie limfocyty krwi obwodowej (PBL), szansę znalezienia komórek B produkujących swoiste przeciwciało w obwodzie zwiększają się wtedy, gdy osobnik jest stymulowany pożądanym antygenem na krótko przed zebraniem PBL [M.A.A. Persson i in., PNAS, 88, 2432 (1991)]. Następnie izoluje się całkowity RNA i można klonować mRNA ze zbioru Ig, przy użyciu swoistych starterów w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), z następującą potem koekspresją łańcuchów ciężkich i łańcuchów lekkich cząsteczki Ig na powierzchni cząstki faga nitkowatego, w wyniku czego dochodzi do utworzenia „organizmu”, który analogicznie do komórki B może wiązać się z antygenem. W piśmiennictwie sposób ten zwany jest także „podejściem kombinatorycznym”, ponieważ umożliwia on niezależne łączenie ze sobą łańcuchów ciężkich i łańcuchów lekkich z utworzeniem funkcjonalnego fragmentu przeciwciała Fab,

186 019 przyłączonego do jednego z białek (zwanego pili) końcowego segmentu faga nitkowatego. Fagi niosące cząsteczki Fab (w dalszej części mniejszego opisu określane jako cząstki Phab) selekcjonuje się pod względem pożądanej swoistości antygenowej z zastosowaniem sposobu znanego jako biopening (ang. „bio-panning”). Antygen można nanieść na stały nośnik; swoiste Phab wiążą się z antygenem, podczas gdy nieswoiste Phab zostają wymyte ze stałego nośnika. Następnie swoiste Phab amplifikuje się w bakteriach, pozwala się im ponownie związać z antygenem na stałym nośniku i cały proces biopeningu powtarza się.

Kolejne rundy peningu i amplifikacji wybranych Phab w bakteriach doprowadzają, w rezultacie, do zwiększenia ilości swoistych Phab, co można stwierdzić na podstawie wzrostu miana jednostek tworzących kolonie (cfu) po wysianiu na płytki po każdej rundzie peningu. Wcześniejsze doświadczenie twórców wynalazku, a także opublikowane dane wskazują na to, że swoisty fag może zostać wykryty zazwyczaj po 4 - 6 rundach peningu [M. Vogel i in., Eur. J. Immunol., 24, 1200 (1994)]. Jednakże, w cytowanych powyżej publikacjach z dotychczasowego stanu techniki nie ma żadnej wzmianki o tym, że wskazane tam etapy można wykorzystać do zakończonego powodzeniem wytwarzania fragmentów Fab przeciwciał anty-Rh D.

W załączonych figurach la - 16b ujawniono sekwencje DNA kodujące zmienne regiony (regiony V) fragmentów Fab Rd D i odpowiednie sekwencje polipeptydów.

Figura 17 przedstawia system ekspresyjny pComb3 stosowany zgodnie z niniejszym wynalazkiem.

Figury 17 i 19 przedstawiają oddzielne wytwarzanie genów łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego kompletnego przeciwciała, zgodnie z opisem podanym w przykładzie 6.

Przedmiotami niniejszego wynalazku są polipeptydy zdolne do tworzenia struktur wiążących antygen, swoiste względem antygenów Rh D zgodnie z definicją podaną w zastrz. 1. Tabela zamieszczona w zastrz. 1 odnosi się do załączonych figur. Dla każdej sekwencji podano jej numer identyfikacyjny. Pozycja regionów CDR1 (region 1 determinujący komplementamość), CDR2 i CDR3 wskazane są na figurach i według numeru par zasad w tabeli zamieszczonej w zastrz. Korzystnymi polipeptydami według wynalazku są przeciwciała anty-Rh D, które obejmują zmienne regiony łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego zgodnie z sekwencjami podanymi na fig. la - 16b. Fig. 1a, 2a,..16a odnoszą się do zmiennych regionów łańcucha ciężkiego, a fig. 1b, 2b...16b odnoszą, się do zmiennych regionów łańcucha lekkiego.

Dalszymi przedmiotami niniejszego wynalazku są sekwencje DNA kodujące polipeptydy wiążące antygen według definicji podanej w zastrz. 6. Korzystnymi sekwencjami DNA są sekwencje kodujące zmienne regiony fragmentów Fab przeciwciał anty-Rh D zgodnie z fig. 1a 16b. Fig. 1a, 2a...16a odnoszą się do łańcucha ciężkiego, a fig. 1b, 2b...16b odnoszą się do łańcucha lekkiego.

Dalszym przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinantonyng polipeptydów Fab według definicji podanej w zastrz. 11.

Dalszym przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób dokonywania selekcji polipeptów rrkombinαntonynh według zastrz. 12.

Dalszymi przedmiotami niniejszego wynalazku są przeciwciała anty-Rh D według definicji podanej w zastrz. 14, korzystnie cząsteczki immunoglobuliny anty-Rh D zawierające zmienne regiony łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego zgodnie z fig. 1a - 16b, w kombinacji ze znanymi stałymi regionami łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego.

Dalszymi przedmiotami niniejszego wynalazku są kompozycje farmaceutyczne i diagnostyczne zawierające polipeptydy, przeciwciała anty-Rh D lub fragmenty Fab według wynalazku.

Całą reamplifiksnaną populację Phab otrzymaną po każdym peningu można przetestować pod względem jej swoistości, z wykorzystaniem różnych technik, takich jak ELISA i test immunodottingu. Można ją także definiować przez charakter antygenu, na przykład Phab anty-Rh D wykrywa się za pomocą pośredniej hemaglutynacji przy użyciu króliczego przeciwciała antyfagowego lub stosując równoważny odczynnik Coombsa jako przeciwciało wiążące krzyżowo. Po zidentyfikowaniu całej populacji Phab jako pozytywnej wobec pożądanego antygenu, nyizolowuje się poszczególne klony Phab i poddaje seknennjonowaniu DNA kodują186 019 cy cząsteczki pożądanego Fab. Następnie, można wytworzyć poszczególne Fab z zastosowaniem systemu ekspresji pComb3, co pokazano na fig. 16. W systemie tym, gen gIU, kodujący białko pIII segmentu końcowego wycina się z wektora fagmidowego pComb3. Umożliwia to wytworzenie Fab rozpuszczalnego w bakteryjnej periplazmie. Następnie, tak uzyskane poszczególne fragmenty Fab można poddać testowi na swoistość antygenową.

Jako środek do wydobycia przeciwciał monoklonalnych z niestabilnych linii komórek hybrydoma zastosowano także podejście polegające na prezentowaniu fagów. Doniesiono o tym w związku z przeciwciałami anty-Rh D [D.L. Siegel i L.E. Silberstein, Blood, 83, 2334 (1994); M. Dziegiel i in., J. Immunol. Methods, 182, 7 (1995)]. Fagowej biblioteki prezentacyjnej, skonstruowanej z wykorzystaniem nieuodpomionych dawców, używa się także do selekcjonowania fragmentów Fv (to jest zmiennych regionów łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego, Hh i V_L), swoistych dla ludzkich antygenów grupowych krwi, obejmujących jeden fragment Fv o reaktywności skierowanej przeciw antygenowi Rh D [J.D. Marks i in., Biotechnology, 11, 1145 (1993)].

Ważnymi okolicznościami, które należy brać pod uwagę przy konstruowaniu bibliotek kombinatorycznych są: źródło komórek użytych do ekstrakcji RNA i charakter antygenu zastosowanego do peningu. Dlatego też, według wynalazku korzysta się z dawcy hiperimmunizowanego, stymulowanego i.v. krwinkami czerwonymi (rbc) Rh D*. PBL aawcy zebaano w dniu +5 i+18 po i.v. podaniu dawki stymulującej i użyto do skonstruowania 2 bibliotek komeiaatorcczacch, określanych w dalszej części niniejszego opisu jako, odpowiednio, biblioteka Dl (LD1) i biblioteka D2 (LD2). Podwójna analiza immunofluorescznccjaa, której poddano zebrane PBL, wykonana przy użyciu markerów CD20 i CD38 dla, odpowiednio, komórek pan B i komórek limfoelastnidalacch, wykazała wyższy od normalnie spotykanego procentowy udział limfoelastoidalnych komórek B, o morfologii komórek osocza. Duża liczba komórek osocza, stwierdzona w przypadku krwi obwodowej, stanowi zjawisko w najwyższym stopniu niezwykłe, ponieważ normalnie znajduje się ich w obwodzie mniej niż 1%. Prawdopodobnie, wskazuje to na fakt, że ten konkretny dawca odznacza się wysokim procentowym udziałem krążących komórek B o swoistości względem antygenu Rh D.

