CN101448941A - 抗人血小板生成素受体激动剂抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗人血小板生成素受体(别名：人c－Mpl)的激动剂抗体。更具体地说，本发明提供了一种抗人血小板生成素受体激动剂抗体，其中激动剂抗体包含：含有(1)人抗体重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列，(2)具有在人抗体亚类之间的域取代的重链恒定区的氨基酸序列和人抗体轻链恒定区的氨基酸序列，或(3)在上述氨基酸序列(1)或(2)中具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的抗体恒定区；和能结合并激活人血小板生成素受体的抗体可变区；以及其中激动剂抗体具有特性：(a)如通过使用人脐带血衍生的CD34+细胞的CFU－MK集落形成试验所测定的，该抗体在10,000ng/ml或更低的浓度下诱导集落形成；和(b)在使用UT7/TPO细胞的细胞增殖试验中，该抗体的最大活性为PEG－rHuMGDF的50％或以上，50％有效浓度(EC50)为100nM或以下。还提供了用于治疗血小板减少症的包含所述抗体的药物组合物。

Description

抗人血小板生成素受体激动剂抗体

技术领域

本发明涉及一种抗人血小板生成素受体(别名：人c-Mpl)的激动剂抗体(agonist antibody)。

本发明进一步涉及一种在临床需要增加血小板的情况下用于患者/疾病的治疗剂，特别是用于血小板减少症的治疗剂，其包含作为活性成分的、所述抗-人c-Mpl激动剂抗体。

发明背景

<TPO和TPO受体>

血小板生成素(TPO)是一种促进巨核细胞和血小板体内增殖的血细胞生成因子。人TPO是一种全长包含332个氨基酸残基的糖蛋白，并且已知其N-末端序列对于人TPO活性起重要作用。人TPO显示其结合细胞膜上TPO受体的功能。

c-Mpl是目前所知唯一的TPO受体。人c-Mpl是一种具有一个跨膜域的糖蛋白，如果该糖蛋白含有信号肽则包含635个氨基酸，其成熟形式包含610个氨基酸，并且其属于I型细胞因子受体家族。已报道了人c-Mpl的mRNA序列和蛋白序列(Genbank：NM_005373，NP_005364)。同一家族分子的实例包括促红细胞生成素受体(EpoR)、G-CSF受体(G-CSFR)和白介素3受体(IL-3R)。人c-Mpl在其胞外区域具有2个CRH(细胞因子受体同系物)域(从N-末端起称为CRH1和CRH2)，并且上述域包含该细胞因子受体家族所特有的WSXWS基序。胞内域包含2条序列—Box1和Box2，它们是信号转导所必需的。这提示TPO结合CRH1并使c-Mpl二聚体化，由此转导信号；然而，该结合及激活的特定方式尚未阐明。一旦c-Mpl二聚体化，就激活已结合于胞内域的信号激酶，并在细胞内传递磷酸化信号。已知TPO-Mpl信号激活Jak-STAT、PI3K-Akt和Ras-MAPK途径。据报道，相对于野生型小鼠，TPO或c-Mpl缺失的小鼠血小板计数减少大约10％-20％，表明该TPO-Mpl系统是调节血小板计数的关键系统。不仅在巨核细胞中，在未分化的造血祖细胞或造血干细胞中也观察到c-Mpl表达。已知与c-Mpl-阴性级分相比，骨髓中c-Mpl-阳性细胞级分具有更高的重建骨髓能力。还已知c-Mpl-缺陷小鼠具有减少数量的造血干细胞以及减少数量的巨核细胞和血小板(Hiroshi Miyazaki，“Future Prospects forThrombopoietin，”Japanese Journal of Transfusion Medicine，46(3)，311-316，2000；和Murone，M.等，Stem Cell 16：1-6，1998)。这些发现暗示在干细胞水平上或其后，TPO-Mpl系统与造血系统有关。

由于TPO的克隆，因此已预计到其作为血小板减少症治疗剂的应用，并且在过去已进行关于两种重组TPOs：全长人TPO(rhTPO)和包含构成人TPO活性部位的、N-末端163个氨基酸的聚乙二醇化肽序列的PEG-rHuMGDF(聚乙二醇化的重组人巨核细胞增殖和发育因子)的临床试验(Kuter，DJ等，Blood 100(10)：3457-69，2002)。在该临床试验中，发现重组TPOs成功地增加了健康志愿者和特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者的血小板。同样地，已证明了减轻由非清髓性化学疗法引起的血小板减少症的效果。尽管病例数目少，但已报道了重组TPOs对再生障碍性贫血(AA)或骨髓增生异常综合征(MDS)患者的效果(Yonemura，Y.等，Int J Hemat(82)307-309，2005；和Komatsu，N.等，Blood 96，296a，2000)。

<c-Mpl激动剂抗体>

已研究了多种具有与TPO一样的、c-Mpl-介导的信号传导性质，但具有完全不同分子性质的TPO模拟物(Broudy，VC等，Cytokine25(2)：52-60，2004；和Wang B.等，Clin Pharmacol Ther.，76(6)：628-38，2004)。已知的模拟物大致分为，例如肽低分子、非肽低分子、抗体衍生的分子、激动剂抗体等。

已知的抗-c-Mpl激动剂人抗体的实例包括12B5、12E10和12D5(WO 99/10494)。以诸如完整IgG这样的完整抗体不具有抗原代人细胞的活性。在本申请中，术语“原代人细胞”指作为TPO在体内的作用对象的细胞，例如来源于人脐带血或骨髓的CD34+细胞，但不是对TPO高敏感的、特别建立的细胞系，或其中已导入并高水平表达TPO受体基因的细胞。该术语指作为TPO在体内的作用对象的细胞，例如来源于人脐带血或骨髓的CD34+细胞。

已知的鼠激动剂抗体的实例包括BAH-1(WO 99/03495；和DengB.等，Blood 92(6)：1981-1988，1998)和VB22B(WO 2005/056604)。已知鼠抗体在人血中显示抗原性并因此不适合作为药物。一般而言，很难利用，例如CDR嫁接，来以完整抗体形式将激动剂抗体人源化并同时保持活性(WO 2005/056604；和Ji Hee Son等，Journal ofImmunological Methods 286：187-201，2004)。即使存在这样的已知激动剂抗体，也不容易产生作用于原代细胞的激动剂人抗体。

如上所述与TPO模拟物有关的、抗体衍生的低分子也代表了某一类型的激动剂抗体。已报道通过修饰抗体的一部分制备了双抗体和单链(Fv)₂(sc(Fv)₂)(WO 99/10494；和WO 2005/056604)。然而，通过这样的技术所产生的、经修饰的抗体可具有由分子深度修饰引起的抗原性，因此不利于应用。同样地，它们在血中的半衰期应较完整抗体短。因此，使用这样的修饰抗体作为药物仍存在问题。

由此，完整抗体具有用作药物的特性，例如低抗原性或在血中半衰期持久；然而，如上所述，很难以完整抗体形式产生具有足够活性的激动剂人抗体。

因此，本发明人已尝试获得具有足够活性而无需深度修饰抗体结构的激动剂人抗体。结果，本发明人现已成功获得如下所述的目的抗体。此外，本发明人现已成功修饰了抗体铰链区，由此改善了激动活性。根据本发明产生的抗体适合作为血小板减少症治疗剂。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的抗-人c-Mpl激动剂抗体。

在本发明中，“抗体”能将基本上相当于天然配体—TPO的信号转导至人c-Mpl(现有技术中用完整抗体难以实现该信号转导)并对原代人细胞具有增殖刺激活性。

本发明的另一个目的是提供用于改善激动剂抗体活性而无需将抗体片段化的技术，提供了具有适合药物所需特性，如抗原分子原本具有的长半衰期和低抗原性的，新的抗-人c-Mpl激动剂抗体。

为了达到上述目的，本发明人已对抗-人c-Mpl激动剂抗体进行了集中研究。结果，本发明人成功获得以完整抗体形式的、产生基本上相当于天然配体所产生的信号、并具有针对人原代细胞活性的人抗体。此外，本发明人已对所获得的激动剂抗体进行了集中研究。结果，找到用于改善抗体激动活性而无需使其片段化的修饰技术，由此完成了本发明。

具体来说，本发明包括下列特征。

1.抗人血小板生成素受体的激动剂抗体

根据本发明的抗人血小板生成素受体激动剂抗体包括下列抗体(1)-(6)。

(1)抗人血小板生成素受体激动剂抗体，其中该抗体包括含有下列(i)-(iii)任一氨基酸序列的抗体恒定区：

(i)人抗体重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列，

(ii)具有人抗体亚类之间域取代的重链恒定区的氨基酸序列和人抗体轻链恒定区的氨基酸序列，或

(iii)在氨基酸序列(i)或(ii)中具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；和

能结合并激活人血小板生成素受体的抗体可变区；以及

其中，所述抗体具有下列特性(a)和/或(b)：

(a)如利用人脐带血衍生的CD34+细胞进行的CFU-MK集落形成试验所测定的、该抗体在10,000ng/ml或更低的浓度下诱导集落形成；和/或

(b)在利用UT7/TPO细胞进行的细胞增殖试验中，该抗体的活性是结构如下所述的PEG-rHuMGDF的50％以上、且50％有效浓度(EC50)为100nM或以下。

在本申请中，人抗体亚类包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人免疫球蛋白恒定区等的序列可获得自，例如NCBI网站(如GenBank或UniGene)。实例包括人IgG1重链恒定区，登录号：J00228；人IgG2重链恒定区，登录号：J00230；人IgG3重链恒定区，登录号：X03604；人IgG4重链恒定区，登录号：K01316；人轻链κ恒定区，登录号：V00557、X64135和X64133；以及人轻链λ恒定区，登录号：X64132和X64134。

在本申请中，术语“利用人脐带血衍生的CD34+细胞的CFU-MK集落形成试验”指如以下实施例6中所描述的试验技术，并且可基于所述试验技术测定集落形成所需抗体浓度。

在本申请中，术语“利用UT7/TPO细胞进行的细胞增殖试验”指如以下实施例5中所描述的试验技术，并且可基于所述试验技术测定增殖活性和EC50。

在本申请中，术语“PEG-rHuMGDF”指包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的分子，所述分子是对由下述大肠杆菌产生的多肽进行提取、再折叠、纯化并将聚乙二醇(PEG)部分共价连接至其氨基末端制备的，上述大肠杆菌经包含编码下述截短蛋白的cDNA的质粒转化，所述的截短蛋白包含人TPO氨基末端受体结合域(Ulich等，Blood 86：971-976，1995)，该分子具有下列结构：

PEG-NH-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDFSLGEWKTQMEETKAQDILGAVTLLLEGVMAARGQLGPTCLSSLLGQLSGQVRLLLGALQSLLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIFLSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVRRAPPTTAVPS-COOH.

在本申请中，术语“激活人c-Mpl”指在表达人c-Mpl的细胞中胞内转导人c-Mpl-相关信号。

在本申请中，术语“几个”指例如2-约10，如2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4或2-3的整数。

(2)在具有如通过集落形成试验所测定的诱导集落形成活性，和/或如通过利用UT7/TPO细胞进行的细胞增殖试验所测定的细胞增殖活性的抗体之中，具备在10,000ng/ml或更低、优选1,000ng/ml或更低，更优选100ng/ml或更低的浓度下诱导集落形成活性的根据上述(1)的抗体。

(3)具有PEG-rHuMGDF的50％以上、优选70％以上，更优选90％以上的细胞增殖活性，且50％有效浓度(EC50)为100nM以下、优选10nM以下，更优选1nM以下的、根据上述(1)的抗体。

(4)根据上述(1)的抗体，其显示如通过集落形成试验和细胞增殖试验所测定的下述活性：

(i)具有下列特性(a)和(b)的抗人血小板生成素受体激动剂抗体：

(a)如通过利用人脐带血衍生的CD34+细胞的CFU-MK集落形成试验所测定的，该抗体在10,000ng/ml或更低的浓度下诱导集落形成；和

(b)在利用UT7/TPO细胞进行的细胞增殖试验中，该抗体的最大活性是具有以下结构的PEG-rHuMGDF的50％或以上，50％有效浓度(EC50)为100nM或以下。

(ii)具有下列特性(a)和(b)的抗人c-Mpl激动剂抗体：

(a)如通过利用人脐带血衍生的CD34+细胞的CFU-MK集落形成试验所测定的，该抗体在1,000ng/ml或更低的浓度下诱导集落形成；和

(b)在利用UT7/TPO细胞进行的细胞增殖试验中，该抗体的最大活性是具有以下结构的PEG-rHuMGDF的70％或以上，50％有效浓度(EC50)为10nM或以下。

(iii)具有下列(a)和(b)特性的抗人c-Mpl激动剂抗体：

(a)如通过利用人脐带血衍生的CD34+细胞的CFU-MK集落形成试验所测定的，该抗体在100ng/ml或更低的浓度下诱导集落形成；和

(b)在利用UT7/TPO细胞进行的细胞增殖试验中，该抗体的最大活性是具有以下结构的PEG-rHuMGDF的90％或以上，50％有效浓度(EC50)为1nM或以下。

(5)包含重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的、根据上述(1)的抗体，其中所述氨基酸序列选自下述的氨基酸序列(a)-(h)(在此括号中是可变区序列所来源的、以下实施例中所描述的抗体名称)：

(a)包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的轻链可变区(抗体名称：7-10)；

(b)包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的轻链可变区(抗体名称：4-49)；

(c)包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的轻链可变区(抗体名称：6-4-50)；

(d)包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的轻链可变区(抗体名称：6-5-2)；

(e)包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含下述氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列为在如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；

(f)包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含下述氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列为在如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；

(g)包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含下述氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列为在如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；和

(h)包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含下述氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列为在如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列。

(6)根据上述(1)-(5)任一项的抗体，其中抗人c-Mpl激动剂抗体为人抗体。

2.重链修饰的激动剂抗体

根据本发明，重链修饰的激动剂抗体包括下列抗体。

(1)激动剂抗体，其中重链恒定区的上铰链区包含下列氨基酸序列(a)和(b)中的任一项：

(a)如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；或

(b)如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，和

其中从中间铰链区至C末端包含人免疫球蛋白G4氨基酸序列，或在人免疫球蛋白G4氨基酸序列中涉及抗体依赖的细胞毒性(ADCC)活性等的、与对于激动剂抗体而言较不可取的特性有关的区域中具有突变的氨基酸序列。

在本申请中，术语“上铰链”指根据Kabat EU编号系统(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public HealthService，National Institute of Health，Bethesda，Md.，1991)从第216位至第226位的N-末端序列。术语“中间铰链”指根据Kabat EU编号系统从第226位至第231位的N-末端序列。图4B显示了关于包含人免疫球蛋白G4的各亚型的上铰链部分的氨基酸序列、中间铰链部分的氨基酸序列和所述部分前后的氨基酸序列。在该图中，CH1指邻接上铰链的CH1区的一部分，CH2指在CH2区中称为下铰链的部分。

(2)包含重链的抗体，其中重链恒定区从中间铰链区至C末端的区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列为在人免疫球蛋白G4氨基酸序列中第228位用脯氨酸取代丝氨酸、第235位用谷氨酸取代亮氨酸的氨基酸序列，在此所述位置基于Kabat EU编号系统。

(3)根据上述(2)的重链修饰的抗体，其是如下列(i)或(ii)所示的抗人c-Mpl激动剂人抗体。

(i)包含重链的抗人c-Mpl激动剂抗体，其中重链恒定区的上铰链区包含氨基酸序列(a)或(b)中的任一项：

(a)如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；或

(b)如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，和

其中重链恒定区从中间铰链区至C末端的区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列为人免疫球蛋白G4氨基酸序列，或在人免疫球蛋白G4氨基酸序列中第228位用脯氨酸取代丝氨酸、在第235位用谷氨酸取代亮氨酸的氨基酸序列，在此所述位置基于Kabat EU编号系统。

(ii)根据更优选的实施方案，上述(i)的抗人c-Mpl激动剂抗体选自抗体(a)-(h)：

(a)含有下述重链和轻链的抗体，所述的重链包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述的轻链包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

(b)含有下述重链和轻链的抗体，所述的重链包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述的轻链包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；

(c)含有下述重链和轻链的抗体，所述的重链包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述的轻链包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；

(d)含有下述重链和轻链的抗体，所述的重链包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述的轻链包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；

(e)含有下述重链和轻链的抗体，所述的重链包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述的轻链包含在如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中具有一个或几个构架区氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；

(f)含有下述重链和轻链的抗体，所述的重链包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述的轻链包含在如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；

(g)含有下述重链和轻链的抗体，所述的重链包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述的轻链包含在如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；和

(h)含有下述重链和轻链的抗体，所述的重链包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述的轻链包含在如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列。

3.抗人c-Mpl激动剂抗体的制药用途和药物组合物

本发明的抗人c-Mpl激动剂抗体能在体内和在体外结合并激活c-Mpl受体，和/或能刺激血小板(即血小板生成活性)及血小板祖细胞产生(即血巨核细胞生成活性)。

包含作为活性成分的、本发明的抗人c-Mpl激动剂抗体的药物组合物及其制药用途的具体实例包括：

(1)药物组合物，包含作为活性成分的、上述第1节(1)-(6)中和上述第2节(3)中所述的任一抗体。

(2)用于增加血小板的药剂，其包含作为活性成分的、上述第1节(1)-(6)中和上述第2节(3)中所述的任一抗体。

(3)根据上述(2)的用于增加血小板的药剂，其在实施骨髓移植或脐带血移植时用于促进血小板恢复。

(4)用于血小板减少症的治疗剂，其包含作为活性成分的、上述第1节(1)-(6)中和上述第2节(3)中所述的任一抗体。

(5)根据上述(4)的用于血小板减少症的治疗剂，其中血小板减少症是下列疾病(a)-(f)中的任一项：

(a)特发性血小板减少性紫癜(ITP)；

(b)癌症化疗后血小板减少症；

(c)再生障碍性贫血；

(d)骨髓增生异常综合征(MDS)；

(e)可归因于肝病的血小板减少症；或

(f)骨髓移植或脐带血移植后的血小板减少症。

(6)用于增加血细胞的药剂，包含作为活性成分的、用于在造血干细胞移植后促进血细胞恢复的人c-Mpl激动剂抗体。

(7)根据上述(6)的用于增加血细胞的药剂，其包含作为活性成分的、上述第1节(1)-(6)中和上述第2节(3)中所述的任一抗体。

4.产生本发明抗体的方法

可利用产生本发明抗体的杂交瘤制备本发明的抗体。可选地，可从抗体产生细胞，如杂交瘤，克隆编码单克隆抗体的基因，并可利用基因重组技术将克隆的基因整合入适当的载体中来产生重组抗体。产生本发明抗体的方法的优选实例包括下述方法。

产生抗人c-Mpl激动剂抗体的方法，包括制备哺乳动物细胞，培养哺乳动物细胞，以及从培养所述细胞的培养基中分离和纯化编码包含所述重链和轻链的抗体的DNA的表达产物，所述哺乳动物细胞带有包含编码重链的核苷酸序列的DNA和包含编码轻链的核苷酸序列的DNA，以及包含控制所述DNA表达的核苷酸序列的一种或多种DNA，其中上述的核苷酸序列选自下述的(a)-(h)：

