NO327947B1 - Polypeptider som kan danne antigenbindende strukturer med spesifisitet for Rhesus D-antigener, DNA-sekvenser, fremgangsmater for seleksjon av rekombinante polypeptider som kan danne antigenbindende strukturer med spesifisitet for Rhesus D-antigener, anti-Rhesus D-antistoffer, framgangsmate for fremstilling av fullstendige anti-Rhesus D-antistoffer, farmasoytisk preparat samt diagnostisk preparat for Rhesus D-type bestemmelse - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse omfatter polypeptider som kan danne

antigenbindende strukturer med spesifisitet for Rhesus D-antigener, DNA-sekvenser, fremgangsmåte for seleksjon av rekombinante polypeptider som kan danne antigenbindende strukturer med spesifisitet for Rhesus D-antigener, anti-Rhesus D-antistoffer, fremgangsmåte for fremstilling av fullstendige anti-Rhesus D-antistoffer, farmasøytisk preparat samt diagnostisk preparat for Rhesus D-typebestemmelseAntistoffene ka

Det beskrives også anvendelse av Fab-molekylene enten alene eller sammen

med Fc-konstante områder i form av komplette antistoffer for behandling av andre forstyrrelser som kan dra fordel av anti-Rhesus D-immunglobulin, f.eks. behandling av idiopatisk trombocytopenisk purpura (ITP).

I tillegg kan anti-Rhesus D-immunglobulin anvendes etter feil overføring av

rhesus positivt blod til rhesus negative resipienter for å forebygge sensibilisering for Rhesus D-antigenet. Det beskrives videre anvendelsen av disse Fab-fragmenter og - antistoffer som diagnostiske midler.

HDN er den generelle angivelse for hemolytisk anemi hos fostere og nyfødte

babyer forårsaket av antistoffer fra moren. Disse antistoffer er rettet mot antigener på overflaten av de føtale erytrocytter. Disse antigener kan tilhøre rhesus, ABO eller andre blodgruppesystemer.

Rhesusblodgruppesystemet omfatter 5 hovedantigener: D, C, c, E og e (Issitt,

P.D., Med. Lab. Sei. 45:395,1988). D-antigenet er det mest viktige av disse antigener ettersom det er meget immunogent og gir anti-Rhesus-D-antistoffer under rhesusin-kompatible graviditeter og etter transfusjon av rhesusinkompatibelt blod. D-antigenet er funnet i omtrent 85 % av europeerne i Europa og disse individer er ansett for å være rhesus-positive. Individer som mangler D-antigenet kalles rhesus-negative. Uttrykket

av D-antigenet kan variere som følge av enten lav antigentetthet, heretter kjent som D

eller Du, eller som følge av delvis antigenisitet, heretter kjent som delvise D-antigener.

Rhesus D-antigen, som er et membranprotein fra erytrocytten, har nylig blitt

klonet og primærstrukturen til denne er beskrevet (Le Van Kim, C, et al., PNAS 89:10925,1992). Modellstudier antyder at Rhesus D-antigenet har 12 transmembran-områder med kun meget korte forbindende områder som strekker seg utenfor cellemembranen eller som stikker ut i cytoplasmaet.

De delvise D-fenotyper ble først identifisert hos mennesker som bar D-

antigenet på deres røde blodceller, men som hadde et alloanti-D i deres sera (Rose, R.

R. og Sanger, R., Blood groups in man, Blackwell Scientific, Oxford, U.K. 1975; Tippett, P. et al., Vox Sanguinis, 70:123, 1996). Dette kan forklares ved at antigenet har en mosaikkstruktur med minst 9 ulike epitoper (epDl til epD9). Hos enkelte D-variantpersoner mangler således de røde blodceller deler av denne mosaikk og antistoffene fremstilles med de manglende D-epitoper. Rhesus-positive individer som lager antistoffer mot delvise D-antigener er klassifisert i seks hovedulike kategorier (D<11> til D<vn>) hver med en ulik abnormalitet i D-antigenet. I den senere tid er det vist at disse D-kategorier gir ulike reaksjonsmønstre ved testing mot paneler av humane monoklonale anti-D-antistoffer (Tippett, P., et al., Vox Sanguinis, 70:123, 1996). De ulike reaksjonsmønstre identifiserte de 9 epitoper som således definerer de ulike delvise D-kategorier. Antallet epitoper til stede på D-antigenet varierer fra én delvis D-kategori til en annen der D<VI->kategorien uttrykker minst epD3, 4 og 9. DVI" kategorien er klinisk viktig ettersom en D<VI->kvinne kan immuniseres sterkt nok til å forårsake hemolytisk sykdom hos den nyfødte.

Den profylaktiske virkning av anti-RhD IgG for forebyggelse av hemolytisk sykdom hos nyfødte er godt kjent og har vært rutinemessig anvendt i mange år. Som følge av dette har denne alvorlige sykdom blitt sjelden. Likevel er den underliggende forårsakelse til sykdom, f.eks. RhD-inkompatibilitet mellom en RhD-negativ mor som bærer et RhD-positivt barn fortsatt til stede og krever således en kontinuerlig tilføring av terapeutisk anti-RhD IgG.

I de senere år har forsikringen om en kontinuerlig forsyning av anti-RhD IgG blitt et økende problem. Oppsamlingen av tilgjengelig hyperimmunt serum fra alloimmuniserte rhesus- negative kvinner som har født to eller flere barn er drastisk redusert som følge av suksessen med profylaktisk anti-RhD. De foreliggende fremgangsmåter for produksjon krever således gjentatt immunisering fra en gruppe donorer som er økende tilbakeholdende, for produksjon av antiserum med høy titer (Selinger, M., Br. J. Obstet. Gynaecol, 98:509,1991). Det er også forbundet med risikofaktorer og tekniske problemer ved anvendelsen rhesus-positive røde blodceller for repetert immunisering, dette innebærer risikoen for overføring av virus-sykdommer, slik som hepatitt B, AIDS og andre foreløpig ukjente virus (Hughes-Jones, N.C., Br. J. Haematol. 70:263,1988). Derfor er en alternativ fremgangsmåte for produksjon av anti-RhD-antistoffer påkrevet.

I løpet av de siste få år har ulike alternative kilder for hyperimmunserum blitt utprøvd, men alle er forbundet med ulemper. Epstein Barr Virus (EBV)-transformasjon av lymfocytter som danner B-lymfoblastoidcellelinjer som sekrerer spesifikt antistoff deriblant mot Rhesus D-antigenet (Crawford et al., Lancet 386: 19. febr. 1983) er ustabil og krever omfattende kloning. Også som følge av de lave transformasjonseffektiviteter (1-3 % i B-celler) kan kun et begrenset nivå antistoffspesifisiteter erholdes fra det potensielle repertoar. I tillegg ser det ut til at mus ikke responderer på Rhesus-D-antigen og således er ingen murine monoklonale antistoffer tilgjengelige som kunne vært anvendt for produksjon av kimære eller humaniserte antistoffer. Inntil for kort tid siden var det eneste andre alternativ, produksjon av humane antistoffer ved hjelp av hybridomteknikken som også var begrenset på grunn av mangelen på en egnet human myelomcellefusjonspartner (Kozbor, D. og Roder, J.C. Immunol. Today. 4:72,1983).

Det er således en målsetning med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe Fab-fragmenter som er reaktive mot Rhesus D-antigenet i tillegg til fullstendige antistoffer omfattende Fab-fragmenter som mangler de ovenfor nevnte ulemper.

