JP2015535005A - 抗シュードモナス属(Pseudomonas)PslおよびPcrV結合分子を用いた併用治療 - Google Patents
抗シュードモナス属(Pseudomonas)PslおよびPcrV結合分子を用いた併用治療 Download PDFInfo
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Abstract
本開示は、抗シュードモナス属(Pseudomonas)PslおよびPcrV結合分子を含む併用療法、ならびにシュードモナス属(Pseudomonas)感染の予防および治療に用いるための関連組成物に関する。【選択図】図1−1
Description
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本出願と一緒に、2013年11月5日作成、サイズ382キロバイトの「PSEUD−101WO1.txt」という名称のASCIIテキストファイルにて電子書式で提出された配列表の内容は、参照により全体として本明細書に組み込むものとする。
本出願と一緒に、2013年11月5日作成、サイズ382キロバイトの「PSEUD−101WO1.txt」という名称のASCIIテキストファイルにて電子書式で提出された配列表の内容は、参照により全体として本明細書に組み込むものとする。
本開示は、シュードモナス属(Pseudomonas)感染の予防および治療に使用するための、抗シュードモナス属(Pseudomonas)PslおよびPcrV結合ドメインを用いて併用療法に関する。さらに、本開示は、このような療法に有用な組成物を提供する。
緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)(P.aeruginosa)は、易感染性個体内で急性および慢性感染の両方を引き起こすグラム陰性日和見病原体である(Ma et al.,Journal of Bacteriology 189(22):8353−8356(2007))。このことは、部分的には、臨床使用される抗生物質に対する細菌の高い自然耐性に起因し、部分的には、高度に抗生物質耐性のバイオフィルムの形成に起因する(Drenkard E.,Microbes Infect 5:1213−1219(2003);Hancokc & Speert,Drug Resist Update 3:247−255(2000))。
緑膿菌(P.aeruginosa)は、西洋諸国における院内感染の一般的原因である。これは、熱傷患者および免疫不全個体において菌血症の原因となる作用物質であることが多い。(Lyczak et al.,Microbes Infect 2:1051−1060(2000))。これは、特に、人工呼吸器装着患者において院内感染グラム陰性肺炎の最も一般的な原因でもあり(Craven et al.,Semin Respir Infect 11:32−53(1996))、嚢胞性線維症の個体の肺中で最も高頻度に見られる病原体である。(Pier et al.,ASM News 6:339−347(1998))。
シュードモナス属(Pseudomonas)Pslエキソ多糖は、緑膿菌(P.aeruginosa)の表面に固定されることが報告されており、宿主組織のコロニー化の易化およびバイオフィルム形成の樹立/維持に重要であると考えられている(Jackson,K.D.,et al.,J Bacteriol 186,4466−4475(2004))。この構造は、マンノースリッチ繰り返し五糖を含む(Byrd,M.S.,et al.,Mol Microbiol 73,622−638(2009))。
PcrVは、III型分泌系の比較的保存された成分である。PcrVは、III型分泌性毒素の標的真核細胞への送達を媒介するIII型分泌装置の輸送装置の不可欠な成分であると考えられる(Sawa T,et al.,Nat.Med.5,392−398(1999))。PcrVに対する能動および受動免疫は、細胞傷害性緑膿菌(P.aeruginosa)に感染したマウスの急性肺傷害および死亡率を改善した(Sawa et al.2009)。PcrVに対する免疫の主要な作用は、III型分泌性毒素の標的真核細胞への輸送の遮断によるものである。
多剤耐性の増加に起因して、新たなシュードモナス属(Pseudomonas)特異的防止および治療剤の同定のための新規方針の開発が当分野において依然として必要とされている。
本開示は、シュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する単離結合分子を提供し、ここで、前記結合分子は、免疫グロブリンVHおよび免疫グロブリンVLを含み、前記VHは、配列番号255または配列番号257のアミノ酸配列を有し、前記VLは、配列番号256のアミノ酸配列を有する。
関連する実施形態において、本開示は、シュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する単離結合分子を提供し、ここで、前記結合分子は、免疫グロブリンVHおよび免疫グロブリンVLを含み、その各々が、3つの相補性決定領域:CDR1、CDR2、およびCDR3を含む。VH CDR1は、配列番号311であるか、または1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントであってもよく、VH CDR2は、配列番号312であるか、または1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントであってもよく、また、VH CDR3は、配列番号313であるか、または1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントであってもよい。これに加え、またはこれに代わり、VL CDR1は、配列番号314であるか、または1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントであってもよく、VL CDR2は、配列番号315であるか、または1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントであってもよく、また、VL CDR3は、配列番号316であるか、または1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントであってもよい。これらの実施形態によれば、VHおよびVL CDRは、Kabat番号付与系に従う。
別の実施形態において、本開示は、シュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する単離結合分子を提供し、ここで、前記結合分子は、免疫グロブリンVHおよび免疫グロブリンVLを含み、前記VHは、配列番号317と少なくとも90%同一であるか、または完全に同一であるアミノ酸配列を有し、これに加え、またはこれに代わり、前記VLは、配列番号318と少なくとも90%同一であるか、または完全に同一であるアミノ酸配列を有する。
これらの実施形態のいずれかにおいて、結合分子は、抗PcrV抗体またはその抗原結合断片であってよい。例えば、結合分子は、VHが、1つまたは複数の重鎖定常領域を有し得る抗体重鎖の一部であり、VLが、1つの軽鎖定常領域を有し得る抗体軽鎖の一部である抗体またはその抗原結合断片であってもよい。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、同一であってよい2つの抗体重鎖と、同一であってよい2つの抗体軽鎖とを有する。
特定の実施形態において、抗体またはその断片は、二重特異性抗体である。例えば、シュードモナス属(Pseudomonas)PcrVおよびシュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する二重特異性抗体。特定の態様では、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する二重特異性抗体の結合ドメインは、抗Psl ScFv分子であってよい。特定の実施形態では、抗Psl ScFv分子は、配列番号240〜配列番号254のアミノ酸配列、または配列番号240〜配列番号254の2つ以上のアミノ酸配列の任意の組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、抗Psl ScFv分子を、前述のような抗PcrV抗体またはその抗原結合断片の各重鎖のヒンジ領域に挿入する。
本明細書に開示する特定の二重特異性抗体において、各抗体重鎖は、式:VH−CH1−H1−L1−S−L2−H2−CH2−CH3を含み、ここで、CH1は、重鎖定常領域ドメイン−1であり、H1は、第1重鎖ヒンジ領域断片であり、L1は、第1リンカーであり、Sは、抗PcrV ScFv分子であり、L2は、第2リンカーであり、H2は、第2重鎖ヒンジ領域断片であり、CH2は、重鎖定常領域ドメイン−2であり、CH3は、重鎖定常領域ドメイン−3である。例えば、結合分子は、配列番号255、配列番号257、または配列番号317のVHアミノ酸配列を含んでよく、CH1は、配列番号319を含んでよい。特定の態様において、L1およびL2は、同じでも、異なっていてもよく、各々が、アミノ酸配列(a)[GGGGS]n(nは、0、1、2、3、4、もしくは5である)、(b)[GGGG]n(nは、0、1、2、3、4、もしくは5である)、またはアミノ酸配列(a)および(b)の組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、H1は、EPKSC(配列番号320)であってよく、H2は、DKTHTCPPCP(配列番号321)であってよい。特定の実施形態では、Sは、配列番号240〜配列番号254の1つまたは複数を含み得る。別の態様としては、CH2−CH3は、
(X1は、MまたはYであり、X2は、SまたはTであり、X3は、TまたはEである)であってよい。本明細書に開示する特定の二重特異性抗体において、各抗体軽鎖は、式VL−CLを含んでよく、CLは、抗体軽鎖κ定常領域または抗体軽鎖λ定常領域であってよく、VLは、配列番号256または配列番号318のアミノ酸配列であってよい。
本明細書に記載する特定の二重特異性抗体は、2つの同一重鎖および2つの同一軽鎖を含み、各抗体重鎖は、配列番号264を含み、各抗体軽鎖は、配列番号263を含む。具体的には、本開示は、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよびシュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する二重特異性抗体を提供し、ここで、前記抗体は、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含み、前記重鎖は、配列番号264のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号263のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、本開示は、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子を提供し、ここで、前記結合分子は、免疫グロブリンVHおよび免疫グロブリンVLを有してよく、これらは各々、3つの相補性決定領域:CDR1、CDR2、およびCDR3を含む。これらの実施形態によれば、VH CDR1は、配列番号47であってよく、VH CDR2は、配列番号48であってよく、VH CDR3は、配列番号258、配列番号267、配列番号268、配列番号269、配列番号270、配列番号271、配列番号272、配列番号273、配列番号274、配列番号275、配列番号276、配列番号277、配列番号278、もしくは配列番号279であってよく、また、VL CDR1は、配列番号50であってよく、VL CDR2は、配列番号51であってよく、VL CDR3は、配列番号280、配列番号281、配列番号282、配列番号52、配列番号283、配列番号284、配列番号285、配列番号286、もしくは配列番号287であってよい。VHおよびVL CDRは、Kabat番号付与系に従う。
これら抗Psl結合分子のいくつかにおいて、VH CDR3は、配列番号258であり、VL CDR3は、配列番号280である。より具体的には、VHは、配列番号288を含み、VLは、配列番号289を含む。
これら抗Psl結合分子のいくつかにおいて、VH CDR3は、配列番号267であり、VL CDR3は、配列番号281である。より具体的には、VHは、配列番号290を含み、VLは、配列番号291を含む。
これら抗Psl結合分子のいくつかにおいて、VH CDR3は、配列番号268であり、VL CDR3は、配列番号282である。より具体的には、VHは、配列番号292を含み、VLは、配列番号293を含む。
これら抗Psl結合分子のいくつかにおいて、VH CDR3は、配列番号269であり、VL CDR3は、配列番号52である。より具体的には、VHは、配列番号294を含み、VLは、配列番号11を含む。
これら抗Psl結合分子のいくつかにおいて、VH CDR3は、配列番号270であり、VL CDR3は、配列番号283である。より具体的には、VHは、配列番号295を含み、VLは、配列番号296を含む。
これら抗Psl結合分子のいくつかにおいて、VH CDR3は、配列番号271であり、VL CDR3は、配列番号284である。より具体的には、VHは、配列番号297を含み、VLは、配列番号298を含む。
これら抗Psl結合分子のいくつかにおいて、VH CDR3は、配列番号272であり、VL CDR3は、配列番号285である。より具体的には、VHは、配列番号299を含み、VLは、配列番号300を含む。
これら抗Psl結合分子のいくつかにおいて、VH CDR3は、配列番号273であり、VL CDR3は、配列番号286である。より具体的には、VHは、配列番号301を含み、VLは、配列番号302を含む。
これら抗Psl結合分子のいくつかにおいて、VH CDR3は、配列番号274であり、VL CDR3は、配列番号52である。より具体的には、VHは、配列番号303を含み、VLは、配列番号11を含む。
これら抗Psl結合分子のいくつかにおいて、VH CDR3は、配列番号275であり、VL CDR3は、配列番号52である。より具体的には、VHは、配列番号304を含み、VLは、配列番号11を含む。
これら抗Psl結合分子のいくつかにおいて、VH CDR3は、配列番号276であり、VL CDR3は、配列番号52である。より具体的には、VHは、配列番号305を含み、VLは、配列番号11を含む。
これら抗Psl結合分子のいくつかにおいて、VH CDR3は、配列番号277であり、VL CDR3は、配列番号52である。より具体的には、VHは、配列番号306を含み、VLは、配列番号11を含む。
これら抗Psl結合分子のいくつかにおいて、VH CDR3は、配列番号278であり、VL CDR3は、配列番号52である。より具体的には、VHは、配列番号307を含み、VLは、配列番号11を含む。
これら抗Psl結合分子のいくつかにおいて、VH CDR3は、配列番号279であり、VL CDR3は、配列番号287である。より具体的には、VHは、配列番号308を含み、VLは、配列番号325を含む。
これら抗Psl結合分子のいくつかにおいて、VHは、配列番号309のアミノ酸配列を含み、VLは、配列番号310のアミノ酸配列を含む。
前述した抗Psl結合分子の各々は、抗体またはその抗原結合断片、例えば、一本鎖Fv(ScFv)抗体分子であってよい。ある態様では、ScFvは、式:VH−L−VL(Lは、リンカーである)を含み、他の態様では、ScFvは、式:VL−L−VH(Lは、リンカーである)を含む。これらの態様の各々において、Lは、アミノ酸配列(a)[GGGGS]n(nは、0、1、2、3、4、もしくは5である)、(b)[GGGG]n(nは、0、1、2、3、4、もしくは5である)であるか、またはLは、(a)および(b)の組み合わせであってもよい。別の態様では、Lは、リンカーのC末端にアミノ酸ala−leuをさらに含み得る。
特定の抗Psl ScFvは、アミノ酸配列:配列番号240を含む。特定の抗Psl ScFvは、アミノ酸配列番号262を含む。本開示に提供する他の抗Psl ScFvは、アミノ酸配列:配列番号241、配列番号242、配列番号243、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252、配列番号253、もしくは配列番号254の1つまたは複数を含む。
本開示では、前述したアミノ酸配列、例えば、配列番号240、配列番号241、配列番号242、配列番号243、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252、配列番号253、配列番号254、配列番号262、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号263、配列番号264、配列番号258、配列番号263、配列番号264、配列番号267、配列番号268、配列番号269、配列番号270、配列番号271、配列番号272、配列番号273、配列番号274、配列番号275、配列番号276、配列番号277、配列番号278、配列番号279、配列番号280、配列番号281、配列番号282、配列番号283、配列番号284、配列番号285、配列番号286、配列番号287、配列番号288、配列番号289、配列番号290、配列番号291、配列番号292、配列番号293、配列番号294、配列番号295、配列番号296、配列番号298、配列番号299、300、配列番号301、配列番号302、配列番号303、配列番号304、配列番号305、配列番号306、配列番号307、配列番号308、配列番号309、配列番号310、配列番号311、配列番号312、配列番号313、配列番号315、配列番号316、配列番号317、配列番号318、もしくは配列番号325のいずれか1つまたは複数を含む単離ポリペプチドもさらに提供される。
さらに、前述したいずれかの結合分子、もしくはそのサブユニット、前述したいずれかの二重特異性抗体、もしくはそのサブユニット、または前述したいずれかのポリペプチドの1つまたは複数を含むか、または産生することができる細胞も提供される。
本開示はまた、前述したいずれかの結合分子、もしくはそのサブユニット、前述したいずれかの二重特異性抗体、もしくはそのサブユニット、または前述したいずれかのポリペプチドの1つまたは複数をコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドも提供する。さらに、こうしたポリヌクレオチドを含むベクター、およびこうしたポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞も提供される。
また、前述したいずれかの結合分子、もしくはそのサブユニット、前述したいずれかの二重特異性抗体、もしくはそのサブユニット、または前述したいずれかのポリペプチドの1つまたは複数と、薬学的に許容可能な担体とを含む組成物も提供される。特定の態様では、こうした組成物の1成分が、感染患者から単離された緑膿菌(P.aeruginosa)株の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、もしくは少なくとも95%と結合し、ここで、緑膿菌(P.aeruginosa)株は、肺、唾液、眼、膿汁、糞便、尿、洞、創傷、皮膚、血液、骨、もしくは膝液の1つまたは複数から単離することができる。前述した特定の組成物において、結合分子もしくはそのサブユニット、または二重特異性抗体もしくはそのサブユニットは、抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物学的応答改質剤、医薬剤、リンホカイン、異種抗体もしくはその断片、検出可能な標識、またはポリエチレングリコール(PEG)などの1つまたは複数の薬剤にコンジュゲートすることができる。検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、または放射性標識の1つまたは複数であってよい。本明細書に記載するいずれかの組成物は、限定するものではないが、シプロフロキサシン(Ciprofloxacin)またはメロペネム(Meropenem)などの1種または複数の抗生物質をさらに含んでもよい。
本開示はさらに、シュードモナス属(Pseudomonas)感染の予防または治療が必要とされる対象においてシュードモナス属(Pseudomonas)感染を予防または治療する方法も提供し、この本方法は、対象に、有効量の本明細書に記載のいずれかの組成物を投与することを含む。
さらに、シュードモナス属(Pseudomonas)感染の予防または治療が必要とされる対象においてシュードモナス属(Pseudomonas)感染を予防または治療する方法であって、対象に、有効量の本明細書に記載のいずれかの二重特異性抗体または二重特異性抗体を含む本明細書に記載のいずれかの組成物を投与することを含む方法も提供される。特定の実施形態において、こうした投与は、前記対象におけるシュードモナス属(Pseudomonas)感染の予防または治療に相乗的治療効果をもたらし、また、前記相乗効果は、二重特異性抗体と同じシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよびシュードモナス属(Pseudomonas)PcrV結合特異性を有する単一特異性結合分子の等モル量の投与の個々の効果を合わせたものより大きい。特定の態様では、相乗的治療効果によって、結合ドメインの一方だけを投与した対象の相加生存率より高い生存率がもたらされる。
また、シュードモナス属(Pseudomonas)感染の予防または治療が必要とされる対象においてシュードモナス属(Pseudomonas)感染を予防または治療する方法であって、対象に、有効量の本明細書に記載のいずれかの組成物を投与することを含み、前記組成物が、1抗生物質を含む方法も提供され、ここで、前記投与は、前記対象におけるシュードモナス属(Pseudomonas)感染の予防または治療に相乗的治療効果をもたらし、前記相乗効果は、(a)前記二重特異性抗体のみ、(b)前記二重特異性抗体と同じシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよびシュードモナス属(Pseudomonas)PcrV結合特異性を有する単一特異性結合分子、ならびに(c)前記抗生物質の1つまたは複数の等モル量の投与の個々の効果を合わせたものより大きい。
本明細書に記載する方法のいずれかによれば、組成物または二重特異性抗体を2つ以上の予防/治療サイクルにわたって投与し、シュードモナス属(Pseudomonas)感染は、緑膿菌(P.aeruginosa)感染であってよく、対象はヒトであってよい。特定の態様では、感染は、限定するものではないが、眼感染、肺感染、熱傷感染、創傷感染、皮膚感染、血液感染、もしくは骨感染の1つまたは複数である。特定の態様では、対象は、急性肺炎、熱傷、角膜感染、もしくは嚢胞性線維症の1つまたは複数に罹患している。
本開示はさらに、本明細書に記載する組成物のいずれかを含むキットを提供する。
I.定義
用語「a」または「an」で修飾された実体は、その実体の1つまたは複数を指し、例えば、「シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する結合分子」は、「シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する1つまたは複数の結合分子を表すと理解されることに留意すべきである。したがって、用語「a」(または「an」)、「1つまたは複数」および「少なくとも1つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。
用語「a」または「an」で修飾された実体は、その実体の1つまたは複数を指し、例えば、「シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する結合分子」は、「シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する1つまたは複数の結合分子を表すと理解されることに留意すべきである。したがって、用語「a」(または「an」)、「1つまたは複数」および「少なくとも1つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、単数形「ポリペプチド」および複数形「ポリペプチド」を包含するものとし、アミド結合(ペプチド結合としても公知)により直鎖状に結合しているモノマー(アミノ酸)から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、2つ以上のアミノ酸の任意の1つまたは複数の鎖を指し、規定の長さの生成物を指さない。したがって、2つ以上のアミノ酸の1つまたは複数の鎖を指すために使用されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、それらの用語のいずれにも代えて、またはそれらの用語と互換的に使用することができる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾、例として、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護/遮断基による誘導体化、タンパク質分解開裂、または非天然に生じたアミノ酸による修飾の生成物も指すものとする。ポリペプチドは、天然生物学的資源に由来し得、または組換え技術により産生することができるが、指定される核酸配列から必ずしも翻訳されない。これは、任意の様式、例として化学合成により生成することができる。
本明細書に開示のポリペプチドは、約3アミノ酸以上、5アミノ酸以上、10アミノ酸以上、20アミノ酸以上、25アミノ酸以上、50アミノ酸以上、75アミノ酸以上、100アミノ酸以上、200アミノ酸以上、500アミノ酸以上、1000アミノ酸以上、または2000アミノ酸以上のサイズであり得る。ポリペプチドは、定義された3次元構造を有し得るが、それらは、そのような構造を必ずしも有さない。定義された3次元構造を有するポリペプチドは、フォールドと称され、定義された3次元構造を有さないが、多数の異なる立体構造を採り得るポリペプチドは、アンフォールドと称される。本明細書において使用される糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基、例えば、セリン残基またはアスパラギン残基の酸素含有または窒素含有側鎖を介してタンパク質に付着している少なくとも1つの炭水化物部分に結合しているタンパク質を指す。
「単離」ポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、その天然環境中に存在しないポリペプチドを意図する。特定のレベルの精製は要求されない。例えば、単離ポリペプチドは、そのネイティブまたは天然環境から取り出すことができる。宿主細胞中で発現された組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書に開示の単離とみなされ、任意の好適な技術により分離、分別、または部分的もしくは実質的に精製されたネイティブまたは組換えポリペプチドと同様である。
本明細書に開示の他のポリペプチドは、上記ポリペプチドの断片、誘導体、アナログ、またはバリアント、およびそれらの任意の組み合わせである。用語「断片」、「バリアント」、「誘導体」および「アナログ」には、例えば、本明細書に開示のシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する結合分子、抗体を指す場合、対応するネイティブ抗体またはポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドが含まれる。ポリペプチドの断片には、本明細書の他箇所で考察される特異的抗体断片に加え、例えば、タンパク質分解断片、および欠失断片が含まれる。本明細書に開示のシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する結合分子、例えば抗体のバリアントには、上記の断片、およびアミノ酸置換、欠失、または挿入に起因して変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。バリアントは、天然に生じ得、または非天然に生じ得る。非天然に生じるバリアントは、当分野において公知の突然変異導入技術を使用して産生することができる。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。本明細書に開示のシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体の誘導体は、ネイティブポリペプチド上に見出されない追加の特徴を示すように変化させたポリペプチドである。例には、融合タンパク質が含まれる。バリアントポリペプチドは、本明細書において「ポリペプチドアナログ」と称することもできる。本明細書において使用される、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体の「誘導体」は、側鎖官能基の反応により化学的に誘導体化された1つまたは複数の残基を有する対象のポリペプチドを指す。「誘導体」として、20種の標準的なアミノ酸の1つまたは複数の天然に生じるアミノ酸誘導体を含有するペプチドも含まれる。例えば、4−ヒドロキシプロリンは、プロリンに代えて用いることができ;5−ヒドロキシリジンは、リジンに代えて用いることができ;3−メチルヒスチジンは、ヒスチジンに代えて用いることができ;ホモセリンは、セリンに代えて用いることができ;オルニチンは、リジンに代えて用いることができる。
用語「ポリヌクレオチド」は、単数形の核酸および複数形の核酸を包含するものとし、単離核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)またはプラスミドDNA(pDNA)を指す。ポリヌクレオチドは、慣用のホスホジエステル結合または非慣用結合(例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸(PNA)中に見出されるもの)を含み得る。用語「核酸」は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の1つまたは複数の核酸セグメント、例えば、DNAまたはRNA断片を指す。「単離」核酸またはポリヌクレオチドは、そのネイティブ環境から取り出された核酸分子、DNAまたはRNAを意図する。例えば、ベクター中に含有されるシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本明細書に開示の単離とみなされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の精製された(部分的または実質的に)ポリヌクレオチドが含まれる。単離RNA分子には、ポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロRNA転写物が含まれる。単離ポリヌクレオチドまたは核酸には、さらに合成により産生されたそのような分子が含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節エレメント、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターであり得、またはそれらを含み得る。
本明細書において使用される「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「終止コドン」(TAG、TGA、またはTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、それは、コード領域の一部とみなすことができるが、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはコード領域の一部でない。2つ以上のコード領域が、単一ポリヌクレオチド構築物中、例えば、単一ベクター上に、または別個のポリヌクレオチド構築物中、例えば別個の(異なる)ベクター上に存在し得る。さらに、任意のベクターは、単一コード領域を含有し得、または2つ以上のコード領域を含み得、例えば、単一ベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別個にコードし得る。さらに、ベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体をコードする核酸に融合されておりまたは融合されていない異種コード領域をコードし得る。異種コード領域には、限定されるものではないが、特殊化エレメントまたはモチーフ、例えば分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインが含まれる。
ある実施形態において、ポリヌクレオチドまたは核酸はDNAである。DNAの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、1つまたは複数のコード領域と作動可能に会合しているプロモーターおよび/または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含み得る。作動可能な会合は、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドについてのコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響または制御下に配置するように1つまたは複数の調節配列と会合している場合である。2つのDNA断片(例えば、ポリペプチドコード領域およびそれと会合しているプロモーター)は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合および2つのDNA断片間の結合の性質が遺伝子産物の発現を指向する発現調節配列の能力もDNAテンプレートの転写される能力も妨害しない場合、「作動可能に会合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらし得る場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合している。プロモーターは、所定の細胞中でのみDNAの実質的な転写を指向する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーターに加え、他の転写制御エレメントは、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルが細胞特異的転写を指向するためにポリヌクレオチドと作動可能に会合していてよい。好適なプロモーターおよび他の転写制御領域は、本明細書に開示される。
種々の転写制御領域は、当業者に公知である。これらには、限定されるものではないが、脊椎動物において機能する転写制御領域、例えば、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス(イントロンAと連携する前初期プロモーター)、シミアンウイルス40(初期プロモーター)、およびレトロウイルス(例えば、ラウス肉腫ウイルス)からのプロモーターおよびエンハンサーセグメントが含まれる。他の転写制御領域には、脊椎動物遺伝子に由来するもの、例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ−グロビンならびに真核細胞中で遺伝子発現を制御し得る他の配列が含まれる。追加の好適な転写制御領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびにリンホカイン誘導プロモーター(例えば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘導可能なプロモーター)が含まれる。
同様に、種々の翻訳制御エレメントは、当業者に公知である。これらには、限定されるものではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント(特に、内部リボソーム進入部位、またはIRES、CITE配列とも称される)が含まれる。
他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、RNA、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)の形態であり得る。
ポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本明細書に開示のポリヌクレオチド、例えば、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を指向する分泌またはシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と会合していてよい。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を越える成長タンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から開裂されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞により分泌されるポリペプチドが一般に、ポリペプチドの分泌または「成熟」形態を産生するために完全または「全長」ポリペプチドから開裂されるポリペプチドのN末端に融合しているシグナルペプチドを有することに精通している。ある実施形態において、ネイティブシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド、または作動可能に会合しているポリペプチドの分泌を指向する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、またはその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列により置換することができる。
ある結合分子、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体が本明細書に開示される。特に全長サイズ抗体、例えば天然に生じる抗体を指さない場合、用語「結合分子」は、全長サイズ抗体およびそのような抗体の抗原結合断片、バリアント、アナログ、または誘導体、例えば、天然に生じる抗体または免疫グロブリン分子またはエンジニアリングされた抗体分子または抗体分子と同様の様式で抗原に結合する断片を包含する。
本明細書において使用される用語「結合分子」は、最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。本明細書にさらに記載するように、結合分子は、本明細書に記載の結合ドメインの1つまたは複数を含み得る。本明細書において使用される「結合ドメイン」には、抗原決定基に特異的に結合する部位が含まれる。抗原結合分子の非限定的な例は、抗体または抗原特異的結合を保持するその断片である。
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書において互換的に使用することができる。抗体(または本明細書に開示のその断片、バリアント、もしくは誘導体は、少なくとも重鎖の可変ドメインならびに少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的十分に理解されている。例えば、Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)参照。
以下により詳細に考察されるとおり、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に区別することができる種々の広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン(γ、μ、α、δ、ε)として分類され、それらは一部のサブクラス(例えば、γ1〜γ4)を有することを認識する。抗体の「クラス」をIgG、IgM、IgA IgG、またはIgEとしてそれぞれ決定するのはこの鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1などは、十分に特性決定されており、機能的特殊化を付与することが公知である。これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの改変バージョンは、本開示に照らして当業者に容易に認識可能であり、したがって本開示の範囲内である。
軽鎖は、カッパまたはラムダ(κ、λ)のいずれかに分類される。それぞれの重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖と結合していてよい。一般に、軽鎖および重鎖は、互いに共有結合しており、免疫グロブリンがハイブリドーマ、B細胞または遺伝子エンジニアリングされた宿主細胞のいずれかにより生成された場合、2つの重鎖の「テール」部分が共有ジスルフィド結合または非共有結合により互いに結合している。重鎖において、アミノ酸配列は、Y形状のフォーク型末端におけるN末端からそれぞれの鎖の下方部におけるC末端に及ぶ。
軽鎖および重鎖の両方は、構造および機能ホモロジーの領域に分割される。用語「定常」および「可変」は、機能的に使用される。これに関して、軽(VL)鎖および重(VH)鎖部分の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することが認識される。逆に、軽鎖(CL)および重鎖(CH1、CH2またはCH3)の定常ドメインは、重要な生物学的特性、例えば、分泌、経胎盤移動、Fc受容体結合、補体結合などを付与する。慣習により、定常領域ドメインの番号付与は、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠くなるにつれて増加する。N末端部分は可変領域であり、C末端部分は定常領域であり;CH3およびCLドメインは、実際には、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端をそれぞれ含む。
上記のとおり、可変領域は、結合分子が抗原上のエピトープを選択的に認識し、それに特異的に結合することを可能とする。すなわち、結合分子、例えば、抗体のVLドメインおよびVHドメイン、または相補性決定領域(CDR)のサブセットは、組み合わさって3次元抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この4元結合分子構造は、Yのそれぞれのアームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、VHおよびVL鎖のそれぞれの3つのCDRにより定義される。
天然に生じる抗体において、それぞれの抗原結合ドメイン中に存在する6つの「相補性決定領域」または「CDR」は、抗体が水性環境中でその3次元形状を取るため、抗原結合ドメインを形成するように特異的に位置しているアミノ酸の短い不連続配列である。抗原結合ドメイン中のアミノ酸の残部は、「フレームワーク」領域と称され、より小さい分子内変動性を示す。フレームワーク領域は、概して、β−シート立体構造を採用し、CDRは、このβ−シート構造を接続し、一部の場合、その一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖内非共有相互作用による正確な配向におけるCDRの位置決めを提供する足場を形成するように作用する。位置決めされたCDRにより形成された抗原結合ドメインは、免疫反応抗原上のエピトープに対する表面相補性を定義する。この相補性表面は、抗体のそのコグネートエピトープへの非共有結合を促進する。CDRおよびフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸は、任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域について当業者により容易に同定することができる。それというのも、それらは既に定義されているためである(参照により全体として本明細書に組み込まれる“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”Kabat,E.,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,(1983);およびChothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196:901−917(1987)参照)。
当分野の範囲内で使用および/または許容される用語の2つ以上の定義が存在する場合、本明細書において使用される用語の定義は、特に明確に逆の記載がない限り全てのそのような意味を含むものとする。具体例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される不連続抗原結合部位を説明するための用語「相補性決定領域」(CDR)の使用である。この特定の領域は、参照により本明細書に組み込まれるKabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(1983)およびChothia et al.,J.Mol.Biol.196:901−917(1987)により記載されており、これらの定義は、互いを比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにも関わらず、抗体またはそのバリアントのCDRを指すためのいずれの定義の適用も、本明細書において定義および使用される用語の範囲内であるものとする。上記の参照文献のそれぞれにより定義されるCDRを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として表1に以下に記載する。特定のCDRを包含する正確な残基数は、CDRの配列およびサイズに応じて変動する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮してどの残基が特定のCDRを含むかを定型的に決定することができる。
Kabat et al.は、あらゆる抗体に適用可能な可変ドメイン配列についての番号付与系も定義した。当業者は、配列自体を越えるいかなる実験データにも依存することなく「Kabat番号付与」のこの系をあらゆる可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書において使用される「Kabat番号付与」は、Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)により記載される番号付与系を指す。特に記載のない限り、本明細書に開示のシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体中の規定のアミノ酸残基位置の番号付与への言及は、Kabat番号付与系に従う。