(a)编码包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的重链的核苷酸序列，和编码包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的轻链的核苷酸序列；

(b)编码包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的重链的核苷酸序列，和编码包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的轻链的核苷酸序列；

(c)编码包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的重链的核苷酸序列，和编码包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的轻链的核苷酸序列；

(d)编码包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的重链的核苷酸序列，和编码包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的轻链的核苷酸序列；

(e)编码包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的重链的核苷酸序列，和编码包含下述氨基酸序列的轻链的核苷酸序列，所述氨基酸序列为在如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中具有一个或几个构架区氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；

(f)编码包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的重链的核苷酸序列，和编码包含下述氨基酸序列的轻链的核苷酸序列，所述氨基酸序列为在如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；

(g)编码包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的重链的核苷酸序列，和编码包含下述氨基酸序列的轻链的核苷酸序列，所述氨基酸序列为在如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；和

(h)编码包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的重链的核苷酸序列，和编码包含下述氨基酸序列的轻链的核苷酸序列，所述氨基酸序列为在如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列。

5.本发明的DNA

本发明的DNA的实例如下。

(1)包含编码抗人Mpl激动剂抗体重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列新的DNA，其包含编码选自下列(a)-(d)的氨基酸序列的核苷酸序列：

(a)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

(b)如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；

(c)如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；和

(d)如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

(2)包含编码抗人Mpl激动剂抗体轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列的新的DNA，其包含编码选自下列(a)-(h)的氨基酸序列的核苷酸序列：

(a)如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

(b)如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；

(c)如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；

(d)如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；

(e)在如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；

(f)在如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；

(g)在如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；和

(h)在如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列。

(3)根据上述(1)或(2)的DNA，其编码包含可变区和恒定区的抗体重链或轻链。

(4)根据上述(3)的编码抗体重链的DNA，其中抗体重链恒定区的上铰链区包含下列氨基酸序列(a)和(b)任一项：

(a)如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；或

(b)如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，和

其中重链恒定区从中间铰链区至C末端的区包含人免疫球蛋白G4氨基酸序列，或在人免疫球蛋白G4氨基酸序列中第228位用脯氨酸取代丝氨酸、第235位用谷氨酸取代亮氨酸的氨基酸序列，在此所述位置基于Kabat EU编号系统。

本说明书包括如本申请优先权文件日本专利申请第2006-81322号和第2006-299554号说明书和/或附图中所披露的所有或部分内容。

附图简述

图1显示了激动剂抗体的结合活性。利用FDCP-hMpl细胞和FDCP2细胞(FDCP亲本细胞)通过流式细胞术检查所示抗体的结合活性(参见实施例2)。结果显示每种抗体都能特异性结合人c-Mpl。

图2A-D显示了UT7/TPO试验结果，特别是在UT7/TPO细胞增殖试验中纯化的抗体(IgG1)的增殖曲线(参见实施例5)。

图3显示了CFU-Mk试验结果，其是利用人脐带血衍生的CD34+细胞的集落形成试验结果(参见实施例6)。

图4A显示了与重组抗体制备相关的N5KG1载体结构。“C”代表巨细胞病毒启动子/增强子，“B”代表牛增殖激素多腺苷酸化区，“N1”代表新霉素磷酸转移酶的外显子1，“K”代表人免疫球蛋白κ恒定区，“G1”代表人免疫球蛋白γ1恒定区，“BT”代表鼠β球蛋白主要启动子，“N2”代表新霉素磷酸转移酶的外显子2，“D”代表二氢叶酸还原酶，“VH”代表重链可变区以及“VL”代表轻链可变区。

图4B显示了天然人免疫球蛋白氨基酸序列，以及与重组抗体制备有关的IgG4PE、IgG4344、IgG4344h1、IgG4344uh和IgG4344uhm的CH1区和铰链区(即上铰链和中间铰链区)氨基酸序列。

图4C(即图4C-1-图4C-3)显示了制备用于重组抗体制备的表达载体N5KG1_7-10和N5KG1_4-49的过程。

图4D(即图4D-1-图4D-3)显示了制备用于重组抗体制备的表达载体N5KG1_6-4-50和N5KG1_6-5-2的过程。

图4E显示了与重组抗体制备有关的不同修饰重链的恒定区序列。

图4F(即图4F-1和图4F-2)显示了与重组抗体制备有关的7-10G4344uhm重链的核酸和氨基酸序列。

图4G显示了与重组抗体制备有关的7-10G4344uhm轻链的核酸和氨基酸序列。

图5显示了铰链修饰抗体的活性。图5A代表通过UT7/TPO细胞增殖试验测定的4-49G1、4-49G3311和4-49G3331的活性，以及图5B代表通过UT7/TPO细胞增殖试验测定的7-10G4344uhm和4-49G4344uhm的活性。

图6A显示了涉及激动剂抗体7-10G4344uhm和4-49G4344uhm的信号传导分析结果(参见实施例11)。

图6B显示了涉及激动剂抗体6-5-2G1和6-5-2G3344的信号传导分析结果(参见实施例11)。

图7显示了人血小板引发效应(priming effect)，其是实施例12中所述测试的结果。显示了激动剂抗体7-10G3311或4-49G3311对人血小板的引发效应。同样地，仅有各自激动剂抗体(没有ADP)不会发生血小板凝集。

图8是显示在施用激动剂抗体于食蟹猴后，其血小板计数改变的图。如实施例13中所描述的，将激动剂抗体施用于食蟹猴，然后监测血小板计数。箭头指示第一次施用(PEG-rHuMGDF)和第二次施用(激动剂抗体)的日期。

图9A显示了在1,000个CD34+细胞(右图)或10,000个CD34+细胞(左图)移植入NOG脐带血移植小鼠模型，随后施用分析物后，随时间推移的外周人血小板计数改变。“Pre”指示施用前的血小板计数。

图9B显示了在1,000个CD34+细胞(右图)或10,000个CD34+细胞(左图)移植入NOG脐带血移植小鼠模型，随后施用测试物质后6周其骨髓中人祖细胞计数(菌落计数；GM+E+GEM)。“祖细胞计数”指除巨核细胞之外的总菌数，“GM”指粒细胞和巨噬细胞，“E”指红细胞以及“GEM”指粒细胞-巨噬细胞-红细胞集落生成单位。结果表示为平均值±标准差(平均值±SD)。“媒介物(Vehicle)”代表作为对照的PBS(磷酸盐缓冲盐水)以及“NT”代表未处理的。

图9C显示了在1,000个CD34+细胞(右图)或10,000个CD34+细胞(左图)移植入NOG脐带血移植小鼠模型，随后施用分析物后6周外周人细胞的嵌合率。“媒介物”代表作为对照的PBS(磷酸盐缓冲盐水)以及“NT”代表未处理的。

图10显示了在施用激动剂抗体于人Mpl Tg小鼠后血小板计数日变化。将TPO或媒介物(PBS)施用于作为对照的Tg小鼠，将10μg7-10G4344uhm施用于非-Tg小鼠(野生型；非-Tg)，试验结果示于图中。结果显示为平均值±SEM。

图11显示了激动剂抗体7-10G4344uhm的轻链修饰的抗体与FM3A-hMpl细胞的结合。

图12显示了激动剂抗体7-10G4344uhm的轻链修饰的抗体的UT-7/TPO细胞增殖试验结果。

实施发明的最佳方式

以下，本发明将更详细地描述。

本发明提供了作用于原代人细胞的抗-人c-Mpl激动剂人抗体。

可通过用人Mpl重组蛋白或人Mpl表达细胞免疫产生人抗体的小鼠(如KM小鼠^TM，Kirin Brewery Co.，Ltd.)，由常规制备单克隆抗体的方法分离本发明的抗体。可选地，抗体基因可分离自杂交瘤，可构建表达载体，可制备表达细胞，也可在上述过程期间制备具有不同恒定区的重组抗体。

1.本发明的抗体

在本申请中，术语“抗体”指包含Fab、铰链和Fc区的抗体。抗体的实例包括天然存在的抗体，或通过经已知技术获得的产生单克隆抗体的杂交瘤产生的、具有类似于天然存在抗体的结构的抗体，从事先获得的抗体基因遗传工程化的抗体，以及通过定点诱变部分修饰遗传工程化的抗体。本发明的抗人cMpl激动剂抗体和重链修饰的激动剂抗体描述如上。

一般而言，激动剂抗体结合细胞膜上的靶分子形成复合物，由此传递信号。由于二价抗体与两个分子结合，可预期抗形成同型二聚体的细胞因子受体家族，如促红细胞生成素受体(EpoR)、G-CSF受体(G-CSFR)或血小板生成素受体(c-Mpl)的激动剂抗体形成二聚体。许多仅具有Fab片段的激动剂抗体不显示活性的事实暗示了这一点。

在复合物形成时两个抗原结合部位容易彼此接近很重要。以完整抗体形式存在不具有足够活性的抗体，当其转变为低分子形式，例如sc(Fv)₂时，显示升高的激动活性的事实暗示了这一点。然而，这样的低分子抗体由于其相当程度的修饰可能产生抗原性问题，并且其血液半衰期可能缩短。因此，利用低分子抗体作为药物尚有待解决的问题。为了在实践中利用完整抗体所具有的、作为药物使用有益的，例如低抗原性或血液半衰期长的这样的特性，亟待具有高活性而无明显结构修饰的激动剂抗体。

如以下实施例2中所描述的，本发明人现已改良了常规免疫方法，获得了以完整抗体形式存在的、具有高活性的抗-人c-Mpl激动剂抗体。上述改良的免疫的实例是用高表达细胞株免疫，以及用持续活化的突变受体表达细胞免疫。如以下实施例6中所述，通过利用人脐带血衍生的CD34+细胞的集落培养，证实了所述的激动剂抗体诱导了集落形成，暗示该抗体可用作药物。

本发明人现已进一步努力改善铰链部分柔性，以增加复合物形成效率并增加激动活性。高柔性序列的实例例如甘氨酸接头。作为替代性的实例，还可利用在人IgGs中具有最高柔性的IgG3铰链区。最好利用天然序列以致不削弱抗体的低抗原性。因此，IgG3铰链序列是更优选的。

此外，可通过遗传工程修饰制备下述抗体，其具有最适于作为具有低细胞毒性和高铰链柔性的激动剂抗体恒定区的人IgG3上铰链区，以及作为来自中间铰链至C-末端的区的人IgG4序列。

更具体地说，通过本领域公知的遗传工程修饰将抗体转变为不同亚类的抗体(如参见EP314161)，即通过遗传工程操作编码本发明抗体可变区的DNA可将抗体修饰为不同亚类的抗体。此外，人IgG4重链恒定区第228位的丝氨酸可改变为脯氨酸，由此抑制由IgG4分子内交联(S-S键)形成单体，上述的位置基于EU编号系统(参见Sequences of proteins of immunological interest，NIH出版物编号91-3242)。同样地，第235位的亮氨酸可改变为谷氨酸，由此降低抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的活性。包含这样的2个突变的IgG4称为IgG4PE。

如上所述，本发明人已生产了最适于激动剂抗体、且具有低细胞毒性和高铰链柔性的恒定区。该恒定区具有人IgG3的上铰链区，从中间铰链至C-末端的区具有人IgG4序列。该恒定区可与抗-c-Mpl激动剂抗体的可变区相结合来产生具有更高安全性和活性的激动剂抗体。

2.制备本发明抗体的方法

可通过多种技术产生本发明的抗体。首先，制备本发明抗体需要杂交瘤。可通过使用如以下实施例1中所描述的、与本发明有关抗原的免疫小鼠或其他动物产生人抗体，具体来说，免疫诸如产生人抗体的转基因小鼠之类的非人哺乳动物。可根据常规技术获得单克隆抗体，即通过让获得自致敏动物的抗体产生细胞与不具有产生自身抗体能力的骨髓瘤细胞融合，由此获得杂交瘤，培养杂交瘤并选择产生显示与用作免疫的抗原具有特异性亲和力的单克隆抗体的克隆。根据需要，从所获得的抗体中进一步选择激动剂抗体，可通过用于评价与激动剂抗体的靶受体起反应的配体活性技术的方法进行该选择。可通过用于评价TPO活性方法的方法，例如以下实施例5中所描述的UT7/TPO细胞增殖试验，适当地选择抗人c-Mpl激动剂抗体。

本发明抗人c-Mpl激动剂抗体、特别是单克隆抗体的产生包括下列步骤。更具体而言，(1)纯化用作免疫原的生物多聚物和/或制备包含在细胞表面过表达的抗原蛋白的细胞；(2)通过注射抗原免疫动物、采血、测定抗体效价并决定提取脾等时间，然后制备抗体产生细胞；(3)制备骨髓瘤细胞；(4)抗体产生细胞和骨髓瘤细胞之间的细胞融合；(5)选择产生目的抗体的杂交瘤；(6)分离单细胞克隆(纯培养株)；(7)任选地，培养杂交瘤用于大量生产单克隆抗体，或繁殖其中已移植了杂交瘤的动物；(8)检查由此产生的单克隆抗体的生理活性和识别/特异性，或作为标记试剂用于性质测定；(9)克隆单克隆抗体基因，并制备重组抗体；等等。

以下，根据上述步骤详细描述用于制备抗人c-Mpl的激动剂单克隆抗体的方法，但用于产生这样的抗体的方法并不受限于此。例如，还可利用除脾细胞之外的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞。

(1)抗原

一般而言，当要获得人c-Mpl抗体时，由于人c-Mpl蛋白的一级结构是已知的(参见GenBank：NP_005364)，因此通过本领域公知的方法由c-Mpl氨基酸序列化学合成肽，所获得的肽可用作抗原。同样地，缺少c-Mpl跨膜区和膜内区的可溶性c-Mpl重组蛋白可用作抗原。

可选地，多种人血巨核细胞细胞系或人c-Mpl表达细胞系，例如强制表达c-Mpl的细胞系，可用作所述抗原。尽管多种人血巨核细胞细胞系或强制表达细胞系被认为是人c-Mpl表达细胞系，但在这样的细胞系中的c-Mpl表达水平仅为每细胞中几千分子，因此这样的细胞系不适合用作抗原。当用包含向FDCP2(即，鼠造血细胞系)中导入了人c-Mpl的表达细胞系FDCP-hMpl(参见FEBS Lett.Oct 21，1996；395(2-3)：228-234)免疫产生人抗体的小鼠(如KM小鼠^TM)时，抗体效价增加实际上并不足够，且无法获得该hMpl-特异性人抗体。当人血巨核细胞细胞系用作为抗原时，还诱导出与其他膜分子反应的抗体，以致于利用所述细胞系并不总能适合于有效诱导c-Mpl-特异性抗体。当将抗原蛋白表达细胞系，非人c-Mpl抗体，用于获得具有激动活性抗体的目的进行免疫时，优选显示高表达水平的细胞。特别优选利用已导入并以高水平表达人c-Mpl的鼠细胞系，特别是MHC-相容的细胞系，作为宿主细胞。鼠细胞系的实例包括以下实施例1中所描述的细胞，即通过利用携带有全长人c-Mpl基因的pEF-MPL635或pCMV-MPL635作为表达载体、鼠L929或FM3A细胞系作为宿主细胞获得的细胞。

除野生型人c-Mpl之外，可以使用以相同方式强制表达人c-Mpl的持续活化突变体的细胞系(如在第508位的Trp已突变为Ser，且以配体依赖的方式持续传递激动信号的突变体；Abe M.等，Leukemia，2002年8月；16(8)：1500-1506)。由于预计这样的突变体具有不同于野生型的三维结构，因此针对这样的持续活化突变体显示高亲和力的抗体可显示强激动活性。

上述显示强制表达的细胞系可任选地与人cMPL、其胞外可溶区等共同用作为抗原。

(2)用于制备抗体产生细胞的方法

将上述(1)中获得的抗原与弗氏完全或不全佐剂，或诸如钾矾的佐剂混合，并将所得到的混合物施用于试验动物作为免疫原。最佳的试验动物是通过遗传修饰能产生人抗体的小鼠(即人抗体产生小鼠)。

用于本发明中的人抗体产生小鼠(如KM小鼠^TM)缺少内源性小鼠免疫球蛋白(Ig)重链和小鼠κ轻链，并且这样的小鼠包含同时含有人Ig重链基因(SC20)的染色体14片段和人Igκ链转基因(KCo5)。通过将具有人Ig重链基因座的谱系A小鼠与具有人Igκ链转基因的谱系B小鼠杂交制备该小鼠。谱系A是内源性Ig重链和遭破坏的κ轻链两者的纯合子，并且是携带有子代可传递的染色体14片段(SC20)的小鼠谱系(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，2000.Vol.97：722)。谱系B是内源性小鼠Ig重链和κ轻链都缺陷的纯合子，并且是携带有人Igκ链转基因(KCo5)的小鼠谱系(Nat.Biotechnol.，1996，Vol.14：845)。因此，缺少鼠Ig重链和κ链的KM小鼠能产生人抗体。

当免疫小鼠时，通过皮下注射、腹膜内注射、静脉注射、皮内注射、肌内注射或爪垫注射，优选腹膜内注射、爪垫注射或静脉注射的任一种施用免疫原。

免疫可实施一次获以合适的时间间隔(优选以2-4周的时间间隔)实施几次。此后，测定免疫动物血清中针对抗原的抗体效价，显示足够高的抗体效价的动物可用作抗体产生细胞的来源，由此增加随后操作的效果。一般而言，在最后一次免疫后3-5天获得自动物的抗体产生细胞优选用于随后的细胞融合。

可使用的测定抗体效价方法的实例包括各种已知技术，例如流式细胞术、放射性同位素免疫测定(在下文中称为“RIA法”)、固相酶免疫测定(在下文中称为“ELISA”)、荧光抗体法和被动血凝反应。从检测灵敏度、即时性、准确度或操作自动化可能性的观点来看，例如流式细胞术或ELISA是更优选的。

在本发明中，可以下述方法测定抗体效价，例如，在流式细胞术情况下。首先，让抗原表达细胞与含人抗体样品(如小鼠血清、杂交瘤培养物上清液或纯化的抗体)反应。接着，添加作为第二抗体的已用荧光进行标记的抗人抗体的抗体以结合人抗体，洗涤所得到的产物，并通过荧光测定结合细胞的第二抗体的量。由此测定抗体效价。

(3)制备骨髓瘤细胞方法

来源于哺乳动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔或人的没有产生自身抗体能力的细胞可用作为骨髓瘤细胞。一般而言，优选使用建立自小鼠的骨髓瘤细胞系，例如8-氮鸟嘌呤抗性小鼠(BALB/c)-衍生的骨髓瘤细胞系P3X63Ag8U.1(P3-U1)(Yelton，D.E.等，CurrentTopics in Microbiology and Immunology，81，1-7，1978)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)(Kohler，G.等，European J.Immunology，6，511-519，1976)、Sp2/O-Ag14(SP-2)(Shulman，M.等，Nature，276，269-270，1978)、P3X63Ag8.653(653)(Kearney，J.F.等，J.Immunology，123，1548-1550，1979)、P3X63Ag8(X63)(Horibata，K.andHarris，A.W.Nature，256，495-497，1975)等。在合适的培养基，例如8-氮鸟嘌呤培养基(即含8-氮鸟嘌呤、补充有谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素和胎牛血清的RPMI-1640培养基(在下文中称为“FCS”))、Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(在下文中称为“IMDM”)，或Dulbecco氏改良的Eagle培养基(在下文中称为“DMEM”)中对这样的细胞系进行传代培养。在细胞融合前，在常规培养基(如含10％FCS的DMEM培养基)中对所述细胞系传代培养3或4天，以便确保在细胞融合之日2×10⁷个或更多细胞的数量。