I løpet av de siste få år har kloningsteknikkrepertoaret og konstruksjonen av fag display- biblioteker åpnet opp nye muligheter for produksjon av humane antistoffer med definert spesifisitet (Williamson, R.A. et al., PNAS 90:4141,1993). Disse fremgangsmåter ble således anvendt for fremstillingen av polypeptider om kan danne antigenbindende strukturer med spesifisitet for Rhesus D-antigener, særlig for Fab-fragmenter med en aktivitet mot Rhesus D- og delvise D-antigener.

Genereringen av humane antistoffer ved hjelp av repertoarkloning, som beskrevet i de senere år (Barbas III, CF. og Lerner, R.A., Companion Methods Enzymol. 2:119,1991) er basert på isolering av mRNA fra perifere B-celler. Denne fremgangsmåte gir muligheten av å isolere naturlige antistoffer, autoantistoffer eller antistoffer generert under forløpet av en immunrespons (Zebedee, S.L. et al., PNAS 89:3175, 1992; Vogel, M. et al., Eur. J. Immunol. 24:1200,1994). Denne fremgangsmåte bygger på konstruksjon av et rekombinant antistoffbibliotek fra en spesifikk donor med utgangspunkt i mRNA som koder for immunglobulin (Ig)-molekyler. Ettersom kun de perifere blodlymfocytter (PBL) kan isoleres fra en donor, øker sannsynligheten for å finne spesifikke antistoffproduserende B-celler i periferien dersom et individ innsprøytes med det ønskede antigen kort forut for innhøsting av PBL (Persson, M.A-A., et al., PNAS 88:2432, 1991). Total-RNA isoleres så og mRNA fra lg repertoaret kan klones ved anvendelse av Ig-spesifikke primere i polymerasekjedereaksjonen (PCR) etterfulgt av koekspresjon av tunge og lette kjeder fra Ig-molekylet på overflaten av en filamentøs fag-partikkel, som således danner en "organisme" som i likhet med en B-celle kan binde til et antigen. I litteraturen er denne fremgangsmåte også kjent som den kombinatoriske tilnærming ettersom denne tillater uavhengig kombinering av tunge og lette kjeder for å danne et funksjonelt Fab-antistoffragment bundet til én av haleproteinene, kalt pill, til en filamentøs fag. Fag som bærer Fab-molekyler (heretter kjent som Phab-partikler) utvelges for den ønskede antigenspesifisitet, ved hjelp av en fremgangsmåte kjent som bio-panning. Antigenet kan anvendes på en fast understøtte, spesifikke Phab binder til antigenet mens ikke-spesifikke Phab vaskes fra og til slutt elueres spesifikke Phab fra den faste understøtte. Spesifikke Phab amplifiseres så i bakterier, som tillates å bindes på ny til antigenet på den faste understøtte og hele prosessen med bio-panning repeteres.

Siegel D. L., Annals N. Y. Acad. of Sei, nr. 764, s. 547-558 presenterer en fremgangsmåte for utvelgelse av rekombinant Fab-anti-Rh (D)-antistoffer.

Dziegel D. M. et al., Jour. of Cell. Biochem., 1994, suppl., s. 212, abstract T513 beskriver en metode for å tilveiebringe Fab-rekombinante antistoffer ved å lage et Fab-bibiotek fra en anti-Rh (D)-produserende hybridomcellelinje. Videre presenteres nye anti-Rh (D)-antistoffer og fremgangsmåter for fremstilling av slike antistoffer.

De etterfølgende runder med panning og amplifikasjon av utvalgte Phab i bakterier fører til en anrikning av spesifikke Phab som kan observeres i form av en økning i titer av kolonidannede enheter (cfu) utplatet etter hver runde med panning. Oppfinnerens tidligere erfaring og publiserte data tyder på at spesifikke fag vanligvis kan påvises etter 4 til 6 runder med panning (Vogel, M. et al. Eur. J. Immunol. 24:1200, 1994). Ifølge teknikkens stand referert til ovenfor er det imidlertid ikke noe som typer på at de angitte trinn kan anvendes for å få en suksessfull fremstilling av Fab-fragmenter på anti-Rh D-antistoffer.

I de angitte figurer la til 16b er DNA-sekvenser som koder for ulike områder (V-områder) til anti Rh D Fab-fragmenter og tilsvarende polypeptidsekvenser angitt. Fig. 17 viser pComb3-ekspresjonssystemet anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 18 og 19 viser den separate fremstilling av genene til tung og lett kjede til det fullstendige antistoff ifølge beskrivelsen i Eksempel 6.

Foreliggende oppfinnelse omfatter polypeptider, kjennetegnet ved at de kan danne antigen-bindende strukturer med spesifisitet for Rhesus D-antigener som omfatter Rhesus D-spesifikke CDR 1-, CDR 2- og CDR 3-områder i aminosyresekvensparene VH og VL med samme eller forskjellige identifiseirngsnummer, i figurene angitt tabellen nedenfor:

Identifiseringsnumre for hver sekvens er gitt. Lokaliseringer til de Rhesus D-spesifikke CDR1 (komplementært bestemmende område 1), CDR2 og CDR3-områder er angitt i figurene og ifølge baseparnummer i tabellen i krav 1. Foretrukne polypeptider er anti-Rhesus D-antistoffer som omfatter de variable områder til tung og lett kjede ifølge sekvensene gitt i Fig. la-16b. Figurene la, 2a,...16a er relatert til variable områder av den tunge kjede og Figurene lb, 2b,...16b er relatert til de variable områder til lett kjede.

En videre målsetning med foreliggende oppfinnelse er DNA-sekvenser, kjennetegnet ved at de koder for polypeptider som kan danne antigenbindende strukturer med spesifisitet for Rhesus D-antigener som omfatter områder med de Rhesus D-spesifikke CDR 1-, CDR 2- og CDR 3-segmenter av DNA-sekvensparene Vh og VL med samme eller forskjellig identifikasjonsnummer ifølge figurene gitt i

tabellen ifølge oppfinnelsen.

Foretrukne DNA-sekvenser er de som koder for variable områder til Fab-fragmenter i anti-Rh D-antistoffer ifølge Figurene la, 16b. Figurene la, 2a,...16a er relatert til tung kjede og Figurene lb, 2b, 16b er relatert til lett kjede.

En videre målsetning med oppfinnelsen er en fremgangsmåte for seleksjon av rekombinante polypeptider som kan danne antigenbindende strukturer med spesifisitet for Rhesus D-antigener og som særlig viser reaktivitet med den delvise Rhesus DVI variant og uten noen bevis for reaktivitet med røde blodceller av rhesusnegative fenotyper, særlig uten reaktivitet mot rhesus-allelene C, c, E, og e, hvilken fremgangsmåte omfatter følgende trinn: a) utførelse av negative absorpsjoner ved anvendelse av Rhesus D-negative celler inneholdende både C- og E-antigener, og b) utførelse av en positiv panning ved anvendelse, i minst en adsorpsjon, av Rhesus D<VI> positive celler behandlet med bromelase.

Videre målsetninger med den foreliggende oppfinnelse er ati-Rhesus D-antistoffer, kjennetegnet ved at de har tunge og lette variable kjedeområder, omfattende de Rhesus D-spesifikke CDR 1-, CDR 2- og CDR 3-sekvenser av aminosyresekvensparene VH og VL med samme eller ulike identifikasjonsnummere ifølge tabellen angitt ifølge oppfinnelsen.