結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体には、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Fab、Fab’およびF(ab’)2、Fd、Fv、単鎖Fv(scFv)、単鎖抗体、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、VLまたはVHドメインのいずれかを含む断片、Fab発現ライブラリーにより産生された断片が含まれる。scFv分子は、当分野において公知であり、例えば、米国特許第5,892,019号明細書に記載されている。本開示により包含される免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスの免疫グロブリン分子のものであり得る。
「特異的に結合する」は、一般に、結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体が、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、および結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間の一部の相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、結合分子は、それがその抗原結合ドメインを介してランダムの無関連なエピトープに結合するよりも容易にそのエピトープに結合する場合、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書において、ある結合分子があるエピトープに結合する相対親和性を特定するために使用される。例えば、結合分子「A」は、所与のエピトープについて結合分子「B」よりも高い特異性を有するとみなすことができ、または結合分子「A」は、それが関連エピトープ「D」について有するよりも高い特異性でエピトープ「C」に結合すると言うことができる。
「優先的に結合する」は、抗体がエピトープに、それが関連、類似、同種、または相似エピトープに結合するよりも容易に特異的に結合することを意味する。したがって、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が関連エピトープと交差反応し得るとしても、関連エピトープよりもそのエピトープに結合する可能性が高い。
非限定的な例として、結合分子、例えば、抗体は第1のエピトープに、それが前記第1のエピトープに第2のエピトープについての抗体のKD未満の解離定数(KD)で結合する場合、優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例において、結合分子、例えば、抗体は、第1の抗原に、それが第1のエピトープに第2のエピトープについての抗体のKDよりも少なくとも1桁小さい親和性で結合する場合、優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例において、結合分子は、第1のエピトープに、それが第1のエピトープに第2のエピトープについての抗体のKDよりも少なくとも2桁小さい親和性で結合する場合、優先的に結合するとみなすことができる。
別の非限定的な例において、結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、第1のエピトープに、それが第1のエピトープに第2のエピトープについての抗体のk(off)よりも小さいオフ速度(off rate)(k(off))で結合する場合、優先的に結合するとみなすことができる。別の限定的な例において、結合分子は、第1のエピトープに、それが第1のエピトープに第2のエピトープについての抗体のk(off)よりも少なくとも1桁小さい親和性で結合する場合、優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例において、結合分子は、第1のエピトープに、それが第1のエピトープに第2のエピトープについての抗体のk(off)よりも少なくとも2桁小さい親和性で結合する場合、優先的に結合するとみなすことができる。
本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、5×10-2秒-1、10-2秒-1、5×l0-3秒-1または10-3秒-1以下のオフ速度(k(off)で本明細書に開示の標的抗原、例えば、多糖またはその断片もしくはバリアントに結合すると言うことができる。本明細書に開示の結合分子は、5×10-4秒-1、10-4秒-1、5×10-5秒-1、または10-5秒-15×10-6秒-1、10-6秒-1、5×10-7秒-1または10-7秒-1以下のオフ速度(k(off))で標的抗原、例えば、多糖に結合すると言うことができる。
本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体または抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、103M-1秒-1、5×103M-1秒-1、104M-1秒-1または5×104M-1秒-1以上のオン速度(k(on))で標的抗原、例えば、多糖に結合すると言うことができる。本明細書に開示の結合分子は、105M-1秒-1、5×105M-1秒-1、106M-1秒-1、または5×106M-1秒-1または107M-1秒-1以上のオン速度(on rate)(k(on))で標的抗原、例えば、多糖に結合すると言うことができる。
結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、それがある程度、エピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合を遮断する程度にそれがそのエピトープに優先的に結合する場合、所与のエピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合を競合阻害すると言われる。競合阻害は、当分野において公知の任意の方法、例えば、競合ELISAアッセイにより測定することができる。結合分子は、所与のエピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合を少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、または少なくとも50%だけ競合阻害すると言うことができる。
本明細書において使用される用語「親和性」は、個々のエピトープと免疫グロブリン分子のCDRとの結合の強さの尺度を指す。例えば、Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)の27−28ページ参照。本明細書において使用される用語「アビディティー」は、免疫グロブリンの集団と抗原との複合体の総合安定性、すなわち、抗原との免疫グロブリン混合物の機能的組み合わせ強度を指す。例えば、Harlowの29−34ページ参照。アビディティーは、集団における個々の免疫グロブリン分子と規定のエピトープとの親和性、ならびにさらには免疫グロブリンおよび抗原の価数の両方に関する。例えば、2価モノクローナル抗体と高度に反復するエピトープ構造を有する抗原、例えば、ポリマーとの相互作用は、高いアビディティーの1つである。
本明細書に開示の結合分子またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、それらの交差反応性に関して記載または規定することもできる。本明細書において使用される用語「交差反応性」は、1つの抗原に特異的な結合分子、例えば抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体の、第2の抗原と反応する能力を指し;2つの異なる抗原物質間の関連性の尺度である。したがって、結合分子は、それがその形成を誘導したもの以外のエピトープに結合する場合、交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般に、誘導エピトープと同一の相補性構造特徴の多くを含有し、一部の場合、実際に元のものよりも良好に適合し得る。
結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、抗原に対するそれらの結合親和性に関して記載または規定することもできる。例えば、結合分子は、5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、または10-15M以下の解離定数またはKDで抗原に結合し得る。
単鎖抗体を含む抗体断片は、可変領域を単独でまたは以下のものの全部または一部との組み合わせで含み得る:ヒンジ領域、CH1、CH2、およびCH3ドメイン。可変領域とヒンジ領域、CH1、CH2、およびCH3ドメインとの任意の組み合わせも含む抗原結合断片も含まれる。本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片は、任意の動物起源、例として鳥類および哺乳動物からのものであり得る。抗体は、ヒト、ネズミ、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリ抗体であり得る。別の実施形態において、可変領域は、コンドリクトイド(condricthoid)起源(例えば、サメから)であり得る。本明細書において使用される「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、下記のおよび例えばKucherlapati et al.による米国特許第5,939,598号明細書に記載のヒト免疫グロブリンライブラリーから、または1つまたは複数のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体が含まれる。
本明細書において使用される用語「重鎖部分」には、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。重鎖部分を含む結合分子、例えば、抗体は、CH1ドメイン、ヒンジ(例えば、上部、中央部、および/または下部ヒンジ領域)ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、またはそのバリアントもしくは断片の少なくとも1つを含む。例えば、結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、CH1ドメインを含むポリペプチド鎖;CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、およびCH2ドメインを含むポリペプチド鎖;CH1ドメインおよびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖;CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、およびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖、またはCH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖を含み得る。別の実施形態において、結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、CH3ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本開示において使用される結合分子は、CH2ドメインの少なくとも一部分を欠損し得る(例えば、CH2ドメインの全部または一部)。上記のとおり、これらのドメイン(例えば、重鎖部分)は、それらのアミノ酸配列が天然に生じる免疫グロブリン分子から変動するように改変することができることが当業者により理解される。
本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体の重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子から由来してよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、IgG1分子に由来するCH1ドメインおよびIgG3分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例において、重鎖部分は、部分的にはIgG1分子に由来し、部分的にはIgG3分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例において、重鎖部分は、部分的にはIgG1分子に由来し、部分的にはIgG4分子に由来するキメラヒンジを含み得る。
本明細書において使用される用語「軽鎖部分」には、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。軽鎖部分は、VLまたはCLドメインの少なくとも1つを含む。
本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、それらが認識または特異的に結合する抗原、例えば、標的多糖のエピトープまたは部分に関して記載または規定することができる。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的多糖の部分は、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的抗原、例えば、多糖は、単一エピトープを含み得るが、典型的には、少なくとも2つのエピトープを含み、抗原のサイズ、立体構造、およびタイプに応じて任意数のエピトープを含み得る。
上記のとおり、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および3次元形状は周知である。本明細書において使用される用語「VHドメイン」には、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインが含まれ、用語「CH1ドメイン」には、免疫グロブリン重鎖の第1(ほとんどはアミノ末端)の定常領域ドメインが含まれる。CH1ドメインは、VHドメインに隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端である。
本明細書において使用される用語「CH2ドメイン」には、例えば、慣用の番号付与スキームを使用して抗体の約残基244から残基360に及ぶ重鎖分子の部分が含まれる(残基244から360、Kabat番号付与系;および残基231〜340、EU番号付与系;前掲のKabat EA et al.参照。CH2ドメインは、それが別のドメインと密接に対合しないという点でユニークである。むしろ、2つのN結合分枝炭水化物鎖が、インタクトなネイティブIgG分子の2つのCH2ドメイン間に介入される。CH3ドメインがIgG分子のCH2ドメインからC末端に及び、約108残基を含むことも十分に立証されている。
本明細書において使用される用語「ヒンジ領域」には、CH1ドメインをCH2ドメインに連結させる重鎖分子の部分が含まれる。このヒンジ領域は、約25残基を含み、フレキシブルであり、したがって2つのN末端抗原結合領域が独立して移動することを可能とする。ヒンジ領域は、3つの区別されるドメイン:上部、中央部、および下部ヒンジドメイン(Roux et al.,J.Immunol.161:4083(1998))に下位分類することができる。
本明細書において使用される用語「ジスルフィド結合」には、2つの硫黄原子間に形成される共有結合が含まれる。アミノ酸システインは、第2のチオール基とのジスルフィド結合または架橋を形成し得るチオール基を含む。ほとんどの天然に生じるIgG分子において、CH1およびCL領域はジスルフィド結合により結合しており、2つの重鎖は、Kabat番号付与系を使用して239および242(226または229位、EU番号付与系)に対応する位置において2つのジスルフィド結合により結合している。
本明細書において使用される用語「キメラ抗体」は、免疫反応領域または部位が第1の種から得られまたはそれに由来し、定常領域(インタクト、部分的または改変されていてよい)が第2の種から得られる任意の抗体を意味するものとする。一部の実施形態において、標的結合領域または部位は非ヒト資源(例えば、マウスまたは霊長類)を形成し、定常領域はヒトである。
本明細書において使用される用語「二重特異性抗体」は、単一の抗体分子内に2つの異なる抗原に対する結合部位を有する抗体を指す。規定抗体構造に加えて、2つの結合特異性を備える他の分子を構築できることは理解されよう。さらに、二重特異性抗体による抗原結合は、同時とすることも連続的とすることもできることも理解されよう。トリオーマおよびハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性抗体を分泌することができる細胞系の2つの例である。二重特異性抗体はまた、組換え手段によって構築することもできる(StroehleinおよびHeiss,Future Oncol.6:1387−94(2010);MabryおよびSnavely,IDrugs 13:543−9(2010))。
本明細書において使用される用語「エンジニアリングされた抗体」は、重鎖および軽鎖のいずれかまたは両方の可変ドメインが、既知の特異性の抗体からの1つまたは複数のCDRの少なくとも部分的な置換により、ならびに必要により、部分的なフレームワーク領域置換および配列変化により変化した抗体を指す。CDRはフレームワーク領域が由来する抗体と同一のクラスまたはさらにはサブクラスの抗体に由来し得るが、CDRは異なるクラスの抗体、好ましくは、異なる種からの抗体に由来することが想定される。既知の特異性の非ヒト抗体からの1つまたは複数の「ドナー」CDRがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域中にグラフトされたエンジニアリングされた抗体は、本明細書において「ヒト化抗体」と称される。CDRの全てをドナー可変領域からの完全なCDRにより置き換えてある可変ドメインの抗原結合能を別のものに移すことは必要でないことがある。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために必要な残基を移すことのみが必要であることがある。例えば、米国特許第5,585,089号明細書、米国特許第5,693,761号明細書、米国特許第5,693,762号明細書、および米国特許第6,180,370号明細書に記載の説明を考慮すると、それは定型実験の実施により、または機能的エンジニアリングもしくはヒト化抗体を得るための試行錯誤試験により、当業者の能力の十分範囲内である。
本明細書において使用される用語「適切にフォールドされたポリペプチド」には、ポリペプチドを含む機能ドメインの全てが明確に活性であるポリペプチド(例えば、抗シュードモナス属(Pseudomonas)PslおよびPcrV抗体)が含まれる。本明細書において使用される用語「不適切にフォールドされたポリペプチド」には、ポリペプチドの機能ドメインの少なくとも1つが活性でないポリペプチドが含まれる。一実施形態において、適切にフォールドされたポリペプチドは、少なくとも1つのジスルフィド結合により結合しているポリペプチド鎖を含み、逆に、不適切にフォールドされたポリペプチドは、少なくとも1つのジスルフィド結合により結合していないポリペプチド鎖を含む。
本明細書において使用される用語「エンジニアリングされた」には、合成手段による(例えば、組換え技術、インビトロペプチド合成、ペプチドの酵素もしくは化学カップリングまたはそれらの技術のいくつかの組み合わせによる核酸またはポリペプチド分子の操作が含まれる。
本明細書において使用される用語「結合している」、「融合している」または「融合」は、互換的に使用される。これらの用語は、あらゆる手段、例として化学コンジュゲーションまたは組換え手段によるさらに2つのエレメントまたは構成成分の連結を指す。「インフレーム融合」は、元のORFの正確な翻訳リーディングフレームを維持する様式で連続するより長いORFを形成するための2つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム(ORF)の連結を指す。したがって、組換え融合タンパク質は、元のORF(セグメントが通常、天然では連結されていない)によりコードされるポリペプチドに対応する2つ以上のセグメントを含有する単一タンパク質である。リーディングフレームはこうして融合セグメント全体にわたり連続的とされるが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列により物理的または空間的に分離することができる。例えば、免疫グロブリン可変領域のCDRをコードするポリヌクレオチドはインフレームで融合することができるが、「融合」CDRが連続ポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも1つの免疫グロブリンフレームワーク領域または追加のCDR領域をコードするポリヌクレオチドにより分離することができる。
ポリペプチドに関して、「直鎖配列」または「配列」は、配列中で互いに隣接する残基がポリペプチドの1次構造中で連続する、アミノからカルボキシ末端方向におけるポリペプチド中のアミノ酸の順序である。
本明細書において使用される用語「発現」は、遺伝子が生化学物質、例えば、ポリペプチドを産生するプロセスを指す。このプロセスには、細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の顕在化、例として、限定されるものではないが、遺伝子ノックダウンならびに一過的発現および安定的発現の両方が含まれる。それには、限定されるものではないが、遺伝子のメッセンジャーRNA(mRNA)への転写、およびそのようなmRNAのポリペプチドへの翻訳が含まれる。最終所望産物が生化学物質である場合、発現には、その生化学物質および任意の前駆体の作出が含まれる。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書において使用される遺伝子産物は、遺伝子の転写により産生される核酸、例えば、メッセンジャーRNA、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれでもよい。本明細書に記載の遺伝子産物には、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を有する核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解開裂などを有するポリペプチドがさらに含まれる。
本明細書において使用される用語「治療する」または「治療」は、目的が含む所望な生理学的変化、感染、または障害を予防または遅滞(縮減)させることである療法的治療および防止的または予防的措置の両方を指す。利益または所望の臨床結果には、限定されるものではないが、検出可能か検出不能かにかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化(すなわち、悪化しない)、対象における感染原因物質、例えば緑膿菌(P.aeruginosa)のクリアランスまたは低減、疾患進行の遅延または遅滞、疾患状態の改善または緩和、および寛解(一部または完全を問わない)が含まれる。「治療」は、治療を受けない場合に予期される生存率と比較した生存率の延長も意味し得る。治療を必要とする者には、既に感染、病態、または障害を有する者ならびに病態または障害を有しやすい者または病態もしくは障害を予防すべき者、例えば、緑膿菌(P.aeruginosa)感染を受けやすい熱傷患者または免疫抑制患者が含まれる。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後診断、または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、家畜動物、農場動物、および動物園、競技、または愛玩動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、ウシ、クマなどが含まれる。
本明細書において使用される「抗シュードモナス属(Pseudomonas)PslおよびPcrV結合ドメインまたは結合分子の投与から利益を受ける対象」および「治療を必要とする動物」などの語句には、抗シュードモナス属(Pseudomonas)PslおよびPcrV結合ドメインまたは結合分子、例えば、上記結合ドメインの1つまたは複数を含む抗体の投与から利益を受ける対象、例えば、哺乳動物対象が含まれる。このような結合ドメイン、または結合分子は、例えば、シュードモナス属(Pseudomonas)PslもしくはPcrVの検出(例えば、診断手順のため)、および/または治療、すなわち、抗シュードモナス属(Pseudomonas)PslおよびPcrV結合分子による疾患の緩和もしくは予防のために用いることができる。本明細書により詳細に記載される通り、抗シュードモナス属(Pseudomonas)PslおよびPcrV結合分子は、非コンジュゲート形態で使用することができ、または例えば、薬物、プロドラッグ、もしくは同位体にコンジュゲートすることができる。
本明細書において使用される用語「相乗効果」は、化合物の併用によって生じる相加より大きな治療効果を指し、この場合、併用によって得られる治療効果は、化合物単独の個々の投与から生じるであろう相加効果を超える。特定の実施形態は、シュードモナス属(Pseudomonas)感染の治療において、相乗効果を生み出す方法を包含し、ここで、前記効果は、対応する相加効果より、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも500%、または少なくとも1000%大きい。
「共投与」は、抗Ps1および抗PcrV結合ドメイン、または抗Ps1および抗PcrV結合ドメインの一方もしくは両方を含む結合分子などの様々な化合物の投与を指し、その際、上記化合物が、抗シュードモナス属(Pseudomonas)免疫を誘導するようにする。化合物は、同一のまたは異なる組成物において投与することができ、これらは、もし個別であれば、互いに短い間隔で、一般には互いに24時間以内、より典型的には互いに約1〜8時間以内、より典型的には、互いに約1〜4時間以内に投与するか、あるいは、ほぼ同時投与する。相対量は、所望の相乗効果を達成する投与量である。
II.結合ドメイン及び結合分子
Pslに結合する抗体およびこれらの抗体を用いるフォーマットは、当分野で記載されている。例えば、2012年6月8日に提出されたPCT出願PCT/US/2012/041538号明細書、および2012年11月6日に提出されたPCT出願PCT/US/2012/63639号明細書(代理人整理番号AEMS−115WO1、名称「MULTISPECIFIC AND MULTIVALENT BINDING PROTEINS AND USES THEREOF」)(参照により全体として本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
Pslに結合する抗体およびこれらの抗体を用いるフォーマットは、当分野で記載されている。例えば、2012年6月8日に提出されたPCT出願PCT/US/2012/041538号明細書、および2012年11月6日に提出されたPCT出願PCT/US/2012/63639号明細書(代理人整理番号AEMS−115WO1、名称「MULTISPECIFIC AND MULTIVALENT BINDING PROTEINS AND USES THEREOF」)(参照により全体として本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
一実施形態は、抗シュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する結合ドメインであって、結合によって、III型毒素分泌系の活性を破壊し得るドメインを対象とする。特定の実施形態では、結合ドメインは、抗体V2L2と同一のシュードモナス属(Pseudomonas)結合特異性を有する。
別の実施形態は、シュードモナス属(Pseudomonas)PslまたはPcrVに特異的に結合する結合ドメインであって、(a)上皮細胞への緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の付着を阻害すること、(b)緑膿菌(P.aeruginosa)のオプソニン食菌殺傷(OPK)を促進、媒介、もしくは増強すること、(c)上皮細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)の付着を阻害すること、または(d)III型毒素分泌系の活性を破壊することによって、シュードモナス属(Pseudomonas)感染に対する相乗効果を生み出す結合ドメインを対象とする。ある実施形態において、上記結合ドメインは、抗体Cam−003、WapR−004、V2L2、または29D2と同一のシュードモナス属(Pseudomonas)結合特異性を有する。
別の実施形態は、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する一方もしくは両方のドメインを含む単離結合分子であって、結合分子の投与により、シュードモナス属(Pseudomonas)感染に対する相乗効果を生み出す分子を対象とする。ある実施形態において、上記結合分子は、限定されるものではないが、Cam−003、WapR−004、V2L2、もしくは29D22などの抗体またはその断片由来の結合ドメインを含むことができる。
本明細書において使用される用語「結合ドメイン」または「抗原結合ドメイン」には、抗原上のエピトープ(例えば、シュードモナス属(Pseudomonas)PslまたはPcrVのエピトープ)に特異的に結合する部位が含まれる。抗体の抗原結合ドメインは、典型的には、免疫グロブリン重鎖可変領域の少なくとも一部および免疫グロブリン軽鎖可変領域の少なくとも一部を含む。これらの可変領域により形成される結合部位が、抗体の特異性を決定する。
本開示は、より具体的には、少なくとも2つの抗シュードモナス属(Pseudomonas)結合ドメインを含む組成物であって、一方の結合ドメインがPslに特異的に結合し、他方の結合ドメインがPcrVに特異的に結合する、組成物を対象とする。一実施形態において、本組成物は、WapR−004、Cam−003、Cam−004、Cam−005、WapR−001、WapR−002、WapR−003、もしくはWapR−016の重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含む抗体またはその抗原結合断片と同一のシュードモナス属(Pseudomonas)Pslエピトープに特異的に結合する1つの結合ドメインを含む。ある実施形態において、第2結合ドメインは、V2L2または29D2の重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含む抗体またはその抗原結合断片と同一のシュードモナス属(Pseudomonas)PcrVエピトープに特異的に結合する。
一実施形態において、組成物は、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する、および/またはWapR−004、Cam−003、Cam−004、Cam−005、WapR−001、WapR−002、WapR−003、もしくはWapR−016のVHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属(Pseudomonas)Pslへの結合を競合阻害する1つの結合ドメインを含む。ある実施形態では、第2結合ドメインは、同一のシュードモナス属(Pseudomonas)PcrVエピトープに特異的に結合する、および/またはV2L2または29D2の重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属(Pseudomonas)PcrVへの結合を競合阻害する。
別の実施形態は、V2L2または29D2のVHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片と同一のシュードモナス属(Pseudomonas)PcrVエピトープに特異的に結合する、単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を対象とする。
また、シュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合し、V2L2または29D2のVHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属(Pseudomonas)PcrV結合を競合阻害する、単離結合分子、例えば、抗体またはその断片も含まれる。
一実施形態は、WapR−001、WapR−002、もしくはWapR−003のVHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片と同一のシュードモナス属(Pseudomonas)Pslエピトープに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を対象とする。
また、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合し、WapR−001、WapR−002、もしくはWapR−003のVHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属(Pseudomonas)Pslへの結合を競合阻害する単離結合分子、例えば、抗体またはその断片も含まれる。
さらには、WapR−016のVHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片と同一のシュードモナス属(Pseudomonas)Pslエピトープに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその断片も含まれる。
また、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合し、WapR−016のVHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属(Pseudomonas)Pslへの結合を競合阻害する単離結合分子、例えば、抗体またはその断片も含まれる。
抗体を作製する方法は、当分野において周知であり、本明細書に記載される。シグナル配列を有さないシュードモナス属(Pseudomonas)PslまたはPcrVの種々の断片または全長シュードモナス属(Pseudomonas)PslまたはPcrVに対する抗体を産生したら、本明細書に記載のエピトープマッピングプロトコルおよび当分野において公知の方法(例えば、 “Chapter 11−Immunology,”Current Protocols in Molecular Biology,Ed.Ausubel et al.,v.2,John Wiley & Sons,Inc.(1996)に記載の二重抗体サンドイッチELISA)により抗体または抗原結合断片が結合するシュードモナス属(Pseudomonas)Pslのアミノ酸、またはエピトープを決定することが決定できる。追加のエピトープマッピングプロトコルは、Morris,G.Epitope Mapping Protocols,New Jersey:Humana Press(1996)に見出すことができ、それらは両方とも参照により全体として本明細書に組み込まれる。エピトープマッピングは、市販の手段(すなわち、ProtoPROBE,Inc.(Milwaukee,Wisconsin))により実施することもできる。
ある態様において、本開示は、前記参照モノクローナル抗体についてのKD未満の解離定数(KD)を特徴とする親和性でシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体を対象とする。
ある実施形態において、本明細書に開示の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、PslまたはPcrVの少なくとも1つのエピトープに特異的に結合し、すなわち、そのようなエピトープに、それが無関連またはランダムエピトープに結合するよりも容易に結合し;PslまたはPcrVの少なくとも1つのエピトープに優先的に結合し、すなわち、そのようなエピトープに、それが関連、類似、同種、または相似エピトープに結合するよりも容易に結合し;PslまたはPcrVのあるエピトープに特異的または優先的にそれ自体結合する参照抗体の結合を競合阻害し;または約5×10-2M、約10-2M、約5×10-3M、約10-3M、約5×10-4M、約10-4M、約5×10-5M、約10-5M、約5×10-6M、約10-6M、約5×10-7M、約10-7M、約5×10-8M、約10-8M,約5×10-9M,約10-9M、約5×10-10M、約10-10M、約5×10-11M、約10-11M、約5×10-12M、約10-12M、約5×10-13M、約10-13M、約5×10-14M、約10-14M、約5×10-15M、または約10-15M未満の解離定数KDを特徴とする親和性でPslまたはPcrVの少なくとも1つのエピトープに結合する。
結合解離定数に関して使用される用語「約」は、抗体親和性を計測するために利用される方法における固有のバリエーションの程度を許容する。例えば、使用される装置類の精度のレベル、計測される試料の数に基づく標準誤差、および丸め誤差に応じて、用語「約10-2M」は、例えば、0.05Mから0.005Mを含み得る。
具体的な実施形態において、結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、5×10-2秒-1、10-2秒-1、5×l0-3秒-1または10-3秒-1以下のオフ速度(k(off))でシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに結合する。あるいは、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、5×10-4秒-1、10-4秒-1、5×10-5秒-1、または10-5秒-1 5×10-6秒-1、10-6秒、-15×10-7秒-1または10-7秒-1以下のオフ速度(k(off))でシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに結合する。
他の実施形態において、本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、103M-1秒-1、5×103M-1秒-1、104M-1秒-1または5×104M-1秒-1以上のオン速度(k(on))でシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに結合する。あるいは、本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、105M-1秒-1、5×105M-1秒-1、106M-1秒-1、または5×106M-1秒-1または107M-1秒-1以上のオン速度(k(on))でシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに結合する。
種々の実施形態において、本明細書に記載の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、シュードモナス属(Pseudomonas)のオプソニン食菌殺傷を促進し、または上皮細胞へのシュードモナス属(Pseudomonas)結合を阻害する。本明細書に記載のある実施形態において、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV標的は、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)Pslおよび/またはPcrVである。他の実施形態において、本明細書に記載のある結合分子は、それらの資源にかかわらず構造的に関連する多糖分子に結合し得る。そのようなPsl様分子は、緑膿菌(aeruginosa)Pslと同一でありまたは十分な構造関連性を有して開示される結合分子の1つまたは複数による特異的認識を可能とすることが予期される。他の実施形態において、本明細書に記載する特定の結合分子は、それらの供給源にかかわらず構造的に関連するポリペプチド分子に結合し得る。そのようなPcrV様分子は、緑膿菌(P.aeruginosa)PcrVと同一であるか、または開示される結合分子の1つまたは複数による特異的認識を可能にするのに十分な構造関連性を有することが予想される。従って、例えば、本明細書に記載の特定の結合分子は、他の細菌種により産生されるPsl様および/またはPcrV様分子、例えば、他のシュードモナス属(Pseudomonas)種、例えば、蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、またはシュードモナス・アルカリゲネス(Pseudomonas alcaligenes)により産生されるPsl様またはPcrV様分子に結合し得る。あるいは、本明細書に記載のある結合分子は、合成により、またはPslおよび/またはPcrV様分子を産生するように遺伝子改変された宿主細胞により産生されるPsl様またはPcrV様分子に結合し得る。
特に記載のない限り、結合分子、例えば、抗体への言及において本明細書において使用される「その断片」は、抗原結合断片、すなわち、抗原に特異的に結合する抗体の一部分を指す。
抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、1つまたは複数のエフェクター機能を媒介する定常領域を含み得る。例えば、抗体定常領域への補体のC1構成成分の結合は、補体系を活性化し得る。補体の活性化は、病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体の活性化は、炎症応答も刺激し、自己免疫過敏にも関与し得る。さらに、抗体は、Fc領域を介して種々の細胞上の受容体に結合し、抗体Fc領域上のFc受容体結合部位が細胞上のFc受容体(FcR)に結合する。異なるクラスの抗体、例としてIgG(ガンマ受容体)、IgE(イプシロン受容体)、IgA(アルファ受容体)およびIgM(ミュー受容体)に特異的な多数のFc受容体が存在する。細胞表面上のFc受容体への抗体の結合は、多数の重要および多様な生物学的応答、例として、抗体コートされた粒子の飲込みおよび破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体コートされた標的細胞の溶解(抗体依存性細胞媒介性細胞毒性、またはADCCと呼ばれる)、炎症メディエーターの放出、胎盤通過および免疫グロブリン産生の制御を誘発する。
したがって、本明細書に開示のある実施形態は、定常領域ドメインの1つまたは複数の少なくとも一部分が所望の生化学的特徴、例えば、ほぼ同一の免疫原性の完全な未変化抗体と比較してエフェクター機能の低減、非共有結合ダイマー化能、腫瘍の部位における局在化能の増加、血清半減期の低減、または血清半減期の増加を提供するように欠失され、そうでなければ変化した抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。例えば、本明細書に記載のある結合分子は、免疫グロブリン重鎖と類似のポリペプチド鎖を含むが、1つまたは複数の重鎖ドメインの少なくとも一部分を欠くドメイン欠失抗体である。例えば、ある抗体において、改変抗体の定常領域の1つのドメイン全体が欠失され、例えば、CH2ドメインの全部または一部が欠失される。
抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体または抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体の改変形態は、当分野において公知の技術を使用して完全前駆体または親抗体から作製することができる。例示的な技術を本明細書の他箇所に考察する。
ある実施形態において、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片の可変領域および定常領域の両方は、完全ヒトである。完全ヒト抗体は、当分野において公知のおよび本明細書に記載の技術を使用して作製することができる。例えば、特異的抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように改変されたが、内在性遺伝子座が損なわれたトランスジェニック動物に抗原を投与することにより調製することができる。そのような抗体を作製するために使用することができる例示的な技術は、米国特許第6,150,584号明細書、米国特許第6,458,592号明細書、米国特許第6,420,140号明細書に記載されている。他の技術は、当分野において公知である。完全ヒト抗体は、同様に、種々のディスプレイ技術、例えば、本明細書の他箇所により詳細に記載されるファージディスプレイ系または他のウイルスディスプレイ系により産生することができる。
本明細書に開示の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、当分野において公知の技術を使用して作製または製造することができる。ある実施形態において、結合分子またはその断片は、「組換え産生」することができ、すなわち、組換えDNA技術を使用して産生される。抗体分子またはその断片を作製するための例示的な技術は、本明細書の他箇所により詳細に考察される。
本明細書に記載のある抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体において、Fc部分は、当分野において公知の技術を使用してエフェクター機能を減少させるように突然変異させることができる。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活性化(点突然変異または他の手段を介する)は、循環改変抗体のFc受容体結合を低減させ得、それにより腫瘍局在化を増加させる。他の場合、定常領域改変は補体結合を抑え、したがって血清半減期およびコンジュゲート細胞毒素の非特異的会合を低減させ得る。抗原特異性および抗体フレキシビリティーの増加に起因して局在の向上を可能とする定常領域のさらに他の改変を使用してジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を改変することができる。得られる生理学的プロファイル、バイオアベイラビリティーおよび改変の他の生化学的効果、例えば、局在化、生体分布および血清半減期は、周知の免疫学的技術を使用して過度の実験なしで容易に計測および定量することができる。
