JP6420813B2 - 抗シュードモナス属(Pseudomonas)Psl結合分子およびその使用 - Google Patents
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Description
本発明はまた、以下を含む。
[項目1]
シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、(a)上皮細胞への緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の付着を阻害し得、(b)緑膿菌(P.aeruginosa)のオプソニン食菌殺傷(OPK)を促進し得、または(c)上皮細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)の付着を阻害し得、かつ緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを促進し得る、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目2]
抗体またはその抗原結合断片を含む、項目1に記載の結合分子またはその断片。
[項目3]
WapR−004、Cam−003、Cam−004、またはCam−005の重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)領域を含む抗体またはその抗原結合断片と同一のシュードモナス属(Pseudomonas)Pslエピトープに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目4]
シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合し、WapR−004、Cam−003、Cam−004、またはCam−005のVHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属(Pseudomonas)Psl結合を競合阻害する、単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目5]
前記WapR−004のVHおよびVLは、配列番号11および配列番号12をそれぞれ含み、前記Cam−003のVHおよびVLは、配列番号1および配列番号2をそれぞれ含み、前記Cam−004のVHおよびVLは、配列番号3および配列番号2をそれぞれ含み、前記Cam−005のVHおよびVLは、配列番号4および配列番号2をそれぞれ含む、項目3または4に記載の結合分子またはその断片。
[項目6]
WapR−001、WapR−002、またはWapR−003のVHおよびVL領域を含む抗体またはその抗原結合断片と同一のシュードモナス属(Pseudomonas)Pslエピトープに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目7]
シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合し、WapR−001、WapR−002、またはWapR−003のVHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属(Pseudomonas)Psl結合を競合阻害する、単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目8]
前記WapR−001のVHおよびVLは、配列番号5および配列番号6をそれぞれ含み、前記WapR−002のVHおよびVLは、配列番号7および配列番号8をそれぞれ含み、前記WapR−003のVHおよびVLは、配列番号9および配列番号10をそれぞれ含む、項目6または7に記載の結合分子またはその断片。
[項目9]
WapR−016のVHおよびVL領域を含む抗体またはその抗原結合断片と同一のシュードモナス属(Pseudomonas)Pslエピトープに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目10]
シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合し、WapR−016のVHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属(Pseudomonas)Psl結合を競合阻害する、単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目11]
前記WapR−016のVHおよびVLは、配列番号15および配列番号16をそれぞれ含む、項目9または10に記載の結合分子またはその断片。
[項目12]
抗体VHを含む、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記VHは、配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、または配列番号15と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目13]
前記VHは、配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、または配列番号15を含む、項目12に記載の結合分子またはその断片。
[項目14]
抗体VLを含む、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記VLは、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、および配列番号16と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目15]
前記VLは、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、および配列番号16を含む、項目14に記載の結合分子またはその断片。
[項目16]
抗体またはその抗原結合断片を含む、項目3〜15のいずれか1項に記載の結合分子またはその断片。
[項目17]
(a)それぞれ、配列番号1および配列番号2、
(b)それぞれ、配列番号3および配列番号2、
(c)それぞれ、配列番号4および配列番号2、
(d)それぞれ、配列番号5および配列番号6、
(e)それぞれ、配列番号7および配列番号8、
(f)それぞれ、配列番号9および配列番号10、
(g)それぞれ、配列番号11および配列番号12、
(h)それぞれ、配列番号13および配列番号14、または
(i)ぞれぞれ、配列番号15および配列番号16、
と少なくとも90%同一のVHおよびVLアミノ酸配列を含む、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
[項目18]
(a)それぞれ、配列番号1および配列番号2、
(b)それぞれ、配列番号3および配列番号2、
(c)それぞれ、配列番号4および配列番号2、
(d)それぞれ、配列番号5および配列番号6、
(e)それぞれ、配列番号7および配列番号8、
(f)それぞれ、配列番号9および配列番号10、
(g)それぞれ、配列番号11および配列番号12、
(h)それぞれ、配列番号13および配列番号14、または
(i)ぞれぞれ、配列番号15および配列番号16、
のVHおよびVLアミノ酸配列を含む、項目17に記載の抗体またはその断片。
[項目19]
抗体VHを含む、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記VHは、配列番号17、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号35、配列番号41、配列番号47、配列番号53、または配列番号59と同一、または4、3、2、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一のVH相補性決定領域−1(VHCDR1)アミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目20]
抗体VHを含む、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記VHは、配列番号18、配列番号24、配列番号27、配列番号30、配列番号36、配列番号42、配列番号48、配列番号54、または配列番号60と同一、または4、3、2、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一のVH相補性決定領域−2(VHCDR2)アミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目21]