Fortrinnsvis er anti-Rh D-immunglobulinmolekyler omfattende tung og lett kjedevariable områder ifølge Figurene la til 16b, kombinert med kjente tunge og lette konstante kjedeområder.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av fullstendige anti-Rhesus D-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn i sekvensiell rekkefølge: a) separat amplifisering av medlemmene av et par av et tungkjedet V-gensegment og et lettkjedet V-gensegment inneholdende Rhesus D-spesifikke

CDR 1-, CDR 2- og CDR 3-områder som vist i henholdsvis figurene 15a-16a og 15b-16b, fra et anti-Rhesus D-Fab-kodende plasmid, ved utførelse av en

polymerasekjedereaksjon med spesifikke primere,

b) separat fremstilling av genene til et fullstendig anti-Rhesus D-tung-immunglobulinkjede og et fullstendig anti-Rhesus D-immunglobulin lett

kjede i egnede plasmider inneholdende konstante immglobulinområdegensegmenter som koder for hver av de humane 7I-, 72-, 73- og t4-tunge kjeder og for den humane k- eller X- lette kjede, og overføring av de erholdte plasmider separat til egnede E. coli-bakterier, og c) kotransfeksjon av de erholdte plasmider inn i egnede eukaryote vertsceller, dyrking av cellene, separering av utransformerte celler, kloning av kulturene,

seleksjon av den best produserende klon, anvendelse av denne som en produksjonskultur og isolering av de fullstendige antistoffer fra supernatanten til cellekulturen.

Også omfattet av oppfinnelsen er et farmasøytisk preparat, kjennetegnet ved at det omfatter minst ett polypeptid ifølge definisjonen gitt i oppfinnelsen, eller minst ett anti-Rhesus D-antistoff ifølge oppfinnelsen, for profylakse av hemolytisk sykdom hos nyfødte, for behandling av idiopatisk trombocytopenisk purpura og feiltransfusjoner av rhesusinkompatibelt blod.

Til slutt omfatter oppfinnelsen et diagnostisk preparat for Rhesus D-typebestemmelse, kjennetegnet ved at det omfatter Fab-fragmenter ifølge oppfinnelsen eller anti-Rhesus D-antistoffer ifølge oppfinnelsen.

Videre målsetninger er farmasøytiske og diagnostiske preparater omfattende polypeptider, anti-Rh D-antistoffer eller Fab-fragmenter som angitt heri.

Den totale re-amplifiserte Phab-populasjon erholdt etter hver panning kan testes med hensyn til spesifisitet ved anvendelse av ulike fremgangsmåter, slik som ELISA og immundotanalyser. Dette er også definert ved egenskapene til antigenet, for eksempel påvises anti-Rhesus D-Phab ved indirekte haemagglutinering ved anvendelse av et kaninanti-fag-antistoff eller ekvivalent Coombs-reagens som kryss-bindende antistoff. Når en total Phab-populasjon er identifisert som positiv med hensyn til det ønskede antigen, isoleres individuelle Phab-kloner og DNA som koder for de ønskede Fab-molekyler, sekvenseres. Individuelle Fab kan så produseres ved anvendelse av pComb3-ekspresjonssystemet som er illustrert i Fig. 16.1 dette system kuttes glll-genet, som koder for haleproteinet pill, ut fra fagemidvektoren pComb3. Dette tillater produksjon av oppløselig Fab i bakteriell periplasma. Slike individuelle Fab-fragmenter kan så testes med hensyn til antigenspesifisitet.

Fag display-fremgangsmåten er også anvendt som en fremgangsmåte for innhenting av monoklonale antistoffer fra ustabile hybridomcellelinjer. Dette er rapportert for anti-Rhesus D-antistoffer (Siegel, D.L. og Silberstein, L.E. Blood. 83:2334,1994; Dziegiel, M. et al., J. Immunol. Methods, 182:7,1995). Et fag display-bibliotek konstruert fra ikke-immuniserte donorer er også anvendt for å selektere Fv-fragmenter (dvs. variable områder fra tunge og lette kjeder, VH og VL) som er spesifikke for humane blodgruppeantigener som omfatter ett FV-fragment som reagerer mot Rhesus D-antigenet (Marks, J.D. et al., Biotechnology, 11:1145, 1993).

Viktige betraktninger i forbindelse med konstruksjon av kombinatoriske biblioteker er cellekilden anvendt for RNA-ekstraksjon og egenskapene til antigenet anvendt for panning. Av denne grunn anvender foreliggende oppfinnelse en hyper-immun donor som ble innsprøytet i.v. med Rhesus D<+> røde blodceller (rbc). PBL til donoren ble høstet ved +5 og +18 dager etter i.v. innsprøytingen og ble anvendt for å konstruere to kombinatoriske biblioteker heretter kjent som henholdsvis bibliotek Dl (LD1) og bibliotek D2 (LD2). Doble immunfluorescensanalyser av innhøstet PBL, ved anvendelse av markørene CD20 og CD38 for henholdsvis pan B-celler og lymfoblastoide celler, viste et høyere prosentinnhold enn normalt av lymfoblastoide B-celler med hensyn til plasmacellemorfologi. Det høye antallet plasmaceller funnet i det perifere blod er mest uvanlig ettersom det ved normal tilstand er mindre enn 1 % i periferien og dette indikerer sannsynligvis at donoren hadde et høyt prosentvis innhold av sirkulerende B-celler med spesifisitet for Rhesus D-antigenet.

Etter konstruksjon av biblioteket ble seleksjonen av Phab som var spesifikk for Rhesus D-antigenet oppnådd ved bio-panning av fersk full rbc med fenotype RI RI (CDe/CDe) dvs. referansecellene anvendt for Rhesus D-typeangivelse. Dette var nødvendig ettersom Rhesus D-antigenet, et integrert membranprotein på 417 amino-syrer (Le Van Kim, C. et al. PNAS 89:10925,1992), mistet sin immunogenisitet under rensing (Paradis, G. et al, J. Immunol. 137:240, 1986) og derfor kan ikke et kjemisk renset D-antigen bindes til en fast fase for seleksjon av immunreaktive Phab som for andre antigenspesifisiteter tidligere selektert for i dette system (Vogel, M. et al., Eur. J. Immunol. 24:1200,1994). Modelleringsstudier har vist at kun veldig korte forbindende områder av Rhesus D-antigenet strakk seg utenfor cellemembranen eller stakk ut i cytoplasmaet (Chérif-Zahar, B. et al, PNAS 87:6243, 1990). Delene av RhD-antigenet som er synlige for antistoffer er således relativt begrenset og kan være under konformasjonsmessig tvang. Dette aspekt av Rhesus D-antigenet blir enda mer viktig når man tar hensyn til Phab med reaktivitet mot de delvise D-fenotyper som i det vesentlige mangler visse definerte epitoper av D-membranproteinet (Mouro, I. et al, Blood. 83:1129, 1994).

Videre, ettersom full-rbc ikke bare uttrykker D-antigenet har en serie av negative absorpsjoner blitt utført på Rhesus D-negativ rbc for å adsorbere ut Phab som reagerer med andre antigenproteiner funnet i rbc.

Denne panning-prosedyre utført i Phab, som kommer fra både LD1 og LD2-biblioteker førte til isolering av 6 ulike Fab-produserende kloner fra bibliotek LD1, 8 ulike Fab-produserende kloner fra bibliotek LD2 og 2 Fab-produserende kloner fra de samlede biblioteker LD1 og LD2.

Nomenklaturen og figurene hvor sekvensene er listet opp er gitt i Tabell 1.

Fab-klonene vist ovenfor viser eksklusiv reaktivitet mot Rhesus D-antigen, 3 av 5 Du rbc testet og agglutineringsreaktivitet mot delvise D-fenotyper som følger: Rh33, DIII, DIVa, DIVb, DVa, DVII.