Po skonstruowaniu biblioteki, dokonano selekcji Phab swoistych względem antygenu Rh D, stosując technikę biopeningu z udziałem świeżych pełnych rbc o fenotypie R1R1 (CDe/CDe), to znaczy komórek odniesieniow^^ używanych do typowania Rh D. Było to niezbędne, ponieważ antygen Rh D, będący integralnym białkiem błony o 417 aminokwasach [Le Van Kim i in., PNAS, 89, 10925 (1992)] traci swą immunogenność podczas oczyszczania [G. Paradis i in., J. Immunol., 137, 240 (1986)], wobec czego oczyszczonego metodami chemicznymi antygenu D nie można związać z fazą stałą w celu selekcji immunoaktywnych Phab, jak w przypadku innych rodzajów antygenów, dotychczas selekcjonowanych w tym układzie [M. Vogeli in., Eur. J. Ommunol., 24, 1200 (1994)]. Wyniki badań z modelowaniem sugerowały, że jedynie bardzo krótkie regiony łączące antygenu Rh D wystają poza błonę komórkową lub są eksponowane do cytoplazmy [B. Cherif-Zachar i in., PNAS, 87, 6243 (1990)]. Tak więc, części antygenu Rh D widoczne dla przeciwciał mają rozmiary względnie ograniczone i mogą być konformacyjnie skrępowane. Ta cecha charakterystyczna antygenu Rh D staje się jeszcze bardziej znacząca wtedy, gdy bierze się pod uwagę selekcję Phab o reaktywności skierowanej na fenotypy częściowego D, którym zasadniczo brak pewnych określonych epitopów białka błony D [I. Mouro i in, Blood, 83, 1129 (1994)].

Następnie, ponieważ w pełnych rbc dochodzi do ekspresji nie tylko antygenu D, należy przeprowadzić całą serię absorpcji negatywnych z udziałem rbc Rh D(-), w celu wydzielenia, na drodze absorbeji, tych Phab, które reagują z innymi białkami antygenowymi znajdującymi się w rbc.

Tego rodzaju technika peningu zastosowana w przypadku Phab pochodzących z obu bibliotek, LD1 i LD2, doprowadziła do wyizolowania 6 różnych klonów produkujących Fab z biblioteki LD1, 8 różnych klonów produkujących Fab z biblioteki LD2 i 2 klony produkujące Fab z połączonych bibliotek LD1 i LD2.

Nazewnictwo i figury, na których wyszczególniono sekwencje, podano w tabeli 1.

186 019

Tabela 1

Biblioteka LD1 Klon nr	Sekwencja Vh Figura	Sekwencja V_LFigura	Biblioteka LD2 Klon nr	Sekwencja V_HFigura	Sekwencja V_LFigura
LD1-40	la	1b	LD2-1	6a	6b
LD1-52	2a	2b	LD2-4	7a	7b
LD1-84	3a	3b	LD2-5	8a	8b
LD1-110	4a	4b	LD2-10	9a	9b
LD1-117	5a	5b	LD2-11	10a	10b
			LD2-14	11a	11b
			LD2-17	12a	12b
			LD2-20	13a	13b

Powyższe klony Fab przejawiają pierwszorzędną aktywność w stosunku do antygenu Rh D, 3 z 5 przebadanych rbc D^u , orzz aktyw/noćć polegającą na aglutynowaniu w stosunku do eenotypów częściowego D, jak następuje: Rh33, DIII, DIVa, DIVb, DVa, DVII.

Jednakże, przy użyciu do peningu Phab wyżej wymienionych rbc R1R1, nie wyizolowano żadnych klonów reagujących z fenotypem częściowego dVi. Ponieważ było wiadome, że surowica pierwotnego, hiperimmunizowanego dawcy, badana w czasie konstruowania biblioteki rekombinantowej, reaguje z fenotypem DVI, biblioteka rekombinantową powinna obejmować także swoistość anty-DVI.

W celu wyselekcjonowania aktywności DVI dokonano zmiany warunków przeprowadzania peningu, polegającej na zastosowaniu różnych komórek. Jako źródło komórek do powtórnego peningu bibliotek LD1 i LD2 wykorzystano specjalnego dawcę, którego rbc zostały typowane i o których było wiadomo, że dochodzi w nich do ekspresji fenotypu częściowego DVI. Tę drugą serię peningów przeprowadzano zasadniczo w taki sam sposób, jak w przypadku serii pierwszej, z tym wyjątkiem, że zamiast rbc R1R1 użyto rbc DVI oraz wprowadzono obróbkę rbc DVI z udziałem bromelazy. W przypadku fenotypu DVI dochodzi do ekspresji najmniejszej liczby epitopów Rh D, w wyniku czego trudno jest wytworzyć przeciwciała skierowane przeciw niemu. Doniesiono, że tylko 15% nie wyselekcjonowanych poliklonalnych anty-D i 35% wyselekcjonowanych anty-D wytworzonych przez osoby Rhreagowało z komórkami DVI+ [I. Mouro i in., Blood, 83, 1129 (1994)]. Obróbki z udziałem bromelazy, prowadzącej do usunięcia kwasu N-acetyl^ne^a^inowego (kwasu sjalowego) z błony rbc, dokonano w celu nadania epitopom Rh DVI większej dostępności podczas przeprowadzenia peningu z udziałem wstępnie zaadsorbowanych Phab.

Ta druga seria peningów przeprowadzonych z udziałem biblioteki LD1 dała w wyniku 1 klon produkujący Fab, LD1-6-17. Nazewnictwo podano w tabeli 2.

Tabela 2

Biblioteka LD1	Sekwencja V_H Figura	Sekwencja V_L Figura
Klon nr: LD1-6-17	14a	14b

Jednakże, klon ten reagował z allelami Rh C i Rh E i wykazywał fałszywą reakcję z rbc DVI+. Wynikało to także z fenotypu dawcy DVI (Cc DVI ee), w przypadku którego dochodziło do ekspresji allelu C, który nie był wyabsorbowany przez rbc Rh- (ccddee).

Tak więc, przeprowadzono trzecią serię peningów na puli bibliotek lD1 i LD2, przy użyciu rozmaitych rbc w fazie absorpcji. Po 6 rundach peningu, przy użyciu rbc zarówno poddanych, jak i nie poddanych działaniu bromelazy w obu etapach absorpcji, oraz po wyeluowaniu z rbc DVI + , otrzymano całą populację Phab, które reagowały wyłącznie z rbc o fenotypie R1R1 (CCDDee) i 2 różnymi dawcami, w których dochodziło do ekspresji wariantu DVI.

186 019

Ta trzecia seria peningów na bibliotekach LD1 i LD2 dała w rezultacie 2 klony produkujące Fab, reagujące z rbc DVI+. Nazewnictwo podano w tabeli 3.

Tabela 3

Biblioteka LD1/LD2	Sekwencja Vh Figura	Sekwencja V_l Figura
Klon nr: LD1/2-6-3	15a	15b
Klon nr: LD1/2-6-33	16a	16b

W taki sposób wyizolowano 16 różnych klonów Fab anty-Rh D. DNA z tych klonów wyodrębniono i poddano sekwencjonowaniu z zastosowaniem immunofluorescencyjnej metody sekwencjonowania cyklicznego, przy użyciu systemu sekwencjonowania ABI 373A. Nukleotyd i odpowiednie sekwencje aminokwasów wspomnianych klonów Fab stanowią podstawę niniejszego wynalazku.

Wyniki analizy sekwencyjnej potwierdziły, że wyizolowano szereg klonów niosących ten sam odcinek genu Vh, ale różne odcinki genu Vl. Jest tak w przypadku dwóch klonów LD2-1 iLD2-10, dwóch klonów LD2-4 iLD2-11, oraz trzech klonów LD2-14, LD1/2-6-3 i LD1/2-6-33.

Otrzymane sekwencje DNA i fragmenty Fab są użyteczne, jeśli chodzi o otrzymanie kompletnych przeciwciał o aktywności skierowanej przeciw antygenowi Rh D. Odpowiednimi systemami ekspresji dla tych przeciwciał są: mysie komórki szpiczaka lub komórki jajnika chomika chińskiego.

Wynalazek objaśniają szczegółowo następujące przykłady, nie ograniczające w żaden sposób zakresu wynalazku.

W przykładzie 1 opisano konstrukcję 2 bibliotek kombinatorycznych, a zwłaszcza wyżej wspomnianych bibliotek LD1 i LD2.

W przykładzie 2 opisano serię peningów wykonanych przy użyciu rbc R1R1 na wspomnianych bibliotekach LD1 i LD2.

W przykładzie 3 opisano serię peningów wykonanych z udziałem rbc poddanych i nie poddanych obróbce przy użyciu bromelazy do absorpcji i poddanych działaniu bromelazy rbc DVI+ z udziałem puli wspomnianych bibliotek LD1 i LD2.