ある実施形態において、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、治療すべき動物において、例えば、ヒトにおいて有害な免疫応答を誘発しない。一実施形態において、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、当分野において認識される技術を使用してそれらの免疫原性を低減させるように改変される。例えば、抗体は、ヒト化、脱免疫化することができ、またはキメラ抗体を作製することができる。これらのタイプの抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持し、または実質的に保持するが、ヒトにおいて免疫原性がより小さい非ヒト抗体、典型的には、ネズミまたは霊長類抗体に由来する。このことは、種々の方法、例として、(a)非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域上にグラフト化してキメラ抗体を生成すること;(b)非ヒト相補性決定領域(CDR)の1つまたは複数の少なくとも一部を、クリティカルなフレームワーク残基を保持してまたは保持せずにヒトフレームワークおよび定常領域中にグラフト化すること;または(c)非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によりヒト様セクションによりそれらを覆うことにより達成することができる。そのような方法は、Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851−6855(1984);Morrison et al.,Adv.Immunol.44:65−92(1988);Verhoeyen et al.,Science 239:1534−1536(1988);Padlan,Molec.Immun.28:489−498(1991);Padlan,Molec.Immun.31:169−217(1994)、ならびに米国特許第5,585,089号明細書、米国特許第5,693,761号明細書、米国特許第5,693,762号明細書、および米国特許第6,190,370号明細書に開示されており、それらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる。
脱免疫化を使用して抗体の免疫原性を減少させることもできる。本明細書において使用される用語「脱免疫化」には、T細胞エピトープを改変するための抗体の変化が含まれる(例えば、国際公開第9852976A1号パンフレット、国際公開第0034317A2号パンフレット参照)。例えば、出発抗体からのVHおよびVL配列を分析し、相補性決定領域(CDR)および配列内の他のキー残基に関してエピトープの局在を示すそれぞれのV領域からヒトT細胞エピトープを「マッピング」する。T細胞エピトープマップからの個々のT細胞エピトープを分析して最終抗体の活性の変化が低リスクな代替アミノ酸置換を同定する。アミノ酸置換の組み合わせを含む一連の代替VHおよびVL配列を設計し、続いてこれらの配列を本明細書に開示の一連の結合ポリペプチド、例えば、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV特異的抗体またはその抗原結合断片中に取り込み、次いで機能について試験する。次いで、改変VおよびヒトC領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子を発現ベクター中にクローニングし、後続のプラスミドを完全抗体の産生のために細胞系中に導入する。次いで、抗体を適切な生化学および生物学的アッセイにおいて比較し、最適なバリアントを同定する。
抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、当分野において公知の任意の好適な方法により生成することができる。対象の抗原に対するポリクローナル抗体は、当分野において周知の種々の手順により産生することができる。例えば、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV抗体またはその抗原結合断片は、種々の宿主動物、例として、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ、ハムスター、ヤギ、ロバなどに投与して抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導することができる。種々のアジュバントを使用して宿主種に応じて免疫学的応答を増加させることができ、それには、限定されるものではないが、フロイント(完全および不完全)、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニック(pluronic)ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、BCG(カルメット・ゲラン桿菌)およびコリネバクテリウム・バルブム(Corynebacterium parvum)が含まれる。そのようなアジュバントも当分野において周知である。
モノクローナル抗体は、当分野において公知の広範な技術、例として、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術の使用、またはそれらの組み合わせを使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、例として当分野において公知のものおよび例えば、Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.(1988)に教示されるものを使用して産生することができる。
抗体または抗体断片(例えば、抗原結合部位)をコードするDNAは、抗体ライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーに由来していてもよい。特に、そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー(例えば、ヒトまたはネズミ)から発現される抗原結合ドメインをディスプレイするために利用することができる。対象の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原により、例えば、標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使用して選択または同定することができる。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、scFv、Fab、Fv OE DAB(軽鎖または重鎖からの個々のFv領域)またはファージ遺伝子IIIもしくは遺伝子VIIIタンパク質に組換え融合されたジスルフィド安定化Fv抗体ドメインを有するファージから発現されるfdおよびM13結合ドメインを含む糸状ファージである。例示的な方法は、例えば、欧州特許第368684B1号明細書;米国特許第5,969,108号明細書、Hoogenboom,H.R.and Chames,Immunol.Today 21:371(2000);Nagy et al.Nat.Med.8:801(2002);Huie et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:2682(2001);Lui et al.,J.Mol.Biol.315:1063(2002)に記載されており、それらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの刊行物(例えば、Marks et al.,Bio/Technology 10:779−783(1992))は、鎖シャフリングによる高親和性ヒト抗体の産生、ならびに大ファージライブラリーの構築のための方針としてのコンビナトリアル感染およびインビボ組換えを記載している。別の実施形態において、リボソームディスプレイを使用してバクテリオファージをディスプレイプラットフォームとして置き換えることができる(例えば、Hanes et al.,Nat.Biotechnol.18:1287(2000);Wilson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:3750(2001);またはIrving et al.,J.Immunol.Methods 248:31(2001)参照)。さらに別の実施形態において、細胞表面ライブラリーを抗体についてスクリーニングすることができる(Boder et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:10701(2000);Daugherty et al.,J.Immunol.Methods 243:211(2000))。そのような手順は、モノクローナル抗体の単離および後続のクローニングのための慣習的なハイブリドーマ技術の代替手段を提供する。
ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上でディスプレイされる。例えば、VHおよびVL領域をコードするDNA配列は、動物cDNAライブラリー(例えば、リンパ組織のヒトまたはネズミcDNAライブラリー)または合成cDNAライブラリーから増幅される。ある実施形態において、VHおよびVL領域をコードするDNAは、PCRによりscFvリンカーにより一緒に連結させ、ファージミドベクター(例えば、pCANTAB6またはpComb3HSS)中にクローニングする。ベクターを大腸菌(E.coli)中にエレクトロポレートし、大腸菌(E.coli)をヘルパーファージにより感染させる。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、糸状ファージ、例として、fdおよびM13であり、VHまたはVL領域を通常、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのいずれかに組換え融合させる。対象の抗原(すなわち、シュードモナス属(Pseudomonas)PslまたはPcrV)に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原により、例えば、標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使用して選択または同定することができる。
抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の追加の例には、Brinkman et al.,J.Immunol.Methods 182:41−50(1995);Ames et al.,J.Immunol.Methods 184:177−186(1995);Kettleborough et al.,Eur.J.Immunol.24:952−958(1994);Persic et al.,Gene 187:9−18(1997);Burton et al.,Advances in Immunology 57:191−280(1994);PCT出願PCT/GB91/01134号明細書;PCT公開国際公開第90/02809号パンフレット;国際公開第91/10737号パンフレット;国際公開第92/01047号パンフレット;国際公開第92/18619号パンフレット;国際公開第93/11236号パンフレット;国際公開第95/15982号パンフレット;国際公開第95/20401号パンフレット;および米国特許第5,698,426号明細書;米国特許第5,223,409号明細書;米国特許第5,403,484号明細書;米国特許第5,580,717号明細書;米国特許第5,427,908号明細書;米国特許第5,750,753号明細書;米国特許第5,821,047号明細書;米国特許第5,571,698号明細書;米国特許第5,427,908号明細書;米国特許第5,516,637号明細書;米国特許第5,780,225号明細書;米国特許第5,658,727号明細書;米国特許第5,733,743号明細書および米国特許第5,969,108号明細書に開示のものが含まれ、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
上記参照文献および下記実施例において記載されるとおり、ファージ選択後、ファージからの領域をコードする抗体を単離し、使用して完全抗体、例として、ヒト抗体、または任意の他の所望の抗原結合断片を生成し、任意の所望の宿主、例として哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌中で発現させることができる。例えば、当分野において公知の方法、例えば、PCT公開国際公開第92/22324号パンフレット;Mullinax et al.,BioTechniques 12(6):864−869(1992);およびSawai et al.,AJRI 34:26−34(1995);およびBetter et al.,Science 240:1041−1043(1988)(前記参照文献は、参照により全体として本明細書に組み込まれる)に開示のものを使用してFab、Fab’およびF(ab’)2断片を組換え産生する技術も用いることができる。
単鎖Fvおよび抗体を産生するために使用することができる技術の例には、米国特許第4,946,778号明細書および米国特許第5,258,498号明細書;Huston et al.,Methods in Enzymology 203:46−88(1991);Shu et al.,PNAS 90:7995−7999(1993);およびSkerra et al.,Science 240:1038−1040(1988)に記載のものが含まれる。ある実施形態、例えば、治療投与において、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を使用することができる。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、ネズミモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。キメラ抗体を産生する方法は、当分野において公知である。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるMorrison,Science 229:1202(1985);Oi et al.,BioTechniques 4:214(1986);Gillies et al.,J.Immunol.Methods 125:191−202(1989);米国特許第5,807,715号明細書;米国特許第4,816,567号明細書;および米国特許第4,816397号明細書参照。ヒト化抗体は、非ヒト種からの1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する所望抗原に結合する非ヒト種抗体からの抗体分子である。ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、抗原結合を変化、好ましくは、改善させるためにCDRドナー抗体からの対応する残基により置換されることが多い。これらのフレームワーク置換は、当分野において周知の方法により、例えば、CDRおよびフレームワーク残基の相互作用をモデリングして抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定し、配列比較して特定の位置において特殊なフレームワーク残基を同定することにより同定される。(例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるQueen et al.,米国特許第5,585,089号明細書;Riechmann et al.,Nature 332:323(1988)参照)。抗体は、当分野において公知の種々の技術、例として、例えばCDRグラフト化(欧州特許第239,400号明細書;PCT公開国際公開第91/09967号パンフレット;米国特許第5,225,539号明細書;米国特許第5,530,101号明細書;および米国特許第5,585,089号明細書)、ベニアリング(veneering)またはリサーフェイシング(resurfacing)(欧州特許第592,106号明細書;欧州特許第519,596号明細書;Padlan,Molecular Immunology 28(4/5):489−498(1991);Studnicka et al.,Protein Engineering 7(6):805−814(1994);Roguska.et al.,PNAS 91:969−973(1994))および鎖シャフリング(米国特許第5,565,332号明細書)を使用してヒト化することができる。
完全ヒト抗体は、ヒト患者の療法的治療に特に望ましい。ヒト抗体は、当分野において公知の種々の方法、例として、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用する上記ファージディスプレイ法により作製することができる。それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第4,444,887号明細書および米国特許第4,716,111号明細書;ならびにPCT公開国際公開第98/46645号パンフレット、国際公開第98/50433号パンフレット、国際公開第98/24893号パンフレット、国際公開第98/16654号パンフレット、国際公開第96/34096号パンフレット、国際公開第96/33735号パンフレット、および国際公開第91/10741号パンフレットも参照。
ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現し得ないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを使用して産生することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をランダムにまたは相同組換えによりマウス胚性幹細胞中に導入することができる。さらに、種々の会社は、上記と同様の技術を使用して選択抗原に対して指向されたトランスジェニックマウスにおいて産生されたヒト抗体の提供に参画し得る。
選択エピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイド選択(guided selection)」と称される技術を使用して生成することができる。このアプローチにおいて、選択非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を使用して同一エピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドする(Jespers et al.,Bio/Technology 12:899−903(1988)。米国特許第5,565,332号明細書も参照)。
別の実施形態において、所望のモノクローナル抗体をコードするDNAは、慣用の手順を使用して容易に単離および配列決定することができる(例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブの使用による)。単離およびサブクローニングされたハイブリドーマ細胞または単離ファージは、例えば、そのようなDNAの資源として機能し得る。DNAを単離したら、発現ベクター中に配置し、次いで他では免疫グロブリンを産生しない原核または真核宿主細胞、例えば大腸菌(E.coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞または骨髄腫細胞中に形質移入することができる。より特定すると、単離DNA(本明細書に記載のとおり合成であり得る)を使用して、参照により本明細書に組み込まれるNewman et al.,米国特許第5,658,570号明細書、1995年1月25日出願に記載のとおり抗体を製造するために定常および可変領域配列をクローニングすることができる。所望の抗体を発現する形質転換細胞は、比較的大量に成長させて免疫グロブリンの臨床および市販供給品を提供することができる。
一実施形態において、単離結合分子、例えば、抗体は、抗体分子の少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含む。別の実施形態において、単離結合分子は、1つまたは複数の抗体分子からの少なくとも2つのCDRを含む。別の実施形態において、単離結合分子は、1つまたは複数の抗体分子からの少なくとも3つのCDRを含む。別の実施形態において、単離結合分子は、1つまたは複数の抗体分子からの少なくとも4つのCDRを含む。別の実施形態において、単離結合分子は、1つまたは複数の抗体分子からの少なくとも5つのCDRを含む。別の実施形態において、本明細書の単離結合分子は、1つまたは複数の抗体分子からの少なくとも6つのCDRを含む。
具体的な実施形態において、重鎖および/または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を調査して相補性決定領域(CDR)の配列を、当分野において周知の方法により、例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の既知アミノ酸配列を比較して配列超可変性の領域を決定することにより同定することができる。定型的なDNA技術を使用して、CDRの1つまたは複数をフレームワーク領域内、例えば、ヒトフレームワーク領域中に挿入して非ヒト抗体をヒト化することができる。フレームワーク領域は、天然に生じるものまたはコンセンサスフレームワーク領域、好ましくは、ヒトフレームワーク領域であり得る(例えば、ヒトフレームワーク領域の列記についてChothia et al.,J.Mol.Biol.278:457−479(1998)参照)。フレームワーク領域およびCDRの組み合わせにより生成されたポリヌクレオチドは、所望の抗原、例えば、PslまたはPcrVの少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。1つまたは複数のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内に作製することができ、アミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、そのような方法を使用して鎖内ジスルフィド結合に関与する1つまたは複数の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製して1つまたは複数の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を生成することができる。ポリヌクレオチドに対する他の変化は、本開示により包含され、当業者の能力の範囲内である。
結合分子またはその断片がシュードモナス属(Pseudomonas)PslまたはPcrVに特異的に結合する本明細書に記載の抗体分子(例えば、VH領域および/またはVL領域)のバリアント(誘導体を含む)を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる結合分子も提供される。当業者に公知の標準的な技術、例として、限定されるものではないが、アミノ酸置換をもたらす部位特異的突然変異導入およびPCR媒介突然変異導入を使用してシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する結合分子またはその断片をコードするヌクレオチド配列中に突然変異を導入することができる。バリアント(誘導体を含む)は、参照VH領域、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL領域、VLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3に対して50未満のアミノ酸置換、40未満のアミノ酸置換、30未満のアミノ酸置換、25未満のアミノ酸置換、20未満のアミノ酸置換、15未満のアミノ酸置換、10未満のアミノ酸置換、5未満のアミノ酸置換、4未満のアミノ酸置換、3未満のアミノ酸置換、または2未満のアミノ酸置換を含むポリペプチドをコードする。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えられたものである。類似の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分枝側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。あるいは、突然変異は、コード配列の全部または一部に沿って、例えば飽和突然変異導入によりランダムに導入することができ、得られた突然変異体を生物学的活性についてスクリーニングして活性(例えば、シュードモナス属(Pseudomonas)PslまたはPcrV結合能)を保持する突然変異体を同定することができる。
例えば、抗体分子のフレームワーク領域中にのみ、またはCDR領域中にのみ突然変異を導入することが可能である。導入される突然変異は、サイレントまたは中立ミスセンス突然変異であり得、すなわち、抗体の抗原結合能に対して影響を有さずまたはほとんど有さない。これらのタイプの突然変異は、コドン使用頻度を最適化するためまたはハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用であり得る。あるいは、非中立ミスセンス突然変異は、抗体の抗原結合能を変化させ得る。ほとんどのサイレントおよび中立ミスセンス突然変異の局在は、フレームワーク領域中である可能性が高い一方、ほとんどの非中立ミスセンス突然変異の局在は、CDR中である可能性が高いが、これらは絶対要件ではない。当業者は、所望の特性、例えば、不変の抗原結合活性または変化した結合活性(例えば、抗原結合活性の改善または抗体特異性の変化)を有する突然変異体分子を設計および試験することができる。突然変異導入後、コードされるタンパク質は定型的に発現させることができ、コードされるタンパク質の機能的および/または生物学的活性(例えば、シュードモナス属(Pseudomonas)PslまたはPcrVの少なくとも1つのエピトープに結合する能力)は、本明細書に記載の技術を使用してまたは当分野において公知の定型的改変技術により測定することができる。
一実施形態は、本明細書に開示する抗シュードモナス属(Pseudomonas)PslおよびPcrV結合ドメインを含む二重特異性抗体を提供する。ある実施形態において、二重特異性抗体は、第1のPsl結合ドメインと、第2のPcrV結合ドメインを含む。2より大きい原子価を有する二重特異性抗体が考慮される。例えば、本明細書に記載の方法を用いて、三重特異性抗体を作製することも可能である(Tutt et al.,J.Immunol.,147:60(1991))。
一実施形態は、二重特異性抗体を製造する方法を提供し、この方法は、二重特異性分子に存在する両重鎖可変ドメインと対合することができる単一軽鎖を使用する。この軽鎖を同定するために、様々な戦略を用いることができる。一実施形態では、二重特異性抗体を用いてターゲティングすることができる各抗原に対して、一連のモノクローナル抗体を同定した後、これらの抗体に使用した軽鎖のどれが、第2標的に対して同定された抗体のいずれかの重鎖と対合したとき機能することができるかを決定する。このようにして、両方の抗原との結合を可能にするように2つの重鎖と機能し得る軽鎖を同定することができる。別の実施形態では、ファージディスプレイなどのディスプレイ技術によって、2つ以上の重鎖と共に機能し得る軽鎖を同定することができる。一実施形態では、多様なレパトアの重鎖可変ドメインと単一の軽鎖可変ドメインを含むファージライブラリーを構築する。このライブラリーをさらに使用して、目的とする様々な抗原に結合する抗体を同定することができる。従って、ある実施形態では、同定された抗体は、共通の軽鎖を有することになる。
特定の実施形態において、二重特異性抗体は、少なくとも1つの一本鎖Fv(scFv)を含む。ある実施形態では、二重特異性抗体は、2つのscFvを含む。例えば、1抗体内に含まれるCH3ドメイン−含有ポリペプチドの一方または両方にscFvを融合することができる。ある方法は、二重特異性分子を製造するステップを含み、ここで、少なくともCH3ドメインを含む重鎖定常領域の一方または両方を一本鎖Fvドメインと一緒に用いることにより、抗原ライブラリーを取得する。
III.抗体ポリペプチド
本開示はさらに、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を構成する単離ポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象とする。本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体またはその断片は、ポリペプチド、例えば、例えば免疫グロブリン分子に由来するPslおよび/またはPcrV特異的抗原結合領域をコードするアミノ酸配列を含む。指定のタンパク質「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ポリペプチドの起源を指す。ある場合、特定の出発ポリペプチドまたはアミノ酸配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、出発配列、または少なくとも10〜20アミノ酸、少なくとも20〜30アミノ酸、少なくとも30〜50アミノ酸からなりもしくは他では起源を出発配列中に有すると当業者に同定可能であるその一部分と本質的に同一のアミノ酸配列を有する。
本開示はさらに、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を構成する単離ポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象とする。本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体またはその断片は、ポリペプチド、例えば、例えば免疫グロブリン分子に由来するPslおよび/またはPcrV特異的抗原結合領域をコードするアミノ酸配列を含む。指定のタンパク質「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ポリペプチドの起源を指す。ある場合、特定の出発ポリペプチドまたはアミノ酸配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、出発配列、または少なくとも10〜20アミノ酸、少なくとも20〜30アミノ酸、少なくとも30〜50アミノ酸からなりもしくは他では起源を出発配列中に有すると当業者に同定可能であるその一部分と本質的に同一のアミノ酸配列を有する。
表2に示す配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、または配列番号74の1つまたは複数と少なくとも80%、85%、90%、95%または100%同一の免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列を含むシュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も開示される。
さらに、表2に示す配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、または配列番号74の1つまたは複数と同一、または1、2、3、4、5つ以上のアミノ酸置換を除いて同一のVHアミノ酸配列を含むシュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片が開示される。
一部の実施形態は、VHを含むシュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、VHのVHCDR1、VHCDR2またはVHCDR3領域の1つまたは複数は、表2に示す配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、または配列番号74の1つまたは複数の1つまたは複数の参照重鎖VHCDR1、VHCDR2またはVHCDR3アミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%または100%同一の単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を含む。
さらに、VHを含むシュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、VHのVHCDR1、VHCDR2またはVHCDR3領域の1つまたは複数は、表2に示す配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、または配列番号74の1つまたは複数の1つまたは複数の参照重鎖VHCDR1、VHCDR2および/またはVHCDR3アミノ酸配列と同一、または4、3、2、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一の単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片が開示される。したがって、この実施形態によれば、VHは、表3に示すVHCDR1、VHCDR2、またはVHCDR3アミノ酸配列の1つまたは複数と同一または4、3、2、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一のVHCDR1、VHCDR2、またはVHCDR3の1つまたは複数を含む。
表2に示す配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、または配列番号16の1つまたは複数と少なくとも80%、85%、90%、95%または100%同一の免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列を含むシュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も開示される。
一部の実施形態は、表2に示す配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、または配列番号16の1つまたは複数と同一、または1、2、3、4、5つ以上のアミノ酸置換を除いて同一のVLアミノ酸配列を含むシュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を開示する。
VLを含むシュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、VLのVLCDR1、VLCDR2またはVLCDR3領域の1つまたは複数は、表2に示す配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、または配列番号16の1つまたは複数の1つまたは複数の参照軽鎖VLCDR1、VLCDR2またはVLCDR3アミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%または100%同一である単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も提供される。
さらに、VLを含むシュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、VLのVLCDR1、VLCDR2またはVLCDR3領域の1つまたは複数は、表2に示す配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、または配列番号16の1つまたは複数の1つまたは複数の参照重鎖VLCDR1、VLCDR2および/またはVLCDR3アミノ酸配列と同一、または4、3、2、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一である単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片が提供される。したがって、この実施形態によれば、VLは、表3に示すVLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3アミノ酸配列の1つまたは複数と同一、または4、3、2、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一のVLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3の1つまたは複数を含む。
他の実施形態において、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片は、(a)それぞれ、配列番号1および配列番号2、(b)それぞれ、配列番号3および配列番号2、(c)それぞれ、配列番号4および配列番号2、(d)それぞれ、配列番号5および配列番号6、(e)それぞれ、配列番号7および配列番号8、(f)それぞれ、配列番号9および配列番号10、(g)それぞれ、配列番号11および配列番号12、(h)それぞれ、配列番号13および配列番号14;(i)それぞれ、配列番号15および配列番号16または(j)それぞれ、配列番号74および配列番号12と少なくとも80%、85%、90% 95%または100%同一のVHおよびVLアミノ酸配列を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる。ある実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列配列番号11を有するVHおよび配列番号12のアミノ酸配列を有するVLを含む。一部の実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列配列番号1を有するVHおよび配列番号2のアミノ酸配列を有するVLを含む。他の実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列配列番号11を有するVHおよび配列番号12のアミノ酸配列を有するVLを含む。
特定の実施形態は、各々が相補性決定領域1(CDR1)、CDR2、およびCDR3を含む免疫グロブリンVHおよび免疫グロブリンVLを含有するシュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、VH CDR1は、PYYWT(配列番号47)であり、VH CDR2は、YIHSSGYTDYNPSLKS(配列番号48)であり、VH CDR3は、以下:ADWDRLRALDI(Psl0096、配列番号258)、AMDIEPHALDI(Psl0225、配列番号267)、ADDPFPGYLDI(Psl0588、配列番号268)、ADWNEGRKLDI(Psl0567、配列番号269)、ADWDHKHALDI(Psl0337、配列番号270)、ATDEADHALDI(Psl0170、配列番号271)、ADWSGTRALDI(Psl0304,配列番号272)、GLPEKPHALDI(Psl0348、配列番号273)、SLFTDDHALDI(Psl0573、配列番号274)、ASPGVVHALDI(Psl0574、配列番号275)、AHIESHHALDI(Psl0582、配列番号276)、ATQAPAHALDI(Psl0584、配列番号277)、SQHDLEHALDI(Psl0585、配列番号278)、およびAMPDMPHALDI(Psl0589、配列番号279)から成る群から選択され、VL CDR1は、RASQSIRSHLN(配列番号50)であり、VL CDR2は、GASNLQS(配列番号51)であり、また、VL CDR3は、以下:QQSTGAWNW(Psl0096、配列番号280)、QQDFFHGPN(Psl0225、配列番号281)、QQSDTFPLK(Psl0588、配列番号282)、QQSYSFPLT(WapR0004、Psl0567、Psl0573、Psl00574、Psl0582、Psl0584、Psl0585、配列番号52)、QDSSSWPLT(Psl0337、配列番号283)、SQSDTFPLT(Psl0170、配列番号284)、GQSDAFPLT(Psl0304、配列番号285)、LQGDLWPLT(Psl0348、配列番号286)、およびQQSLEFPLT(Psl0589、配列番号287)から成る群から選択され、ここで、VHおよびVL CDRは、Kabat番号付けシステムに従う。
特定の実施形態は、各々が相補性決定領域1(CDR1)、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリンVHおよび免疫グロブリンVLを含有するシュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、VH CDR1は、PYYWT(配列番号47)であり、VH CDR2は、YIHSSGYTDYNPSLKS(配列番号48)であり、VL CDR1は、RASQSIRSHLN(配列番号50)であり、VL CDR2は、GASNLQS(配列番号51)であり、また、VH CDR3およびVL CDR3は、それぞれ、ADWDRLRALDI(Psl0096、配列番号258)およびQQSTGAWNW(Psl0096、配列番号280);AMDIEPHALDI(Psl0225、配列番号267)およびQQDFFHGPN(Psl0225、配列番号281);ADDPFPGYLDI(Psl0588、配列番号268)およびQQSDTFPLK(Psl0588、配列番号282);ADWNEGRKLDI(Psl0567、配列番号269)およびVL CDR3はQQSYSFPLT(WapR0004、Psl0567、Psl0573、Psl00574、Psl0582、Psl0584、Psl0585、配列番号52)であり;ADWDHKHALDI(Psl0337、配列番号270)およびQDSSSWPLT(Psl0337、配列番号283);ATDEADHALDI(Psl0170、配列番号271)およびSQSDTFPLT(Psl0170、配列番号284);ADWSGTRALDI(Psl0304,配列番号272)およびGQSDAFPLT(Psl0304、配列番号285);GLPEKPHALDI(Psl0348、配列番号273)および(Psl0348、配列番号286);SLFTDDHALDI(Psl0573、配列番号274)および配列番号52;ASPGVVHALDI(Psl0574、配列番号275)および配列番号52;AHIESHHALDI(Psl0582、配列番号276)および配列番号52;ATQAPAHALDI(Psl0584、配列番号277)および配列番号52;SQHDLEHALDI(Psl0585、配列番号278)および配列番号52;またはAMPDMPHALDI(Psl0589、配列番号279)およびQQSLEFPLT(Psl0589、配列番号287)を含む。
特定の実施形態は、免疫グロブリンVHおよび免疫グロブリンVLを含むシュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、VHは、
(X1は、GまたはCである)(Psl0096、配列番号288)を含み、また、VLは、
(X2は、GまたはCである)(Psl0096、配列番号289)を含み;ここで、VHは、QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAMDIEPHALDIWGQGTMVTVSS(Psl0225、配列番号290)を含み、また、VLは、DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDDGFPNFGGGTKVEIK(Psl0225、配列番号291)を含み;ここで、VHは、QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADDPFPGYLDIWGQGTMVTVSS(Psl0588、配列番号292)を含み、またVLは、DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDTFPLKFGGGTKVEIK(Psl0588、配列番号293)を含み;VHは、QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADWNEGRKLDIWGQGTMVTVSS(Psl0567、配列番号294)を含み、また、VLは、配列番号11を含み;ここで、VHは、QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADWDHKHALDIWGQGTMVTVSS(Psl0337、配列番号295)を含み、また、VLは、DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQDSSSWPLTFGGGTKVEIK(Psl0337、配列番号296)を含み;ここで、VHは、EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARATDEADHALDIWGQGTLVTVSS(Psl0170、配列番号297)を含み、また、VLは、EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSDTFPLTFGGGTKLEIK(Psl0170、配列番号298)を含み;ここで、VHは、EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARADWSGTRALDIWGQGTLVTVSS(Psl0304、配列番号299)を含み、また、VLは、EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCWASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSDAFPLTFGGGTKLEIK(Psl0304、配列番号300)を含み;ここで、VHは、EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARGLPEKPHALDIWGQGTLVTVSS(Psl0348、配列番号301)を含み、また、VLは、EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGDLWPLTFGGGTKLEIK(Psl0348、配列番号302)を含み;ここで、VHは、EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARSLFTDDHALDIWGQGTLVTVSS(Psl0573、配列番号303)を含み、また、VLは、配列番号11を含み;ここで、VHは、EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARASPGVVHALDIWGQGTLVTVSS(Psl0574、配列番号304)を含み、また、VLは、配列番号11を含み;ここで、VHは、EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARAHIESHHALDIWGQGTLVTVSS(Psl0582、配列番号305)を含み、また、VLは、配列番号11を含み;ここで、VHは、EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARATQAPAHALDIWGQGTLVTVSS(Psl0584、配列番号306)を含み、また、VLは、配列番号11を含み;ここで、VHは、EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARSQHDLEHALDIWGQGTLVTVSS(Psl0585、配列番号307)を含み、また、VLは、配列番号11を含み;ここで、VHは、EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARAMPDMPHALDIWGQGTLVTVSS(Psl0589、配列番号308)を含み;ここで、VLは、EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLEFPLTFGGGTKLEIK(Psl0589、配列番号325)を含む。