Ved anvendelse av ovennevnte RI RI rbc for panning av Phab ble ingen kloner isolert som reagerte mot den delvise DVI-fenotypen. Ettersom serumet av den opprinnelige hyperimmune donor som ble testet på tidspunktet for konstruksjon av det rekombinante bibliotek var kjent for å reagere mot DVI- fenotypen burde det rekombinante bibliotek også ha anti-DVI spesifisitet.

For å selektere for DVI-reaktiviteten ble panningbetingelsene forandret ved at ulike celler ble anvendt. En spesiell donor der rbc var typeangitt og som var kjent for å uttrykke den delvise DVI-fenotype, ble anvendt som kilde for celler for repanning av LD1 og LD2-biblioteker. Denne andre serie av panninger ble i det vesentlige utført på samme måte som første serie bortsett fra tilsetningen av det DVI rbc til erstatning for R1R1 rbc og tilsetningen av bromelasebehandling til DVI rbc. DVI-fenotypen uttrykker det minste antall Rhesus D-epitoper og det er derfor vanskelig å fremstille antistoffer mot denne. Det er rapportert at kun 15 % av uselekterte polyklonale anti-D og 35 % av selektert anti-D fremstilt av Rhesus D-negative individer reagerte med DVI+-celler (Mouro, I. et al, Blood. 83:1129, 1994). Bromelasebehandling, som fjerner N-acetylneuraminsyre (sialsyre) fra rcb-membranen, ble utført for å gjøre Rhesus DVI-epitopene mer tilgjengelige under panningen med de tre absorberte Phab.

Denne andre panningserie av LD 1-biblioteket førte til 1 Fab-produserende klon LD1-6-17. Nomenklaturen er gitt i tabell 2.

Denne klon reagerte med rhesusallelene C og E og viste en falsk positiv reaksjon med DVI-positiv rbc. Dette skyldtes også fenotypen til DVI-donoren (Cc DVI ee) som uttrykte C-allele som ikke ble absorbert ut av den rhesus-negative rbc (ccddee).

En tredje serie av panninger på et forråd av LD1- og LD2-bibliotekene ble således utført ved anvendelse av andre rbc med hensyn til absorpsjonsfasen. Etter 6 runder med panning ved anvendelse av både bromelasebehandlet og ubehandlet rbc for begge absorpsjonstrinn og elueringen fra DVI-positive rbc ble en total populasjon av Phab erholdt som reagerte kun med rbc med fenotype R1R1 (CCDDee) og 2 ulike donorer som uttrykker DVI-varianten.

Denne tredje serie av panninger av LD1- og LD2-bibliotekene førte til 2 Fab-produserende kloner som reagerte med DVI+rbc. Nomenklaturen er gitt i Tabell 3.

Totalt 16 ulike anti-Rhesus D Fab-kloner ble således isolert. DNA fra disse kloner ble isolert og sekvensert ved anvendelse av fluorescenssyklussekvensering på et ABI373A sekvenseringssystem. Nukleotid- og tilsvarende aminosyresekvensen til nevnte Fab-kloner danner grunnlaget for oppfinnelsen.

Sekvensanalyser viste at flere kloner ble isolert som hadde samme VH-gensegment, men ulike VL-gensegmenter. Dette er tilfellet for henholdsvis de to kloner LD2-1 og LD2-10, for de to kloner LD2-4 og LD2-11 og de tre kloner LD2-14, LD1/2-6-3 og LD1/2-6-33.

DNA-sekvensene erholdt og Fab-fragmentene er anvendbare for fremstillingen av fullstendige antistoffer med en aktivitet mot Rhesus D-antigenet. Egnede ekspresjonssystemer for slike antistoffer er muse-myelomceller eller kinesiske hamsterovarieceller.

Forsøkene som følger forklarer oppfinnelsen i detalj, uten å begrense rammen av oppfinnelsen.

Eksempel 1 beskriver konstruksjonen av 2 kombinatoriske biblioteker; særlig fra bibliotekene LD1 og LD2, som nevnt tidligere.

Eksempel 2 beskriver en serie av panninger ved anvendelse av RI RI rbc på bibliotekene LD1 og LD2 som nevnt i detalj tidligere.

Eksempel 3 beskriver en serie av panninger ved anvendelse av både bromelase- og ikke bromelasebehandlet rbc for absorpsjon og bromelasebehandlet DVI-positive rbc ved anvendelse av et forråd av bibliotekene LD1 og LD2.

Eksempel 4 beskriver en indirekte haemagglutineringsanalyse ved anvendelse av et kanin-anti-fag-antistoff, som en ekvivalent til Coombs-reagens, for å måle anrikning og spesifisitet til Rhesus D-spesifikke Phab etter panning.

Eksempel 5 beskriver fremstillingen og rensingen av Fab-antistofffragmenter for anvendelse som diagnostiske midler.

Eksempel 6 beskriver fremstillingen av fullstendige anti-Rhesus D-immunglobuliner ved anvendelse av sekvensene ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 1

Konstruksjon av rekombinante LD1- og LD2-biblioteker

a) Kilde for lymfocyttene

En voksen mann som var med i den frivillige gruppe av hyperimmune Rhesus

D-donorer ble gitt en i.v. innsprøytning på 2 ml med fylte rbc fra en kjent mannlig donor med blodgruppe O Rhd<+>. PBL ble høstet ved +5 og +18 dager etter innsprøyting og de mononukleære celler (MNC) ble isolert ved hjelp av Ficoll-gradientsentrifugering (Lymphoprep, Pharmacia, Milwaukee, WI). Resultatene av donor-lymfocyttanalysene ved dag +5 er gitt i tabell 4. +5 dag MNC ble anvendt direkte for RNA-fremstilling ved anvendelse av en fenol-kloroformguanidinumisotio-cyanatprosedyre (Chomczynski, P. og Sacchi, N., Anal. Biochem. 162:156,1987). +18 dag MNC ble først dyrket i 3 dager i RPMI-1640 medium (Seromed, Basel) inneholdende IO<3> U/ml IL-2 (Sandoz Research Center, Wien, Østerrike) og 10 /Ag/ml mitogen fra kermesbær (PWM; Sigma L9379, Buchs, Sveits) før ekstraksjon av RNA.

b) Konstruksjon av bibliotek

To separate biblioteker ble konstruert og kalt LD1 og LD2 (som beskrevet

ovenfor) tilsvarende cellene innhøstet henholdsvis ved +5 dager og +18 dager (endelig +21 dager deriblant +3 dager PWM stimulering) etter i.v. innsprøytingen. Totalt RNA ble så fremstilt fra disse celler ved anvendelse av en fenol-kloroformguanidiumisotio-cyanatfremgangsmåte. Fra dette RNA ble 10 fig anvendt for å fremstille cDNA ved