W przykładzie 4 opisano test hemaglutynacji biernej z udziałem króliczego przeciwciała antyfagowego, jako równoważnego odczynnika Coombsa, do monitorowania zwiększania stężenia i swoistości Phab swoistych względem Rh D po peningu.

W przykładzie 5 opisano wytwarzanie i oczyszczanie fragmentów przeciwciała Fab z przeznaczeniem do stosowania jako odczynniki diagnostyczne.

W przykładzie 6 opisano wytwarzanie kompletnych immunoglobulin anty-Rh D przy użyciu sekwencji według niniejszego wynalazku.

Przykład 1

Konstrukcja rekombinantowych bibliotek LD1 i LD2

a) Źródło limfocytów.

Dorosłemu mężczyźnie, będącemu członkiem kohorty hiperimmunizowanych ochotników-dawców Rd D, podano i.v. dawkę stymulującą w postaci 2 ml masy rbc pochodzących od znanego mężczyzny-dawcy o grupie krwi O Rh D+. W +5 i +18 dniu od podania dawki stymulującej zebrano PBL i wyodrębniono komórki monoklonalne (MNC) metodą wirowania w gradiencie fikolu (Lymphoprep, Pharmacia, Milwaukee, W). Wyniki analizy limfocytów dawcy z +5 dnia podano w tabeli 4. MNC z dnia +5 użyto bezpośrednio do wypreparowania RNA z wykorzystaniem fenolowochloroformowej metody z użyciem izotiocyjanianu guanidyny [P. Chomczynski i N. Sacchi, Anal. Biocehm., 162, 156 (1987)]. MNC z dnia +18 wpierw hodowano w ciągu 3 dni w podłożu RPMI-1640 (Seromed, Bazyleja) zawierającym 10³ jedn/ml IL-2 (Sandoz Research Center, Wiedeń, Austria) i 10 pg/ml mitogenu szkarłatki (PWM; Sigma L9379, Buchs, Szwajcaria), po czym dopiero dokonywano ekstrakcji RNA.

186 019

Tabela 4

Analiza immunofluorescencyjna limfocytów dawcy z +5 dnia od podania i.v. dawki stymulującej

Antygen powierzchiowy	% komórek pozytywnych	Antygen powierzchniowy	% komórek pozytywnych
CD20	15	CD8	12
CD38	20	CD25	7,6
CD20/38	15	CD57	12,5
CD3	47	CD14	6
CD4	34	HLA-DR	18

b) Konstrukcja biblioteki

Skonstruowano dwie oddzielne biblioteki, nazwane LD1 i LD2 (jak to szczegółowo omówiono w powyższej części niniejszego opisu), odpowiadające komórkom zebranym w dniu, odpowiednio, +5 i+18 (ostatecznie +21 dni, włączając w to +3 dni stymulowania PWM) po podaniu i.v. dawki stymulującej. Następnie wypreparowano z tych komórek RNA z wykorzystaniem fenolowo-chloroformowej metody zużyciem izotiocyjanianu guanidyny. Z tak otrzymanego RNA pobrano 10 pg w celu wytworzenia cDNA przy użyciu 400 ng startera oligo(dT), po czym przeprowadzono odwróconą transkrypcję z użyciem odwrotnej transkryptazy M-MuLV z przyjęciem warunków procesu wyszczególnionych w instrukcji dostawcy (Boehringer Mannheim, Niemcy). Amplifikację metodą PCR przeprowadzono sposobem opisanym przez M. Vogela i in., E. J. of Immunol., 24, 1200 (1994). Mówiąc krótko, 100 pl mieszaniny reakcyjnej PCR zawierało bufor Perkina-Elmera z 10 mM MgCb, 5 pl cDNA, 150 ng każdego stosownego startera 5' i 3', wszystkie cztery dNTP (200 jM każdego) i 2 jedn/ml polimerazy Taq (Perkin Elmer, NJ). Amplifikację, metodą PCR, łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego cząsteczki Fab przeprowadzono osobno przy użyciu zestawu starterów z firmy Stratacyte (szczegóły podano w poniższej części niniejszego opisu). W przypadku łańcucha ciężkiego posłużono się sześcioma starterami „w górę”, hybrydyzującymi każdą z sześciu rodzin genów Vh, podczas gdy w przypadku łańcucha lekkiego użyto jednego startera kappa i jednego startera lambda. Startery „w dół”, w przypadku łańcucha ciężkiego, przeznaczone były do dopasowania regionu stykowego stałych domen γ1 i γ3 w przypadku łańcucha ciężkiego. Dla łańcucha lekkiego, startery „w dół” dopasowane były do końca 3' stałych domen kappa i lambda. Otrzymane metodą PCR oba łańcuchy, ciężki i lekki, zebrano osobno i poddano oczyszczaniu na żelu, po czym dokonano cięcia przy użyciu enzymów restrykcyjnych, odpowiednio, Xhoł/Spel i Sacl/Xbal (Boehringer Mannheim). Po strawieniu, produkty PCR poddano jednorazowo ekstrakcji układem fenol/chloroform/alkohol izoamylowy, a następnie oczyszczaniu metodą wycinania żelu. Insercję fragmentu Fd strawionego Xhol/Spel i następującego po tym ligowania lekkiego łańcucha strawionego Sacl/Xbal do wektora pComb3, transformację do komórek XL1-Blue i wytworzenie fagów przeprowadzono tak, jak to opisali C.F. Barbas III i R.A. Lemer, Companion Methods Enzymol., 2, 119 (1991).

Po transformacji komórek E. coli XL1-Blue, pobrano próbki i oznaczono miano na płytkach w celu określenia rozmiarów bibliotek. Otrzymane wyniki wykazały uzyskanie bibliotek ekspresyjnych liczących 7,5 x 10⁶ i 7,7 x 10⁶ jednostek tworzących kolonie (cfu) dla, odpowiednio, LD1 i LD2.

c) Startery PCR.

VHI 5'-CAC TCiC CTG GCG CAG CCG CCT GCG TCT GT-3'

VHII S^C-AT CCG ATC CCA GAT AGT CTA CCT GAA ATC GAC'

VHIII 5'-GTC CAG GTG GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-VHIV 5'-GTC CCTi TTC CCA GATr CCA CTO CC C GAA TTC GA-3'

VHV 5^0^ TGA GAC GAr G’^ CCA CTO CTC GAO TTC GA-3'

VHVI 5'-GTC CTC TCA CCG GAT CCG CTG CTC GAG TTA GAA3'

CHI(gI) 5'-GAT GCA GAC AAT GAG GCG TTT — ACA-3'

VL(k) 5'-AT ACA GCG CAC CGC CTC ATA ATC ACC AGC CTC CCA-''

186 019

CL(k) 5'-T CCT TCT AGA TTA CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA ACT C-3'

VL(I) 5'C TGC ACA CKjG TCC TGG GCC GAG CTC GTG GTG ACT C7A-33'

CL(I) 5'G CAT TCT AGA CTA TTA TGA ACA TTC TGT AGG GGC-3'.

d) Wektoiy i bakt<epyne.

Wektor pComb3, zastosowany do klonowania Fd i łańcucha lekkiego, otrzymano z Scripps Research Institute La Jolla, CA; [C.F. Barbas III i R.A. Lemer, Companion Methods Enzymol., 2, 119 (1991)]. Szczep Escherichia coli XL1-Blue, zastosowany do transformacji wektora pComb3 i faga pomocniczego VCSM13, otrzymano z firmy Stratacyte (La Jolla, CA).

Przykład 2

Selekcja Phab Rh D z bibliotek LD1 i LD2 na rbc R1R.1

a) Absorpcja i biio^<^nii^jg.

Dla każdej rundy peningu, jeszcze przed pozytywną selekcją na rbc grupy O Rh+ (R1R1), wykonano serię trzech negatywnych absorpcji na rbc grupy O Rh-. Świeże rbc zebrano w mieszaninie antykoagulacyjnej ACD (kwas cytrynowy, cytrynian trisodowy, glukoza) i przemyto 3 razy 0,9% NaCl. Następnie zliczono rbc w roztworze Hayemsa i stężenie ich doprowadzono do 40 x 10⁶/ml. Absorpcja: 1 ml preparatu fagowego w PBS/3% BSA wprowadzono do osadu rbc grupy O Rh- (16 x 10⁶ rbc) w 12 ml probówkach (Greiner 187261, Reinach, Szwajcaria) i inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu 30 minut, przy ostrożnym wstrząsaniu. Wszystkie probówki poddano wstępnemu blokowaniu w PBS/3% BSA w ciągu co najmniej godziny, w temperaturze pokojowej. Następnie osadzono rbc za pomocą wirowania w ciągu 5 minut, przy 300 x g, w temperaturze 4°C. Powstały tak supernatant z fagami ostrożnie zebrano i cały ten proces powtórzono jeszcze dwa razy. Po ostatniej absorpcji, supernatant z fagami wprowadzono do osadu rbc grupy O Rh+ (16 x 106 rbc) i ponownie inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu 30 minut, przy łagodnym wstrząsaniu. Następnie rbc przemywano w co najmniej 5 razy w 10 ml lodowato zimnego PBS i wirowano w ciągu 5 min, przy 300 x g, w temperaturze 4°C, po czym przeprowadzono elucję przy użyciu 200 pl 76 mM kwasu cytrynowego, pH 2,8, w ciągu 6 minut, w temperaturze pokojowej, a następnie dokonano zobojętnienia przy użyciu 200 pl 1M Tris. Po odwirowaniu rbc, przy 300 x g, w temperaturze 4°C, utworzony supernatant zawierający wyeluowane fagi ostrożnie usunięto i przechowywano z nośnikiem białkowym (0,3% BSA), w temperaturze 4°C, w stanie gotowości do reamplifikacji. W tabeli 5 podano liczbę Phab swoistych względem Rh D z każdej rundy peningu.

