MX2013014372A - Moleculas de union anti-pseudomonas lectina pisum satinum (psl) y usos de las mismas. - Google Patents

Moleculas de union anti-pseudomonas lectina pisum satinum (psl) y usos de las mismas.

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Abstract

La presente descripción se refiere a moléculas de unión anti-Ps1 de Pseudomonas y usos de las mismas, en particular en la prevención y el tratamiento de infección por Pseudomonas. Asimismo, la descripción proporciona composiciones y métodos para prevenir y tratar la infección por Pseudomonas.

Description

MOLECULAS DE UNION ANTI -PSEUDOMONAS LECTINA PISUM SATINUM (PSL) Y USOS DE LAS MISMAS Campo de la Invención La presente descripción se refiere a moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas y usos de las mismas, en particular en la prevención y el tratamiento de infección por Pseudomonas. Asimismo, la descripción proporciona composiciones y métodos para prevenir y tratar la infección por Pseudomonas.
Antecedentes de la Invención Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) es un patógeno oportunista gram negativo que provoca infecciones agudas y crónicas en individuos comprometidos (Ma et al., Journal of Bacteriology 189 (22) : 8353-8356 (2007)). Esto se debe en parte a la alta resistencia innata de la bacteria a los antibióticos de uso clínico y en parte a la formación de biopelículas altamente resistentes a los antibióticos (Drenkard E., Microbes Infect 5 1213-1219 (2003); Hancokc & Speert, Drug Resist Update 3:247-255 (2000)).
P. aeruginosa es una causa común de las infecciones adquiridas en hospitales en el mundo occidental . Es un agente frecuente que causa la bacteriemia en víctimas de quemaduras en individuos inmunodeprimidos (Lyczak et al . , Microbes Infect 2:1051-1060 (2000)). También es la causa más común de REF: 245385 neumonía gram-negativa hospitalaria (Craven et al., Semin Respir Infect 11:32-53 (1996)), especialmente en pacientes con ventilación mecánica, y es el patógeno más prevalente en los pulmones en individuos con fibrosis quística (Pier et al., ASM News 6:339-347 (1998)). Las infecciones graves por P. aeruginosa pueden volverse sistémicas, resultando en sepsis. La sepsis se caracteriza por una inflamación sistémica grave, que a menudo resulta en la falla de múltiples órganos y la muerte .
Se reporta que el exopolisacárido Psl de Pseudomonas está anclado a la superficie de P. aeruginosa y se cree que es importante para facilitar la colonización de los tejidos huéspedes y para establecer/mantener la formación de biopelícula (Jackson, K.D., et al., J Bacteriol 186, 4466-4475 (2004)). Su estructura compromete el pentasacárido de repetición rico en mañosa (Byrd, M.S., et al., Mol Microbiol 73, 622-638 (2009) ) .
Debido a una resistencia a múltiples fármacos cada vez más alta, sigue siendo necesario en la técnica desarrollar estrategias nuevas para la identificación de nuevos agentes profilácticos y terapéuticos específicos para Pseudomonas.
Breve descripción de la Invención Una modalidad está dirigida a una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas, en donde la molécula de unión (a) puede inhibir la unión de Pseudomonas aeruginosa a células epiteliales, (b) puede promover la OPK de P. aeruginosa, o (c) puede inhibir la unión de P. aeruginosa a células epiteliales y puede promover la OPK de P. aeruginosa.
También se describe una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de Psl de Pseudomonas como un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena liviana (VL) de WapR-004, Cam-003, Cam-004 o Cam-005.
También se describe una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas e inhibe de forma competitiva la unión de Psl de Pseudomonas mediante un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende las VH y VL de WapR-004, Cam-003, Cam-004 o Cam-005.
Algunas modalidades incluidas en la presente descripción incluyen la molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo tal como se describió anteriormente, en donde las VH y VL de WapR-004 comprenden la SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente, las VH y VL de Cam-003 comprenden la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, las VH y VL de Cam-004 comprenden la SEQ ID NO : 3 y SEQ ID NO : 2, respectivamente, y las VH y VL de Cam-005 comprenden la SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 2, respectivamente.
También se describe una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de Psl de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende las regiones VH y VL de WapR-001, WapR-002 o WapR-003.
También se describe una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas e inhibe de forma competitiva la unión de Psl de Pseudomonas mediante un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende las VH y VL de WapR-001, WapR-002 o WapR-003.
Algunas modalidades incluyen la molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo tal como se describió anteriormente, en donde las VH y VL de WapR-001 comprenden la SEQ ID NO : 5 y SEQ ID NO : 6, respectivamente, las VH y VL de WapR-002 comprenden la SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO : 8, respectivamente, y las VH y VL de WapR-003 comprenden la SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente.
También se proporciona una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de Psl de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende las regiones VH y VL de WapR-016.
También se proporciona una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas e inhibe de forma competitiva la unión de Psl de Pseudomonas mediante un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende las VH y VL de WapR-016.
Algunas modalidades incluyen la molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describió anteriormente, en donde las VH y VL de WapR-016 comprenden la SEQ ID NO: SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente .
También se proporciona una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VH de anticuerpo, en donde la VH comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15.
Algunas modalidades incluyen una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VL de anticuerpo, en donde la VL comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16.
También se proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende secuencias de aminoácidos de VH y VL al menos 90% idénticas o idénticas a: (a) SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, (b) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO : 2, respectivamente, (c) SEQ ID NO : 4 y SEQ ID NO: 2 , respectivamente, (d) SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 , respectivamente, (e) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente, (f) SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente, (g) SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 ,. respectivamente, (h) SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, respectivamente; o (i) SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. En modalidades específicas, el anticuerpo descrito anteriormente o fragmento de unión a antígenos del mismo comprende una VH con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y una VL con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En otras modalidades, el anticuerpo descrito anteriormente o fragmento de unión a antígenos del mismo comprende una VH con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11 y una VL con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
También se describe una molécula de unión aislada, por ejemplo, una anticuerpo o fragmento de unión a antígenos de la misma que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VH de anticuerpo, en donde la VH comprende una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de VH-1 (VHCDR1) idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos a: SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 59.
También se proporciona una molécula de unión aislada, por ejemplo, una anticuerpo o fragmento de unión a antígenos de la misma que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VH de anticuerpo, en donde la VH comprende una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de VH-2 (VHCDR2) idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos a: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 54 o SEQ ID NO: 60.
También se proporciona una molécula de unión aislada, por ejemplo, una anticuerpo o fragmento de unión a antígenos de la misma que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VH de anticuerpo, en donde la VH comprende una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de VH-3 (VHCDR3 , por sus siglas en inglés) idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos a: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55 o SEQ ID NO: 61.
También se describe una molécula de unión aislada, por ejemplo, una anticuerpo o fragmento de unión a antígenos de la misma que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VL de anticuerpo, en donde la VL comprende una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de VL-1 (VLCDR1, por sus siglas en inglés) idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos a: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 56 o SEQ ID NO : 62.
También se proporciona una molécula de unión aislada, por ejemplo, una anticuerpo o fragmento de unión a antígenos de la misma que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VL de anticuerpo, en donde la VL comprende una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de VL-2 (VLCDR2, por sus siglas en inglés) idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos a: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 57 o SEQ ID NO: 63.
Algunas modalidades incluyen una molécula de unión aislada, por ejemplo, una anticuerpo o fragmento de unión a antígenos de la misma que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VL de anticuerpo, en donde la VL comprende una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de VL-3 (VLCDR3, por sus siglas en inglés) idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos a: SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 58 o SEQ ID NO: 64.
También se proporciona una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VH de anticuerpo, en donde la VH comprende una secuencia de aminoácidos de VHCDRl, VHCDR2 , y VHCDR3 idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos en una o más de las VHCDR a: SEQ ID NOs : 17, 18, y 19, SEQ ID NOs : 23, 24, y 25, SEQ ID NOs: 26, 27, y 28, SEQ ID NOs : 29, 30, y 31, SEQ ID NOs : 35, 36, y 37, SEQ ID NOs: 41, 42, y 43, SEQ ID NOs : 47, 48, y 49, SEQ ID NOs : 53, 54, y 55 o SEQ ID NOs : 59, 60, y 61, respectivamente.
Algunas modalidades incluyen una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VL de anticuerpo, en donde la VL comprende una secuencia de aminoácidos de VLCDR1 , VLCDR2 , y VLCDR3 idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos en una o más de las VHCDR a: SEQ ID NOs: 20, 21 y 22, SEQ ID NOs : 32, 33 y 34, SEQ ID NOs : 38, 39, y 40, SEQ ID NOs : 44, 45, y 46, SEQ ID NOs : 50, 51, y 52, SEQ ID NOs : 56, 57, y 58, o SEQ ID NOs : 62, 63 y 64, respectivamente .
También se describe una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VL de anticuerpo, en donde la VL comprende una secuencia de aminoácidos de VLCDR1, VLCDR2 , y VLCDR3 idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos en una o más de las VHCDR a: SEQ ID NOs: 20, 21 y 22, SEQ ID NOs : 32, 33 y 34, SEQ ID NOs : 38, 39, y 40, SEQ ID NOs: 44, 45, y 46, SEQ ID NOs : 50, 51, y 52, SEQ ID NOs : 56, 57, y 58, o SEQ ID NOs : 62, 63 y 64, respectivamente Algunas modalidades incluyen la molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describió anteriormente, que (a) puede inhibir la unión de Pseudomonas aeruginosa a células epiteliales, (b) puede promover la OPK de P. aeruginosa o (c) puede inhibir la unión de P. aeruginosa a células epiteliales y puede promover la OPK de P. aeruginosa .
Otras modalidades incluyen la molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo, tal como se describió anteriormente, donde la inhibición máxima de la unión de P. aeruginosa a células epiteliales se logra a una concentración de anticuerpos de aproximadamente 50 µ9/p?1 o menos, 5.0 g/ml o menos o aproximadamente 0.5 g/ml o menos, o a una concentración de anticuerpos en el intervalo de aproximadamente 30 ug/ml a aproximadamente 0.3 µ9/??1, o a una concentración de anticuerpos de aproximadamente 1 µ9/p?1, o a una concentración de anticuerpos de aproximadamente 0.3 µ9/p?1.
Ciertas modalidades incluyen la molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describió anteriormente, donde la EL50 de la OPK es menor que aproximadamente 0.5 µg/ml, menor que aproximadamente 0.05 9/p?1 o menor que aproximadamente 0.005 µg/ml, o donde la EL50 de la OPK varía de aproximadamente 0.001 µg/ml a aproximadamente 0.5 µ9/p?1, o donde la EL50 de la OPK es menor que aproximadamente 0.2 µ9/t?1, o en donde la EL50 de la OPK es menor que aproximadamente 0.02 µg/ml .
También se incluye la molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describió anteriormente, que se une específicamente a Psl de P. aeruginosa con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10"2 M, 10~2 M, 5 x 10"3 M, 10~3 M, 5 x 1CT4 M, 10"4 M, 5 x 10"5 M, 10"5 M, 5 x 10"6 M, 10"6 M, 5 x 10"7 , 10"7 M, 5 X 10"8 M, 10~8 M, 5 X 10"9 M, 10"9 M, 5 x 10"10 M, 10~10 M, 5 x 10"11 M, 10"11 M, 5 x 10~12 M, 10"12 M, 5 x 10"13 M, 10"13 M, 5 x 10"14 M, 10"14 M, 5 x 10"15 M o 10"15 M, o en donde la KD está en un intervalo de aproximadamente 1 x 10"10 a aproximadamente 1 x 10"6 M. En una modalidad, un anticuerpo aislado tal como se describe en la presente se une específicamente a Psl de Pseudomonas con una afinidad caracterizada por una D de aproximadamente 1.18 x 10"7 M, tal como se determina mediante ensayo de unión OCTET*. En otra modalidad, un anticuerpo aislado tal como se describe en la presente se une específicamente a Psl de Pseudomonas con una afinidad caracterizada por una KD de aproximadamente 1.44 x 10"7 M, tal como se determina mediante ensayo de unión OCTET* .
En varias modalidades, las moléculas de unión descritas anteriormente son humanizadas.
En varias modalidades, las moléculas de unión descritas anteriormente son quiméricas.
En varias modalidades, las moléculas de unión descritas anteriormente son completamente humanizadas.
En ciertas modalidades, las moléculas de unión descritas anteriormente son fragmentos Fab, fragmentos Fab 1 , fragmentos F(ab)2 o fragmentos scFv.
En ciertas modalidades, las moléculas de unión descritas anteriormente comprenden regiones constantes de cadena liviana que consisten en una región constante kappa humana o una región constante lambda humana.
En ciertas modalidades, las moléculas de unión descritas anteriormente comprenden una región constante de cadena pesada o fragmento de la misma. En modalidades adicionales, la región constante de cadena pesada o fragmento de la misma es una IgGl humana.
En ciertas modalidades, las moléculas de unión descritas anteriormente son anticuerpos monoclonales.
En algunas modalidades, las moléculas de unión descritas anteriormente, por ejemplo, un anticuerpo o fragmentos del mismo, se conjugan con un agente seleccionado del grupo que consiste en agente antimicrobiano, un agente terapéutico, un profármaco, un péptido, una proteína, una enzima, un lípido, un modificador de respuesta biológica, agente farmacéutico, una linfocina, un anticuerpo heterólogo o fragmento del mismo, una etiqueta detectable, polietilenglicol (PEG) y una combinación de dos o más de los agentes. En modalidades adicionales, la etiqueta detectable se selecciona del grupo que consiste en una enzima, una etiqueta fluorescente, una etiqueta quimioluminiscente , una etiqueta bioluminiscente , una etiqueta radiactiva o una combinación de dos o más de cualquiera de las etiquetas detectables .
Modalidades adicionales incluyen composiciones que comprenden las moléculas de unión descritas anteriormente, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos y un portador.
Ciertas modalidades incluyen un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica la VH descrita anteriormente. En algunas modalidades, el polinucleótido comprende además un ácido nucleico que codifica la VL descrita anteriormente, donde una molécula de unión o fragmento de unión a antígenos de la misma expresados por el polinucleótido se une específicamente a Psl de Pseudomonas. En algunas modalidades, el polinucleótido tal como se describe en la presente codifica una molécula de scFv que incluye VH y VL, que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70. En otras modalidades, la descripción incluye un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica la VL descrita anteriormente. En modalidades adicionales, el polinucleótido comprende además un ácido nucleico que codifica la VH descrita anteriormente, donde una molécula de unión o fragmento de unión a antígenos de la misma expresados por el polinucleótido se une específicamente a Psl de Pseudomonas.
Ciertas modalidades proporcionan vectores que comprenden los polinucleótidos descritos anteriormente. En modalidades adicionales, los polinucleótidos están operativamente asociados con un promotor. En modalidades adicionales, la descripción proporciona células hospederases que comprenden los vectores. En modalidades adicionales, la descripción proporciona vectores en los que el polinucleótido está asociado operativamente con un promotor, donde los vectores pueden expresar una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describió anteriormente que se une específicamente a Psl de Pseudomonas en una célula hospedera adecuada.
Algunas modalidades proporcionan un método de producción de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describió anteriormente que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende cultivar una célula hospedera que contiene un vector que comprende los polinucleótidos descritos anteriormente y recuperar el anticuerpo o fragmento del mismo. Modalidades adicionales proporcionan una molécula de unión aislada o fragmento de la misma producida por el método descrito anteriormente.
En algunas modalidades, la especie de Pseudomonas es Pseudomonas aeruginosa .
En modalidades adicionales, las moléculas de unión descritas anteriormente o fragmentos de las mismas, anticuerpos o fragmentos de los mismos, o composiciones, se unen a dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más serotipos de P. aerugínosa diferentes, o a al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% de cepas de P. aerugínosa aisladas de pacientes infectados. En modalidades adicionales, las cepas de P. aerugínosa se aislan de uno o más de pulmón, esputo, ojo, pus, heces, orina, senos, una herida, piel, sangre, hueso o fluido de rodilla. Los serotipos de P. aerugínosa se categorizan de acuerdo con un Sistema Internacional de Clasificación Antigénica (IATS) originalmente descrito en Liu, P.V. et al. Int. J. Syst . Bacteríol . 33:256-264 (1983), complementado, por ejemplo, por Liu P.V., ang S., J. Clin. Microbíol . 28:922-925 (1990).
Algunas modalidades están dirigidas a un método para prevenir o tratar una infección por Pseudomonas en un sujeto que lo necesita que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de la molécula de unión o fragmento de la misma, el anticuerpo o fragmento del mismo, la composición, el polinucleótido, el vector o la célula hospedera descritos en la presente. En modalidades adicionales, la infección por Pseudomonas es una infección por P. aerugínosa . En algunas modalidades, el sujeto es un humano. En ciertas modalidades, la infección es una infección ocular, una infección pulmonar, una infección por quemaduras, una infección de herida, una infección en la piel, una infección en la sangre, una infección en los huesos o una combinación de dos o más de las infecciones. En modalidades adicionales, el sujeto padece neumonía, lesión de quemaduras, infección de la córnea, fibrosis quística o una combinación de éstas.
Algunas modalidades están dirigidas a un método para bloquear o prevenir la unión de P. aeruginosa a células epiteliales que comprende poner en contacto una mezcla de células epiteliales y P. aeruginosa con la molécula de unión o fragmento de la misma, el anticuerpo o fragmento del mismo, la composición, el polinucleótido, el vector o la célula hospedera descritos en la presente.
También se describe un método para promover la OPK de P. aeruginosa que comprende poner en contacto una mezcla de células fagocíticas y P. aeruginosa con la molécula de unión o fragmento de la misma, el anticuerpo o fragmento del mismo, la composición, el polinucleótido, el vector o la célula hospedera descritos en la presente. En modalidades adicionales, las células fagocíticas son células HL-60 diferenciadas o leucocitos polimorf©nucleares (P N) .