(4)细胞融合

抗体产生细胞是血浆细胞及其祖细胞，即淋巴细胞。这样的细胞可获得自个体的任何部位。一般而言，抗体产生细胞可获得自脾细胞、淋巴结、骨髓、扁桃体、外周血或任何它们合适的组合。最通常使用脾细胞。

在最后一次免疫后，从显示特定抗体效价的小鼠上切下含有抗体产生细胞的部位，例如脾，来制备产生抗体的脾细胞。随后，可将脾细胞与骨髓瘤细胞融合。目前，最常用于使脾细胞与步骤(3)中获得的骨髓瘤细胞融合的技术是一种涉及使用聚乙二醇的方法，该聚乙二醇细胞毒性相对低并提供了简单的融合操作。举例来说，该方法包括下列步骤。

用无血清培养基(如DMEM)或磷酸盐缓冲盐水(在下文中称为“PBS”)彻底洗涤脾细胞和骨髓瘤细胞，将脾细胞与骨髓瘤细胞以约5:1-10:1比例混合，然后离心所得到的产物。除去上清液，使沉淀的细胞团块充分松散，并在搅拌的同时向其中逐滴添加含1ml50％(w/v)聚乙二醇(分子量：1000-4000)的无血清培养基。此后，缓慢添加10ml无血清培养基，随后离心。再次弃去上清液，将沉淀的细胞悬浮于含适当量的次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸苷(在下文中称为“HAT”)和人白介素-6(在下文中称为“IL-6”)(在下文中称为“HAT培养基”)的常规培养基中，将所得到的悬液分配到培养平板(在下文中称为“平板”)的每个孔中，接着在5％CO₂下于37℃培养约2周。在培养期间，添加足够的HAT培养基。

(5)杂交瘤选择

当上述骨髓瘤细胞为8-氮鸟嘌呤抗性细胞系，即次黄嘌呤/鸟嘌呤/转磷酸核糖基酶(HGPRT)-缺失细胞系时，非融合的骨髓瘤细胞和骨髓瘤/骨髓瘤融合细胞无法在含HAT培养基中生存。尽管抗体产生细胞之间的融合细胞或抗体产生细胞和骨髓瘤细胞之间的杂交瘤可以生存，但抗体产生细胞之间的融合细胞的寿命有限。因此，通过在含HAT培养基中持续培养，只有作为抗体产生细胞和骨髓瘤细胞之间的融合细胞的杂交瘤才能生存，由此进行杂交瘤的选择。对于已成长为菌落的杂交瘤，用通过从HAT培养基中除去氨基蝶呤制备的培养基(在下文中称为“HT培养基”)交换HAT培养基。此后，对培养物上清液部分进行取样，并通过例如流式细胞术测定抗-人c-Mpl抗体效价。以上描述了一种涉及使用8-氮鸟嘌呤抗性细胞系的方法。应当注意到取决于选择杂交瘤的方法其他细胞系也可使用，并且在这样的情况下培养基组分也可改变。

(6)克隆步骤

将已发现产生作为以与上述(2)中相同的方法测定抗体效价的结果的特异性抗体的杂交瘤转移到另一个平板中，然后进行克隆。克隆技术的实例包括：有限稀释，其中以这样一种方式稀释杂交瘤使得每个孔含有一个杂交瘤，然后进行培养；软琼脂法，在软琼脂培养基中培养杂交瘤，然后回收菌落；使用显微操作器提取每个细胞并接着培养的方法；以及使用细胞分选仪分离细胞的分选克隆。有限稀释简单因此常使用。

通过例如有限稀释对其中观察到抗体效价的孔重复克隆2-4次，并选择其中稳定观察到抗体效价的孔作为产生抗-人c-Mpl单克隆抗体的杂交瘤系。

(7)选择激动剂抗体

可通过各种TPO活性试验系统分析所获得的、产生抗-人c-Mpl单克隆抗体的杂交瘤细胞的培养物上清液，或根据以下(8)中所描述的方法从上清液中纯化的抗体来选择激动性抗体。优选的筛选技术的一个实例是在哺乳动物细胞中表达人Mpl，接下来进行细胞增殖试验的方法。例如，使用表达人Mpl的BaF3小鼠细胞系的增殖试验(Orita等，Blood.2005年1月15日；105(2)：562-6)。由于小鼠细胞并不总是反映人细胞的反应，因此，更优选应用表达人Mpl的人细胞的增殖试验技术，以便选择对人细胞具有更强活性的抗体。涉及使用人细胞的系统的具体实例如以下实施例5中所描述的使用UT7/TPO细胞的细胞增殖试验。

(8)通过培养杂交瘤制备单克隆抗体

通过用常规培养基交换HT培养基培养已克隆的杂交瘤。可经使用大培养瓶的振荡培养、旋动培养或使用中空纤维系统的培养进行大量培养。可通过本领域公知的方法，例如凝胶过滤纯化经上述大量培养获得的上清液，来获得抗-人c-Mpl单克隆抗体。可选地，所述杂交瘤可在相同谱系(如BALB/c)小鼠或nu/nu小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或兔腹腔中生长，以获得含有大量抗-人c-Mpl单克隆抗体的腹水。用于简单纯化单克隆抗体的技术的实例，例如使用市售单克隆抗体纯化试剂盒(如MAbTrap GII试剂盒；Amersham Pharmacia Biotech)。由此获得的单克隆抗体具有高的、针对人c-Mpl的抗原特异性。

(9)检测单克隆抗体

可以下列方法测定如上所获得的单克隆抗体的同种型和亚类。相关技术的实例包括Ouchterlony法、ELISA和RIA。尽管Ouchterlony法简单，但如果单克隆抗体浓度低则该技术需要浓缩步骤。当使用ELISA或RIA时，培养物上清液同样可与吸附抗原的固相起反应，并使用与不同免疫球蛋白同种型和亚类起反应的第二抗体。因此，可鉴定单克隆抗体的同种型和亚类。此外，可通过Follin-Lowry法或基于280nm处的吸光度(1.4(OD280)＝免疫球蛋白1mg/ml)定量蛋白。同样地，可由杂交瘤克隆单克隆抗体编码基因以测定该序列。因此，可鉴定亚类。

(10)克隆编码单克隆抗体的基因以及制备重组抗体

从抗体产生细胞，如杂交瘤，克隆单克隆抗体编码基因，将克隆基因整合入适当的载体，并将所得到的载体导入宿主细胞(如哺乳动物细胞系、酵母细胞或昆虫细胞)。因此，可通过基因重组技术制备重组抗体(P.J.Delves.，Antibody production essential techniques，1997，WILEY，P.Shepherd和C.Dean.，Monoclonal Antibodies，2000OXFORD UNIVERSITY PRESS，J.W.Goding，Monoclonal Antibodies：principles and practice，1993，ACADEMIC PRESS)。

本发明包括含有产生本发明抗体的杂交瘤所携带的抗体的编码基因序列的核酸，特别是，本发明杂交瘤所产生抗体的重链可变区和轻链可变区的核酸。本申请中使用的术语“核酸”包括DNA和RNA。

为了制备编码来自杂交瘤的单克隆抗体的基因，通过PCR或其他方法制备分别编码单克隆抗体L链V区、L链C区、H链V区和H链C区的DNAs。根据抗体基因或氨基酸序列设计的寡DNA可用作为引物，自杂交瘤制备的DNA可用作为模板。将这样的DNAs整合入合适的载体，并将所得到的载体导入宿主细胞中用于表达。可选地，将这样的DNAs分别整合入合适的载体中用于共表达。

使用可在宿主微生物中自主生长的噬菌体或质粒载体。质粒DNAs的实例包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母衍生的质粒。噬菌体DNA的一个实例是λ噬菌体。

由于可正确形成抗体的三维结构，真核细胞可作为宿主用于转化。其实例包括酵母、动物细胞例如COS或CHO细胞以及昆虫细胞。当使用动物宿主细胞时，具体来说，例如可使用N5KG1-Val Lark载体(IDEC Pharmaceuticals：美国专利第6,001,358号)。该载体是一种用来在动物细胞中表达重组抗体的表达载体，其包含两个CMV启动子/增强子以及在其下游的重链和轻链可变区克隆位点。此外，该载体最初包含在上述位点下游的、编码人γ1链恒定区和人κ链恒定区的基因序列。任意重链和轻链可变区可以符合读框的方式整合入该载体可变区克隆位点中。因此，可表达包含连接至人κ链恒定区的轻链可变区以及连接至人γ1链恒定区重链可变区的抗体。导入了所述载体的动物细胞在培养液中产生了抗体(人IgG1)。同样地，可以使用包含不同重链恒定区基因的载体。例如，N5KG4PE载体(IDEC Pharmaceuticals)包含作为恒定区基因的、包含上述导入人γ4中的两个突变(即Ser228Pro和Leu235Glu)的序列。任意重链和轻链可变区基因序列均可整合入N5KG4PE载体中以表达包含任意可变区的IgG4PE。此外，可修饰重链或轻链基因以制备包含不同恒定区的抗体。

应当理解的是用于本发明中所使用的哺乳动物细胞的表达载体并不限于那些上述表达载体。例如，可使用包含作为用于调节表达的核苷酸序列的CMV启动子/增强子的其他表达载体。可选地，与上述的的启动子/增强子不同的、已知的启动子/增强子可用作为表达调节序列。启动子的实例包括那些获得自诸如多瘤病毒、鸡痘病毒(UK2211504，公开于1989年7月5日)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、鸡肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和最优选的猿猴病毒40(SV40)的病毒基因组的启动子，以及异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子和热休克蛋白启动子。作用于启动子以改善转录的增强子的实例包括来自已知的哺乳动物基因(即珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-甲胎蛋白和胰岛素)的增强子和来自真核细胞病毒的增强子(如可使用处在复制起点的SV40晚期增强子、增强子(bp100-270)、处在复制起点的多瘤病毒晚期增强子和多瘤病毒增强子以及腺病毒增强子)。

表达载体可包含为mRNA转录终止和稳定化所需的序列。这样的序列可通常获得自真核生物或病毒DNA或cDNA的5’-非翻译区，有时获得自3’-非翻译区。

可通过任何方法将基因导入宿主中，这样的方法的实例包括钙离子法、电穿孔、原生质球法、乙酸锂法、磷酸钙法和脂质转染法。用于将基因导入下述动物中的方法对实例包括显微注射、包括利用电穿孔或脂质转染将基因导入ES细胞的方法以及核移植。

在本发明中，可通过培养转化体并从培养物上清液中取样目的抗体从而获得目的抗体。使用适合使用的宿主的培养基经静置培养、摇瓶培养等培养转化体。

培养后，使用培养液本身或借助于离心或其它手段除去细胞纯化分泌至胞外的抗体。此后，可单独使用或任选地组合使用借助于各种用于蛋白分离/纯化的层析技术的常规生化技术以从培养产物中分离并纯化靶抗体。

此外，可利用制备转基因动物的技术来制备包含整合到其内源基因中的、编码目的抗体基因的动物宿主，例如转基因牛、山羊、绵羊或猪。此后，可从转基因动物所分泌的乳汁中大量获得来源于上述抗体基因的单克隆抗体(Wright，G.，等，1991，Bio/Technology9，830-834)。

用于制备本发明的抗人Mpl激动剂抗体的优选方法，包括但不限于，如上述用于解决所述技术问题的方法中使用的、示例性的基因重组技术的方法。

3.本发明的DNA

如上所述，本发明提供了：

(1)包含编码选自下列(a)-(d)的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，其是编码抗人Mpl激动剂抗体重链可变区氨基酸序列的碱基序列：

(a)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

(b)如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；

(c)如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；和

(d)如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；以及

(2)包含编码选自下列(a)-(h)的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，其是编码抗人Mpl激动剂抗体轻链可变区氨基酸序列的碱基序列：

(a)如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

(b)如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；

(c)如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；

(d)如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；

(e)在如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；

(f)在如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；

(g)在如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；和

(h)在如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列。

这些DNA可用于如上述第2节中所描述的、产生本发明的抗人Mpl激动剂抗体的方法中，更具体而言，可用于使用基因重组技术产生抗体的方法中。

编码上述可变区的氨基酸序列(a)-(d)的DNA可通过下述方法获得，即由上述获得用于产生抗人Mpl激动剂抗体的杂交瘤的方法制备的杂交瘤，如下述实施例7所述，通过常规技术提取mRNA，使用基于已知抗体恒定区氨基酸序列制备的引物由通过5’-RACE法获得。依照布达佩斯条约，在2006年3月14日将包含编码可变区的DNAs的质粒保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，305-8566，Japan)。

表1

 

SEQ ID NO.(质粒名称)	登录号	保藏日期
			2(抗-hMpl 7-10_HV/pCR4)	FERM-BP-10559	2006年3月14日
4(抗-hMpl 4-49_HV/pCR4)	FERM-BP-10553	2006年3月14日
			6(抗-hMpl 6-4-50_HV/pCR4)	FERM-BP-10555	2006年3月14日
8(抗-hMpl 6-5-2_HV/pCR4)	FERM-BP-10557	2006年3月14日
			3(抗-hMpl 7·10_LV/pCR4)	FERM-BP-10560	2006年3月14日
5(抗-hMpl 4-49_LV/pCR4)	FERM-BP-10554	2006年3月14日
			7(抗-hMpl 6-4-50_LV/pCR4)	FERM-BP-10556	2006年3月14日
9(抗-hMpl 6-5-2_LV/pCR4)	FERM-BP-10558	2006年3月14日

作为构成本发明的激动剂抗体的轻链可变区的具体实例，例如包含SEQ ID NO：3、5、7或9所示的氨基酸序列。所述的氨基酸序列的构架区可包含一个或几个氨基酸残基的缺失、取代、添加或插入。同样地，所述的氨基酸序列可包含与构架区序列具有至少85％、86％、87％、88％或89％，优选至少90％、92％、93％或94％，以及更优选至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在本申请中，术语“构架区”指从可变区，如SEQ ID NO：3、5或7所示的氨基酸序列中除三个互补决定区(CDRs)即RASQGISS(A或T)LA(氨基酸第24-34位)、DASSLES(氨基酸第50-56位)和QQFNSYP(L或Y或W)T(氨基酸第89-97位)外的区域。对如SEQ ID NO：9所示的氨基酸区的情况下，术语“构架区”指可变区中除RASQSVSSSYLA(氨基酸第24-35位)、DASSRAT(氨基酸第51-57位)和QQYGSSPIT(氨基酸第90-98位)外的区域。如之后实施例17中所证实的，本发明的突变抗体可具有基本上等效于未突变抗体的激动活性，甚至在构架区中存在氨基酸突变的情况下亦是如此。更具体地说，该突变抗体可具有结合细胞如FM3A-hMpl细胞的人血小板生成素受体、由此激活该受体的能力，和/或扩增UT-7/TPO细胞的能力。

所述突变的一个实例是在保守氨基酸之间的取代。保守氨基酸具有彼此类似的特性例如电荷、结构或极性。这样的保守氨基酸可分类为：例如碱性氨基酸(Arg、His或Lys)；酸性氨基酸(Glu或Asp)；非极性氨基酸(Ala、Leu、Ile、Val、Gly或Pro)；极性氨基酸(Ser、Thr、Cys、Met、Asn或Gln)和芳香族氨基酸(Phe、Tyr或Trp)。

序列同一性是导入或没有导入缺口(gap)的两条或多条氨基酸(或核苷酸)序列比对中匹配残基的百分数。序列同一性通常是相对于氨基酸(或核苷酸)总数的相同氨基酸(或核苷酸)数量的百分数。根据需要，可通过访问数据库例如NCBI(U.S.A.)并利用已知算法例如BLAST或FASTA用于序列检索从而确定序列同一性。

可通过例如定点诱变或PCR(利用含突变的引物)将突变导入编码无突变氨基酸序列的DNA中。用于导入突变的方法描述于例如，Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Mannual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989中。

除可变区之外，本发明的DNA可进一步包含编码重链或轻链恒定区的核苷酸序列。

基于所保藏的DNA以及已知的人抗体恒定区的序列，可通过公知的遗传工程化技术实现涉及用于产生本发明抗体的方法的上节所述的重链恒定区的修饰。

4.抗人c-Mpl激动剂抗体的制药用途和药物组合物

本发明的抗人c-Mpl激动剂抗体具有在体内和在体外结合并激活c-MPL受体的能力和/或刺激血小板产生的能力(即血小板生成活性)以及刺激血小板祖细胞产生的能力(即血巨核细胞生成活性)。

推测人c-Mpl受体在造血干细胞和巨核细胞中表达。据报道施用PEG-rHuMGDF增加了正常动物骨髓中成红细胞或粒细胞/巨噬细胞的祖细胞(Stem Cell，14：651-660，1996)。然而，移植了人脐带血的小鼠中施用PEG-rHuMGDF，尽管没有观察到人祖细胞生长，但导致除鼠巨核细胞之外的祖细胞生长。在施用抗人c-Mpl激动剂抗体，骨髓中人成红细胞或粒细胞/巨噬细胞的祖细胞的数量显著提高(实施例14)。这表明抗人c-Mpl激动剂抗体有选择性地将信号导入人细胞中以改善巨核细胞以及其他细胞的活力。

包含作为活性成分的、本发明的抗人c-Mpl激动剂抗体的药物组合物治疗的病症通常伴有的巨核细胞/血小板不足或预期或预计在未来巨核细胞/血小板不足(如由计划的外科手术或血小板捐献所引起的不足)。这样的病症起因于暂时或持久的体内活性Mpl配体不足。因此，本发明的组合物可用于预防性或治疗性治疗有待对血小板不足(即血小板减少症)进行治疗的患者的血小板减少症。此外，所述组合物可用于预防性或治疗性治疗在涉及长期各类细胞减少的造血干细胞移植后，需要进行恢复血细胞治疗的患者的各类细胞减少症，所述造血干细胞移植例如骨髓移植、脐带血移植或外周血干细胞移植。