また、式VH−L−VL、あるいは、VL−L−VH(Lは、リンカー配列である)を含む、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離抗体一本鎖Fv(ScFv)断片(「抗PslScFv」)も開示される。特定の態様において、リンカーは、(a)[GGGGS]n(nは、0、1、2、3、4、もしくは5である)、(b)[GGGG]n(nは、0、1、2、3、4、もしくは5である)、または(a)および(b)の組み合わせを含み得る。例えば、リンカーの一例は、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号326)を含む。特定の実施形態では、リンカーは、リンカーのC末端にアミノ酸アラニン−ロイシンをさらに含む。特定の実施形態では、抗PslScFvは、配列番号240、配列番号241、配列番号242、配列番号243、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252、配列番号253、配列番号254、または配列番号262のアミノ酸配列を含む。
また、式VH−L−VL、あるいは、VL−L−VH(Lは、リンカー配列である)を含む、シュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する単離抗体一本鎖Fv(ScFv)断片(「抗PcrVScFv」)も開示される。特定の態様において、リンカーは、(a)[GGGGS]n(nは、0、1、2、3、4、もしくは5である)、(b)[GGGG]n(nは、0、1、2、3、4、もしくは5である)、または(a)および(b)の組み合わせを含み得る。例えば、リンカーの一例は、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号326)を含む。特定の実施形態では、リンカーは、リンカーのC末端にアミノ酸アラニン−ロイシンをさらに含む。
さらに、配列番号216または配列番号217と少なくとも80%、85%、90%、95%もしくは100%同一である免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)および/または軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列を含むシュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も開示される。
さらにまた、VHを含む、シュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、VHのVHCDR1、VHCDR2もしくはVHCDR3領域の1つまたは複数が、表3に示す配列番号218〜220の1つもしくは複数の1つまたは複数の参照重鎖VHCDR1、VHCDR2および/もしくはVHCDR3アミノ酸配列と同一であるか、または4つ、3つ、2つ、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一である、単離結合分子も開示される。従って、この実施形態によれば、VHは、表3に示すVHCDR1、VHCDR2もしくはVHCDR3アミノ酸配列の1つまたは複数と同一であるか、または4つ、3つ、2つ、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一であるVHCDR1、VHCDR2、もしくはVHCDR3の1つもしくは複数を含む。
さらには、VLを含む、シュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、VLのVLCDR1、VLCDR2もしくはVLCDR3領域の1つまたは複数が、表3に示す配列番号221〜223の1つもしくは複数の1つまたは複数の参照軽鎖VLCDR1、VLCDR2および/もしくはVLCDR3アミノ酸配列と同一であるか、または4つ、3つ、2つ、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一である、単離結合分子も提供される。従って、この実施形態によれば、VLは、表3に示すVLCDR1、VLCDR2、もしくはVLCDR3アミノ酸配列の1つまたは複数と同一であるか、または4つ、3つ、2つ、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一であるVLCDR1、VLCDR2もしくはVLCDR3の1つもしくは複数を含む。
また、VHおよびVLを含む、シュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、VHが、配列番号255および配列番号257から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、また、VLが、配列番号256のアミノ酸配列を含む、単離結合分子も提供される。
さらに、各々がCDR1、CDR2、およびCDR3を含む、VHおよびVLを含む、シュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も提供され、ここで、VH CDR1は、(a)SYAMS(配列番号311)、または1つ、2つ、3つ、もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントであり、VH CDR2は、AISGSGYSTYYADSVKG(配列番号312)、または1つ、2つ、3つ、もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントであり、VH CDR3は、EYSISSNYYYGMDV(配列番号313)、または1つ、2つ、3つ、もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントであるか;あるいは(b)VL CDR1は、WASQGISSYLA(配列番号314)、または1つ、2つ、3つ、もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントであり、VL CDR2は、AASTLQS(配列番号315)、または1つ、2つ、3つ、もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントであり、VL CDR3は、QQLNSSPLT(配列番号316)、または1つ、2つ、3つ、もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントであるか;あるいは(c)(a)および(b)の組み合わせであり、ここで、VHおよびVL CDRは、Kabat番号付けシステムに従う。この実施形態の特定の態様では、(a)VHは、配列番号317と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含み、(b)VLは、配列番号318と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含むか;あるいは(c)(a)および(b)の組み合わせである。
さらにまた、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよびシュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する単離二重特異性結合分子、例えば、二重特異性抗体またはその抗原結合断片も開示され、この分子は、配列番号228、配列番号229、もしくは配列番号235と少なくとも80%、85%、90%、95%、または100%同一の免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)および/または軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、本明細書に開示する二重特異性抗体は、BS1、BS2、BS3、またはBS4の構造を有し、これらは全て、図17に示す。本明細書に開示する特定の二重特異性抗体において、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する結合ドメインは、抗PslScFv分子を含む。他の態様では、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する結合ドメインは、通常の重鎖および軽鎖を含む。同様に、本明細書に開示する特定の二重特異性抗体において、シュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する結合ドメインは、抗PcrVScFv分子を含む。他の態様では、シュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する結合ドメインは、通常の重鎖および軽鎖を含む。
特定の実施形態において、本明細書に開示する二重特異性抗体は、2012年4月16日に提出された米国仮特許出願第61/624,651号明細書および2012年11月6日に提出された国際出願PCT/US2012/63639号明細書(代理人整理番号AEMS−115WO1、名称「MULTISPECIFIC AND MULTIVALENT BINDING PROTEINS AND USES THEREOF」)(これらは、参照により全体として本明細書に組み込まれる)に詳細に開示されているBS4構造を有した。例えば、本開示は、抗PslScFv分子が、抗PcrV抗体またはその断片の各重鎖のヒンジ領域に挿入されている二重特異性抗体を提供する。
本開示は、抗体重鎖および抗体軽鎖を含む単離結合分子、例えば、二重特異性抗体を提供し、ここで、抗体重鎖は、式VH−CH1−H1−L1−S−L2−H2−CH2−CH3を含み、式中、CH1は、重鎖定常領域ドメイン−1であり、H1は、第1重鎖ヒンジ領域断片であり、L1は、第1リンカーであり、Sは、抗PcrVScFv分子であり、L2は、第2リンカーであり、H2は、第2重鎖ヒンジ領域断片であり、CH2は、重鎖定常領域ドメイン−2であり、CH3は、重鎖定常領域ドメイン−3である。特定の態様では、VHは、配列番号255、配列番号257、または配列番号317のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、L1およびL2は、同一のまたは異なっており、独立して、(a)[GGGGS]n(nは、0、1、2、3、4、もしくは5である)、(b)[GGGG]n(nは、0、1、2、3、4、もしくは5である)、または(a)および(b)の組み合わせを含む。特定の実施形態では、H1は、EPKSC(配列番号320)を含み、H2は、DKTHTCPPCP(配列番号321)を含む。
特定の態様において、Sは、配列番号240、配列番号241、配列番号242、配列番号243、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252、配列番号253、配列番号254、もしくは配列番号262のアミノ酸配列、またはこれらのアミノ酸配列の2つ以上の任意の組み合わせを有する抗PslScFv分子を含む。
さらなる態様において、CH2−CH3は、(配列番号322)を含み、ここで、X1は、MまたはYであり、X2は、SまたはTであり、X3はTまたはEである。別の態様では、抗体軽鎖は、VL−CLを含み、ここで、CLは、抗体軽鎖κ定常領域または抗体軽鎖λ定常領域である。別の態様では、VLは、配列番号256または配列番号318のアミノ酸配列を含む。CLは、例えば、配列番号323のアミノ酸配列を含み得る。
さらに、配列番号264を含むVHと、配列番号263のアミノ酸配列を含むVLを含む、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよびシュードモナス属(Pseudomonas)PcrVの両方に特異的に結合する、単離結合分子、例えば、二重特異性抗体が提供される。
一部の実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、タンデム一本鎖(sc)Fv断片であってよく、これは、リンカー(例えば、ポリペプチドリンカー)により互いに共有結合的にテザリングされた2つの異なるscFv断片(すなわち、V2L2およびW4)を含有する(Ren−Heidenreich et al.Cancer 100:1095−1103(2004);Korn et al.J Gene Med 6:642−651(2004))。いくつかの実施形態では、リンカーは、CH1ドメインなどの重鎖ポリペプチド定常領域の全部もしくは一部を含有するか、またはこの領域であり得る。いくつかの実施形態では、2つの抗体断片は、米国特許第7,112,324号明細書および第5,525,491号明細書に記載されているように、ポリグリシン−セリンまたはポリセリン−グリシンリンカーによって共有結合することができる。二重特異性タンデムscFv抗体を作製する方法は、Maletz et al.Int J Cancer 93:409−416(2001);およびHonemann et al.Leukemia 18:636−644(2004)に記載されている。あるいは、抗体は、Zapata et al.Protein Eng.8:1057−1062(1995)に記載されているように、「線状抗体」であってもよい。手短には、これらの抗体は、1対の抗原結合領域を形成する1対のタンデムFdセグメント(VH−CH1−VH−CH1)を含む。
本開示はまた、Wu et al.(2007)Nat Biotechnol 25(11):1290−1297に記載の四価ドュアル可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig)分子などの二重特異性抗体のバリアント形態も包含する。DVD−Ig分子は、2つの異なる親抗体由来の2つの異なる軽鎖可変ドメイン(VL)が、組換えDNA技術により直接または短いリンカーを介してタンデムで連結され、これに軽鎖定常ドメインか続くように設計される。例えば、DVD−Ig軽鎖ポリペプチドは、(a)V2L2由来のVL;および(b)WapR−004由来のVLをタンデムで含有することができる。同様に、重鎖は、タンデムで連結された2つの異なる重鎖可変ドメイン(VH)と、これに続く定常ドメインCH1およびFc領域を含む。例えば、DVD−Ig重鎖ポリペプチドは、(a)V2L2由来のVH;および(b)WapR−004由来のVHをタンデムで含有することができる。この場合、細胞中の2つの鎖の発現によって、4つの抗原結合部位を含むヘテロテトラマーが形成され、その2つは、V2L2に特異的に結合し、2つはPslに特異的に結合する。2つの親抗体からDVD−Ig分子を生成する方法は、例えば、PCT公開番号:国際公開第2008/024188号パンフレットおよび国際公開第2007/024715号パンフレットにさらに記載されている。
ある実施形態において、本明細書に記載の単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、または10-15M以下の解離定数(KD)を特徴とする親和性でシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する。
具体的な実施形態において、本明細書に記載の単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、約1×10-10から約1×10-6Mの範囲の解離定数(KD)を特徴とする親和性でシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する。一実施形態において、本明細書に記載の単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載のOCTET(登録商標)結合アッセイにより測定される約1.18×10-7MのKDを特徴とする親和性でシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する。別の実施形態において、本明細書に記載の単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載のOCTET(登録商標)結合アッセイにより測定される約1.44×10-7MのKDを特徴とする親和性でシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する。
一部の実施形態は、(a)上皮細胞への緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の付着を阻害することができ、(b)緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを促進することができ、または(c)上皮細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)の付着を阻害することができ、しかも、緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを促進することができる上記単離結合分子、例えば、前述したような抗体またはその断片を含む。
一部の実施形態において、上記単離結合分子、例えば、抗体またはその断片において、上皮細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)付着の最大阻害は、約50μg/ml以下、5.0μg/ml以下、もしくは約0.5μg/ml以下の抗体濃度、または約30μg/mlから約0.3μg/mlの範囲の抗体濃度、または約1μg/mlの抗体濃度、または約0.3μg/mlの抗体濃度において達成される単離結合分子、例えば、抗体またはその断片。
特定の実施形態は、OPK EC50が、約0.5μg/ml未満、約0.05μg/ml未満、もしくは約0.005μg/ml未満であり、また、OPK EC50が、約0.001μg/mlから約0.5μg/mlの範囲であり、またはOPK EC50が、約0.02μg/mlから約0.08μg/mlの範囲であり、またはOPK EC50は、約0.002μg/mlから約0.01μg/mlの範囲であり、またはOPK EC50は、約0.2μg/ml未満であり、またはOPK EC50は、約0.02μg/ml未満である、上記単離結合分子、例えば、前述したような抗体またはその断片を含む。ある実施形態において、本明細書に記載の抗シュードモナス属(Pseudomona)Psl結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、モノクローナル抗体WapR−004、WapR−004RAD、Cam−003、Cam−004、もしくはCam−005と同一のPslエピトープに特異的に結合し、またはそのようなモノクローナル抗体をシュードモナス属(Pseudomonas)Pslへの結合から競合阻害する。WapR−004RADは、配列番号11のVHアミノ酸配列のアミノ酸置換G98Aを除いてWapR−004と同一である。
一部の実施形態は、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145;または配列番号146の1つまたは複数と同一、または1、2、3、4、5つ以上のアミノ酸置換を除いて同一のscFv−Fc分子アミノ酸配列を含むWapR−004(W4)突然変異体を含む。
他の実施形態は、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145;または配列番号146の1つまたは複数と少なくとも80%、85%、90% 95%または100%同一のscFv−Fc分子アミノ酸配列を含むWapR−004(W4)突然変異体を含む。
一部の実施形態において、本明細書に記載の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Psl結合分子、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、モノクローナル抗体WapR−001、WapR−002、もしくはWapR−003と同一のエピトープに特異的に結合し、またはそのようなモノクローナル抗体をシュードモナス属(Pseudomonas)Pslへの結合から競合阻害する。
ある実施形態において、本明細書に記載の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Psl結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、モノクローナル抗体WapR−016と同一のエピトープに特異的に結合し、またはそのようなモノクローナル抗体をシュードモナス属(Pseudomonas)Pslへの結合から競合阻害する。
特定の実施形態において、本明細書に記載の抗シュードモナス属(Pseudomonas)PcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、モノクローナル抗体V2L2と同一のPcrVエピトープに特異的に結合する、および/またはこうしたモノクローナル抗体がシュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに結合するのを競合阻害する。
例えば、ある態様では、抗シュードモナス属(Pseudomonas)PcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、V2L2および/またはV2L2−MDを含む。
ある実施形態において、本明細書に記載の抗シュードモナス属(Pseudomonas)PcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、モノクローナル抗体29D2と同一のPcrVエピトープに特異的に結合する、および/またはこうしたモノクローナル抗体がシュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに結合するのを競合阻害する。
本明細書に記載の任意の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、追加のポリペプチド、例えば、コードされるポリペプチドの分泌を指向させるためのシグナルペプチド、本明細書に記載の抗体定常領域、または本明細書に記載の他の異種ポリペプチドをさらに含み得る。さらに、本明細書の結合分子またはその断片は、他箇所に記載のポリペプチド断片を含む。さらに、本明細書に記載の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、本明細書に記載の融合ポリペプチド、Fab断片、scFv、または他の誘導体であり得る。
また、本明細書の他箇所により詳細に記載されるとおり、本開示は、本明細書に記載の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体を含む組成物を含む。
本明細書に記載の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、それらが由来した天然に生じる結合ポリペプチドからのそれらのアミノ酸配列において変動するように改変することができることも当業者により理解される。例えば、設計されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、類似であり得、例えば、出発配列とある同一性パーセントを有し、例えば、それは出発配列と60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%同一であり得る。
当分野では公知のように、2つのポリペプチド配列間の「配列同一性」は、1つのポリペプチドのアミノ酸配列を第2のポリペプチドの配列と比較することにより決定する。本明細書において述べる場合、いずれか特定のポリペプチドが、別のポリペプチドと約70%、75%、80%、85%、90%、または95%同一であるかどうかは、当分野において公知の方法およびコンピュータプログラム/ソフトウエア、例えば、限定されるものではないが、BESTFITプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix (登録商標),Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)を使用して決定することができる。BESTFITは、Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics 2:482−489(1981)の局所相同性アルゴリズムを使用して2つの配列間の相同性の最良のセグメントを見出す。特定の配列が、例えば参照配列と95%同一かどうかを決定するためにBESTFITまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、パラメータは、無論、同一性の割合が参照ポリペプチド配列の全長にわたり計算され、参照配列中のアミノ酸の総数の5%までの相同性のギャップが許容されるように設定される。
「配列同一性」の割合はまた、比較ウインドウにわたって2つの最適にアラインメントした配列を比較することにより決定することもできる。比較用の配列を最適にアラインメントするために、比較ウインドウ内中のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの部分は、ギャップと呼ばれる付加または欠失を含み得るが、参照配列は一定に維持する。最適なアラインメントは、ギャップがある場合でも、参照および比較配列間の可能な限り大きな数の「同一」位置をもたらすアラインメントである。2つの配列間の「配列同一性」パーセントの決定は、2004年9月1日現在、国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)から入手可能なプログラムのバージョン「BLAST 2 Sequences」を用いて決定することができ、このプログラムは、プログラムBLASTN(ヌクレオチド配列比較用)およびBLASTP(ポリペプチド配列比較用)を組み込んでおり、これらのプログラムは、KarlinおよびAltschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(12):5873−5877,1993)に基づく。「BLAST 2 Sequences」を使用する場合、2004年9月1日現在のデフォルトパラメータであるパラメータは、語長(3)、オープンギャップペナルティ(11)、伸張ギャップペナルティ(1)、ギャップドロップオフ(50)、例外値(10)およびいずれか他の要求されるパラメータ、限定されるものではないが、マトリックスオプションなどに用いることができる。
さらに、「非必須」アミノ酸領域における保存的置換または変化に導くヌクレオチドまたはアミノ酸置換、欠失、または挿入を作製することができる。例えば、設計されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、1つまたは複数の個々のアミノ酸置換、挿入、または欠失、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20以上の個々のアミノ酸置換、挿入、または欠失を除いて出発配列と同一であり得る。ある実施形態において、設計されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、出発配列に対して1から5、1から10、1から15、または1から20の個々のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する。
本明細書に記載の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、融合タンパク質を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなり得る。融合タンパク質は、例えば、少なくとも1つの標的結合部位、および少なくとも1つの異種部分、すなわち、天然で自然に結合しない部分を有する免疫グロブリン抗原結合ドメインを含むキメラ分子である。アミノ酸配列は、通常、融合ポリペプチドに一緒になる別個のタンパク質中に存在し得、またはそれらは通常、同一タンパク質中に存在し得るが、融合ポリペプチド中の新たな配置で配置される。融合タンパク質は、例えば、化学合成により、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作出および翻訳することにより作出することができる。
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または他の部分に適用される用語「異種」は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または他の部分が比較されている実体の残部から区別される実体に由来することを意味する。非限定的な例において、結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体に融合すべき「異種ポリペプチド」は、同一種の非免疫グロブリンポリペプチド、または異なる種の免疫グロブリンもしくは非免疫グロブリンポリペプチドに由来する。
IV.融合タンパク質および抗体コンジュゲート
一部の実施形態において、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、コンジュゲート形態で複数回投与することができる。さらに別の実施形態において、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、未コンジュゲート形態で投与し、次いでコンジュゲート形態で投与することができ、またはその逆で投与することができる。
一部の実施形態において、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、コンジュゲート形態で複数回投与することができる。さらに別の実施形態において、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、未コンジュゲート形態で投与し、次いでコンジュゲート形態で投与することができ、またはその逆で投与することができる。
具体的な実施形態において、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、1つまたは複数の抗菌剤、例えば、ポリミキシンB(PMB)にコンジュゲートすることができる。PMBは、多剤耐性グラム陰性感染の治療について承認された小分子リポペプチド抗生物質である。PMBは、その殺菌活性に加え、リポ多糖(LPS)に結合し、その炎症促進効果を中和する。(Dixon,R.A.& Chopra,I.J Antimicrob Chemother 18,557−563(1986))。LPSは、炎症およびグラム陰性敗血症の発症に顕著に寄与すると考えられている。(Guidet,B.,et al.,Chest 106,1194−1201(1994))。担体分子へのPMBのコンジュゲートは、内毒素血症および感染の動物モデルにおいてLPSを中和し、保護を媒介することが示されている。(Drabick,J.J.,et al.Antimicrob Agents Chemother 42,583−588(1998))。1つまたは複数のPMB分子を、本開示のモノクローナル抗体(mAb)のFc領域中に導入されたシステイン残基に付着する方法も開示される。例えば、Cam−003−PMBコンジュゲートは、緑膿菌(P.aeruginosa)への特異的なmAb媒介結合を保持し、OPK活性も保持した。さらに、mAb−PMBコンジュゲートは、インビトロでLPSに結合し、それを中和した。具体的な実施形態において、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、抗生物質(例えば、シプロフロキサシン、メロペネム、トブラマイシン、アズトレオナム)と併用することができる。
ある実施形態において、本明細書に記載の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、抗体と通常会合していない異種アミノ酸配列または1つまたは複数の他の部分(例えば、抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物学的応答改質剤、医薬剤、リンホカイン、異種抗体またはその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール(PEG)、および任意の前記薬剤の2つ以上の組み合わせ)を含み得る。さらなる実施形態において、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、または任意の前記検出可能な標識の2つ以上の組み合わせからなる群から選択される検出可能な標識を含み得る。
V.結合分子をコードするポリヌクレオチド
本明細書に記載の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードする核酸分子も、本明細書において提供される。
本明細書に記載の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードする核酸分子も、本明細書において提供される。
一実施形態は、表2に示す配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号74、または配列番号216の1つまたは複数と少なくとも80%、85%、90%、95%もしくは100%同一である免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列をコードする核酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。
一実施形態は、配列番号257または配列番号259の免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列をコードする核酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。例えば、それぞれ、配列番号261、および配列番号259の核酸配列。
別の実施形態は、表2に示す配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号74、または配列番号216の1つもしくは複数と同一であるか、あるいは1、2、3、4、5つ以上のアミノ酸置換を除いて同一であるVHアミノ酸配列をコードする核酸を含む、本質的にそれから構成される、またはそれから構成される単離ポリヌクレオチドを提供する。
さらに別の実施形態は、VHをコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドであって、VHのVHCDR1、VHCDR2またはVHCDR3領域の1つまたは複数は、表2に示す配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号74、または配列番号216の1つもしくは複数の1つもしくは複数の参照重鎖VHCDR1、VHCDR2および/またはVHCDR3アミノ酸配列と同一であるか、あるいは4、3、2、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一である単離ポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態は、VHを含むシュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドであって、VHのVHCDR1、VHCDR2またはVHCDR3領域の1つまたは複数は、表2に示す配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、または配列番号74の1つまたは複数の1つまたは複数の参照重鎖VHCDR1、VHCDR2および/またはVHCDR3アミノ酸配列と同一、または4、3、2、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一の単離ポリヌクレオチドを提供する。
さらなる実施形態は、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的または優先的に結合するポリヌクレオチドによりコードされるVHを含む単離結合分子、例えば、抗体または抗原結合断片を提供する。
別の実施形態は、表2に示す配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、または配列番号217の1つもしくは複数と少なくとも80%、85%、90% 95%または100%同一の免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列をコードする核酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態は、配列番号256の免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列をコードする核酸、例えば、配列番号260の核酸配列を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。
さらなる実施形態は、表2に示す配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、または配列番号217の1つもしくは複数と同一であるか、あるいは1、2、3、4、5つ以上のアミノ酸置換を除いて同一であるVLアミノ酸配列をコードする核酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態は、VLをコードする核酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドであって、VLのVLCDR1、VLCDR2またはVLCDR3領域の1つもしくは複数は、表2に示す配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、もしくは配列番号16、または配列番号217の1つもしくは複数の1つもしくは複数の参照軽鎖VLCDR1、VLCDR2またはVLCDR3アミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%または100%同一である単離ポリヌクレオチドを提供する。
さらなる実施形態は、VLを含むシュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドであって、VLのVLCDR1、VLCDR2またはVLCDR3領域の1つもしくは複数は、表2に示す配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、または配列番号217の1つもしくは複数の1つもしくは複数の参照重鎖VLCDR1、VLCDR2および/またはVLCDR3アミノ酸配列と同一であるか、または4、3、2、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一である単離ポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態において、ポリヌクレオチドによりコードされるVLを含む単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的または優先的に結合する。
一実施形態は、VHおよびVLを含むscFv分子をコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドであって、scFvは、表4に示す配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、または配列番号70の1つまたは複数と少なくとも80%、85%、90% 95%または100%同一である単離ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態において、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する上記ポリヌクレオチドの1つまたは複数によりコードされる単離抗体またはその抗原結合断片は、(a)それぞれ、配列番号1および配列番号2、(b)それぞれ、配列番号3および配列番号2、(c)それぞれ、配列番号4および配列番号2、(d)それぞれ、配列番号5および配列番号6、(e)それぞれ、配列番号7および配列番号8、(f)それぞれ、配列番号9および配列番号10、(g)それぞれ、配列番号11および配列番号12、(h)それぞれ、配列番号13および配列番号14;(i)それぞれ、配列番号15および配列番号16;または(j)それぞれ、配列番号74および配列番号12と少なくとも80%、85%、90%、95%または100%同一のVHおよびVLアミノ酸配列を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる。
ある実施形態において、上記ポリヌクレオチドの1つまたは複数によりコードされる単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、または10-15M以下の解離定数(KD)を特徴とする親和性でシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する。
具体的な実施形態において、上記ポリヌクレオチドの1つまたは複数によりコードされる単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、約1×10-10Mから約1×10-6Mの範囲の解離定数(KD)を特徴とする親和性でシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する。一実施形態において、上記ポリヌクレオチドの1つまたは複数によりコードされる単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載のOCTET(登録商標)結合アッセイにより測定される約1.18×10-7Mの解離定数(KD)を特徴とする親和性でシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する。別の実施形態において、上記ポリヌクレオチドの1つまたは複数によりコードされる単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載のOCTET(登録商標)結合アッセイにより測定される約1.44×10-7MのKDを特徴とする親和性でシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する。
特定の実施形態において、上記ポリヌクレオチドの1つもしくは複数によりコードされる抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、モノクローナル抗体WapR−004、WapR−004RAD、Cam−003、Cam−004、もしくはCam−005と同一のPslエピトープに特異的に結合するか、またはそのようなモノクローナル抗体をシュードモナス属(Pseudomonas)Pslへの結合から競合阻害し;ならびに/またはモノクローナル抗体V2L2と同一のPcrVエピトープに特異的に結合するか、またはそのようなモノクローナル抗体をシュードモナス属(Pseudomonas)Pslへの結合から競合阻害する。WapR−004RADは、配列番号11のVHアミノ酸配列をコードするVH核酸配列の核酸置換G293C(配列番号71の317位におけるVHコード部分中のヌクレオチドの置換)を除いてWapR−004と同一である。WapR−004RAD VHをコードする核酸配列は配列番号76として提示する。
一部の実施形態は、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145;または配列番号146の1つまたは複数と同一、または1、2、3、4、5つ以上のアミノ酸置換を除いて同一のW4突然変異体scFv−Fc分子アミノ酸配列をコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。
他の実施形態は、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145;または配列番号146の1つまたは複数と少なくとも80%、85%、90% 95%または100%同一のW4突然変異体scFv−Fc分子アミノ酸配列をコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。
一実施形態は、W4突然変異体scFv−Fc分子をコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドであって、核酸は、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、または配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号190、配列番号191、配列番号192、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214;または配列番号215の1つまたは複数と少なくとも80%、85%、90% 95%または100%同一である単離ポリヌクレオチドを提供する。
一実施形態は、V2L2ポリペプチドをコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドであって、核酸が、配列番号238または配列番号239の1つまたは複数と少なくとも80%、85%、90%、95%または100%同一である単離ポリヌクレオチドを提供する。
他の実施形態において、上記ポリヌクレオチドの1つまたは複数によりコードされる抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、モノクローナル抗体WapR−001、WapR−002、もしくはWapR−003と同一のエピトープに特異的に結合し、またはそのようなモノクローナル抗体をシュードモナス属(Pseudomonas)Pslへの結合から競合阻害する。
ある実施形態において、上記ポリヌクレオチドの1つまたは複数によりコードされる抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、モノクローナル抗体WapR−016と同一のエピトープに特異的に結合し、またはそのようなモノクローナル抗体をシュードモナス属(Pseudomonas)Pslへの結合から競合阻害する。