anvendelse av en oligo(dT)-primer (400 ng) og revers transkribert med M-MuLV-reverstranskriptase ifølge betingelsene angitt av produsenten (Boehringer Mannheim Tyskland). PCR-amplifikasjon ble utført som beskrevet i Vogel, M. et al, E.J. of Immunol. 24:1200, 1994. Kort beskrevet inneholdt 100 fil PCR-reaksjon Perkin-Elmer-buffer med 10 mM MgCl2, 5 /il cDNA, 150 ng hver av egnet 5' og 3' primer, alle fire dNTP med 200 iM av hver og 2 U/ml Taq Polymerase (Perkin Eimer, NJ). PCR-ampliifkasjonen av tung og lett kjede av Fab-molekylet ble utført separat med et sett av primere fra Stratacyte (detaljer er gitt nedenfor). For den tunge kjede ble seks oppstrømsprimere anvendt som hybridiserte til hver av de seks familiene av VH-gener mens én kappa og én lambdaprimer ble anvendt for den lette kjede. Nedstrøms-primerne ble konstruert til å passe hengselsområdet til de konrtante domener 7I og 73 for den tunge kjede. For den lette kjede ble nedstrømsprimerne tilpasset til 3'ende til de konstante kappa og lambdadomener. Tunge og lette kjede-PCR-produkter ble samlet separat, renset på gel og kuttet med henholdsvis Xhol/Spel og Sacl/Xbal-restriksjonsenzymer (Boehringer Mannheim). Etter kløyving ble PCR-produktene ekstrahert én gang med fenol:kloroform: isoamylalkohol og renset ved hjelp av geleksisjon. Innsettingen av Xhol/Spel kløyvet Fd-fragment og etterfølgende ligering

av Sacl/Xbal-kløyver lett kjede inn i pComb3-vektoren, transformasjonen inn i XL1-blå-celler, og produksjon av fag ble utført som beskrevet av (Barbas III, CF. og Lerner, R.A., Companion Methods Enzymol. 2:119, 1991).

Etter transformasjon av XLl-Blue-E.coli-celler ble prøver tatt og titrert på plater for å bestemme bibliotekstørrelsen. Disse resultater viste ekspresjonsbiblioteker på 7,5xl0<6> og 7,7xl0<6> cfu (kolonidannende enheter) for henholdsvis LD1 og LD2.

c) PCR primere

d) Vektorer og bakteriestammer

pComb3-vektoren anvendt for kloning av Fd og den lette kjede ble erholdt fra

Scripps Research Institute La Jolla, CA; (Barbas III, CF. og Lerner, R.A., Companion Methods Enzymol. 2:119,1991). Escherichia co/i-stamme XL-l-Blue anvendt for transformasjon av pComb3-vektoren og VCSM13 hjelperfag ble anskaffet fra Stratacyte (La Jolla, CA).

Eksempel 2

Seleksjon av Rhesus D-Phab fra bibliotekene LD1 og LD2 på RiRl rbc

a) Absorpsjon og bio- panning

En serie av tre negative absorpsjoner på rbc-gruppe O Rh negativ ble utført

for hver panningrunde før positiv seleksjon på rbc-gruppe O Rh positiv (R1R1). Fersk rbc ble innsamlet i ACD (syresitratdekstrose)-antikoagulant og vasket 3 ganger i

0,9 % NaCl. Rbc ble tellet i Hayems oppløsning og justert til 40xl06/ml. Absorpsjon: 1 ml fagutfelling i PBS/3% BSA ble tilsatt rbc-gruppe O Rh negativ pellet (16xl0<6 >rbc) i 12 ml rør (Greiner 187261, Reinach, Sveits) og inkubert ved romtemperatur i

30 min med forsiktig rysting. Alle rør ble stoppet på forhånd i PBS/3% BSA i minimum 11 ved romtemperatur. Rbc ble pelletert ved hjelp av sentrifugering i 4 min ved 300 x g ved 4 °C. Den resulterende fagsupernatant ble forsiktig innhøstet og prosessen ble gjentatt to ytterligere ganger. Etter den endelige adsorpsjon ble fagsupernatanten tilsatt rbc-gruppe 0 Rh-positiv pellet (16xl0<6> rbc) og på ny inkubert i RT i 30 min med forsiktig rysting. Rbc ble så vasket minst 5 ganger i 10 ml iskald PBS, sentrifugert 5 min 300 x g ved 4 °C, etterfulgt av eluering med 200 /ti 76 mM sitronsyre, pH 2,8 i 6 min ved romtemperatur og nøytralisert med 200 fil IM tris. Rbc ble sentrifugert ved 300 x g, 5 min ved 4 °C og den resulterende supernatant, inneholdende de eluerte fag ble forsiktig fjernet og lagret med bærerprotein (0,3 % BSA) ved 4 °C, klar for reamplifikasjon. Antallet Rhesus D-spesifikke Phab for hver panningrunde er gitt i Tabell 5.

Eksempel 3

Seleksjon av Rhesus D-Phab fra de samlede LD1- og LD2-bibliotek på DVI+rbc

a) Absorpsjon på rbc gruppe 0 Rh negativ, fenotyper 1 ( r' r, Ccddee) og 2

( ryry, CCddEE)

En serie av fire negative absorpsjoner på rbc-gruppe 0 Rh-negativ ble utført for hver panningrunde før positiv seleksjon på rbc-gruppe O Rh DVI-positiv. Negative absorpsjoner ble utført på følgende måte: Trinn 1) fenotype 1 behandlet med bromelase; trinn 2) fenotype 1 uten bromelase; trinn 3) fenotype 2 behandlet med bromelase; trinn 4) fenotype 2 uten bromelase. Frossen rbc ble tint i en blanding av sorbitol og fosfatbufret saltoppløsning, hensatt i denne oppløsning i minimum 10 min og så vasket 5 til 6 ganger i fosfatbufret saltløsning og til slutt lagret i stabiliserende oppløsning (DiaMed EC-oppløsning) klar for anvendelse. Før panning ble rbc vasket 3 ganger i 0,9 % NaCl etterfulgt av telling i Hayems oppløsning. Absorpsjon: 1 ml fag utfelling i PBS/3% BSA ble tilsatt til en rbc-pellet (2xl0<8>) som i trinn 1 i 12 ml rør (Greiner 187261, Reinach, Sveits) og inkubert ved romtemperatur i 30 min med forsiktig rysting. Alle rør ble blokkert på forhånd i PBS/3% BSA i minimum 11 ved romtemperatur. Rbc ble pelletert ved sentrifugering i 5 min ved 300 x g ved 4 °C. Den resulterende fagsupernatant ble forsiktig innhøstet og prosessen ble gjentatt ved anvendelse av rbc som angitt ovenfor i trinnene 2, 3 og 4.

b) Behandling av rbc Rhesus D- negativ r' r og ryry

og Rhesus DVI+ med bromelase

Bromelase 30 (Baxter, Diidingen, Sveits) ble anvendt for å behandle rbc Rhesus DVI+ i samme mengder som anvendt ved en rutinemessig haemagglutineringsanalyse, dvs. 10 fil bromelase pr. 2xl0<6> rbc. Bromelase ble således tilsatt til den krevede mengde rbc og inkubert ved 37 °C i 30 min, etterfulgt av vasking 3 ganger i 0,9 % NaCl, tellet på ny i Hayems- oppløsning og justert til påkrevet konsentrasjon i PBS/ 3 % BSA klar for Phab-panning.

c) Bio- panningpå bromelasebehandlet Rhesus DVI+ rbc

Etter den endelige absorpsjon på rbc ryry som ikke var bromelasebehandlet

ble fagsupernatanten delt i 2 like deler og tilsatt henholdsvis enten enzym- eller ikke-enzym-behandlet rbc gruppe O Rh DVI+-pellet (40xl0<6>), og på ny inkubert ved romtemperatur i 30 min med forsiktig rysting. De 2 populasjoner av rbc ble så vasket minst 5 ganger i 10 ml iskald PBS, sentrifugert 5 min ved 300 x g ved 4 °C, etterfulgt av eluering med 200 fi\ 76 mM sitronsyre, pH 2,8 i 6 min ved romtemperatur og nøytralisert med 200 fil IM tris. Rbc ble sentrifugert ved 300 x g, 5 min ved 4 °C og

de resulterende supernatanter inneholdende de eluerte fag fra enten bromelase- eller ikke-bromelasebehandlet DVI+rbc ble forsiktig fjernet og lagret med bærerprotein (0,3 % BSA) ved 4 °C, klar for reamplifikasjon. I ytterligere runder med panning ble eluert fag fra enten bromelase- eller ikke-bromelasebehandlet DVI+rbc holdt separat og hver prøve fulgte absorpsjonsprotokolltrinnene 1 til 4. Elueringstrinnet var litt

forskjellig sammenlignet med panningrunde 1 ettersom fag-populasjonene ikke på ny ble delt i 2 deler. Kun fag eluert fra bromelasebehandlet DVI+rbc ble eluert på ny fra bromelasebehandlet DVI+rbc og kun de fag som var eluert fra ikke-bromelasebehandlet DVI+rbc ble på ny også eluert fra ikke-bromelasebehandlet DVI+rbc. Antallet spesifikke Phab etter hver panningrunde er gitt i tabell 6.