血小板减少症(血小板不足)可由多种原因引起，包括化学疗法和使用多种药物的其他治疗方法、放射疗法、外科手术、意外出血以及其他具体的病理状况。可通过本发明治疗的并发血小板减少症的典型病理状况的具体实例包括：再生障碍性贫血；特发性或免疫性血小板减少症(ITP)，例如特发性血小板减少性紫癜伴发乳腺癌；ITP伴发HIV和血栓性血小板减少性紫癜伴发HIV；转移性肿瘤引起的血小板减少症；全身性红斑狼疮，例如新生儿狼疮综合征伴发脾肿大；范可尼贫血；维生素B12缺乏；叶酸缺乏；May-Hegglin二氏血小板异常；Wiskott-Aldridge综合征；慢性肝衰竭；骨髓增生异常综合征伴发血小板减少症；阵发性睡眠性血红蛋白尿症；C7E3 Fab(阿昔单抗)治疗后急性重度血小板减少症；同种免疫性血小板减少症，例如母体同种免疫性血小板减少症；血小板减少症伴发抗磷脂抗体及血栓形成；自身免疫性血小板减少症；药物诱导的免疫性血小板减少症，例如卡波铂诱导的血小板减少症或肝素诱导的血小板减少症；胎儿血小板减少症；妊娠期间的血小板减少症；Hughes′综合征；类狼疮血小板减少症；意外和/或大量出血；骨髓增生病；患恶性病患者中血小板减少症；血栓性血小板减少性紫癜，例如在癌症患者中作为血栓形成性血小板减少性紫癜/溶血性尿毒症综合征出现的血栓形成性微血管病；自身免疫性溶血性贫血；隐性空肠憩室穿孔；单纯性红细胞再生不良；自身免疫性血小板减少症；流行性肾病；利福平相关的急性肾衰竭；Paris-Trousseau血小板减少症；新生儿同种免疫性血小板减少症；阵发性夜间血红蛋白尿；胃癌中的血液学改变；儿童溶血性尿毒症综合征；以及与病毒感染有关的血液学表现包括甲型肝炎病毒和CMV-有关的血小板减少症。同样地，某些用于AIDS的治疗导致了血小板减少症(如AZT)。某些伤口愈合障碍也可能受益于血小板计数增加。这样的疾病包括那些并发其它类型血液不足以及血小板减少症的疾病。

在血小板成为必需的一段几小时到几天的时间之前，可施用作为活性成分的本发明的激动剂抗体来治疗预期的血小板减少症(如由于未来的外科手术)。在遇到紧急情况时(如意外和大出血)，本发明的激动剂抗体可与血液或纯化的血小板一起施用。同样地，可施用作为活性成分的本发明的激动剂抗体来治疗各类细胞减少症(如由脐带血移植引起的)。

特别优选的治疗靶标的实例包括(1)特发性血小板减少性紫癜或血小板减少症合并肝衰竭，和(2)由癌化学疗法引起的血小板减少症和/或各类细胞减少症、再生障碍性贫血、脊髓发育不良综合征(MDS)、骨髓移植或脐带血移植。

本发明的抗人c-Mpl激动剂抗体可用于保持血小板和/或巨核细胞以及相关细胞的活力或贮存寿命。因此，在包含这样的细胞的组合物中包含有效量的激动剂抗体是有用的。

包含作为活性成分的本发明的抗人c-Mpl激动剂抗体的药物组合物可注射、口服、经鼻、经皮或其他剂型施用，包括如静脉内、皮内、肌内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼内、眼球后和肺内(如气溶胶药物)施用，或皮下注射(包括用于长期释放的贮藏(depot)施用)；以及舌下、直肠和阴道施用，或外科手术植入，如包埋在脾被膜下、脑中或角膜中。可在一段给定时间内通过单次剂量或多剂量实施治疗。一般而言，本发明包括有效量的本发明的抗人c-Mpl激动剂抗体以及药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体的药物组合物。这样的组合物包括各种缓冲成分(如Tris-HCl、乙酸盐或磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂；添加剂例如表面活性剂和增溶剂(如吐温80或聚山梨醇酯80)，抗氧化剂(如抗坏血酸或焦亚硫酸钠)，防腐剂(如硫柳汞(Thimersol)或苯甲醛)以及填充剂(如乳糖或甘露糖醇)；其中包裹了所述活性物质的聚合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)粉粒制剂或脂质体。药物组合物还可任选地包括用作药物载体、赋形剂或介质的其他药学上可接受的液体、半固体或固体稀释剂。其实例包括但不限于，聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、硬脂酸镁、甲基及丙基羟基苯甲酸、淀粉、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯胶、磷酸钙、矿物油、可可豆油以及可可属(theobroma)油类。所述组合物可制备为液体形式、或可制备为干粉形式例如冻干粉形式。也包括可植入的持续释放形式和经皮形式。

考虑到各种改变药物作用的因素如患者的年龄、状况、体重、性别和饮食，任何感染的严重程度，给药时间和其他临床因素，由主治医师决定包括于治疗上述病症方法中的给药方案。一般而言，剂量应当在100μg-1mg本发明抗体/公斤体重/天的范围内，优选10-100μg/kg；以及更优选1-10μg/kg，以日剂量给予，或以较长或较短的时间间隔如每隔一天、一周两次、每周一次或每日两次或三次以等效剂量给予。

在治疗以其他症状及血小板不足为特征的病状中，包含作为活性成分的根据本发明的抗人c-Mpl激动剂抗体的药物组合物可单独使用或与其他细胞因子、可溶性Mpl受体、造血因子、白细胞介素或生长因子结合使用。与通常的造血刺激物例如IL-3或GM-CSF相结合的根据本发明的抗人c-Mpl激动剂抗体预计在治疗某些类型的血小板减少症中是有用的。其他巨核细胞刺激因子例如meg-CSF、干细胞因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素M(OSM)或其他具有巨核细胞刺激活性的分子也可与Mpl配体一起使用。用于上述联合给药的附加示范性细胞因子或血细胞生成因子包括IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-11，集落刺激因子-1(CSF-1)，M-CSF，SCF，GM-CSF，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，EPO，干扰素-α(IFN-α)，复合干扰素，IFN-β，IFN-γ，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，血小板生成素(TPO)，血管生成素例如Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4、Ang-Y，人血管生成素样多肽，血管内皮生长因子(VEGF)，血管生成素，骨形态发生蛋白-1，骨形态发生蛋白-2，骨形态发生蛋白-3，骨形态发生蛋白-4，骨形态发生蛋白-5，骨形态发生蛋白-6，骨形态发生蛋白-7，骨形态发生蛋白-8，骨形态发生蛋白-9，骨形态发生蛋白-10，骨形态发生蛋白-11，骨形态发生蛋白-12，骨形态发生蛋白-13，骨形态发生蛋白-14，骨形态发生蛋白-15，骨形态发生蛋白受体IA，骨形态发生蛋白受体IB，脑衍生的神经营养因子，睫状节神经细胞营养因子，睫状节神经细胞营养因子α，细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子1，细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子2α，细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子2β，β内皮细胞生长因子，内皮缩血管肽1，表皮生长因子，上皮衍生的中性粒细胞引诱剂，成纤维细胞生长因子4，成纤维细胞生长因子5，成纤维细胞生长因子6，成纤维细胞生长因子7，成纤维细胞生长因子8，成纤维细胞生长因子8b，成纤维细胞生长因子8c，成纤维细胞生长因子9，成纤维细胞生长因子10，酸性成纤维细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子受体α1，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子受体α2，生长相关蛋白，生长相关蛋白α，生长相关蛋白β，生长相关蛋白γ，肝素结合表皮生长因子，肝细胞生长因子，肝细胞生长因子受体，胰岛素样生长因子I，胰岛素样生长因子受体，胰岛素样生长因子II，胰岛素样生长因子结合蛋白，角质化细胞生长因子，白血病抑制因子，白血病抑制因子受体α，神经生长因子，神经生长因子受体，神经营养因子-3，神经营养因子-4，胎盘生长因子，胎盘生长因子2，血小板衍生的内皮细胞生长因子，血小板衍生的生长因子，血小板衍生的生长因子A链，血小板衍生的生长因子AA，血小板衍生的生长因子AB，血小板衍生的生长因子B链，血小板衍生的生长因子BB，血小板衍生的生长因子受体α，血小板衍生的生长因子受体β，前B细胞生长刺激因子，干细胞因子受体，TNF包括TNF0、TNF1和TNF2，转化生长因子α，转化生长因子β，转化生长因子β1，转化生长因子β1.2，转化生长因子β2，转化生长因子β3，转化生长因子β5，潜在转化生长因子β1结合蛋白I，转化生长因子β结合蛋白II，转化生长因子β结合蛋白III，肿瘤坏死因子受体I型，肿瘤坏死因子受体II型，尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂受体，血管内皮生长因子以及它们的嵌合蛋白。

因此，预计施用包含作为活性成分的、本发明的抗人c-Mpl激动剂抗体的药物组合物(用于增加成熟血巨核细胞数量)是一种特别有效的刺激血小板产生的方法。还预计这样的施用是一种刺激造血干细胞产生的有效手段。应当调节前述剂量以补偿治疗组合物中的这样的额外组分。可通过常规方法监测所治疗患者的进展。

以下，根据下述实施例本发明将得到更详细的描述；然而，本发明的技术范围并不限于实施例。

实施例

实施例1

抗原制备

1-1：制备人c-Mpl-表达细胞

一般而言，当抗原蛋白表达细胞系用于免疫时，使用显示更高表达水平的细胞系制备抗体是更有利的。已知多种类型的人巨核细胞细胞系或强制表达细胞系是人c-Mpl-表达细胞系；但在这样的细胞系中的c-Mpl表达水平仅为每细胞中几千分子，因此这样的细胞系不适合用作抗原。当用包含向FDCP2(即，鼠造血细胞系)中导入了人c-Mpl的表达细胞系FDCP-hMpl(参见FEBS Lett.Oct 21，1996；395(2-3)：228-234)免疫产生人抗体的小鼠(如KM小鼠^TM)时，抗体效价增加实际上并不足够，且无法获得该hMpl-特异性人抗体。当人血巨核细胞细胞系用作为抗原时，还诱导出与其他膜分子反应的抗体。因此，优选鼠利用已导入并以高水平表达人c-Mpl的鼠细胞系，最好是MHC-相容的细胞系作为宿主，以便有效诱导c-Mpl-特异性抗体。为了制备表达高水平人c-Mpl(hMpl)的细胞，以下列方法制备hMpl表达载体，并将所得到的载体导入两种类型的鼠细胞系(即L929和FM3A)中。

此外，已报道了以不依赖配体方式持续传递激动信号的hMpl突变受体(其中位于第508位的Trp已为Ser所取代的突变体；Abe，M.等，Leukemia，2002年8月；16(8)：1500-1506)。推断这样的突变体具有不同于野生型的构象。对持续活化突变体具有高亲和力的抗体可显示强有力的激动活性。因此，制备了持续活化突变体(在下文中称为“hMpl-Ser”)的表达载体，然后还制备了包含该载体的表达细胞供免疫使用。

1)制备抗-人c-Mpl(hMpl)表达载体

将humpl-Pas12的DNA，即携带有hMpl全长cDNA(Bartley，T.D.等，Cell，Ju1.1，1994；77(7)：1117-1124或Morita，H.等，FEBS Lett.Oct.21，1996；395(2-3)：228-234)的质粒DNA，用作模板来进行PCR用于扩增完整的hMpl编码区。使用设计成在其末端包含限制性内切酶位点(即在5’末端的EcoRI和在3’末端的XbaI)的Mpl_F1和Mpl_R2引物和KOD-Plus-DNA聚合酶(Toyobo，Japan)通过PCR扩增该区。在下列实例中，使用

 PCR System 9700(Perkin Elmer Japan)调节PCR反应温度。反应温度条件为：在94℃起始温度加热5分钟；随后98℃持续10秒和68℃持续3分钟的30个循环；以及最后在72℃加热7分钟。通过乙醇沉淀回收扩增的PCR片段，通过琼脂糖凝胶电泳分离，然后使用QIAquick凝胶抽提试剂盒(Quiagen)纯化，该试剂盒是一种使用膜的DNA纯化试剂盒。将纯化的DNA片段亚克隆入pCR4Blunt-TOPO载体(Toyobo)，并分析质粒中克隆的插入DNA片段的核苷酸序列，在该分析中M13-20FW和M13RV引物用于DNA核苷酸测序。分析插入部分的DNA核苷酸序列，并选择其中插入部分与hMpl序列(GenBank登录号：M90102)一致、且具有所设计的序列的引物部分的质粒DNA。随后，纯化包含hMpl核苷酸序列的质粒DNA，用EcoRI和XbaI限制性内切酶消化，并经琼脂糖凝胶电泳回收并纯化稍小于约2kb的DNA片段。独立地，也用EcoRI和XbaI限制性内切酶消化具有人EF启动子和杀稻瘟菌素(Bsd)选择标记的表达载体pEF6/Myc-His(Invitrogen)和具有CMV启动子和新霉素(Neo)选择标记的pEGEP-N1载体(BD Biosciences Clontech)，并用碱性磷酸酶(大肠杆菌C75；TaKaRa Bio，Japan)处理脱磷酸。然后使用琼脂糖凝胶电泳和DNA纯化试剂盒回收DNA。使用T4DNA连接酶将纯化的完整hMpl区的DNA片段连接到每一表达载体DNA，并将所得到的产物导入大肠杆菌DH10B以获得转化体。分析含插入DNA片段的转化体中质粒DNA的DNA核苷酸序列，并获得插入了全长hMpl cDNA的pEF-MPL635和pCMV-MPL635。

Mpl_F1：5’-AGAGAGAGAG GAATTCGCCA CCATGCCCTC CTGGGCCCTCTT-3’(SEQ ID NO：12)

Mpl_R2：5’-AGAGAGAGAG CGGCCGCTCA AGGCTGCTGCCAATAGCTTA GTG-3’(SEQ ID NO：13)

M13-20FW：5’-GTAAAACGACGGCCAGTG-3’(SEQ ID NO：14)

M13RV：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’(SEQ ID NO：15)

2)制备持续活化的人c-Mpl(hMpl-Ser)表达载体

制备hMpl突变体表达载体，已报道了以不依赖TPO的方式激活胞内信号的该突变体(即其中位于第508位的Trp已为Ser所取代的突变体；Abe，M.等，Leukemia，2002年8月；16(8)：1500-1506)。为了改变编码第508位氨基酸残基的密码子(即从TGG到TCG)，使用GeneEditor^TM体外定点诱变系统(Promega)将pEF-MPL635的DNA用作模板来进行定点诱变。Mut_MplSer508用作诱变寡核苷酸(在此5’-末端已被磷酸化)。将包括在试剂盒中的目的诱变寡核苷酸和选择核苷酸与模板DNA退火以合成带有导入突变的链。通过利用在GeneEditor^TM抗生素选择混合物存在下只有突变体倍增的事实选择突变体。更具体地说，在dsDNA模板于室温在碱性环境(0.2M NaOH，0.2mM EDTA(终浓度))下温育后5分钟后，添加1/10体积的2M乙酸铵(pH4.6)中和含碱变性模板DNA的溶液，然后通过乙醇沉淀回收碱变性的模板DNA。向碱变性的模板DNA添加试剂盒所带的诱变寡核苷酸、新的抗生素抗性获得选择寡核苷酸(在此5’-末端已被磷酸化)和退火缓冲液，在75℃下加热所得到的产物5分钟，并通过缓慢降低温度至37℃进行退火。随后，使用试剂盒所带的Synthesis 10×缓冲液、T4DNA聚合酶和T4 DNA连接酶在37℃下反应90分钟用于突变的链的合成和连接。在存在GeneEditor^TM抗生素选择混合物的情况下，通过转化、培养感受态BMH71-18mutS细胞制备的大肠杆菌转化株制备质粒DNA，随后用该质粒DNA转化感受态JM109细胞，接着在包含GeneEditor^TM抗生素选择混合物的LB平板上接种细胞。培养平板上出现的转化体，并分析质粒DNA的DNA核苷酸序列，由此获得表达其中第508位氨基酸残基已被取代(即Ser取代Trp)的hMpl的pEF-MPL635-Ser载体。

Mut_MplSer508：5’-CTGCTGCTGC TGAGGTCGCA GTTTCCTGCACACTAC-3’(SEQ ID NO：16)

3)制备表达全长人c-Mpl的L929细胞

将制备的pEF-MPL635载体(1μg)先与脂质转染胺试剂(购自Invitrogen)和脂质转染胺PLUS试剂(购自Invitrogen)混合，然后再与无血清Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)混合。将混合物添加到在6-孔板上培养的L929细胞(1.5 x 10⁵个细胞/孔)中，并处理培养物3小时以便将质粒DNA导入细胞中。然后在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养所得到细胞过夜。在第二天，添加10μg/ml杀稻瘟菌素(购自Invitrogen)到培养基中来选择抗药细胞。此后，利用抗-c-Mpl抗体通过荧光激活细胞分选(FACS)法分离c-Mpl-表达细胞，由此建立表达全长人c-Mpl的L929细胞系(在下文中称为“L929-hMpl”)。使用FACS-Vantage(Becton Dickinson)实施FACS。在选择后，在含5μg/ml杀稻瘟菌素和10％FBS的DMEM培养基中培养并维持细胞。

4)制备表达全长人c-Mpl的FM3A细胞

用和上述3)一样的方法，将pEF-MPL635载体导入FM3A细胞中以建立表达全长人c-Mpl的FM3A细胞系(在下文中称为“FM3A-hMpl”)。在含5μg/ml杀稻瘟菌素和10％FBS的Roswell ParkMemorial Institute(RPMI)培养基中培养并维持所建立的细胞。

5)制备持续活化的、表达人Mpl的FM3A细胞

用和上述3)一样的方法，将如上所述的pEF-MPL635-Ser载体导入FM3A细胞中以建立表达hMpl-Ser的FM3A细胞系(在下文中称为“FM3A-hMpl-Ser”)。在含5μg/ml杀稻瘟菌素和10％FBS的RPMI培养基中培养并维持细胞。

1-2：制备可溶性人c-Mpl重组蛋白

将编码缺少人c-Mpl跨膜区和胞内域、并具有下列序列的可溶性人c-Mpl的DNA连接入表达载体pEAK8(EdgeBioSystems)，然后通过transfectam试剂(可获得自Promega)将该表达载体导入Hek293细胞。在选择稳定表达细胞后，通过抗-Mpl抗体柱子纯化其培养物上清液来制备可溶性人c-Mpl重组蛋白(以下缩写成“可溶性Mpl-x”或“sMpl-x”)。

NH₂-MPSWALFMVTSCLLLAPQNLAQVSSQDVSLLASDSEPLKCFSRTFEDLTCFW

DEEEAAPSGTYQLLYAYPREKPRACPLSSQSMPHFGTRYVCQFPDQEEVRLFFPLH

LWVKNVFLNQTRTQRVLFVDSVGLPAPPSIIKAMGGSQPGELQISWEEPAPEISDFL

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ENCEEEEKTNPGLQTPQFSRCHFKSRNDSIIHILVEVTTAPGTVHSYLGSPFWIHQA

VRLPTPNLHWREISSGHLELEWQHPSSWAAQETCYQLRYTGEGHQDWKVLEPPL

GARGGTLELRPRSRYRLQLRARLNGPTYQGPWSSWSDPTRVETATETAW-COOH

(SEQ ID NO：17)

实施例2

制备单克隆抗体

用抗原免疫产生人抗体的小鼠(KM小鼠^TM)制备单克隆抗体，从而获得本发明的抗体，上述小鼠能通过遗传修饰产生人抗体。KM小鼠缺少内源性小鼠免疫球蛋白(Ig)重链和小鼠κ轻链，同时携带有具有人Ig重链基因(SC20)的染色体14片段和人Igκ链转基因(KCo5)。特别是，KM小鼠具有产生人抗体的能力并且缺少鼠Ig重链和κ链。通过在具有人Ig重链基因座的谱系A小鼠和具有人Igκ链转基因的谱系B小鼠之间进行杂交制备该小鼠。谱系A小鼠是缺陷内源性Ig重链和κ轻链基因的纯合子，其携带有可传递到子代的染色体14片段(SC20)谱(参见Tomizuka.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，2000，Vol97：722)。谱系B小鼠是内源性小鼠Ig重链和κ轻链基因都缺陷的纯合子，其携带有人Igκ链转基因(KCo5)(参见Nat.Biotechnol.，1996，Vol14：845)。