Tabela 5

Selekcja Phab Rh D+ z bibliotek LD1 i LD2 na rbc R1R1.

Pening Runda nr^a)	Liczba wyeluowanych fagów swoistych względem Rh D
Biblioteka Dl cfu	Biblioteka D2 cfu
1	8x 106	4,6 x 107
2	6x 10⁷	1,4 x 107
3	1 x 10⁸	7,9 x 10⁷
4	3x 108	1,3 x 108
5	3x 108	1 x 108
6	nd	2,8 x 108

a) W każdej rundzie inkubowano 10¹² Phab w probówkach z rbc grupy O RH- (faza absorpcji), z następującą po tym elucją z rbc grupy O RH+ (R1R1). nd = nie wykonano cfu = jednostki tworzące kolonie.

186 019

Przykład 3

Selekcja Phab Rh D z połączonych bibliotek LD1 i LD2 na rbc DVI+

a) Absorpcja na rbc grupy O Rh-; fenotypy 1 (r'r, CCddee) i 2 (ryry, CCddEE).

Dla każdej rundy peningu, jeszcze przed pozytywną selekcją na rbc grupy O Rh DVI+, wykonano serię czterech negatywnych absorpcji na rbc grupy O Rh-. Absorpcje negatywne przeprowadzono w następującym porządku:

Etap 1): fenotyp 1, działanie bromelazą;

Etap 2): fenotyp 1, bez podziałania bromelazą;

Etap 3): fenotyp 2, działanie bromelazą;

Etap 4): fenotyp 2, bez podziałania bromelazą.

Zamrożone rbc rozmrożono w mieszaninie sorbitu i wodnego roztworu chlorku sodowego buforowanego fosforanem, po czym odstawiono w tym roztworze na czas co najmniej 10 minut, a następnie przemyto 5-6 razy wodnym roztworem chlorku sodowego buforowanego fosforanem i ostatecznie przechowywano w roztworze stabilizującym (DiaMed ECSolution), gotowe do użycia. Przed przeprowadzeniem peningu, rbc przemyto 3 razy 0,9% NaCl, po czym zliczono w roztworze Hayemsa. Absorpcja: 1 ml preparatu fagowego w PBS/3% bSa wprowadzono do osadu rbc (2 x 10⁸) jak w etapie 1, w 12 ml probówkach (Greiner 187261, Reinach, Szwajcaria) i inkubowano w temperaturze pokojowej wciągu 30 minut, przy ostrożnym wstrząsaniu. Wszystkie probówki poddano wstępnemu blokowaniu w PBS/3% BSA w ciągu co najmniej godziny, w temperaturze pokojowej. Następnie osadzono rbc za pomocą wirowania w ciągu 5 minut, przy 300 x g, w temperaturze 4°C. Powstały tak fagowy supernatant ostrożnie zebrano i cały ten proces powtórzono przy użyciu rbc tak, jak to szczegółowo opisano w etapach 2, 3 i 4.

b) Obróbka rbc Rh D- r'r i ryry i Rh DVI+ przy użyciu bromelazy.

Do obróbki rbc Rh DVI+ użyto bromelazy 30 (Baxter, Dudingen, Szwajcaria), przy zachowaniu takich samych stosunków ilościowych, jakich użyto w rutynowym teście hemagjutynacji, to znaczy użyto 10 pl bromelazy na 2 x 10⁶ rbc. Tak więc, bromelazę dodawano do potrzebnej ilości rbc i przeprowadzano inkubację w temperaturze 37°C w ciągu 30 minut, a następnie przemywano 3 razy w 0,9 % NaCl. Po ponownym zliczeniu w roztworze Hayemsa i doprowadzeniu do żądanego stężenia w PBS/3% BSA, otrzymano rbc gotowe do wykonania peningu Phab.

c) Biopening na rbc Rh DVI+ poddanych działaniu bromelazy.

Po końcowej absorpcji na rbc ryry nie poddanych działaniu bromelazy, supernatant fagowy podzielono na 2 równe części i dodano, odpowiednio, albo do osadu rbc grupy O Rh DVI+ poddanych działaniu enzymu (40 x 10⁶), albo do osadu rbc grupy O Rh DVI+ nie poddanych działaniu enzymu (40 x 106). Następnie przeprowadzono ponowną inkubację w temperaturze pokojowej, w ciągu 30 minut, przy łagodnym wstrząsaniu. Następnie obie populacje rbc przemywano co najmniej 5 razy w 10 ml lodowato zimnego PBS, wirowano w ciągu 5 minut przy 300 x g, w temperaturze 4°C, a następnie eluowano przy użyciu 200 pl 76 mM kwasu cytrynowego, pH 2,8, w ciągu 6 minut, w temperaturze pokojowej. Po zobojętnieniu przy użyciu 200 pl 1 M Tris, rbc wirowano przy 300 x g w ciągu 5 min, w temperaturze 4°C, po czym utworzone tak supernatanty zawierające fagi wyeluowane albo z rbc DVI+ poddanych działaniu bromelazy, albo z rbc DVI+ nie poddanych działaniu bromelazy, ostrożnie usunięto i przechowywano z nośnikiem białkowym (0,3%BSA), w temperaturze 4°C, w stanie gotowości do reamplifikacji. W dalszych rundach peningu fagi wyeluowane z rbc DVI+ poddanych, lub nie poddanych, działaniu bromelazy, przetrzymywano osobno i poddano je wszystkie protokołowi absorpcji, w etapach 1 do 4. Etap elucji nieco się różnił od 1 rundy peningu, ponieważ populacje faga nie były ponownie podzielone na 2 części. Tylko te fagi, które eluowały się z rbc DVI+ poddanych działaniu bromelazy, ulegały ponownie elucji z rbc DVI+ poddanych działaniu bromelazy, a tylko te fagi, które eluowały się z rbc DVI+ nie poddanych działaniu bromelazy, ulegały ponownie elucji z rbc DVI+ nie poddanych działaniu bromelazy. Liczby dotyczące swoistych Phab po każdej rundzie peningu podano w tabeli 6.

186 019

Tabela 6

Selekcja Phab Rh D z połączonych bibliotek LD1 i LD2 na krwinkach czerwonych DVI+

Pening Runda nr	Liczba nyeluowanycg fagów swoistych względem DVI+
Bez bromelazy cfu	Z bromelazą cfu
1	1,9 x 10⁶	4,4 x 106
2	1,6 x 10⁶	4x 10⁵
3	2,4 x 107	4,1 x 107
4	3x 106	5x 107
5	1 x 10⁸	1 x 10⁸
6	nd	3x 10⁸

a) W każdej rundzie inkubowano w probówkach 10¹² Phab z 2 odmiennymi fenotypami rbc grupy O Rh- (faza absorpcji), z następującą po tym elucją z rbc grupy O Rh DVI+.

Przykład 4.

Monitorowanie rund peningu i określenie swoistości Phab obecnych w większym stężeniu przy użyciu króliczego przeciwciała antyfagowego

Test hemaglutynacji pośredniej.

Świeżo zebrane rbc z różnych układów grupowych krwi, ABO i Rh, przemyto 3 razy w 0,9% NaCl i doprowadzono do uzyskania 3 - 5% roztworu (45 - 50 x 10⁷ml) albo w 0,9% NaCl, lub PBS/3% BSA. Dla każdego zespołu warunków przeprowadzania testu, razem inkubowano 50 pl rbc i 100 pl czynników testowych (strąconego i amplifikowanego faga lub przeciwciał kontrolnych), w szklanych probówkach do oznaczania grup krwi (Baxter, Dudingen, Szwajcaria), w ciągu 30 minut, w temperaturze 37°C. Krwinki czerwone przemyto 3 razy w 0,9% NaCl, po czym inkubowano z 2 kroplami odczynnika Coombsa (Baxter Dudingen, Szwajcaria) w przypadku kontroli pozytywnych, albo z 100 pl rozcieńczonymi w stosunku 1/1000 króliczymi przeciwciałami antyfaosnymi (wytworzonymi za pomocą immunizonania królików preparatem faga VCSM13, z następującym potem oczyszczeniem na kolumnie Affi-Gel Blue i absorpcji na E. coli, z usunięciem przeciwciał swoistych względem E. coli). Probówki inkubowano w ciągu 20 minut w temperaturze 37°C, po czym wirowano w ciągu minuty przy 125 x g. Krwinki czerwone badano pod względem aglutynacji za pomocą ostrożnego wstrząsania, przy użyciu powiększającej przeglądarki.