Breve Descripción de las Figuras Figuras 1A-1F: La detección de células enteras fenotípicas con bibliotecas de bacteriófagos de anticuerpos identificó anticuerpos específicos de P. aeruginosa funcionalmente activos. FIG 1A Presentación de la estrategia de selección de anticuerpos completa. FIG IB Diagrama de flujo que describe el proceso para aislar los genes de la región variable de anticuerpos de pacientes recientemente expuestos a P. aeruginosa. FIG 1C Características de las bibliotecas de expresión de bacteriófagos de scFv que indican el tamaño y la diversidad del repertorio de anticuerpos clonados. Fig ID Comparación de la eficiencia de la selección de expresión de bacteriófagos usando la biblioteca de anticuerpos del paciente o una biblioteca de anticuerpos sin tratamiento previo, cuando se seleccionan en P. aeruginosa 3064 ? apR ) o P. aeruginosa PA01 MexAB OprM ? WapR (2) en suspensión. Las barras indican las titulaciones de salida (en UFC) en cada ronda de selección, y los círculos indican la proporción de secuencias de VH CDR3 duplicados, una indicación de enriquecimiento clonal . FIG 1E La detección ELISA de scFv de expresión de bacteriófagos para evaluar la unión a múltiples cepas de P. aeruginosa . Los datos de ELISA (absorbancia a 450 nm) se muestran para ocho bacteriófagos-scFvs individuales de selecciones y un bacteriófago-scFv irrelevante. FIG. 1F La unión FACS de anticuerpos específicos de P. aeruginosa con cepas representativas de serotipos de P. aeruginosa únicos. Para cada anticuerpo evaluado se muestra un anticuerpo testigo negativo de IgG humana como una pico sombreado .
Figuras 2A-2D: Evaluación de mAb específicos que promueven la OP de P. aeruginosa Fig. 2A ensayo de opsonofagocitosis con una cepa del serogrupo 05 de P. aeruginosa luminiscente (PAOl.lux), con diluciones de anticuerpos monoclonales purificados derivados del cribado de bacteriófagos. Fig. 2B Ensayo de opsonofagocitosis con la cepa del serogrupo 011 de P. aeruginosa ( 9882 - 80. lux) , con diluciones de los anticuerpos monoclonales WapR-004 y Cam-003 purificados derivados del cribado de bacteriófagos. Tanto en la Fig. 2A como en la Fig. 2B se utilizó como testigo negativo R347, un anticuerpo humano coincidente con isotipo que no se une a antígenos de P. aeruginosa. Figs . 2A, 2B Los resultados son datos representativos de tres experimentos independientes realizados para cada anticuerpo. Figs. 2C-2D: Evaluación de Cam-003 que promueve la destrucción opsonofagocítica (OPK) de P. aeruginosa . Fig. 2C Ensayo de opsonofagocitosis con cepas no mucoides representativas de serotipos de antígeno O clínicamente relevantes (6294 (06 ExoU") , 6077 (011 ExoU+) , 9882-80. lux (011 ExolT) , 33356 (09 ExoU") , 2410. lux (06) y 6206. lux (011 ExoU+) ) . Fig. 2D Ensayo de opsonofagocitosis con cepas mucoides representativas que se diseñaron para ser luminiscentes (A004.1ux, AOlO.lux y A015.1ux). Las líneas representan la destrucción porcentual media y las barras de error representan la desviación estándar. La destrucción porcentual se calculó con respecto a los resultados obtenidos en ensayos realizados en ausencia del anticuerpo. Figs. 2C, 2D) Se utilizó un testigo de R347 dentro de los ensayos individuales para cada cepa. Para simplicidad, el testigo de R347 no se incluyó en las figuras. Los resultados son datos representativos de tres experimentos independientes realizados para cada cepa.
Figuras 3A-3K: Identificación del objetivo de exopolisacáridos Psl de P. aeruginosa de anticuerpos derivados de detección fenotípica. La reactividad de los anticuerpos se determinó mediante ELISA indirecta sobre placas recubiertas con las cepas de P. aeruginosa indicadas: Fig. 3A PAOl, PAOlñwbpL, PAOlArmlC y PAOlñgalU de tipo salvaje. Fig. 3B PAOlApslA. El anticuerpo Genway es específico para una proteína de membrana externa de P. aeruginosa y se utilizó como un testigo positivo. Fig. 3G Análisis de unión FACS de Cam-003 a PAOl y PAOlApslA. Cam-003 se indica mediante una línea sólida negra y un pico claro; se utilizó como testigo negativo un anticuerpo de IgGl humana no específico de P. aeruginosa coincidente con isotipo y se indica mediante un pico sombreado y una línea gris. Fig. 3D El LPS purificado de PAOl y PAOlApslA se resolvió mediante SDS-PAGE y se inmunotransfirió con antisueros derivados de ratones vacunados con PAOl wapR algD, una cepa mutante deficiente en transporte de antígenos O a la membrana externa y producción de alginatos. (E) Datos de unión de ELISA de Cam-003 con mutantes isogénicos de PAOl. Línea 1: PAO1?wbpLAalgD; Línea 2: PAO1?wbpLka1gD/SpslA; Línea 3: PAO1?wbpL a1gDApelA; Línea 4: PAOl wbpL algD pslA + pUCP; Línea 5: AO1?wbpL a1gDApslA + pPW145. pPW145 es un vector de expresión de pUCP que contiene pslA.
* Indica P<0.005 usando la prueba U de Mann- hitney cuando se compara la unión de Cam-003 con la de R347. (F y G) Ensayos de opsonofagocitosis que indican que Cam-003 solo media la destrucción de cepas capaces de producir Psl (PAOl y PAOlApslA tipo salvaje complementados in trans con el gen pslA) . (H e I) Datos de ELISA que indican la reactividad de los anticuerpos anti-Psl WapR-001, WapR-004 y WapR-016 con PAOl LwbpL algD y PAOl AwbpL algDApslA . (J) La reactividad de los anticuerpos se determinó mediante ELISA indirecta sobre placas recubiertas con las cepas de P. aeruginosa indicadas: PAOl, PAOlAwbpL, PAO1?wbpL a1gD, PAOlArmlC y PAOlAgalU de tipo salvaje. Se utilizó R347 como testigo negativo en todos los experimentos. (A, B, C, F, G, H, I, J) . Cada panel es un conjunto de datos representativo de tres experimentos independientes. (K) La captura de anticuerpos anti-Psl de Psl enriquecidos aislados de células de P. aeruginosa enteras tal como se mide en un instrumento FORTEBIO® OCTET9 384. Se utilizó R347 como testigo negativo. Los resultados son datos representativos de tres experimentos independientes.
Figura 4: mAb anti-Psl inhiben la unión de células de cepa de P. aeruginosa luminiscente PAOl . lux a células A549. Se agregó PAOl . lux se fase logarítmica a una monocapa confluente de células A549 a una MOI de 10 y posteriormente análisis de RLU después de lavado repetido para quitar la P. aeruginosa sin unir. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes realizados por duplicado para cada concentración de anticuerpos.
Figuras 5A-5U: Las cepas de P. aeruginosa con pases in vivo mantienen/aumentan la expresión de Psl . El anticuerpo Cam-003 se muestra mediante una línea sólida negra y un pico claro; el anticuerpo testigo negativo de IgG humana se muestra como una línea gris y un pico sombreado. Fig. 5A Para el testigo positivo, se ensayó el Cam-003 para unión a cepas cultivadas a la fase logarítmica de un cultivo de toda la noche (~5 x 108/ml) . Fig. 5B Los inóculos para cada cepa se prepararon hasta 5 x 108 UFC/ml a partir de una placa de TSA de toda la noche cultivada en césped y evaluada para reactividad a Cam-003 mediante citometría de flujo. Fig. 5C Cuatro horas después del desafío intraperitoneal , las bacterias se cosecharon de ratones mediante lavaje peritoneal y se ensayaron en busca de la presencia de Psl con Cam-003 mediante citometría de flujo. Fig. 5D Cuatro horas y Fig. 5E veinticuatro horas después del desafío intranasal, las bacterias se cosecharon de ratones mediante lavaje broncoalvelolar (BAL) y se ensayaron en busca de la presencia de Psl con Cam-003 mediante citometría de flujo. Cada panel de citometría de flujo es un conjunto de datos representativos de cinco experimentos independientes Figs. 5F-5U. Unión de los anticuerpos específicos de P. aeruginosa (Cam-003, Cam-004 y Cam-005) a cepas representativas de los serotipos de P. aeruginosa únicos Fig. 5F PA01(05), Fig. 5G 2135 (01), Fig. 5H 2531 (01), Fig. 51 2410 (06), Fig. 5J 2764 (011), Fig. 5K 2757 (011), Fig. 5L 33356 (09), Fig. 5M 33348 (01), Fig. 5N 3039 (NT), Fig. 50 3061 (NT), Fig. 5P 3064 (NT), Fig. 5Q 19660 (NT), Fig. 5R 9882-80 (Olí), Fig. 5S 6073 (011), Fig. 5T 6077 (011) y Fig. 5U 6206 (011) . Los anticuerpos Cam-003, Cam-004 y Cam-005 se muestran mediante una línea gris y un pico claro; el anticuerpo testigo negativo de IgG humana se muestra como una línea sólida negra y un pico sombreado.
Figuras 6A-6G: Tasas de supervivencia para animales tratados con anticuerpos monoclonales anti-Psl Cam-003 o WapR-004 en un modelo de neumonía agudo de P. aeruginosa. Figs. 6A-6D Los animales fueron tratados con Cam-003 a 45, 15 y 5 mg/kg y R347 a 45 mg/kg o PBS 24 horas antes de la infección intranasal con Fig. 6A PA01 (1.6 x 107 UFC) , Fig. 6B 33356 (3 x 107 UFC), Fig. 6C 6294 (7 x 106 UFC), Fig. 6D 6077 (1 x 106 UFC) . Figs. 6E-6F. Los animales se trataron con WapR-004 a 5 y 1 mg/kg tal como se indicó y posteriormente sé infectaron con 6077 a Fig. 6E (8 x 105 UFC) o Fig. 6F (6 x 105 UFC) . Se monitoreó cuidadosamente la supervivencia de los animales hasta 72 horas Figs. 6A-6D o durante 120 horas Figs. 6E-6F. Figs. 6G. Los animales fueron tratados con Cam-003 a 15 mg/kg o 5 mg/kg, o R347 a 15 mg/kg 24 horas antes de la infección intranasal con PA01 (4.4 x 107 UFC) , y Cam-003 a 15 mg/kg 24 horas antes de la infección intranasal con PAOlApslA (3 x 107 UFC) . En todos los experimentos, PBS y R347 sirvieron como testigos negativos. Los resultados son representados como curvas de supervivencia de Kaplan-Meier; las diferencias en supervivencia se calcularon mediante prueba de clasificación logarítmica para Cam-003 con respecto a R347. Fig. 6A Cam-003 (45 mg/kg - P<0.0001; 15 mg/kg -P=0.0003; 5 mg/kg - P=0.0033). Fig. 6B Cam-003 (45 mg/kg -P=0.0012; 15 mg/kg - P=0.0012; 5 mg/kg - P=0.0373). Fig. 6C Cam-003 (45 mg/kg - P=0.0007; 15 mg/kg - P=0.0019; 5 mg/kg -P=0.0212). Fig. 6D Cam-003 (45 mg/kg - P<0.0001; 15 mg/kg -P<0.0001; 5 mg/kg - P=0.0001). Los resultados son representativos de al menos dos experimentos independientes. Fig. 6E [Cam-003 (5 mg/kg) con respecto a R347 (5 mg/kg) : P=0.02; Cam-003 (1 mg/kg) con respecto a R347 (5 mg/kg): P=0.4848; WapR-004 (5 mg/kg) con respecto a R347 (5 mg/kg): P<0.0001; WapR-004 (1 mg/kg) con respecto a R347 (5 mg/kg): P=0.0886 WapR-004 (5 mg/kg) con respecto a Cam-003 (5 mg/kg): P=0.0017; WapR-004 (1 mg/kg) con respecto a Cam-003 (1 mg/kg): P=0.2468; R347 (5 mg/kg) con respecto a PBS: P=0.6676] Fig. 6F [Cam-003 (5 mg/kg) con respecto a R347 (5 mg/kg): P=0.0004; Cam-003 (1 mg/kg) con respecto a R347 (5 mg/kg): P<0.0001; WapR-004 (5 mg/kg) con respecto a R347 (5 mg/kg) : P<0.0001; WapR-004 (1 mg/kg) con respecto a R347 (5 mg/kg) : P<0.0001; apR-004 (5 mg/kg) con respecto a Cam-003 (5 mg/kg) : P=0.0002; WapR-004 (1 mg/kg) con respecto a Cam-003 (1 mg/kg) : P=0.2628; R347 (5 mg/kg) con respecto a PBS : P=0.6676. Fig. 6G Cam-003 (15 mg/kg - P=0.0028; 5 mg/kg -P=0.0028)] . Los resultados son representativos de cinco experimentos independientes.
Figuras 7A-7F: Los anticuerpos monoclonales anti-psl, Cam-003 y WapR-004 reducen la carga de órganos después de la inducción de neumonía aguda. Los ratones fueron tratados con anticuerpo Cam-003 24 horas antes de la infección con Fig. 7A PAOl (1.1 x 107 UFC) , Fig. 7B 33356 (1 x 107 UFC) , Fig. 7C 6294 (6.25 x 106 UFC) Fig. 7D 6077 (1 x 106 UFC) y anticuerpo WapR-004 24 horas antes de la infección con Fig. 7E 6294 (~1 x 107 UFC) y Fig. 7F 6206 (~1 x 106 UFC) . 24 horas postinfección, los animales se sacrificaron después de la cosecha de órganos para identificación de UFC viable. Las diferencias en UFC viable se determinaron mediante prueba U de Mann-Whitney para Cam-003 o WapR-004 con respecto a R347. Fig. 7A Pulmón: Cam-003 (45 mg/kg - P=0.0015; 15 mg/kg - P=0.0021; 5 mg/kg - P=0.0015) ; Bazo: Cam-003 (45 mg/kg - P=0.0120; 15 mg/kg - P=0.0367) ; Riñones : Cam-003 (45 mg/kg - P=0.0092; 15 mg/kg - P=0.0056) ; Fig. 7B Pulmón: Cam-003 (45 mg/kg -P=0.0010; 15 mg/kg - P<0.0001; 5 mg/kg - P=0.0045) ; Fig. 7C Pulmón: Cam-003 (45 mg/kg - P=0.0003; 15 mg/kg - P=0.0039; 5 mg/kg - P=0.0068); Bazo: Cam-003 (45 mg/kg - P=0.0057; 15 mg/kg - P=0.0230; 5 mg/kg - P=0.0012); Fig. 7D Pulmón: Cam-003 (45 mg/kg - P=0.0005; 15 mg/kg - P=0.0003; 5 mg/kg -P=0.0007); Bazo: Cam-003 (45 mg/kg - P=0.0015; 15 mg/kg -P=0.0089; 5 mg/kg - P=0.0089); Ríñones: Cam-003 (45 mg/kg -P=0.0191; 15 mg/kg - P=0.0355; 5 mg/kg - P=0.0021). Fig. 7E Pulmón: WapR-004 (15 mg/kg - P=0.0011; 5 mg/kg - P=0.0004; 1 mg/kg - P=0.0002); Bazo: WapR-004 (15 mg/kg - P<0.0001; 5 mg/kg - P=0.0014; 1 mg/kg - P<0.0001); Fig. 7F Pulmón: WapR-004 (15 mg/kg - P<0.0001; 5 mg/kg - P=0.0006; 1 mg/kg -P=0.0079); Bazo: WapR-004 (15 mg/kg - P=0.0059; 5 mg/kg -P=0.0261; 1 mg/kg - P=0.0047); Riñon: WapR-004 (15 mg/kg -P=0.0208; 5 mg/kg - P=0.0268.
Figuras 8A-8G: Los anticuerpos monoclonales anti-Psl Cam-003 y WapR-004 son activos en un modelo de queratitis de P. aeruginosa y un modelo de lesión térmica. Los ratones fueron tratados con un anticuerpo de IgGl testigo o Cam-003 a 45 mg/kg Figs . 8A, 8B o 15 mg/kg Figs. 8C, 8D o PBS o un anticuerpo de IgGl testigo o Cam-003 a 45 mg/kg o WapR-004 a 45 mg/kg o 15 mg/kg o 5 mg/kg Fig. 8F, 8G 24 horas antes de la infección con 6077 (011-citotóxico - 2 x 106 UFC) . Inmediatamente antes de la infección, se realizaron tres raspaduras de 1 mm en la córnea izquierda de cada animal y posteriormente se realizó una aplicación tópica de P. aeruginosa en un inoculo de 5 µ? . 24 horas después de la infección, se calcularon los puntajes de la patología de la córnea seguido de la extracción del ojo para determinar la UFC viable. Las diferencias en los puntajes de la patología y UFC viable se determinaron mediante prueba U de Mann-Whitney. Fig. 8A P=0.0001, Fig. 8B P<0.0001, Fig. 8C P=0.0003, Fig. 8D P=0.0015. Fig. 8F y Fig. 8G Cam-003 (45 mg/kg) con respecto a WapR-004 (45 mg/kg): P=0.018; Cam-003 (45 mg/kg) con respecto a WapR-004 (15 mg/kg): P=0.0025; WapR-004 (45 mg/kg) con respecto a WapR-004 (15 mg/kg): P=0.1331; WapR-004 (5 mg/kg) con respecto a testigo: P<0.0001. Los resultados son representativos de cinco experimentos independientes. Fig. 8E Análisis de supervivencia de ratones CF-1 tratados con Cam-003 y R347 en un modelo de lesión térmica de P. aeruginosa después de una inyección de 6077 (2 x 105 UFC) (clasificación logarítmica: R347 con respecto a Cam-003 15 mg/kg, P=0.0094; R347 con respecto a Cam-003 5 mg/kg, P=0.0017). Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes, (n) se refiere al número de animales en cada grupo .
Figuras 9A-9E: Un anticuerpo mutante Fe de Cam-003, Cam-003-??, ha disminuido la OPK y la eficacia in vivo pero mantiene la actividad anti-unión de células. Fig. 9A Ensayo de OPK de PA01. lux con Cam-003 y Cam-003-??, que alberga mutaciones en el dominio Fe que evita las interacciones de Fe con receptores de Fcy (Oganesyan, V., et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 64, 700-704 (2008)). Se utilizó R347 como testigo negativo. Los resultados son datos representativos de tres experimentos independientes. Fig. 9B Ensayo de unión de células PAOl con Cam-003 y Cam-003-??. Los resultados son datos representativos de dos experimentos independientes. Figs . 9C-9E Modelo de neumonía aguda que compara la eficacia de Cam-003 con respecto a Cam-003-??. Modelo de neumonía aguda de la cepa 6077 de P. aeruginosa que utiliza ratones BALB/c inoculados con Fig. 9C 1.22 x 106 Fig. 9D 2.35 x 105 o Fig. 9E 1.07 x 106 que compara la eficacia de Cam-003 con respecto a Cam-003-??. Los ratones fueron tratados con anticuerpo 24 horas antes del desafío. Figs. 9C-9E. Se utilizaron diez animales en cada grupo. Los resultados son datos representativos de dos experimentos independientes.