在本实施例中，通过已知技术制备单克隆抗体(Introduction toMonoclonal Antibody Experiment Protocols，Ando，Tamie等，Kodansha(Tokyo，Japan)，1991)。

1)免疫

按实施例1中所制备的L929-hMpl细胞、FM3A-hMpl细胞、表达持续活化的c-Mpl的FM3A-hMpl-Ser细胞以及sMpl-x重组蛋白用作人c-Mpl免疫原。实施例2中制备的产生人抗体的小鼠用作待免疫的动物，并以如下方法实施免疫，其中，所述的小鼠产生人免疫球蛋白。

免疫(方法1)：

将实施例1中制备的L929-hMpl细胞(5×10⁶个细胞)与Ribi佐剂混合，并将混合物用于腹膜内初次免疫9周龄的产生人抗体的小鼠。初次免疫后，用相同的细胞(2×10⁶个细胞)和白细胞介素6(IL-6)(5μg)每隔一周通过它们的尾静脉免疫小鼠7次，最后在从每只小鼠切除脾和淋巴结前用相同的细胞通过它们的尾静脉进行最终免疫。

免疫(方法2)：

将实施例1中制备的FM3A-hMpl-Ser细胞(5×10⁶个细胞)用紫外线照射，向其中添加Ribi佐剂，并将所得到的混合物用于腹膜内初次免疫9周龄产生人抗体的小鼠。初次免疫后，用相同的细胞(5×10⁶个细胞)每隔一周腹膜内免疫小鼠7次，最后在从每只小鼠切除脾和淋巴结前3天用实施例1中制备的FM3A-hMpl细胞(2×10⁶个细胞)和IL-6(5μg)通过它们的尾静脉最终免疫。

免疫(方法3)：

混合实施例1中制备的sMpl-x重组蛋白(10μg)和完全弗氏佐剂(CFA)，并将混合物用于皮下初次免疫9周龄产生人抗体的小鼠。通过用sMpl-x重组蛋白(5μg)和不完全弗氏佐剂(IFA)的混合物皮下免疫小鼠每周一次进行第2-5次免疫。通过腹膜内施用L929-hMpl细胞(5×10⁶个细胞)进行第6-8次免疫。最后，在从每只小鼠上切除脾和淋巴结前3天，sMpl-x重组蛋白(5μg)和IL-6(5μg)用于经尾静脉最终免疫小鼠。

2)制备杂交瘤

在最后一次免疫后3天通过外科手术从小鼠上切下脾和/或淋巴结，置于10ml含350mg/ml碳酸氢钠、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的无血清DMEM培养基中，并在筛网(细胞过滤器，Falcon)上使用刮刀压碎。离心已通过筛网的细胞悬液以沉淀细胞，然后在无血清DMEM培养基中洗涤两次，悬浮于无血清DMEM培养基中，并测定细胞计数。独立地，也用无血清DMEM培养基洗涤不大于1×10⁸个细胞/ml细胞密度的骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC No.CRL-1581)，该骨髓瘤细胞已在5％二氧化碳存在下于37℃在含10％FCS的DMEM培养基中进行培养，然后悬浮于无血清DMEM培养基中，并测定细胞计数。将回收的细胞悬液与鼠骨髓瘤细胞悬液以5:1细胞计数比例混合，离心混合物，并完全除去上清液。用移液管尖端搅拌的同时向沉淀中缓慢添加作为融合试剂的1ml 50％(w/v)聚乙二醇1500(BoehringerMannheim)，分两次缓慢添加预热至37℃的1ml无血清DMEM培养基，然后再添加7ml无血清DMEM培养基。离心后，除去上清液并使用如下所述的有限稀释对残留的融合细胞筛选目的杂交瘤。简言之，通过在含10％胎牛血清(FCS)和次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸苷(T)(在下文中称为“HAT，”Sigma)的DMEM培养基中进行培养选择杂交瘤。此外，通过使用含10％ FCS和HT(Sigma)的DMEM培养基的有限稀释获得单个克隆。在96-孔微量滴定板(Becton Dickinson)上进行培养。选择(或筛选)产生抗-人c-Mpl人单克隆抗体的杂交瘤克隆，通过如实施例4中所描述的流式细胞术，或如实施例5中所描述的使用UT7/TPO细胞的细胞增殖试验鉴定各杂交瘤所产生的人单克隆抗体。作为用于评价激动剂抗体活性的系统，可在诸如BaF3的小鼠细胞系中表达人Mpl，然后进行细胞增殖试验(Orita等，Blood，2005年1月15日；105(2)：562-6)。然而，这样的细胞反应无法总是反映人细胞的反应。由于UT7/TPO是一种人衍生的细胞系，因此其用于筛选被认为利于选择具有对人细胞更强活性的抗体。

作为筛选的结果，选择了4个克隆的、产生抗-人Mpl激动剂抗体的杂交瘤，即杂交瘤7-10(通过方法1获得的)、杂交瘤4-49(通过方法2获得的)以及杂交瘤6-4-50和6-5-2(通过方法3获得的)。产生非激动剂抗体的杂交瘤—杂交瘤2-35(通过方法1获得的)被选作为对照。

实施例3

从杂交瘤培养物上清液制备纯化的抗体

以下列方法从杂交瘤培养物上清液中纯化抗-人c-Mpl单克隆抗体。使用rmp蛋白A(Amersham Pharmacia Biotech)，0.8×40cm柱(Bio-Rad)，PBS作为吸附缓冲液以及0.02M甘氨酸缓冲液(pH 3)作为洗脱缓冲液，对含抗体的培养物上清液进行亲和纯化。通过添加1MTris(pH 9.0)将洗脱级分的pH调节至7.2左右。使用透析膜(10,000截断值，Spectrum Laboratories)用PBS替换所制备的抗体溶液，并通过膜滤器MILLEX-GV(Millipore)，孔径0.22μm经过滤灭菌获得纯化的抗-人c-Mpl单克隆抗体。通过测定280nm处吸光度并通过将1mg/ml规定为等于1.4OD计算确定该纯化的抗体的浓度。

以下列方法制备含抗-人c-Mpl单克隆抗体的培养物上清液。

首先，在含10ng/ml重组人IL-6(R&D Systems)和10％低IgG胎牛血清(HyClone)的eRDF培养基(Kyokuto Pharmaceutical Industrial)中调节产生抗体的杂交瘤。低温保存经调节的杂交瘤。随后，在含牛胰岛素(5μg/ml，Gibco-BRL)、人转铁蛋白(5μg/ml，Gibco-BRL)、乙醇胺(0.01mM，Sigma)、亚硒酸钠(2.5 x 10^-5mM，Sigma)、10ng/ml重组人IL-6(R&D Systems)和1％低IgG胎牛血清(HyClone)的eRDF培养基(Kyokuto Pharmaceutical Industrial)中对它们中的某些进行调节。在烧瓶中培养每种杂交瘤，当杂交瘤的％活力达到90％时回收培养物上清液。将回收的上清液施加于10-μm滤器接着0.2-μm滤器(GelmanScience)以除去污染物。

实施例4

通过流式细胞术评价抗-人c-Mpl抗体的结合活性

使用杂交瘤培养物上清液或纯化的抗体通过流式细胞术测定抗-人c-Mpl抗体的结合活性。使用FM3A-hMpl细胞或表达人Mpl的FDCP2细胞(FDCP-hMpl)(FEBS，Lett.，Oct 21，1996，395(2-3)：228-34)。

对于每次反应，将细胞(4 x 10⁵个细胞)悬浮于50μl FACS染色培养基(2％FBS，0.1％ NaN₃，1mM EDTA溶于PBS)，添加50μl杂交瘤培养物上清液或纯化的人抗体溶液(终浓度：0.1-1μg/ml)，在冰上反应30分钟。在用FACS染色培养基洗涤后，添加第二抗体—R-藻红蛋白(RPE)标记的山羊抗-人IgγF(ab’)抗体(Cat# 2043-09，SouthernBiotechnology)，在光屏蔽条件下再次在冰上反应30分钟，接着再次洗涤。为了分析抗体的结合活性，将细胞悬浮于含碘化吡啶(PI)的FACS染色培养基中。使用FACS Calibur(Becton Dickinson)进行该分析。

图1显示了使用不同的纯化抗体的流式细胞术结果。每种抗体都结合FDCP-hMpl细胞，但不结合其亲本细胞株FDCP2细胞(“FDCP亲本”)。因此，证实了那些抗体各自特异性结合人Mpl。

实施例5

使用UT7/TPO细胞评价抗-人c-Mpl抗体的激动活性

使用杂交瘤上清液或纯化的抗体进行UT7/TPO细胞增殖试验来评价激动活性。UT7/TPO细胞是一种TPO-依赖的人巨核细胞细胞系(参见Ozaki K等，Blood，Dec 15，1998；92(12)：4652-62)。一般而言，在含10％FBS和5ng/ml PEG-rHuMGDF的Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM)中培养并维持细胞。以下列方法进行细胞增殖试验。

(1)将UT7/TPO细胞培养物置于50-ml试管中并离心制备细胞沉淀(离心条件：1,500rpm，5min，4℃)。除去培养基，将沉淀悬浮在无细胞因子、含10％FBS的IMDM培养基(在下文中称为“增殖试验培养基”)中。再次离心细胞并悬浮于新鲜的增殖试验培养基中。再次重复离心和悬浮。

(2)在5％CO₂存在下于37℃培养上述(1)中悬浮于增殖试验培养基中的细胞6小时。

(3)培养后，离心细胞制备沉淀，然后悬浮于增殖试验培养基中。在该情况下，将细胞密度调节至6×10⁵个细胞/ml，并将50μl细胞悬液置于96-孔板的每个孔中。

(4)随后，添加40μl增殖试验培养基到10μl杂交瘤培养物上清液中，并将所得到的产物添加到每个孔中。当使用纯化的抗体时，以2x终浓度的浓度将样品添加到50μl增殖试验培养基中，并将所得到的产物添加到孔中。

(5)在5％ CO₂存在下于37℃培养48小时。

(6)以10μl/孔浓度添加WST-8试剂(Dojindo Laboratories)，并培养2小时。

(7)使用吸光酶标仪(Sunrise Rainbow；Tecan)(测量波长：450nm；参比波长：超过600nm)测定每个孔的吸光度。

图2显示了使用纯化的抗体7-10(图2A)、4-49(图2B)、6-4-50(图2C)和6-5-2(图2D)通过UT7/TPO细胞增殖试验获得的增殖曲线。下表2显示了抗-人c-Mpl抗体亚类和被确定为筛选结果的活性强度(通过UT7/TPO细胞增殖试验测定的50％有效浓度(EC50)和最大活性(Max))，以及制备抗体的实施例2中所描述的免疫方法。

表2

+：EC₅₀：1-10nM

++：EC₅₀：0.1-1nM

实施例6

集落形成试验

使用人脐带血衍生的CD34+细胞进行CFU-Mk集落形成试验，并检查纯化的抗体对人原代细胞的作用。以下列方法使用MegaCult^TM-C(Cat#04972，Stem Cell Technologies)进行试验。

(1)添加MegaCult^TM-C培养基(0.85ml)到0.15ml含样品的IMDM中，使得总体积为1ml。

(2)将制备自人脐带血的CD34+细胞以1.1 x 10⁵个细胞/ml的浓度悬浮于IMDM中，并将来自悬液的0.05ml等分试样添加到含有上述(1)的培养基的独立试管中。

(3)涡旋含有细胞的试管，添加0.6ml冰冷的胶原溶液，然后再次涡旋混合物。

(4)以0.75ml的量添加上述(1)-(3)的细胞样品混合物到室玻片(chamber slide)的每个孔中。

(5)将室玻片置于100-mm培养皿中。为了防止室玻片干燥，将含3ml纯水的35-mm培养皿置于上述100-mm培养皿中。

(6)将含室玻片的培养皿放在恒温箱架子上，在5％CO₂存在下于37℃培养10-12天。

(7)培养后，用固定液(甲醛:丙酮＝1:3)固定细胞。

(8)使用抗-人CD41抗体进行免疫染色以检测CFU-Mk集落。用显微镜计算菌落计数，彼此比较试样形成CFU-Mk集落的能力。

图3显示了集落培养的结果。7-10_IgG1或4-49_IgG1诱导了集落形成。

实施例7

抗体基因的克隆和测序

为了制备重组抗体，从选择的产生抗-人c-Mpl激动剂抗体的杂交瘤分离抗体基因，特别是编码重链(H链)的人IgγcDNA和编码轻链(L链)的人IgκcDNA，并测定它们的序列。

1)单克隆抗体cDNA的合成

为了获得包含杂交瘤中表达的、人抗体重链和轻链可变区的DNA片段，使用特异于人Igγ和人Igκ恒定区的引物，通过5’-RACE(5′cDNA末端快速扩增)法进行克隆。具体来说，根据所附使用说明书，使用BD SMART RACE cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences Clontech)进行克隆。

作为用于cDNA合成的原料，向杂交瘤7-10、4-49、6-4-50和6-5-2细胞添加用于RNA提取的Isogen(Nippon Gene，Japan)，并根据厂商使用说明书纯化总RNA。使用约1μg纯化的总RNA作为模板制备第一链cDNA。

以下列方法合成第一链cDNA。在70℃下温育含1μg/3μl总RNA、1μl5’CDS和1μl SMART Oligo的反应溶液2分钟。其后，2μl5×缓冲液、1μl DTT、1μl DNTP混合物和1μl PowerScript逆转录酶添加到其中，并在42℃下温育混合物1.5小时。

此外，添加50μl的tricine-EDTA缓冲液，并在72℃下温育混合物7分钟以获得第一链cDNA。

2)通过PCR扩增重链基因和轻链基因并确认核苷酸序列

2-1)通过PCR扩增重链和轻链基因

为了扩增人抗体基因cDNA，将具有人抗体特异性序列的3’-引物(特别是下述的)和下述的5’引物用作PCR引物组，所述的5’引物与使用BD SMART RACE cDNA扩增试剂盒(通用引物A混合物)合成的cDNA5’末端附加的序列特异性杂交，将KOD-Plus-DNA聚合酶(Toyobo)用作PCR酶来制备具有以下所示组成的反应溶液。该溶液用于PCR。

无菌H₂O 28μl

cDNA 2.5μl

KOD-Plus-缓冲液(10x) 5μl

dNTPs混合物(2mM) 5μl

MgSO₄(25mM) 2μl

KOD-Plus-(1单位/μl) 1μl

通用引物A混合物(UPM)(10x) 5μl

基因特异性引物(GSP)(10μM) 1.5μl

总体积 50μl

使用UPM引物和IgG1p引物扩增重链基因，所述引物包括在SMART RACE cDNA扩增试剂盒中。另一方面，使用UPM引物和hk-2引物组成的引物组扩增轻链基因。

IgG1p引物：5’-TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTTGTG-3’(SEQ ID NO：18)

hk-2：5’-GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA GC-3’(SEQ ID NO：19)

在下列温度条件下进行该反应：

94℃持续30秒和72℃持续3分钟的循环重复5次，94℃持续30秒、70℃持续30秒和72℃持续3分钟的循环重复5次，以及94℃持续30秒、68℃持续30秒和72℃持续3分钟的循环重复25次。

此外，向上述2μl反应溶液中添加98μl的tricine-EDTA缓冲液，使用5μl稀释溶液作为模板，并使用较第一次PCR更向内的引物组进行第二次PCR(嵌套式PCR)。PCR溶液组分显示如下。

无菌H₂O 30μl

第一PCR反应溶液(50-倍稀释的) 5μl

KOD-Plus-缓冲液(10x) 5μl

dNTPs混合物(2mM) 5μl

MgSO₄(25mM )2μl

KOD-Plus-(1单位/μl) 1μl

嵌套通用引物A(NUP；10μM) 1μl

基因特异性引物(GSP)(10μM) 1μl

总体积 50μl

当进行重链基因扩增时，NUPM引物(SMART RACE cDNA扩增试剂盒附带的；BD Biosciences Clontech)与hh2引物(在杂交瘤4-49、6-4-50和6-5-2情况下)或IgG2p_134引物(在杂交瘤7-10情况下)结合使用。当进行轻链基因扩增时，使用UPM引物和hk-5引物。通过在94℃起始温度加热1分钟，接着是在94℃加热5秒、在68℃持续10秒以及在72℃持续3分钟的20个循环，然后是在72℃加热7分钟进行反应。

2-2)测定抗体基因的核苷酸序列

通过上述方法扩增的重链的PCR片段(在下文中称为“HV[C]”)由重链的5’-非翻译区、前导序列(分泌信号序列)、可变区(HV)以及部分的恒定区([C])组成。类似地，轻链的PCR-扩增片段(在下文中称为“LV[C]”)由轻链的5’-非翻译区、前导序列(分泌信号序列)、可变区(LV)以及部分的恒定区([C])组成。本文中使用的术语“前导序列(分泌信号)”指为抗体分泌所需要的并且从成熟抗体蛋白中切割下的氨基酸序列。通过乙醇沉淀、琼脂糖凝胶电泳分离并接着由应用膜的DNA纯化试剂盒(QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen))纯化，从PCR溶液中回收HV[C]片段和LV[C]片段。将纯化的扩增的HV[C]片段和扩增的LV[C]片段分别亚克隆入Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen)的pCR4Blunt-TOPO载体(Toyobo)中。分析插入所获得克隆的质粒中的DNA的核苷酸序列。为了测定DNA的核苷酸序列，使用M13-20FW和M13RV引物。

hk-5：5’-AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT CCA GAT TTC-3’(SEQ ID NO：20)

hh2引物5’-GCT GGA GGG CAC GG TCA CCA CGC TG-3’(SEQ ID NO：21)

IgG2p_134：5’-TGCACGCCGC TGGTCAGGGC GCCTGAGTTC C-3’(SEQID NO：22)

编码激动剂抗体7-10重链可变区和轻链可变区DNA的核苷酸序列以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列显示如下。

<7-10的重链核酸序列>(ATG起始密码子至编码可变区C-末端氨基酸残基的DNA序列)

ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAG

TGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTC

CCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCAC

TGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTG

GAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTC

CAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTG

AGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAAATCTATGGTTCGGGGAGTTCCGTT

ACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA(SEQ

ID NO：23)

<7-10的重链氨基酸序列>(前导序列至可变区)

(下划线的氨基酸残基构成作为分泌信号的前导序列)

MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHW

VRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDT

ALYYCAKNLWFGEFRYWYFD LWGRGTLVTV SS(SEQ ID NO：24)

<7-10的轻链核酸序列>(ATG起始密码子至编码可变区C-末端氨基酸残基的DNA序列)

ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCA

GGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCT

GTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGC

TTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGA

TGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTG

GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTT

ATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGG

TGGAGATCAAA(SEQ ID NO：25)

<7-10的轻链氨基酸序列>(前导序列至可变区)

(下划线的氨基酸残基构成作为分泌信号的前导序列)

MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHW

VRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDT

ALYYCAKNLWFGEFRYWYFDLWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO：26)

编码激动剂抗体4-49重链可变区和轻链可变区DNA的核苷酸序列以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列显示如下。