W przypadku badania oczyszczonych Fab pod względem aglutynacji, zamiast króliczego przeciwciała αntyfαgoneoo użyto oczyszczonego metodą chromatografii powinowactwa przeciwciała anty-Fab (The Binding Site, Birmingham, Zjednoczone Królestwo).

W tabeli 7 przedstawiono wyniki testów grmaglutonacji próbek Phab po wykonaniu różnych rund peningu na rbc R1R1.

W tabeli 8 przedstawiono wyniki testów hemaglutynacji próbek Phab po wykonaniu różnych rund peningu na rbc Rh DVI+.

W tabeli 9 przedstawiono wzór rozkładu aktywności poszczególnych klonów Fab z bibliotek LD1 i LD2 z udziałem wariantów częściowego D.

Tabela 7

Monitorowanie Phab z bibliotek LD1 i LD2 z zastosowaniem testu hemaglutynacji pośredniej po peningu na rbc R1R1

Próbka Phab Runda peningu	Biblioteka LD1	Biblioteka LD2
testowana na r	bc O RH D+a)
1	2	3
Nr 4 nierozylrńnzona	+	+
1/4	+	+/-
1/:20	-	-
		- 1

186 019 ciąg dalszy tabeli 7

1	2	3
Nr 5
nierozcieńczona	++	+
1/4	++	+
1/20	-	-
Nr 6
nierozcieńczona	nd	+++
1/4	nd	++
1/20	nd	nd
Fag pomocniczy (b)
nierozcieńczona, 1/4, 1/20	-	-

a) Hemaglutynację pośrednią wykonano w szklanych probówkach, przy użyciu 50 pl rbc (40 x 107/ml) i 100 pl Phab, zaczynając od poziomu 4 x 10ⁿ/ml. Po upływie 30 min w temperaturze 37°C, rbc przemyto 3 razy i dalej prowadzono inkubacje w ciągu 20 minut w temperaturze 37°C z rozcieńczonym w stosunku 1/1000 króliczym przeciwciałem przeciwfagowym.

b) Faga pomocniczego M13 użyto jako kontroli negatywnej i wykazano brak nieswoistej aglutynacji pod wpływem samej tylko cząstki faga.

Aglutynację punktowano na skali ocen na podstawie oszacowania wizualnego, od „+++” (silna aglutynacja) zstępująco do (brak aglutynacji); nd = nie wykonano.

Tabela 8

Monitorowanie Phab z połączonych bibliotek LD1 i LD2 przez pośrednią hemaglutynację po peningu na rbc Rh DVI+

Próbka Phab Runda peningu	Fenotypy rbc
CCDDee	ccddee	Ccddee	CCddEE	DVI (E.J.)	DVI (K.S.)
rbc DVI+ bez działania bromelazy
Runda nr 3 Runda nr 5	a) +++ ++	_-	+/-	(+)	+/-	+/-
rbc DVI+ z działaniem bromelazą
Runda nr 4 Runda nr 5 Runda nr 6	+++ +++ ++++	-	- I , + + , i i 1 1	+/-	(+) (+++) +++	+/- ++ +-H-
LD1-6-17			reaktywne z C i E
LD1/2-6-3 LD 1/2-6-33	+-H-+ ++++	-	_-		+/- +	nd nd

a) Aglutynację punktowano na skali ocen na podstawie oszacowania wizualnego, od „++++” (silna aglutynacja) zstępująjąco do (brak aglutynacji); nd = nie wykonano.

Uwaga: tylko te Phab, które eluowały się z rbc DVI+ poddanych działaniu bromelazy wykazywały oznaki aglutynacji względem 2 różnych dawców DVI+.

186 019

Tabela 9

Analiza klonalna aktywności klonów Fab anty-Rh D z bibliotek LD1 i LD2 w stosunku do wariantów częściowego D

a) Fab Klon nr	Rh33	DIII	DIVa	DIVb	DVa	dvi	dvii
LD1 - 40	-	(b)+++	+	+	+/-	-	++
- 52	-	+++	-	-	+++	-	+++
- 84	-	++	-	-	-	-	+
- 110	(+)	+++	++	+	+	-	++
- 117	-	+++	-	-	-	-	++
LD2 - 1	+++	nd	+++	+++	+	-	+++
- 4	-	+++	-	+	-	-	+
- 5	-	nd	+++	+++	-	-	+++
- 10	(-)	+++	+++	+++	+	-	++
- 11	-	+++	-	-	-	-	++
- 14	+++	+++	+++	+++	+++	-	+++
- 17	-	+++	+++	+	+/-	-	+++
- 20	-	+++	+++	-	+n-	-	+++
LD1/2-6-3	++	+++	+++	-H-	+++	+	++
LD1/2-6-33	+/-	+++	+++	++	+++	+	++

a) Preparaty rozpuszczalnych Fab sporządzono z każdego klonu, z następującą potem hemaglutynacją pośrednią.

b) Aglutynację punktowano na skali ocen na podstawie oszacowania wizualnego, od „+++” (wszystkie komórki uległy zlepieniu się z utworzeniem aglutynatu) zstępująco do (komórki w ogóle się nie zlepiły).

Przykład 5

Wytwarzanie i oczyszczanie fragmentów Fab przeciwciała z przeznaczeniem do zastosowania jako odczynniki diagnostyczne

Po przeprowadzeniu czynności związanych z biopeningiem, szczegółowo opisanych w przykładach 2 i 3, wyselekcjonowano populację fagów, które wykazywały swoistą aglutynację na rbc Rh D+ i jej użyto do wytworzenia fagmidowego DNA. Bardziej szczegółowo, Phab wyselekcjonowanych na rbc R1R1 po 5-tej i 6-tej rundzie biopeningu przeprowadzonego dla bibliotek, odpowiednio, LD1 i LD2, i po 5-tej rundzie biopeningu na rbc DVI+, użyto do wyizolowania klonu LD1-6-17. W celu otrzymania rozpuszczalnego Fab, musi zaistnieć delecja sekwencji gIII kodującej białko pIII końcowego segmentu cząstki faga.

Fagmidowy DNA wytworzono z zastosowaniem zestawu Nucleotrap (Machery-Nagel), a sekwencję gIII usunięto za pomocą trawienia tak otrzymanego fagmidowego DNA przy użyciu Nhe1/Spe1 w sposób opisany przez D.R. Burtona i in. (PNAS, 1989). Po transformacji do XL1-Blue wyselekcjonowano poszczególne klony (nazewnictwo podano w tabeli 1) i prowadzono ich wzrost w LB (br^lic^n Furia) zawierająccrn 50 pgbnl kaabenicyllny, w temperaturze 37°C, do uzyskania gęstości optycznej (OD) wynoszącej 0,6 przy 600 nm. Hodowle indukowano 2 mM ionpropyln-β-D-tingalaktopirannzydem (IPTG) (Biofin^, Praroman, Szwajcaria) i prowadzono ich wzrost pbzeo noc, w temperaturze 37°C. Całą hodowlę wirowano przy 10000 x g, w ciągu 30 min, w trmprbjtrbor 4°C, w celu osadzenia bakterii. Na osad bakterii podziałano roztworem lisnoym./DNaoa w celu uwolnienia fragmentów Fab wewoątrz komórek. Gdy pewna ilość Fab uwalniała się do supernatantu hodowli, zbierano także ją osobno. Tak otrzymywane preparaty Fab połączono i wytrącono 60% siarczanem amonu (Merck, Darmstadt, Niemcy) w celu zatężenia Fab, po czym poddano je wyczerpującej dializie w wodnym roztworze chlorku sodowego buforowanym fosforanem (PBS) oraz ultrawirowaniu przy 200000 x g, w celu osadzenia jakichkolwiek obecnych kompleksów niernopusz18

186 019 czalnych. Następnie, przeprowadzono oczyszczanie preparatów Fab na kolumnie z wypełnieniem ceramicznym (hydroksyapatyt; HTP Econo cartridge, BioRad, Glattburg, Szwajcaria), z zastosowaniem elucji gradientowej przy użyciu PBS (bufor A) i PBS + 0,5 M NaCl (bufor B). Gradient liniowy zaprogramowano tak, aby następował wzrost od 0 do 100% buforu B w ciągu 40 minut. Fab eluowano jako pojedynczy pik w zakresie od 40 do 60% buforu B. Frakcje pozytywne, według oznaczenia metodą immunodottingu z użyciem koniugatu peroksydazy anty-Fab (The Binding Site, Birmingham, Zjednoczone Królestwo) połączono i zatężono przy użyciu poli(glikolu etylenowego), po czym poddano wyczerpującej dializie wobec PBS. Frakcji pozytywnych z kolumny hcdroksyapatctu dla każdego klonu użyto w klasycznym teście hemaglutynacji pośredniej, przeprowadzanym w szklanych probówkach z zastosowaniem albo typowego odczynnika Coombsa (Baxter Diagnostics AG Dade, surowica anty-ludzka), albo anty-Fab (The Binding Site, Birmingham, Zjednoczone Królestwo), jako odczynnika łączącego krzyżowo. Tych Fab o określonej swoistości względem wariantów częściowego D, jak to przedstawiono powyżej (tabela 8), można użyć do typowania rbc o nieznanym fenotypie częściowego D.