Figuras 10A-10B: Fig. 10A: Mapeo de epítopos e identificación de la afinidad de unión relativa para anticuerpos monoclonales anti-Psl. El mapeo de epítopos se realizó por ELISA de competición y se confirmó usando un ® sistema de flujo OCTET con Psl derivado del sobrenadante de un cultivo durante toda la noche de la cepa PAOl de P. aeruginosa. Las afinidades de unión relativas se midieron en un instrumento FORTEBIOs OCTET® 384. También se muestran concentraciones de anticuerpos donde la unión celular se inhibió al máximo y los valores de EL50 de OPK para cada anticuerpo. Fig. 10B. Afinidades de unión relativa de varios mutantes de WapR-004 tal como se midieron en un instrumento FORTEBIO® OCTETS 384. También se muestran los valores de EL50 de la OPK para los diversos mutantes.
Figuras 11A-11M: Evaluación de clones de mutantes de WapR-004 (W4) en el ensayo de OPK de P. aeruginosa Figs . 11A-11M) Ensayo de opsonofagocitosis con la cepa del serogrupo 05 de P. aeruginosa luminiscente (PAOl.lux), con diluciones de diferentes clones mutantes W4 en el formato de scFv-Fc. En algunas instancias, la IgGl de W4 se incluyó en el ensayo y se indica como W4-IgGl. W4-RAD-Cam y W4-RAD-GB representan la misma secuencia de apR-004RAD descrita en la presente. "W4-RAD" es una abreviación de apR-004RAD, y las designaciones 4-RAD-Cam y W4-RAD-GB en los paneles D a M representan dos preparaciones diferentes de WapR-004RAD. En todos los experimentos, se utilizó como testigo negativo R347, un anticuerpo monoclonal de IgGl humana que no se une a antígenos de P. aeruginosa.
Figura 12: Método de conjugación dirigida a sitio de Polimixina B (PMB) con mAb en los que el enlazante SM-PEG12 heterobifuncional (Pierce) se conjugó con una amina primaria sobre PMB en condiciones que se determinó favorecen la conjugación de un solo enlazante. Se determinó la eficiencia de la conjugación y los niveles de PMB libre de enlazante en las muestras mediante UPLC y espectrometría.
Figuras 13A-13B: Conjugados dirigidos a sitio de PMB- mAb. Usando el método de conjugación dirigida a sitio desarrollado, se conjugó PMB con variantes de mAb CAM-003 y A7 (testigo de hlgGl) con uno (SM, ND10) , dos (DM, ND10/19) o tres (TM, ND4/10/19) cisteínas diseñadas en la región Fe. Fig 13A: Residuos imitados de la región Fe de Cam-003 y A7. Fig. 13B: El número promedio de PMB en conjugados de PMB-mAb (mutante único (SM, por sus siglas en inglés) > mutante doble 1 (DM1, por sus siglas en inglés) > mutante doble 2 (DM2, por sus siglas en inglés) ) .
Figuras 14A-14B: Evaluación de conjugados de PMB-mAb que se unen a células PAOl de P. aeruginosa de tipo salvaje mediante análisis FACS . Fig. 14A: Cam-003 (Cam-003 -SM-PMB, Cam-003 -DM1-PMB, Cam-003-DM2-PMB, Cam-003 conjugado con testigo de tipo salvaje (Cam-003-Testigo-PMB) ) . Fig. 14B : conjugados testigo de A7 (A7-SM-PMB, A7-DM1-PMB , A7-DM2-PMB, A7 de tipo salvaje conjugado con testigo (A7 -Testigo-PMB) ) . Se utilizó R347 como testigo negativo en todos los experimentos .
Figuras 15A-15B: actividad de OPK de conjugados de PMB-mAb contra Fig. 15A: cepa de tipo salvaje de PAOl de P. aeruginosa y Fig. 15B: contra la cepa de P. aeruginosa pslA que no expresa el objetivo de Psl.
Figuras 16A-16B: Neutralización de LPS de P. aeruginosa por conjugados de PMB-mAb. Fig. 16A: conjugados de PMB-Cam-003 y Cam-003 de tipo salvaje conjugado con testigo y Fig. 16B: conjugados de PMB-A7 y A7 de tipo salvaje conjugado con testigo.
Figura 17: Estructura que muestra polimixina, un lipopéptido antibacteriano que neutraliza los efectos proinflamatorios de LPS y puede utilizarse para el tratamiento de infecciones MDR Gram-negativas (colistina/polimixina E) . Las polimixinas tienen 5 ácidos diamonbutíricos con carga negativa (con un círculo) que median las interacciones con Lípido A de carga negativa en LPS y neutralizan su actividad proinflamatoria .
Figuras 18A-18B: La actividad de OPK por la línea celular de neutrófilos HL-60 humana en presencia de complemento de conejo fue evaluada usando la cepa PA01 de P. aeruginosa que expresa luciferasa bacteriana. Fig. 18A: % de destrucción por Conjugados de CAM-003-PMB. Fig. 18B: % de destrucción por Conjugados de A7-PMB.
Figuras 19A-19B: Fig. 19A. Supervivencia porcentual de ratones C57B1/6 dosificados con 45 mg/kg de Conjugados de CAM-TM-PMB. Fig. 19B: Supervivencia porcentual de ratones C57B1/6 dosificados con 45 mg/kg de Conjugados de A7-TM-PMB.
Figuras 20A-20B: Fig. 20A. Supervivencia porcentual de ratones C57B1/6 dosificados con 45 mg/kg, 15 mg/kg y 5 mg/kg de Conjugados de CAM-TM-PMB. Fig. 20B: Supervivencia porcentual de ratones C57B1/6 dosificados con 45 mg/kg, 15 mg/kg y 5 mg/kg de Conjugados de A7-TM-PMB.
Figuras 21A-21C: Supervivencia porcentual de ratones C57B1/6 dosificados con conjugados de mAb o PMB-mAb i.p Fig. 21A: 10 mg/kg. Fig. 2IB: 1 mg/kg. Fig. 21C: 0.1 mg/kg.
Descripción Detallada de la Invención I. DEFINICIONES Cabe señalar que el término "una" entidad se refiere a una o más de la entidad; por ejemplo, "una molécula de unión que se une específicamente a Psl de Pseudomonas" se entiende que representa una o más moléculas de unión que se unen específicamente a Psl de Pseudomonas. De esta forma, los términos "uno, "una", "uno/a o más" y "al menos uno/a" pueden utilizarse indistintamente en la presente.
Tal como se utiliza en la presente, el término "polipéptido" comprende un "polipéptido" al igual que el plural "polipéptidos " , y se refiere a una molécula compuesta por monómeros (aminoácidos) enlazados de forma lineal por enlaces de amida (también conocidos como enlaces peptídicos) . El término "polipéptidos" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. De esta forma, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos , "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término utilizado para hacer referencia a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, se incluyen en la definición de "polipéptido" y puede utilizarse el término "polipéptido" en su lugar o de forma indistinta. El término "polipéptido" también se refiere a los productos de las modificaciones post-expresión del polipéptido que incluyen, a modo no taxativo, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/de bloqueo, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos no naturales. Un polipéptido puede derivar de una fuente biológica natural o producirse mediante tecnología recombinante , pero no necesariamente se traduce de una secuencia de ácidos nucleicos designada. Puede generarse de cualquier manera, incluida por síntesis química.
Un polipéptido, tal como se describe en la presente, puede tener un tamaño de aproximadamente 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1,000 o más o 2,000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional, aunque no necesariamente tienen la estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se denominan plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, sino que pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, se denominan no plegados. Tal como se utiliza en la presente, el término glicoproteína se refiere a una proteína acoplada a al menos un resto de carbohidratos que está unido a una proteína por medio de una cadena lateral que contiene oxígeno o nitrógeno de un residuo aminoácido, por ejemplo, un residuo de serina o un residuo de asparagina.
Por polipéptido "aislado" o un fragmento, variante o derivado del mismo se entiende un polipéptido que no está en su medio natural. No es necesario un nivel de purificación particular. Por ejemplo, puede retirarse un polipéptido aislado de su medio nativo o natural. Los polipéptidos producidos recombinantemente y las proteínas expresadas en células hospederases se consideran aisladas tal como se describen en la presente, dado que son polipéptidos nativos o recombinantes que se han separado, fraccionado o purificado considerablemente por medio de una técnica adecuada.
Otros polipéptidos descritos en la presente son fragmentos, derivados, análogos o variantes de los polipéptidos anteriores, y cualquier combinación de ellos. Los términos "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo" cuando se refieren a una molécula de unión tal como un anticuerpo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas tal como se describe en la presente incluyen cualquier polipéptido que retiene al menos parte de las proteínas de unión del anticuerpo nativo o polipéptido correspondiente. Los fragmentos de polipéptidos incluyen, por ejemplo, fragmentos proteolíticos , así como fragmentos de eliminación, además de fragmentos de anticuerpos específicos, descritos en otras partes en la presente. Las variantes de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas tal como se describe en la presente, incluyen fragmentos tales como los que se describieron anteriormente, y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos. Las variantes pueden ser naturales o no. Las variantes no naturales pueden producirse usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Las variantes de polipéptidos pueden comprender sustituciones conservadoras o no conservadoras, eliminaciones o adiciones de aminoácidos. Los derivados de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas, tal como se describe en la presente, son polipéptidos que se han alterado para exhibir características adicionales que no se encuentran en el polipéptido nativo. Ejemplos incluyen proteínas de fusión. Los polipéptidos también pueden denominarse en la presente "análogos de polipéptidos". Tal como se utiliza en la presente, un "derivado" de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas se refiere a un polipéptido objetivo que tiene uno o más residuos químicamente derivados por reacción de un grupo lateral funcional. También se incluyen como "derivados" los polipéptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos naturales de veinte aminoácidos estándar. Por ejemplo, la 4-hidroxiprolina puede ser sustituida por prolina; la 5- hidroxilisina puede ser sustituida por lisina; la 3-metilhistidina puede ser sustituida por histidina; la homoserina puede ser sustituida por serina y la ornitina puede ser sustituida por lisina.
Se pretende que el término "polinucleótido" abarque un ácido nucleico singular, así como ácidos nucleicos plurales, y se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada o constructo, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (ADNp) . Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace de amida, tal como se encuentra en ácidos nucleicos peptídicos (A P) ) . La expresión "ácido nucleico" se refiere a cualquiera o uno o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido. Ácido nucleico "aislado" o polinucleótido significa una molécula de ácidos nucleicos, ADN o ARN, que se ha retirado de su medio nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas contenido en un vector se considera aislado tal como se describe en la presente. Ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospederases heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o básicamente) en una solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcriptos de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos . Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados incluyen además las moléculas producidas sintéticamente. Adicionalmente, un polinucleótido o ácido nucleico aislado puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de unión de ribosomas o un terminador de la transcripción.
Tal como se utiliza en la presente, una "región codificadora" es una porción de ácido nucleico que consiste en codones traducidos a aminoácidos. A pesar de que un "codón de finalización" (TAG, TGA o TAA) no se traduce a un aminoácido, puede considerarse que es parte de una región de codificación, pero ninguna región de flanqueo, por ejemplo, promotores, sitios de unión de ribosomas, terminadores transcripcionales , intrones y similares es parte de una región de codificación. Dos o más regiones de codificación pueden estar presentes en un solo constructo de polinucleótidos, por ejemplo, en un vector único o en constructos de polinucleótidos separados, por ejemplo, en vectores separados (diferentes) . Asimismo, cualquier vector puede contener una sola región o puede comprender dos o más regiones de codificación, por ejemplo, un solo vector puede codificar por separado una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina. Adicionalmente, un vector, polinucleótido o ácido nucleico puede codificar regiones de codificación heterólogas, ya sea fusionadas o no fusionadas a un ácido nucleico que codifica una molécula de unión que se une específicamente a Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de antígeno, variante o derivado del mismo. Regiones de codificación heterólogas incluyen, a modo no taxativo, elementos especializados de motivos, tales como un péptido de señal secretora o un dominio funcional heterólogo.
En ciertas modalidades, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso del ADN, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido normalmente puede incluir un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o traducción operativamente asociados con una o más regiones de codificación. Una asociación operable se da cuando una región de codificación para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de forma tal que se coloca la expresión del producto génico bajo la influencia o el control de secuencias reguladoras. Dos fragmentos de ADN (tal como una región de codificación de polipéptidos y un promotor asociado con la misma) están "operativamente asociados" si la inducción de la función del promotor resulta en la transcripción de ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza del enlace entre los fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de expresión de dirigir la expresión del producto génico ni interfiere con la capacidad de la plantilla de ADN de transcribirse. De esta forma, una región promotora estaría operativamente asociada con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción del ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirige una transcripción importante del ADN sólo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo, potenciadores , operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pueden estar operativamente asociados con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de células. Promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción se describen en la presente.
Los expertos en la técnica conocen una variedad de regiones de control de la transcripción. Estas incluyen, a modo no taxativo, regiones de control de la transcripción que funcionan en células vertebradas, tales como, a modo no taxativo, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, junto con el intrón A) , virus del simio 40 (el promotor temprano) y retrovirus (tales como el virus del sarcoma de Rous) . Otras regiones de control de la transcripción incluyen aquellas derivadas de genes vertebrados tales como actina, proteína de shock de calor, hormona del crecimiento bovina y ß-globina de conejo, así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido, así como promotores inducibles por linfocina (por ejemplo, promotores inducibles por interferones o interleuquinas) .
De manera similar, los expertos en la técnica conocen una variedad de elementos de control de la traducción. Estos incluyen, a modo no taxativo, sitios de unión de ribosomas, codones de iniciación y terminación de la traducción y elementos derivados de picornavirus (particularmente un sitio de entrada de ribosomas interno, o IRES, al que también se lo denomina secuencia de CITE) .
En otras modalidades, un polinucleótido puede ser ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm) .
Las regiones de codificación de polinucleótidos y ácidos nucleicos pueden asociarse con regiones de codificación adicionales que codifican péptidos secretores o de señal que dirigen la secreción de un polipéptido tal como se describe en la presente, por ejemplo, un polinucleótido que codifica una molécula de unión que se une específicamente a Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos, variante o derivado del mismo. De acuerdo con la hipótesis de la señal, las proteínas secretadas por células de mamífero tienen una secuencia líder peptídica o secretora de señal que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena proteica en crecimiento a través del retículo endoplasmático rugoso. Los expertos en la técnica saben que los polipéptidos secretados por las células de los vertebrados generalmente tienen un péptido señal fusionado con el extremo N-terminal del polipéptido, que se escinde del polipéptido completo o de "longitud completa" para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En ciertas modalidades, se utiliza el péptido señal nativo, por ejemplo, una inmunoglobulina de cadena pesada o un péptido señal de cadena liviana, o un derivado funcional de la secuencia que retiene la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que está operativamente asociado con la misma. Alternativamente, puede utilizarse un péptido señal de mamífero o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder de tipo salvaje puede sustituirse por la secuencia líder del activador de plasminógeno de tejido humano (TPA, por sus siglas en inglés) o ß-glucuronidasa de ratón.
Se describen en la presente ciertas moléculas de unión, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos. A menos que se haga referencia específicamente a anticuerpos de tamaño completo tales como los anticuerpos naturales, la expresión "molécula de unión" comprende anticuerpos de tamaño completo, así como fragmentos de unión a antígenos, variantes, análogos o derivados de los anticuerpos, por ejemplo, moléculas de anticuerpos o inmunoglobulina naturales o moléculas de anticuerpos diseñadas o fragmentos que unen el antígeno de manera similar a las moléculas de anticuerpos.
Tal como se utiliza en la presente, la expresión "molécula de unión" se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a un determinante antigénico. Un ejemplo no taxativo de una molécula de unión a antígenos es un anticuerpo o fragmento del mismo que retiene la unión específica a antígenos.
Las expresiones "anticuerpo" e "inmunoglobulina" pueden utilizarse indistintamente en la presente. Un anticuerpo (o un fragmento, variante o derivado del mismo, tal como se describe en la presente) comprende al menos el dominio variable de una cadena pesada y al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena liviana. Las estructuras de inmunoglobulina básicas en los sistemas de los vertebrados se comprenden relativamente bien. Ver, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies : A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988) .
Como se describirá en más detalle a continuación, la expresión "inmunoglobulina" comprende varias clases amplias de polipéptidos que pueden distinguirse bioquímicamente. Los expertos en la técnica apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon (?, µ, a, d, e) con algunas subclases entre éstas (por ejemplo, ??-?4) . Es la naturaleza de esta cadena la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgG o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulina (isotipos) , por ejemplo, IgGx, IgG2, lgG3, lgG4, IgAi, etc., están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles para los expertos en la técnica en vistas de la presente descripción y, por consiguiente, están dentro del alcance de esta descripción.
Las cadenas ligeras se clasifican en kappa o lambda (?, ?) . Cada clase de cadena pesada puede unirse con una cadena liviana kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas se unen covalentemente entre sí, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas se unen entre sí mediante enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan ya sea mediante hibridomas, células B o células hospederases diseñadas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos, van desde el extremo N-terminal en los extremos bifurcados de la configuración en Y al extremo C-terminal al final de cada cadena.
Tanto las cadenas ligeras como las pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional . Los términos "constante" y "variable" se utilizan funcionalmente . En este sentido, se apreciará que los dominios variables de las porciones de cadena liviana (VL) y pesada (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad de los antígenos. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena liviana (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas importantes, tales como secreción, movilidad transplacental , unión del receptor Fe, unión del complemento y similares. Por convención, la numeración de los dominios de región constante aumenta a medida que se vuelven más distantes del sitio de unión a antígenos o el extremo terminal amino del anticuerpo. La porción del extremo N-terminal es una región variable y en la porción del extremo C-terminal es una región constante; los dominios de CH3 y CL en realidad comprenden el extremo C-terminalarboxi de la cadena pesada y liviana, respectivamente.
Tal como se indicó anteriormente, la región variable permite que la molécula de unión reconozca selectivamente y se una específicamente a epítopos en antígenos. Es decir, el dominio VL y el dominio VH, o el subconjunto de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) , de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, se combinan para formar la región variable que define un sitio de unión a antígenos tridimensional. Esta estructura de moléculas de unión cuaternaria forma el sitio de unión a antígenos presente al final de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión a antígenos es definido por tres CDR en cada una de las cadenas VH y VL.