本開示は、本明細書の他箇所に記載のポリヌクレオチドの断片も含む。さらに、上記の融合ポリヌクレオチド、Fab断片、および他の誘導体をコードするポリヌクレオチドも提供される。
ポリヌクレオチドは、当分野において公知の任意の方法により産生または製造することができる。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学合成オリゴヌクレオチドからアセンブルすることができ(例えば、Kutmeier et al.,BioTechniques 17:242(1994)に記載のとおり)、手短に述べると、抗体をコードする配列の部分を含有する重複オリゴヌクレオチドを合成し、それらのオリゴヌクレオチドをアニールおよびライゲートし、次いでライゲートされたオリゴヌクレオチドのPCRによる増幅を含む。
あるいは、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、好適な資源からの核酸から生成することができる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンは入手可能でないが、抗体分子の配列が既知の場合、抗体をコードする核酸は、化学合成することができ、または好適な資源(例えば、抗体cDNAライブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞もしくは例えば抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞から生成されたcDNAライブラリー、またはそれから単離された核酸、好ましくは、ポリA+RNA)から、配列の3’および5’末端にハイブリダイズする合成プライマーを使用するPCR増幅により、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングにより、例えば抗体をコードするcDNAライブラリーからのcDNAクローンを同定することにより得ることができる。次いで、PCRにより生成された増幅核酸を、当分野において周知の任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクター中にクローニングすることができる。
抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を決定したら、そのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作の分野において周知の方法、例えば、組換えDNA技術、部位特異的突然変異導入、PCRなどを使用して操作して(例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)およびAusubel et al.,eds.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY(1998)に記載の技術参照、これらは両方とも参照により全体として本明細書に組み込まれる)、例えば、アミノ酸置換、欠失、および/または挿入を作出するために異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成することができる。
抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、未改変RNAもしくはDNAまたは改変RNAもしくはDNAであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成することができる。例えば、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、1本鎖および2本鎖DNA、1本鎖および2本鎖領域の混合物であるDNA、1本鎖および2本鎖RNA、ならびに1本鎖および2本鎖領域の混合物であるRNA、1本鎖またはより典型的には2本鎖または1本鎖および2本鎖領域の混合物であり得るDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子から構成することができる。さらに、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、RNAもしくはDNAまたはRNAおよびDNAの両方を含む3本鎖領域から構成することができる。抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、1つまたは複数の改変塩基または安定性もしくは他の理由のために改変されたDNAもしくはRNA骨格も含有し得る。「改変」塩基には、例えば、トリチル化塩基および特殊塩基、例えば、イノシンが含まれる。種々の改変をDNAおよびRNAに作製することができ;したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的改変形態を包含する。
免疫グロブリン(例えば、免疫グロブリン重鎖部分または軽鎖部分)に由来するポリペプチドの非天然バリアントをコードする単離ポリヌクレオチドは、1つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされるタンパク質中に導入されるように、1つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列中に導入することにより作出することができる。突然変異は、標準的な技術、例えば、部位特異的突然変異導入およびPCR媒介突然変異導入により導入することができる。保存的アミノ酸置換は、1つまたは複数の非必須アミノ酸残基において作製することができる。
VI.抗体ポリペプチドの発現
周知のとおり、RNAは、元のハイブリドーマ細胞または他の形質転換細胞から標準的な技術、例えば、グアニジニウムイソチオシアネート抽出および沈殿に続く遠心分離またはクロマトグラフィーにより単離することができる。所望により、mRNAは、総RNAから標準的な技術、例えば、オリゴdTセルロース上でのクロマトグラフィーにより単離することができる。好適な技術は、当分野において知られている。
周知のとおり、RNAは、元のハイブリドーマ細胞または他の形質転換細胞から標準的な技術、例えば、グアニジニウムイソチオシアネート抽出および沈殿に続く遠心分離またはクロマトグラフィーにより単離することができる。所望により、mRNAは、総RNAから標準的な技術、例えば、オリゴdTセルロース上でのクロマトグラフィーにより単離することができる。好適な技術は、当分野において知られている。
一実施形態において、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体の軽鎖および重鎖をコードするcDNAは、周知の方法に従って逆転写酵素およびDNAポリメラーゼを使用して同時または別個に作製することができる。PCRは、コンセンサス定常領域プライマーによりまたは公開されている重鎖および軽鎖DNAおよびアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーにより開始することができる。上記のとおり、PCRを使用して抗体軽鎖および重鎖をコードするDNAクローンを単離することもできる。この場合、ライブラリーはコンセンサスプライマーまたはより大きい相同プローブ、例えば、マウス定常領域プローブによりスクリーニングすることができる。
DNA、典型的には、プラスミドDNAは、当分野において公知の技術を使用して細胞から単離し、例えば、組換えDNA技術に関する上記の参照文献に詳細に記載される標準的な周知技術に従って制限マッピングおよび配列決定することができる。無論、DNAは、単離プロセスまたは後続の分析の間の任意の時点において本開示による合成物であり得る。
本開示の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体を提供するための単離遺伝子材料の操作後、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子をコードするポリヌクレオチドは、典型的には、所望量の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子を産生するために使用することができる宿主細胞中への導入のために発現ベクター中に挿入する。
抗体、またはその断片、誘導体もしくはアナログ、例えば、上記標的分子、例えば、Pslおよび/またはPcrVに結合する抗体の重鎖または軽鎖の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を要求する。本開示の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはその部分(重鎖または軽鎖可変ドメインを含有する)をコードするポリヌクレオチドを得たら、抗体分子産生のためのベクターを当分野において周知の技術を使用する組換えDNA技術により産生することができる。したがって、本明細書に記載のヌクレオチド配列をコードする抗体を含有するポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製する方法が本明細書に記載される。当業者に周知の方法を使用して抗体コード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。したがって、本開示は、プロモーターに作動可能に結合している本開示の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み得(例えば、PCT公開国際公開第86/05807号パンフレット;PCT公開国際公開第89/01036号パンフレット;および米国特許第5,122,464号明細書参照)、抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖全体の発現のためにそのようなベクター中にクローニングすることができる。
用語「ベクター」または「発現ベクター」は、所望遺伝子を宿主細胞中に導入し、および発現させるためのビヒクルとして本開示により使用されるベクターを意味するために本明細書において使用される。当業者に公知のとおり、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から容易に選択することができる。一般に、本開示と同等なベクターは、選択マーカー、所望遺伝子のクローニングならびに原核または真核細胞中への進入および/またはその細胞中での複製能を易化するための適切な制限部位を含む。
本開示の目的のため、多数の発現ベクター系を用いることができる。例えば、ベクターの1つのクラスは、動物ウイルス、例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス(RSV、MMTVまたはMOMLV)またはSV40ウイルスに由来するDNAエレメントを利用する。他には、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニック系の使用が含まれる。さらに、DNAを染色体中に統合させた細胞を、形質移入された宿主細胞の選択を可能とする1つまたは複数のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性(例えば、抗生物質)または重金属、例えば、銅耐性を提供し得る。選択可能マーカー遺伝子は、発現させるべきDNA配列に直接結合させ、または同一の細胞中に同時形質転換により導入することができる。追加のエレメントがmRNAの最適な合成に必要とされることもある。これらのエレメントには、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルが含まれ得る。
一部の実施形態において、クローニングされた可変領域遺伝子を上記の合成重鎖および軽鎖定常領域遺伝子(例えば、ヒト)とともに発現ベクター中に挿入する。無論、真核細胞中で発現を誘発し得る任意の発現ベクターを本開示において使用することができる。好適なベクターの例には、限定されるものではないが、プラスミドpcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER−HCMV、pUB6/V5−His、pVAX1、およびpZeoSV2(Invitrogen,San Diego,CAから入手可能)、およびプラスミドpCI(Promega,Madison,WIから入手可能)が含まれる。一般に、高レベルの免疫グロブリン重鎖および軽鎖を好適に発現するものについての大量の形質転換細胞のスクリーニングは、例えば、ロボットシステムにより実施することができる定型実験である。
より一般には、本開示の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体のモノマーサブユニットをコードするベクターまたはDNA配列を調製したら、発現ベクターを適切な宿主細胞中に導入することができる。宿主細胞中へのプラスミドの導入は、当業者に周知の種々の技術により達成することができる。これらには、限定されるものではないが、形質移入(電気泳動およびエレクトロポレーションを含む)、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープDNAとの細胞融合、マイクロインジェクション、およびインタクトウイルスによる感染が含まれる。Ridgway,A.A.G.“Mammalian Expression Vectors”Vectors,Rodriguez and Denhardt,Eds.,Butterworths,Boston,Mass.,Chapter 24.2,pp.470−472(1988)参照。典型的には、宿主中へのプラスミド導入は、エレクトロポレーションを介する。発現構築物を保有する宿主細胞は、軽鎖および重鎖の産生に適切な条件下で成長させ、重鎖および/または軽鎖タンパク質合成についてアッセイする。例示的アッセイ技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射免疫アッセイ(RIA)、または蛍光活性化細胞ソーター分析(FACS)、免疫組織化学などが含まれる。
発現ベクターを慣用の技術により宿主細胞に移し、次いで形質移入細胞を慣用の技術により培養して本明細書に記載の方法において使用される抗体を産生する。したがって、本開示は、異種プロモーターに作動可能に結合している抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。2本鎖抗体の発現についての一部の実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、下記に詳述するとおり免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞中で同時発現させることができる。
ある実施形態は、上記VHおよびVLをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドにより発現される結合分子またはその抗原結合断片は、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する単離ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、表4に示す配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、または配列番号70の1つまたは複数と少なくとも80%、85%、90% 95%または100%同一のVHおよびVLを含むscFv分子をコードする。
一部の実施形態は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に会合している。追加の実施形態において、本開示は、そのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。さらなる実施形態において、本開示は、ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に会合しており、好適な宿主細胞中でシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する結合分子を発現し得るベクターを提供する。
シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrVに特異的に結合する結合分子またはその断片を産生する方法であって、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを含有する宿主細胞を培養すること、および前記抗体、またはその断片を回収することを含む方法も提供される。さらなる実施形態において、本開示は、上記方法により産生される単離結合分子またはその断片を提供する。
本明細書において使用される「宿主細胞」は、組換えDNA技術を使用して構築され、少なくとも1つの異種遺伝子をコードするベクターを保有する細胞を指す。組換え宿主からの抗体の単離方法の記載において、用語「細胞」および「細胞培養物」は、特に明確に記載のない限り、抗体の資源を示すために互換的に使用される。換言すると、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠沈させた全細胞、または培地および懸濁細胞を両方含有する細胞培養物からのいずれかを意味し得る。
種々の宿主発現ベクター系を利用して本明細書に記載の方法において使用される抗体分子を発現させることができる。そのような宿主発現系は、対象のコード配列を産生することができ、続いて精製することができるビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換または形質移入された場合、インサイチューで本開示の抗体分子を発現し得る細胞も表す。これらには、限定されるものではないが、微生物、例えば、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターにより形質転換された細菌(例えば、大腸菌(E.coli)、枯草菌(B.subtilis);抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母(例えば、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ピチア属(Pichia));抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)により感染された昆虫細胞系;抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)により感染され、または組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)により形質転換された植物細胞系;または哺乳動物細胞のゲノム(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス(例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)に由来するプロモーターを含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BLK、293、3T3細胞)が含まれる。細菌細胞、例えば、大腸菌(Escherichia coli)、または真核細胞は、特に完全組換え抗体分子の発現のため、組換え抗体分子の発現に使用される。例えば、ベクター、例えばヒトサイトメガロウイルスからの主要前初期遺伝子プロモーターエレメントと連携する哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)は、抗体のための有効な発現系である(Foecking et al.,Gene 45:101(1986);Cockett et al.,Bio/Technology 8:2(1990)。
タンパク質発現に使用される宿主細胞系は、哺乳動物起源であることが多く;当業者には、発現させるべき所望の遺伝子産物に最良に適合する特定の宿主細胞系を決定することができる能力があると考えられている。例示的な宿主細胞系には、限定されるものではないが、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)、DG44およびDUXB11(チャイニーズハムスター卵巣系、DHFRマイナス)、HELA(ヒト子宮頸癌)、CVI(サル腎臓系)、COS(SV40T抗原を有するCVIの誘導体)、VERY、BHK(ベビーハムスター腎臓)、MDCK、293、WI38、R1610(チャイニーズハムスター線維芽細胞)BALBC/3T3(マウス線維芽細胞)、HAK(ハムスター腎臓系)、SP2/O(マウス骨髄腫)、P3x63−Ag3.653(マウス骨髄腫)、BFA−1c1BPT(ウシ内皮細胞)、RAJI(ヒトリンパ球)および293(ヒト腎臓)が含まれる。宿主細胞系は、典型的には、市販サービス、米国培養細胞系統保存機関(American Tissue Culture Collection)、または公開文献から入手可能である。
さらに、挿入配列の発現をモジュレートし、または望まれる規定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば、開裂)は、タンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾についての特徴および規定の機序を有する。適切な細胞系または宿主系を、発現される外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確保するように選択することができる。この目的のため、1次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。
組換えタンパク質の長期高収量産生のため、安定的発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞系をエンジニアリングすることができる。ウイルス複製起源を含有する発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)、および選択可能なマーカーにより制御されたDNAにより形質転換することができる。外来DNAの導入後、エンジニアリングされた細胞を強化培地中で1〜2日間成長させることができ、次いで選択培地にスイッチする。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをそれらの染色体中に安定的に統合させ、成長してフォーカスを形成することを可能とし、次いで細胞系中にクローニングおよび拡張することができる。この方法は、有利には、抗体分子を安定的に発現する細胞系をエンジニアリングするために使用することができる。
多数の選択系、例として、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al.,Cell 11:223(1977))、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202(1992))を使用することができ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al.,Cell 22:817 1980)遺伝子を、tk、hgprtまたはaprt細胞中でそれぞれ用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性を以下の遺伝子についての選択をベースとして使用することができる:メトトレキセート耐性を付与するdhfr(Wigler et al.,Natl.Acad.Sci.USA 77:357(1980);O’Hare et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527(1981));ミコフェノール酸耐性を付与するgpt(Mulligan & Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072(1981));アミノグリコシドG418耐性を付与するneo Clinical Pharmacy 12:488−505;Wu and Wu,Biotherapy 3:87−95(1991);Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573−596(1993);Mulligan,Science 260:926−932(1993);およびMorgan and Anderson,Ann.Rev.Biochem.62:191−217(1993);TIB TECH 11(5):155−215(May,1993)ならびにハイグロマイシン耐性を付与するhygro(Santerre et al.,Gene 30:147(1984)。使用することができる組換えDNA技術の分野において一般に公知の方法は、Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY(1993);Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990);およびChapters 12 and 13,Dracopoli et al.(eds),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley & Sons,NY(1994);Colberre−Garapin et al.,J.Mol.Biol.150:1(1981)に記載されており、それらは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅により増加させることができる(概説については、Bebbington and Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,Academic Press,New York,Vol.3.(1987)参照)。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させる。増幅領域が抗体遺伝子と会合するため、抗体の産生も増加する(Crouse et al.,Mol.Cell.Biol.3:257(1983))。
インビトロ産生は、大量の所望のポリペプチドを与えるためのスケールアップを可能とする。組織培養条件下での哺乳動物培養のための技術は、当分野において公知であり、それには、例えば、エアリフト反応器もしくは連続撹拌反応器中での均一懸濁液培養、または例えば、中空繊維、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上での固定化もしくは捕捉細胞培養が含まれる。必要および/または所望により、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的生合成の後または本明細書に記載のHICクロマトグラフィー工程の前またはその後、ポリペプチドの溶液を慣用のクロマトグラフィー法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、DEAE−セルロース上でのクロマトグラフィーまたは(免疫)親和性クロマトグラフィーにより精製することができる。
本明細書に開示の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードする構築物は、非哺乳動物細胞、例えば、細菌または酵母または植物細胞中で発現させることもできる。容易に核酸を取り込む細菌には、腸内細菌、例えば、大腸菌(Escherichia coli)またはサルモネラ属(Salmonella);バシラス科(Bacillaceae)、例えば、枯草菌(Bacillus subtilis)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、連鎖球菌属(Streptococcus)およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)の株のメンバーが含まれる。異種ポリペプチドは、細菌中で発現される場合、典型的には、封入体の一部になることがさらに認識される。異種ポリペプチドは、単離、精製し、次いで機能分子にアセンブルしなければならない。抗体の4価形態が望ましい場合、次いでサブユニットは4価抗体に自己組織化する(国際公開第02/096948A2号パンフレット)。
細菌系において、発現される抗体分子に意図される使用に応じて多数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、大量のそのようなタンパク質を産生すべき場合、抗体分子の医薬組成物の生成のため、容易に精製することができる高レベルの融合タンパク質産物の発現を指向するベクターが望ましいことがある。そのようなベクターには、限定されるものではないが、融合タンパク質が産生されるように抗体コード配列をベクター中にインフレームでlacZコード領域と個々にライゲートすることができる大腸菌(E.coli)発現ベクターpUR278(Ruther et al.,EMBO J.2:1791(1983));pINベクター(Inouye & Inouye,Nucleic Acids Res.13:3101−3109(1985);Van Heeke & Schuster,J.Biol.Chem.24:5503−5509(1989))などが含まれる。pGEXベクターを使用して外来ポリペプチドをグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させることもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、溶解細胞からマトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合に続く遊離グルタチオンの存在下での溶出により容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローニングされる標的遺伝子産物をGST部分から放出させることができるように、トロンビンまたはXa因子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計される。
原核生物に加え、真核微生物を使用することもできる。出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、または一般的なパン酵母が、真核微生物のうちで最も一般に使用されるが、多数の他の株、例えば、メタノール資化酵母(Pichia pastoris)が一般に利用可能である。
サッカロミセス属(Saccharomyces)における発現のため、例えば、プラスミドYRp7(Stinchcomb et al.,Nature 282:39(1979);Kingsman et al.,Gene 7:141(1979);Tschemper et al.,Gene 10:157(1980))が一般に使用される。このプラスミドは、トリプトファン中での成長能を欠く酵母の突然変異株、例えば、ATCC番号44076またはPEP4−1(Jones,Genetics 85:12(1977))のための選択マーカーを提供するTRP1遺伝子を既に含有する。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのtrpl傷害の存在は、トリプトファンの不存在下での成長による形質転換の検出に有効な環境を提供する。
昆虫系において、キンウワバ科(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)を典型的には、ベクターとして使用して外来遺伝子を発現させる。このウイルスは、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞中で成長する。抗体コード配列をウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)中に個々にクローニングし、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に配置することができる。
本開示の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体を組換え発現させたら、それを免疫グロブリン分子の精製についての分野において公知の任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインA後の特異的抗原についての親和性によるもの、およびサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差により、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術により精製することができる。本開示の抗体の親和性を増加させる別の方法は、米国特許出願公開第20020123057A1号明細書に開示されている。
VII.血清型無差別結合分子の同定
本開示は、優れたまたは所望の治療活性を有する血清型非依存性治療結合分子、例えば、抗体またはその断片を同定するための標的無差別全細胞アプローチを包含する。本方法を利用して感染作用物質、例えば、細菌病原体の不所望な活性をアンタゴナイズ、中和、クリアランス、または遮断し得る結合分子を同定することができる。当分野において公知のとおり、多くの感染作用物質は、それらのドミナント表面抗原の顕著なバリエーションを示し、それらが免疫学的監視を回避することを可能とする。本明細書に記載の同定法は、多くの異なるシュードモナス属(Pseudomonas)種または他のグラム陰性病原体に共有される抗原を標的化する結合分子を同定し得、したがって複数種からの複数の病原体を標的化し得る治療剤を提供する。例えば、本方法を利用して血清型非依存様式で緑膿菌(P.aeruginosa)の表面に結合し、細菌病原体に結合した場合、細菌細胞、例えば、細菌病原体、例えば、日和見シュードモナス属(Pseudomonas)種(例えば、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、およびシュードモナス・アルカリゲネス(Pseudomonas alcaligenes))に対するオプソニン食菌(OPK)活性を媒介、促進、または向上させ、および/または上皮細胞へのそのような細菌細胞の付着を阻害する一連の結合分子を同定することができる。
本開示は、優れたまたは所望の治療活性を有する血清型非依存性治療結合分子、例えば、抗体またはその断片を同定するための標的無差別全細胞アプローチを包含する。本方法を利用して感染作用物質、例えば、細菌病原体の不所望な活性をアンタゴナイズ、中和、クリアランス、または遮断し得る結合分子を同定することができる。当分野において公知のとおり、多くの感染作用物質は、それらのドミナント表面抗原の顕著なバリエーションを示し、それらが免疫学的監視を回避することを可能とする。本明細書に記載の同定法は、多くの異なるシュードモナス属(Pseudomonas)種または他のグラム陰性病原体に共有される抗原を標的化する結合分子を同定し得、したがって複数種からの複数の病原体を標的化し得る治療剤を提供する。例えば、本方法を利用して血清型非依存様式で緑膿菌(P.aeruginosa)の表面に結合し、細菌病原体に結合した場合、細菌細胞、例えば、細菌病原体、例えば、日和見シュードモナス属(Pseudomonas)種(例えば、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、およびシュードモナス・アルカリゲネス(Pseudomonas alcaligenes))に対するオプソニン食菌(OPK)活性を媒介、促進、または向上させ、および/または上皮細胞へのそのような細菌細胞の付着を阻害する一連の結合分子を同定することができる。
ある実施形態は、血清型無差別結合分子を同定する方法であって、(a)ナイーブおよび/または回復期抗体ライブラリーをファージ中で調製すること、(b)血清型特異的抗体をライブラリーから枯渇パニングにより除去すること、(c)血清型非依存性の全細胞に特異的に結合する抗体についてライブラリーをスクリーニングすること、および(d)得られた抗体を所望の機能特性についてスクリーニングすることを含む方法を開示する。
ある実施形態は、ナイーブまたは緑膿菌(P.aeruginosa)感染回復期患者に由来する抗体ファージライブラリーを用いる本明細書に開示の全細胞表現型スクリーニングアプローチを提供する。血清型特異的反応性に対して最初に選択したパニング方針を使用して、緑膿菌(P.aeruginosa)全細胞に結合する異なるクローンを単離した。選択されたクローンをヒトIgG1抗体に変換し、血清型分類または組織単離の部位にかかわらず緑膿菌(P.aeruginosa)臨床単離物と反応することを確認した(実施例参照)。本明細書に記載の機能活性スクリーンは、抗体が哺乳動物細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)付着の予防に有効であり、オプソニン食菌(OPK)殺傷を濃度依存および血清型非依存様式で媒介することを示した。
さらなる実施形態において、上記結合分子もしくはその断片、抗体もしくはその断片、または組成物は、2つ以上、3つ以上、4つ以上、もしくは5つ以上の異なる緑膿菌(P.aeruginosa)血清型、または感染患者から単離された緑膿菌(P.aeruginosa)血清型の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%もしくは少なくとも95%に結合する。さらなる実施形態において、緑膿菌(P.aeruginosa)株は、肺、唾液、眼、膿汁、糞便、尿、洞、創傷、皮膚、血液、骨、または膝液の1つまたは複数から単離される。
VIII.抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子を含む医薬組成物
本開示において使用される医薬組成物は、当業者に周知の薬学的に許容可能な担体を含む。非経口投与のための調製物には、無菌水性または非水性液剤、懸濁液、または乳濁液が含まれる。本明細書に開示のある医薬組成物は、許容可能な剤形、例として、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液または液剤で経口投与することができる。ある医薬組成物は、鼻腔エアゾールまたは吸入により投与することもできる。保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、および不活性ガスなども存在し得る。本明細書に開示の治療方法において使用される好適な配合物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,16th ed.(1980)に記載されている。
本開示において使用される医薬組成物は、当業者に周知の薬学的に許容可能な担体を含む。非経口投与のための調製物には、無菌水性または非水性液剤、懸濁液、または乳濁液が含まれる。本明細書に開示のある医薬組成物は、許容可能な剤形、例として、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液または液剤で経口投与することができる。ある医薬組成物は、鼻腔エアゾールまたは吸入により投与することもできる。保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、および不活性ガスなども存在し得る。本明細書に開示の治療方法において使用される好適な配合物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,16th ed.(1980)に記載されている。
単一剤形を産生するために担体材料と組み合わせることができる抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体の量は、治療される宿主および特定の投与方式に応じて変動する。投与量レジメンは、最適な所望応答(例えば、治療または防止応答)を提供するように調整することもできる。組成物は、化合物に好適な送達または担持系として機能する生体適合性担体材料中に分散した抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体も含み得る。
IX.治療結合分子を使用する治療方法
本明細書に開示の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体を調製およびそれが必要とされる対象に投与する方法は周知であり、または当業者により容易に決定することができる。抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入によるものまたは局所であり得る。本明細書において使用される非経口という用語には、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、または皮下投与が含まれる。投与に好適な形態は、注射、特に静脈内もしくは動脈内注射または点滴用液剤である。しかしながら、本明細書に教示と同等な他の方法において、本明細書に開示の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、有害細胞集団、例えば、感染の部位に直接送達することができ、それにより治療剤への疾患組織の曝露を増加させる。例えば、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子は、眼組織、熱傷損傷、または肺組織に直接投与することができる。
本明細書に開示の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体を調製およびそれが必要とされる対象に投与する方法は周知であり、または当業者により容易に決定することができる。抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入によるものまたは局所であり得る。本明細書において使用される非経口という用語には、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、または皮下投与が含まれる。投与に好適な形態は、注射、特に静脈内もしくは動脈内注射または点滴用液剤である。しかしながら、本明細書に教示と同等な他の方法において、本明細書に開示の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、有害細胞集団、例えば、感染の部位に直接送達することができ、それにより治療剤への疾患組織の曝露を増加させる。例えば、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子は、眼組織、熱傷損傷、または肺組織に直接投与することができる。
本明細書に開示の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、シュードモナス属(Pseudomonas)感染のインビボ治療について薬学的有効量で投与することができる。これに関して、開示結合分子は、活性剤の投与を易化し、安定性を促進するように配合されることが認識される。本出願の目的のため、薬学的有効量は、標的への有効な結合を達成するためおよび利益、例えば、シュードモナス属(Pseudomonas)感染の治療、改善、縮減、クリアランス、または予防を達成するために十分な量を意味するものとする。
一部の実施形態は、シュードモナス属(Pseudomonas)感染の予防または治療が必要とされる対象においてシュードモナス属(Pseudomonas)感染を予防または治療する方法であって、対象に有効量の本明細書に記載の結合分子もしくはその断片、抗体もしくはその断片、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を投与することを含む方法を対象とする。さらなる実施形態において、シュードモナス属(Pseudomonas)感染は、緑膿菌(P.aeruginosa)感染である。一部の実施形態において、対象はヒトである。ある実施形態において、感染は眼感染、肺感染、熱傷感染、創傷感染、皮膚感染、血液感染、骨感染、または前記感染の2つ以上の組み合わせである。さらなる実施形態において、対象は、急性肺炎、熱傷損傷、角膜感染、嚢胞性線維症、またはそれらの組み合わせを罹患する。
ある実施形態は、上皮細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)の付着を遮断または予防する方法であって、上皮細胞および緑膿菌(P.aeruginosa)の混合物を、本明細書に記載の結合分子もしくはその断片、抗体もしくはその断片、組成物、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞と接触させることを含む方法を対象とする。
緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを向上させる方法であって、食細胞および緑膿菌(P.aeruginosa)の混合物を、本明細書に記載の結合分子もしくはその断片、抗体もしくはその断片、組成物、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞と接触させることを含む方法も開示される。さらなる実施形態において、食細胞は、分化HL−60細胞またはヒト多形核白血球(PMN)である。
本開示の範囲に従うと、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体もしくは誘導体は、上記の治療方法に従って治療効果を産生するために十分な量でヒトまたは他の哺乳動物に投与することができる。本明細書に開示の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、そのようなヒトまたは他の動物に、本開示の抗体を公知の技術に従って慣用の薬学的に許容可能な担体または希釈剤と組み合わせることにより調製された慣用の剤形で投与することができる。
シュードモナス属(Pseudomonas)感染の治療のための本開示の組成物の有効用量は、多くの異なる要因、例として、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトか動物か、投与される他の医薬品、および治療が防止的か療法的かに応じて変動する。通常、患者はヒトであるが、非ヒト哺乳動物、例として、トランスジェニック哺乳動物を治療することもできる。治療投与量を当業者に公知の定型方法を使用して力価測定して安全性および効力を最適化することができる。
抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、当業者に公知の種々の要因に応じて種々の頻度において複数の場合に投与することができる。あるいは、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は徐放配合物として投与することができ、この場合、低頻度の投与が要求される。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変動する。