<4-49的重链核酸序列>(ATG起始密码子至编码可变区C-末端氨基酸残基的DNA序列)

ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAG

TGTGAAGAGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGT

CCCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGTA

CTGGGTCCGGCAAGTTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTT

GGAACAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCGTTT

CCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCT

GAGGACACGGCCTTATATTACTGTGCAAAAGCCCTATGGTTCGGGGAGTTCCCC

CACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTC

A(SEQ ID NO：27)

<4-49的重链氨基酸序列>(前导序列至可变区)

(下划线的氨基酸残基构成作为分泌信号的前导序列)

MELGLSWIFLVAILKGVQCEEQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFDDYAMYW

VRQVPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTVSRDNAKNSLYLQMNSLRAED

TALYYCAKALWFGEFPHYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：28)

<4-49轻链核酸序列>(ATG起始密码子至编码可变区C-末端氨基酸残基的DNA序列)

ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCA

GGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCT

GTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTAC

TTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGA

TGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTG

GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTT

ATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGC

TGGAGATCAAACGT(SEQ ID NO：29)

<4-49的轻链氨基酸序列>(前导序列至可变区)

(下划线的氨基酸残基构成作为分泌信号的前导序列)

MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSTLA

WYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQF

NSYPYTFGQGTKLEIKR(SEQ ID NO：30)

编码激动剂抗体6-4-50重链可变区和轻链可变区DNA的核苷酸序列以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列显示如下。

<6-4-50的重链核酸序列>(ATG起始密码子至编码可变区C-末端氨基酸残基的DNA序列)

ATGGAATTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGT

GTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCC

CTGAGACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACCTTTGATAATTATGCCATGTACT

GGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGG

AATAGTGGTGACATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCC

AGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGA

GGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGGGATGCGGGGTTCGGGGAGTTCCACT

ACGGTCTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID

NO：31)

<6-4-50的重链氨基酸序列>(前导序列至可变区)

(下划线的氨基酸残基构成作为分泌信号的前导序列)

MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCATSGFTFDNYAMYW

VRQAP

GKGLEWVSGISWNSGDIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYC

ARDAGFGEFHYGLDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：32)

<6-4-50的轻链核酸序列>(ATG起始密码子至编码可变区C-末端氨基酸残基的DNA序列)

ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCA

GGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCT

GTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGC

TTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCTCCTGATCTATGA

TGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTG

GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTT

ATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGG

TGGAAATCAAACGT(SEQ ID NO：33)

<6-4-50的轻链氨基酸序列>(前导序列至可变区)

(下划线的氨基酸残基构成作为分泌信号的前导序列)

MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALA

WYQQKPGKVPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQF

NSYPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：34)

编码激动剂抗体6-5-2重链可变区和轻链可变区DNA的核苷酸序列以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列显示如下。

<6-5-2的重链核酸序列>(ATG起始密码子至编码可变区C-末端氨基酸残基的DNA序列)

ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAG

TGTGAAGTGCAACTGGTGGAGTGTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTC

CCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCAC

TGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTG

GAATAGTGGTAGTATAGGTTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTC

CAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTG

AGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAACCTATATGGTTCGGGGAGTGGGGAA

ACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

(SEQ ID NO：35)

<6-5-2的重链氨基酸序列>(前导序列至可变区)

(下划线的氨基酸残基构成作为分泌信号的前导序列)

MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVECGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHW

VRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDT

ALYYCAKPIWFGEWGNYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：36)

<6-5-2的轻链氨基酸序列>(ATG起始密码子至编码可变区C-末端氨基酸残基的DNA序列)

ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACC

ACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGG

GGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACT

TAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATG

CATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGG

ACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTAT

TACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTG

GAGATTAAACGT(SEQ ID NO：37)

<6-5-2的轻链氨基酸序列>(前导序列至可变区)

(下划线的氨基酸残基构成作为分泌信号的前导序列)

METPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWY

QQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGS

SPITFGQGTRLEIKR(SEQ ID NO：38)

[实施例8]构建重组抗体表达载体

将以上述方法从杂交瘤中克隆的抗体可变区整合入人抗体表达载体，并制备具有不同恒定区的重组抗体表达载体。

人抗体表达载体—N5KG1-Val Lark(以下缩写为“N5KG1”)(IDEC Pharmaceuticals，参见美国专利第6,001,358号)是一种用于在动物细胞中表达重组抗体的质粒载体。N5KG1的结构示于图4A中。N5KG1包含两个CMV启动子/增强子，以及在其下游的重链和轻链可变区基因克隆位点。此外，N5KG1最初包含上述克隆位点下游的、编码人重链恒定区(γ1)和人轻链恒定区(κ)的基因序列。任何重链和轻链可变区(包括前导序列或分泌信号序列)都可以符合读框的方式掺入该载体可变区克隆位点中，由此可表达包含连接至人κ链恒定区的轻链可变区以及连接至人γ1链恒定区的重链可变区的抗体。因此，其中导入了载体的动物细胞在培养基中产生了IgG1抗体。

类似地，表达载体N5KG4PE(IDEC Pharmaceuticals)包含IgG4PE的重链恒定区。IgG4PE是具有导入IgG4中的两个突变Ser228Pro和Leu235Glu的序列。Ser228Pro是抑制由IgG4分子内交联(即S-S键)引起的单体形成的突变，Leu235Glu是降低抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的活性的突变。

将N5KG1的IgG1恒定区转变为IgG3来制备N5KG3。

在该实施例中，通过向重链恒定区(特别是铰链区)添加不同的修饰，由N5KG1、N5KG3和N5KG4PE制备表达载体。

在本实施例中向恒定区添加的修饰，首先，是抗体域在亚类之间的取代。抗体重链恒定区具有自N-末端侧具有CH1-铰链-CH2-CH3的域结构。在本实施例中，通过将这些域单元组合到亚类序列中制备重链恒定区。例如，制备了其中CH1和铰链区序列来自人IgG3以及CH2和CH3序列来自人IgG1的重链恒定区。对具有以CH1/铰链/CH2/CH3顺序存在的重链恒定区的抗体进行亚类命名，其被命名为IgG3/3/1/1(以下称为例如IgG3311，省略了“/”)。还制备了其中铰链区序列是，例如来自人IgG3，CH1、CH2和CH3序列来自人IgG4PE的另一种重链恒定区。具有这样的重链恒定区的抗体被命名为IgG4344。

第二，制备人IgG3铰链区的修饰。抗体铰链区可分成上铰链和中间铰链。术语“上铰链”指从残基216至位于较残基226的N-末端侧的残基的序列，在此残基编号基于Kabat EU编号系统(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService，National Institute of Health，Bethesda，Md.，1991)。术语“中间铰链”指从残基226至位于较残基231的N-末端侧的残基的序列，在此残基编号基于同一系统。人IgG3的铰链区由上铰链的12个氨基酸残基和中间铰链的50个氨基酸残基组成，其中中间铰链分成5个氨基酸和15个氨基酸的3次重复(即5+15 x 3＝50)。在该实施例中，制备IgG3中间铰链序列重复被缩短为一次的突变体。这样的铰链被命名为G3h1，并将具有该类型铰链的抗体与所述域单元的突变相结合，所得到的组合被命名为IgGx3xxh1(在此x是任意的)。

同样地，制备缺失了IgG3中间铰链后面的一半重复序列的重链恒定区。这样的铰链被命名为G3uh(“上铰链突变”的缩写)，并称为IgGx3xxuh。

此外，将突变L217S和R228P添加到G3uh铰链来制备重链恒定区。该突变旨在将G3uh铰链带到更接近于IgG4PE序列的位置。所得到的产物被命名为G3uhm(“上铰链突变”的缩写)，并将具有上述产物的抗体称为IgGx3xxuhm。

图4B显示了天然存在的人免疫球蛋白和IgG4PE、IgG4344、IgG4344h1、IgG4344uh和IgG4344uhm铰链区的氨基酸序列。

在该实施例中，抗-Mpl激动剂抗体的可变区用于制备表达具有下列恒定区的抗体的表达载体：

IgG1、IgG4PE、IgG3311、IgG3331、IgG3344、IgG3344h1、IgG4344、IgG4344h1、IgG4344uh和IgG4344uhm。

以下，描述了用于制备表达载体的方法。

1)制备IgG1亚类的抗-c-Mpl抗体表达载体

1-1)制备抗-人c-Mpl抗体4-49_IgG1和抗体7-10_IgG1表达载体

通过先后将重链可变区和轻链可变区插入N5KG1载体制备抗体7-10和4-49表达载体。

图4C显示了制备表达载体的过程。将包含抗体7-10和4-49的HV[C]和LV[C]片段(如实施例7中所描述的)的质粒DNA用作模板，并将末端包含用于连接的限制性内切酶位点(在5’-末端侧的SalI和在3’-末端侧的NheI)的一组引物，由KOD-Plus-DNA聚合酶通过PCR扩增重链和轻链的前导序列和可变区。将PCR-扩增的重链和轻链的前导序列加上可变区分别以HV片段和LV片段表示。

将7-10HV和4-49HV片段插入N5KG1。用于扩增HV片段的引物如下所示。

7-10；

用于HV片段的5’引物：40-3H5Sal

5’-AGAGAGAGAG GTCGACCACC ATGGAGTTGG GACTGAGCTGGATTT-3’(SEQ ID NO：39)

用于HV片段的3’引物：40-3H3Nhe

5’-AGAGAGAGAG GCTAGCTGAG GAGACAGTGA CCAGGGTGCC A-3’(SEQ ID NO：40)

4-49；

用于HV片段的5’引物：F24HSal

5’-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTT-3’(SEQ ID NO：41)

用于HV片段的3’引物：C15H3Nhe

5’-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3’(SEQ IDNO：42)

通过在94℃起始温度加热1分钟，以及94℃持续5秒和68℃持续45秒的35个循环，然后在72℃加热7分钟进行该反应。用限制性内切酶SalI和NheI消化扩增的DNA片段，并经琼脂糖凝胶电泳回收约430-bp DNA片段，接着进行纯化。独立地，依次用限制性内切酶SalI和NheI消化N5KG1载体，并用碱性磷酸酶(大肠杆菌C75)(Takara Shuzo，Japan)处理脱磷酸。此后，经琼脂糖凝胶电泳并使用DNA纯化试剂盒回收约8.9-kb DNA片段。使用T4DNA连接酶将这两条片段彼此连接，然后导入大肠杆菌DH10B以获得转化体。分析来自所得到转化体的质粒DNA的核苷酸序列，并获得其中HV片段以符合读框的方式插入重链恒定区5’上游区的质粒DNAs—N5KG1_7-10_Hv和N5KG1_4-49_Hv。

随后，将LV片段(由轻链前导序列和可变区组成)插入质粒载体，所述的质粒载体包含插入其中的HV片段。用包含LV[C]片段的质粒DNA用作模板，在末端附加有用于连接的限制性内切酶位点(在5’-末端侧的BglII和在3’-末端侧的BsiWI)的引物，通过PCR扩增LV片段。用于扩增LV片段的引物如下所示。

7-10；

用于LV片段的5’引物：165-1B_L18Bgl

5’-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTC-3’(SEQ ID NO：43)

用于LV片段的3’引物：165_1B_L18_Bsi

5’-AGAGAGAGAG CGTACGTTTG ATCTCCACCT TGGTCCCTCC-3’(SEQID NO：44)

4-49；

用于LV片段的5’引物：DNP_L1Bglp

5’-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGAGGGTCCCCGCTCAGCTC-3’(SEQID NO：45)

用于LV片段的3’引物：A27_R_N202

5’-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGC-3’(SEQID NO：46)

通过在94℃起始温度加热1分钟，接着是在94℃加热5秒以及在68℃持续45秒的35个循环，然后是在72℃加热7分钟进行该反应。将纯化的LV的扩增的DNA片段亚克隆到pCR4Blunt-TOPO载体(Toyobo，Japan)中。分析插入获得的克隆质粒中的DNA核苷酸序列。为了测定DNA核苷酸序列，使用M13-20FW和M13RV引物。分析插入片段的DNA核苷酸序列，并选择并没有不同于模板LV以及具有所设计的引物序列的质粒DNA(TOPO_7-10_Lv和TOPO_4-49_Lv)。随后，用限制性内切酶BglII和BsiWI消化DNA，并经琼脂糖凝胶电泳回收约400-bp DNA片段然后进行纯化。通过T4DNA连接酶将纯化的DNA片段，与用限制性内切酶BglII和BsiWI消化并脱磷酸的、包含插入了HV的7-10或4-49的载体连接(约9.3-kb)，将所得到的产物导入大肠杆菌DH10B以获得转化体。分析转化体的DNA序列或限制性内切酶切割模式以选择包含目的质粒DNA的克隆。此外，大量纯化所获得的抗体表达质粒DNA，以便证实在克隆过程期间在完整重链区、完整轻链区以及位于插入区附近的DNA核苷酸序列中没有发生突变。表达载体7-10_IgG1和4-49_IgG1被命名为N5KG1_7-10和N5KG1_4-49。

图4C显示了产生N5KG1_7-10和N5KG1_4-49的过程。

1-2)制备抗-人c-Mpl抗体6-4-50_IgG1和6-5-2_IgG1表达载体

通过先后将轻链可变区和重链可变区插入人抗体表达载体制备6-4-50和6-5-2表达载体。

利用包含抗体6-4-50和6-5-2的LV[C]片段(如实施例7中所描述的)的质粒DNA作为模板，末端附加有用于连接的限制性内切酶位点(在5’-末端侧的BglII和在3’-末端侧的BsiWI)的一组引物，由KOD-Plus-DNA聚合酶，通过PCR扩增LV片段(由轻链的前导序列和可变区组成)。所使用的引物如下所示。

6-4-50；

用于LV片段的5’引物：208LF

5’-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGC-3’(SEQ ID NO：47)

用于LV片段的3’引物：62LP3Bsi

5’-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTG-3’(SEQ IDNO：48)

6-5-2；

用于LV片段的5’引物：A27F

5’-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTC-3’(SEQ ID NO：49)

用于LV片段的3’引物：202LR

5’-AGAGAGAGAGCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCCTTGGC-3’(SEQ ID NO：50)

通过在94℃起始温度加热1分钟，接着在94℃加热5秒以及在68℃持续45秒的35个循环，然后是在72℃加热7分钟进行反应。用限制性内切酶BglII和BsiWI消化扩增的DNA片段，并通过琼脂糖凝胶电泳回收约400-bp DNA片段并纯化。独立地，依次用限制性内切酶BglII和BsiWI消化N5KG1载体并用碱性磷酸酶(大肠杆菌C75)(Takara Shuzo，Japan)处理脱磷酸。此后，经琼脂糖凝胶电泳并使用DNA纯化试剂盒回收约8.9-kb DNA片段。使用T4DNA连接酶将这两条片段相互连接并导入大肠杆菌DH10B以获得转化体。分析包含插入DNA片段的所得到的转化体的质粒DNA核苷酸序列，并获得了其中LV片段以符合读框的方式插入编码N5KG1的人抗体轻链恒定区的5’-上游区的质粒DNA，即：N5KG1_6-4-50_Lv和N5KG1_6-5-2_Lv。随后，将HV片段(由重链的前导序列和可变区组成)插入质粒载体，所述的质粒载体包含插入其中的LV片段。利用包含HV[C]片段的质粒DNA(如实施例7中所述)作模板，一组在其末端附加有用于连接的限制性内切酶位点(在5’-末端侧的SalI和在3’-末端侧的NheI)的引物，通过PCR扩增HV片段。所使用的引物如下所示。

6-4-50；

用于HV片段的5’-引物：50-5-7Hsal

5-AGAGAGAGAG GTCGACCACC ATGGAATTGG GACTGAGCTGGATTTT-3’(SEQ ID NO：51)

用于HV片段的3’-引物：C15H3Nhe

5’-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3’(SEQ IDNO：52)

6-5-2；

用于HV片段的5’-引物：F24HSal

5’-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTT-3’(SEQ ID NO：53)

用于HV片段的3’-引物：L66H3Nhe

5’-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC-3’(SEQ IDNO：54)

通过在94℃起始温度加热1分钟，接着在94℃加热5秒和在68℃持续45秒的35个循环，然后在72℃加热7分钟进行反应。将扩增的纯化的HV片段的DNA片段亚克隆到pCR4Blunt-TOPO载体(Toyobo，Japan)中。分析插入所获得的质粒克隆中的DNA的核苷酸序列。为测定DNA核苷酸序列，使用M13-20FW和M13RV引物。分析插入片段的DNA核苷酸序列，并选择并没有不同于模板HV并且具有所设计的引物序列的质粒DNA(TOPO_6-4-50_Hv和TOPO_6-5-2_Hv)。随后，DNAs分别用限制性内切酶SalI和NheI消化，然后经琼脂糖凝胶电泳回收约430-bp DNA片段并纯化。独立地，将要被插入的DNA片段，与用限制性内切酶SalI和NheI消化并脱磷酸的、LV的6-4-50或6-5-2的片段的载体(约9.3-kb)相连接，将所得到的产物导入大肠杆菌DH10B以获得转化体，从转化体中选择具有靶质粒DNA的克隆。此外，大量纯化所得到的抗体表达质粒DNAs，以便证实在克隆过程期间在完整重链区、完整轻链区以及位于插入区附近的DNA核苷酸序列中没有发生突变。抗体表达载体6-4-50_IgG1和6-5-2_IgG1被命名为N5KG1_6-4-50和N5KG1_6-5-2。

图4D显示了产生N5KG1_6-4-50和N5KG1_6-5-2的过程。

2)制备亚类IgG4PE的抗-人c-Mpl抗体

使用前述N5KG4PE载体制备亚类IgG4PE抗体表达载体。用限制性内切酶NheI和BamHI切割N5KG4PE的质粒DNA，并纯化含重链恒定区的片段，然后连接到抗-cMpl抗体N5KG1_7-10和N5KG1_4-49的相同的限制性内切酶位点上制备N5KG4PE_7-10和N5KG4PE_4-49。

3)制备N5KG3

通过用具有以下序列的IgG3恒定区取代N5KG1的IgG1重链恒定区，制备人IgG3表达载体N5KG3。

IgG3恒定区的氨基酸序列

STKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL

QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPR

CPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVF

LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKLREEQ

YNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYT

LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFL

YSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK*(SEQ ID NO：55)

IgG3恒定区的核苷酸序列

CTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACC

TCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACC

GGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC

CGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGC

CCTCCAGCAGTTTGGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGAATCACAAGCCC

AGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACA

CAACTCACACATGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCC

CCGTGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCC

ACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCC

CAGCACCTGAACTCCTGGGAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCC

AAGGATACCCTTATGATTTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGAC

GTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAAGTGGTACGTGGACGGCGTGG

AGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCTGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTTC

CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGA

GTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCA

TCTCCAAAACCAAAGGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA

TCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAG

GCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAG

AACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTC

TACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTC

ATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTACACGCAGAAGAGCCTCT

CCCTGTCTCCGGGTAAATGA(SEQ ID NO：56)