En anticuerpos naturales, las seis "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR" presentes en cada uno de los dominios de unión a antígenos son secuencias cortas no contiguas de aminoácidos que se posicionan específicamente para formar el dominio de unión a antígenos a medida que el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un medio acuoso. El resto de los aminoácidos en los dominios de unión a antígenos, a los que se hace referencia como regiones de "marco", muestran menos variabilidad intermolecular. Las regiones marco adoptan en gran medida una conformación de lámina ß y las CDR forman bucles que se conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina ß. De esta forma, las regiones marco actúan para forman un andamio que proporciona el posicionamiento de las CDR en la orientación correcta mediante interacciones intercadenas, no covalentes . El dominio de unión a antígenos formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo del antígeno inmunorreactivo . Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo a su epítopo cognado. Los expertos en la técnica pueden identificar fácilmente los aminoácidos que comprenden las CDR y las regiones marco, respectivamente, para cualquier región variable de cadena pesada o liviana, dado que han sido definidos con precisión (ver "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); y Chothia y Lesk, J. Mol. Biol . , 196:901-917 (1987), que se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad) .
En el caso que haya dos o más definiciones de un término que se utiliza y/o se acepta en la técnica, la definición del término tal como se utiliza en la presente incluirá todos los demás significados a menos que se especifique explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es el uso de la expresión "región determinante de la complementariedad" ("CDR") para describir los sitios de combinación de antígenos no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de polipéptidos de cadena pesada y liviana. Esta región particular ha sido descrita por Kabat et al., U.S. Dept . of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia et al., J". Mol. Biol. 196:901-917 (1987), que se incorporan a la presente a modo de referencia, donde las definiciones incluyen la superposición o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. No obstante, la aplicación de cualquiera de las definiciones para hacer referencia a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo debe estar dentro del alcance de la expresión tal como se define y utiliza en la misma. Los residuos de aminoácidos apropiados que comprenden las CDR tal como son definidas por cada una de las referencias citadas anteriormente se establecen a continuación en la Tabla I como comparación. Los números exactos de residuos que comprenden una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y el tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de manera rutinaria qué residuos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo TABLA 1: Definiciones de CDR1 xLa numeración de todas las definiciones de CDR en la Tabla 1 sigue las convenciones de numeración que se establecen en Kabat et al. (ver a continuación) .
Kabat et al. también definieron un sistema de numeración para las secuencias de dominio variable que son aplicables a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar de manera no ambigua este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin basarse en ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. Tal como se utiliza en la presente, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración establecido por Kabat et al., U.S. Dept . of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983) . A menos que se especifique lo contrario, las referencias a la numeración de posiciones de residuos de aminoácidos específicas en una molécula de unión que se une específicamente a Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos, variante o derivado del mismo tal como se describe en la presente, están de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.
Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos incluyen, a modo no taxativo, anticuerpos policlonales , monoclonales , humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena simple, fragmentos de unión a epítopos, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs , Fvs de una sola cadena (scFv) , anticuerpos de una sola cadena, Fvs enlazados a disulfuro (sdFv) , fragmentos que comprenden el dominio VL o VH, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab. Las moléculas de ScFv se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos 5,892,019. Las moléculas de inmunoglobulina o anticuerpos comprendidos por esta descripción pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , clase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 , IgG , IgAl e IgA2) o subclase de molécula de inmunog1obulina.
"Se une específicamente" generalmente significa que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo se une a un epítopo por medio de su dominio de unión a antígenos, y que la unión supone complementariedad entre el dominio de unión a antígenos y el epítopo. De acuerdo con esta definición, se dice que una molécula de unión "se une específicamente" a un epítopo cuando se une al epítopo por medio de su dominio de unión a antígenos más fácilmente que si se uniera a un epítopo no relacionado aleatorio. La expresión "especificidad" se utiliza en la presente para calificar la afinidad relativa por la que cierta molécula de unión se une a cierto epítopo. Por ejemplo, puede considerarse que la molécula de unión "A" tiene más especificidad para un epítopo dado que la molécula de unión "B" o la molécula de unión "A" puede decirse que se une al epítopo "C" con mayor especificidad que la que tiene para un epítopo relacionado "D" .
"Se une preferiblemente" significa que el anticuerpo se une específicamente a un epítopo más fácilmente que si se uniera a un epítopo relacionado, similar, homólogo o análogo. De esta forma, un anticuerpo que "se une preferiblemente" a un epítopo dado se uniría más probablemente al epítopo que a un epítopo relacionado, aunque el anticuerpo puede reaccionar de forma cruzada con el epítopo relacionado.
A modo de ejemplo no taxativo, puede considerarse que una molécula de unión, por ejemplo un anticuerpo, se une a un primer epítopo preferiblemente si se une al primer epítopo con una constante de disociación (KD) que es menor que la KD del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no taxativo, puede considerarse que una molécula de unión, tal como un anticuerpo, se une a un primer antígeno preferiblemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es de al menos un orden de magnitud menos que la KD del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no taxativo, una molécula de unión puede considerarse que se une a un primer epítopo preferiblemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es de al menos dos órdenes de magnitud menos que la KD del anticuerpo para el segundo epítopo.
En otro ejemplo no taxativo, puede considerarse que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo se une a un primer epítopo preferiblemente si se une al primer epítopo con una tasa de desactivación (k(desact.)) que es menor que la k(desact.) del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no taxativo, puede considerarse que una molécula de unión se une a un primer epítopo preferiblemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es de al menos un orden de magnitud menos que la k(disoc) del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no taxativo, puede considerarse que una molécula de unión se une a un primer epítopo preferiblemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es de al menos dos órdenes de magnitud menos que la k(disoc) del anticuerpo para el segundo epítopo.
Puede decirse que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo descritos en la presente, se une a un antígeno objetivo, por ejemplo, un polisacárido descrito en la presente o un fragmento o variante del mismo con una tasa de desactivación (k(desact.)) menor o igual a 5 X 10"2 seg"1, 10"2 seg"1, 5 X 10" 3 seg"1 o 10"3 seg"1. Puede decirse que una molécula de unión tal como se describe en la presente se une a un antígeno objetivo, por ejemplo, un polisacárido con una tasa de desactivación (k(desact.)) menor o igual a 5 X 10"4 seg"1, 10"4 seg"1, 5 X 10"5 seg"1, o 10"5 seg"1 5 X 10"6 seg"1, 10"6 seg"1, 5 X 10"7 seg"1 o 10"7 seg"1.
Puede decirse que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos, variante o derivado descrito en la presente se une a un antígeno objetivo, por ejemplo, un polisacárido con una tasa de activación (k(activ.)) mayor o igual a 103 NT1 seg"1, 5 X 103 M" 1 seg"1, 104 M"1 seg"1 o 5 X 104 M"1 seg"1. Puede decirse que una molécula de unión tal como se describe en la presente se une a un antígeno objetivo, por ejemplo, un polisacárido con una tasa de activación (k(act.)) mayor o igual a 105 M"1 seg"1, 5 X 105 M"1 seg"1, 106 M"1 seg"1 o 5 X 106 M"1 seg"1 o 107 M"1 seg"1.
Se dice que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de referencia o fragmento de unión a antígenos a un epítopo dado si se une preferiblemente al epítopo en la medida que bloquea, en cierta medida, la unión del anticuerpo de referencia o fragmento de unión a antígenos al epítopo. La inhibición competitiva puede determinarse por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos ELISA de competición. Puede decirse que una molécula de unión inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia o el fragmento de unión a antígenos a un. epítopo dado al menos 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60%, o al menos 50%.
Tal como se utiliza en la presente, la expresión "afinidad" se refiere a una medida de la resistencia de la unión de un epítopo individual con la CDR de una molécula de inmunoglobulina . Ver, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies : A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) en las páginas 27-28. Tal como se utiliza en la presente, la expresión "avidez" se refiere a la estabilidad general del complejo entre una población de inmunoglobulinas y un antígeno, es decir, la resistencia de la combinación funcional de una mezcla de inmunoglobulina con el antígeno. Ver, por^ ejemplo, Harlow en las páginas 29-34. La avidez se relaciona con la afinidad de las moléculas de inmunoglobulina individuales en la población con epítopos específicos, y también las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un antígeno con una estructura de epítopo altamente repetitiva, tal como un polímero, sería de avidez alta .
Las moléculas de unión o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos t l como se describe en la presente también pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. Tal como se utiliza en la presente, la expresión "reactividad cruzada" se refiere a la capacidad de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, específica para un antígeno, de reaccionar con un segundo antígeno; una medida de relación entre dos sustancias antigénicas diferentes. De esta forma, una molécula de unión reacciona de forma cruzada si se une a un epítopo que no sea el que indujo su formación. El epítopo reactivo cruzado generalmente contiene muchas de las mismas características estructurales complementarias que el epítopo de inducción, y en algunos casos, puede ajustarse mejor que el original.
Una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo también puede describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a un antígeno. Por ejemplo, una molécula de unión puede unirse a un antígeno con una constante de disociación o KD no mayor que 5 X 10"2 M, 10~2 M, 5 x 1CT3 M, 10"3 M, 5 X 1CT4 M, 10"4 M, 5 x 1CT5 M, 10"5 M, 5 x 10"6 M, 10"6 M, 5 x 10"7 M, 10"7 M, 5 x 10"8 M, 10~8 M, 5 x 1CT9 M, 10"9 M, 5 x ÍCT10 M, 10"10 M, 5 x 10"11 M, 10"U M, 5 x 10"12 M, 10"12 M, 5 x 10~13 M, 10"13 M, 5 x 10"14 M, 10" 14 M, 5 x 10"15 M o 10"15 M .
Los fragmentos de anticuerpos que incluyen anticuerpos de una sola cadena pueden comprender las regiones variables solas o en combinación con la totalidad o una porción de lo siguiente: región bisagra, dominio CH1, dominio CH2 y dominio CH3. También se incluye fragmentos de unión a antígenos que comprenden también cualquier combinación de regiones variables con una región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos descritos en la presente pueden ser de cualquier origen animal, incluidas aves y mamíferos. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanos, de murino, burro, conejo, cabra, cobayo, camello, llama, caballo o pollo. En otra modalidad, la región variable puede originarse de condrictios (por ejemplo, de tiburones) . Tal como se utiliza en la presente, anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, tal como se describió anteriormente y, por ejemplo en la Pat . de los Estados Unidos No. 5,939,598 de Kucherlapati et al.
Tal como se utiliza en la presente, la expresión "porción de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de inmunoglobulina. Una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo que comprende una porción de cadena pesada comprende al menos uno de: un dominio CH1, un dominio una bisagra (por ejemplo, región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio de CH2 , un dominio de CH3 o una variante o fragmento del mismo. Por ejemplo, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo puede comprender una cadena de polipéptido que comprende un dominio CH1 ; una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1 , al menos una porción de un dominio bisagra y un dominio bisagra CH2 ; una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1 y un dominio CH3 ; una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio de bisagra y un dominio CH3 , o una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En otra modalidad, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo comprende una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH3. Asimismo, una molécula de unión para utilizar en la descripción puede carecer de al menos una porción de un dominio CH2 (por ejemplo, todo o parte de un dominio CH2) . Tal como se indicó anteriormente, un experto en la técnica entenderá que estos dominios (por ejemplo, las porciones de cadena pesada) pueden modificarse de forma tal que varían en la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina natural.
Las porciones de cadena pesada de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo tal como se describe en la presente pueden derivar de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una porción de la cadena pesada de un polipéptido puede comprender un dominio CH1 derivado de una molécula de IgGl y una región de bisagra derivada de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de la cadena pesada puede comprender una región de bisagra derivada, en parte, de una molécula de IgGl y, en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de la cadena pesada puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgGl y, en parte, de una molécula de IgG4.
Tal como se utiliza en la presente, la expresión "porción de cadena liviana" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena liviana de inmunoglobulina . La porción de cadena liviana comprende al menos uno de un dominio VL o CL.
Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente pueden describirse o especificarse en términos del epítopo o porción de un antigeno, por ejemplo, un polisacárido objetivo que reconocen o se une específicamente. La porción de un polisacárido objetivo que interactúa específicamente con el dominio de unión a antígenos de un anticuerpo es un "epítopo" o un "determinante antigénico" . Un antígeno objetivo, por ejemplo, un polisacárido puede comprender un solo epítopo, pero normalmente comprende al menos dos epítopos y puede incluir cualquier número de epítopos dependiendo del tamaño, conformación y tipo de antígeno.
Tal como se indicó anteriormente, las estructuras subunitarias y la configuración tridimensional de las regiones constantes de las varias clases de inmunoglobulina se conocen bien. Tal como se utiliza en la presente, la expresión "dominio de VH" incluye el dominio variable terminal amino de una cadena pesada de inmunoglobulina y la expresión "dominio de CH1" incluye el primer dominio de la región constante (la mayor parte amino terminal) de una cadena pesada. El dominio CH1 es adyacente al dominio VH y es de terminal amino a la región de bisagra de una molécula de cadena pesada de inmunoglobulina .
Tal como se utiliza en la presente, la expresión "dominio CH2" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que se extiende, por ejemplo, de aproximadamente el residuo 244 al residuo 360 de un anticuerpo usando los esquemas de numeración convencionales (residuos 244 a 360, sistema de numeración de Kabat ; y los residuos 231-340, sistema de numeración de la UE; ver Kabat EA et al. op . cit. El dominio CH2 es único ya que no está íntimamente apareado con otro dominio. Por el contrario, dos cadenas de carbohidrato ramificadas N-ligadas están interpuestas entre los dos dominios CH2 de una molécula IgG nativa intacta. También está bien documentado que el dominio CH3 se extiende del dominio CH2 al extremo C-terminal de la molécula de IgG y comprende aproximadamente 108 residuos.
Tal como utiliza en la presente, la expresión "región de bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 con el dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, permitiendo así que las dos regiones de unión a antígenos de extremo N-terminales se muevan con independencia. Las regiones de bisagra pueden subdividirse en tres dominios distintos: dominios de bisagra superior, medio e inferior (Roux et al., J. Immunol . 151:4083 (1998)).
Tal como se utiliza en la presente, la expresión "enlace disulfuro" incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. La cisteína de aminoácidos comprende un grupo tiol que puede formar un enlace · o puente disulfuro con un segundo grupo tiol . En la mayoría de las moléculas de IgG naturales, las regiones de CH1 y CL están ligadas por un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas están ligadas por dos enlaces disulfuro en las posiciones que corresponden a 239 y 242 usando el sistema de numeración de Kabat (posición 226 o 229, sistema de numeración de la UE) .
Tal como se utiliza en la presente, la expresión "anticuerpo quimérico" significará cualquier anticuerpo en donde la región inmunorreactiva o sito inmunorreactivo se obtiene o deriva de una primera especie y la región constante (que puede estar intacta, parcial o modificada) se obtiene de una segunda especie. En algunas modalidades, la región o sitio de unión objetivo será de una fuente no humana (por ejemplo, ratón o primate) y la región constante es humana.
Tal como se utiliza en la presente, la expresión "anticuerpo diseñado" se refiere a un anticuerpo en el que el dominio variable en la cadena pesada y liviana o ambas es alterado por al menos un reemplazo parcial de una o más CDR de un anticuerpo de especificidad conocida y, en caso que sea necesario, mediante un reemplazo parcial de la región marco y un cambio de secuencia. A pesar de que las CDR pueden derivar de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase que el anticuerpo del cual derivan las regiones marco, se prevé que las CDR derivarán de un anticuerpo de clase diferente y preferiblemente de un anticuerpo de una especie diferente. Un anticuerpo diseñado en el que una o más CDR donantes de un anticuerpo no humano de especificidad conocida se injerta con una región marco de cadena pesada o liviana se denomina en la presente "anticuerpo humanizado." Puede no ser necesario reemplazar todas las CDR con las CDR completas de la región variable del donante para transferir la capacidad de unión a antígenos de un dominio variable a otro. Por el contrario, puede ser necesario sólo transferir aquellos residuos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de unión objetivo. Dadas las explicaciones que se indican en, por ejemplo, las Pat . de los EE.UU. Nos. 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762 y 6,180,370, estará dentro de la competencia de los expertos en la técnica, ya sea llevando a cabo experimentos de rutina o mediante pruebas de ensayo y error, obtener un anticuerpo diseñado o humanizado funcional.
Tal como se utiliza en la presente la expresión "polipéptido debidamente plegado" incluye polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos anti-Psl de Pseudomonas) en los que todos los dominios funcionales que comprenden el polipéptido son distintivamente activos. Tal como se utiliza en la presente, la expresión "polipéptido indebidamente plegado" incluye polipéptidos en los que al menos uno de los dominios funcionales del polipéptido no es activo. En una modalidad, un polipéptido debidamente plegado comprende cadenas de polipéptidos ligadas por al menos un enlace disulfuro y, por el contrario, un polipéptido indebidamente plegado comprende cadenas de polipéptidos no ligadas por al menos un enlace disulfuro.
Tal como se utiliza en la presente, la expresión "diseñado" incluye manipulación de las moléculas de ácido nucleico o polipéptido por medios sintéticos (por ejemplo, por medio de técnicas recombinantes , síntesis peptídicas in vi tro, por medio de acoplamiento químico de péptidos o una combinación de estas técnicas) .
Tal como se utiliza en la presente, los términos "ligado", "fusionado" o "fusión" se utilizan indistintamente. Estos términos se refieren a unir dos o más elementos o componentes, por cualquier medio incluida conjugación química o medios recombinantes. Una "fusión en marco" se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abierta (ORF, por sus siglas en inglés) de polinucleótidos para formar un ORF más largo continuo, de manera que mantenga el marco de lectura translacional correcto de los ORF originales. De esta forma, una proteína de fusión recombinante es una sola proteína que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los ORF originales (cuyos segmentos normalmente no se unen en naturaleza) . A pesar de que el marco de lectura se hace continuo de este modo a lo largo de todos los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar física o espacialmente separados por, por ejemplo, una secuencia enlazante marco. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican las CDR de una región variable de inmunoglobulina pueden fusionarse, en marco, pero estar separados por un polinucleótido que codifica al menos una región marco de inmunoglobulina o regiones de CDR adicionales, siempre que las CDR "fusionadas" sean cotraducidas como parte de un polipéptido continuo.