本開示の組成物は、任意の好適な方法により、例えば、非経口、脳室内、経口、吸入スプレーにより、局所、直腸、鼻腔、バッカル、経膣または植込リザーバーを介して投与することができる。本明細書において使用される用語「非経口」には、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、鞘内、肝内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術が含まれる。
X.相乗作用
ChouおよびTalalay(Adv.Enzyme Regul.,22:27−55(1984))は、定性および定量的方法で併用薬効果の実験的知見を表すための数学的方法を開発した。相互排他的薬物については、一般化アイソボール(isobol)方程式が、あらゆる程度の作用に適用されることを証明した(ChouおよびTalalayの第52頁を参照)。アイソボール(isobol)、すなわちアイソボログラムは、同一の程度の作用を有する2つの薬物のあらゆる用量での併用の図式表示である。アイソボログラムでは、直線が相加作用を、凹曲線(直線下方の曲線)が相乗作用を、また凸曲線(直線上方の曲線)が拮抗作用をそれぞれ表す。これらの曲線は、相互排他的薬物の併用が、相加、相乗、もしくは拮抗作用的のいずれであっても、全濃度範囲にわたって同一のタイプの作用を示すであろうことも明らかにする。ほとんどの併用は、相加作用を示す。しかし、場合によっては、併用が、相加作用より小さいか、または大きい作用を示す例もある。これらの併用は、それぞれ、拮抗作用的または相乗作用的と呼ばれる。併用は、その最適用量で用いられる上記成分の一方または他方より治療的に優れていれば、治療的相乗作用を発現する。T.H.Corbett et al.,Cancer Treatment Reports,66,1187(1982)を参照されたい。Tallarida RJ(J Pharmacol Exp Ther.2001 Sep;298(3):865−72)はまた、「明らかに類似の作用を生成する2つの薬物は、同時に用いると、増大または低減した作用を生成することがある。これらのケースを単純に相加的な作用から識別するためには、定量的評価が必要である」と述べている。
ChouおよびTalalay(Adv.Enzyme Regul.,22:27−55(1984))は、定性および定量的方法で併用薬効果の実験的知見を表すための数学的方法を開発した。相互排他的薬物については、一般化アイソボール(isobol)方程式が、あらゆる程度の作用に適用されることを証明した(ChouおよびTalalayの第52頁を参照)。アイソボール(isobol)、すなわちアイソボログラムは、同一の程度の作用を有する2つの薬物のあらゆる用量での併用の図式表示である。アイソボログラムでは、直線が相加作用を、凹曲線(直線下方の曲線)が相乗作用を、また凸曲線(直線上方の曲線)が拮抗作用をそれぞれ表す。これらの曲線は、相互排他的薬物の併用が、相加、相乗、もしくは拮抗作用的のいずれであっても、全濃度範囲にわたって同一のタイプの作用を示すであろうことも明らかにする。ほとんどの併用は、相加作用を示す。しかし、場合によっては、併用が、相加作用より小さいか、または大きい作用を示す例もある。これらの併用は、それぞれ、拮抗作用的または相乗作用的と呼ばれる。併用は、その最適用量で用いられる上記成分の一方または他方より治療的に優れていれば、治療的相乗作用を発現する。T.H.Corbett et al.,Cancer Treatment Reports,66,1187(1982)を参照されたい。Tallarida RJ(J Pharmacol Exp Ther.2001 Sep;298(3):865−72)はまた、「明らかに類似の作用を生成する2つの薬物は、同時に用いると、増大または低減した作用を生成することがある。これらのケースを単純に相加的な作用から識別するためには、定量的評価が必要である」と述べている。
相乗作用は、半数影響原理に基づくChouおよびTalalayの併用係数(CI)方法を用いて測定することができる(Chang et al.,Cancer Res.45:2434−2439,(1985)を参照)。この方法は、様々な細胞傷害性レベルの2つの薬物間の相乗、相加、または拮抗作用の程度を計算する。CI値が1より小さい場合、2つの薬物間に相乗作用がある。CI値が1であれば、2つの薬物間に相加作用はあるが、相乗作用はない。1より大きいCI値は、拮抗作用を示す。CI値が小さいほど、相乗作用が大きい。別の実施形態では、部分阻害濃度(FIC)を用いて相乗作用を決定する。この部分値は、単独で作用するIC50の関数として、併用で作用する薬物のIC50を表すことにより決定する。2つの相互作用する薬物については、各薬物のFIC値の和が、相乗相互作用の尺度を表す。FICが1より小さい場合、2つの薬物間に相乗作用がある。FIC値が1であれば、相加作用を示す。FIC値が小さいほど、相乗作用が大きい。
いくつかの実施形態において、1種または複数種の結合剤を「低用量」(すなわち、単独で投与すると非治療的とみなされる用量)で投与するシュードモナス属(Pseudomonas)治療において相乗作用が得られ、この場合、他の結合剤(低用量または治療用量で投与される)と併用した低用量の結合剤の投与によって、上記結合剤を単独で個別に投与して得られるであろう相加作用を上回る相乗作用が得られる。ある実施形態では、相乗作用は、「低用量」で投与される1種または複数種の結合剤の投与によって達成され、ここで、低用量は、毒性または他の望ましくない副作用を回避するように提供される。
XI.免疫アッセイ
抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、当分野において公知の任意の方法により免疫特異的結合についてアッセイすることができる。使用することができる免疫アッセイには、限定されるものではないが、いくつか例を挙げると、ウエスタンブロットのような技術を使用する競合および非競合アッセイ系、放射免疫アッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインA免疫アッセイが含まれる。そのようなアッセイは定型的であり、当分野において周知である(例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるAusubel et al.,eds,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York,Vol.1(1994)参照)。例示的な免疫アッセイを以下に手短に記載する(しかし、限定を意図するものではない)。
抗シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよび/またはPcrV結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、当分野において公知の任意の方法により免疫特異的結合についてアッセイすることができる。使用することができる免疫アッセイには、限定されるものではないが、いくつか例を挙げると、ウエスタンブロットのような技術を使用する競合および非競合アッセイ系、放射免疫アッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインA免疫アッセイが含まれる。そのようなアッセイは定型的であり、当分野において周知である(例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるAusubel et al.,eds,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York,Vol.1(1994)参照)。例示的な免疫アッセイを以下に手短に記載する(しかし、限定を意図するものではない)。
抗体−抗原相互作用の親和性の計測に利用可能な種々の方法が存在するが、速度定数の測定については比較的少ない。ほとんどの方法は、抗体または抗原のいずれかの標識に依存し、定型的な計測の煩雑化が不可避であり、計測量が不確実になる。抗体親和性は、多数の方法、例として、OCTET(登録商標)、BIACORE(登録商標)、ELISA、およびFACSにより計測することができる。
OCTET(登録商標)システムは、96ウェルプレートフォーマット中のバイオセンサーを使用して速度論的分析を報告する。タンパク質結合および解離イベントは、溶液中のあるタンパク質の、ForteBioバイオセンサー上に固定化された第2のタンパク質への結合を計測することによりモニタリングすることができる。PslまたはPcrVへの抗PslまたはPcrV抗体の結合を計測する場合、PslまたはPcrVをOCTET(登録商標)チップ上に固定化し、次いで溶液中の抗体の結合を分析する。次いで、固定化PslまたはPcrVに対する抗体の会合および解離を装置センサーにより検出する。次いで、データを収集し、親和性曲線フィッティングのためにGraphPad Prismにエクスポートする。
BIACORE(登録商標)上で実施される表面プラズモン共鳴(SPR)は、抗体−抗原相互作用の親和性を計測する慣用の方法と比べて多数の利点を提供する:(i)抗体にも抗原にも標識する必要がない;(ii)抗体を予め精製する必要がなく、細胞培養物上澄みを直接使用することができる;(iii)異なるモノクローナル抗体相互作用の迅速な半定量比較を可能とするリアルタイム計測が可能であり、多くの評価目的に十分である;(iv)生物特異的表面を、一連の異なるモノクローナル抗体を同一条件下で容易に比較することができるように再生することができる;(v)分析手順を完全自動化し、広範な計測系列を使用者の介在なしで実施することができる。BIAapplications Handbook,version AB(1998年再版)、BIACORE(登録商標)コード番号BR−1001−86;BIAtechnology Handbook,version AB(1998年再版)、BIACORE(登録商標)コード番号BR−1001−84。
SPRベース結合試験は、結合ペアの一方のメンバーをセンサー表面上に固定化することを要求する。固定化された結合パートナーは、リガンドと称される。溶液中の結合パートナーは、分析物と称される。一部の場合、リガンドは、捕捉分子と称される別の固定化分子への結合を介して表面に間接的に付着される。SPR応答は、分析物が結合または解離したときの検出器表面における質量濃度の変化を反映する。
SPRに基づき、リアルタイムBIACORE(登録商標)計測は、相互作用をそれらが生じたときに直接モニタリングする。この技術は速度論的パラメータの決定に十分適合する。競合親和性ランキングは極端に実施しやすく、速度論および親和性定数の両方をセンサーグラムデータから導くことができる。
分析物をリガンド表面にわたり別々のパルスでインジェクトする場合、得られたセンサーグラムを3つの必須相に分割することができる:(i)試料インジェクションの間の分析物とリガンドとの会合;(ii)分析物結合の速度が複合体からの解離により平衡される試料インジェクションの間の平衡または定常状態;(iii)緩衝液流動間の表面からの分析物の解離。
会合および解離相は、分析物−リガンド相互作用(kaおよびkd、複合体形成および解離の速度、kd/ka=KD)のキネティクスに関する情報を提供する。平衡相は、分析物−リガンド相互作用(KD)の親和性に関する情報を提供する。
BIAevaluationソフトウエアは、数値積分およびグローバルフィッティングアルゴリズムの両方を使用して曲線フィッティングのための包括的ファシリティーを提供する。データの好適な分析により、相互作用についての分離速度および親和性定数を簡単なBIACORE(登録商標)調査から得ることができる。この技術により計測可能な親和性の範囲は極めて広く、mMからpMに及ぶ。
エピトープ特異性は、モノクローナル抗体の重要な特徴である。BIACORE(登録商標)によるエピトープマッピングは、放射免疫アッセイ、ELISAまたは他の表面吸着法を使用する慣用の技術とは対照的に、抗体の標識も精製も要求せず、いくつかのモノクローナル抗体の配列を使用して多部位特異性試験を可能とする。さらに、大量の分析物を自動的に処理することができる。
ペアワイズ結合実験は、2つのMAbの同一抗原に同時に結合する能力を試験する。別個のエピトープに対して指向されたMAbは、独立して結合する一方、同一または密接に関連するエピトープに対して指向されたMAbは、互いの結合を干渉する。BIACORE(登録商標)によるこれらの結合実験は、実施が容易である。
例えば、第1のMabに結合させるための捕捉分子を使用し、次いで抗原および第2のMAbを連続的に添加することができる。センサーグラムは、1.どれほどの数の抗原が第1のMabに結合するか、2.どの程度、第2のMAbが表面付着抗原に結合するか、3.第2のMAbが結合しない場合、ペアワイズ試験の順序の逆転は結果を変えるかどうかを明らかにする。
ペプチド阻害は、エピトープマッピングに使用される別の技術である。この方法は、ペアワイズ抗体結合試験を補完し得、抗原の1次配列が既知の場合、機能的エピトープを構造的特徴と関連づけ得る。ペプチドまたは抗原断片を、固定化抗原への異なるMAbの結合の阻害について試験する。所与のMAbの結合を干渉するペプチドは、そのMAbにより定義されるエピトープと構造的に関連すると想定される。
XII.投与
抗Psl結合ドメインもしくは抗PcrV結合ドメインのいずれかを含む組成物、または抗Pslおよび抗PcrV結合ドメインの両方を含む組成物は、患者のシュードモナス属(Pseudomonas)の治療において相乗効果をもたらすように、投与する。投与は、所望の治療効果、すなわち相乗作用をもたらすものであれば、あらゆる好適な手段によって行うことができる。特定の実施形態において、療法の同一のサイクル中に抗体を投与する。例えば、規定された期間内の療法の1サイクル中に、両方の抗体を対象に投与する。ある実施形態では、抗体の投与は、個別の治療サイクルでの連続的な投与中に行ってもよく、例えば、第1治療サイクルは、抗Psl抗体の投与を含み、第2治療サイクルは、抗PcrV抗体の投与を含む。患者への投与される結合ドメインの投与量も投与の頻度に応じて変動し、当業者によって容易に決定され得る。
抗Psl結合ドメインもしくは抗PcrV結合ドメインのいずれかを含む組成物、または抗Pslおよび抗PcrV結合ドメインの両方を含む組成物は、患者のシュードモナス属(Pseudomonas)の治療において相乗効果をもたらすように、投与する。投与は、所望の治療効果、すなわち相乗作用をもたらすものであれば、あらゆる好適な手段によって行うことができる。特定の実施形態において、療法の同一のサイクル中に抗体を投与する。例えば、規定された期間内の療法の1サイクル中に、両方の抗体を対象に投与する。ある実施形態では、抗体の投与は、個別の治療サイクルでの連続的な投与中に行ってもよく、例えば、第1治療サイクルは、抗Psl抗体の投与を含み、第2治療サイクルは、抗PcrV抗体の投与を含む。患者への投与される結合ドメインの投与量も投与の頻度に応じて変動し、当業者によって容易に決定され得る。
他の実施形態において、結合ドメインを治療サイクル中に2回以上投与する。例えば、いくつかの実施形態において、結合ドメインは、3または4週間の治療サイクル中、連続3週にわたり毎週投与する。
投与が所望の効果をもたらす限りにおいて、1つ若しくは複数の結合ドメインを含む組成物の投与を同一のまたは異なる日に行ってよい。
当業者であれば、所望の治療効果をもたらす他の用量または投与頻度が、本発明での使用に適していることを容易に理解されよう。
XII.キット
また別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の方法を実施するのに用いることができるキットを提供する。特定の実施形態において、キットは、1つまたは複数の容器に本明細書に記載の結合分子を含む。当業者であれば、本発明の開示された結合ドメイン、ポリペプチドおよび抗体を、当分野では公知の確立されたキットフォーマットの1つに容易に導入できることは容易に認識されよう。
また別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の方法を実施するのに用いることができるキットを提供する。特定の実施形態において、キットは、1つまたは複数の容器に本明細書に記載の結合分子を含む。当業者であれば、本発明の開示された結合ドメイン、ポリペプチドおよび抗体を、当分野では公知の確立されたキットフォーマットの1つに容易に導入できることは容易に認識されよう。
本開示の実施は、特に記載のない限り、当分野の技能の範囲内の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の慣用の技術を用いる。そのような技術は、文献に十分説明されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.,Sambrook et al.,ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press:(1989);Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook et al.,ed.,Cold Springs Harbor Laboratory, New York(1992),DNA Cloning,D.N.Glover ed.,Volumes I and II(1985);Oligonucleotide Synthesis,M.J.Gait ed.,(1984);Mullis et al.米国特許第4,683,195号明細書;Nucleic Acid Hybridization,B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984);Transcription And Translation,B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984);Culture Of Animal Cells,R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,(1987);Immobilized Cells And Enzymes,IRL Press,(1986);B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);論文、Methods In Enzymology,Academic Press,Inc.,N.Y.;Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,J.H.Miller and M.P.Calos eds.,Cold Spring Harbor Laboratory(1987);Methods In Enzymology,Vols.154 and 155(Wu et al.eds.);Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology,Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London(1987);Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I−IV,D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,(1986);Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986);およびAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)参照。
抗体改変の一般原理は、Antibody Engineering,2nd edition,C.A.K. Borrebaeck,Ed.,Oxford Univ.Press(1995)に記載されている。タンパク質改変の一般原理は、Protein Engineering,A Practical Approach,Rickwood,D.,et al.,Eds.,IRL Press at Oxford Univ.Press,Oxford,Eng.(1995)に記載されている。抗体および抗体−ハプテン結合の一般原理は、以下の文献に記載されている:Nisonoff,A.,Molecular Immunology,2nd ed.,Sinauer Associates,Sunderland,MA(1984);ならびにSteward,M.W.,Antibodies,Their Structure and Function,Chapman and Hall,New York,NY(1984)。さらに、当分野において公知であり、詳細に記載していない免疫学の標準的方法は、一般に以下の文献に記載のように実施する:Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,New York;Stites et al.(eds),Basic and Clinical−Immunology(8th ed.),Appleton & Lange,Norwalk,CT(1994)ならびにMishell and Shiigi(eds),Selected Methods in Cellular Immunology,W.H.Freeman and Co.,New York(1980)。
免疫学の一般原理を記載する標準的な参照文献には、Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons, New York;Klein,J.,Immunology:The Science of Self−Nonself Discrimination,John Wiley & Sons,New York(1982);Kennett,R.,et al.,eds.,Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses,Plenum Press,New York(1980);Campbell,A.,“Monoclonal Antibody Technology”in Burden,R.,et al.,eds.,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Vol.13,Elsevere,Amsterdam(1984),Kuby Immunnology 4th ed.Ed.Richard A.Goldsby,Thomas J.Kindt and Barbara A.Osborne,H.Freemand & Co.(2000);Roitt,I.,Brostoff,J.and Male D.,Immunology,6th ed.London:Mosby(2001);Abbas A.,Abul,A.and Lichtman,A.,Cellular and Molecular Immunology,Ed.5,Elsevier Health Sciences Division(2005);Kontermann and Dubel,Antibody Engineering,Springer Verlan(2001);Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Press(2001);Lewin,Genes VIII,Prentice Hall(2003);Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988);Dieffenbach and Dveksler,PCR Primer Cold Spring Harbor Press(2003)が含まれる。
実施例1
ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーの構築およびスクリーニング
本実施例は、シュードモナス属(Pseudomonas)感染に対する新規保護抗原を同定するためのナイーブおよび緑膿菌(P.aeruginosa)感染回復期患者の両方に由来するヒト抗体ファージライブラリーを用いる標的無差別全細胞パニングアプローチを記載する(図1A)。インビトロ機能スクリーンに含まれるアッセイは、オプソニン食菌(OPK)殺傷アッセイおよび上皮細胞系A549を使用する細胞付着アッセイを含んだ。リード候補物は、優れたインビトロ活性に基づき、緑膿菌(P.aeruginosa)急性肺炎、角膜炎、および熱傷感染モデルにおいて試験した。
ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーの構築およびスクリーニング
本実施例は、シュードモナス属(Pseudomonas)感染に対する新規保護抗原を同定するためのナイーブおよび緑膿菌(P.aeruginosa)感染回復期患者の両方に由来するヒト抗体ファージライブラリーを用いる標的無差別全細胞パニングアプローチを記載する(図1A)。インビトロ機能スクリーンに含まれるアッセイは、オプソニン食菌(OPK)殺傷アッセイおよび上皮細胞系A549を使用する細胞付着アッセイを含んだ。リード候補物は、優れたインビトロ活性に基づき、緑膿菌(P.aeruginosa)急性肺炎、角膜炎、および熱傷感染モデルにおいて試験した。
図1Bは、患者抗体ファージディスプレイライブラリーの構築を示す。全血を6人の回復期患者から診断7〜10日後にプールし、次いでRNA抽出し、上記のとおりファージライブラリーを構築した(Vaughan,T.J.,et al.,Nat Biotechnol 14,309−314(1996);Wrammert,J.,et al.,Nature 453,667−671(2008))。図1Cは、最終クローニングscFvライブラリーが5.4×108個の形質転換体を含有したことを示し、配列決定は、scFv遺伝子の79%が全長でありインフレームであることを明らかにした。VH CDR3ループは、エピトープ特異性の決定に重要なことが多く、ライブラリー選択前にアミノ酸レベルにおいて84%の多様性であった。
患者ライブラリーに加え、最大1×1011個の結合メンバーを含有するナイーブヒトscFvファージディスプレイライブラリー(Lloyd,C.,et al.,Protein Eng Des Sel 22,159−168(2009))を、抗体単離に使用した(Vaughan,T.J.,et al.,Nat Biotechnol 14,309−314(1996))。加熱殺傷した緑膿菌(P.aeruginosa)(1×109)をIMMUNO(商標)チューブ(Nunc;MAXISORP(商標))中に固定化し、次いで上記のとおりファージディスプレイ選択を行い(Vaughan,T.J.,et al.,Nat Biotechnol 14,309−314(1996))、但しトリエタノールアミン(100nM)を溶出緩衝液として使用した。懸濁液中の緑膿菌(P.aeruginosa)に基づく選択のため、加熱殺傷細菌をブロッキングし、次いでブロッキングされたファージを細胞に添加した。洗浄後、溶出させたファージを使用して上記のとおり大腸菌(E.coli)に感染させた(Vaughan,1996)。大腸菌(E.coli)からのファージのレスキューおよびELISAによる加熱殺傷緑膿菌(P.aeruginosa)への結合は、上記のとおり実施した(Vaughan,1996)。
全細胞親和性選択方法の開発および評価後、新たな回復期患者ライブラリーおよび既に構築されたナイーブライブラリーの両方(Vaughan,T.J.,et al.,Nat Biotechnol 14,309−314(1996))を、完全O抗原を有する緑膿菌(P.aeruginosa)株3064およびO抗原の表面発現を欠くアイソジェニックwapR突然変異株の懸濁液に対する親和性選択に供した。図1Dは、連続患者ライブラリー選択からのアウトプット力価が、ナイーブライブラリーよりも患者ライブラリーについてより大きい速度において増加することが見出されたことを示す(ラウンド3においてそれぞれ1×107対3×105)。さらに、ライブラリーにおけるVH CDR3ループ配列の重複(選択の間のクローン濃縮の尺度)も、ラウンド3において患者ライブラリーにおいて88〜92%に達し、ナイーブライブラリーにおける15〜25%と比較して高いことが見出された(図1D)。次に、親和性選択からの個々のscFvファージを緑膿菌(P.aeruginosa)異種血清型株に対する反応性についてELISAによりスクリーニングした(図1E)。ELISAプレート(Nunc;MAXISORP(商標))を、上記のとおり一晩培養物からの緑膿菌(P.aeruginosa)株によりコートした(DiGiandomenico,A.,et al.,Infect Immun 72,7012−7021(2004))。希釈抗体をブロッキングしたプレートに1時間添加し、洗浄し、HRPコンジュゲート抗ヒト2次抗体により1時間処理し、次いで上記のとおり発色および分析した(Ulbrandt,N.D.,et al.,J Virol 80,7799−7806(2006))。両方のライブラリーを用いる全細胞選択から得られたファージのドミナント種は、血清型特異的反応性をもたらした(データ示さず)。大腸菌(E.coli)またはウシ血清アルブミンへの非特異的結合の不存在下で血清型非依存性結合を示すクローンをさらなる評価のために選択した。
IgG発現のため、選択抗体のVHおよびVL鎖をヒトIgG1発現ベクター中にクローニングし、HEK293細胞中で同時発現させ、上記のとおりプロテインA親和性クロマトグラフィーにより精製した(Persic,L.,et al.,Gene 187,9−18(1997))。これらの選択血清型非依存的ファージからの可変領域から作製されたヒトIgG1抗体を、緑膿菌(P.aeruginosa)特異性について確認し、FACS分析によりドミナント臨床関連血清型への全細胞結合により後続の分析のために優先順位を付けた(図1F)。それというのも、この方法は、ELISAよりもストリンジェントであるためである。フローサイトメトリーをベースとする結合アッセイのため、対数増殖中期の緑膿菌(P.aeruginosa)株をPBS中に2.0のOD650まで濃縮した。抗体(10μg/mL)および細菌(約1×107個の細胞)を振とうしながら4℃において1時間インキュベートした後、洗浄した細胞をALEXA FLUOR647(登録商標)ヤギ抗ヒトIgG抗体(Invitrogen,Carlsbad,CA)と4℃において0.5時間インキュベートした。洗浄した細胞を、推奨されるとおりBACLIGHT(商標)緑色細菌染色により染色した(Invitrogen,Carlsbad,CA)。試料をLSR IIフローサイトメーター(BD Biosciences)上でランさせ、BD FacsDiva(v.6.1.3)およびFlowJo(v.9.2;TreeStar)を使用して分析した。FACSにより結合を示す抗体を、オプソニン食菌殺傷(OPK)アッセイにおける機能的活性試験のためにさらに優先順位を付けた。
実施例2
緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを促進するmAbの評価
本実施例は、緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを促進する優先順位を付けたヒトIgG1抗体の評価を記載する。図2Aは、WapR−007および陰性対照抗体R347を除き、全ての抗体が発光緑膿菌(P.aeruginosa)血清型O5株(PAO1.lux)の濃度依存的殺傷を媒介したことを示す。WapR−004およびCam−003は、優れたOPK活性を示した。OPKアッセイは、修正した(DiGiandomenico,A.,et al.,Infect Immun 72,7012−7021(2004))に記載のとおり実施した。手短に述べると、アッセイを、96ウェルプレート中で0.025mlのそれぞれのOPK構成成分を使用して実施した;緑膿菌(P.aeruginosa)株;希釈子ウサギ血清;分化HL−60細胞;およびモノクローナル抗体。一部のOPKアッセイにおいて、記載(Choi,K.H.,et al.,Nat Methods 2,443−448(2005))のとおり構築した発光緑膿菌(P.aeruginosa)株を使用した。発光OPKアッセイは、上記のとおり実施したが、Perkin Elmer ENVISION Multilabelプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用して相対ルシフェラーゼ単位(RLU)を測定した。
緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを促進するmAbの評価
本実施例は、緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを促進する優先順位を付けたヒトIgG1抗体の評価を記載する。図2Aは、WapR−007および陰性対照抗体R347を除き、全ての抗体が発光緑膿菌(P.aeruginosa)血清型O5株(PAO1.lux)の濃度依存的殺傷を媒介したことを示す。WapR−004およびCam−003は、優れたOPK活性を示した。OPKアッセイは、修正した(DiGiandomenico,A.,et al.,Infect Immun 72,7012−7021(2004))に記載のとおり実施した。手短に述べると、アッセイを、96ウェルプレート中で0.025mlのそれぞれのOPK構成成分を使用して実施した;緑膿菌(P.aeruginosa)株;希釈子ウサギ血清;分化HL−60細胞;およびモノクローナル抗体。一部のOPKアッセイにおいて、記載(Choi,K.H.,et al.,Nat Methods 2,443−448(2005))のとおり構築した発光緑膿菌(P.aeruginosa)株を使用した。発光OPKアッセイは、上記のとおり実施したが、Perkin Elmer ENVISION Multilabelプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用して相対ルシフェラーゼ単位(RLU)を測定した。
WapR−004およびCam−003抗体が別の臨床関連O抗原血清型株9882−80.luxに対するOPK活性を媒介する能力を評価した。図2Bは、WapR−004およびCam−003OPK活性の向上が株9882−80(O11)に及ぶことを示す。
さらに、本実施例は、緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを促進するscFv−FcフォーマットにおけるWapR−004(W4)突然変異体の評価を記載する。ある突然変異体Wap−004RAD(W4−RAD)は、部位特異的突然変異導入を介して特異的に作出してVH中のRGDモチーフを除去した。他のW4突然変異体は以下のとおり調製した。ネステッドPCRを記載(Roux,K.H.,PCR Methods Appl 4,S185−194(1995))のとおり実施して回復期緑膿菌(P.aeruginosa)感染患者に由来するscFvライブラリーから分析のためにW4バリアント(体細胞超突然変異に由来)を増幅させた。これは、WapR−004が由来したライブラリーである。W4バリアント断片を、当分野において公知の標準的手順を使用してサブクローニングおよび配列決定した。W4突然変異体軽鎖(LC)をWapR−004重鎖(HC)により組み換えてscFv−FcフォーマットのW4突然変異体を産生した。さらに、WapR−004RAD重鎖(HC)突然変異体をscFv−FcフォーマットのM7およびM8の親LCにより組み換えた。構築物は、当分野において公知の標準的な手順を使用して調製した。図11(A〜M)は、陰性対照抗体R347を除き、全てのWapR−004(W4)突然変異体が発光緑膿菌(P.aeruginosa)血清型O5株(PAO1.lux)の濃度依存的殺傷を媒介したことを示す。
潜在的免疫原性を低減するようにWapR−004−RAD可変領域を生殖系列化して、WapR−004−生殖系(「WapR−004−GL」)を作製し、部位指定突然変異誘発によりリード最適化した。Pslに対して改善された親和性を有するクローンを競合スクリーンで選択した。上位のクローンを親和性改善により等級付けし、インビトロ機能性アッセイで分析した。14のリード最適化クローンは、Psl0096、Psl0170、Psl0225、Psl0304、Psl0337、Psl348、Psl0567、Psl0573、Psl0574、Psl0582、Psl0584、Psl0585、Psl0588およびPsl0589である。
実施例3
血清型非依存性抗緑膿菌(P.aeruginosa)抗体は、Pslエキソ多糖を標的化する
本実施例は、表現型スクリーニングに由来する抗緑膿菌(P.aeruginosa)抗体の標的の同定を記載する。標的分析は、血清型非依存性抗体がタンパク質または炭水化物抗原を標的化したかどうかを試験するように実施した。ELISAにおいて、プロテイナーゼKにより完全に消化されたPAO1全細胞抽出物への結合の損失は観察されず、このことは反応性が表面接近可能な炭水化物残基を標的化したことを示唆する(データ示さず)。アイソジェニック突然変異体は、O抗原、アルギネート、およびLPSコア生合成を担う遺伝子において構築した;wbpL(O抗原欠損);wbpL/algD(O抗原およびアルギネート欠損);rmlC(O抗原欠損およびトランケート外部コア);およびgalU(O抗原欠損およびトランケート内部コア)。緑膿菌(P.aeruginosa)突然変異体は、Schweizer(Schweizer,H.P.,Mol Microbiol 6,1195−1204(1992);Schweizer,H.D.,Biotechniques 15,831−834(1993))により記載されるアレル置換方針に基づき構築した。ベクターは、大腸菌(E.coli)株S17.1から緑膿菌(P.aeruginosa)株PAO1中に動員させ;組換え体を記載(Hoang,T.T.,et al.,Gene 212,77−86(1998))のとおり単離した。遺伝子欠失は、PCRにより確認した。緑膿菌(P.aeruginosa)突然変異体は、野生型遺伝子を保有するpUCP30Tベース構築物により補完した。抗体の反応性は、間接ELISAにより上記緑膿菌(P.aeruginosa)株によりコートしたプレート上で測定した:図3Aは、wbpLまたはwbpL/algD二重突然変異体へのCam−003結合が影響を受けなかったが、rmlCおよびgalU突然変異体への結合が消失したことを示す。これらの結果はLPSコアへの結合と一致した一方、PAO1から精製されたLPSに対する反応性は観察されなかった。rmlCおよびgalU遺伝子は、近年、Pslエキソ多糖、D−マンノース、L−ラムノース、およびD−グルコースからなる繰り返し五糖ポリマーの生合成に要求されることが示された。pslAがPsl生合成に要求されるため、アイソジェニックpslAノックアウトPAO1ΔpslAへのCam−003結合を試験した(Byrd,M.S.,et al.,Mol Microbiol 73,622−638(2009))。PAO1ΔpslAへのCam−003の結合は、ELISA(図3B)およびFACS(図3C)により試験した場合に消失した一方、この突然変異体中のLPS分子は影響を受けなかった(図3D)。Cam−003の結合は、pslAにより補完されたPAO1ΔwbpL/algD/pslA三重突然変異体においてにおいて回復し(図3E)、これはCam−003がこの突然変異体とは対照的に補完PAO1ΔpslAに対するオプソニン殺傷を媒介する能力と同様であった(図3Fおよび3G)。Pelエキソ多糖突然変異体へのCam−003抗体の結合も、影響を受けず、このことはさらに、Pslを本発明者らの抗体標的として確認する(図3E)。結合アッセイは、残留抗体もPslに結合することを確認した(図3Hおよび3I)。
血清型非依存性抗緑膿菌(P.aeruginosa)抗体は、Pslエキソ多糖を標的化する
本実施例は、表現型スクリーニングに由来する抗緑膿菌(P.aeruginosa)抗体の標的の同定を記載する。標的分析は、血清型非依存性抗体がタンパク質または炭水化物抗原を標的化したかどうかを試験するように実施した。ELISAにおいて、プロテイナーゼKにより完全に消化されたPAO1全細胞抽出物への結合の損失は観察されず、このことは反応性が表面接近可能な炭水化物残基を標的化したことを示唆する(データ示さず)。アイソジェニック突然変異体は、O抗原、アルギネート、およびLPSコア生合成を担う遺伝子において構築した;wbpL(O抗原欠損);wbpL/algD(O抗原およびアルギネート欠損);rmlC(O抗原欠損およびトランケート外部コア);およびgalU(O抗原欠損およびトランケート内部コア)。緑膿菌(P.aeruginosa)突然変異体は、Schweizer(Schweizer,H.P.,Mol Microbiol 6,1195−1204(1992);Schweizer,H.D.,Biotechniques 15,831−834(1993))により記載されるアレル置換方針に基づき構築した。ベクターは、大腸菌(E.coli)株S17.1から緑膿菌(P.aeruginosa)株PAO1中に動員させ;組換え体を記載(Hoang,T.T.,et al.,Gene 212,77−86(1998))のとおり単離した。遺伝子欠失は、PCRにより確認した。緑膿菌(P.aeruginosa)突然変異体は、野生型遺伝子を保有するpUCP30Tベース構築物により補完した。抗体の反応性は、間接ELISAにより上記緑膿菌(P.aeruginosa)株によりコートしたプレート上で測定した:図3Aは、wbpLまたはwbpL/algD二重突然変異体へのCam−003結合が影響を受けなかったが、rmlCおよびgalU突然変異体への結合が消失したことを示す。これらの結果はLPSコアへの結合と一致した一方、PAO1から精製されたLPSに対する反応性は観察されなかった。rmlCおよびgalU遺伝子は、近年、Pslエキソ多糖、D−マンノース、L−ラムノース、およびD−グルコースからなる繰り返し五糖ポリマーの生合成に要求されることが示された。pslAがPsl生合成に要求されるため、アイソジェニックpslAノックアウトPAO1ΔpslAへのCam−003結合を試験した(Byrd,M.S.,et al.,Mol Microbiol 73,622−638(2009))。PAO1ΔpslAへのCam−003の結合は、ELISA(図3B)およびFACS(図3C)により試験した場合に消失した一方、この突然変異体中のLPS分子は影響を受けなかった(図3D)。Cam−003の結合は、pslAにより補完されたPAO1ΔwbpL/algD/pslA三重突然変異体においてにおいて回復し(図3E)、これはCam−003がこの突然変異体とは対照的に補完PAO1ΔpslAに対するオプソニン殺傷を媒介する能力と同様であった(図3Fおよび3G)。Pelエキソ多糖突然変異体へのCam−003抗体の結合も、影響を受けず、このことはさらに、Pslを本発明者らの抗体標的として確認する(図3E)。結合アッセイは、残留抗体もPslに結合することを確認した(図3Hおよび3I)。
実施例4
抗PslmAbは、培養上皮細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)の付着を遮断する。
本実施例は、抗Psl抗体が上皮細胞との緑膿菌(P.aeruginosa)会合を遮断したことを示す。抗Psl抗体を、不透明96ウェルプレート(Nunc Nunclon Delta)中で成長させたA549細胞(腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞系)のコンフルエント単層に添加した。対数増殖期の発光緑膿菌(P.aeruginosa)PAO1株(PAO1.lux)を10のMOIにおいて添加した。PAO1.luxをA549細胞と37℃において1時間インキュベートした後、A549細胞を洗浄し、次いでLB+0.5%グルコースを添加した。実施例2に記載のOPKアッセイにおいて実施したとおり、37℃における短時間のインキュベーション後に細菌を定量した。A549細胞を有さないウェルからの計測値を使用して非特異的結合について補正した。図4は、Cam−005およびWapR−007を除き、全ての抗体がA549細胞へのPAO1.luxの会合を用量依存様式で低減させたことを示す。OPKアッセイにおいて最良に機能したmAbのWapR−004およびCam−003(図2A〜B、および実施例2参照)も、A549肺上皮細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)細胞付着の阻害において最も活性であり、陰性対照と比較して最大約80%の低減を提供した。WapR−016は、3番目に活性の抗体であり、WapR−004およびCam−003と同様の阻害活性を示したが、10倍高い抗体濃度において示した。
抗PslmAbは、培養上皮細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)の付着を遮断する。
本実施例は、抗Psl抗体が上皮細胞との緑膿菌(P.aeruginosa)会合を遮断したことを示す。抗Psl抗体を、不透明96ウェルプレート(Nunc Nunclon Delta)中で成長させたA549細胞(腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞系)のコンフルエント単層に添加した。対数増殖期の発光緑膿菌(P.aeruginosa)PAO1株(PAO1.lux)を10のMOIにおいて添加した。PAO1.luxをA549細胞と37℃において1時間インキュベートした後、A549細胞を洗浄し、次いでLB+0.5%グルコースを添加した。実施例2に記載のOPKアッセイにおいて実施したとおり、37℃における短時間のインキュベーション後に細菌を定量した。A549細胞を有さないウェルからの計測値を使用して非特異的結合について補正した。図4は、Cam−005およびWapR−007を除き、全ての抗体がA549細胞へのPAO1.luxの会合を用量依存様式で低減させたことを示す。OPKアッセイにおいて最良に機能したmAbのWapR−004およびCam−003(図2A〜B、および実施例2参照)も、A549肺上皮細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)細胞付着の阻害において最も活性であり、陰性対照と比較して最大約80%の低減を提供した。WapR−016は、3番目に活性の抗体であり、WapR−004およびCam−003と同様の阻害活性を示したが、10倍高い抗体濃度において示した。
実施例5
インビボ継代緑膿菌(P.aeruginosa)株は、Pslの発現を維持/増加させる