Eksempel 4

Måling av panningrundene og bestemmelse av spesifisiteten til anrikede Phab ved anvendelse av et kanin anti-fag-antistoff

Indirekte hemaglutineringsanalyse

Ferskt innhentet rbc fra ulike ABO og rhesus blodgrupper ble vasket 3 ganger i 0,9 % NaCl og justert til en 3-5 % oppløsning (45-50x10<7>/ml) i enten 0,9 % NaCl eller PBS/3% BSA. For hver testbetingelse ble 50 pil rbc og 100 /il test (utfelt og amplifisert fag eller kontrollantistoffer) inkubert sammen i glassblodgrupperingsrør

(Baxter, Dudingen, Sveits) i 30 min ved 37 °C. Rbc ble vasket 3 ganger i 0,9 % NaCl og så inkubert med 2 dråper Coombs-reagens (Baxter, Dudingen, Sveits) for å finne positive kontroller eller med 100 ( il 1/1000 fortynnet kanin-anti-fag-antistoffer (fremstilt ved immunisering av kaniner med fag VCSM13 utfelling, etterfulgt av rensing på en Affi-Gel blå kolonne og absorpsjon på E.coli for å fjerne E.coli-spesifikke antistoffer). Rørene ble inkubert i 20 min ved 37 °C, sentrifugert i 1 min ved 125xg og rbc ble undersøkt med hensyn til agglutinering ved forsiktig rysting og anvendelse av lupe.

Når renset Fab ble testet med hensyn til agglutinering ble et affinitetsrenset anti-Fab-antistoff (The Binding Site, Birmingham, U.K.) anvendt istedenfor kanin-anti-fag-antistoffet.

Tabell 7 viser resultatene av haemagglutineringstester av Phab-prøver etter ulike runder med panning på R1R1 rbc.

Tabell 8 viser resultatene av haemagglutineringstester av Phab-prøver etter ulike runder med panning på Rhesus DVI+rbc.

Tabell 9 viser reaktivitetsmønstre til individuelle Fab-kloner fra bibliotekene LD1 og LD2 med delvise D-varianter.

a) Indirekte haemagglutinering ble utført i glassrør ved anvendelse av 50 /il rbc (40xl0<7>/ml) og 100 /il Phab som starter ved 4xlO<u>/ml. Etter 30 min ved 37 °C ble rbc vasket 3 ganger og ytterligere inkubert i 20 min ved 37 °C med en 1/1000 fortynning av kanm-antifag-antistoff. b) M13-hjelperfag ble anvendt som en negativ kontroll og viste ingen uspesifikk agglutinering på grunn av fagpartiklene alene.

Agglutinering ble skåret ved hjelp av visuell vurdering fra +++ (kraftig agglutinering) nedover til - (ingen agglutinering). nd = ikke gjort

Eksempel 5

Fremstilling og rensing av Fab-antistoffragmenter for anvendelse i form av diagnostiske midler

Etter biopanningprosedyrene beskrevet i Eksemplene 2 og 3 ble en fag-populasjon som viste spesifikk agglutinering på Rhesus D+rbc utvalgt og anvendt for å fremstille fagemid DNA. Mer presist ble Phab utvalgt fra RI RI rbc og anvendt etter 5. og 6. runde med bio-panning etter henholdsvis LD1- og LD2-biblioteker, og etter den 5. bio-panning på DVI+ rbc for isolering av LDl-6-17-klonen. For å produsere oppløselig Fab må sekvensen glll som koder for plll-haleprotein til fagpartikkelen fjernes.

Fagemid DNA ble fremstilt ved anvendelse av et Nukleotrap-sett (Machery-Nagel) og glll-sekvensen ble fjernet ved kløyving av det således isolerte fagemid-DNA med Nhel/Spel som beskrevet i (Burton, D.R., et al., PNAS, 1989). Etter transformasjon inn i XLI-blå ble individuelle kloner utvalgt (nomenklatur er gitt i tabell 1) og dyrket i LB (Luria Broth) inneholdende 50 /ig/ml carbenicillin ved 37 °C til en OD på 0,6 ved 600 nm. Kulturer ble indusert med 2 mM isopropyl /3-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) (Biofinex, Praroman, Sveits), og dyrket over natten ved 37 °C. Hele kulturen ble spunnet ved lOOOOxg i 30 min ved 4 °C for å pelletere bakteriene. Bakteriepelleten ble behandlet med en lysozym/DNase-oppløsning for å frigjøre Fab-fragmentene inn i cellene. Ettersom enkelte Fab ble frigjort til kultursupernatanten ble denne også innhøstet separat. Disse Fab-preparater ble så samlet og utfelt med 60 % ammonium-sulfat (Merck, Darmstadt, Tyskland) for å konsentrere Fab etterfulgt av omfattende dialyse i fosfatbufret saltløsning (PBS) og ultrafiltrering ved 200000xg for å pelletere alle uoppløselige komplekser. Fab-preparatene ble så renset på en keramisk hydroksy-apatittkolonne (HTP Econo cartridge, BioRad, Glattbrugg, Sveits) ved anvendelse av en gradienteluering av PBS (Buffer A) og PBS+0,5M NaCl (Buffer B). Den lineære gradient ble programmert til å øke fra 0-100 % Buffer B i 40 min Fab ble eluert som en enkelttopp mellom 40-60 % Buffer B. De positive fraksjoner, som identifisert ved hjelp av immundotanalyse ved anvendelse av et anti-Fab-peroksidasekonjugat (The Binding Site, Birmingham, U.K.) ble samlet, konsentrert ved anvendelse av polyetylenglykol og dialysert kraftig mot PBS. De positive fraksjoner fra hydroksyapatittkolonnen, for hver klon, ble anvendt i en klassisk indirekte haemagglutineringsanalyse i glassrør, ved anvendelse av enten standard Coombs-reagens (Baxter Diagnostics AG Dade, anti-humant serum) eller et anti-Fab (The Binding Site, Birmingham, U.K.) som kryss-bindende reagens. Disse Fab med definert spesifisitet på de delvise D-varianter som gitt på fag 18 kan anvendes for å typebestemme rbc med ukjent, delvis D-fenotype.

Eksempel 6

Konstruksjon av fullstendige immunglobulingener

LD2-14 tung kjede V-gen (VH gen) ble amplifisert fra det anti-Rhesus D-Fab-kodende plasmid LD2-14 med polymerasekjedereaksjonen (PCR) ved anvendelse av spesifikke primere. 5' primer hadde sekvensen:

5-GGGTCGACGCACAGGTGAAACTGCTCGAGTCTGG-3',

mens 3'primeren hadde sekvensen:

5-GCCGATGTGTAAGGTGACGTGGTCCCCTTG-3'.