4)制备IgG3311表达载体

使用N5KG3作为模板以linkH和13ch1-R为引物，在98℃加热1秒、60℃持续30秒以及72℃持续30秒，并重复该反应15次的反应制备IgG3311表达载体。与此同时，使用N5KG1作为模板，以13ch1和linkH2引物的98℃持续1秒、60℃持续30秒以及72℃持续30秒的反应循环重复15次。使用PCR纯化试剂盒纯化扩增的DNA片段，将两种纯化的DNA片段等量混合，重复98℃持续1秒、60℃持续30秒以及72℃持续30秒的反应循环5次，并使用外加的linkH和linkH2引物进行额外的15个反应循环。用NheI和BamHI切割扩增的DNA片段并用N5KG1载体IgG1恒定区取代。该表达载体被命名为N5KG3311。

linkH：GGGTAC GTC CTC ACA TTC AGT GAT CAG(SEQ ID NO：57)

13ch1-R：GTC TTC GTG GCT CAC GTC CAC CAC CAC GCA(SEQ ID NO：58)

13ch1：TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC(SEQ ID NO：59)

linkH2：TGA TCA TAC GTA GAT ATC ACG GC(SEQ ID NO：60)

5)制备IgG3331表达载体

用N5KG3作为模板，以linkH和CH3consR为引物，在98℃加热1秒、60℃持续30秒以及72℃持续30秒，并重复该反应15次的反应制备IgG3311表达载体。与此同时，使用N5KG1作为模板，以CH3cons和linkH2引物，98℃持续1秒、60℃持续30秒以及72℃持续30秒的反应循环重复15次。使用PCR纯化试剂盒纯化扩增的DNA片段，将纯化的两种DNA片段等量段混合，重复98℃持续1秒、60℃持续30秒以及72℃持续30秒的反应循环5次，并使用外加的linkH和linkH2引物进行额外的15个反应循环。用NheI和BamHI切割扩增的DNA片段并用N5KG1载体IgG1恒定区取代。该表达载体被命名为N5KG3311。

CH3consR：GGTGTACACCTGTGGCTCTCGGGGCTGCCC(SEQ ID NO：61)

CH3cons：GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACC(SEQ ID NO：62)

以下，描述了制备IgG3344、IgG3344h1、IgG4344、IgG4344h1、IgG4344uh和IgG4344uhm的方法。通过PCR扩增它们的恒定区，克隆扩增产物获得质粒。用N5KG1_7-10的IgG1恒定区等取代这样的修饰的恒定区。

6)制备IgG3344和IgG3344h1恒定区

以下列方法使用N5KG3331和N5KG4PE作为模板，通过基于PCR的诱变(通过重叠延伸法的定点诱变)制备IgG3344表达载体。

使用N5KG3331作为模板，以G3G4_P1_F和G3G4_P2_R作为引物，通过在94℃起始温度加热1分钟，接着是在94℃加热15秒、在55℃持续10秒以及在68℃持续1分钟的35个循环，然后是在72℃加热7分钟进行PCR。与此同时，在相同条件下使用前述表达载体N5KG4PE作为模板以及G3G4_P3_F和G3G4_P4_R作为引物进行PCR。通过琼脂糖凝胶电泳回收扩增的DNA片段，接着使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化。将等量的这些纯化的DNA片段互相混合。退火这两条DNA片段的重叠部分并进行5个延伸反应循环，所述循环包括在94℃起始温度加热1分钟，和94℃持续10秒，55℃持续10秒以及68℃持续1.5分钟。此后，添加G3G4_P1_F和G3G4_P4_R引物到反应溶液中以便扩增全长序列，并重复在94℃加热5秒以及68℃持续2分钟的循环20次，然后是在72℃加热7分钟。G3G4_P1_F和G3G4_P4_R引物包含限制性内切酶位点(在G3G4_P1_F中NheI位点以及在G3G4_P4_R中BamHI位点)以便切割人抗体恒定区的编码区，并用抗体表达载体的相应区取代该编码区。通过琼脂糖凝胶电泳回收扩增的PCR片段，然后使用QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。将纯化的扩增片段亚克隆到Zero Blunt TOPOPCR克隆试剂盒(Invitrogen)的pCR 4 Blunt-TOPO载体中，并分析插入所得到克隆质粒中DNA的核苷酸序列。基于核苷酸序列分析结果，选择具有IgG3344和IgG3344h1恒定区的克隆。

G3G4_P1_F：5’-AGAGAGGCTA GCACCAAGGG CCCATCG-3’(SEQ ID NO：63)

G3G4_P2_R：5’-GAACTCAGGT GCTGGGCACC TTGGGCACG-3’(SEQ IDNO：64)

G3G4_P3_F：5’-CCAAGGTGCC CAGCACCTGA GTTCGAGGGG GGA-3’(SEQ ID NO：65)

G3G4_P4_R：5’-AGAGAGGGAT CCTCATTTAC CCAGAGACAG GGA-3’(SEQ ID NO：66)

7)制备IgG4344恒定区

用N5KG3331作为模板，以G434_P5_F和G434_P6_R作为引物，在94℃起始温度加热1分钟，接着是在94℃加热15秒、55℃持续10秒以及68℃持续1分钟的35个循环，然后是在72℃加热7分钟的反应制备IgG4344表达载体。与此同时，使用N5KG4PE作为模板以及G434_P7_F和G3G4_P2_R作为引物在相同的条件下进行PCR。通过琼脂糖凝胶电泳回收扩增的DNA片段，然后通过QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化。对这两条纯化的DNA片段以及已用N5KG4PE作为模板以及G3G4_P3_F和G3G4_P4_R作为引物扩增并纯化的DNA片段(即三种类型的DNA片段)进行重叠延伸反应。具体而言，使三种类型DNA片段的重叠部分退火，通过在94℃起始温度加热1分钟，并通过94℃持续10秒、55℃持续10秒以及68℃持续1.5分钟的5个循环进行延伸。为了扩增全长序列，添加G434_P5_F和G3G4_P4_R引物到反应溶液中，然后进行在94℃加热5秒以及在68℃持续2分钟的20个循环，接着是在72℃加热7分钟。通过QIAquick凝胶提取试剂盒纯化扩增的PCR片段并亚克隆入pCR4Blunt-TOPO载体中。然后分析插入所获得的质粒克隆中的DNA的核苷酸序列。基于核苷酸序列分析结果，选择具有IgG4344恒定区的克隆。

G434_P5_F：5’-AGAGAGGCTA GCACCAAGGG GCCATCC-3’(SEQ ID NO：67)

G434_P6_R：5’-GGTTTTGAGC TCAACTCTCT TGTCCACCTT GGTGTTGC-3’(SEQID NO：68)

G434_P7_F：5’-GTGGACAAGA GAGTTGAGCT CAAAACCCCA CTTGGTGACAC-3’(SEQ ID NO：69)

8)制备IgG4344h1恒定区

用N5KG4344作为模板，以G434_P5_F和G434_P6_R作为引物，通过PCR制备IgG4344h1表达载体，包括在98℃起始温度加热10秒，接着是在98℃加热10秒、在55℃持续30秒以及在72℃持续1分钟的7个循环，然后是在98℃加热10秒以及在68℃持续1分钟的30个循环，之后是在72℃加热7分钟。使用了Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio)。与此同时，使用N5KG3344h1作为模板，以G434_P7_F和G3G4_P4_R引物，在相同的条件下进行PCR。通过琼脂糖凝胶电泳回收扩增的DNA片段，然后通过QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化。将这些纯化的DNA片段等量混合，使两条DNA片段的重叠部分退火，通过在98℃起始温度加热10秒，接着在98℃加热10秒、在55℃持续30秒以及在72℃持续1分钟的7个循环延伸退火产物。添加G434_P5_F和G3G4_P4_R引物到反应溶液中以便扩增全长序列。此外，重复98℃持续10秒以及68℃持续1分钟的循环30次，接着是在72℃加热7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳回收扩增的PCR片段，然后使用QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。将纯化的扩增片段亚克隆入pCR 4 Blunt-TOPO载体中，并分析插入所获得的克隆质粒中的DNA核苷酸序列。基于核苷酸序列分析结果，选择具有G4344h1恒定区的克隆。

9)制备IgG4344uh恒定区

用N5KG4344作为模板，以G434_P5_F和17-1R作为引物，通过PCR制备G4344uh，包括在98℃起始温度加热10秒，接着是在98℃加热10秒、在50℃持续30秒以及在72℃持续1分钟的5个循环，然后是在98℃加热10秒、在55℃持续30秒以及在72℃持续1分钟的5个循环，之后是在98℃加热10秒以及在68℃持续1分钟的25个循环，然后是在72℃加热7分钟。使用了Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio，Japan)。与此同时，用N5KG3344h1作为模板，以17-2F和G3G4_P4_R作为引物，在相同的条件下进行PCR。通过琼脂糖凝胶电泳回收扩增的DNA片段，然后通过QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。将这些纯化的DNA片段等量混合，使两条DNA片段的重叠部分退火，通过在98℃起始温度加热10秒，接着在98℃加热10秒以及在68℃持续1分钟的5个循环，然后在98℃加热10秒、在55℃持续30秒以及在72℃持续1分钟的5个循环延伸退火产物。此后，添加G434_P5_F和G3G4_P4_R引物到反应溶液中以便扩增全长序列。重复在94℃加热30秒以及68℃持续1分钟的循环30次，然后在72℃加热7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳回收扩增的PCR片段，然后使用QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。将纯化的扩增片段亚克隆入pCR 4 Blunt-TOPO载体中，并分析插入所获得的质粒克隆中的DNA核苷酸序列。基于核苷酸序列分析结果，选择具有IgG4344uh恒定区的克隆。

17-1R：5’-AGGTGCTGGG CACCGTGGGC ATGTGTGAGT TGT-3’(SEQ ID NO：70)

17-2F：5’-CACACATGCC CACGGTGCCC AGCACCTGAG TTC-3’(SEQ ID NO：71)

10)制备IgG4344uhm恒定区

通过PCR制备IgG4344uhm表达载体，用N5KG4PE作为模板，以G434_P5_F和17m-1R作为引物，包括在98℃起始温度加热10秒，接着是在98℃加热10秒、在50℃持续30秒以及在72℃持续1分钟的5个循环，然后是在98℃加热10秒、在55℃持续30秒以及在72℃持续1分钟的5个循环，接着是在98℃加热10秒以及在68℃持续1分钟的25个循环，然后是在72℃加热7分钟。使用了PyrobestDNA聚合酶。与此同时，在相同条件下进行PCR，使用N5KG4PE作为模板以及17m-2F和G3G4_P4_R作为引物。通过琼脂糖凝胶电泳回收扩增的DNA片段，并接着通过QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。将这些纯化的DNA片段等量混合，使两条DNA片段的重叠部分退火，并通过94℃持续30秒、55℃持续30秒和72℃持续1分钟的7个循环延伸退火产物。此后，添加G434_P5_F和G3G4_P4_R引物到反应溶液中以便扩增全长序列，并重复在94℃加热30秒以及68℃持续1分钟的循环30次，之后在72℃加热7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳回收扩增的PCR片段，并接着利用QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。将纯化的扩增片段亚克隆入pCR 4 Blunt-TOPO载体中，并分析插入所得到克隆的质粒的DNA核苷酸序列。基于核苷酸序列分析结果，选择具有IgG4344uhm恒定区的克隆。

17m-1R：5’-TGTGTGAGTT GTGTCACCAA GTGGGGTTTT GGACTCAACTCTCTTGTCCA CCTTGGT-3’(SEQ ID NO：72)

17m-2F：5’-ACCCCACTTG GTGACACAAC TCACACATGC CCACCATGCCCAGCACCTGA GTTCGAG-3’(SEQ ID NO：73)

图4E显示了各种修饰重链的氨基酸序列。

11)制备包含不同修饰的重链恒定区的抗体表达载体

用限制性内切酶NheI和BamHI切割具有不同修饰的重链恒定区的质粒DNA，并纯化分离恒定区序列。随后，用相同的酶消化抗-人c-Mpl抗体表达载体N5KG1_7-10、N5KG1_4-49、N5KG1_6-4-50和N5KG1_6-5-2，并进行恒定区取代。

图4F显示了7-10_IgG4344uhm的重链序列。

图4G显示了7-10_IgG4344uhm的轻链序列。

实施例9

在293F细胞中瞬时表达并纯化抗-人c-Mpl抗体

使用EndoFree质粒试剂盒(Qiagen)制备实施例8中制备的表达载体的DNA，并使用FreeStyleTM 293表达系统(Invitrogen LifeTechnologies)导入游离的293细胞(Invitrogen Life Technologies)中，经瞬时表达获得含抗体的培养物上清液。将已通过膜滤器(孔径：0.22μm，Millipore)过滤的培养物上清液(含约500μg IgG)施加于用于抗体纯化的亲和层析柱，即HiTrap rProtein A FF(柱体积：1ml)(AmershamBiosciences)，用PBS(-)洗涤，用20mM柠檬酸盐缓冲液(pH3.4)洗脱，然后回收到含200mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)的试管中。

实施例10

制备重组抗体

将构建的抗体表达载体导入宿主细胞中来制备抗体表达细胞。通过在无血清EX-CELL325PF(JRH)培养基中调节dhfr-缺陷的CHODG44细胞(IDEC Pharmaceuticals Corporation)制备的细胞系用作宿主细胞。经电穿孔将载体导入宿主细胞。用限制性内切酶AscI线性化抗体表达载体(约2μg)，使用Bio-Rad电穿孔仪(electrophoreter)在350V和500μF下将该基因导入4×10⁶个CHO细胞中，并将所得到的细胞接种在96-孔培养平板上。导入载体后，添加G418并持续培养。在观察到菌落后，选择抗体表达细胞系。在5％ CO₂存在下，在EX-CELL325-PF培养基(JRH)(含2mM谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和次黄嘌呤和胸苷(HT)补充物(1:100)(Invitrogen))中培养所选择的CHO细胞系。在Mabselect蛋白A柱(AmershamPharmacia Biotech)上吸附培养物上清液，用PBS洗涤，然后用含50mM NaCl的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH3.4)洗脱。用50mM磷酸钠(pH7.0)中和洗脱液。用Milli-Q水将所得到的产物稀释约1.5-倍以便将电导率调节至4.0ms/cm或更低。随后，施加样品并使之吸附于包含连接SP-Sepharose(HiTrap SP FF)(Amersham Pharmacia Biotech)的Q-Sepharose(Hitrap Q HP)(Amersham Pharmacia Biotech)柱上，用20mM磷酸钠缓冲液(pH5.0)洗涤，并用1×PBS缓冲液洗脱。制备的抗体溶液通过0.22μm膜滤器，MILLEX-GV(Millipore)经过滤灭菌。通过测定280nm处的吸光度并基于1.4OD等于1mg/ml根据吸光度值进行计算确定纯化的抗体的浓度。

通过UT7/TPO试验(实施例5)测定修饰的重组抗体的活性。当与4-49_IgG1比较时，发现IgG3311和IgG3331的活性增加了(图5A)，并发现7-10_IgG4344uhm和4-49_IgG4344uhm的活性相当于PEG-rHuMGDF的活性。

表3中概述了各种修饰的抗体的活性。发现通过修饰恒定区所有激动剂抗体的活性都增加了。抗体7-10和4-49的IgG1和IgG4PE具有相当的活性，以及IgG4344uhm较IgG4PE具有更高的活性。在IgG4344uhm中，位于处于IgG4PE上铰链区的7个氨基酸的氨基酸序列中第4-7位的C-末端氨基酸已被位于处于IgG3上铰链区的12个氨基酸的氨基酸序列中第4-12位的序列所取代(参见图4B)。因此认为该区对增加活性重要。

表3

+：EC₅₀1-10nM

++：EC₅₀0.1-1nM

+++：EC₅₀ 0.01-0.1nM

NT：未测试

实施例11

通过激动剂抗体的信号转导

当TPO结合c-Mpl受体时，发生胞内蛋白磷酸化。已知为TPO所激活的主要途径的实例包括三个途径，即Jak-STAT、Ras-MAPK和PI3K-Akt。使用特异于磷酸化蛋白的抗体，通过蛋白质印迹分析由激动剂抗体所引起的c-Mpl下游磷酸化信号传导。所使用的抗体如下：抗-STAT5(Cat#9352，Cell Signaling)、抗-磷酸-STAT5(Cat#9351L，CellSignaling)、抗-JAK2(Cat#06-255，Upstate)、抗-磷酸-JAK2(Cat#07-606，Upstate)、抗-Erk1/2(Cat#9272，Cell Signaling，)、抗-磷酸-Erk1/2(Cat#9271L，Cell Signaling)、抗-Akt(Cat#9102，Cell Signaling)和抗-磷酸-Akt(Cat#9101S，Cell Signaling)。

以下列方法使用这些抗体实施试验。

1)在无细胞因子IMDM培养基中洗涤UT7/TPO细胞并培养6小时。

2)培养后，将细胞调节为1×10⁶个细胞/ml并以2ml/孔接种在6-孔板上。

3)添加激动剂抗体或PEG-rHuMGDF(作为阳性对照)到孔中刺激细胞。

4)在5分钟至2小时的刺激后，回收细胞并用冰冷的PBS洗涤。

5)通过离心沉淀细胞，弃去上清液，在PhosphoSafe^TM提取试剂(Cat#71296，Novagen)中溶解沉淀，再次进行离心，由此回收上清液(细胞提取物)。

6)通过蛋白质印迹对上述5)中获得的细胞提取物检测磷酸化蛋白。

结果示于图6。通过激动剂抗体7-10G4344uhm和4-49G4344uhm观察到的磷酸化是出现在类似于TPO信号传导的途径中的磷酸化(图6A)。关于抗体6-5-2，在IgG1中没有观察到Jak2或STAT5的磷酸化，而在IgG3344中却观察到了(图6B)。

实施例12

对人血小板的引发效应

尽管TPO并不导致血小板凝集，但其具有促进由凝集诱发剂，如ADP，所引起的血小板凝集的效应(即引发效应)。通过下列步骤检测激动剂抗体对人血小板的引发效应。

1)在140g下将含1/10体积的作为抗凝血剂的3.1％(w/v)柠檬酸三钠的、获得自健康人志愿者的外周血离心15分钟，制备富血小板血浆(以下缩写为“PRP”)。

2)再次进行离心(2,500g，15min)以沉淀血细胞，并收集血浆。

3)测定PRP中血小板计数，然后用血浆调节至3 x 10⁵个细胞/μl。

4)添加样品到100μl上述3)中制备的血小板悬液中，并在搅拌的同时温育混合物3分钟。

5)添加5μl的30μM ADP(SIGMA)，在Hematracer 801(MCMedical，Japan)上测定由血小板凝集引起的浊度减少。

结果示于图7。在存在添加的ADP情况下，观察到激动剂抗体的引发效应。在仅有抗体(即无ADP)的情况下，不发生血小板凝集。

实施例13

施用于食蟹猴

为了分析血小板计数改变，施用激动剂抗体于食蟹猴。为证实个体对TPO的应答，在第一天(0天)静脉内施用PEG-rHuMGDF(10μg/kg)，观察3周情况，并在最初施用后21天以1mg/kg的剂量静脉内施用纯化的激动剂抗体7-10G4PE(个体A)和7-10G3344h1(个体B)。

结果示于图8。在个体A和B中都观察到了由PEG-rHuMGDF所引起的短暂的血小板计数增加。在施用激动剂抗体7-10G3344h1后，在个体B中观察到血小板计数增加。同样地，在施用该抗体后没有观察到严重的毒性。