インビボでのPsl発現が維持されるかどうかを試験するため、マウスに緑膿菌(P.aeruginosa)単離物を腹腔内注射し、次いで注射4時間後に腹腔洗浄により細菌を回収した。Pslの存在は、対照抗体およびCam−003を用いてフローサイトメトリーにより分析した。それというのも、抗体結合についての条件がよりストリンジェントであり、Psl発現に陽性または陰性である細胞の定量を可能とするためである。エクスビボ結合のため、細菌接種材料(0.1ml)を、一晩TSAプレートから調製し、BALB/cマウスに腹腔内送達した。チャレンジ4時間後において、細菌を回収し、RBCを溶解させ、超音波処理し、0.1%Tween−20および1%BSAを補給したPBS中で再懸濁させた。実施例1に既に記載したとおり試料を染色し、分析した。図5は、野生型緑膿菌(P.aeruginosa)株を有する腹腔洗浄後に回収された細菌が、対数増殖期の培養細菌と同等の濃いCam−003染色を示したことを示す(図5Aおよび5Cを比較)。インビボ継代野生型細菌は、接種材料と比較して染色の向上を示した(図5Bおよび5Cを比較)。接種材料内で、Pslは株6077について検出されず、株PAO1(O5)および6206(O11−細胞毒性)について最少で検出された。細菌へのCam−003の結合は接種材料に関して増加し、このことは、Psl発現がインビボで維持または増加されることを示す。野生型株6077、PAO1、および6206は、インビボ継代後にPslを発現するが、pslAを欠失する株PAO1(PAO1ΔpslA)は、Cam−003と反応し得ない。これらの結果は、Pslをモノクローナル抗体の標的としてさらに強調する。
インビボ継代緑膿菌(P.aeruginosa)株は、Pslの発現を維持/増加させる
インビボでのPsl発現が維持されるかどうかを試験するため、マウスに緑膿菌(P.aeruginosa)単離物を腹腔内注射し、次いで注射4時間後に腹腔洗浄により細菌を回収した。Pslの存在は、対照抗体およびCam−003を用いてフローサイトメトリーにより分析した。それというのも、抗体結合についての条件がよりストリンジェントであり、Psl発現に陽性または陰性である細胞の定量を可能とするためである。エクスビボ結合のため、細菌接種材料(0.1ml)を、一晩TSAプレートから調製し、BALB/cマウスに腹腔内送達した。チャレンジ4時間後において、細菌を回収し、RBCを溶解させ、超音波処理し、0.1%Tween−20および1%BSAを補給したPBS中で再懸濁させた。実施例1に既に記載したとおり試料を染色し、分析した。図5は、野生型緑膿菌(P.aeruginosa)株を有する腹腔洗浄後に回収された細菌が、対数増殖期の培養細菌と同等の濃いCam−003染色を示したことを示す(図5Aおよび5Cを比較)。インビボ継代野生型細菌は、接種材料と比較して染色の向上を示した(図5Bおよび5Cを比較)。接種材料内で、Pslは株6077について検出されず、株PAO1(O5)および6206(O11−細胞毒性)について最少で検出された。細菌へのCam−003の結合は接種材料に関して増加し、このことは、Psl発現がインビボで維持または増加されることを示す。野生型株6077、PAO1、および6206は、インビボ継代後にPslを発現するが、pslAを欠失する株PAO1(PAO1ΔpslA)は、Cam−003と反応し得ない。これらの結果は、Pslをモノクローナル抗体の標的としてさらに強調する。
実施例6
緑膿菌(P.aeruginosa)急性肺炎モデルにおける抗Pslモノクローナル抗体Cam−003およびWapR−004により処理した動物についての生存率
抗体またはPBSをそれぞれのモデルに感染24時間前に投与した。緑膿菌(P.aeruginosa)急性肺炎、角膜炎、および熱傷感染モデルを上記のとおり修正して実施した(DiGiandomenico,A.,et al.,Proc Natl Acad Sci USA 104,4624−4629(2007))。急性肺炎モデルにおいて、BALB/cマウス(The Jackson Laboratory)を0.05mlの接種材料中で懸濁させた緑膿菌(P.aeruginosa)株により感染させた。熱傷モデルにおいて、CF−1マウス(Charles River)は、92℃への10秒間の金属焼印加熱により10%の総体表面積熱傷を受けた。動物を緑膿菌(P. aeruginosa)株6077により示した用量において皮下感染させた。臓器負荷実験のため、急性肺炎をマウスにおいて誘導し、次いでCFUの決定のために肺、脾臓、および腎臓を感染24時間後に回収した。
緑膿菌(P.aeruginosa)急性肺炎モデルにおける抗Pslモノクローナル抗体Cam−003およびWapR−004により処理した動物についての生存率
抗体またはPBSをそれぞれのモデルに感染24時間前に投与した。緑膿菌(P.aeruginosa)急性肺炎、角膜炎、および熱傷感染モデルを上記のとおり修正して実施した(DiGiandomenico,A.,et al.,Proc Natl Acad Sci USA 104,4624−4629(2007))。急性肺炎モデルにおいて、BALB/cマウス(The Jackson Laboratory)を0.05mlの接種材料中で懸濁させた緑膿菌(P.aeruginosa)株により感染させた。熱傷モデルにおいて、CF−1マウス(Charles River)は、92℃への10秒間の金属焼印加熱により10%の総体表面積熱傷を受けた。動物を緑膿菌(P. aeruginosa)株6077により示した用量において皮下感染させた。臓器負荷実験のため、急性肺炎をマウスにおいて誘導し、次いでCFUの決定のために肺、脾臓、および腎臓を感染24時間後に回収した。
モノクローナル抗体Cam−003およびWapR−004を、臨床疾患と関連する最も高頻度の血清型を表す緑膿菌(P.aeruginosa)株に対して急性致死肺炎モデルにおいて評価した。図6Aおよび6Cは、対照と比較して株PAO1および6294により感染させたCam−003処理マウスの有意な濃度依存性生存率を示す。図6Bおよび6Dは、33356および細胞毒性株6077によるチャレンジからの完全な保護が、Cam−003により45および15mg/kgにおいて行われた一方、80および90%の生存率が5mg/kgにおいて33356および6077についてそれぞれ観察されたことを示す。図6Eおよび6Fは、株6077(O11)(8×105CFU)(図6E)、または6077(011)(6×105CFU)(図6F)を有する急性肺炎モデルにおけるWapR−004処理マウスにおける有意な濃度依存性生存率を示す。
次に、Cam−003およびWapR−004をそれらの肺における緑膿菌(P.aeruginosa)臓器負荷を低減させ、遠位の臓器に拡散する能力について試験し、その後、動物を種々の濃度のWapR−004、Cam−003、または対照抗体によりいくつかの異なる濃度において処理した。Cam−003は、試験された4つ全ての株に対する緑膿菌(P.aeruginosa)肺負荷の低減において有効であった。Cam−003は、高病原性細胞毒性株6077に対して最も有効であり、低用量が高用量と同様に有効であった(図7D)。Cam−003は、PAO1(図7A)、6294(図7C)、および6077(図7D)により感染させたマウスの脾臓および腎臓への播種の低減における顕著な効果も有した一方、これらの臓器への播種は、33356感染マウスにおいては観察されなかった(図7B)。図7Eおよび7Fは、同様に、WapR−004が6294(O6)および6206(O11)による急性肺炎の導入後に臓器負荷を低減させたことを示す。具体的には、WapR−004は、感染マウスにおける脾臓および腎臓への緑膿菌(P.aeruginosa)播種の低減において有効であった。
実施例7
抗PcrVモノクローナル抗体V2L2の構築
r−PcrVを用いたUltra−Short免疫方法により、VelocImmune(登録商標)マウス(Regeneron Pharmaceuticals)を免疫し、PcrVへの結合および生存緑膿菌(P.aeruginosa)の溶血活性の中和について血清力価を追跡した。血清中に抗溶血活性を示すマウスを死なせ、脾臓およびリンパ節(腋窩、鼠径部および膝窩)を採取した。これらの器官からの細胞集団をビオチン化r−PcrVでパニングして、抗PcrV特異的B細胞を選択した。次に、選択した細胞をマウス骨髄腫パートナーP3X63−Ag8と融合させ、ハイブリドーマ選択培地中に25K細胞/ウェルで接種した。10日後、ハイブリドーマウェルからの培地を新鮮な培地と完全に交換し、さらに3〜4日後、ハイブリドーマ上澄みを抗溶血活性についてアッセイした。抗溶血活性を示すコロニーを、96ウェルプレートの0.2細胞/ウェルで限界希釈クローニングし、抗溶血活性アッセイを反復した。抗溶血活性を示すクローンをUltra−low IgG含有ハイブリドーマ培地に順応させた。順化培地からのIgGを精製し、インビトロ抗溶血活性についてアッセイし、緑膿菌(P.aeruginosa)による感染からの防御についてインビボでアッセイした。また、競合アッセイにより抗体を様々なグループに分類した。目的の抗体からの可変(V)ドメインを、それぞれの異なるクローンに由来するcDNAからサブクローニングした。サブクローン化Vセグメントを、哺乳動物発現プラスミド中の対応定常ドメインのcDNAとフレーム内で融合させた。組換えIgGを発現させ、HEK293細胞から精製した。特定のクローンから2つ以上のcDNA V−配列を取得した場合には、可変重鎖および軽鎖のあらゆる組み合わせを発現させ、特性決定することにより、機能性IgGを同定した。
抗PcrVモノクローナル抗体V2L2の構築
r−PcrVを用いたUltra−Short免疫方法により、VelocImmune(登録商標)マウス(Regeneron Pharmaceuticals)を免疫し、PcrVへの結合および生存緑膿菌(P.aeruginosa)の溶血活性の中和について血清力価を追跡した。血清中に抗溶血活性を示すマウスを死なせ、脾臓およびリンパ節(腋窩、鼠径部および膝窩)を採取した。これらの器官からの細胞集団をビオチン化r−PcrVでパニングして、抗PcrV特異的B細胞を選択した。次に、選択した細胞をマウス骨髄腫パートナーP3X63−Ag8と融合させ、ハイブリドーマ選択培地中に25K細胞/ウェルで接種した。10日後、ハイブリドーマウェルからの培地を新鮮な培地と完全に交換し、さらに3〜4日後、ハイブリドーマ上澄みを抗溶血活性についてアッセイした。抗溶血活性を示すコロニーを、96ウェルプレートの0.2細胞/ウェルで限界希釈クローニングし、抗溶血活性アッセイを反復した。抗溶血活性を示すクローンをUltra−low IgG含有ハイブリドーマ培地に順応させた。順化培地からのIgGを精製し、インビトロ抗溶血活性についてアッセイし、緑膿菌(P.aeruginosa)による感染からの防御についてインビボでアッセイした。また、競合アッセイにより抗体を様々なグループに分類した。目的の抗体からの可変(V)ドメインを、それぞれの異なるクローンに由来するcDNAからサブクローニングした。サブクローン化Vセグメントを、哺乳動物発現プラスミド中の対応定常ドメインのcDNAとフレーム内で融合させた。組換えIgGを発現させ、HEK293細胞から精製した。特定のクローンから2つ以上のcDNA V−配列を取得した場合には、可変重鎖および軽鎖のあらゆる組み合わせを発現させ、特性決定することにより、機能性IgGを同定した。
実施例8
緑膿菌(P.aeruginosa)角膜感染モデルにおける抗Pslモノクローナル抗体Cam−003、WapR−004および抗PcrVモノクローナル抗体V2L2により処理した動物についての生存率
次に、Cam−003およびWapR−004の効力を、病原体の付着および損傷組織のコロニー化能を強調する緑膿菌(P.aeruginosa)角膜感染モデルにおいて評価した。図8A〜Dおよび8F〜Gは、Cam−003およびWapR−004を受けたマウスが、陰性対照処理動物に観察されたものよりも眼の総ホモジネートにおいて顕著に少ない病原性および細菌カウント数の低減を有したことを示す。図8Eは、Cam−003は熱傷モデルにおいて試験した場合でも有効であったことを示し、抗体処理対照と比較して15および5mg/kgにおいて顕著な保護を提供する。図8(H):抗Pslおよび抗PcrVモノクローナル抗体V2L2を緑膿菌(P.aeruginosa)マウス角膜炎モデルにおいて試験した。C3H/HeNマウスに、PBSもしくは対照IgG1抗体(R347)を45mg/kgで、またはWapR−004(α−Psl)を5mg/kgで、またはV2L2(α−PcrV)を5mg/kgで腹腔内(IP)注射してから16時間後に、6077(O11−細胞毒性−1×106CFU)により感染させた。感染直前、マウスを麻酔してから、解剖顕微鏡下で27ゲージ針を用い、3つの1mmの擦り傷を各マウスの片方の眼の角膜および間質表層上に作り、次いで5μlの接種材料中の緑膿菌(P.aeruginosa)6077株を局所塗布した。感染から48時間後に眼を撮影し、続いて、解剖顕微鏡下で眼の視覚化により角膜の等級付けを行った。角膜感染の等級付けは、Prestonらによって以前記載されているように実施した(Preston,MJ.,1995,Infect.Immun.63:3497)。手短には、動物処理について知らない検査者によって、株6077による感染から48時間後に感染した免疫を等級付けした。以下の等級付け計画を用いた:グレード0、肉眼で非感染の目と同一の眼;グレード1、薄い混濁が瞳を一部覆っている;グレード2、濃い混濁が瞳を覆っている;グレード3、濃い混濁が瞳全体を覆っている;グレード4、角膜穿孔(眼球の収縮)。全身投与(IP)したCam−003またはWapR−004RADは、R347対照mAb治療動物で観察されたものより、眼の総ホモジネートにおいて有意に少ない病原性および低減した細菌コロニー形成単位(CFU)を示した。同様の結果が、R347処理対照と比較して、V2L2処理動物でも観察された。
緑膿菌(P.aeruginosa)角膜感染モデルにおける抗Pslモノクローナル抗体Cam−003、WapR−004および抗PcrVモノクローナル抗体V2L2により処理した動物についての生存率
次に、Cam−003およびWapR−004の効力を、病原体の付着および損傷組織のコロニー化能を強調する緑膿菌(P.aeruginosa)角膜感染モデルにおいて評価した。図8A〜Dおよび8F〜Gは、Cam−003およびWapR−004を受けたマウスが、陰性対照処理動物に観察されたものよりも眼の総ホモジネートにおいて顕著に少ない病原性および細菌カウント数の低減を有したことを示す。図8Eは、Cam−003は熱傷モデルにおいて試験した場合でも有効であったことを示し、抗体処理対照と比較して15および5mg/kgにおいて顕著な保護を提供する。図8(H):抗Pslおよび抗PcrVモノクローナル抗体V2L2を緑膿菌(P.aeruginosa)マウス角膜炎モデルにおいて試験した。C3H/HeNマウスに、PBSもしくは対照IgG1抗体(R347)を45mg/kgで、またはWapR−004(α−Psl)を5mg/kgで、またはV2L2(α−PcrV)を5mg/kgで腹腔内(IP)注射してから16時間後に、6077(O11−細胞毒性−1×106CFU)により感染させた。感染直前、マウスを麻酔してから、解剖顕微鏡下で27ゲージ針を用い、3つの1mmの擦り傷を各マウスの片方の眼の角膜および間質表層上に作り、次いで5μlの接種材料中の緑膿菌(P.aeruginosa)6077株を局所塗布した。感染から48時間後に眼を撮影し、続いて、解剖顕微鏡下で眼の視覚化により角膜の等級付けを行った。角膜感染の等級付けは、Prestonらによって以前記載されているように実施した(Preston,MJ.,1995,Infect.Immun.63:3497)。手短には、動物処理について知らない検査者によって、株6077による感染から48時間後に感染した免疫を等級付けした。以下の等級付け計画を用いた:グレード0、肉眼で非感染の目と同一の眼;グレード1、薄い混濁が瞳を一部覆っている;グレード2、濃い混濁が瞳を覆っている;グレード3、濃い混濁が瞳全体を覆っている;グレード4、角膜穿孔(眼球の収縮)。全身投与(IP)したCam−003またはWapR−004RADは、R347対照mAb治療動物で観察されたものより、眼の総ホモジネートにおいて有意に少ない病原性および低減した細菌コロニー形成単位(CFU)を示した。同様の結果が、R347処理対照と比較して、V2L2処理動物でも観察された。
実施例9
Cam−003Fc突然変異抗体Cam−003−TMは、縮小したOPKおよびインビボ効力を有するが、抗細胞付着活性を維持する。
二重の作用機序についての潜在性を考慮して、Fcγ受容体との相互作用を低減させるFcドメイン中の突然変異を保有するCam−003Fc突然変異抗体Cam−003−TM(Oganesyan,V.,et al.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 64,700−704(2008))を作出して、保護が抗細胞付着またはOPK活性とより相関性を示すかどうかを同定した。緑膿菌(P.aeruginosa)突然変異体を、Schweizer(Schweizer,H.P.,Mol Microbiol 6,1195−1204(1992);Schweizer,H.D.,Biotechniques 15,831−834(1993))により記載されるアレル置換方針に基づき構築した。ベクターを大腸菌(E.coli)株S17.1から緑膿菌(P.aeruginosa)株PAO1中に動員させ;組換え体を記載(Hoang,T.T.,et al.,Gene 212,77−86(1998))のとおり単離した。遺伝子欠損はPCRにより確認した。緑膿菌(P.aeruginosa)突然変異体は、野生型遺伝子を保有するpUCP30Tベース構築物により補完した。図9Aは、Cam−003−TMが、Cam−003と比較してOPK活性の4倍の降下を示したが(それぞれ、0.24および0.06のEC50)、細胞付着アッセイにおいて有効であったことを示す(図9B)。図9Cは、Cam−003−TMが肺炎に対してもあまり有効でなかったことを示し、このことは、最適なOPK活性が最適な保護に必要であることを示唆する。OPKおよび細胞付着アッセイは、それぞれ実施例2および4に既に記載のとおり実施した。
Cam−003Fc突然変異抗体Cam−003−TMは、縮小したOPKおよびインビボ効力を有するが、抗細胞付着活性を維持する。
二重の作用機序についての潜在性を考慮して、Fcγ受容体との相互作用を低減させるFcドメイン中の突然変異を保有するCam−003Fc突然変異抗体Cam−003−TM(Oganesyan,V.,et al.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 64,700−704(2008))を作出して、保護が抗細胞付着またはOPK活性とより相関性を示すかどうかを同定した。緑膿菌(P.aeruginosa)突然変異体を、Schweizer(Schweizer,H.P.,Mol Microbiol 6,1195−1204(1992);Schweizer,H.D.,Biotechniques 15,831−834(1993))により記載されるアレル置換方針に基づき構築した。ベクターを大腸菌(E.coli)株S17.1から緑膿菌(P.aeruginosa)株PAO1中に動員させ;組換え体を記載(Hoang,T.T.,et al.,Gene 212,77−86(1998))のとおり単離した。遺伝子欠損はPCRにより確認した。緑膿菌(P.aeruginosa)突然変異体は、野生型遺伝子を保有するpUCP30Tベース構築物により補完した。図9Aは、Cam−003−TMが、Cam−003と比較してOPK活性の4倍の降下を示したが(それぞれ、0.24および0.06のEC50)、細胞付着アッセイにおいて有効であったことを示す(図9B)。図9Cは、Cam−003−TMが肺炎に対してもあまり有効でなかったことを示し、このことは、最適なOPK活性が最適な保護に必要であることを示唆する。OPKおよび細胞付着アッセイは、それぞれ実施例2および4に既に記載のとおり実施した。
実施例10
抗Psl抗体についてのエピトープマッピングおよび相対親和性
エピトープマッピングを競合ELISAにより実施し、緑膿菌(P.aeruginosa)株PAO1の一晩培養物の上澄みに由来するPslを用いるOCTET(登録商標)フローシステムを使用して確認した。競合ELISAのため、EZ−Linkスルホ−NHS−ビオチンおよびビオチン化キット(Thermo Scientific)を使用して抗体をビオチン化した。抗原コートプレートを、未標識抗体と同時インキュベートしたEC50のビオチン化抗体により処理した。HRP−コンジュゲートストレプトアビジン(Thermo Scientific)とインキュベートした後、プレートを上記のとおり発色させた。抗PslmAb間の競合実験は、抗体が少なくとも3つのユニークエピトープを標的化することを決定し、クラス1、2、および3抗体と称した(図10A)。クラス1および2抗体は、結合について競合しないが、クラス3抗体WapR−016は、クラス1および2抗体の結合を部分的に阻害する。
抗Psl抗体についてのエピトープマッピングおよび相対親和性
エピトープマッピングを競合ELISAにより実施し、緑膿菌(P.aeruginosa)株PAO1の一晩培養物の上澄みに由来するPslを用いるOCTET(登録商標)フローシステムを使用して確認した。競合ELISAのため、EZ−Linkスルホ−NHS−ビオチンおよびビオチン化キット(Thermo Scientific)を使用して抗体をビオチン化した。抗原コートプレートを、未標識抗体と同時インキュベートしたEC50のビオチン化抗体により処理した。HRP−コンジュゲートストレプトアビジン(Thermo Scientific)とインキュベートした後、プレートを上記のとおり発色させた。抗PslmAb間の競合実験は、抗体が少なくとも3つのユニークエピトープを標的化することを決定し、クラス1、2、および3抗体と称した(図10A)。クラス1および2抗体は、結合について競合しないが、クラス3抗体WapR−016は、クラス1および2抗体の結合を部分的に阻害する。
抗体親和性は、一晩PAO1培養物の上澄みに由来するPslを使用してOCTET(登録商標)結合アッセイにより測定した。抗体KDは、それぞれの抗体について7つの濃度の結合キネティクスを平均化することにより測定した。親和性計測値は、384傾斜底ウェルプレートを使用するFORTEBIO(登録商標)OCTET(登録商標)384装置により取った。一晩PAO1培養物±pslA遺伝子からの上澄みをPsl資源として使用した。試料をOCTET(登録商標)アミノプロピルシラン(PBS中で水和)センサー上にロードし、ブロッキングし、次いでいくつかの濃度において抗PslmAb結合、およびPBS+1%BSA中への解離を計測した。全ての手順は、記載(Wang,X.,et al.,J Immunol Methods 362,151−160)のとおり実施した。会合および解離生ΔnMデータをGraphPad Prismにより曲線フィッティングした。図10Aは、上記で特性決定された抗Psl抗体の相対結合親和性を示す。クラス2抗体は、全ての抗Psl抗体のうちで最大の親和性を有した。図10Aは、細胞付着およびOPKデータ実験のまとめも示す。図10Bは、実施例2に記載した部位指定突然変異誘発によりリード最適化したWap−004RAD(W4RAD)突然変異体ならびに他のW4突然変異体の相対結合親和性およびOPK EC50値を示す。図10Cは、Wap−004RAD(W4RAD)、Wap−004RAD−生殖系列(W4RAD−GL)、ならびにリード最適化した抗Pslモノクローナル抗体(Psl0096、Psl0170、Psl0225、Psl0304、Psl0337、Psl348、Psl0567、Psl0573、Psl0574、Psl0582、Psl0584、Psl0585、Psl0588およびPsl0589)の相対結合親和性を示す。以下の実施例10に示すように、そのOPK活性増大に基づき、強調表示したクローンPsl0096、Psl0225、Psl0337、Psl0567およびPsl0588を選択した。
実施例11
緑膿菌(P.aeruginosa)オプソニン食菌殺傷(OPK)アッセイにおけるリード最適化WapR−004(W4)突然変異体クローンおよびリード最適化抗Pslモノクローナル抗体の評価
この実施例は、実施例2に記載の方法を用いて、緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを促進するリード最適化WapR−004(W4)突然変異体クローンおよびリード最適化抗Pslモノクローナル抗体の評価について記載する。図11A〜Qから、陰性対照抗体R347を除くすべての抗体が、発光緑膿菌(P.aeruginosa)血清型O5株(PAO1.lux)の抗体濃度依存的殺傷を媒介したことがわかる。
緑膿菌(P.aeruginosa)オプソニン食菌殺傷(OPK)アッセイにおけるリード最適化WapR−004(W4)突然変異体クローンおよびリード最適化抗Pslモノクローナル抗体の評価
この実施例は、実施例2に記載の方法を用いて、緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを促進するリード最適化WapR−004(W4)突然変異体クローンおよびリード最適化抗Pslモノクローナル抗体の評価について記載する。図11A〜Qから、陰性対照抗体R347を除くすべての抗体が、発光緑膿菌(P.aeruginosa)血清型O5株(PAO1.lux)の抗体濃度依存的殺傷を媒介したことがわかる。
実施例12
抗PcrVモノクローナル抗体V2L2は、複数の株からの急性肺炎による致死率を低下させる
PcrVエピトープ多様性を3つのアプローチ:ビーズを用いたフローサイトメトリー法、競合ELISAおよび断片化rPcrVのウエスタンブロットを用いて分析した。抗PcrVmAb間の競合実験により、抗体が、少なくとも6つのユニークなエピトープ(クラス1、2、3、4、5および6抗体と称する)をターゲティングしたことが判明した(図12A)。クラス2および3抗体は、結合について部分的に競合する。以下に記載するように、別のエピトープクラス:クラス1(V2L7、3G5、4C3および11Ab)、クラス2(1E6および1F3)、クラス3(29D2、4A8および2H3)、クラス4(V2L2)およびクラス5(21F1、LE10およびSH3)を呈示するmAbを、インビボ保護について試験した。
抗PcrVモノクローナル抗体V2L2は、複数の株からの急性肺炎による致死率を低下させる
PcrVエピトープ多様性を3つのアプローチ:ビーズを用いたフローサイトメトリー法、競合ELISAおよび断片化rPcrVのウエスタンブロットを用いて分析した。抗PcrVmAb間の競合実験により、抗体が、少なくとも6つのユニークなエピトープ(クラス1、2、3、4、5および6抗体と称する)をターゲティングしたことが判明した(図12A)。クラス2および3抗体は、結合について部分的に競合する。以下に記載するように、別のエピトープクラス:クラス1(V2L7、3G5、4C3および11Ab)、クラス2(1E6および1F3)、クラス3(29D2、4A8および2H3)、クラス4(V2L2)およびクラス5(21F1、LE10およびSH3)を呈示するmAbを、インビボ保護について試験した。
ハイブリドーマ技術を用いて、新規抗PcrVmAbを単離し、ウサギ赤血球溶解阻害アッセイを用いて、大部分の強力なT3SS阻害物質を選択した。細胞傷害性アッセイの阻害パーセントを親V2L2mAb、mAb166(陽性対照)およびR347(陰性対照)について分析したが、ここでは、約10のMOIで対数増殖期緑膿菌(P.aeruginosa)6077(exoU+)と混合した培養気管上皮細胞系A549に、抗体を投与した。放出された乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性を測定することによりA549溶解をアッセイし、mAbの存在下での溶解をmAbなしのウェルと比較することにより、阻害パーセントを決定した。V2L2mAb、mAb166(陽性対照)およびR347(陰性対照)をRBCの溶解を阻止するその能力について評価したが、ここでは、抗体を対数増殖期緑膿菌(P.aeruginosa)6077(exoU+)および洗浄済ウサギ赤血球(RBC)と混合し、37℃で2時間インキュベートした。インタクトなRBCをペレット化し、溶解の程度を無細胞上澄みのOD405を測定することにより決定した。抗PcrVmAbの存在下での溶解をmAbなしのウェルと比較することにより、阻害パーセントを決定した。陽性対照抗体のmAb166は、以前特性決定された抗PcrV抗体である(J Infect Dis.186:64−73(2002),Crit Care Med.40:2320−2326(2012))。(B)親V2L2mAbは、0.10μg/mlのIC50で、細胞傷害性の阻害を示し、mAb166(IC50:2.8μg/ml)より28倍低いIC50濃度を呈示した。(C)V2L2も、0.37μg/mlのIC50で、RBC溶解の阻害を示し、mAb166(IC50:3.7μg/ml)より10倍低いIC50濃度を呈示した。
潜在的免疫原性を低減するように、V2L2可変領域を完全に生殖系列化した。全6つのCDRについて20個のアミノ酸で各位置をランダム化する節減突然変異誘発を用いて、V2L2を親和性成熟させ、親和性が改善した単一突然変異を同定した。次に、コンビナトリアルライブラリーを用いて、親和性が改善した単一突然変異のあらゆる可能な組み合わせをコードした。IgGフォーマットの結合ELISAを用いて、PcrVに対する親和性が改善したクローンを選択した。親和性の改善により上位クローンをランク付けし、インビトロ機能性アッセイで分析した。V2L2CDRを系統的に突然変異誘発し、競合スクリーンにより、PcrVに対する親和性が改善したクローンを選択した。親和性増大によりクローンをランク付けし、機能性アッセイで分析した。図12Dに示すように、シュードモナス属(Pseudomonas)株6077感染A549細胞を用いて、V2L2生殖系列化MAb(V2L2−GL)、V2L2−GL最適化mAb(V2L2−P4M、V2L2−MFS、V2L2−MDおよびV2L2−MR)、ならびに陰性対照R347について、RBC溶解を分析した。V2L2−GL、V2L2−P4M、V2L2−MFS、V2L2−MDおよびV2L2−MRは、RBC溶解の阻害を示した。図12Eに示すように、mAb1E6、1F3、11A6、29D2、PCRV02およびV2L7は、RBC溶解の阻害を示した。図12Fに示すように、V2L2は、RBC溶解の阻害において29D2より強力であった。
Bio−Rad ProteOn(商標)XPR36計器を用いて、V2L2−GLおよびV2L2−MDの結合反応速度を測定した。抗ヒトIgG試薬を用いて、GLCバイオセンサーチップ上で抗体を捕捉した。rPcrVタンパク質を様々な濃度で注射した後、解離期が600秒にわたり続いた。データを取得し、ProteOn Managerソフトウエアを用いて分析した。図12(G〜H)は、(G)V2L2−GLおよび(H)V2L2−MD抗体の相対結合親和性を示す。クローンV2L2−MDは、V2L2−GLに対しKdを2〜3倍増大した。
急性肺炎モデルを用い、抗PcrV抗体の投与のインビボ効果をマウスにおいて試験した。図13(A〜B)に示すように、各回で濃度を増加させるV2L2抗体、陽性対照抗PcrV抗体(mAb166)、または陰性対照(R347)のいずれかでマウスのグループを処理した。また、図13(C〜D)に示すように、各回で濃度を増加させるV2L2抗体、PcrV抗体PcrV−02、または陰性対照(R347)のいずれかによってマウスのグループを処理した。処理から24時間後、全マウスを5×107CFU(C)緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)6294(O6)または(D)PA103A(O11)により感染させた。図13に示すように、ほぼ全ての対照マウスが、感染後48時間までに感染により死んだ。しかし、V2L2は、感染後168時間まで、生存の向上に用量依存的効果を示した。さらに、V2L2は、同様の用量でmAb166より有意に強力な防御をもたらした(6077株の場合、P=0.025、5mg/kg;6294株の場合、P<0.0001、1mg/kg)。
図13(E〜H)に示すように、各回で濃度を増加させる11A6、3G5もしくはV2L7、同一の濃度の29D2、1F3、1E6、V2L2、LE10、SH3、4A8、2H3、または21F1、濃度を増加させる29D2、濃度を増加させるV2L2、PcrV抗体PcrV−02、または陰性対照(R347)のいずれかによって、マウスのグループを処理した。マウスにmAbを腹腔内(IP)注射してから24時間後、シュードモナス属(Pseudomonas)株6077(6×106CFU/動物)を鼻腔内注射した。図13Eに示すように、mAb11A6、3G5およびV2L7は、インビボで防御をもたらさなかった。図13Fに示すように、mAb29D2は、インビボで防御をもたらす。図13Gに示すように、mAbV2L2も、インビボで保護をもたらす。図13Hは、29D2およびV2L2のインビボ比較を示す。図13Iは、mAbV2L2が、別のシュードモナス属(Pseudomonas)株(すなわち、6294およびPA103A)から防御することを示している。
また、V2L2の投与に応答するシュードモナス属(Pseudomonas)に感染したマウスの臓器負荷も試験した。図14(A)マウスを1mg/kgのR347(対照)、または1mg/kg、0.2mg/kg、もしくは0.07mg/kgのV2L2のいずれかで処理した後、1.2×106cfuのシュードモナス属(Pseudomonas)株6206で鼻腔内感染させた。図14(B)マウスはまた、15mg/kgのR347(陰性対照);15.0mg/kg、5.0mg/kg、もしくは1.0mg/kgのmAb166(陽性対照);または5.0mg/kg、1.0mg/kg、もしくは0.2mg/kgのV2L2のいずれかによっても処理し、次いで、5.5×106cfuのシュードモナス属(Pseudomonas)株6206で鼻腔内感染させた。図14(A〜B)に示すように、V2L2は、腎臓におけるクリアランスにほとんど効果がないが、用量依存的に、肺および脾臓の両方に対する播種を大幅に低減した。さらに、V2L2は、同様の用量で、mAb166より有意な臓器CFU低減をもたらした(P<0.0001、1mg/kg、肺)。
実施例13
WapR−004(抗Psl)およびV2L2(抗PcrV)抗体を用いた併用療法のインビボ活性
抗体V2L2およびWapR−004(RAD)を用いて、抗Pslおよび抗PcrV結合ドメインの併用投与のインビボ効果をさらに試験した。マウスのグループをR347(2.1mg/kg−陰性対照)、V2L2(0.1mg/kg)、W4−RAD(0.5mg/kg)、またはV2L2/W4併用(各々、0.1、0.5、1.0もしくは2.0mg/kgのいずれか)で処理した。抗体の投与から24時間後、全マウスを、5.25×105cfu6206(O11−ExoU+)含有の接種材料で感染させた。感染から24時間後、肺、脾臓、および腎臓を採取し、ホモジナイズした後、組織のグラム当たりのコロニー形成単位(CFU)決定のために平板培養した。図15に示すように、試験濃度で、V2L2およびW4のいずれも、臓器負荷の低減に有効であり、V2L2/W4併用は、組織クリアランスにおいて相加作用を示した。肺組織の組織学的検査から、V2L2またはWapR−004を単独で受けたマウスと比較して、少ない出血、少ない浮腫、および炎症性浸潤の低減が明らかにされた(表5)。
WapR−004(抗Psl)およびV2L2(抗PcrV)抗体を用いた併用療法のインビボ活性
抗体V2L2およびWapR−004(RAD)を用いて、抗Pslおよび抗PcrV結合ドメインの併用投与のインビボ効果をさらに試験した。マウスのグループをR347(2.1mg/kg−陰性対照)、V2L2(0.1mg/kg)、W4−RAD(0.5mg/kg)、またはV2L2/W4併用(各々、0.1、0.5、1.0もしくは2.0mg/kgのいずれか)で処理した。抗体の投与から24時間後、全マウスを、5.25×105cfu6206(O11−ExoU+)含有の接種材料で感染させた。感染から24時間後、肺、脾臓、および腎臓を採取し、ホモジナイズした後、組織のグラム当たりのコロニー形成単位(CFU)決定のために平板培養した。図15に示すように、試験濃度で、V2L2およびW4のいずれも、臓器負荷の低減に有効であり、V2L2/W4併用は、組織クリアランスにおいて相加作用を示した。肺組織の組織学的検査から、V2L2またはWapR−004を単独で受けたマウスと比較して、少ない出血、少ない浮腫、および炎症性浸潤の低減が明らかにされた(表5)。
同様に免疫した動物も、急性肺炎感染からの生存について評価した。
実施例14
緑膿菌(P.aeruginosa)急性肺炎モデルにおける抗PcrVモノクローナル抗体V2L2により処理した動物についての生存率
実施例11に既述したように、緑膿菌(P.aeruginosa)に対する急性致死的肺炎モデルにおいて、モノクローナル抗体V2L2−GL、V2L2−MD、V2L2−A、V2L2−C、V2L2−PM4およびV2L2−MFSを評価した。図16(A〜F)は、対照と比較して、6077株に感染させた全てのV2L2処理マウスにおける生存を示す。しかし、各用量:0.5mg/kgおよび1mg/kg(A〜C)または0.5mg/kgおよび0.1mg/kg(D〜F)のV2L2抗体間で生存における有意な差は観察されない。図16(G〜I)は、対照と比較して、6077株に感染させた全てのV2L2処理マウスにおける生存を示す。各用量:0.5mg/kgおよび1mg/kg(G〜I)のV2L2抗体間で生存に有意な差は観察されない。(A〜H)
緑膿菌(P.aeruginosa)急性肺炎モデルにおける抗PcrVモノクローナル抗体V2L2により処理した動物についての生存率
実施例11に既述したように、緑膿菌(P.aeruginosa)に対する急性致死的肺炎モデルにおいて、モノクローナル抗体V2L2−GL、V2L2−MD、V2L2−A、V2L2−C、V2L2−PM4およびV2L2−MFSを評価した。図16(A〜F)は、対照と比較して、6077株に感染させた全てのV2L2処理マウスにおける生存を示す。しかし、各用量:0.5mg/kgおよび1mg/kg(A〜C)または0.5mg/kgおよび0.1mg/kg(D〜F)のV2L2抗体間で生存における有意な差は観察されない。図16(G〜I)は、対照と比較して、6077株に感染させた全てのV2L2処理マウスにおける生存を示す。各用量:0.5mg/kgおよび1mg/kg(G〜I)のV2L2抗体間で生存に有意な差は観察されない。(A〜H)
全ての対照マウスが、感染後約48時間までに感染により死んだ。
実施例15
WapR−004/V2L2二重特異性抗体の構築
図17Aは、TNFα二重特異性モデル構築物を示す。Bs1−TNFα/W4の場合、W4scFvを、(G4S)2リンカーを介してTNFαVLのアミノ末端に融合させる。Bs2−TNFα/W4の場合、W4scFvを、(G4S)2リンカーを介してTNFαVHのアミノ末端に融合させる。Bs3−TNFα/W4の場合、W4scFvを、(G4S)2リンカーを介してCH3のカルボキシ末端に融合させる。
WapR−004/V2L2二重特異性抗体の構築
図17Aは、TNFα二重特異性モデル構築物を示す。Bs1−TNFα/W4の場合、W4scFvを、(G4S)2リンカーを介してTNFαVLのアミノ末端に融合させる。Bs2−TNFα/W4の場合、W4scFvを、(G4S)2リンカーを介してTNFαVHのアミノ末端に融合させる。Bs3−TNFα/W4の場合、W4scFvを、(G4S)2リンカーを介してCH3のカルボキシ末端に融合させる。
WapR−004+V2L2の併用が、シュードモナス属(Pseudomonas)チャレンジからの防御をもたらすことから、WapR−004scFv(W4−RAD)およびV2L2IgGを含む二重特異性構築物を作製した(図17B)。Bs2−V2L2−2Cを作製するために、W4−RADscFvを、(G4S)2リンカーを介してV2L2VHのN末端に融合させた。Bs3−V2L2−2Cを作製するために、W4−RADscFvを、(G4S)2リンカーを介してCH3のC末端に融合させた。Bs4−V2L2−2Cを作製するために、W4−RADscFvをヒンジ領域に挿入し、scFvのN末端およびC末端上に(G4S)2リンカーにより連結させた。Bs2−W4−RAD−2Cを作製するために、V2L2scFvを、(G4S)2リンカーを介してW4−RADVHのアミノ末端に融合させた。
Bs3構築物のW4−RADscFvを作製するために、W4−RADVHおよびVLをPCRにより増幅した。W4−RADVHを増幅するのに用いたプライマーは、以下の通りであった:(G4S)2リンカーと、22bpのVH N末端配列(GTAAAGGCGGAGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCGG(配列番号224))とを含むW4−RADVHフォワードプライマー;および(G4S)2リンカーの一部と、22bpのVH C末端配列(GATCCTCCGCCGCCGCTGCCCCCTCCCCCAGAGCCCCCTCCGCCACTCGAGACGGTGACCAGGGTC(配列番号225))とを含むW4−RADVHリバースプライマー。同様に、W4−RADVLを、以下のプライマーを用い、PCRにより増幅した:(G4S)2リンカーの一部と、22bpのVL N末端配列(AGGGGGCAGCGGCGGCGGAGGATCTGGGGGAGGGGGCAGCGAAATTGTGTTGACACAGTCTC(配列番号226))とを含むW4−RADVLフォワードプライマー;およびベクター配列の一部と、22bpのVL C末端配列(CAATGAATTCGCGGCCGCTCATTTGATCTCCAGCTTGGTCCCAC(配列番号227))とを含むW4−RADVLリバースプライマー。次に、重複断片を互いに融合させることにより、W4−RADscFvを形成した。
Bs3ベクターのW4−RADscFv配列:下線で示す配列は、G4Sリンカーである
W4−RADscFv断片を増幅した後、これを精製してから、BamHI/NotIで消化しておいたBs3ベクターに連結させた。連結は、In−Fusionシステムを用いて行い、続いて、Stellarコンピテント細胞で形質転換を実施した。コロニーを配列決定することにより、正しいW4−RADscFv挿入片を確認した。
Bs3−V2L2−2Cを作製するために、Bs3ベクター中のIgG部分をV2L2IgGで置換した。手短には、W4−RADscFvを含有するBs3ベクターをBssHII/SalIで消化し、得られたベクターバンドをゲル精製した。同様に、V2L2ベクターを含有するベクターをBssHII/SalIで消化し、V2L2挿入片をゲル精製した。次に、V2L2挿入片をBs3−W4−RADscFvベクターと連結させてから、コロニーを配列決定することにより、正しいV2L2IgG挿入片を確認した。
同様の手法を用いて、Bs2−V2L2−2Cを作製した。
Bs2ベクターのW4−RADscFv−V2L2VH配列:下線で示す配列は、G4Sリンカーである
以下のプライマーを用いて、W4−RADscFvを増幅した。VH(フォワードプライマー)およびVL(リバースプライマー):一部のイントロン、3’シグナルペプチドと、22bpのW4−RADVH N末端配列(TTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCGG(配列番号230))とを含むBs2ベクターのW4−RADVHフォワードプライマー、および(G4S)2リンカーと、32bpのVL C末端配列(CCCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCGCCTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCACAGCCGAAAG(配列番号231))とを含むBs2ベクターのW4−RADVLリバースプライマー。
V2L2VH領域を増幅するために、以下のプライマーを用いた:(G4S)2リンカーと、22bpのV2L2VH N末端配列(GGCGGAGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGAGATGCAGCTGTTGGAGTCTGG(配列番号232))とを含むV2L2VHフォワードプライマー、およびCH1N末端配列と、22bpのV2L2VH C末端配列(ATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC(配列番号233))とを含むV2L2VHリバースプライマー。
次に、これらのプライマーを用いて、V2L2VHを増幅した後、これをオーバーラップによりW4−RADscFvおよびV2L2VHと結合させることにより、W4−RADscFv−V2L2−VHを取得した。次いで、W4−RADscFv−V2L2−VHをゲル精製し(オーバーラップPCRから);BsrGI/SalIでBs2ベクターを消化し、ベクターバンドをゲル精製することにより、W4−RADscFv−V2L2VHをBs2ベクターに連結させた。次に、In−Fusionシステムにより、W4−RADscFv−V2L2−VHをBs2ベクターと連結させ、Stellarコンピテント細胞中に形質転換させて、正しいW4−RADscFv−V2L2−VH挿入片についてコロニーを確認した。Bs2ベクター中のVLをV2L2VLで置換するために、W4−RADscFv−V2L2−VHを含むBs2ベクターをBssHII/BsiWIで消化し、ベクターバンドをゲル精製した。次に、pOE−V2L2ベクターをBssHII/BsiWIで消化し、V2L2VL挿入片をゲル精製した。次いで、V2L2VL挿入片をBs2−W4−RADscFv−V2L2−VHベクターと連結させて、正しいV2L2IgG挿入片についてコロニーを配列決定した。
W4−RADscFvをPCRおよび以下のプライマーを用いて作製した:リンカー配列の一部と、24bpのW4−RADVH N末端配列(GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCGGGC(配列番号236))を含むBs4ベクターのW4−RADVHフォワードプライマー;ならびに一部のヒンジ配列、リンカーおよび21bpのW4−RADVL C末端配列(GTGTGAGTTTTGTCggatccCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC(配列番号237))を含むBs4ベクターのW4−RADVLリバースプライマー。
次に、W4−RADscFv(PCRから)をゲル精製することにより、W4−RADscFvをBs4ベクターに連結して、Bs4−V2L2−2Cを取得し;Bs4−V2L2ベクターをBamHIで消化した後、ベクターバンドをゲル精製した。続いて、In−Fusionシステムおよびベクター形質転換Stellarコンピテント細胞により、W4−RADscFvをBs4ベクターと連結させた。正しいW4−RADscFv挿入片についてコロニーを確認した。
Bs4−V2L2−2C構築物の軽鎖および重鎖の配列をそれぞれ、配列番号327および328に記載する。
実施例16
Psl/PcrV二重特異性抗体は、肺炎モデルにおいて生存を促進する
初めに、Bs2およびBs3二重特異性抗体を試験して、これらが、二重特異性フォーマットにおいてそのW4またはV2L2活性を保持するかどうかを調べた。親W4scFvについて、W4およびTNFα結合アームを有する二重特異性抗体を作製した。発光緑膿菌(P.aeruginosa)株PAO1.luxを用いて、細胞付着アッセイを実施した。図18に示すように、全ての二重特異性構築物が、親W4−IgG1構築物と同様に機能した。
Psl/PcrV二重特異性抗体は、肺炎モデルにおいて生存を促進する