PCR-reaksjonen ble utført med Deep Vent DNA-polymerase og den bufrede oppløsning (2mM Mg++) fra New England Biolabs ved betingelsene anbefalt av produsenten, deriblant 100 pmol av hver primer og de fire deoksynukleotider i en konsentrasjon på 250 fiM av hver. Reaksjonen ble utført i 30 sykluser med følgende temperaturtrinn: 60 s ved 94 °C (forlenget til 2 min under den første syklus), 60 s ved 57 °C og 60 s ved 72 °C (forlenget til 10 min under den siste syklus). Post-amplifikasjonstilsetning av 3' A-overheng ble utført ved en etterfølgende inkubasjon i 10 min ved 72 °C i nærvær av 1 enhet Taq DNA-polymerase (Boehringer Mannheim, Tyskland). PCR-produktet ble renset ved anvendelse av QIAquick PCR rensingssett (Qiagen, Sveits) og klonet inn i vektoren PCRII ved anvendelse av Invitrogens TA-kloningssett (San Diego, USA). Det resulterende plasmid TAVH14 ble kløyvet med Sali og BstEU, VH-genet ble isolert ved hjelp av en preparativ agarosegelelektroforese ved anvendelse av Qiagens QIAquick gelekstraksjonssett.

Vektor #150 (Sandoz Pharma, Basel) inneholdende et irrelevant men intakt humant genomisk immunglobulin VH-gen ble kuttet med Sali og BstEU og vektorfragmentet ble isolert ved hjelp av preparativ agarosegelelektroforese ved anvendelse av Qiagens QIAquick gelekstraksjonssett. Ligering av vektor og PCR-produkt ble utført ved 25 °C i 2 t i et totalt volum på 20 /il ved anvendelse av rapid DNA-ligeirngssett (Boehringer Mannheim, Tyskland). Etter legering ble reaksjonsblandingen fortynnet med 20 /il H20 og ekstrahert med 10 volumer n-butanol for å fjerne salter. DNAet ble så plettert ved sentrifugering, vakuumtørket og resuspendert i 10 /il H20. 5 /il av denne DNA-oppløsning ble elektroporert (0,1 cm kyvetter, 1,9 kV, 200 fl, 25 /iFD) med en GenePulser (BioRad, Gaithersburg) i 40 /il elektroporering kompetent E. coli XLI-blå MRF (Stratagene, La Jolla), fortynnet med SOC-medium, inkubert ved 37 °C i 11 og platet ut på LB-plater inneholdende ampicillin (50 /ig/ml). Plasmidminiprepareringer (Qiagen, Basel) av de resulterende kolonier ble sjekket ved hjelp av restriksjonskløyvinger for tilstedeværelse av et egnet innskudd.

Med denne prosedyre ble det irrelevante tilstedeværende VH-gen i vektor #150 erstattet med den amplifiserte anti-Rhesus D VH-sekvens fra LD2-14 og dette ga plasmid cassVH14. Strukturen til den resulterende immunglobulin VH-gen-konstruksjon ble bekreftet ved hjelp av sekvensering, kuttet ut ved hjelp av kløyving med EcoEl og BamRl og gelrenset som beskrevet ovenfor. Ekspresjonsvektor #10 (Sandoz Pharma, Basel) inneholdende den humane genomiske immunglobulin-C7l-gensekvens ble også kløyvet med EcoRl og BamRl, isolert ved hjelp av preparativ agarosegelelektroforese, ligert med 2scøRI/2?amHI-VH-gensegmentet tidligere erholdt fra plasmid cassVH14 og elektroporert inn i E.coli XLI-blå MRF' som beskrevet ovenfor. Dette førte til et komplett anti-Rhesus D-tung immunglobulingenkjede i ekspresjonsvektoren 14IgGl (Figur og ).

LD2-14 lett kjede V-gen (VL-gen) ble amplifisert fra samme anti-Rhesus D-Fab-plasmid LD2-14 ved hjelp av PCR ved anvendelse av spesifikke primere. 5'-primer hadde sekvensen:

5-TACGCGTTGTGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAT-3',

mens 3'-primer hadde sekvensen:

5'-AGTCGCTCAGTTCGTTTGATTTCAAGCTTGGTCC-3<*>.

PCR-reaksjon, produktrensing og etterfølgende kloningstrinn var analoger til trinnene beskrevet for VH-genet, bortsett fra at egnede lettkjedevektorer ble anvendt. I korte trekk ble VL-PCR-produktet klonet inn i pCRII-vektor som ga plasmid TAVL 14, skåret ut derfra med MM og HindlU og isolert ved hjelp av gelekstraksjon. VL-genet ble deretter klonet inn i Mlul og //mdlll-setene i vektor #151 (Sandoz Pharma, Basel) for således å erstatte det irrelevante tilstedeværende VL-gen med den amplifiserte anti-Rhesus D VL-sekvens til LD2-14. Sekvensen til det resulterende plasmid cassVL-14 ble bekreftet, EcoRI/Jføal-fragmentet inneholdende VL-genet ble så subklonet inn i restriksjonssetene £cøRI og Xbal i vektor # 98 (Sandoz Pharma, Basel, Sveits) som inneholder det humane genomiske immunglobulin Cfc-gensegment. Denne prosedyre erstattet det irrelevante tilstedeværende VL-gen i plasmid # 98 og ga ekspresjonsvektoren 14kappa som inneholdt det fullstendige anti-Rhesus D-lettkj edeimmunglobulingen.

Musemyelomcellelinjen SP2/0-Ag 14 (ATCC CRL 1581) ble kotransfektert ved hjelp av elektroporering med ekspresjonsvektorer 14IgGl og 14kappa på forhånd linearisert henholdsvis i det unike iscøRI og Afofl-kløyvingssete. Elektroporeringen ble utført som følger: eksponentielt dyrkede celler ble vasket to ganger og suspendert i fosfatbufret sukrose (272 raM sukrose, 1 mM MgCl2, 7 mM NaH2P04, pH 7,4) til en tetthet på 2x10<7> celler/ml. 0,8 ml celler ble tilsatt en 0,4 cm kyvette, blandet med 15 /xg lineariserte plasmider, 14IgGl og 14kappa, holdt på is i 15 min, elektroporert med 290 Volt, 200 (2, 25 jiiFR, satt tilbake på is i 15 min, overført til en T75-celledyrknings-kolbe med 20 ml kaldt RPMI 1640-medium (10 % varmeinaktivert føtalt bovint serum, 50 fiM-beta-merkaptoetanol), hensatt 21 ved romtemperatur og så inkubert i 601 ved 37 °C. Etter denne tidsperiode ble cellene overført til 50 ml medium inneholdende 1 mg/ml G418 for seleksjon. Stabile transfektanter ble så utvalgt i tilstedeværelse av økende konsentrasjoner av metotrexat for å amplifisere det integrerte DNA og således øke ekspresjonen av det tilsvarende antistoff rD2-14.

Ekspresjon av rD2-14 i kultursupernatanten (SrD2-14) ble målt ved hjelp av en enzymbundet immunsorbentanalyse (ELISA) spesifikk for humane 7I og kappa-kjeder. Kvantifisering av de Rhesus D-spesifikke immunglobuliner i anti-D-analysen ifølge Ph. Eur. viste mellom 1,1 og 11,4 /-ig/ml agglutinerende antistoff i slike supernatanter. Disse testet agglutineringsnegative med hensyn til rhesus-negative rbc og viste det samme agglutineringspotensial mot delvise D-varianter som Fab LD2-14 uttrykt i E. coli. Data er vist i tabell 10.