En el contexto de los polipéptidos, una "secuencia lineal" o una "secuencia" está en el orden de los aminoácidos en un polipéptido en una dirección de extremo amino a carboxilo en la que los residuos vecinos entre sí en la secuencia son contiguos en la estructura primaria del polipéptido.
El término "expresión" tal como se utiliza en la presente se refiere a un proceso por el cual un gen produce un producto bioquímico, por ejemplo, un polipéptido. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula, incluida, a modo no taxativo, la desactivación génica así como la expresión transitoria y la expresión estable. Incluye, a modo no taxativo, la transcripción del gen a ARN mensajero (AR m) y la traducción de ARNm a polipéptido (s) . Si el producto final deseado es un producto bioquímico, la expresión incluye la creación del producto bioquímico y cualquier precursor. La expresión de un gen produce un "producto génico" . Tal como se utiliza en la presente, un producto génico puede ser un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido por la transcripción de un, o un polipéptido que se traduce de un transcripto. Los productos génicos descritos en la presente incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones post-transcripcionales , por ejemplo, poliadenilación o polipéptidos con modificaciones de traducción, por ejemplo, metilación, glicosilación, la adición de lípidos, la asociación con otras subunidades de proteínas, escisión proteolítica y similares.
Tal como se utilizan en la presente, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren al tratamiento terapéutico y las medidas profilácticas o preventivas, en donde el fin es prevenir o detener (disminuir) un cambio fisiológico, infección o trastorno. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, a modo no taxativo, alivio de los síntomas, reducción del alcance de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, que no empeora) de la enfermedad, eliminación o reducción de un agente infeccioso tal como P. aeruginosa en un sujeto, un retraso o ralentización del avance de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable . "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se está recibiendo tratamiento. Quienes necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen la infección, afección o trastorno así como aquellos propensos a tener la afección o trastorno o aquellos en los que la afección o trastorno debe prevenirse, por ejemplo, en pacientes con quemaduras o pacientes inmunosuprimidos susceptibles a infección con P. aeruginosa .
"Sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero" significa cualquier sujeto particularmente un sujeto mamífero, para quien se desea el diagnóstico, pronóstico o terapia. Los sujetos mamíferos incluyen humanos, animales domésticos, animales de granja y animales de zoológico, deportes o mascotas tales como perros, gatos, cobayos, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas, osos, etc.
Tal como se utilizan en la presente, frases tales como "un sujeto que se beneficiaría de la administración de un anticuerpo anti-Psl de Pseudomonas" y "un animal que necesita tratamiento" incluyen sujetos, tales como sujetos mamíferos, que se beneficiarían de la administración de un anticuerpo anti-Psl de Pseudo onas usado, por ejemplo, para detección de Psl de Pseudomonas (por ejemplo, para un procedimiento de diagnóstico) y/o del tratamiento, es decir, paliación o prevención de una enfermedad, con un anticuerpo anti-Psl de Pseudomonas. Tal como se describe en más detalle en la presente, el anticuerpo anti-Psl de Pseudomonas puede utilizarse en una forma no conjugada o puede conjugarse, por ejemplo, con un fármaco, profármaco o un isótopo.
II . MOLÉCULAS DE UNIÓN Una modalidad está dirigida a una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas, en donde la molécula de unión (a) puede inhibir la unión de Pseudomonas aeruginosa a células epiteliales, (b) puede promover, mediar la destrucción opsonof gocítica (OPK) de P. aeruginosa, o (c) puede inhibir la unión de P. aeruginosa a las células epiteliales y puede promover, mediar o mejorar la OPK de P. aeruginosa . En ciertas modalidades, la molécula de unión o fragmento de la misma tal como se describió anteriormente puede ser un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo tal como Cam-003 o WapR-004.
Tal como se utiliza en la presente, la expresión "dominio de unión a antígenos" incluye un sitio que se une específicamente a un epítopo o antígeno (por ejemplo, un epítopo de Psl de Pseudomonas) . El dominio de unión a antígenos de un anticuerpo normalmente incluye al menos una porción de una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y al menos una porción de una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina. El sitio de unión formado por estas regiones variables determina la especificidad del anticuerpo.
La descripción está dirigida más específicamente a una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de Psl de Pseudomonas como un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena liviana (VL) de WapR-004, Cam-003, Cam-004 o Cam-005.
Se incluye además una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas e inhibe de forma competitiva la unión de Psl de Pseudomonas mediante un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende las VH y VL de WapR-004, Cam-003, Cam-004 o Cam-005.
Una modalidad está dirigida a una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de Psl de Pseudomonas que un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende las regiones VH y VL de WapR-001, WapR-002 o WapR-003.
También se incluye una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas e inhibe de forma competitiva la unión de Psl de Pseudomonas mediante un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende las VH y VL de WapR-001, WapR-002 o WapR-003.
Se incluye además una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas e inhibe de forma competitiva la unión de Psl de Pseudomonas mediante un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende las VH y VL de WapR-016.
También se incluye una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas e inhibe de forma competitiva la unión de Psl de Pseudomonas mediante un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende las VH y VL de WapR16.
Los métodos de modalidad de anticuerpos se conocen bien en la técnica y se describen en la presente. Una vez que se han producido los anticuerpos para varios fragmentos de Psl de Pseudomonas o para Psl de Pseudomonas de longitud completa sin la secuencia de señal, determinar qué aminoácidos, o epítopo, de Psl de Pseudomonas al que el anticuerpo o fragmento de unión a antígenos se une puede determinarse mediante protocolos de mapeo de epítopos tal como se describe en la présente, así como mediante métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, ELISA de intercalación de doble anticuerpo tal como se describe en "Chapter 11 -Immunology, " Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel et al., v.2, John iley & Sons, Inc. (1996)). Protocolos de mapeo de epítopos adicionales pueden encontrarse en Morris, G. Epitope Mapping Protocols, Nueva Jersey: Humana Press (1996), que se incorporan a modo de referencia en su totalidad. El mapeo de epítopos también puede realizarse a través de medios disponibles en el mercado (es decir, ProtoPROBE, Inc. (Milwaukee, isconsin) ) .
En ciertos aspectos, la descripción está dirigida a una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) que es menor que la KD paral anticuerpo monoclonal de referencia.
En ciertas modalidades, una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos, variante o derivado del mismo tal como se describe en la presente se une específicamente a al menos un epítopo de Psl, es decir, se une a un epítopo más fácilmente que si se uniera a un epítopo aleatorio no relacionado; se une preferentemente a al menos un epítopo de Psl, es decir, se une a tal epítopo más fácilmente que si se uniera a un epítopo homólogo o análogo similar relacionado; inhibe de manera competitiva la unión de un anticuerpo de referencia que se une específicamente o preferentemente a cierto epítopo de Psl; o se une a al menos un epítopo de Psl con una afinidad caracterizada por una constante de disociación KD de menos de aproximadamenti 3 5 X 10" 2 M, aproximadamente 102 M, aproximadamente 5 X 10"3 M , aproximadamente 10"3 M, aproximadamente 5 X 10"4 M, _ aproximadamente lO"4 M, aproximadamente 5 X 10"5 M, aproximadamente 10"5 M, aproximadamente 5 X 10"6 M , aproximadamente 10"6 M, aproximadamente 5 X lO"7 M, aproximadamente 10"7 M, aproximadamente 5 X 10"8 M, aproximadamente 10"8 M,. aproximadamente 5 X lO"9 M , aproximadamente 10"9 M, aproximadamente 5 X 10-io M , aproximadamente 10-io , aproximadamente 5 X 10"11 , aproximadamente lO"11 M, aproximadamente 5 X 10"12 M, aproximadamente lO'12 M, aproximadamente 5 X lO'13 M, aproximadamente lO"13 M, aproximadamente 5 X 10"14 M, aproximadamente 10"14 M, aproximadamente 5 x 10"15 M o aproximadamente 10""15 M.
Tal como se utiliza en el contexto de las constantes de disociación de unión, el término "aproximadamente" permite el grado de variación inherente en los métodos utilizados para medir la afinidad de anticuerpos. Por ejemplo, dependiendo del nivel de precisión de la instrumentación utilizada, el error estándar en base al número de las muestras medidas y un error de redondeo, el término "aproximadamente 10"2 M" podría incluir, por ejemplo, de 0.05 M a 0.005 M.
En modalidades específicas una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos, variante o derivado del mismo se une a Psl de Pseudomonas con una tasa de desactivación (k(desact.)) menor o igual a 5 X 10"2 seg"1, 10"2 seg"1, 5 X 10"3 seg"1 o 10"3 seg"1. Alternativamente, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos, variante o derivado del mismo se une a Psl de Pseudomonas con una constante de disociación (k(desact.)) menor o igual a 5 X 10"4 seg"1, 10"4 seg"1, 5 X 10"5 seg"1, o 10"5 seg"1 5 X 10"6 seg"1, 10"6 seg"1, 5 X 10"7 seg"1 o 10"7 seg"1.
En otras modalidades, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos, variante o derivado del mismo descrito en la presente se une a Psl de Pseudomonas con una tasa de activación (k(act.)) mayor o igual a 103 M"1 seg"1, 5 X 103 M"1 seg"1, 104 M"1 seg"1 o 5 X 104 M"1 seg"1. Alternativamente, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos, variante o derivado del mismo descrito en la presente se une a Psl de Pseudomonas con una constante de asociación (k(act.)) mayor o igual a 105 M"1 seg'1, 5 X 105 M"1 seg"1, 106 M"1 seg"1 o 5 X 106 M"1 seg"1 o 107 M"1 seg"1.
En varias modalidades, una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos, variante o derivado del mismo tal como se describe en la presente promueve la destrucción opsonofagocítica de Pseudomonas, o inhibe la unión de Pseudomonas a células epiteliales. En ciertas modalidades descritas en la presente, el objetivo de Psl de Pseudomonas es Psl de Pseudomonas aeruginosa . En otras modalidades, ciertas moléculas de unión descritas en la presente pueden unirse a moléculas de polisacáridos relacionados estructuralmente independientemente de su f ente. Las moléculas similares a Psl se esperaría que sean idénticas a o tengas suficiente relación estructural con Psl de P. aeruginosa para permitir el reconocimiento específico por una o más de las moléculas de unión describedas . Por ejemplo, ciertas moléculas de unión descritas en la presente pueden unirse a moléculas similares a Psl producidas por otras especies bacterianas, por ejemplo, moléculas similares a Psl producidas por otras especies de Pseudomonas, por ejemplo, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida o Pseudomonas alcaligenes . Alternativamente, ciertas moléculas de unión tal como se describen en la presente pueden unirse a moléculas similares a Psl producidas sintéticamente o mediante células hospederases genéticamente modificadas para producir moléculas similares a Psl.
A menos que se indique específicamente, tal como se utiliza en la presente un "fragmento de la misma" en referencia a una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, se refiere a un fragmento de unión a antígenos, es decir, una porción del anticuerpo que se une específicamente al antígeno.
Las moléculas de unión anti-Psl de Pseudo onas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos pueden comprender una región constante que media una o más funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente Cl del complemento con una región constante de anticuerpos puede activar el sistema del complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y lisis de patógenos. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y puede también estar involucrada en la hipersensibilidad autoinmune. Además, los anticuerpos se unen a receptores en varias células por medio de la región Fe, con sitio de unión del receptor Fe en la región Fe del anticuerpo que se une a un receptor Fe (FcR) en una célula. Hay varios receptores de Fe que son específicos para diferentes clases de anticuerpos, incluida IgG (receptores gamma) , IgE (receptores épsilon) , IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu) . La unión de anticuerpos con receptores Fe en superficies celulares activa una cantidad de respuestas biológicas importantes y diversas incluida la inmersión y destrucción de partículas recubiertas por anticuerpos, la eliminación de complejos inmunes, lisis de células objetivo recubiertas por anticuerpos por células destructoras (denominada citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, o ADCC) , liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placental y control de la producción de inmunoglobulina .
Por lo tanto, ciertas modalidades describedas en la presente incluyen una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígenos, variante o derivado del mismo, en el que al menos una fracción de uno o más de los dominios de región constante fue eliminado o de otro modo alterado de forma tal que proporciona las características bioquímicas deseadas tales como funciones efectoras reducidas, la capacidad de dimerizarse de forma no covalente, más capacidad para localizarse en el sitio de un tumor, menos semivida en suero o más semivida en suero cuando se compara con un anticuerpo entero inalterado de aproximadamente la misma inmunogenicidad Por ejemplo, ciertas moléculas de unión descritas en la presente son anticuerpos eliminados de dominios que comprenden una cadena de polipéptidos similar a una cadena pesada de inmunoglobulina, pero que careen de al menos una porción de uno o más dominios de cadena pesada. Por ejemplo, en ciertas modalidades, un dominio entero de la región constante del anticuerpo modificado se eliminará, por ejemplo, se eliminará todo o parte del dominio CH2.
Formas modificadas de moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos pueden obtenerse a partir de anticuerpos precursores enteros o base usando técnicas conocidas en la técnica. Técnicas ejemplares se describen en otras partes en la presente.
En ciertas modalidades, tanto las regiones variables como constantes de moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos, son completamente humanas. Anticuerpos completamente humanos pueden obtenerse usando técnicas que son conocidas por los expertos en la técnica y tal como se describe en la presente. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos totalmente humanos contra un antígeno específico mediante la administración del antígeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir los anticuerpos en respuesta al desafío antigénico, pero cuyos locus endógenos han sido deshabilitados. Técnicas ejemplares que pueden utilizarse para realizar los anticuerpos se describen en las patentes de los Estados Unidos: 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140. Otras técnicas se conocen en la técnica. Anticuerpos humanos completos pueden de manera similar producirse por varias tecnologías de expresión, por ejemplo, expresión de bacteriófagos u otros sistemas de expresión viral, tal como se describe en más detalle en otras partes en la presente.
Moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos tal como se describe en la presente, pueden obtenerse o fabricarse usando técnicas que son conocidas en la técnica. En ciertas modalidades, las moléculas de unión o fragmentos de las mismas se "producen recombinantemente" , es decir, se producen usando tecnología de ADN recombinante . Ejemplos de técnicas para obtener moléculas de anticuerpos o fragmentos de las mismas se describen en más detalle en otras partes en la presente.
En ciertas moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente, la porción Fe puede mutarse para reducir la función efectora usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la eliminación o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de región constante puede reducir la unión del receptor Fe del anticuerpo modificado circulante aumentando así la localización del tumor. En otros casos puede ser que las modificaciones de regiones constantes moderan la unión del complemento y de esta forma reducen la semivida del suero y la asociación no específica de una citotoxina conjugada. Aun otras modificaciones de la región constante pueden utilizarse para modificar los enlaces disulfuro o restos de oligosacáridos que permiten la localización mejorada debido a una mayor especificidad de antígenos o flexibilidad de anticuerpos. El perfil fisiológico resultante, biodisponibilidad y otros efectos bioquímicos de las modificaciones, tales como localización, biodistribución y semivida del suero, pueden medirse fácilmente y cuantificarse usando técnicas inmunológicas bien conocidas sin excesiva experimentación.
En ciertas modalidades, las moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos no provocarán una respuesta inmune perjudicial en el animal a tratar, por ejemplo, en un humano. En una modalidad, las moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos se modifican para reducir su inmunogenicidad usando técnicas reconocidas en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden humanizarse, desinmunizarse o pueden realizarse anticuerpos quiméricos. Estos tipos de anticuerpos derivan de un anticuerpo no humano, normalmente un anticuerpo de murino o primate, que retiene o básicamente retiene las propiedades de unión a antígenos del anticuerpo base, pero que es menos inmunogénico en humanos. Esto puede lograrse por varios métodos, incluidos (a) injerto de todos los dominios variables no humanos en regiones constantes humanas para generar anticuerpos quiméricos; (b) injerto de al menos una parte de una o más de las regiones determinantes de la complementariedad no humana (CDR) en un marco humano y regiones constantes con o sin retención de residuos marco críticos; o (c) trasplantar todos los dominios variables no humanos, pero "ocultándolos" con una sección similar humana por reemplazo de los residuos de superficie. Los métodos se describen en Morrison et al., Proc . Nati. Acad Sci . 81:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol . 44:65-92 (1988); Verhoeyen eü al., Science 239 : 1534 - 1536 (1988) ; Padlan, Molec . Immun. 28:489-498 (1991) ; Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994), y las Pat . de los Estados Unidos Nos. 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762 y 6,190,370, las cuales se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.
También puede utilizarse desinmunización para reducir la inmunogenicidad de un anticuerpo. Tal como se utiliza en la presente, la expresión "desinmunización" incluye la alteración de un anticuerpo para modificar los epítopos de células T (ver, por ejemplo, W09852976A1, O0034317A2) . Por 7 ejemplo, las secuencias de VH y VL del anticuerpo de partida se analizan y un "mapa" de epítopos de células T humanas de cada región V que muestra la ubicación de los epítopos en relación con las regiones determinantes de la complementariedad (CD ) y otros residuos clave dentro de la secuencia. Los epítopos de células T individuales del mapa de epítopos de células T se analizan con el fin de identificar sustituciones de aminoácidos alternativos con un bajo riesgo de alterar la actividad del anticuerpo final. Se diseñan varias secuencias de VH y VL alternativas que comprenden combinaciones de sustituciones de aminoácidos y estas secuencias se incorporan posteriormente a la gama de polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de Psl de Pseudomonas o fragmentos de unión a antígenos de los mismos descritos en la presente, de los que se evalúa la función. Los genes de cadena pesada y liviana completos que comprenden regiones V modificadas y C humanas luego se clonan en vectores de expresión y los plásmidos posteriores se introducen en líneas celulares para la producción de anticuerpo completo. Los anticuerpos se comparan luego en ensayos bioquímicos y biológicos apropiados, y se identifica la variante óptima.
Moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión de antígenos, variantes o derivados de los mismos pueden generarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Pueden producirse anticuerpos policlonales contra un antígeno de interés mediante varios procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo anti-Psl de . Pseudomonas o un fragmento de unión a antígenos del mismo puede administrarse a varios animales huéspedes que incluyen, a modo no taxativo, conejos, ratones, ratas, pollos, hámsteres, cabras, burros, etc., para inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales específicos para el antígeno. También se pueden usar diferentes adyuvantes para aumentar la respuesta inmunitaria, dependiendo de la especie de huésped, e incluyen, a modo no taxativo, adyuvante de Freund (completo e incompleto) , geles minerales como hidróxido de aluminio, ' tensioactivos como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y otros adyuvantes potencialmente útiles como el BCG (bacilo de Calmette y Guerin) y la Corynebacterium parvum. Los adyuvantes también se conocen bien en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica incluido el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de expresión de bacteriófagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando técnicas de hibridoma, incluidas aquellas conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988) .