抗体VHを含む、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記VHは、配列番号19、配列番号25、配列番号28、配列番号31、配列番号37、配列番号43、配列番号49、配列番号55、または配列番号61と同一、または4、3、2、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一のVH相補性決定領域−3(VHCDR3)アミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目22]
抗体VLを含む、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記VLは、配列番号20、配列番号32、配列番号38、配列番号44、配列番号50、配列番号56、または配列番号62と同一、または4、3、2、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一のVL相補性決定領域−1(VLCDR1)アミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目23]
抗体VLを含む、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記VLは、配列番号21、配列番号33、配列番号39、配列番号45、配列番号51、配列番号57、または配列番号63と同一、または4、3、2、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一のVL相補性決定領域−2(VLCDR2)アミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目24]
抗体VLを含む、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記VLは、配列番号22、配列番号34、配列番号40、配列番号46、配列番号52、配列番号58、または配列番号64と同一、または4、3、2、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一のVL相補性決定領域−3(VLCDR3)アミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目25]
抗体VHを含む、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記VHは、配列番号17、18および19、配列番号23、24および25、配列番号26、27および28、配列番号29、30および31、配列番号35、36および37、配列番号41、42および43、配列番号47、48および49、配列番号53、54および55、または配列番号59、60および61とそれぞれ同一、またはVHCDRの1つまたは複数における4、3、2、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一のVHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3アミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目26]
抗体VLを含む、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記VLは、配列番号20、21および22、配列番号32、33および34、配列番号38、39および40、配列番号44、45および46、配列番号50、51および52、配列番号56、57および58、または配列番号62、63および64とそれぞれ同一、またはVHCDRの1つまたは複数における4、3、2、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一のVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3アミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目27]
前記結合分子またはその断片が抗体またはその抗原結合断片を含む、項目19〜26のいずれか1項に記載の結合分子。
[項目28]
VHおよびVLを含む、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号17、18、19、20、21および22、配列番号23、24、25、20、21および22、配列番号26、27、28、20、21および22、配列番号29、30、31、32、33および34、配列番号35、36、37、38、39および40、配列番号41、42、43、44、45および46、配列番号47、48、49、50、51および52、配列番号53、54、55、56、57および58、または配列番号59、60、61、62、63および64とそれぞれ同一、または1つまたは複数のCDRにおける4、3、2、もしくは1つのアミノ酸置換を除いて同一のVHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2およびVLCDR3アミノ酸配列を含む、前記単離抗体またはその抗原結合断片。
[項目29]
(a)上皮細胞への緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の付着を阻害し得、(b)緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを促進し得、または(c)上皮細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)の付着を阻害し得、かつ緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを促進し得る、項目2、16〜18、27、または28のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
[項目30]
上皮細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)付着の最大阻害は、約50μg/ml以下、5.0μg/ml以下、または約0.5μg/ml以下の抗体濃度において達成される、項目29に記載の抗体またはその断片。
[項目31]
上皮細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)付着の最大阻害は、約30μg/mlから約0.3μg/mlの範囲の抗体濃度において達成される、項目29に記載の抗体またはその断片。
[項目32]
OPK EC50は、約0.5μg/ml未満、約0.05μg/ml未満、または約0.005μg/ml未満である、項目29に記載の抗体またはその断片。
[項目33]
OPK EC50は、約0.001μg/mlから約0.5μg/mlの範囲である、項目29に記載の抗体またはその断片。
[項目34]
5×10 -2 M、10 -2 M、5×10 -3 M、10 -3 M、5×10 -4 M、10 -4 M、5×10 -5 M、10 -5 M、5×10 -6 M、10 -6 M、5×10 -7 M、10 -7 M、5×10 -8 M、10 -8 M、5×10 -9 M、10 -9 M、5×10 -10 M、10 -10 M、5×10 -11 M、10 -11 M、5×10 -12 M、10 -12 M、5×10 -13 M、10 -13 M、5×10 -14 M、10 -14 M、5×10 -15 M、または10 -15 M以下の解離定数(K D )を特徴とする親和性で緑膿菌(P.aeruginosa)Pslに特異的に結合する、項目2、16〜18、または27〜33のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
[項目35]
親和性は、約1×10 -10 Mから約1×10 -6 Mの範囲の解離定数(K D )を特徴とする、項目2、16〜18、または27〜35のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。[項目36]
ヒト化である、項目2、16〜18、または27〜35のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
[項目37]