Przykład 6

Konstrukcja kompletnych genów immunoglnbuliac

Gen V ciężkiego łańcucha LD2-14 (gen Vh) amplifikowano z plazmidu LD2-14 kodującego anty-Fab Rh D z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przy użyciu specyficznych starterów. Starter 5' miał sekwencję następującą:

'-GGGTCGACGCACAGGTGAAACTGCTCGAGTCTGG-3', podczas gdy starter 3' miał sekwencję następującą: 5'-GCCGATGTGTAAGGTGACCGTGGTCCCCTTG-3'.

Reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu polimerazy DNA Deep Vent i roztworu buforowego (2 mM Mg⁺⁺) z firmy New England Biolabs, z zachowaniem warunków reakcji zalecanych przez wytwórcę, przy użyciu 100 pmoli każdego startera oraz czterech dezoksynukleotydów, każdego w stężeniu 250 pM. Reakcja przebiegała w 30 cyklach z przyjęciem następujących czasów i temperatur: 60 s w temperaturze 94°C (wydłużenie o 2 min w pierwszym cyklu), 60 s w temperaturze 57°C i 60 s w temperaturze 72°C (wydłużenie o 10 min w ostatnim cyklu). Poamplifikacyjnego dodania 3'-końcowcch wystających części nici A DNA dokonano przez następującą potem 10-minutową inkubację w temperaturze 72°C w obecności 1 jednostki polimerazy DNA Taq (Boehrinegr Mannheim, Niemcy). Produkt PCR poddano oczyszczaniu przy użyciu zestawu „QIAquick PCR Purificatioa Kit” (Qiagen, Szwajcaria) i klonowano do wektora pCRII przy użyciu zestawu „TA C^ing Kit” (San Diego, USA). Po strawieniu otrzymanego plazmidu TAVH14 przy użyciu Sa/1 i BstEII, gen Vh wyizolowano metodą pbzparatcwnej elektroforezy w żelu agarazowym przy użyciu zestawu „QIAquick Gel EKtraction Kit” z firmy Qiagen.

Wektor # 150 (Sandoz Pharma, Bazyleja), zawierający nieistotny tu, chociaż nienaruszany ludzki genomowy gen Vh immunoglobuliny wycięto przy użyciu Sa/I i Bst/EII, po czym fragment wektorowy wyodrębniono metodą przparatCwaej elektroforezy w żelu agarozowym przy użyciu zestawu „QIAquick Gel Extraction Kit” z firmy Qiagza. Ligowanie wektora z produktu PCR przeprowadzono w temperaturze 25°C w ciągu 2 godzin, w całkowitej objętości 20 pl przy użyciu zestawu „Rapid DNA Ligation Kit” (Boehringer Mannheim, Niemcy). Po dokonaniu ligowania, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 20 pl H2O i poddano ekstrakcji 10 objętościami n-butanolu w celu usunięcia soli. Następnie DNA osadzono przez odwirowanie i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym zawieszono w 10 pl H2O. 5 pl tak otrzymanego roztworu DNA wprowadzono metodą zlzktbopobacji (0,1 cm kuwetki, 1,9 kV, 200 Ω, 25 pFD) przy użyciu urządzenia GenePulser (BioRad, Gaithersburg) do 40 pl elektropora^nie kompetentnych komórek E. coli XL1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla), rozcieńczonych podłożem SOC, inkubowanych w temperaturze 37°C w ciągu godziny i wysianych na płytki LB zawierające ampicylinę w stężeniu 50 pg/ml. Przy użyciu produktów trawienia restrykcyjnego badano miaiprepabatc plazmidowe (Qiagen, Bazyleja) utworzonych kolonii, pod względem obecności odpowiedniego insertu.

186 019

W ten sposób, nieistotny tu gen Vh obecny w wektorze #150 został zastąpiony amplifikowaną sekwencją Vh anty-Rh D z LD2-14, w wyniku czego uzyskano plazmid naosVHl4. Strukturę wytworzonego tak konstruktu, stanowiącego gen Vh immunoglobuliny, potwierdzono za pomocą sekwencjononania i po wycięciu za pomocą trawienia przy użyciu EcoRI i BamHI, poddano go oczyszczaniu sposobem powyżej opisanym. Wektor ekspresyjny #10 (Sandoz Pharma, Bazyleja), zawierający odcinek ludzkiego genomonego genu immunoglobuliny Cyl, także poddano trawieniu przy użyciu EcoRI i BamHI, po czym wyizolowano go metodą preparatywnej elektroforezy w żelu agarozowym i ligowano z odcinkiem EcoRI/BamHI genu Vh, otrzymanym poprzednio z plazmidu nassVH14, a następnie dokonano jego elektroporacji do komórek E. coli XL1-Blue MRF' w sposób powyżej opisany. W wyniku tego, otrzymano kompletny gen łańcucha ciężkiego immunoglobuliny anty-Rh D w wektorze ekspresyjnym 14IgG1 (fig. i).

Z tego samego anty-Rh D-Fab plazmidu LD2-14 amplifikowano gen V łańcucha lekkiego LD2-14 (gen Vl) metodą PGR przy użyciu specyficznych starterów. Starter 5' miał sekwencję następującą:

5'-TACGCGTTGTGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAT-3', podczas gdy starter 3' miał sekwencję następującą: 5'-AGTCGCTCAGTTCGTTTGATTTCAAGCTTGGTCC-3'.

Etapy reakcji PCR, oczyszczania jej produktu i następującego potem klonowania przeprowadzono w sposób analogiczny do sposobu opisanego odnośnie do genu Vh, z tą różnicą, że użyto odpowiednich wektorów łańcucha lekkiego. Mówiąc krótko, Vl jako produkt PCR, klonowano do wektora pCRII dostarczającego plazmidu TAVL14, z którego gen wycięto przy użyciu MluI i Hindlll i wyodrębniono metodą ekstrakcji żelowej. Następnie gen Vl klonowano do miejsc MluI i Hindlll wektora #151 (Sandoz Pharma, Bazyleja), zastępując w ten sposób nieistotny tu gen Vl amplifikowaną anty-Rh D sekwencją Vl z LD2-14. Po potwierdzeniu sekwencji utworzonego tak plazmidu caosVL-14, fragment EcoRI/XbaI zawierający gen Vl subklonowano do miejsc restrykcyjnych EcoRI i XbaI wektora # 98 (Sandoz Pharma, Bazyleja, Szwajcaria), który zawiera odcinek ludzkiego grnomsweoo genu immunoglobuliny C_K. Tym sposobem zastąpiono nieistotny tu, obecny gen Vl w plazmidzie # 98 i otrzymano wektor ekspresyjny 14 kappa, zawierający kompletny gen łańcucha lekkiego immunoglobuliny anty-Rh D.