初めに、Bs2およびBs3二重特異性抗体を試験して、これらが、二重特異性フォーマットにおいてそのW4またはV2L2活性を保持するかどうかを調べた。親W4scFvについて、W4およびTNFα結合アームを有する二重特異性抗体を作製した。発光緑膿菌(P.aeruginosa)株PAO1.luxを用いて、細胞付着アッセイを実施した。図18に示すように、全ての二重特異性構築物が、親W4−IgG1構築物と同様に機能した。
図19(A〜C)に示すように、(A)6206および(B)6206ΔpslA感染細胞の両方を用いて、Bs2−V2L2およびBs3−V2L2の両者について、細胞傷害性の阻害パーセントを分析し、また(C)6206感染細胞を用いて、Bs2−V2L2−2C、Bs3−V2L2−2C、およびBs4−V2L2−2Cについて、RBC溶解の阻害パーセントを分析した。図19(A〜C)に示すように、全ての二重特異性抗体が、6206および6206ΔpslA感染細胞を用いた親V2L2抗体と同様のレベルで、抗細胞傷害活性を保持し、RBC溶解を阻止した。
Bs2およびBs3二重特異性抗体が、緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを媒介する能力を、実施例2に記載の方法を用いて評価した。Bs2−V2L2抗体は、親W4−RAD抗体と比較して同様の殺傷を示したが、Bs3−V2L2抗体の殺傷は低下した(図20A)。Bs2−V2L2−2CおよびBs4−V2L2−2C抗体は、親W4−RAD抗体と比較して同様の殺傷を示したが、Bs3−V2L2−2C抗体の殺傷は低下した(図20B)。図20Cは、Bs4抗体の様々な調製物(古いロット対新しいロット)が、親W4−RAD抗体と比較して同様の殺傷を示したが、Bs4−V2L2−2C−YTE抗体は、Bs4−V2L2−2Cと比較して、OPK活性の3倍低下を呈したことを示す。YTE突然変異体は、IgGの重鎖に導入された3つの「YTE突然変異」M252Y、S254T、およびT256E(番号付けは、Kabatに記載のEUインデックスに従う)の組み合わせを含む。米国特許第7,658,921号明細書(参照として本明細書に組み込む)を参照されたい。YTE突然変異体は、同一の抗体の野生型と比較して、約4倍抗体の血清半減期を延長することが判明している。例えば、Dall’Acqua et al.,J.Biol.Chem.281:23514−24(2006)および米国特許第7,083,784号明細書(参照により全体として本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
W4およびV2L2の両方が二重特異性フォーマットにおいて活性を保持することを確認した後、急性肺炎感染からの生存について、Bs2−V2L2、Bs3−V2L2およびBs4−V2L2構築物を評価した。図21Aに示すように、感染後約30時間までに、全ての対照マウスが感染により死んだ。Bs3−V2L2マウスは全て、V2L2対照を受けたマウスと共に生存した。約90%のW4−RAD免疫動物が生存した。対照的に、図B〜Fは、Bs2−V2L2マウスの約50%が、120時間までに感染により死んだことを示す。感染後約48時間までに、全ての対照マウスが感染により死んだ。図G〜Hから、いずれの用量でBs4−V2L2−2CおよびBs4−V2L2−2C−YTE処理したマウスの間にも生存率の差は認められない。これらの結果は、両抗体が、6206急性肺炎モデルにおいて同等に機能することを示すものである。図21Iから、Bs2−V2L2、Bs4−V2L2−2C、およびW4−RAD+V2L2抗体混合物が、緑膿菌(P.aeruginosa)株6206(ExoU+)でチャレンジしたマウスの致死的肺炎に対する防御において最も有効であることがわかる。
前述と同様の免疫マウスについて臓器負荷も評価した。前述のように免疫した後、マウスを2.75×105CFU6206によりチャレンジした。図22に示すように、試験濃度で、Bs2−V2L2およびBs3−V2L2の両方が、肺において臓器負荷を有意に低減させた。しかし、二重特異性構築物を準最適濃度で用いたために、二重特異性構築物のいずれも、親抗体と比較して、脾臓または腎臓における臓器負荷を有意に低減させることはできなかった。準最適濃度を用いて、抗体活性を解読することができた。
6294株を用いて、二重特異性抗体の生存および臓器負荷効果も評価した。6294モデル系を用いて、BS2−V2L2およびBS3−V2L2の両方が、全ての組織において臓器負荷を、V2L2親抗体のそれと同等のレベルまで有意に低減させた。W4−RAD親抗体は、臓器負荷の低減に影響をもたらさなかった(図23A)。図23Bに示すように、Bs2−V2L2、Bs3−V2L2、およびW4−RAD+V2L2の組み合わせは、全ての組織において臓器負荷をV2L2親抗体と同等のレベルまで有意に低減させた。
免疫マウスについての生存データは、前記と同様の6294チャレンジマウスにおいて同様であった。図24に示すように、BS3−V2L2は、V2L2単独処理マウスと同様の生存活性を示したが、BS2−V2L2処理マウスは、やや低いチャレンジからの防御レベルを示した。
また、前述のように併用治療動物と比較して、二重特異性抗体治療動物においても臓器負荷を評価した。図25(A〜C)に示すように、BS2−V2L2およびBS3−V2L2の両方が、肺、脾臓および腎臓において臓器負荷をW4+V2L2併用と同等のレベルまで低減させた。肺の場合、ダンの事後検定(Dunn’s post test)を含むクラスカル−ウォリス(Kruskal−Wallis)検定を用いると、併用は、細菌CFU Bs2−およびBs3−V2L2ならびにV2L2を有意に低減させた。低減への傾向は認められたものの、脾臓および腎臓における細菌負荷に有意な差は観察されなかった。肺炎モデルにおいて、6206を用い、Bs4−GLOについても臓器負荷試験を実施した。図25(D)に示すように、より高い濃度の抗体をマウスの予防に用いると、肺からの有意な(ダンの事後検定(Dunn’s post test)を含むクラスカル−ウォリス(Kruskal−Wallis)検定)レベルの細菌負荷の低減が観察された。さらに、このモデルに、より高い濃度のBs4−GLOを用いると、脾臓および腎臓への細菌播種の有意な低減も観察された。
これらの結果を、緑膿菌(P.aeruginosa)株6294を用いた1.33×107CFU(表6A)、緑膿菌(P.aeruginosa)株6294を用いた1.7×107CFU(表6B)、および緑膿菌(P.aeruginosa)株6206を用いた9.25×105CFU(表7)によりチャレンジした免疫BALB/cマウスの肺組織の組織学的検査によって確認した。
実施例17
治療補助療法:Bs4−V2L2−2C+抗生物質
実施例6に既述したように、緑膿菌(P.aeruginosa)6206株に対するBs4二重特異性抗体および抗生物質補助療法の生存効果を急性致死的肺炎モデルにおいて評価した(図26(A〜J))。(A〜B)マウスをR347(陰性対照)またはBs4−V2L2−2Cで処理してから24時間後、6206により感染させるか、または、感染から1時間後、シプロフロキサシン(CIP)で処理するか、あるいは、感染から24時間前のBs4−V2L2−2Cと、感染から1時間後のCIPの併用で処理した。(C)マウスを6206により感染させてから1時間後に、R347またはCIPまたはBs4−V2L2−2C、あるいはBs4−V2L2−2CとCIPの併用で処理した。(D)マウスを6206により感染させてから2時間後に、R347またはCIPまたはBs4−V2L2−2C、あるいはBs4−V2L2−2CとCIPの併用で処理した。(E)マウスを6206により感染させてから2時間後に、R347もしくはBs4−V2L2−2Cで処理するか、または感染から1時間後にCIPで処理するか、あるいは感染から2時間後のBs4−V2L2−2Cと、感染から1時間後のCIPとの併用で処理した。(F)マウスを6206により感染させてから1時間後に、R347またはメロペネム(Meropenem)(MEM)もしくはBs4−V2L2−2C、またはBs4−V2L2−2CとMEMの併用で処理した。(G)マウスを6206により感染させてから2時間後に、R347もしくはBs4−V2L2−2Cで処理するか、または感染から1時間後にMEMで処理するか、あるいは感染から2時間後のBs4−V2L2−2Cと、感染から1時間後のMEMとの併用で処理した。(H)マウスを6206により感染させてから2時間後に、R347またはBs4−V2L2−2CもしくはMEM、あるいはBs4−V2L2−2CとMEMの併用で処理した。(I)マウスを6206により感染させてから4時間後に、R347またはCiproもしくはBs4−V2L2−2C、あるいはBs4−V2L2−2CとCiproの併用で処理した。全ての対照マウスは、感染後約24時間までに感染により死んだ。図26(A〜I)からわかるように、CIPまたはMEMのいずれかと併用したBs4抗体は、抗生物質療法の効果を高めるが、これは、分子を組み合わせた場合の相乗的防御を示すものである。さらに別の試験では、Bs4もしくはCIP単独で、または併用(Bs4+CIP)で処理したマウスにおける細菌負荷のレベルに焦点を当てる。図26(J)に示すように、全ての臓器(肺、脾臓および腎臓)における細菌負荷のレベルは、R347+CIPおよびBs4+CIPで同様であったが、CIPと併用してBs4を含有させたマウスだけは、感染から生き残る(図26(A〜E、I))。総合すると、これらのデータは、この動物モデル設定において細菌負荷を低減する上で抗生物質は重要であるが、細菌病原性を低減し、従って、正常な宿主免疫を保護するためには、特異的抗体が必要であることがわかる。
治療補助療法:Bs4−V2L2−2C+抗生物質
実施例6に既述したように、緑膿菌(P.aeruginosa)6206株に対するBs4二重特異性抗体および抗生物質補助療法の生存効果を急性致死的肺炎モデルにおいて評価した(図26(A〜J))。(A〜B)マウスをR347(陰性対照)またはBs4−V2L2−2Cで処理してから24時間後、6206により感染させるか、または、感染から1時間後、シプロフロキサシン(CIP)で処理するか、あるいは、感染から24時間前のBs4−V2L2−2Cと、感染から1時間後のCIPの併用で処理した。(C)マウスを6206により感染させてから1時間後に、R347またはCIPまたはBs4−V2L2−2C、あるいはBs4−V2L2−2CとCIPの併用で処理した。(D)マウスを6206により感染させてから2時間後に、R347またはCIPまたはBs4−V2L2−2C、あるいはBs4−V2L2−2CとCIPの併用で処理した。(E)マウスを6206により感染させてから2時間後に、R347もしくはBs4−V2L2−2Cで処理するか、または感染から1時間後にCIPで処理するか、あるいは感染から2時間後のBs4−V2L2−2Cと、感染から1時間後のCIPとの併用で処理した。(F)マウスを6206により感染させてから1時間後に、R347またはメロペネム(Meropenem)(MEM)もしくはBs4−V2L2−2C、またはBs4−V2L2−2CとMEMの併用で処理した。(G)マウスを6206により感染させてから2時間後に、R347もしくはBs4−V2L2−2Cで処理するか、または感染から1時間後にMEMで処理するか、あるいは感染から2時間後のBs4−V2L2−2Cと、感染から1時間後のMEMとの併用で処理した。(H)マウスを6206により感染させてから2時間後に、R347またはBs4−V2L2−2CもしくはMEM、あるいはBs4−V2L2−2CとMEMの併用で処理した。(I)マウスを6206により感染させてから4時間後に、R347またはCiproもしくはBs4−V2L2−2C、あるいはBs4−V2L2−2CとCiproの併用で処理した。全ての対照マウスは、感染後約24時間までに感染により死んだ。図26(A〜I)からわかるように、CIPまたはMEMのいずれかと併用したBs4抗体は、抗生物質療法の効果を高めるが、これは、分子を組み合わせた場合の相乗的防御を示すものである。さらに別の試験では、Bs4もしくはCIP単独で、または併用(Bs4+CIP)で処理したマウスにおける細菌負荷のレベルに焦点を当てる。図26(J)に示すように、全ての臓器(肺、脾臓および腎臓)における細菌負荷のレベルは、R347+CIPおよびBs4+CIPで同様であったが、CIPと併用してBs4を含有させたマウスだけは、感染から生き残る(図26(A〜E、I))。総合すると、これらのデータは、この動物モデル設定において細菌負荷を低減する上で抗生物質は重要であるが、細菌病原性を低減し、従って、正常な宿主免疫を保護するためには、特異的抗体が必要であることがわかる。
実施例6に既述したように、緑膿菌(P.aeruginosa)6206株に対するBs4二重特異性抗体およびトブラマイシン(Tobramycin)抗生物質補助療法の生存効果を急性致死的肺炎モデルにおいて評価する。マウスをR347(陰性対照)またはBs4−V2L2−2Cで処理してから24時間後に、6206により感染させるか、または、感染から1時間後にトブラマイシンで処理するか、あるいは、感染の24時間前のBs4−V2L2−2Cと、感染から1時間後のトブラマイシンの併用で処理する。また、マウスを6206により感染させてから1時間後に、R347またはトブラマイシンもしくはBs4−V2L2−2C、あるいはBs4−V2L2−2Cとトブラマイシンの併用で処理する。さらに、マウスを6206により感染させてから2時間後に、R347またはトブラマイシンもしくはBs4−V2L2−2C、あるいはBs4−V2L2−2Cとトブラマイシンの併用で処理する。さらにまた、マウスを6206により感染させてから2時間後に、R347もしくはBs4−V2L2−2Cで処理するか、または感染から1時間後にトブラマイシンで処理するか、あるいは感染から2時間後のBs4−V2L2−2Cと、感染から1時間後のトブラマイシンとの併用で処理する。マウスを6206により感染させてから4時間後に、R347またはトブラマイシンもしくはBs4−V2L2−2C、あるいはBs4−V2L2−2Cとトブラマイシンの併用で処理する。
実施例6に既述したように、緑膿菌(P.aeruginosa)6206株に対するBs4二重特異性抗体およびアズトオレナム(Aztreonam)抗生物質補助療法の生存効果を急性致死的肺炎モデルにおいて評価する。マウスをR347(陰性対照)またはBs4−V2L2−2Cで24時間処理した後、6206により感染させるか、または、感染から1時間後にアズトレオナムで処理するか、あるいは、感染の24時間前のBs4−V2L2−2Cと、感染から1時間後のアズトレオナムの併用で処理する。また、マウスを6206により感染させてから1時間後に、R347またはアズトレオナムもしくはBs4−V2L2−2C、あるいはBs4−V2L2−2Cとアズトレオナムの併用で処理する。さらに、マウスを6206により感染させてから2時間後に、R347またはアズトレオナムまたはBs4−V2L2−2C、あるいはBs4−V2L2−2Cとアズトレオナムの併用で処理する。さらにまた、マウスを6206により感染させてから2時間後に、R347またはBs4−V2L2−2Cで処理するか、または感染から1時間後にアズトレオナムで処理するか、あるいは感染から2時間後のBs4−V2L2−2Cと、感染から1時間後のアズトレオナムとの併用で処理する。マウスを6206により感染させてから4時間後、R347またはアズトレオナムもしくはBs4−V2L2−2C、あるいはBs4−V2L2−2Cとアズトレオナムの併用で処理する。
実施例18
BS4−GLO二重特異性抗体の構築
図35Aに示すように、抗PslscFv(Psl0096scFv)およびV2L2−MD(VH+VL)を含むBS4−GLO(生殖系列化リード最適化)二重特異性構築物を作製した。BS4−GLO軽鎖は、生殖系列化リード最適化抗PcrV抗体軽鎖可変領域(すなわち、V2L2−MD)を含む。BS4−GLO重鎖は、式VH−CH1−H1−L1−S−L2−H2−CH2−CH3を含み、ここで、CH1は、重鎖定常領域ドメイン1であり、H1は、第1重鎖ヒンジ領域断片であり、L1は、第1リンカーであり、Sは、抗PcrVScFv分子であり、L2は、第2リンカーであり、H2は、第2重鎖ヒンジ領域断片であり、CH2は、重鎖定常領域ドメイン2であり、CH3は、重鎖定常領域ドメイン3である。
BS4−GLO二重特異性抗体の構築
図35Aに示すように、抗PslscFv(Psl0096scFv)およびV2L2−MD(VH+VL)を含むBS4−GLO(生殖系列化リード最適化)二重特異性構築物を作製した。BS4−GLO軽鎖は、生殖系列化リード最適化抗PcrV抗体軽鎖可変領域(すなわち、V2L2−MD)を含む。BS4−GLO重鎖は、式VH−CH1−H1−L1−S−L2−H2−CH2−CH3を含み、ここで、CH1は、重鎖定常領域ドメイン1であり、H1は、第1重鎖ヒンジ領域断片であり、L1は、第1リンカーであり、Sは、抗PcrVScFv分子であり、L2は、第2リンカーであり、H2は、第2重鎖ヒンジ領域断片であり、CH2は、重鎖定常領域ドメイン2であり、CH3は、重鎖定常領域ドメイン3である。
抗PslScFvおよび抗Psl(VH+VL)を含む別のBs4−GLO二重特異性構築物を図35Bに示し、これを同様に作製する。
実施例19
Bs4−GLO二重特異性抗体の機能活性および効果の評価
二重特異性抗体Bs4−WT(Bs4−V2L2−2Cとも称する)、BS4−GL(生殖系列化抗PcrVおよび抗Psl可変領域を含む)および実施例18に記載のように作製したBs4−GLOを、実施例2に既述したように、オプソニン食菌殺傷アッセイ(図27A)、実施例4に既述したように、抗細胞付着アッセイ(図27B)、および実施例12に既述したように、RBC溶解抗細胞傷害性アッセイ(図27C)における機能活性の差について試験した。抗体間に、機能活性のインビトロでの差は観察されなかった。
Bs4−GLO二重特異性抗体の機能活性および効果の評価
二重特異性抗体Bs4−WT(Bs4−V2L2−2Cとも称する)、BS4−GL(生殖系列化抗PcrVおよび抗Psl可変領域を含む)および実施例18に記載のように作製したBs4−GLOを、実施例2に既述したように、オプソニン食菌殺傷アッセイ(図27A)、実施例4に既述したように、抗細胞付着アッセイ(図27B)、および実施例12に既述したように、RBC溶解抗細胞傷害性アッセイ(図27C)における機能活性の差について試験した。抗体間に、機能活性のインビトロでの差は観察されなかった。
Bs4−GLOのインビトロ効果を以下のように調べた。予防評価の場合、マウスを複数の濃度(すなわち、0.007mg/kg、0.02mg/kg、0.07mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、10mg/kgもしくは15mg/kg)のBs4−GLOで予防的に処理し(図28A)、その24時間後に、以下の緑膿菌(P.aeruginosa)株(6206(1.0×106),6077(1.0×106),6294(2.0×107)またはPA103(1.0×106))により感染させた。治療評価の場合、マウスを以下の緑膿菌(P.aeruginosa)株(6206(1.0×106),6077(1.0×106),6294(2.0×107)またはPA103(1.0×106))により感染させてから1時間後に、複数の濃度(すなわち、0.03mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kgもしくは45mg/kg)のBs4−GLOで治療的に処理した(図28B)。
実施例6に既述したように、様々な緑膿菌(P.aeruginosa)株に対するBs4−GLO二重特異性抗体の生存効果を急性致死的肺炎モデルにおいて評価した。図29は、緑膿菌(P.aeruginosa)致命的菌血症モデルにおけるBs4−GLOで治療した動物の生存率を示す。菌血症モデルの態様は、2012年11月6日に提出された米国仮特許出願第61/723,128号明細書(代理人整理番号:ATOX−500P1、名称「METHODS OF TREATING S.AUREUS ASSOCIATED DISEASES」)(参照により全体として本明細書に組み込む)に開示されている。
動物をBs4−GLOまたはR347で24時間処理した後、(A)6294(O6)または(B)6206により腹腔内感染させた。BS4−GLOは、全ての試験濃度で、緑膿菌(P.aeruginosa)株(A)6294および(B)6206でチャレンジしたマウスにおいて致死的肺炎からの保護に有効である。
様々な緑膿菌(P.aeruginosa)株に対するBs4−GLO二重特異性抗体の生存効果を熱損傷モデルにおいて評価した。図30は、緑膿菌(P.aeruginosa)熱損傷モデルにおけるBs4−GLOで予防的に処理した動物の生存率を示す。動物をBs4−GLOまたはR347で数時間処理した後、熱損傷を誘導し、緑膿菌(P.aeruginosa)株(A)6077(O11−ExoU+)または(B)6206(O11−ExoU+)または(C)6294(O6)を創傷下に直接、皮下感染させた。Bs4−GLOは、全ての試験濃度で、緑膿菌(P.aeruginosa)株(A)6077、(B)6206および(C)6294でチャレンジしたマウスの緑膿菌(P.aeruginosa)熱損傷モデルでの予防に有効である。
図31は、緑膿菌(P.aeruginosa)熱損傷モデルにおいて、二重特異性抗体Bs4−GLOで予防的に処理した動物の生存率を示す。(A)熱損傷の誘導から(A)4時間または(B)12時間後に、動物をBs4−GLOまたはR347で処理し、緑膿菌(P.aeruginosa)株6077(O11−ExoU+)を創傷下に直接、皮下感染させた。BS4−GLOは、全ての試験濃度で、熱損傷の誘導の後(B)4時間または(B)12時間後にBs4−GLOで処理し、緑膿菌(P.aeruginosa)株6077により皮下感染させたマウスの緑膿菌(P.aeruginosa)熱損傷モデルにおいて有効である。
実施例20
治療補助療法:Bs4GLO+抗生物質
実施例6に既述したように、Bs4−GLO二重特異性抗体および抗生物質補助療法の生存効果を、緑膿菌(P.aeruginosa)6206株に対する急性致死的肺炎モデルにおいて評価した。
治療補助療法:Bs4GLO+抗生物質
実施例6に既述したように、Bs4−GLO二重特異性抗体および抗生物質補助療法の生存効果を、緑膿菌(P.aeruginosa)6206株に対する急性致死的肺炎モデルにおいて評価した。
図32は、シプロフロキサシン(CIP)を用いた治療補助療法を示す。(A)マウスを緑膿菌(P.aeruginosa)株6206により感染させてから4時間後に、R347+CIPまたはBs4−WT、あるいはBs4−WTとCIPの併用で処理した。(B)マウスを緑膿菌(P.aeruginosa)株6206により感染させてから4時間後に、R347+CIPまたはBs4−GLO、あるいはBs4−GLOとCIPの併用で処理した。(A〜B)CIPと併用したBs4−WTまたはBS4−GLO抗体は、抗生物質療法の効果を増大した。
図33は、メロペネム(MEM)を用いた治療補助療法を示す:(A)マウスを緑膿菌(P.aeruginosa)株6206により感染させてから4時間後に、R347+MEMまたはBs4−WT、あるいはBS4−WTとMEMの併用で処理した。(B)マウスを緑膿菌(P.aeruginosa)株6206により感染させてから4時間後に、R347+MEMまたはBs4、あるいはBs4−GLOとMEMの併用で処理した。(A〜B)MEMと併用したBs4−WTまたはBs4−GLO抗体は、抗生物質療法の効果を増大した。
図34は、致死的菌血症モデルにおける治療補助療法:Bs4−GLOと抗生物質を示す。表示濃度(このモデルにおいて準治療防御用量濃度であると事前に決定されたもの)のBs4−GLOまたはR347(陰性対照)でマウスを処理してから24時間後に、緑膿菌(P.aeruginosa)株6294により腹腔内感染させた。感染から1時間後、マウスを表示濃度(このモデルにおいて準治療防御用量濃度であると事前に決定されたもの)の抗生物質(A)シプロフロキサシン(CIP)、(B)メロペネム(MEM)または(C)トブラマイシン(TOB)で皮下処理した。感染から72時間後まで動物を生存について注意深くモニターした。準保護濃度で、CIP、MEMもしくはTOBのいずれと併用したBs4−GLO抗体も、抗生物質療法の効果を増大した。
本開示は、記載された具体的な実施形態により範囲を限定するものではなく、それは本開示の個々の態様の単一の説明として意図されるものであり、機能的に均等であるあらゆる組成物または方法が本開示の範囲内である。実際には、本明細書に示され、記載されたものに加えた本開示の種々の改変形態が、上記詳細な説明および添付の図面から当業者に明らかである。そのような改変形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内であるものとする。
本明細書に挙げられた全ての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が個別具体的に参照により取り込まれることを示されるかのごとく同程度に参照により本明細書に組み込まれる。さらに、2011年11月7日に提出された米国仮特許出願第61/556,645号;2012年4月16日に提出された第61/624,651号;2012年4月17日に提出された第61/625,299号;2012年9月6日に提出された第61/697,585号ならびに2012年11月6日に提出された国際出願PCT/US2012/63639号明細書(代理人整理番号AEMS−115WO1、名称「MULTISPECIFIC AND MULTIVALENT BINDING PROTEINS AND USES THEREOF」)は、あらゆる目的のために、参照により全体として本明細書に組み込むものとする。
Claims (92)
- シュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する単離結合分子であって、免疫グロブリンVHおよび免疫グロブリンVLを含み、前記VHが、配列番号255及び配列番号257からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記VLが、配列番号256のアミノ酸配列を含む、単離結合分子。
- 前記VHが、配列番号255を含む、請求項1に記載の結合分子。
- 前記VHが、配列番号257を含む、請求項1に記載の結合分子。
- シュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する単離結合分子であって、免疫グロブリンVHおよび免疫グロブリンVLを含み、その各々が、CDR1、CDR2、およびCDR3を含み、
(a)前記VH CDR1が、配列番号311または1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントであり、前記VH CDR2が、配列番号312、または1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントであり、前記VH CDR3が、配列番号313、または1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントである;あるいは
(b)前記VL CDR1が、配列番号314、または1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントであり、前記VL CDR2が、配列番号315、または1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントであり、前記VL CDR3が、配列番号316、または1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントである;あるいは
(c)(a)および(b)の組み合わせであり;
前記VHおよびVL CDRが、Kabat番号付与系に従う、
単離結合分子。 - (a)前記VH CDR1が、配列番号311であり、前記VH CDR2が、配列番号312であり、前記VH CDR3が、配列番号313である;あるいは、
(b)前記VL CDR1が、配列番号314であり、前記VL CDR2が、配列番号315であり、前記VL CDR3が、配列番号316である;あるいは
(c)(a)および(b)の組み合わせである、
請求項4に記載の単離結合分子。 - シュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する単離結合分子であって、免疫グロブリンVHおよび免疫グロブリンVLを含み、
(a)前記VHが、配列番号317と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む;あるいは、
(b)前記VLが、配列番号318と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む;あるいは
(c)(a)および(b)の組み合わせである、
単離結合分子。 - 前記VHが、配列番号317を含み、前記VLが、配列番号318を含む、請求項6に記載の結合分子。
- 抗PcrV抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の結合分子。
- 前記VHが、1つまたは複数の重鎖定常領域をさらに含む抗体重鎖の一部であり、前記VLが、軽鎖定常領域をさらに含む抗体軽鎖の一部である、請求項8に記載の結合分子。
- 2つの抗体重鎖と、2つの抗体軽鎖とを含む、請求項9に記載の結合分子。
- 二重特異性抗体を含む、請求項8〜10のいずれか一項に記載の結合分子。
- シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する結合ドメインをさらに含む、請求項11に記載の結合分子。
- シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する結合ドメインが、抗Psl ScFv分子を含む、請求項12に記載の結合分子。
- 前記抗Psl ScFv分子が、配列番号240〜配列番号254のアミノ酸配列、または配列番号240〜配列番号254の2つ以上のアミノ酸配列の任意の組み合わせを含む、請求項13に記載の結合分子。
- 前記抗Psl ScFv分子が、前記抗PcrV抗体またはその断片の各重鎖のヒンジ領域に挿入されている、請求項13または14に記載の結合分子。
- 各抗体重鎖が、式:VH−CH1−H1−L1−S−L2−H2−CH2−CH3を含み、ここで、CH1は、重鎖定常領域ドメイン−1であり、H1は、第1重鎖ヒンジ領域断片であり、L1は、第1リンカーであり、Sは、抗PcrV ScFv分子であり、L2は、第2リンカーであり、H2は、第2重鎖ヒンジ領域断片であり、CH2は、重鎖定常領域ドメイン−2であり、CH3は、重鎖定常領域ドメイン−3である、請求項15に記載の結合分子。
- VHが、配列番号255、配列番号257、または配列番号317のアミノ酸配列を含む、請求項16に記載の結合分子。
- CH1が、配列番号319を含む、請求項17に記載の結合分子。
- L1およびL2が、同じか、または異なり、独立して、(a)[GGGGS]n(nは、0、1、2、3、4、もしくは5である)、(b)[GGGG]n(nは、0、1、2、3、4、もしくは5である)、または(a)および(b)の組み合わせを含む、請求項16〜18のいずれか一項に記載の結合分子。
- H1が、EPKSC(配列番号320)を含む、請求項16〜19のいずれか一項に記載の結合分子。
- H2が、DKTHTCPPCP(配列番号321)を含む、請求項16〜20のいずれか一項に記載の結合分子。
- Sが、配列番号240〜配列番号254、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項16〜21のいずれか一項に記載の結合分子。
- 各抗体軽鎖が、VL−CLを含み、CLが、抗体軽鎖κ定常領域または抗体軽鎖λ定常領域である、請求項16〜23のいずれか一項に記載の結合分子。
- VLが、配列番号256または配列番号318のアミノ酸配列を含む、請求項24に記載の結合分子。
- CLが、配列番号323のアミノ酸配列を含む、請求項24に記載の結合分子。
- 2つの同一重鎖および2つの同一軽鎖を含み、各抗体重鎖が、配列番号264を含み、各抗体軽鎖が、配列番号263を含む、請求項15〜26のいずれか一項に記載の結合分子。
- シュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよびシュードモナス属(Pseudomonas)PcrVに特異的に結合する二重特異性抗体であって、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号264のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が、配列番号263のアミノ酸配列を含む、二重特異性抗体。
- シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子であって、免疫グロブリンVHおよび免疫グロブリンVLを含み、その各々が、相補性決定領域1(CDR1)、CDR2、およびCDR3を含み、ここで、前記VH CDR1は、配列番号47であり、前記VH CDR2は、配列番号48であり、前記VH CDR3は、配列番号258、配列番号267、配列番号268、配列番号269、配列番号270、配列番号271、配列番号272、配列番号273、配列番号274、配列番号275、配列番号276、配列番号277、配列番号278、および配列番号279からなる群から選択され、前記VL CDR1は、配列番号50であり、前記VL CDR2は、配列番号51であり、前記VL CDR3は、配列番号280、配列番号281、配列番号282、配列番号52、配列番号283、配列番号284、配列番号285、配列番号286、および配列番号287からなる群から選択され、前記VHおよびVL CDRは、Kabat番号付与系に従う、単離結合分子。
- 前記VH CDR3が、配列番号258であり、前記VL CDR3が、配列番号280である、請求項29に記載の結合分子。
- 前記VHが、配列番号288を含み、前記VLが、配列番号289を含む、請求項30に記載の結合分子。
- 前記VH CDR3が、配列番号267であり、前記VL CDR3が、配列番号281である、請求項29に記載の結合分子。
- 前記VHが、配列番号290を含み、前記VLが、配列番号291を含む、請求項32に記載の結合分子。
- 前記VH CDR3が、配列番号268であり、前記VL CDR3が、配列番号282である、請求項29に記載の結合分子。
- 前記VHが、配列番号292を含み、前記VLが、配列番号293を含む、請求項34に記載の結合分子。
- 前記VH CDR3が、配列番号269であり、前記VL CDR3が、配列番号52である、請求項29に記載の結合分子。
- 前記VHが、配列番号294を含み、前記VLが、配列番号11を含む、請求項36に記載の結合分子。
- 前記VH CDR3が、配列番号270であり、前記VL CDR3が、配列番号283である、請求項29に記載の結合分子。
- 前記VHが、配列番号295を含み、前記VLが、配列番号296を含む、請求項38に記載の結合分子。
- 前記VH CDR3が、配列番号271であり、前記VL CDR3が、配列番号284である、請求項29に記載の結合分子。
- 前記VHが、配列番号297を含み、前記VLが、配列番号298を含む、請求項40に記載の結合分子。
- 前記VH CDR3が、配列番号272であり、前記VL CDR3が、配列番号285である、請求項29に記載の結合分子。
- 前記VHが、配列番号299を含み、前記VLが、配列番号300を含む、請求項42に記載の結合分子。
- 前記VH CDR3が、配列番号273であり、前記VL CDR3が、配列番号286である、請求項29に記載の結合分子。
- 前記VHが、配列番号301を含み、前記VLが、配列番号302を含む、請求項44に記載の結合分子。
- 前記VH CDR3が、配列番号274であり、VL CDR3が、配列番号52である、請求項29に記載の結合分子。
- 前記VHが、配列番号303を含み、前記VLが、配列番号11を含む、請求項46に記載の結合分子。
- 前記VH CDR3が、配列番号275であり、前記VL CDR3が、配列番号52である、請求項29に記載の結合分子。
- 前記VHが、配列番号304を含み、前記VLが、配列番号11を含む、請求項48に記載の結合分子。
- 前記VH CDR3が、配列番号276であり、前記VL CDR3が、配列番号52である、請求項29に記載の結合分子。
- 前記VHが、配列番号305を含み、前記VLが、配列番号11を含む、請求項50に記載の結合分子。
- 前記VH CDR3が、配列番号277であり、前記VL CDR3が、配列番号52である、請求項29に記載の結合分子。
- 前記VHが、配列番号306を含み、前記VLが、配列番号11を含む、請求項に記載の結合分子。
- 前記VH CDR3が、配列番号278であり、前記VL CDR3が、配列番号52である、請求項29に記載の結合分子。
- 前記VHが、配列番号307を含み、前記VLが、配列番号11を含む、請求項54に記載の結合分子。
- 前記VH CDR3が、配列番号279であり、前記VL CDR3が、配列番号287である、請求項1に記載の結合分子。
- 前記VHが、配列番号308を含み、前記VLが、配列番号325を含む、請求項56に記載の結合分子。
- シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子であって、免疫グロブリンVHおよび免疫グロブリンVLを含み、前記VHが、配列番号309のアミノ酸配列を含み、前記VLが、配列番号310のアミノ酸配列を含む、単離結合分子。
- 抗Psl抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項29〜58のいずれか一項に記載の結合分子。
- 一本鎖Fv(ScFv)抗体分子を含む、請求項59に記載の結合分子。
- 前記ScFvが、式:VH−L−VL(Lは、リンカーである)を含む、請求項60に記載の結合分子。
- 前記ScFvが、式:VL−L−VH(Lは、リンカーである)を含む、請求項61に記載の結合分子。
- Lが、(a)[GGGGS]n(nは、0、1、2、3、4、もしくは5である)、(b)[GGGG]n(nは、0、1、2、3、4、もしくは5である)、または(a)および(b)の組み合わせを含む、請求項61または62に記載の結合分子。
- 前記リンカーが、前記リンカーのC末端にala−leuをさらに含む、請求項63に記載の結合分子。
- 配列番号240のアミノ酸配列を含む、請求項29、30、31、59〜61、63、または64のいずれか一項に記載の結合分子。
- 配列番号262のアミノ酸配列を含む、請求項29、30、31、59〜61、63、または64のいずれか一項に記載の結合分子。
- 配列番号241、配列番号242、配列番号243、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252、配列番号253、配列番号254、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項29、32〜61、63、または64のいずれか一項に記載の結合分子。
- 配列番号240、配列番号241、配列番号242、配列番号243、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252、配列番号253、配列番号254、配列番号262、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号263、配列番号264、配列番号258、配列番号263、配列番号264、配列番号267、配列番号268、配列番号269、配列番号270、配列番号271、配列番号272、配列番号273、配列番号274、配列番号275、配列番号276、配列番号277、配列番号278、配列番号279、配列番号280、配列番号281、配列番号282、配列番号283、配列番号284、配列番号285、配列番号286、配列番号287、配列番号288、配列番号289、配列番号290、配列番号291、配列番号292、配列番号293、配列番号294、配列番号295、配列番号296、配列番号298、配列番号299、300、配列番号301、配列番号302、配列番号303、配列番号304、配列番号305、配列番号306、配列番号307、配列番号308、配列番号309、配列番号310、配列番号311、配列番号312、配列番号313、配列番号315、配列番号316、配列番号317、配列番号318、配列番号325、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
- 請求項1〜27もしくは請求項29〜67のいずれか一項に記載の結合分子、もしくはそのサブユニット、請求項28に記載の二重特異性抗体もしくはそのサブユニット、請求項68に記載のポリペプチド、またはこれらの任意の組み合わせを含むか、または産生する細胞。
- 請求項1〜27もしくは請求項29〜67のいずれか一項に記載の結合分子、もしくはそのサブユニット、請求項28に記載の二重特異性抗体もしくはそのサブユニット、請求項68に記載のポリペプチド、またはこれらの任意の組み合わせをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチド。
- 請求項70に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項69に記載のポリヌクレオチドまたは請求項70に記載のベクターを含む細胞。
- 請求項1〜27もしくは請求項29〜67のいずれか一項に記載の結合分子、もしくはその抗原結合サブユニットと、薬学的に許容可能な担体とを含む組成物。
- 請求項28に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合サブユニットと、薬学的に許容可能な担体とを含む組成物。
- 感染患者から単離された緑膿菌(P.aeruginosa)株の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%と結合する、請求項73または74に記載の組成物。
- 前記緑膿菌(P.aeruginosa)株が、肺、唾液、眼、膿汁、糞便、尿、洞、創傷、皮膚、血液、骨、または膝液の1つまたは複数から単離される請求項75に記載の組成物。
- 前記結合分子もしくはそのサブユニットまたは前記二重特異性抗体もしくはそのサブユニットが、抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物学的応答改質剤、医薬剤、リンホカイン、異種抗体またはその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール(PEG)、および前記薬剤いずれかの2つ以上の組み合わせからなる群から選択される薬剤にコンジュゲートされている、請求項73〜76のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記検出可能な標識が、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、または前記検出可能な標識いずれかの2つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項77に記載の組成物。
- 抗生物質をさらに含む、請求項73〜78のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記抗生物質が、シプロフロキサシン、メロペネム、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項79に記載の組成物。
- シュードモナス属(Pseudomonas)感染の予防または治療が必要とされる対象においてシュードモナス属(Pseudomonas)感染を予防または治療する方法であって、対象に、有効量の請求項73〜80のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
- シュードモナス属(Pseudomonas)感染の予防または治療が必要とされる対象においてシュードモナス属(Pseudomonas)感染を予防または治療する方法であって、対象に、有効量の請求項28に記載の二重特異性抗体、または請求項74〜80のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、前記組成物が、二重特異性抗体を含む方法。
- 前記投与が、前記対象における前記シュードモナス属(Pseudomonas)感染の予防または治療に相乗的治療効果をもたらし、前記相乗効果が、前記二重特異性抗体と同じシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよびシュードモナス属(Pseudomonas)PcrV結合特異性を有する単一特異性結合分子の等モル量の投与の個々の効果を合わせたものより大きい、請求項82に記載の方法。
- 前記相乗的治療効果によって、結合ドメインの一方だけを投与した対象の相加生存率より高い生存率がもたらされる、請求項83に記載の方法。
- 前記組成物を2つ以上の予防/治療サイクルにわたって投与する、請求項81〜84のいずれか一項に記載の方法。
- シュードモナス属(Pseudomonas)感染の予防または治療が必要とされる対象においてシュードモナス属(Pseudomonas)感染を予防または治療する方法であって、対象に、有効量の請求項79または80に記載の組成物を投与することを含み、前記投与が、前記対象における前記シュードモナス属(Pseudomonas)感染の予防または治療に相乗的治療効果をもたらし、前記相乗効果が、(a)前記二重特異性抗体のみ、(b)前記二重特異性抗体と同じシュードモナス属(Pseudomonas)Pslおよびシュードモナス属(Pseudomonas)PcrV結合特異性を有する前記単一特異性結合分子、ならびに(c)抗生物質、の1つまたは複数の等モル量の投与の個々の効果を合わせたものより大きい、方法。
- 前記組成物を2つ以上の予防/治療サイクルにわたって投与する、請求項86に記載の方法。
- 前記シュードモナス属(Pseudomonas)感染が、緑膿菌(P.aeruginosa)感染である、請求項81〜87のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象は、ヒトである、請求項81〜88のいずれか一項に記載の方法。
- 前記感染は、眼感染、肺感染、熱傷感染、創傷感染、皮膚感染、血液感染、骨感染、または前記感染の2つ以上の組み合わせである、請求項81〜89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象は、急性肺炎、熱傷、角膜感染、嚢胞性線維症、またはそれらの組み合わせを有する、請求項81〜90のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項73〜80のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。
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