キメラである、項目2、16〜18、または27〜35のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
[項目38]
完全ヒトである、項目2、16〜18、または27〜35のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
[項目39]
Fab断片である、項目2、16〜18、または27〜35のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
[項目40]
Fab'断片である、項目2、16〜18、または27〜35のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
[項目41]
F(ab)2断片である、項目2、16〜18、または27〜35のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
[項目42]
単鎖Fv(scFv)断片である、項目2、16〜18、または27〜35のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
[項目43]
ヒトカッパ定常領域およびヒトラムダ定常領域からなる群から選択される軽鎖定常領域を含む、項目2、16〜18、または27〜41のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
[項目44]
重鎖定常領域またはその断片を含む、項目2、16〜18、または27〜41のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
[項目45]
前記重鎖定常領域またはその断片は、ヒトIgG1である、項目44に記載の抗体またはその断片。
[項目46]
モノクローナルである、項目2、16〜18、または27〜45のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
[項目47]
配列番号11のアミノ酸配列を有するVHおよび配列番号12のアミノ酸配列を有するVLを含む、項目18に記載の抗体またはその断片。
[項目48]
ヒトカッパ軽鎖定常領域またはその断片およびヒトIgG1重鎖定常領域またはその断片をさらに含む、項目47に記載の抗体またはその断片。
[項目49]
OCTET(登録商標)結合アッセイにより測定される、約1.18×10 -7 MのK D を特徴とする親和性で緑膿菌(P.aeruginosa)に特異的に結合する、項目47または48に記載の抗体またはその断片。
[項目50]
上皮細胞への付着の最大阻害は、約0.3μg/mlの抗体濃度において達成される、項目47〜49のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
[項目51]
OPK EC50は、約0.02μg/ml未満である、項目47〜50のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
[項目52]
配列番号1のアミノ酸配列を有するVHおよび配列番号2のアミノ酸配列を有するVLを含む、項目18に記載の抗体またはその断片。
[項目53]
ヒトラムダ軽鎖定常領域またはその断片およびヒトIgG1重鎖定常領域またはその断片をさらに含む、項目52に記載の抗体またはその断片。
[項目54]
OCTET(登録商標)結合アッセイにより測定される、約1.44×10 -7 MのK D を特徴とする親和性で緑膿菌(P.aeruginosa)に特異的に結合する、項目51または52に記載の抗体またはその断片。
[項目55]
上皮細胞への付着の最大阻害は、約1.0μg/mlの抗体濃度において達成される、項目51〜54のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
[項目56]
OPK EC50は、約0.2μg/ml未満である、項目52〜55のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
[項目57]
前記抗体が、抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物学的応答改質剤、医薬剤、リンホカイン、異種抗体またはその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール(PEG)、および任意の前記薬剤の2つ以上の組合せからなる群から選択される薬剤にコンジュゲートされている、項目2、16〜18、または27〜56のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
[項目58]
前記検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、または任意の前記検出可能な標識の2つ以上の組合せからなる群から選択される、項目57に記載の抗体またはその断片。
[項目59]
項目2、16〜18または27〜58のいずれか1項に記載の抗体またはその断片と担体とを含む組成物。
[項目60]
項目3〜13、16〜21、25、または27〜59のいずれか1項に記載のVHをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチド。
[項目61]
項目3〜11、14〜18、22〜24、または26〜59のいずれか1項に記載のVLをコードする核酸をさらに含み、前記ポリヌクレオチドにより発現される結合分子またはその抗原結合断片は、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する、項目60に記載のポリヌクレオチド。
[項目62]
配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、または配列番号70のヌクレオチド配列を含む、VHおよびVLを含むscFv分子をコードする、項目61に記載のポリヌクレオチド。
[項目63]
項目3〜11、14〜18、22〜24、または26〜59のいずれか1項に記載のVLをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチド。
[項目64]
項目3〜13、16〜21、25、または27〜59のいずれか1項に記載のVHをコードする核酸をさらに含み、前記ポリヌクレオチドにより発現される結合分子またはその抗原結合断片は、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する、項目63に記載のポリヌクレオチド。
[項目65]
項目60に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[項目66]
前記ポリヌクレオチドと作動可能に会合しているプロモーターをさらに含む、項目65に記載のベクター。
[項目67]
項目63に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[項目68]
前記ポリヌクレオチドと作動可能に会合しているプロモーターをさらに含む、項目67に記載のベクター。
[項目69]
項目61、62、または64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[項目70]
前記ポリヌクレオチドと作動可能に会合している1つまたは複数のプロモーターを含み、好適な宿主細胞中でシュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する結合分子を発現し得る、項目69に記載のベクター。
[項目71]
項目60〜64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドまたは項目65〜70のいずれか1項に記載のベクターを含む宿主細胞。
[項目72]
シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する結合分子またはその抗原結合断片を産生する方法であって、項目71に記載の宿主細胞を培養すること、および前記結合分子またはその断片を回収することを含む、前記方法。
[項目73]
項目72に記載の方法により産生される、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する結合分子またはその抗原結合断片。
[項目74]