Linię komórek mysiego szpiczaka SP2/0-Ag 14 (ATCC CRL1581) kotransfekowano za pomocą elektroporacji razem z wektorami ekspresyjnymi 14igG1 i 14 kappa, uprzednio przeprowadzonymi w postać liniową, do unikalnego miejsca rozszczepienia, odpowiednio, EcoRI i Not\. Elektroporację przeprowadzono w sposób następujący: komórki zebrane w fazie logarytmicznej dwukrotnie przemyto i zawieszono w sacharozie buforowanej fosforanem (272 mM sacharozy, 1 mM MgCk, 7 mM NaH2PO4, pH 7,4), przy gęstości wynoszącej 2 x 107 komórek/ml. Następnie, 0,8 ml zawiesiny komórek wprowadzono do 0,4 ml kuwetki i zmieszano z 15 pg przeprowadzonych w postać liniową plazmidów 14IgG1 i 14 kappa, po czym przetrzymano na lodzie w ciągu 15 minut i poddano elektroporacji (290 woltów, 200 Ω, 25 pFD), po czym ponownie przetrzymano na lodzie w ciągu 15 minut i przeniesiono do kolby do hodowli komórek T75 zawierającej 20 ml zimnego podłoża RPMI 1640 (10% termicznie inaktynsnanej płodowej surowicy bydlęcej, 50 pM p-merkaptoetanol), pozostawiono na 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano w ciągu 60 godzin w temperaturze 37°C. Po upływie tego czasu, komórki przeniesiono do 50 ml podłoża zawierającego 1 mg/ml G418 w celu przeprowadzenia selekcji. Następnie stabilne transfektanty wyselekcjonowano w obecności metotreksatu we wzrastających stężeniach, w celu amplifikowania zintegrowanego DNA, a przez to wzmożenia ekspresji odnośnego przeninnlαła rD2-14.

Ekspresję rD2-14 w supematancie hodowli (SrD2-14) monitorowano z wykorzystaniem enzymatycznego testu immżnsabsorpcojneoo (ELISA), specyficznego dla łańcuchów y1 i kappa człowieka. Knantyfikacja immunoglobulin swoistych względem Rh D, dokonana z zastosowaniem testu anty-D (według Ph. Eur.) potwierdziła obecność w tych supematantach przeciwciała aolutynżjanego w zakresie od 1,1 do 11,4 pg/ml. Zbadano aglutynację negatywną dla rbc Rh- i potwierdzono taki sam potencjał aglutynacyjny wobec wariantów częściowe20

186 019 go D, jak w przypadku Fab LD2-14, do ekspresji których doszło w komórkach E. coli. Otrzymane dane przedstawiono w tabeli 10.

Tabela 10

Analiza porównawcza aktywności klonu Fab anty-Rh D LD2-14 i przeciwciała rD2-14 przeciw wariantom częściowego D

Claims

1. Polipetydy zdolne do neoroenio strnktur wiążących antygeny, o swoistości wośCędem antygenów Rg D, obejmujące swoiste względem Rg D regiony CDR 1, CDR 2 i CDR 3 par sekwencji aminokwasów Vh i Vl, o takich samych lub różnych numerach identyfikanyjnyng, zgodnie z figurami wyszczególnionymi w poniższej tabeli.

Nr identyfikacyjny Vh Vl Figura CDR1 para zasad nr CDR 2 para zasad nr CDR 3 para zasad nr Figura CDR1 para zasad nr CDR 2 para zasad nr CDR 3 para zasad nr LD1-40 fig. la 91-105 148-198 295-342 fig. 1b 64-96 142-162 259-288 LD1-52 fig. 2a 91-105 148-198 295-342 fig. 2b 64-96 142-162 259-288 LD1-84 fig. 3a 91-105 148-198 295-342 fig. 3b 64-96 142-162 259-285 LD1-110 fig. 4a 91-105 148-198 295-342 fig. 4b 64-96 142-162 259-285 LD1-117 fig. 5a 91-105 148-198 295-345 fig. 5b 64-96 142-162 259-288 LD2-1 fig. 6a 91-105 148-198 295-342 fig. 6b 61-99 145-165 262-294 LD2-4 fig. 7a 91-105 148-198 295-342 fig. 7b 64-96 142-162 259-282 LD2-5 fig. 8a 91-105 148-198 295-342 fig. 8b 64-96 142-162 259-288 LD2-10 fig. 9a 91-105 148-198 298-345 fig. 9b 61-102 148-168 265-294 LD2-11 fig. 10a 91-105 148-198 295-342 fig. 10b 64-96 142-162 259-285 LD2-14 fig. 11a 91-105 148-198 295-342 fig. 11b 64-96 142-162 259-285 LD2-17 fig. 12a 91-105 148-198 295-342 fig. 12b 64-96 142-162 259-285 LD2-20 fig. 13a 91-105 148-198 295-342 fig. 13b 64-96 142-162 259-285 LD1-6-17 fig. 14a 91-105 148-198 295-351 fig. 14b 64-96 142-162 259-285 LD1/2-6-3 fig. 15a 91-105 148-198 295-342 fig. 15b 64-96 142-162 259-285 LD 1/2-6-33 fig. 16a 91-105 148-198 295-342 fig. 16b 64-96 142-162 259-285

2. Polipeptydy według zastrz. 1, obejmujące swoiste względem Rh D regiony CDR 1, CDR 2 i CDR 3 par sekwencji aminokwasów Vhc Vl, o takich samych numerach identyfikacyjnych, zgodnie z figurami wyszczególnionymi w tabeli zamieszczonej w zastrz. 1.

3. Polipetydy według zastrz. 1, obejmujące regiony z sekwencjami aminokwasów Vh i Vl i posiadające numery identyfikacyjne, zgodnie z figurami wyszczególnionymi w tabeli zamieszczonej w zastrz. 1.

4. Pslipeptydo według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienne tym, że stanowią fragmenty Fab wiążące się z antygenem.

5. Polipeptydy według zastrz. 1 albo 2, albo 3, zawierające łańcuch ciężki i łańcuch lekki immunoglobuliny, zdolne do tworzenia kompletnych przeciwciał anty-Rh D.

6. Sekwencje DNA kodujące polipeptydy zdolne do tworzenia struktur wiążących antygen, o swoistości względem antygenów Rh D, obejmujące regiony ze swoistymi względem Rh D

186 019 odcinkami CDR 1, CDR 2 i CDR 3 par sekwencji DNA Vh i Vl, o tych samych lub różnych numerach identyfikacyjnych, zgodnie z figurami wyszczególnionymi w poniższej tabeli, oraz ich funkcjonalne równoważniki.

Nr identyfikacyjny Vh Vl Figura CDR1 para zasad nr CDR 2 para zasad nr CDR 3 para zasad nr Figura CDR1 para zasad nr CDR 2 para zasad nr CDR 3 para zasad nr LD1-40 fig. 1a 91-105 148-198 295-342 fig. 1b 64-96 142-162 259-288 LD1-52 fig. 2a 91-105 148-198 295-342 fig. 2b 64-96 142-162 259-288 LD1-84 fig. 3a 91-105 148-198 295-342 fig. 3b 64-96 142-162 259-285 LD1-110 fig. 4a 91-105 148-198 295-342 fig. 4b 64-96 142-162 259-285 LD1-117 fig. 5a 91-105 148-198 295-345 fig. 5b 64-96 142-162 259-288 LD2-1 fig. 6a 91-105 148-198 295-342 fig. 6b 61-99 145-165 262-294 LD2-4 fig. 7a 91-105 148-198 295-342 fig. 7b 64-96 142-162 259-282 LD2-5 fig. 8a 91-105 148-198 295-342 fig. 8b 64-96 142-162 259-288 LD2-10 fig. 9a 91-105 148-198 298-345 fig. 9b 61-102 148-168 265-294 LD2-11 fig. 10a 91-105 148-198 295-342 fig. 10b 64-96 142-162 259-285 LD2-14 fig. 11a 91-105 148-198 295-342 fig. 11b 64-96 142-162 259-285 LD2-17 fig. 12a 91-105 148-198 295-342 fig. 12b 64-96 142-162 259-285 LD2-20 fig. 13a 91-105 148-198 295-342 fig. 13b 64-96 142-162 259-285 LD1-6-17 fig. 14a 91-105 148-198 295-351 fig. 14b 64-96 142-162 259-285 LD 1/2-6-3 fig. 15a 91-105 148-198 295-342 fig. 15b 64-96 142-162 259-285 LD 1/2-6-33 fig. 16a 91-105 148-198 295-342 fig. 16b 64-96 142-162 259-285

7. Sekwencje DNA według zastrz. 6, kodujące polipeptydy zdolne do tworzenia struktur wiążących antygen, o swoistości względem antygenów Rh D, obejmujące regiony ze swoistymi względem Rh D odcinkami CDR 1, CDR 2 i CDR 3 par sekwencji DNA Vh i Vl, o takich samych lub różnych numerach identyfikacyjnych zgodnie z figurami wyszczególnionymi w zastrz. 6.

8. Sekwencje DNA według zastrz. 6 lub 7, obejmujące regiony z sekwencjami DNA Vh i Vl, o numerach identyfikacyjnych zgodnie z figurami wyszczególnionymi w zastrz. 6.

9. Sekwencje DNA według zastrz. 6 albo 7, albo 8, kodujące polipeptydy zdolne do tworzenia fragmentów Fab wiążących antygen.

10. Sekwencje DNA według zastrz. 6 albo 7, albo 8, kodujące polipeptydy zdolne do tworzenia kompletnych przeciwciał anty-Rh D.