El ADN que codifica anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, sitios de unión a antígenos) también pueden derivar de bibliotecas de anticuerpos, tales como bibliotecas de expresión de bacteriófagos. En particular, el bacteriófago puede utilizarse para exhibir dominios de unión a antígenos expresados de un repertorio o biblioteca de anticuerpos combinatoria (por ejemplo, humanos o de murino) . Los bacteriófagos que expresan un dominio de unión antígenos que se une al antígeno de interés pueden seleccionarse o identificarse con antígeno, por ejemplo, usando antígeno o anticuerpo etiquetado unido o capturado a una superficie sólida o perla. Los bacteriófagos utilizados en estos métodos son normalmente bacteriófagos filamentosos que incluyen los dominios de unión fd y M13 expresados de bacteriófagos con scFv, Fab, Fv OE DAB (región Fv individual de cadenas ligeras y pesadas) o dominios de anticuerpos Fv estabilizados por disulfuro recombinantemente fusionados con el gen de bacteriófago III o la proteína VIII génica. Los métodos ejemplares se establecen, por ejemplo, en el documento EP 368 684 Bl; Patente de los Estados Unidos 5,969,108, Hoogenboom, H.R. y Chames, Immunol . Today 21:371 (2000); Nagy et al. Wat. Med. 8:801 (2002); Huie et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98:2682 (2001); Luí et al., J. Mol. Biol . 315:1063 (2002), cada uno de los cuales se incorpora a la presente a modo de referencia. Varias publicaciones (por ejemplo, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)) han descrito la producción de anticuerpos humanos de afinidad alta mediante trasposición de cadenas, así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de bacteriófagos grandes. En otra modalidad, la expresión de los ribosomas puede utilizarse para reemplazar los bacteriófagos como la plataforma de expresión (ver, por ejemplo, Hanes et al., Nat . Biotechnol . 15:1287 (2000); Wilson et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 98:3750 (2001); o Irving et al., J. Immunol . Methods 248:31 (2001)). En otra modalidad adicional, las bibliotecas de superficie celular pueden evaluarse para anticuerpos (Boder et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:10101 (2000); Daugherty et al., J. Immunol. Methods 243:211 (2000)). Los procedimientos proporcionan alternativas a las técnicas de hibridoma tradicionales para el aislamiento y la clonación posterior de anticuerpos monoclonales.
En los métodos de expresión de bacteriófagos, los dominios de anticuerpos funcionales se expresan sobre la superficie de las partículas de bacteriófagos que portan las secuencias de polinucleótidos que codifican los mismos. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican las regiones VH y VL se amplifican de bibliotecas de ADNc animales (por ejemplo, bibliotecas de ADNc humanas o de murino de tejidos linfoides) o bibliotecas de ADNc sintéticas. En ciertas modalidades, el ADN que codifica las regiones VH y VL se une por un enlazante scFv mediante PC y se clona en un vector fagémido (por ejemplo, p CANTAB 6 o pComb 3 HSS) . El vector es electroporado en E. coli y la E. coli se infecta con un bacteriófago ayudante. Los bacteriófagos usados en estos métodos son normalmente bacteriófagos filamentosos incluidos fd y M13 y las regiones VH o VL se fusionan normalmente recombinantemente con el gen III o gen VIII del bacteriófago. Los bacteriófagos que expresan un dominio de unión a antígenos que se une a un antígeno de interés (es decir, Psl de Pseudomonas) pueden seleccionarse o identificarse con antígeno, por ejemplo, usando antígeno o anticuerpo etiquetado unido o capturado a una superficie sólida o perla.
Ejemplos adicionales de métodos de expresión de bacteriófagos que pueden utilizarse para realizar los anticuerpos incluyen aquellos descritos en Brinkman et al . , J Im unol . Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol . Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic efc al., Gene 187:9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); la Solicitud PCT No. PCT/GB91/01134 ; publicaciones PCT WO 90/02809; O 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y la Pat . de los Estados Unidos Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108; cada una de las cuales se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad.
Tal como se describe en las referencias anteriores y en los ejemplos a continuación, después de la selección de bacteriófagos, las regiones codificadoras de anticuerpos del bacteriófago pueden aislarse y utilizarse para generar anticuerpos enteros, incluidos anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión a antígenos deseado, y expresar en cualquier huésped deseado, incluidas células de mamífero, células de insectos, células de plantas, levadura y bacterias. Por ejemplo, las técnicas para producir recombinantemente fragmentos Fab, Fab1 y F(ab' ). también pueden emplearse usando métodos conocidos en la técnica tales como aquellos descritos en la publicación PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12 (6) : 864 - 869 (1992); y Sawai efc al., AJRI 34:26-34 (1995); y Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (las referencias se incorporan a modo de referencia en su totalidad) .
Ejemplos de técnicas que pueden utilizarse para producir Fvs de una sola cadena y anticuerpos incluyen aquellos descritos en las Pat . de los Estados Unidos Nos. 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 50:7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988). En ciertas modalidades tales como administración terapéutica, pueden utilizarse anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones del anticuerpo derivan de diferentes especies de animales, tales como anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol . Methods 125:191-202 (1989); Pat . de los Estados Unidos Nos. 5,807,715; 4,816,567 y 4,816397, que se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad. Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpos de anticuerpo de especie no humana que se une al antígeno deseado que tiene una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las regiones de especie no humana y marco de una molécula de inmunoglobulina humana. A menudo, los residuos marco en las regiones marco humanas serán sustituidos con el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, preferiblemente mejorar, la unión de antígenos. Estas sustituciones marco se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, modelando las interacciones de los residuos de CDR y marco para identificar residuos marco importantes para unión a antígenos y comparación de secuencias para identificar residuos marco poco usuales en posiciones particulares. (Ver, por ejemplo, Queen et al., la Pat . de los Estados Unidos No. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), que se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.) Los anticuerpos pueden humanizarse usando una variedad de técnicas conocidas en la técnicas incluidas, por ejemplo, injerto de CDR (EP 239,400; publicación PCT O 91/09967; Pat. de los Estados Nos. 5,225,539; 5,530,101; y 5,585,089), recubrimiento o revestimiento (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28 (4/5) :489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7 (6) : 805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)) y transposición de cadena (Pat. de los Estados Unidos No. 5,565,332) .
Anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Los anticuerpos humanos pueden obtenerse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluidos los métodos de expresión de bacteriófagos descritos anteriormente usando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina . Ver también las Pat. de los Estados Unidos Nos. 4,444,887 y 4,716,111; y las publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741; cada una de las cuales se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad.
Los anticuerpos humanos también producirse usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar las inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar los genes de inmunoglobulina humanos. Por ejemplo, los complejos de genes de inmunoglobulina de cadena pesada y liviana humana pueden introducirse aleatoriamente o mediante recombinación homologa en células madre embriónicas de ratón. Además, varias compañías pueden encargarse de proporcionar los anticuerpos humanos producidos en ratones transgénicos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando tecnología similar a la que se describió anteriormente.
Pueden generarse anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado usando una técnica que se denomina "selección guiada." En este abordaje se usa un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo. (Jespers et al., Bio/Technology 12:899-903 (1988). Ver también la Patente de los Estados Unidos No. 5,565,332.) En otra modalidad, los anticuerpos monoclonales que codifican ADN pueden aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de ^ligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de murino) . Las células de hibridomas aisladas y subclonadas o bacteriófagos aislados, por ejemplo, pueden servir como una fuente del ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que luego se transfectan a células hospederases procariotas y eucariotas tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen inmunoglobulinas . Más particularmente, el ADN aislado (que puede ser sintético como se describe en la presente) puede utilizarse para clonar las secuencias de regiones constantes y variables para la fabricación de anticuerpos tal como se describe en Newman efc al., Pat . de los Estados Unidos No. 5,658,570, presentada el 25 de enero de 1995, que se incorpora a la presente a modo de referencia. Las células transformadas que expresan el anticuerpo deseado pueden cultivarse en cantidades relativamente grandes para proporcionar suministros clínicos y comerciales de la inmunoglobulina .
En una modalidad, una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo, comprende al menos una CDR de cadena pesada o liviana de una molécula de anticuerpo. En otra modalidad, una molécula de unión aislada comprende al menos dos CDR de una o más moléculas de anticuerpos. En otra modalidad, una molécula de unión aislada comprende al menos tres CDR de una o más moléculas de anticuerpos. En otra modalidad, una molécula de unión aislada comprende al menos cuatro CDR de una o más moléculas de anticuerpos. En otra modalidad, una molécula de unión aislada comprende al menos cinco CDR de una o más moléculas de anticuerpos. En otra modalidad, una molécula de unión aislada de la descripción comprende al menos seis CDR de una o más moléculas de anticuerpos .
En una modalidad específica, la secuencia de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada y/o liviana pueden inspeccionarse para identificar las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) mediante métodos que son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante comparación con secuencias de aminoácidos conocidas de las otras regiones variables de cadena pesada y liviana para determinar la regiones con hipervariabilidad de secuencias. Usando técnicas de ADN recombinante de rutina, una o más CDR pueden insertarse dentro de las regiones marco, por ejemplo, en regiones marco humanas para humanizar un anticuerpo no humano. Las regiones marco pueden ser regiones marco naturales o de consenso, y preferiblemente regiones marco humanas (ver, por ejemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol 278:457-479 (1998) para listar las regiones marco humanas). El polinucleótido generado por la combinación de las regiones marco y CDR codifica un anticuerpo que se une específicamente a al menos un epítopo de un antígeno deseado, por ejemplo, Psl. Pueden utilizarse una o más sustituciones de aminoácidos dentro de las regiones marco y las sustituciones de aminoácidos mejoran la unión del anticuerpo a su antígeno. Adicionalmente , los métodos pueden utilizarse para realizar las sustituciones o eliminaciones de aminoácidos de uno o más residuos de cisterna de la región variable que participan en un uno o más enlaces disulfuro intracadena. Otras alteraciones al polinucleótido están comprendidas por la presente descripción y están dentro de las capacidades de un experto en la técnica.
También se proporcionan moléculas de unión que comprenden, consisten esencialmente o consisten en variantes (incluidos derivados) de moléculas de anticuerpos (por ejemplo, las regiones VH y/o las regiones VL) descritas en la presente, uniéndose las moléculas de unión o fragmentos de las mismas específicamente a Psl de Pseudomonas. Pueden utilizarse técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de unión o fragmento de la misma que se une específicamente a Psl de Pseudomonas, incluidas, a modo no taxativo, mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis mediada por PCR que resulta en sustituciones de aminoácidos. Las variantes (incluidos derivados) codifican polipéptidos que comprenden menos de 50 sustituciones de aminoácidos, menos de 40 sustituciones de aminoácidos, menos de 30 sustituciones de aminoácidos, menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos o menos de 2 sustituciones de aminoácidos con respecto a la región VH de referencia, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 , región VL, VLCDR1, VLCDR2 o VLCDR3. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en la que el residuo de aminoácidos es reemplazado por un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral con una carga similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales de ramas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina , triptófano, histidina) .
Alternativamente, las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia codificadora, tal como mediante mutagénesis por saturación, y puede detectarse la actividad biológica en los mutantes resultantes para identificar mutantes que retienen actividad (por ejemplo, la capacidad de unirse a una Psl de Pseudomonas) .
Por ejemplo, es posible introducir mutaciones sólo en las regiones marco o sólo en las regiones de CDR de una molécula de anticuerpo. Las mutaciones introducidas pueden ser silenciosas o mutaciones de sentido erróneo neutras, es decir, que no tienen o tienen poco efecto en la capacidad de un anticuerpo de unirse a antígenos. Estos tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso de los codones, o mejorar la producción de anticuerpos del hibridoma. Alternativamente, las mutaciones de sentido erróneo no neutras pueden alterar la capacidad del anticuerpo de unirse a antígeno. La ubicación de la mayoría de las mutaciones de sentido erróneo silenciosas y neutras es probable que sea en las regiones marco, mientras que la ubicación de la mayoría de las mutaciones de sentido erróneo no neutras es probable que sea en la CDR, a pesar de que esto no es un requisito absoluto. Un experto en la técnica sería capaz de diseñar y evaluar moléculas mutantes con propiedades deseadas tales como no la alteración en la actividad de unión a antígenos o la alteración en la actividad de unión (por ejemplo, mejoras en la actividad de unión a antígenos o cambio en la especificidad de los anticuerpos) . Luego de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse de rutina y la actividad funcional y/o biológica de la proteína codificada, (por ejemplo, la capacidad de unirse a al menos un epítopo de Ps de Pseudomonas) puede determinarse usando las técnicas descritas en la presente o mediante la modificación de rutina de técnicas conocidas en la técnica.
III. POLIPÉPTIDOS DE ANTICUERPOS La descripción está dirigida adicionalmente a polipéptidos aislados que conforman la molécula de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, que se unen específicamente a Psl de Pseudomonas y polinucleótidos que codifican los polipéptidos. Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos, tal como se describe en la presente, comprenden polipéptidos, por ejemplo secuencias de aminoácidos que codifican, por ejemplo, regiones de unión a antígenos específicas de Psl derivadas de moléculas de inmunoglobulina . Un polipéptido o secuencia de aminoácidos "derivada de" una proteína designada se refiere al origen del polinucleótido . En ciertos casos, el polinucleótido o secuencia de aminoácidos que deriva de un polipéptido de partida particular o secuencia de aminoácidos tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la de la secuencia de partida, o una porción de la misma, en donde la porción consiste en al menos 10-20 aminoácidos, al menos 20-30 aminoácidos, al menos 30-50 aminoácidos, o que de otro modo pueden identificar los expertos en la técnica que tiene su origen en la secuencia de partida .
También se describe una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (VH) al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idéntica a una o más de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 15, o SEQ ID NO: 74 tal como se muestra en la Tabla 2.
Se describe también una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una secuencia de aminoácidos de VH idéntica a o idéntica, salvo por una, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácidos a una o más de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 15, O SEQ ID NO: 74 tal como se muestra en la Tabla 2.
Algunas modalidades incluyen una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VH, donde una o más de las regiones VHCDRl, VHCDR2 o VHCDR3 de la VH son al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idénticas a una o más de las secuencias de aminoácidos de cadena pesada VHCDRl, VHCDR2 o VHCDR3 de una o más de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO: 74 tal como se muestra en la Tabla 2.
Se describe además una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VH, donde una o más de las regiones VHCDRl, VHCDR2 o VHCDR3 de la VH son idénticas a, o idénticas salvo por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácidos, a una o más secuencias de aminoácidos de cadena pesada VHCDRl, VHCDR2 y/o VHCDR3 de referencia de una o más de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 15, o SEQ ID NO: 74 tal como se muestra en la Tabla 2. De esta forma, de acuerdo con esta modalidad, la VH comprende una o más de una VHCDRl, VHCDR2 o VHCDR3 idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos a, una o más de las secuencias de aminoácidos de VHCDRl, VHCDR2 o VHCDR3 que se muestran en la Tabla 3.
También se describe una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena liviana de inmunoglobulina (VL) al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idéntica a una o más de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 tal como se muestra en la Tabla 2.
Algunas modalidades describen una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una secuencia de aminoácidos de VL idéntica a, o idéntica salvo por una, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácidos, a una o más de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 tal como se muestra en la Tabla 2.
También se proporciona una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VL, donde una o más de las regiones VLCDR1 , VLCDR2 o VLCDR3 de la VL son al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idénticas a una o más de las secuencias de aminoácidos de cadena liviana VHCDR1, VHCDR2 o VHCDR3 de una o más de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 tal como se muestra en la Tabla 2.
Se proporciona además una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VL, donde una o más de las regiones VLCDRl, VLCDR2 o VLCDR3 de la VL son idénticas a, o idénticas salvo por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácidos, a una o más secuencias de aminoácidos de cadena pesada VLCDRl, VLCDR2 y/o VLCDR3 de referencia de una o más de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 tal como se muestra en la Tabla 2. De esta forma, de acuerdo con esta modalidad la VL comprende una o más de una VLCDRl, VLCDR2 o VLCDR3 idéntica a o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos, a una o más de las secuencias de aminoácidos de VLCDRl, VLCDR2 o VLCDR3 que se muestran en la Tabla 3.
En otras modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Psl de Pseudomonas, comprende, consiste esencialmente o consiste en secuencias de aminoácidos de VH y VL al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idénticas a: (a) SEQ ID NO : 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, (b) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, (c) SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 2 , respectivamente, (d) SEQ ID NO : 5 y SEQ ID NO: 6 , respectivamente, (e) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO : 8, respectivamente, (f) SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente, (g) SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 , respectivamente, (h) SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, respectivamente; o (i) SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente; o (j) SEQ ID NO: 74 y SEQ ID NO: 12, respectivamente. En ciertas modalidades, el anticuerpo descrito anteriormente o fragmento de unión a antígenos del mismo comprende una VH con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11 y una VL con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el anticuerpo descrito anteriormente o fragmento de unión a antígenos del mismo comprende una VH con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y una VL con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En otras modalidades, el anticuerpo descrito anteriormente o fragmento de unión a antígenos del mismo comprende una VH con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11 y una VL con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
En ciertas modalidades, una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo tal como se describe específicamente en la presente se une a Psl de Pseudomonas con una afinidad caracterizada por una constante de disociación o KD no mayor que 5 x 10"2 M, 10"2 M, 5 x 10"3 M, 10"3 M, 5 x 10"4 M, 10"4 M, 5 x 10"5 M, 1CT5 M, 5 x 10"6 M, 10"6 M, 5 x 10"7 M, 10"7 M, 5 x 10"8 M, 10"8 M, 5 x 10"9 M, 10"9 M, 5 x 10"10 M, 10"10 M, 5 X 10"11 M, 10"11 M, 5 X 10"12 M, 10"12 M, 5 x 10"13 M, 10"13 M, 5 x 10"14 M, 10~14 M, 5 x 10"15 M o 1CT15 M.