前記シュードモナス属(Pseudomonas)種は、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)である、項目1〜16もしくは19〜27のいずれか1項に記載の結合分子もしくはその断片、項目2、16〜18、もしくは27〜58のいずれか1項に記載の抗体もしくはその断片、項目59に記載の組成物、項目60〜64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、項目65〜70のいずれか1項に記載のベクター、または項目71に記載の宿主細胞。
[項目75]
2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上の異なる緑膿菌(P.aeruginosa)血清型に結合する、項目74に記載の結合分子もしくはその断片、抗体もしくはその断片、または組成物。
[項目76]
感染患者から単離された緑膿菌(P.aeruginosa)株の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%に結合する、項目74または75に記載の結合分子もしくはその断片、抗体もしくはその断片、または組成物。
[項目77]
前記緑膿菌(P.aeruginosa)株は、肺、唾液、眼、膿汁、糞便、尿、洞、創傷、皮膚、血液、骨、または膝液の1つまたは複数から単離される、項目76に記載の結合分子もしくはその断片、抗体もしくはその断片、または組成物。
[項目78]
シュードモナス属(Pseudomonas)感染の予防または治療が必要とされる対象においてシュードモナス属(Pseudomonas)感染を予防または治療する方法であって、前記対象に有効量の項目1〜16もしくは19〜27のいずれか1項に記載の結合分子もしくはその断片、項目2、16〜18、もしくは27〜58のいずれか1項に記載の抗体もしくはその断片、項目59に記載の組成物、項目60〜64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、項目65〜70のいずれか1項に記載のベクター、または項目71に記載の宿主細胞を投与することを含む、前記方法。
[項目79]
前記シュードモナス属(Pseudomonas)感染は、緑膿菌(P.aeruginosa)感染である、項目78に記載の方法。
[項目80]
前記対象は、ヒトである、項目78または79に記載の方法。
[項目81]
前記感染は、眼感染、肺感染、火傷感染、創傷感染、皮膚感染、血液感染、骨感染、または前記感染の2つ以上の組合せである、項目78〜80のいずれか1項に記載の方法。[項目82]
前記対象は、急性肺炎、熱傷、角膜感染、嚢胞性線維症、またはそれらの組合せを罹患する、項目78〜81のいずれか1項に記載の方法。
[項目83]
上皮細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)の付着を遮断または予防する方法であって、上皮細胞および緑膿菌(P.aeruginosa)の混合物を、項目1〜16もしくは19〜27のいずれか1項に記載の結合分子もしくはその断片、項目2、16〜18、もしくは27〜58のいずれか1項に記載の抗体もしくはその断片、項目59に記載の組成物、項目60〜64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、項目65〜70のいずれか1項に記載のベクター、または項目71に記載の宿主細胞と接触させることを含む、前記方法。
[項目84]
緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを向上させる方法であって、食細胞および緑膿菌(P.aeruginosa)の混合物を、項目1〜16もしくは19〜27のいずれか1項に記載の結合分子もしくはその断片、項目2、16〜18、もしくは27〜58のいずれか1項に記載の抗体もしくはその断片、項目59に記載の組成物、項目60〜64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、項目65〜70のいずれか1項に記載のベクター、または項目71に記載の宿主細胞と接触させることを含む、前記方法。
[項目85]
前記食細胞は、分化HL−60細胞またはヒト多形核白血球(PMN)である、項目84に記載の方法。
用語「a」または「an」で修飾された実体は、その実体の1つまたは複数を指し、例えば、「シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する結合分子」は、「シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する1つまたは複数の結合分子を表すと理解されることに留意すべきである。したがって、用語「a」(または「an」)、「1つまたは複数」および「少なくとも1つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。
一実施形態は、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、(a)上皮細胞への緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の付着を阻害し得、(b)緑膿菌(P.aeruginosa)のオプソニン食菌殺傷(OPK)を促進、媒介、もしくは向上し得、または(c)上皮細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)の付着を阻害し得、緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを促進、媒介、もしくは向上し得る単離結合分子またはその抗原結合断片を対象とする。ある実施形態において、上記結合分子またはその断片は、抗体またはその抗原結合断片、例えばCam−003またはWapR−004であり得る。
本開示はさらに、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を構成する単離ポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象とする。本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体またはその断片は、ポリペプチド、例えば、例えば免疫グロブリン分子に由来するPsl特異的抗原結合領域をコードするアミノ酸配列を含む。指定のタンパク質「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ポリペプチドの起源を指す。ある場合、特定の出発ポリペプチドまたはアミノ酸配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、出発配列、または少なくとも10〜20アミノ酸、少なくとも20〜30アミノ酸、少なくとも30〜50アミノ酸からなりもしくは他では起源を出発配列中に有すると当業者に同定可能であるその一部分と本質的に同一のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態において、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Psl結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、コンジュゲート形態で複数回投与することができる。さらに別の実施形態において、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Psl結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、未コンジュゲート形態で投与し、次いでコンジュゲート形態で投与することができ、またはその逆で投与することができる。
本明細書に記載の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Psl結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードする核酸分子も、本明細書において提供される。
周知のとおり、RNAは、元のハイブリドーマ細胞または他の形質転換細胞から標準的な技術、例えば、グアニジニウムイソチオシアネート抽出および沈殿に続く遠心分離またはクロマトグラフィーにより単離することができる。所望により、mRNAは、総RNAから標準的な技術、例えば、オリゴdTセルロース上でのクロマトグラフィーにより単離することができる。好適な技術は、当分野において知られている。