11. Sposób wytwarzania polipeptydów rekombinantowych zdolnych do tworzenia struktur wiążących antygen, na przykład fragmentów Fab, o swoistości względem antygenów Rh D, znamienny tym, że kolejno:

a) stymuluje się osobnika zdolnego do tworzenia przeciwciał anty-Rh D przy użyciu krwinek czerwonych Rh D+,

b) · wyodrębnia się ze wspomnianego osobnika komórki jednojądrowe,

c) wyodrębnia się z komórek jednojądrowych całkowity RNA,

d) wytwarza się cDNA przez zastosowanie startera oligo(dT) i odwróconej transkrypcji mRNA z użyciem odwrotnej transkryptazy M-MuLV, oraz amplifikowanie zbioru cDNA na drodze reakcji łańcuchowej polimerazy z użyciem starterów specyficznych dla rodziny genów immunoglobulin,

186 019

e) tworzy się fagową bibliotekę prezentacyjną za pomocą insercji DNA kodującego · łańcuch ciężki i łańcuch lekki polipetydu Fab do wektora fagomidowego, przy czym DNA dla łańcucha ciężkiego zostaje wstawiony w ramce do genu kodującego fagowe białko pili, co umożliwia ekspresję białka fuzyjnego Fab pili na powierzchni faga,

f) transformuje się komórki bakteryjne otrzymanymi plazmidami rekombinantowymi, hoduje się transformowane komórki bakteryjne i doprowadza do koekspresji łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego Fab na cząstkach faga nitkowatego,

g) amplifikuje się faga niosącego Fab w bakteriach,

h) selekcjonuje się poszczególne klony fagów przez wykonanie szeregu rund peningu na krwinkach czerwonych Rh+,

i) wyodrębnia się plazmidowy DNA z wyselekcjonowanych klonów i wycina się gen gUI,

j) transformuje się komórki bakteryjne otrzymanym plazmidem, przeprowadza się hodowlę transformowanych komórek bakteryjnych, w których dochodzi do ekspresji Fab i wyodrębnia się fragmenty Fab.

12. Sposób selekcjonowania polipeptydów rekombinantowych zdolnych do tworzenia struktur wiążących antygen, o swoistości względem antygenów Rh D, a w szczególności wykazujących aktywność w stosunku do wariantu częściowego Rh DVI, bez przejawiana jakiejkolwiek aktywności w stosunku do krwinek czerwonych o fenotypach Rh-, a zwłaszcza bez przejawiania aktywności w stosunku do alleli Rh C, c, E i e, znamienny tym, że kolejno:

a) przeprowadza się szereg negatywnych absorpcji na następujących krwinkach czerwonych: fenotyp 1 (r'r, Ccddee), działanie bromelazą; fenotyp 1, bez działania bromelazą; fenotyp 2 (ryry, CcddEE), działanie bromelazą; fenotyp 2, bez działania bromelazą,

b) przeprowadza się pozytywną absorpcję na krwinkach czerwonych DVI+ z ewentualną obróbką z udziałem bromelazy,

c) oznacza się miano faga wiążącego się z krwinkami czerwonymi DVI+,

d) powtarza się etapy a), b) i c), aż do osiągnięcia przez miano faga wiążącego się z krwinkami czerwonymi DVI+ pożądanego poziomu.

13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że rekombinantowymi polipeptydami zdolnymi do tworzenia struktur wiążących antygen są fragmenty Fab.

14. Przeciwciała anty-Rh D, zawierające zmienne regiony łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego, obejmujące swoiste względem Rh D sekwencje cDr 1, CDR 2 i CDR 3 par sekwencji aminokwasów Vh i V_L, o tych samych lub różnych numerach identyfikacyjnych, zgodnie z numerami wyszczególnionymi w poniższej tabeli.

Nr identyfikacyjny Vh Vl Figura CDR1 para zasad nr CDR 2 para zasad nr CDR 3 para zasad nr Figura CDR1 para zasad nr CDR 2 para zasad nr CDR 3 para zasad nr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 LD1-40 fig. la 91-105 148-198 295-342 fig. 1b 64-96 142-162 259-288 LD1-52 fig. 2a 91-105 148-198 295-342 fig. 2b 64-96 142-162 259-288 LD1-84 fig. 3a 91-105 148-198 295-342 fig. 3b 64-96 142-162 259-285 LD1-110 fig. 4a 91-105 148-198 295-342 fig. 4b 64-96 142-162 259-285 LD1-117 fig. 5a 91-105 148-198 295-345 fig. 5b 64-96 142-162 259-288 LD2-1 fig. 6a 91-105 148-198 295-342 fig. 6b 61-99 145-165 262-294 LD2-4 fig. 7a 91-105 148-198 295-342 fig. 7b 64-96 142-162 259-282 LD2-5 fig. 8a 91-105 148-198 295-342 fig. 8b 64-96 142-162 259-288 LD2-10 fig. 9a 91-105 148-198 298-345 fig. 9b 61-102 148-168 265-294 LD2-11 fig. 10a 91-105 148-198 295-342 fig. 10b 64-96 142-162 259-285

186 019 ciąg dalszy tabeli 1 2 3 4 5 6 7 8 9 LD2-14 fig. 11a 91-105 148-198 295-342 fig. 11b 64-96 142-162 259-285 LD2-17 fig. 12a 91-105 148-198 295-342 fig. 12b 64-96 142-162 259-285 LD2-20 fig. 13a 91-105 148-198 295-342 fig. 13b 64-96 142-162 259-285 LD1-6-17 fig. Ma 91-105 148-198 295-351 fig. 14b 64-96 142-162 259-285 LD 1/2-6-3 fig. 15a 91-105 M8-198 295-342 fig. 15b 64-96 142-162 259-285 LD 1/2-6-33 fig. 16a 91-105 148-198 295-342 fig. 16b 64-96 142-162 259-285

15. Przeciwciała anty-Rh D, zawierające zmienne regiony łańcucha ciężkiego i lekkiego, obejmujące swoiste względem Rh D sekwencje CDR 1, CDR 2 i CDR 3 par sekwencji aminokwasów VHiV_L swoiste względem Rh D, o takich samych numerach identyfikacyjnych, jakie wyszczególniono w tabeli zamieszczonej w zastrz. 14.

16. Przeciwciała anty-Rh D według zastrz. 14 albo 15, zawierające pary sekwencji aminokwasów Vh i Vl o numerach identyfikacyjnych zgodnie z numerami wyszczególnionymi w tabeli zamieszczonej w zastrz. 14.

17. Przeciwciała anty-Rh D według zastrz. 14, 15 lub 16, w których stałe regiony immunoglobuliny stanowią, co najmniej, jeden z izotypów IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4.

18. Sposób wytwarzania kompletnych przeciwciał anty Rh D według któregokolwiek z zastrz. 14 - 17, znamienny tym, że kolejno:

a) amplifikuje się osobno partnerów pary odcinka genu V łańcucha ciężkiego i odcinka genu V łańcucha lekkiego, zawierających swoiste względem Rh D regiony CDR 1, CDR 2 i CDR 3, jak to przedstawiono na fig. fig., odpowiednio, la - 16a i 1b - 16b, z plazmidu kodującego Fab anty-Rh D, za pomocą przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy przy użyciu specyficznych starterów,

b) wytwarza się osobno geny kompletnego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny antyRh D i kompletnego łańcucha lekkiego immunoglobuliny anty-Rh D w stosownych plazmidach zawierających odcinki genu stałego regionu immunoglobuliny, kodujące jeden z ludzkich łańcuchów ciężkich γ1, γ2, γ3 i γ4 i ludzki κ, albo łańcuch lekki X i transformuje się otrzymane tak plazmidy osobno w odpowiednich bakteriach E. coli, oraz

c) kotransfekuje się otrzymane plazmidy do stosownych eukariotycznych komórekgospodarzy, prowadzi się hodowlę tych komórek, oddziela się komórki, które nie uległy transformacji, przeprowadza się klonowanie kolonii, wyselekcjonowuje się najlepiej produkujący klon, wykorzystuje się go jako kulturę produkcyjną i wyodrębnia się kompletne przeciwciała z supernatantu hodowli komórkowej.

19. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera co najmniej jeden polipeptyd odpowiadający definicji podanej w zastrz. 1 albo 2, albo 3, oraz co najmniej jedno przeciwciało anty-Rh D według któregokolwiek z zastrz. 14 - 17, przeznaczona do zapobiegania chorobie hemolitycznej noworodków, do leczenia plamicy małopłytkowej idiopatycznej i do stosowania w przypadku nieprawidłowej transfuzji krwi niezgodnej w układzie Rh.

20. Kompozycja diagnostyczna, przeznaczona do typowania Rh D, znamienna tym, że zawiera fragmenty Fab według zastrz. 4, albo przeciwciała anty-Rh D według któregokolwiek z zatrz.14 - 17.