En modalidades específicas, una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo tal como se describe en la presente se une específicamente a Psl de Pseudomonas con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) en un intervalo de aproximadamente 1 x 10"10 a aproximadamente 1 x 10"6 M. En una modalidad, un anticuerpo de unión aislado, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo tal como se describe en la presente se une específicamente a Psl de Pseudomonas con una afinidad caracterizada por una KD de aproximadamente 1.18 x 10~7 M, tal ® como se determina mediante ensayo de unión OCTET descrito en la presente. En otra modalidad, una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo tal como se describe en la presente se une específicamente a Psl de Pseudomonas con una afinidad caracterizada por una KD de aproximadamente 1.44 x 10"7 M, tal como se determina mediante ensayo de unión OCTET* descrito en la presente.
Algunas modalidades incluyen la molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describió anteriormente, que (a) puede inhibir la unión de Pseudomonas aeruginosa a células epiteliales, (b) puede promover la OPK de P. aeruginosa o (c) puede inhibir la unión de P. aeruginosa a células epiteliales y puede promover la OPK de P. aeruginosa.
En algunas modalidades la molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo, tal como se describió anteriormente, donde la inhibición máxima de la unión de P. aeruginosa a células epiteliales se logra a una concentración de anticuerpos de aproximadamente 50 µg/ml o menos, 5.0 ug/ml o menos o aproximadamente 0.5 µg/ml o menos, o a una concentración de anticuerpos en el intervalo de aproximadamente 30 µg/ml a aproximadamente 0.3 ug/ml, o a una concentración de anticuerpos de aproximadamente 1 g/ml , o a una concentración de anticuerpos de aproximadamente 0.3 ug/ml Ciertas modalidades incluyen la molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describió anteriormente, donde la EL50 de la OPK es menor que aproximadamente 0.5 µg/ml, menor que aproximadamente 0.05 µg/ml, o menor que aproximadamente 0.005 µg/ml, o donde la EL50 de la OPK está en el intervalo de aproximadamente 0.001 µg/ml a aproximadamente 0.5 µg/ml, o donde la EL50 de la OPK está en el intervalo de aproximadamente 0.02 µg/ml a aproximadamente 0.08 µg/ml, o donde la EL50 de la OPK está en el intervalo de aproximadamente 0.002 g/ml a aproximadamente 0.01 ug/ml o donde la EL50 de la OPK es menor que aproximadamente 0.2 µg/ml, o en donde la EL50 de la OPK es menor que aproximadamente 0.02 g/ml . En ciertas modalidades, una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo descrito en la presente se une específicamente al mismo epítopo de Psl que el anticuerpo monoclonal WapR-004, WapR-004RAD, Cam-003, Cam-004 o Cam-005', o inhibirá de forma competitiva la unión del anticuerpo monoclonal a Psl de Pseudomonas. WapR-004RAD es idéntico a WapR-004 salvo por una sustitución de aminoácidos G98A de la secuencia de aminoácidos de VH de SEQ ID NO: 11.
Algunas modalidades incluyen mutantes de WapR-004 (W4) que comprenden una secuencia de aminoácidos de moléculas scFv-Fc idéntica a, o idéntica salvo por uno, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácidos a una o más de: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO : 79, SEQ ID NO : 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO : 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; o SEQ ID NO: 146.
Otras modalidades incluyen mutantes de WapR-004 ( 4) que comprenden una secuencia de aminoácidos de moléculas scFv-Fc al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idéntica a una o más de: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; o SEQ ID NO: 146.
En algunas modalidades, una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo descrito en la presente se une específicamente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal apR-001, WapR-002 o apR-003, o inhibirá de forma competitiva la unión del anticuerpo monoclonal a Psl de Pseudomonas .
En ciertas modalidades, una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo descrito en la presente se une específicamente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal apR-016, o inhibirá de forma competitiva la unión del anticuerpo monoclonal a Psl de Pseudomonas. 10 TABLA 2 : Secuencias de aminoácidos de VH y VL de referencia* 1 4 *Las secuencias de aminoácidos de CDRl, CDR2 y CDR3 de y VL están subrayadas TABLA 3: Secuencias de aminoácidos de CDRl, CDR2 y CDR3 de VH y VL de referencia Cualquier molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente, también pueden incluir polipéptidos adicionales, por ejemplo, un péptido señal para dirigir la secreción del péptido codificado, regiones constantes de anticuerpos tal como se describe en la presente u otros polipéptidos heterólogos tal como se describe en la presente. Además, las moléculas de unión o fragmentos de las mismas de la descripción incluyen fragmentos de polipéptidos tal como se describe en otras partes. Además, las moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente pueden ser polipéptidos de fusión, fragmentos Fab, scFvs u otros derivados, tal como se describe en la presente.
Además, tal como se describe en más detalle en otras partes de la presente, la descripción incluye composiciones que comprenden moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente.
Los expertos en la técnica comprenderán también que las moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente pueden modificarse de forma tal que varían en sus secuencias de aminoácidos con respecto al polipéptido de unión natural del cual derivaron. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o aminoácidos derivada de una proteína designada puede ser similar, por ejemplo, tener cierta identidad porcentual con respecto a la secuencia de inicio, por ejemplo, puede ser 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntica a la secuencia de inicio.
La expresión "identidad de secuencia porcentual" entre dos polinucleótidos o secuencias de polipéptidos se refiere a la cantidad de posiciones coincidentes idénticas compartidas por las secuencias a lo largo de una ventana de comparación, teniendo en cuenta las adiciones o eliminaciones (es decir, brechas) que deben introducirse para una alineación óptima de ambas secuencias. Una posición coincidente es cualquier posición en la cual un nucleótido o aminoácido idéntico se presenta tanto en la secuencia objetivo como la de referencia Las brechas presentadas en la secuencia objetivo no se cuentan, ya que las brechas no son nucleótidos ni aminoácidos Del mismo modo, las brechas presentadas en la secuencia de referencia no se cuentan, ya que lo que se cuenta son los nucleótidos o aminoácidos de la secuencia objetivo y no los nucleótidos o aminoácidos de la secuencia de referencia.
El porcentaje de identidad de secuencia se calcula determinando el número de posiciones en las cuales aparece el residuo de aminoácido o la base de ácido nucleico idénticos en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. La comparación de secuencias y la determinación de la identidad de secuencia porcentual entre dos secuencias pueden lograrse usando programas informáticos disponibles tanto para su uso en línea como para descargar. Distintas fuentes ofrecen programas informáticos adecuados y para alineación de secuencias de proteínas y nucleótidos. Un programa adecuado para determinar la identidad de secuencia porcentual es bl2seq, parte del paquete de programas BLAST disponible en el sitio web del Centro Nacional de Información de Biotecnología BLAST del gobierno de los EE.UU. (blast.ncbi.nlm.nih.gov). Bl2seq realiza una comparación entre dos secuencias usando el algoritmo BLASTN o BLASTP . BLASTN se usa para comparar secuencias de ácidos nucleicos, mientras que BLASTP se usa para comparar secuencias de aminoácidos. Otros programas adecuados son, por ejemplo, Needle, Stretcher, Water o Matcher, parte del paquete de programas bioinformáticos EMBOSS y también disponible en el Instituto Europeo de Bioinformática (EBI, por sus siglas en inglés) en ww . ebi . ac . uk/Tools/psa .
Diferentes regiones dentro de una secuencia objetivo individual de polinucleótidos o polipéptidos que se alinea con una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos de referencia pueden tener su propia identidad de secuencia porcentual. Cabe señalar que el valor de la identidad de secuencia porcentual se redondea al decimal más próximo. Por ejemplo, 80.11, 80.12, 80.13 y 80.14 se redondean hacia abajo en 80.1, mientras que 80.15, 80.16, 80.17, 80.18 y 80.19 se redondean hacia arriba en 80.2. Cabe señalar también que el valor de la longitud será siempre un número entero.
Los expertos en la técnica apreciarán que la generación de una alineación de secuencias para el cálculo de la identidad de secuencia porcentual no se limita a comparaciones secuencia-secuencia binarias exclusivamente generadas por datos de secuencias primarios. Las alineaciones de secuencias pueden derivar de múltiples alineaciones de secuencias. Un programa adecuado para generar alineaciones de múltiples secuencias es ClustalW2 , disponible en www.clustal.org. Otro programa adecuado es MUSCLE, disponible de www.drive5.com/muscle/. ClustalW2 y MUSCLE se encuentran disponibles también, por ejemplo, en el EBI .
Se apreciará también que las alineaciones de secuencias pueden generarse integrando datos de secuencias con datos de fuentes heterogéneas, tales como datos estructurales (por ejemplo, estructuras de proteínas cristalográficas) , datos funcionales (por ejemplo, ubicación de las mutaciones) o datos filogenéticos . Un programa adecuado que integra datos heterogéneos para generar una alineación de múltiples secuencias es T-Coffee, disponible en www.tcoffee.org, y también disponible, por ejemplo, en el EBI Se apreciará también que la alineación final usada para calcular la identidad de secuencia porcentual puede depurarse automática o manualmente.
Puede determinarse si un polipéptido en particular es al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntico a otro polipéptido usando métodos y programas informáticos conocidos en la técnica tales como, a modo no taxativo, el programa BESTFIT ( isconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, adison, WI 53711) . BESTFIT utiliza el algoritmo de homología local de Smith y aterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981) para buscar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Al usar BESTFIT o cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia en particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia, los parámetros se fijan, obviamente, de forma tal que se calcule el porcentaje de identidad para la longitud total de la secuencia de polipéptidos de referencia y que se permitan brechas en la homología de hasta 5% del número total de aminoácidos en la secuencia de referencia.
Más aun, pueden realizarse sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos que conduzcan a sustituciones o cambios conservadores en regiones de aminoácidos "no esenciales". Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o aminoácidos derivada de una proteína designada puede ser idéntica a la secuencia de inicio, excepto por una o más sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos individuales, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, quince, veinte o más sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos individuales. En ciertas modalidades, una secuencia de polipéptidos o aminoácidos derivada de una proteína designada tiene una a cinco, una a diez, una a quince o una a veinte sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos individuales con respecto a la secuencia de inicio.
Una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo descrito en la presente puede comprender, consistir básicamente o consistir en una proteína de fusión. Las proteínas de fusión son moléculas quiméricas que comprenden, por ejemplo, un dominio de unión a antígenos de inmunoglobulina con al menos un sitio de unión objetivo y al menos una porción heteróloga, es decir, una porción con la cual no se une naturalmente en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos pueden existir normalmente en proteínas separadas que se juntan en el polipéptido de fusión o pueden existir normalmente en la misma proteína pero son reemplazadas en una nueva disposición en el polipéptido de fusión. Las proteínas de fusión pueden crearse, por ejemplo, mediante síntesis química o creando y traduciendo un polinucleótido en el cual las regiones peptídicas se codifican en la relación deseada.
El término "heterólogo" aplicado a un polinucleótido, polipéptido u otro resto significa que el polinucleótido, polipéptido u otro resto deriva de una entidad bien diferenciada de la del resto de la entidad con la cual se está comprando. En un ejemplo no taxativo, un "polipéptido heterólogo" que ha de fusionarse a una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígenos, variante o derivado del mismo deriva de un polipéptido que no es inmunoglobulina de la misma especie o una inmunoglobulina o polipéptido que no es inmunoglobulina de una especie diferente.
IV. PROTEÍNAS DE FUSIÓN Y CONJUGADOS DE ANTICUERPOS En algunas modalidades, las moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos pueden administrarse varias veces en forma conjugada. En otras modalidades adicionales, las moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos pueden administrarse en forma no conjugada y luego en forma conjugada o viceversa.
En modalidades específicas, las moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos pueden conjugarse con uno o más agentes antimicrobianos, por ejemplo, Polimixina B (PMB) . La PMB es un antibiótico lipopeptídico pequeño aprobado para el tratamiento de infecciones Gram-negativas resistentes a múltiples fármacos. Además de su actividad bactericida, la PMB se une a lipopolisacáridos (LPS) y neutraliza sus efectos proinflamatorios . (Dixon, R.A. & Chopra, I. J Antimicrob Chemother 18, 557-563 (1986)). Se cree que los LPS contribuyen significativamente a la inflamación y el inicio de la sepsis Gram-negativa . (Guidet, B., et al., C est 106, 1194-1201 (1994)). Las terapias que neutralizan y/o eliminan los LPS de la circulación tienen el potencial de prevenir o retrasar el inicio de la sepsis y de mejorar el resultado clínico. La Polimixina B (PMB) es un antibiótico lipopeptídico aprobado para el tratamiento de infecciones Gram-negativas resistentes a múltiples fármacos. Además de su actividad bactericida, la PMB se une a LPS y neutraliza sus efectos proinflamatorios . Conjugados de PMB con moléculas portadores han demostrado que neutralizan los LPS y median la protección en modelos animales de endotoxemia e infección. (Drabick, J.J., et al. Antimicrob Agents Chemother 42, 583-588 (1998)). También se describe un método para unir una o más moléculas de PMB a residuos de cisteína introducidos en la región Fe de anticuerpos monoclonal (mAb) de la descripción. Por ejemplo, los conjugados de Cam-003-PMB retuvieron la unión específica mediada por mAb a P. aeruginosa y también retuvieron la actividad de OPK. Además, los conjugados de mAb-PMB se unieron y neutralizaron los LPS in vitro.
En ciertas modalidades, una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo descrito en la presente puede comprender una secuencia de aminoácidos heteróloga o uno o más restos diferentes no asociados normalmente a un anticuerpo (por ejemplo, un agente antimicrobiano, un agente terapéutico, un profármaco, un péptido, una proteína, una enzima, un lípido, un modificador de respuesta biológica, agente farmacéutico, una linfocina, un anticuerpo heterólogo o fragmento del mismo, una etiqueta detectable, polietilenglicol (PEG) y una combinación de dos o más de los agentes) . En otras modalidades, una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo descrito en la presente puede comprender una etiqueta detectable que se selecciona del grupo que consiste en una enzima, una etiqueta fluorescente, una etiqueta quimioluminiscente , una etiqueta bioluminiscente , una etiqueta radiactiva o una combinación de dos o más de cualquiera de las etiquetas detectables .
V. POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN MOLÉCULAS DE UNIÓN También se proporcionan en la presente moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente.
Una modalidad proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste básicamente o consiste en un ácido nucleico que codifica una secuencia de ácidos nucleicos de la región variable de cadena pesada (VH) de inmunoglobulina al 11 menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idéntica a una o más de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 74 tal como se muestra en la Tabla 2.
Otra modalidad proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste básicamente o consiste en un ácido nucleico que codifica una secuencia de ácidos nucleicos de VH idéntica o idéntica excepto por una dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácidos a una o más de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 74 tal como se muestra en la Tabla 2.
Otra modalidad adicional proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste básicamente o consiste en un ácido nucleico que codifica una VH, en donde una o más de las regiones VHCDR1, VHCDR2 o VHCDR3 de la VH son idénticas, o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos, a una o más secuencias de aminoácidos de VHCDR1, VHCDR2 y/o VHCDR3 de cadena pesada de referencia de una o más de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 74 tal como se muestra en la Tabla 2.
Otra modalidad proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste básicamente o consiste en un ácido nucleico que codifica una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Pls de Pseudomonas que comprende una VH, en donde una o más de las regiones VHCDR1, VHCDR2 o VHCDR3 de la VH son idénticas, o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos, a una o más secuencias de aminoácidos de VHCDR1 , VHCDR2 y/o VHCDR3 de cadena pesada de referencia de una o más de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 74 tal como se muestra en la Tabla 2.
Una modalidad adicional proporciona una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende la VH codificada por el polinucleótido que específicamente o preferiblemente se une a Psl de Pseudomonas.
Otra modalidad proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste básicamente o consiste en un ácido nucleico que codifica una secuencia de ácidos nucleicos de la región variable de cadena liviana (VL) de inmunoglobulina al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idéntica a una o más de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 16 tal como se muestra en la Tabla 2.
Una modalidad adicional proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste básicamente o consiste en un ácido nucleico que codifica una secuencia de ácidos nucleicos de VL idéntica o idéntica excepto por una dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácidos a una o más de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO : 14, o SEQ ID NO: 16 tal como se muestra en la Tabla 2.
Otra modalidad proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste básicamente o consiste en un ácido nucleico que codifica una VL, en donde una o más de las regiones VLCDRl, VLCDR2 o VLCDR3 de la VL son al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idénticas a una o más secuencias de aminoácidos de VLCDRl, VLCDR2 y/o VLCDR3 de cadena liviana de referencia de una o más de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 tal como se muestra en la Tabla 2.
Una modalidad adicional proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste básicamente o consiste en un ácido nucleico que codifica una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a Pls de Pseudomonas que comprende una VL, en donde una o más de las regiones VLCDRl, VLCDR2 o VLCDR3 de la VL son idénticas, o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos, a una o más secuencias de aminoácidos de VLCDRl, VLCDR2 y/o VLCDR3 de cadena pesada de referencia de una o más de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 tal como se muestra en la Tabla 2.
Una otra modalidad se proporciona una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende la VL codificada por el polinucleótido que específicamente o preferiblemente se une a Psl de Pseudomonas .
Otra modalidad proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste básicamente o consiste en un ácido nucleico que codifica una molécula de scFv que incluye una VH y una VL, en donde la scFv es al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idéntica a una o más de SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70 tal como se muestra en la Tabla 4.
TABLA 4: Secuencias de ácidos nucleicos de scFv de referencia En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígenos del mismo codificado por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente, que se une específicamente a Psl de Pseudomonas, comprende, consiste esencialmente o consiste en secuencias de aminoácidos de VH y VL al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idénticas a: (a) SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, (b) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, (c) SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 2 , respectivamente , (d) SEQ ID NO: 5 y SEQ ID "NO: 6 , respectivamente , (e) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO : 8 , respectivamente , (f) SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente , (g) SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 , respectivamente , (h) SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, respectivamente ; (i) SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente o (j) SEQ ID NO 74 y SEQ ID NO: 12, respectivamente .
En ciertas modalidades, una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo, codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente, se une específicamente a Psl de Pseudomonas con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10~2 M, 10~2 M, 5 x 10"3 M, 10"3 M, 5 X 10~4 M, 10"4 M, 5 x 10"5 M, 10"5 M, 5 x 10"6 M, 10"6 , 5 x 10"7 M, 10"7 M, 5 x 10"8 M, 10"8 M, 5 x 10~9 M, 109 M, 5 x 10"10 M, 10"10 M, 5 x 10"11 M, 10"11 M, 5 x 10~12 M, 10"12 M, 5 x 10"13 M, 10"13 M, 5 x 10~14 M, 10"14 M, 5 x 10"15 M o 10"15 M.