本開示は、優れたまたは所望の治療活性を有する血清型非依存性治療結合分子、例えば、抗体またはその断片を同定するための標的無差別全細胞アプローチを包含する。本方法を利用して感染作用物質、例えば、細菌病原体の不所望な活性をアンタゴナイズ、中和、クリアランス、または遮断し得る結合分子を同定することができる。当分野において公知のとおり、多くの感染作用物質は、それらのドミナント表面抗原の顕著なバリエーションを示し、それらが免疫学的監視を回避することを可能とする。本明細書に記載の同定法は、多くの異なるシュードモナス属(Pseudomonas)種または他のグラム陰性病原体に共有される抗原を標的化する結合分子を同定し得、したがって複数種からの複数の病原体を標的化し得る治療剤を提供する。例えば、本方法を利用して血清型非依存様式で緑膿菌(P.aeruginosa)の表面に結合し、細菌病原体に結合した場合、細菌細胞、例えば、細菌病原体、例えば、日和見シュードモナス属(Pseudomonas)種(例えば、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、およびシュードモナス・アルカリゲネス(Pseudomonas alcaligenes))に対するオプソニン食菌(OPK)活性を媒介、促進、または向上させ、および/または上皮細胞へのそのような細菌細胞の付着を阻害する一連の結合分子を同定することができる。
本開示において使用される医薬組成物は、当業者に周知の薬学的に許容可能な担体を含む。非経口投与のための調製物には、無菌水性または非水性液剤、懸濁液、または乳濁液が含まれる。本明細書に開示のある医薬組成物は、許容可能な剤形、例として、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液または液剤で経口投与することができる。ある医薬組成物は、鼻腔エアゾールまたは吸入により投与することもできる。保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、および不活性ガスなども存在し得る。本明細書に開示の治療方法において使用される好適な配合物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,16th ed.(1980)に記載されている。
本明細書に開示の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Psl結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体を調製およびそれが必要とされる対象に投与する方法は周知であり、または当業者により容易に決定することができる。抗シュードモナス属(Pseudomonas)Psl結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入によるものまたは局所であり得る。本明細書において使用される非経口という用語には、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、または皮下投与が含まれる。投与に好適な形態は、注射、特に静脈内もしくは動脈内注射または点滴用液剤である。しかしながら、本明細書に教示と同等な他の方法において、本明細書に開示の抗シュードモナス属(Pseudomonas)Psl結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、有害細胞集団、例えば、感染の部位に直接送達することができ、それにより治療剤への疾患組織の曝露を増加させる。例えば、抗シュードモナス属(Pseudomonas)Psl結合分子は、眼組織、火傷損傷、または肺組織に直接投与することができる。
抗シュードモナス属(Pseudomonas)Psl結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、当分野において公知の任意の方法により免疫特異的結合についてアッセイすることができる。使用することができる免疫アッセイには、限定されるものではないが、いくつか例を挙げると、ウエスタンブロットのような技術を使用する競合および非競合アッセイ系、放射免疫アッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインA免疫アッセイが含まれる。そのようなアッセイは定型的であり、当分野において周知である(例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるAusubel et al.,eds,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York,Vol.1(1994)参照)。例示的な免疫アッセイを以下に手短に記載する(しかし、限定を意図するものではない)。
OCTET(登録商標)システムは、96ウェルプレートフォーマット中のバイオセンサーを使用して速度論的分析を報告する。タンパク質結合および解離イベントは、溶液中のあるタンパク質の、ForteBioバイオセンサー上に固定化された第2のタンパク質への結合を計測することによりモニタリングすることができる。Pslへの抗Psl抗体の結合を計測する場合、PslをOCTET(登録商標)チップ上に固定化し、次いで溶液中の抗体の結合を分析する。次いで、固定化Pslに対する抗体の会合および解離を装置センサーにより検出する。次いで、データを収集し、親和性曲線フィッティングのためにGraphPad Prismにエクスポートする。
ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーの構築およびスクリーニング
本実施例は、シュードモナス属(Pseudomonas)感染に対する新規保護抗原を同定するためのナイーブおよび緑膿菌(P.aeruginosa)感染回復期患者の両方に由来するヒト抗体ファージライブラリーを用いる標的無差別全細胞パニングアプローチを記載する(図1A)。インビトロ機能スクリーンに含まれるアッセイは、オプソニン食菌(OPK)殺傷アッセイおよび上皮細胞系A549を使用する細胞付着アッセイを含んだ。リード候補物は、優れたインビトロ活性に基づき、緑膿菌(P.aeruginosa)急性肺炎、角膜炎、および火傷感染モデルにおいて試験した。
緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを促進するmAbの評価
本実施例は、緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを促進する優先順位を付けたヒトIgG1抗体の評価を記載する。図2Aは、WapR−007および陰性対照抗体R347を除き、全ての抗体が発光緑膿菌(P.aeruginosa)血清型O5株(PAO1.lux)の濃度依存的殺傷を媒介したことを示す。WapR−004およびCam−003は、優れたOPK活性を示した。OPKアッセイは、修正した(DiGiandomenico,A.,et al.,Infect Immun 72,7012−7021(2004))に記載のとおり実施した。手短に述べると、アッセイを、96ウェルプレート中で0.025mlのそれぞれのOPK構成成分を使用して実施した;緑膿菌(P.aeruginosa)株;希釈子ウサギ血清;分化HL−60細胞;およびモノクローナル抗体。一部のOPKアッセイにおいて、記載(Choi,K.H.,et al.,Nat Methods 2,443−448(2005))のとおり構築した発光緑膿菌(P.aeruginosa)株を使用した。発光OPKアッセイは、上記のとおり実施したが、Perkin Elmer ENVISION Multilabelプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用して相対ルシフェラーゼ単位(RLU)を測定した。
血清型非依存性抗緑膿菌(P.aeruginosa)抗体は、Pslエキソ多糖を標的化する