Agglutinering ble skåret ved hjelp av visuell vurdering fra +++ (alle celler agglutinert i en klump) nedover til - (ingen celler agglutinert).

LD2-14: Fab-fragment fremstilt som beskrevet i Eksempel 5;

SrD2-14: cellekulturnatant inneholdende antistoff rD2-14;

TCB: cellekulturnatant fra utransfekterte celler.

Claims (20)

1. Polypeptider, karakterisert ved at de kan danne antigen-bindende strukturer med spesifisitet for Rhesus D-antigener som omfatter Rhesus D-spesifikke CDR 1-, CDR 2-og CDR 3-områder i aminosyresekvensparene VH og VL med samme eller forskjellige identifiseringsnummer, i figurene angitt tabellen nedenfor:

2. Polypeptider ifølge krav 1, karakterisert ved at de omfatter Rhesus D-spesifikke CDR 1-, CDR 2-og CDR 3-områder i aminosyresekvensparene VH og VL med samme identifiseringsnummere, som angitt i figurene angitt i tabellen i krav 1.

3. Polypeptider ifølge krav 1, karakterisert ved at de omfatter områder med aminosyresekvensene VH og VL og har identifiseringsnummere som angitt i figurene angitt i tabellen i krav 1.

4. Polypeptider ifølge krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at de er antigenbindende Fab-fragmenter.

5. Polypeptider ifølge krav 1,2 eller 3, karakterisert ved at de omfatter tunge og lette immunglobulinkjeder som kan danne fullstendige anti-Rhesus D-antistoffer.

6. DNA-sekvenser, karakterisert ved at de koder for polypeptider som kan danne antigenbindende strukturer med spesifisitet for Rhesus D-antigener som omfatter områder med de Rhesus D-spesifikke CDR 1-, CDR 2- og CDR 3-segmenter av DNA-sekvensparene VH og VL med samme eller forskjellig identifikasjonsnummer ifølge figurene gitt i tabellen ifølge krav 1.

7. DNA-sekvenser ifølge krav 6, karakterisert ved at de koder for polypeptider som kan danne antigen-bindende strukturer med spesifisitet for Rhesus D-antigener som omfatter områder med de Rhesus D-spesifikke CDR 1-, CDR 2- og CDR 3-segmenter av DNA-sekvensparene VH og VL med samme identifikasjonsnummere som angitt i figurene angitt i krav 6.

8. DNA-sekvenser ifølge krav 6 eller 7 som omfatter områder med DNA-sekvensene VH og VL med identifikasjonsnummer ifølge figurene gitt i krav 6.

9. DNA-sekvenser ifølge krav 6, 7 eller 8, karakterisert ved at de koder for polypeptider som kan danne antigenbindende Fab-fragmenter.

10. DNA-sekvenser ifølge krav 6, 7 eller 8, karakterisert ved at de koder for polypeptider som kan danne fullstendige anti-Rhesus D-antistoffer.

11. Fremgangsmåte for seleksjon av rekombinante polypeptider som kan danne antigenbindende strukturer med spesifisitet for Rhesus D-antigener og som særlig viser reaktivitet med den delvise Rhesus DVI variant og uten noen bevis for reaktivitet med røde blodceller av rhesusnegative fenotyper, særlig uten reaktivitet mot rhesus-allelene C, c, E, og e, hvilken fremgangsmåte omfatter følgende trinn: a) utførelse av negative absorpsjoner ved anvendelse av Rhesus D-negative celler inneholdende både C- og E-antigener, og b) utførelse av en positiv panning ved anvendelse, i minst en adsorpsjon, av Rhesus D<VI> positive celler behandlet med bromelase.

12 Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn i sekvensiell rekkefølge: a) utførelse av flere negative absorpsjoner på følgende røde blodceller: fenotype 1 (r'r, Ccddee) behandlet med bromelase, fenotype 1 ikke behandlet med bromelase, fenotype 2 (ryry, CCddEE) behandlet med bromelase og fenotype 2, ikke behandlet med bromelase, b) utførelse av en positiv absorpsjon på DVI+ røde blodceller med eller uten bromelasehandling, c) bestemmelse av titeret for fagbinding til DVI+-røde blodceller, d) repetisjon av trinnene a), b) og c) inntil titeren for fagbinding til DVI+-røde blodceller har nådd et tilfredsstillende nivå.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 11 og 12, karakterisert ved at de rekombinante polypeptider som kan danne antigen-bindende strukturer er Fab-fragmenter.

14. Anti-Rhesus D-antistoffer, karakterisert ved at de har tunge og lette variable kjedeområder, omfattende de Rhesus D-spesifikke CDR 1-, CDR 2- og CDR 3-sekvenser av aminosyresekvensparene VH og VL med samme eller ulike identifikasjonsnummere ifølge tabellen angitt i krav 1.

15. Anti-Rhesus D-antistoffer med tung- og lettkjede varible områder, karakterisert ved at de omfatter de Rhesus D-spesifikke CDR 1-, CDR 2-og CDR 3-sekvenser av aminosyresekvensparene VH og VL med samme identifikasjonsnummere som angitt i tabellen i krav 14.

16. Anti-Rhesus D-antistoffer ifølge krav 14 eller 15, karakterisert ved at de omfatter aminosyresekvensparene VH og VL med identifikasjonsnummere i figurene som angitt i tabellen som referert til i krav 13.

17. Anti-Rhesus D-antistoffer ifølge krav 14,15 eller 16, karakterisert ved at de konstante immunglobulinområder er av minst én av de definerte isotyper, IgGl, IgG2, IgG3 eller IgG4.

18. Fremgangsmåte for fremstilling av fullstendige anti-Rhesus D-antistoffer ifølge ett av kravene 14 til 17, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn i sekvensiell rekkefølge: a) separat amplifisering av medlemmene av et par av et tungkjedet V-gensegment og et lettkjedet V-gensegment inneholdende Rhesus D-spesifikke CDR 1-, CDR 2- og CDR 3-områder som vist i henholdsvis figurene 15a-16a og 15b-16b, fra et anti-Rhesus D-Fab-kodende plasmid, ved utførelse av en polymerasekjedereaksjon med spesifikke primere, b) separat fremstilling av genene til et fullstendig anti-Rhesus D-tung-immunglobulinkjede og et fullstendig anti-Rhesus D-immunglobulin lett kjede i egnede plasmider inneholdende konstante immglobulinområdegensegmenter som koder for hver av de humane 7I-, 72-, 73- og 74-tunge kjeder og for den humane k- eller X- lette kjede, og overføring av de erholdte plasmider separat til egnede E. coli-bakterier, og c) kotransfeksjon av de erholdte plasmider inn i egnede eukaryote vertsceller, dyrking av cellene, separering av utransformerte celler, kloning av kulturene, seleksjon av den best produserende klon, anvendelse av denne som en produksjonskultur og isolering av de fullstendige antistoffer fra supernatanten til cellekulturen.

19. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at den omfatter minst ett polypeptid ifølge definisjonen gitt i krav 1, 2 eller 3, eller minst ett anti-Rhesus D-antistoff ifølge ett av kravene 14 til 17, for profylakse av hemolytisk sykdom hos nyfødte, for behandling av idiopatisk trombocytopenisk purpura og feiltransfusjoner av rhesusinkompatibelt blod.

20. Diagnostisk preparat for Rhesus D-typebestemmelse, karakterisert ved at det omfatter Fab-fragmenter ifølge krav 4 eller anti-Rhesus D-antistoffer ifølge ett av kravene 14 til 17.