实施例14

对人脐带血移植模型的作用

为证实实施例10中制备的激动剂抗体会促进人脐带血移植模型中人造血系统的形成，以下列方法进行试验。

用作为移植预处理(2戈瑞(grays))的放射线辐照NOG(NOD/SCID/IL2-γR KO)小鼠(购自Central Institute forExperimental Animals(CIEA)(Kawasaki，Kanagawa，Japan))，然后通过尾静脉注射1,000-10,000个人脐带血衍生的CD34+细胞。

分析物首先在移植的第二天施用，此后一周一次。分组、分析物和剂量显示如下。每组由6只小鼠组成，腹膜内施用。在每周一次的施用时测定体重。

<分组、分析物和剂量>

I：移植数量：10,000，施用PBS(作为对照)

II：移植数量：1,000，施用PBS

III：移植数量：10,000，施用抗体7-10G4344uhm，100μg/头部/周

IV：移植数量：1,000，施用抗体7-10G4344uhm，100μg/头部/周

V：移植数量：10,000，施用TPO(PEG-rHuMGDF)，5μg/头部/周

VI：移植数量：1,000，施用TPO(PEG-rHuMGDF)，5μg/头部/周

在移植前一天以及移植后2、4和6周，以下列方法分析外周血。

<外周血分析方法>

使用毛细管从小鼠眼眶静脉中采集外周血(约70μl)。

使用KX-21自动化血细胞分析仪(Sysmex)测定血细胞计数。

为了测定人血小板和白细胞的嵌合率，用以下A和B中所示的抗体组合染色细胞，然后通过FACS Calibur进行分析。

A(用于血小板分析)：PE-标记的-抗-人CD41抗体(R7058，Dako)加FITC-标记的-抗-小鼠CD41抗体(#553848，BD Pharmingen)；和

B(用于白细胞分析)：APC-标记的-抗-人CD45抗体(IM2473，Beckman Coulter，Inc.)加FITC-标记的-抗-小鼠CD45抗体(#553080，BD Pharmingen)。在分析时，添加用于定量的荧光珠(Flow-Count珠)来分析给定量的血液。

通过下列公式计算血小板或白细胞的嵌合率：人细胞计数/(人细胞计数+小鼠细胞计数)×100(％)。外周血中总血小板计数乘以嵌合率给出了人血小板计数。

在第6周处死小鼠，从股骨中移除骨髓细胞。对骨髓细胞进行集落培养以测定人血巨核细胞(MK)、红细胞(E)或粒细胞/巨噬细胞(GM)的祖细胞的数量。通过在培养物中添加TPO(50ng/ml)和SCF(100ng/ml)进行用于检测巨核细胞祖细胞(CFU-Mk)的集落培养。在5％CO₂存在下于37℃培养12天。用和实施例6中一样的方法使用抗-人CD41抗体检测菌落。使用Methocult系统(Stem Cell Technologies)并在培养物中添加EPO(4IU/ml)，、SCF(100ng/ml)、IL-3(20ng/ml)和GM-CSF(10ng/ml)进行用于检测红细胞或粒细胞/巨噬细胞的祖细胞的集落培养。在5％CO₂和5％O₂存在下于37℃培养14天。培养后，在显微镜下测定菌落计数。

图9A、9B和9C显示了上述试验的结果。

在移植后6周，已施用抗体的组较其他组显示明显更高的外周血人血小板计数(图9A)。这暗示在脐带血移植时激动剂抗体7-10G4344uhm促进血小板恢复。此外，已施用抗体的组显示在骨髓中明显更高的人红细胞和粒细胞/巨噬细胞祖细胞(图9B)。同样地，指示人白细胞/小鼠白细胞比率的CD45嵌合率相当高，清楚表明在已施用抗体的组中人白细胞增加(图9C)。这暗示抗体7-10G4344uhm可促进其他谱系细胞以及巨核细胞的生存。

这些发现暗示激动剂抗体作用于存在于血细胞分枝为巨核细胞、红细胞和粒细胞/巨噬细胞中每一个谱系时间点上游的细胞。考虑到Mpl在造血干细胞中表达的发现，激动剂抗体非常有可能促进造血干细胞增殖。

然而，在该试验中，已施用TPO的组并不显示类似的作用。这可能是因为TPO还作用于小鼠造血细胞，因此已施用TPO的组可经历骨髓中人细胞和小鼠细胞之间的竞争，结果，可能并不仅仅观察到对人细胞的作用。目的激动剂抗体具有选择性作用人Mpl的特性。因此，在体内首次证实了Mpl-介导的信号对人脐带血造血干细胞扩增的作用。

实施例15

分析铰链区修饰抗体的抗原性

本发明的激动剂抗体具有通过修饰铰链部分增加活性的特性；尽管由该修饰所引起的增加的抗原性是关注的问题。基于铰链修饰的7-10G4344uhm的氨基酸序列，通过计算机模拟预测抗原性。

已体内施用的异种蛋白掺入抗原呈递细胞(APCs)例如树突细胞或巨噬细胞，然后被降解。此后，通过主要组织相容性复合物(MHC)II类分子(就人而言，HLA II类、HLA-DR、DQ和DP)呈递肽。为APCs所呈递的肽被T细胞受体(TCR)所识别，并激活T细胞。激活的T细胞(辅助T细胞)活化了表达识别上述抗原的抗体的B细胞，产生了与异种蛋白起反应的抗体。在这样的机制中，肽和MHC II类分子之间的亲和力是决定抗原性的主要因素。已知由于人MHC II类分子具有许多类型(或多态性)，因此相同的肽显示了取决于II类分子类型的截然不同的亲和力。

分析具有7-10G4344uhm和IgG4PE恒定区的不同人抗体氨基酸序列对各种类型的人HLA-DR、DQ或DP分子的亲和力(使用AlgoNomics提供的HLA分子数据库和解析算法)。

结果，没有新表位出现在铰链修饰中。这暗示本发明的修饰抗体当它们用作药物时不会产生抗原性问题。

实施例16

施用抗体于人Mpl转基因小鼠

本发明的抗体不与小鼠Mpl交叉反应。因此，为了测定功效，制备其中业已导入了作为异源基因的人Mpl转基因(Tg)小鼠，并施用抗体于该Tg小鼠。起先，通过PCR扩增小鼠Mpl的5.5-kb启动子区，接着克隆入pBluescript质粒载体。随后，通过PCR扩增人Mpl的翻译区和3’-非翻译区，并接着连接到小鼠Mpl启动子下游位点上。将所得到的构建体注射入C57BL/6小鼠受精卵中，将所得到的受精卵移植入代孕母鼠中，分娩后代。分娩后3周从尾部提取基因组DNA，并通过PCR选择Tg小鼠。为了建立目的小鼠谱系，将所获得的Tg小鼠与C57BL/6小鼠杂交。分析骨髓中人Mpl的表达。

结果，获得了具有多种人Mpl抗体的Tg小鼠谱系。在来自谱系39L的骨髓中，经RT-PCR观察到人Mpl的表达。使用谱系39L小鼠证实抗体功效。

以单次剂量(3或10μg/ml)施用激动剂抗体7-10G4344uhm于小鼠，并使用KX-21自动化血细胞分析仪分析外周血中血小板计数改变。每周一次从眼眶静脉中采集外周血并进行分析。TPO(PEG-rHuMGDF)用作阳性对照。分组显示如下(6只小鼠/组)。

组I：施用10μg7-10G4344uhm

组II：施用3μg7-10G4344uhm

组III：施用3μg TPO

组IV：施用PBS

组VI：施用10μg野生型7-10G4344uhm

结果示于图10。在已施用抗体的组和已施用TPO的组中血小板计数增加。在施用后2周已施用TPO的组中的血小板计数基本上回到基线。与此相反，在已施用抗体的组中血小板计数仍保持增加，甚至在施用后一个月亦是如此。这暗示激动剂抗体在血液中非常稳定并能以单次剂量在较长一段时间内促进血小板生成。因此，该激动剂抗体特别适合于治疗慢性血小板减少症。

实施例17

评价7-10G4344uhm轻链突变体活性

将突变导入激动剂抗体7-10轻链可变区(7-10VL)的构架区中，并研究对结合活性及激动活性的影响。突变轻链为：激动剂抗体4-49(V104L)的轻链；以及各自包含单个氨基酸取代(即A43V和G100Q)的激动剂抗体6-4-50的突变轻链。将这些突变轻链与7-10G4344uhm的重链相结合来制备抗体。结果，发现它们的结合活性和激动活性与最初的7-10G4344uhm相当。然而，当突变(Y94F)被导入激动剂抗体7-10轻链可变区互补决定区(CDR)中时，结合活性和激动活性减少到最初水平的约1/10。这表明轻链氨基酸序列具有一定的自由度。

各种突变体以及7-10VL的轻链氨基酸序列示于如下。突变位点以粗体和下划线形式指示。

7-10VL(SEQ ID NO：3)：

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK7-10VL_V104L(4-49VL；SEQ ID NO：85)：

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKLEIK7-10VL_G100Q(6-4-50VL取代产物1；SEQ ID NO：86)：

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGQGTKVEIK7-10VL_A43V(6-4-50VL取代产物2；SEQ ID NO：87)：

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKVPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK

7-10VL_Y94F(CDR取代产物；SEQ ID NO：88)：AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSFPLTFGGGTKVEIK

结合活性分析：

制备1、0.1和0.01μg/ml抗体浓度，并使用FM3A-hMpl细胞进行流式细胞术。根据实施例4中所描述的方法进行该试验。抗-DNP(二硝基苯酚)抗体(亚类IgG4；人抗体)用作对照。轻链突变抗体显示相当于7-10G4344uhm抗体的结合活性(图11)。

激动活性分析：

根据实施例5中所描述的方法进行使用UT-7/TPO细胞的细胞增殖试验。轻链突变体抗体显示相当于抗体7-10G4344uhm的激动活性(图12)。

工业实用性

本发明提供了能用作血小板减少症的各种治疗剂的抗-人cMpl激动剂人抗体。本发明还提供了能用于其他激动剂抗体并能提供满意的安全性和药理学效应的抗体恒定区。

本发明提供了以完整抗体形式存在的能激活人血小板生成素受体(c-Mpl)的抗人c-Mpl激动剂抗体。这样的激动剂抗体可用作血小板减少症的各种治疗剂，并且预计其可对医药工业具有显著贡献。

所有在本文中引用的出版物、专利和专利申请皆以其全文在此引入作为参考。

序列表文本

SEQ ID NO：11：铰链区突变体，UH2G3uhm

SEQ ID NOs：12-16：引物

SEQ ID NOs：18-22：引物

SEQ ID NOs：39-54：引物

SEQ ID NOs：57-73：引物

SEQ ID NO：74：G3344h1

SEQ ID NO：75：G3344

SEQ ID NO：76：G4344

SEQ ID NO：77：G4344h1

SEQ ID NO：78：G4344uh

SEQ ID NO：79：G4344uhm

SEQ ID NO：80：G4PE

SEQ ID NO：81：7-10G4344uhm H链

SEQ ID NO：82：7-10G4344uhm H链

SEQ ID NO：83：7-10G4344uhm L链

SEQ ID NO：84：7-10G4344uhm L链

SEQ ID NO：85：7-10VL_V104L(突变体)

SEQ ID NO：86：7-10VL_G100Q(突变体)

SEQ ID NO：87：7-10VL_A43V(突变体)

序列表

<110>Kirin Beer Kabushiki Kaisha

<120>抗人血小板生成素受体的激动型抗体

<130>PH-3098-PCT

<150>JP 2006-81322

<151>2006-03-23

<150>JP 2006-299554

<151>2006-11-02

<160>94

<170>PatentIn 2.1版

<210>1

<211>163

<212>PRT

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<213>智人

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：7-10G4344uhm L链

<400>84

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<400>87

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：7-10VL_Y94F(突变体)

<400>88

<210>89

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<220>

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<223>Xaa为Ala或Thr

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<212>PRT

<213>智人

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<211>9

<212>PRT

<213>智人

<220>

<222>8..8

<223>Xaa为Leu、Tyr或Trp

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<211>12

<212>PRT

<213>智人

<400>92

<210>93

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>93

<210>94

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>94

Claims (20)

1.一种抗人血小板生成素受体(c-Mpl)的激动剂抗体，其中激动剂抗体包含：

包含下列(1)、(2)或(3)的氨基酸序列的抗体恒定区：

(1)人抗体重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列，

(2)具有在人抗体亚类之间的域取代的重链恒定区的氨基酸序列和人抗体轻链恒定区的氨基酸序列，或

(3)在上述氨基酸序列(1)或(2)中具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；和

能结合并激活人血小板生成素受体的抗体可变区；以及

其中激动剂抗体具有特性(a)和(b)：

(a)如通过使用人脐带血衍生的CD34+细胞的CFU-MK集落形成试验所测定的，该抗体在10,000ng/ml或更低的浓度下诱导集落形成；和

(b)在使用UT7/TPO细胞的细胞增殖试验中，该抗体的最大活性为PEG-rHuMGDF的50％或以上，50％有效浓度(EC50)为100nM或以下，所述PEG-rHuMGDF包含如SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列、具有下列结构并在N末端聚乙二醇化：

PEG-NH-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDFSLGE

WKTQMEETKAQDILGAVTLLLEGVMAARGQLGPTCLSSLLGQLSGQVRLLLGAL

QSLLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIFLSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVRRAPPTTA

VPS-COOH。

2.根据权利要求1的抗体，具有特性(a)和(b)：

(a)如通过使用人脐带血衍生的CD34+细胞的CFU-MK集落形成试验所测定的，该抗体在1,000ng/ml或更低的浓度下诱导集落形成；和

(b)在使用UT7/TPO细胞的细胞增殖试验中，该抗体的最大活性为PEG-rHuMGDF的70％或以上，EC50为10nM或以下。

3.根据权利要求1的抗体，具有特性(a)和(b)：

(a)如通过使用人脐带血衍生的CD34+细胞的CFU-MK集落形成试验所测定的，该抗体在100ng/ml或更低的浓度下诱导集落形成；和

(b)在使用UT7/TPO细胞的细胞增殖试验中，该抗体的最大活性为PEG-rHuMGDF的90％或以上，EC50为1nM或以下。

4.根据权利要求1的抗体，其中重链和轻链可变区选自下列(1)-(8)：

(1)包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的轻链可变区；

(2)包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的轻链可变区；

(3)包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的轻链可变区；

(4)包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的轻链可变区；

(5)包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含在如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的轻链可变区；

(6)包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含在如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的轻链可变区；

(7)包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含在如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的轻链可变区；和

(8)包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含在如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的轻链可变区。

5.根据权利要求1-4任一项的抗体，其中抗人c-Mpl激动剂抗体为人抗体。

6.根据权利要求4的抗体，其中重链恒定区包括含有下列氨基酸序列(1)和(2)中任一项的上铰链区：

(1)如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；或

(2)如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，和

其中从重链恒定区的中间铰链部位至C末端的区包含人免疫球蛋白G4氨基酸序列，或在人免疫球蛋白G4氨基酸序列中第228位用脯氨酸取代丝氨酸，第235位用谷氨酸取代亮氨酸的氨基酸序列，其中氨基酸位置基于Kabat EU编号系统。

7.根据权利要求6的抗体，其中抗体选自下列(1)-(8)：

(1)含有包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的轻链的抗体；

(2)含有包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的轻链的抗体；

(3)含有包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的轻链的抗体；

(4)含有包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的轻链的抗体；

(5)含有包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的重链，和包含在如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的轻链的抗体；

(6)含有包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的重链，和包含在如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的轻链的抗体；

(7)含有包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的重链，和包含在如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的轻链的抗体；和

(8)含有包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的重链，和包含在如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的轻链的抗体；

8.一种药物组合物，其包含作为活性成分的、权利要求1-7任一项的抗体。

9.一种用于增加血小板的试剂，其包含作为活性成分的、权利要求1-7任一项的抗体。

10.根据权利要求9的用于增加血小板的试剂，其用于当进行骨髓移植或脐带血移植时促进血小板血小板恢复。

11.一种血小板减少症治疗剂，包含作为活性成分的、权利要求1-7任一项的抗体。

12.根据权利要求11的血小板减少症治疗剂，其中血小板减少症是一种选自下列疾病(1)-(6)的疾病：

(1)特发性血小板减少性紫癜(ITP)；

(2)癌症化疗后引起的血小板减少症；

(3)再生障碍性贫血；

(4)骨髓增生异常综合征(MDS)；

(5)可归因于肝病的血小板减少症；和

(6)骨髓移植或脐带血移植后引起的血小板减少症。

13.一种产生抗人c-Mpl激动剂抗体的方法，包括制备携带有包含编码重链核苷酸序列的DNA，包含编码轻链核苷酸序列的DNA，以及包含一种或多种控制所述DNA表达的核苷酸序列的DNA的哺乳动物细胞，培养哺乳动物细胞，以及从培养所述细胞的培养基中分离和纯化编码包含所述重链和轻链的抗体的DNA的表达产物，其中核苷酸序列选自以下(1)-(8)，：

(1)编码包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的重链的核苷酸序列，和编码包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的轻链的核苷酸序列；

(2)编码包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的重链的核苷酸序列，和编码包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的轻链的核苷酸序列；

(3)编码包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的重链的核苷酸序列，和编码包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的轻链的核苷酸序列；

(4)编码包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的重链的核苷酸序列，和编码包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的轻链的核苷酸序列；

(5)编码包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的重链的核苷酸序列，和编码包含在如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的轻链的核苷酸序列；

(6)编码包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的重链的核苷酸序列，和编码包含在如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的轻链的核苷酸序列；

(7)编码包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的重链的核苷酸序列，和编码包含在如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的轻链的核苷酸序列；和

(8)编码包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的重链的核苷酸序列，和编码包含在如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的轻链的核苷酸序列。

14.包含编码下述氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，所述氨基酸序列选自下列(1)-(4)的氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；

(3)如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；和

(4)如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

15.编码抗体重链的DNA，所述的抗体重链包含选自下列(1)-(4)的氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；

(3)如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；和

(4)如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

16.根据权利要求15的DNA，其中抗体重链含有上铰链区，所述的上铰链区包含下列(1)和(2)任一项的氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；和

(2)如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，以及

其中从抗体重链的中间铰链区至C末端的区包含人免疫球蛋白G4氨基酸序列，或人免疫球蛋白G4氨基酸序列中第228位用脯氨酸取代丝氨酸、第235位用谷氨酸取代亮氨酸的氨基酸序列，其中氨基酸位置基于Kabat EU编号系统。

17.包含编码下述氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，所述的氨基酸序列选自下列(1)-(8)的氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；

(3)如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；

(4)如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；

(5)在如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；

(6)在如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；

(7)在如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；和

(8)在如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列。

18.编码抗体轻链的DNA，所述的抗体轻链包含选自下列(1)-(8)的氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；

(3)如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；

(4)如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；

(5)在如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；

(6)在如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；

(7)在如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列；和

(8)在如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列中的构架区具有一个或几个氨基酸残基缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列。

19.一种用于增加血细胞的试剂，其包含作为活性成分的、用于在造血干细胞移植后促进血细胞恢复的人c-Mpl激动剂抗体。

20.根据权利要求19的用于增加血细胞的试剂，其包含作为活性成分的、权利要求1-7任一项的抗体。

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