本実施例は、表現型スクリーニングに由来する抗緑膿菌(P.aeruginosa)抗体の標的の同定を記載する。標的分析は、血清型非依存性抗体がタンパク質または炭水化物抗原を標的化したかどうかを試験するように実施した。ELISAにおいて、プロテイナーゼKにより完全に消化されたPAO1全細胞抽出物への結合の損失は観察されず、このことは反応性が表面接近可能な炭水化物残基を標的化したことを示唆する(データ示さず)。アイソジェニック突然変異体は、O抗原、アルギネート、およびLPSコア生合成を担う遺伝子において構築した;wbpL(O抗原欠損);wbpL/algD(O抗原およびアルギネート欠損);rmlC(O抗原欠損およびトランケート外部コア);およびgalU(O抗原欠損およびトランケート内部コア)。緑膿菌(P.aeruginosa)突然変異体は、Schweizer(Schweizer,H.P.,Mol Microbiol 6,1195−1204(1992);Schweizer,H.D.,Biotechniques 15,831−834(1993))により記載されるアレル置換方針に基づき構築した。ベクターは、大腸菌(E.coli)株S17.1から緑膿菌(P.aeruginosa)株PAO1中に動員させ;組換え体を記載(Hoang,T.T.,et al.,Gene 212,77−86(1998))のとおり単離した。遺伝子欠失は、PCRにより確認した。緑膿菌(P.aeruginosa)突然変異体は、野生型遺伝子を保有するpUCP30Tベース構築物により補完した。抗体の反応性は、間接ELISAにより上記緑膿菌(P.aeruginosa)株によりコートしたプレート上で測定した:図3Aおよび3Jは、wbpLまたはwbpL/algD二重突然変異体へのCam−003結合が影響を受けなかったが、rmlCおよびgalU突然変異体への結合が消失したことを示す。これらの結果はLPSコアへの結合と一致した一方、PAO1から精製されたLPSに対する反応性は観察されなかった。rmlCおよびgalU遺伝子は、近年、Pslエキソ多糖、D−マンノース、L−ラムノース、およびD−グルコースからなる繰り返し五糖ポリマーの生合成に要求されることが示された。pslAがPsl生合成に要求されるため、アイソジェニックpslAノックアウトPAO1ΔpslAへのCam−003結合を試験した(Byrd,M.S.,et al.,Mol Microbiol 73,622−638(2009))。PAO1ΔpslAへのCam−003の結合は、ELISA(図3B)およびFACS(図3C)により試験した場合に消失した一方、この突然変異体中のLPS分子は影響を受けなかった(図3D)。Cam−003の結合は、pslAにより補完されたPAO1ΔwbpL/algD/pslA三重突然変異体においてにおいて回復し(図3E)、これはCam−003がこの突然変異体とは対照的に補完PAO1ΔpslAに対するオプソニン殺傷を媒介する能力と同様であった(図3Fおよび3G)。Pelエキソ多糖突然変異体へのCam−003抗体の結合も、影響を受けず、このことはさらに、Pslを本発明者らの抗体標的として確認する(図3E)。結合アッセイは、残留抗体もPslに結合することを確認した(図3Hおよび3I)。
抗PslmAbは、培養上皮細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)の付着を遮断する。
本実施例は、抗Psl抗体が上皮細胞との緑膿菌(P.aeruginosa)会合を遮断したことを示す。抗Psl抗体を、不透明96ウェルプレート(Nunc Nunclon Delta)中で成長させたA549細胞(腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞系)のコンフルエント単層に添加した。対数増殖期の発光緑膿菌(P.aeruginosa)PAO1株(PAO1.lux)を10のMOIにおいて添加した。PAO1.luxをA549細胞と37℃において1時間インキュベートした後、A549細胞を洗浄し、次いでLB+0.5%グルコースを添加した。実施例2に記載のOPKアッセイにおいて実施したとおり、37℃における短時間のインキュベーション後に細菌を定量した。A549細胞を有さないウェルからの計測値を使用して非特異的結合について補正した。図4は、Cam−005およびWapR−007を除き、全ての抗体がA549細胞へのPAO1.luxの会合を用量依存様式で低減させたことを示す。OPKアッセイにおいて最良に機能したmAbのWapR−004およびCam−003(図2A〜B、および実施例2参照)も、A549肺上皮細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)細胞付着の阻害において最も活性であり、陰性対照と比較して最大約80%の低減を提供した。WapR−016は、3番目に活性の抗体であり、WapR−004およびCam−003と同様の阻害活性を示したが、10倍高い抗体濃度において示した。
インビボ継代緑膿菌(P.aeruginosa)株は、Pslの発現を維持/増加させる
インビボでのPsl発現が維持されるかどうかを試験するため、マウスに緑膿菌(P.aeruginosa)単離物を腹腔内注射し、次いで注射4時間後に腹腔洗浄により細菌を回収した。Pslの存在は、対照抗体およびCam−003を用いてフローサイトメトリーにより分析した。それというのも、抗体結合についての条件がよりストリンジェントであり、Psl発現に陽性または陰性である細胞の定量を可能とするためである。エクスビボ結合のため、細菌接種材料(0.1ml)を、一晩TSAプレートから調製し、BALB/cマウスに腹腔内送達した。チャレンジ4時間後において、細菌を回収し、RBCを溶解させ、超音波処理し、0.1%Tween−20および1%BSAを補給したPBS中で再懸濁させた。実施例1に既に記載したとおり試料を染色し、分析した。図5は、野生型緑膿菌(P.aeruginosa)株を有する腹腔洗浄後に回収された細菌が、対数増殖期の培養細菌と同等の濃いCam−003染色を示したことを示す(図5Aおよび5Cを比較)。インビボ継代野生型細菌は、接種材料と比較して染色の向上を示した(図5Bおよび5Cを比較)。接種材料内で、Pslは株6077について検出されず、株PAO1(O5)および6206(O11−細胞毒性)について最少で検出された。細菌へのCam−003の結合は接種材料に関して増加し、このことは、Psl発現がインビボで維持または増加されることを示す。野生型株6077、PAO1、および6206は、インビボ継代後にPslを発現するが、pslAを欠失する株PAO1(PAO1ΔpslA)は、Cam−003と反応し得ない。これらの結果は、Pslをモノクローナル抗体の標的としてさらに強調する。
緑膿菌(P.aeruginosa)急性肺炎モデルにおける抗Pslモノクローナル抗体Cam−003およびWapR−004により処理した動物についての生存率
抗体またはPBSをそれぞれのモデルに感染24時間前に投与した。緑膿菌(P.aeruginosa)急性肺炎、角膜炎、および熱傷感染モデルを上記のとおり修正して実施した(DiGiandomenico,A.,et al.,Proc Natl Acad Sci USA 104,4624−4629(2007))。急性肺炎モデルにおいて、BALB/cマウス(The Jackson Laboratory)を0.05mlの接種材料中で懸濁させた緑膿菌(P.aeruginosa)株により感染させた。熱傷モデルにおいて、CF−1マウス(Charles River)は、92℃への10秒間の金属焼印加熱により10%の総体表面積火傷を受けた。動物を緑膿菌(P. aeruginosa)株6077により示した用量において皮下感染させた。臓器負荷実験のため、急性肺炎をマウスにおいて誘導し、次いでCFUの決定のために肺、脾臓、および腎臓を感染24時間後に回収した。
緑膿菌(P.aeruginosa)角膜感染モデルにおける抗Pslモノクローナル抗体Cam−003およびWapR−004により処理した動物についての生存率
次に、Cam−003およびWapR−004の効力を、病原体の付着および損傷組織のコロニー化能を強調する緑膿菌(P.aeruginosa)角膜感染モデルにおいて評価した。図8A〜Dおよび8F〜Gは、Cam−003およびWapR−004を受けたマウスが、陰性対照処理動物に観察されたものよりも眼の総ホモジネートにおいて顕著に少ない病原性および細菌カウント数の低減を有したことを示す。図8Eは、Cam−003は熱傷モデルにおいて試験した場合でも有効であったことを示し、抗体処理対照と比較して15および5mg/kgにおいて顕著な保護を提供する。
Cam−003Fc突然変異抗体Cam−003−TMは、縮小したOPKおよびインビボ効力を有するが、抗細胞付着活性を維持する。
二重の作用機序についての潜在性を考慮して、Fcγ受容体との相互作用を低減させるFcドメイン中の突然変異を保有するCam−003Fc突然変異抗体Cam−003−TM(Oganesyan,V.,et al.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 64,700−704(2008))を作出して、保護が抗細胞付着またはOPK活性とより相関性を示すかどうかを同定した。緑膿菌(P.aeruginosa)突然変異体を、Schweizer(Schweizer,H.P.,Mol Microbiol 6,1195−1204(1992);Schweizer,H.D.,Biotechniques 15,831−834(1993))により記載されるアレル置換方針に基づき構築した。ベクターを大腸菌(E.coli)株S17.1から緑膿菌(P.aeruginosa)株PAO1中に動員させ;組換え体を記載(Hoang,T.T.,et al.,Gene 212,77−86(1998))のとおり単離した。遺伝子欠損はPCRにより確認した。緑膿菌(P.aeruginosa)突然変異体は、野生型遺伝子を保有するpUCP30Tベース構築物により補完した。図9Aは、Cam−003−TMが、Cam−003と比較してOPK活性の4倍の降下を示したが(それぞれ、0.24および0.06のEC50)、細胞付着アッセイにおいて有効であったことを示す(図9B)。図9Cは、Cam−003−TMが肺炎に対してもあまり有効でなかったことを示し、このことは、最適なOPK活性が最適な保護に必要であることを示唆する。OPKおよび細胞付着アッセイは、それぞれ実施例2および4に既に記載のとおり実施した。マウス急性肺炎モデルにおいて試験した場合、Cam−003−TMは、6077の低感染接種材料(2.4×105CFU)においてCam−003と効力が類似であった(図9D)。しかしながら、抗体用量のさらなる力価測定に続くより大きい感染接種材料(1.07×106)によるチャレンジは、Cam−003活性がCam−003−TMよりも優れていることを明らかにし、このことは、OPK活性が最適なインビボ保護に顕著に寄与することを示唆する(図9E)。
抗Psl抗体についてのエピトープマッピングおよび相対親和性
エピトープマッピングを競合ELISAにより実施し、緑膿菌(P.aeruginosa)株PAO1の一晩培養物の上澄みに由来するPslを用いるOCTET(登録商標)フローシステムを使用して確認した。競合ELISAのため、EZ−Linkスルホ−NHS−ビオチンおよびビオチン化キット(Thermo Scientific)を使用して抗体をビオチン化した。抗原コートプレートを、未標識抗体と同時インキュベートしたEC50のビオチン化抗体により処理した。HRP−コンジュゲートストレプトアビジン(Thermo Scientific)とインキュベートした後、プレートを上記のとおり発色させた。抗PslmAb間の競合実験は、抗体が少なくとも3つのユニークエピトープを標的化することを決定し、クラス1、2、および3抗体と称した(図10A)。クラス1および2抗体は、結合について競合しないが、クラス3抗体WapR−016は、クラス1および2抗体の結合を部分的に阻害する。
緑膿菌(P.aeruginosa)PAO1細胞へのポリミキシンB(PMB)−mAbコンジュゲートの結合をFACSにより評価した
本実施例において、細菌クリアランスを媒介し得るオプソニンモノクローナル抗体(mAb)にコンジュゲートされたPMBを評価してコンジュゲートがmAbの機能性を改善および/または拡張する一方、さらにPMBの毒性を低減させるかどうかを決定した。インビボで強力なオプソニン食菌殺傷(OPK)活性および保護を媒介する、緑膿菌(P.aeruginosa)Psl表面エキソ多糖を標的化するmAbのCAM−003を、コンジュゲート評価のために選択した。
緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを促進するPMB−mAbコンジュゲートの評価
本実施例は、PMB−mAbコンジュゲートの緑膿菌(P.aeruginosa)のOPKを促進する能力を評価する2つの実験系列を記載する。第1の実験(図15A〜B)において、ウサギ補体の存在下でのヒトHL−60好中球細胞系によるコンジュゲート媒介OPK活性を、実施例2に記載のとおり細菌ルシフェラーゼを発現する緑膿菌(P.aeruginosa)株を使用して評価した。R347をこれらの実験において陰性対照として使用した。CAM−003コンジュゲートは強力なOPK活性を保持したが、それはコンジュゲート当たりのPMBの数に増加に伴い縮小した(SM>DM1>DM2)(図15A)。CAM−003コンジュゲートは、Psl標的を発現しないΔpslA緑膿菌(P.aeruginosa)株に対するOPK活性を示さず、このことは、mAb媒介結合が殺傷に要求されたことを示す(図15B)。第2の実験系列において、mAbを欠く対照と比べて2時間のインキュベーション後の発光の低減を使用して殺傷%を測定した。図18Aは、CAM−003コンジュゲートがOPK活性を保持したが、それは特にDMおよびTM構築物においてコンジュゲート当たりのPMBの数の増加に伴い縮小したことを示す(WT>SM>DM>TM)。CAM−003コンジュゲートは、Psl標的を発現しないPAO!ΔpslA株に対するOPK活性を示さなかった(図示せず)。図18Bは、A7−PMBコンジュゲートがOPKを媒介しなかったことを示し、このことは、mAb媒介結合が殺傷に要求されたことを示す。
PMB−mAbコンジュゲートによる緑膿菌(P.aeruginosa)LPSの中和
緑膿菌(P.aeruginosa)O10LPS活性の中和を、PMB−mAbコンジュゲートまたはPMB単独をLPSと1時間プレインキュベートし、次いでネズミRAW264.7マクロファージを刺激し、TNF分泌を定量することにより評価した。LPSの最終濃度は2ng/mlであった。TNFは、FACSベースBD(商標)サイトメトリックビーズアレイ(Cytometric Bead Array)(CBA)法(BD Biosciences)により刺激6時間後に定量した。LPS中和は、LPS最大応答に対するTNF産生の減少により計測した。モックコンジュゲート野生型Cam−003ではなく、PMB−Cam−003コンジュゲートがLPS中和を示した。中和の効率は、コンジュゲート中のPMBの平均数に正比例した(DM2>DM1>SM)(図16A)。モックコンジュゲート野生型A7ではなく、PMB−A7コンジュゲートがLPS中和を示した(図16B)。A7コンジュゲートは、CAM−003コンジュゲートよりも良好な中和を示した。A7コンジュゲートは、おそらくそれらの分子により達成されるコンジュゲーション効率がより大きいことに起因してCAM−003コンジュゲートよりも良好な中和を示した。約2つのコンジュゲートPMB分子/mAbが、遊離PMB分子により中和されるLPSの量を中和するために要求される。
ネズミモデルにおけるCam−003−PMB部位特異的コンジュゲートの評価
Cam−003−PMBコンジュゲートの効力を、2つのネズミモデルのタイプにおいて評価した:1)内毒素血症(LPS)チャレンジモデル、コンジュゲートのLPSをインビボで中和および/または解毒する能力を決定するため;および2)緑膿菌(P.aeruginosa)敗血症モデル、Cam−003−PMBコンジュゲートが、抗体媒介細菌クリアランスに加え、PMB媒介LPS中和および/またはクリアランスを介して抗体単独と比べて細菌チャレンジに対する改善された保護をもたらすかどうかを評価するため。他の緑膿菌(P.aeruginosa)チャレンジモデルを使用してCam−003−PMBコンジュゲートの効力を試験することもできる(以下参照)。
PMBは、インビボでLPSに結合し、それを中和し、LPSチャレンジに対する保護を媒介し得ることが十分確立されている(Morrison,DC.et al.J.Immunochemistry 13(10):813−818(1976),Drabick,JJ.et al.,Antimicrob Agents Chemother.42(3):583−588(1998))。内毒素血症モデルにおいて、Cam−003−PMBコンジュゲートは、それらのLPSチャレンジから動物を保護する能力について評価する。グラム陰性細菌、例として、緑膿菌(P.aeruginosa)および大腸菌(E.coli)から精製されたLPSを使用して確立された最小致死量(LD100)においてマウスをチャレンジする。マウスが比較的LPSに耐性を示す場合、D−ガラクトサミンを同時投与することもできる。それというのも、それはLPSに対するマウスの感受性をほぼヒトの感受性まで大幅に増加させるためである(Galanos,C.et al.,Proc Natl Acad Sci USA.76(11):5939−5943(1979))。そのようなモデルは、LPS中和分子、例として、抗体およびポリミキシン−タンパク質コンジュゲートの前臨床効力評価に広く使用されている(Bailat,S.et al.,Infect Immun.65(2):811−814 (1997),Birkenmeier,G.et al.,J Pharmacol Exp Ther.318(2):762−771(2006),Drabick,JJ.et al.,Antimicrob Agents Chemother.42(3):583−588(1998))。Cam−003−PMBコンジュゲート、対照コンジュゲートおよび未コンジュゲートCam−003は、治療または防止的に投与することができ、それらのLPSチャレンジから動物を保護する能力を評価することができる。PMBコンジュゲートにより媒介される保護の程度は、血清または血漿中で計測される炎症促進サイトカインおよびケモカイン、例として、TNF、KCおよびIL−6のレベルと相関させることができる。
緑膿菌(P.aeruginosa)感染のいくつかのネズミモデルを使用してCam−003−PMBコンジュゲートの保護を媒介する能力を評価することができる。緑膿菌(P.aeruginosa)は、マウスに決定されたLD100用量において腹腔内投与(敗血症モデル)、静脈内投与(菌血症モデル)または鼻腔内投与(肺炎モデル)することができる。これらのモデルは、受動または活性ワクチンの前臨床効力試験に既に使用されている(Frank,DW.et al.,J Infect Dis.186(1):64−73.(2002),Secher,T.et al.,J Antimicrob Chemother.66(5):1100−1109(2011),Miyazaki,S.et al.,J Med Microbiol.43(3):169−175(1995),Dunn,DL.et al.,Surgery 96(2):440−446(1984))。
特に、C57Bl/6マウス(1群当たり10匹)にmAbまたはPMB−mAbコンジュゲートを腹腔内投与して6時間後に緑膿菌(P.aeruginosa)PAO10LPS(Sigma)およびD−ガラクトサミンによりチャレンジした。PMB対照は、腹腔内投与して2時間後に0.2mg/kgにおいてチャレンジし、典型的には80〜100%の保護を提供する。対照マウスに未コンジュゲートCAM−003を投与し、全て18時間以内に死亡した。図19AおよびBは、45mg/kgにおいてCAM−003およびA7のDMおよびTMコンジュゲートが90〜100%の保護を提供した一方、SMコンジュゲートは保護的でなかったことを示す。
C57Bl/6マウス(1群当たり10匹)に、mAbまたはPMB−mAbコンジュゲートを腹腔内投与(10、1および0.1mg/kg)して6時間後にLD80−100用量の緑膿菌(P.aeruginosa)株6294(4E7CFU)により腹腔内チャレンジした。2つの試験からのデータをこの分析において組み合わせた。生存率を72時間にわたりモニタリングした。2つの試験の組み合わせたデータを図21A〜Cに示す:A7または緩衝液を投与したほとんどの対照マウスが24時間までに死亡した。未コンジュゲートCAM−003は、50〜90%の保護を示した。保護活性は、用量と逆相関することが明らかになった。CAM−003−PMBコンジュゲートは、10mg/kgの高用量において未コンジュゲートmAbよりも良好な保護を付与し、このことは、感染の間に減少したLPSの中和が生存に寄与したことを示唆する。A7−DM−PMB対照コンジュゲートは、10mg/kgにおいて50%の保護活性を示し、このことは、LPS中和が生存利益を提供し得ることを示唆する。逆に、コンジュゲートは、0.1mg/kgの低用量においてCAM−003よりも保護的でなく、保護活性はコンジュゲートのインビトロOPK活性と相関した(WT>SM>DM>TM)。まとめると、結果は、コンジュゲートPMBがLPSの中和を媒介することによりオプソニン抗体に追加保護活性を付与し、その細菌クリアランス機能を補完し得ることを示す。
Claims (13)
- 抗体またはその抗原結合断片にコンジュゲートされたポリミキシンB(PMB)を含む、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する抗体コンジュゲートであって、
前記抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号17、18、19、20、21および22(Cam−003)、
配列番号23、24、25、20、21および22(Cam−004)、
配列番号29、30、31、32、33および34(WapR−001)、
配列番号35、36、37、38、39および40(WapR−002)、
配列番号41、42、43、44、45および46(WapR−003)、
配列番号47、48、49、50、51および52(WapR−004)、
配列番号47、48、75、50、51および52(WapR−004RAD)、および配列番号59、60、61、62、63および64(WapR−016)
からなる群から選択されるアミノ酸配列VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2およびVLCDR3を含む、重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含む、抗体コンジュゲート。 - 抗体またはその抗原結合断片にコンジュゲートされたポリミキシンB(PMB)を含む、シュードモナス属(Pseudomonas)Pslに特異的に結合する抗体コンジュゲートであって、
前記抗体またはその抗原結合断片は、以下のアミノ酸配列:
配列番号1および配列番号2(Cam−003);
配列番号3および配列番号2(Cam−004);
配列番号5および配列番号6(WapR−001);
配列番号7および配列番号8(WapR−002);
配列番号9および配列番号10(WapR−003);
配列番号11および配列番号12(WapR−004);
配列番号74および配列番号12(WapR−004RAD);および
配列番号15および配列番号16(WapR−016)
から選択される重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含む、抗体コンジュゲート。 - 前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体または完全ヒト抗体である、請求項1または2に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記抗原結合断片が、Fab断片、Fab'断片、F(ab)2断片、Fv断片、または単鎖Fv(scFv)断片である、請求項1または2に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、以下:
(a)ヒトIgA定常領域;
(b)ヒトIgD定常領域;
(c)ヒトIgE定常領域;
(d)ヒトIgG1定常領域;
(e)ヒトIgG2定常領域;
(f)ヒトIgG3定常領域;
(g)ヒトIgG4定常領域;および
(h)ヒトIgM定常領域
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常領域をさらに含む、請求項1または2に記載の抗体コンジュゲート。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、以下:
(a)ヒトIgカッパ軽鎖定常領域;および
(b)ヒトIgラムダ軽鎖定常領域;
からなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常領域をさらに含む、請求項1または2に記載の抗体コンジュゲート。 - 請求項1または2に記載の抗体コンジュゲートと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
- 医薬として使用するための、請求項7に記載の医薬組成物。
- シュードモナス属(Pseudomonas)感染の予防または治療が必要とされる対象におけるシュードモナス属(Pseudomonas)感染の予防または治療に使用するための、請求項8に記載の医薬組成物。
- 前記シュードモナス属(Pseudomonas)感染は、緑膿菌(P.aeruginosa)感染である、請求項9に記載の医薬組成物。
- 上皮細胞への緑膿菌(P.aeruginosa)の付着の遮断または予防に使用するための、請求項7に記載の医薬組成物。
- 緑膿菌(P.aeruginosa)の食細胞によるオプソニン食菌殺傷(OPK)の向上に使用するための、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記食細胞は、分化HL−60細胞またはヒト多形核白血球(PMN)である、請求項12に記載の医薬組成物。
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