En modalidades específicas, una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo, codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente, se une específicamente a Psl de Pseudomonas con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) en un intervalo de aproximadamente 1 x 10"10 a aproximadamente 1 x 10"6 M. En una modalidad, una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo, codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente, se une específicamente a Psl de Pseudomonas con una afinidad caracterizada por una KD de aproximadamente 1.18 x 10~7 M, según se determinó mediante el ensayo de unión OCTET descrito en la presente. En otra modalidad, una molécula de unión aislada, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo, codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente, se une específicamente a Psl de Pseudomonas con una afinidad caracterizada por una KD de aproximadamente 1.44 x 10"7 M, según se determinó mediante el ensayo de unión OCTET descrito en la presente.
En ciertas modalidades, una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente, se une específicamente al mismo epítopo de Psl como un anticuerpo monoclonal WapR-004, WapR-004RAD, Cam-003, Cam-004 o Cam-005 o inhibirá de forma competitival anticuerpo monoclonal de unirse a Psl de Pseudomonas. WapR-004RAD es idéntico a WapR-004 excepto por una sustitución de ácido nucleico de G293C de la secuencia de ácido nucleico de VH que codifica la secuencia de aminoácidos de VH de la SEQ ID NO: 11 (una sustitución del nucleótido en la porción que codifica VH de la SEQ ID NO: 71 en la posición 317) . La secuencia de ácido nucleico que codifica el VH de WapR-004RAD se presenta como la SEQ ID NO 76.
Algunas modalidades proporcionan un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente o consiste en un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la molécula de scFv-Fc mutante W4 idéntica o idéntica excepto por una, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácidos a una o más de: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO : 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 o SEQ ID NO: 146.
Otras modalidades proporcionan un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente o consiste en un ácido nucleico que codifica una molécula de scFv-Fc mutante 4 al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idéntica a una o más de: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO : 140, SEQ ID NO : 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 o SEQ ID NO: 146.
Otras modalidades proporcionan un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente o consiste en un ácido nucleico que codifica una molécula de scFv-Fc mutante W4 al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idéntica a una o más de SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151 O SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID. NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214 O SEQ ID NO : 215.
En otras modalidades, una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente, se une específicamente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal WapR-001, WapR-002 o WapR-003 o inhibirá de forma competitival anticuerpo monoclonal de unirse a Psl de Pseudomonas.
En ciertas modalidades, una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente, se une específicamente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal WapR-016 o inhibirá de forma competitival anticuerpo monoclonal de unirse a Psl de Pseudomonas.
La descripción también incluye fragmentos de los polinucleótidos como se describe en otra parte en la presente. También se proporcionan polinucleótidos que codifican los polinucleótidos de fusión, fragmentos Fab y otros derivados, tal como se describe en la presente.
Los polinucleótidos pueden producirse o fabricarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, si la secuencia de nucleótidos del anticuerpo es conocida, un polinucleótido que codifica el anticuerpo puede ensamblarse a partir de oligonucleótidos químicamente sintetizados (por ejemplo, como se describe en Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)), que, brevemente, implica la síntesis de superponer oligonucleótidos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, aparear y ligar estos oligonucleótidos y luego amplificar los oligonucleótidos ligados por PCR.
Alternativamente, un polinucleótido que codifica una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo puede generarse a partir de ácido nucleico de una fuente adecuada. Si un clon que contiene un ácido nucleico que codifica un anticuerpo particular no está disponible, pero la secuencia de la molécula de anticuerpo es conocida, un ácido nucleico que codifica el anticuerpo puede químicamente sintetizarse u obtenerse de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpos o una biblioteca de ADNc generada de, o ácido nucleico, preferiblemente poli A+ARN, aislado de cualquier tejido o células que expresen el anticuerpo o tal como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo) mediante amplificación por PCR utilizando cebadores sintéticos hibridables en los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante clonación utilizando una sonda de oligonucleótidos específica para la secuencia de genes particulares para identificar, por ejemplo, un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden entonces clonarse en vectores de clonación replicables utilizando cualquier método conocido en la técnica.
Una vez que se determina la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente de una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, su secuencia de nucleótidos puede manipularse utilizando métodos conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante , mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) y Ausubel et al., eds . , Currenfc Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998) , que se incorporan a modo de referencia en la presente en su totalidad) , para generar anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo para crear sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos.
Un polinucleótido que codifica una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo puede estar compuesto por cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que pueden ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo puede estar compuesto por ADN de una sola y doble hebra, ADN que es una mezcla de regiones de una sola y doble hebra, ARN de una sola y doble hebra y ARN que es una mezcla de regiones de una sola y doble hebra, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que puede ser de una sola hebra o, más típicamente, de doble hebra o una mezcla de regiones de una sola y doble hebra. Además, un polinucleótido que codifica una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo puede estar compuesto por regiones de triple hebra que comprenden ARN o ADN o ambas ARN y ADN. Un polinucleótido que codifica una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo también puede contener una o más bases modificadas o estructuras principales de ADN o ARN modificadas para estabilidad o para otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Una variedad de modificaciones pueden realizarse a ADN y ARN; por lo tanto el "polinucleótido" comprende formas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente modificadas.
Un polinucleótido aislado que codifica una variante no natural de un polipéptido derivado de una inmunoglobulina (por ejemplo, una porción de cadena pesada o porción de cadena liviana de inraunoglobulina) puede crearse mediante la introducción de una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de la inmunoglobulina de modo tal que una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos se introducen en la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse mediante técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se realizan en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales.
VI. EXPRESIÓN DE POLIPEPTIDOS DE ANTICUERPOS Es bien sabido que el ARN puede aislarse de las células de hibridoma originales o de otras células transformadas mediante técnicas estándar, tales como extracción de isocianato de guanidinio y precipitación seguida por la centrifugación o cromatografía. Cuando es deseable, el ARNm puede aislarse del ARN total mediante técnicas estándar tales como cromatografía en oligo dT celulosa. Las técnicas adecuadas son conocidas en la técnica.
En una modalidad, los ADNc que codifican las cadenas liviana y pesada de la molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas , por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo puede realizarse, ya sea simultáneamente o separadamente, utilizando transcriptasa inversa y polimerasa de ADN de acuerdo con métodos conocidos. La PCR puede iniciarse mediante cebadores de región constante de consenso o mediante cebadores más específicos en base al ADN de cadena pesada y liviana publicado y secuencias de aminoácidos. Como se planteó anteriormente, la PCR también puede utilizarse para aislar clones de ADN que codifican las cadenas liviana y pesada de anticuerpos. En este caso las bibliotecas pueden evaluarse mediante cebadores de consenso o sondas homologas más grandes, tales como sondas de región constante de ratón.
El ADN, típicamente ADN plasmídico, puede aislarse de las células utilizando técnicas conocidas en la técnica, mapeo por restricción y secuenciado de acuerdo con técnicas conocidas estándar establecidas en detalle, por ejemplo, en las referencias precedentes que se refieren a técnicas de ADN recombinante . Por supuesto, el ADN puede ser sintético de acuerdo con la presente descripción en cualquier punto durante del proceso de aislamiento o análisis posterior.
Luego de la manipulación del material genético aislado para proporcionar una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo de la descripción, los polinucleótidos que codifican moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas están típicamente insertados en un vector de expresión para la introducción en células hospederases que pueden utilizarse para producir la cantidad deseada de moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas.
La expresión recombinante de un anticuerpo o fragmento, derivado o análogo del mismo, por ejemplo, una cadena pesada o liviana que se une a una molécula objetivo descrita en la presente, por ejemplo, Psl, requiere la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo. Una vez que se obtiene un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o liviana de un anticuerpo o porción del mismo (que contiene el dominio variable de cadena pesada o liviana) de la descripción, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede producirse mediante la tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas conocidas en la técnica. Por lo tanto, los métodos para preparar una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica anticuerpos se describen en la presente. Los métodos que son conocidos para un experto en la técnica pueden utilizarse para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican anticuerpos y señales de control transcripcionales y translacionales apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Por lo tanto, la descripción proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica una molécula de anticuerpos de la descripción o una cadena pesada o liviana de la misma o un dominio variable de cadena pesada o liviana, unido operativamente a un promotor. Los vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpos (ver, por ejemplo, Publicación PCT WO 86/05807; Publicación PCT WO 89/01036 y Patente de los Estados Unidos No. 5,122,464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en el vector para la expresión de la cadena pesada o liviana entera.
El término "vector" o "vector de expresión" que se utiliza en la presente significa vectores utilizados de acuerdo con la presente descripción como un vehículo para introducirse en y expresar un gen deseado en una célula hospedera. Como saben los expertos en la técnica, los vectores pueden seleccionarse fácilmente del grupo que consiste en plásmidos, bacteriófagos, virus y retrovirus. En general, los vectores compatibles con la presente descripción comprenderán un marcador de selección, sitios de restricción apropiados para facilitar la clonación del gen deseado y la capacidad de ingresar y/o duplicarse en células eucariotas o procariotas.
A los efectos de la presente descripción, pueden emplearse numerosos sistemas de vectores de expresión. Por ejemplo, una clase de vector utiliza elementos de ADN que derivan de virus animal tal como el virus del papiloma bovino, polyomavirus , adenovirus, virus Vaccinia, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV ó MOMLV) o virus SV40. Otros implican el uso de sistemas policistrónicos con sitios de unión a ribosomas internos. Adicionalmente , las células que han integrado el ADN en sus cromosomas pueden seleccionarse mediante la introducción de uno o más marcadores que permiten la selección de células hospederases transfectadas . El marcador puede proporcionar prototrofía a un huésped auxotrófico, resistencia a biocidas (por ejemplo, antibióticos) o resistencia a metales pesados tales como cobre. El gen marcador seleccionable puede estar directamente unido a las secuencias de ADN a expresar o introducido en la misma célula mediante cotransformación . También pueden ser necesarios elementos adicionales para síntesis óptima de ARNm. Estos elementos pueden incluir secuencias de señal, señales de empalme, así como promotores de transcripción, potenciadores y señales de terminación.
En algunas modalidades los genes de la región variable clonados se insertan en un vector de expresión junto con los genes de la región constante de cadena pesada y liviana (por ejemplo, humanos) sintéticos como se planteó anteriormente. Por supuesto, cualquier vector de expresión que es capaz de provocar una expresión en células eucariotas puede utilizarse en la presente descripción. Ejemplos de vectores adecuados incluyen, a modo no taxativo, los plásmidos pcDNA3 , pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER- HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl y pZeoSV2 (disponibles por Invitrogen, San Diego, CA) y el plásmido pCI (disponible por Promega, Madison, WI) . En general, detectar una gran cantidad de células transformadas para aquellas que expresan niveles altos de manera adecuada de las cadenas de inmunoglobulina pesada y liviana es un experimento de rutina que puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante sistemas robóticos.
Más generalmente, una vez que se ha preparado el vector o secuencia de ADN que codifica una subunidad monomérica de la molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo de la descripción, el vector de expresión puede introducirse en una célula hospedera apropiada. La introducción del plásmido en la célula hospedera puede lograrse mediante varias técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Estos incluyen, a modo no taxativo, transfección (incluyendo electroforesis y electroporación) , fusión de protoplastos , precipitación de fosfato de calcio, fusión celular con ADN encapsulado, microinyección e infección con virus intacto. Ver, Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Vectors, Rodríguez y Denhardt, Eds . , Butterworths, Boston, Mass., Capítulo 24.2, páginas 470-472 (1988) . Típicamente, la introducción de plásmidos en el huésped se realiza a través de electroporación. Las células hospederases que alojan el constructo de expresión se cultivan bajo condiciones apropiadas para la producción de las cadenas ligeras y cadenas pesadas y se someten a ensayo para síntesis de proteína de cadena pesada y/o liviana. Las técnicas de ensayo ejemplares incluyen ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) , radioinmunoensayo (RIA) o análisis mediante clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) , inmunohistoquímica y similares.
El vector de expresión se transfiere a una célula hospedera mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan entonces mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo para su uso en los métodos descritos en la presente. Por lo tanto, la descripción incluye células hospederases que contienen un polinucleótido que codifica una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, o una cadena pesada o liviana de la misma, unida operativamente a un promotor heterogéneo. En algunas modalidades, para la expresión de anticuerpos de cadena doble, los vectores que codifican las cadenas pesadas y ligeras pueden coexpresarse en la célula hospedera para la expresión de toda la molécula de inmunoglobulina, tal como se detalla a continuación.
Ciertas modalidades incluyen un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica las VL y VL descritas anteriormente, en donde una molécula de unión o fragmento de unión a antígenos de la misma expresada por el polinucleótido se une específicamente a Psl de Pseudomonas . En algunas modalidades, el polinucleótido tal como se describe en la presente codifica una molécula de scFv que incluye VH y VL, al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idéntica a una o más de las SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70 como se muestra en la Tabla 4.
Algunas modalidades incluyen vectores que comprenden los polinucleótidos descritos anteriormente. En modalidades adicionales, los polinucleótidos están operativamente asociados con un promotor. En modalidades adicionales, la descripción proporciona células hospederases que comprenden los vectores. En modalidades adicionales, la descripción proporciona vectores en los que el polinucleótido está asociado operativamente con un promotor, en donde los vectores pueden expresar una molécula de unión que se une específicamente a Psl de Pseudomonas en una célula hospedera adecuada .
También se proporciona un método de producción de una molécula de unión o fragmento de la misma que se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende cultivar una célula hospedera que contiene un vector que comprende los polinucleótidos descritos anteriormente y recuperar el anticuerpo o fragmento del mismo. En modalidades adicionales, la descripción proporciona una molécula de unión aislada o fragmento de la misma producida por el método descrito anteriormente.
Tal como se utiliza en la presente, "célula hospedera" se refiere a células que alojan vectores construidos utilizando técnicas de ADN recombinante y codificando al menos un gen heterólogo. En descripciones de procesos para el aislamiento de anticuerpos de huéspedes recombinantes , los términos "célula" y "cultivo celular" se utilizan de manera intercambiable para denotar la fuente de anticuerpos a menos que se especifique claramente de otro modo. En otras palabras, la recuperación del polipéptido de las "células" puede significar ya sea de centrifugar las células enteras o del cultivo celular que contiene el medio y las células suspendidas .
Puede utilizarse una variedad de sistemas de vectores de expresión de huéspedes para expresar moléculas de anticuerpos para su uso en los métodos descritos en la presente. Los sistemas de expresión de huéspedes representan vehículos mediante los cuales las secuencias de codificación de interés pueden producirse y posteriormente purificarse, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias de codificación de nucleótidos apropiadas, expresar una molécula de anticuerpo de la descripción in situ. Estas incluyen a modo no taxativo microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con ADN bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o vectores de expresión de ADN cósmido que contienen secuencias de codificación de anticuerpos; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen secuencias de codificación de anticuerpos; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias de codificación de anticuerpos; sistemas de células de plantas infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus del mosaico de coliflor, CaMV; virus del mosaico de tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias de codificación de anticuerpos o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BLK, 293, 3T3) que alojan constructos de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia) . Las células bacterianas tales como Escherichia coli o células eucariotas, especialmente para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante entera, se utilizan para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante . Por ejemplo, las células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) , en conjunto con un vector tal como el elemento promotor del gen temprano intermedio principal del citomegalovirus es un sistema de expresión efectivo para los anticuerpos (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).
La línea celular huésped utilizada para la expresión de proteínas es a menudo de origen mamífero; los expertos en la técnica comprenderán determinar las líneas celulares huésped que son más adecuadas para el producto génico deseado para expresarlo en la misma. Líneas celulares huésped ejemplares incluyen, a modo no taxativo, CHO (ovario de hámster chino) DG44 y DUXB11 (líneas de ovario de hámster chino, DHFR menos) , HELA (carcinoma cervical humano) , CVI (línea de riñon de mono), COS (un derivado de CVI con el antígeno SV40 T) , VERY, BHK (riñon de hámster bebé) , MDCK, 293, WI38, R1610 (fibroblastos de hámster chino) BALBC/3T3 (fibroblastos de ratón), HAK (línea de riñon de hámster), SP2/0 (mieloma de ratón), P3x63 -Ag3.653 (mieloma de ratón), BFA-lclBPT (células endoteliales bovinas) , RAJI (linfocito humano) y 293 (riñon humano) . Las líneas celulares huésped están típicamente disponibles en servicios comerciales, la American Tissue Culture Collection o la bibliografía publicada.
Además, puede elegirse una cepa de célula hospedera que modula la expresión de las secuencias insertadas o modifica y procesa el producto génico en la forma deseada específica. Las modificaciones (por ejemplo, glicosilacion) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de los productos de proteína pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células hospederases tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postranslacional de las proteínas y los productos génicos. Pueden seleccionarse líneas celulares o sistemas huéspedes apropiados para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína ajena expresada. Con este propósito, pueden utilizarse células hospederases eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcripto primario, la glicosilacion y la fosforilación del producto génico.
Para una producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes , es preferida la expresión estable Por ejemplo, pueden manipularse líneas celulares que expresan de manera estable la molécula de anticuerpo. En lugar de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes virales de duplicación, las células hospederases pueden transformarse con ADN controlado mediante elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo., promotor, mejorador, secuencias, terminadores de sitios de transcripción, poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable . Tras la introducción del ADN ajeno, las células manipuladas pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido y luego cambiarse a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células se integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para que formen focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método puede utilizarse de manera ventajosa para manipular líneas celulares que expresan de forma estable la molécula de anticuerpo .
Puede utilizarse una cantidad de sistemas de selección, incluyendo, a modo no taxativo, los genes de timidina cinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Cell 11:223 (1977) ) , fosforribosiltransferasa de hipoxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)) y fosforribosiltransferasa de adenina (Lowy et al., Cell 22:817 1980) pueden emplearse en células tk- , hgprt- o aprt-, respectivamente. También puede utilizarse la resistencia a antimetabolitos como la base de la selección para los siguientes genes; dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., Nati. Acad. Sci. USA 77:357 (1980) ; O'Hare et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981) ); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol . Toxicol . 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993);, TIB TECH 11 (5) : 155-215 (May, 1993); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984). Métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de ADN recombinantes que pueden utilizarse se describen en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993) ; Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990) y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994) ; Colberre-Garapin et al., J". Mol. Biol . 150:1 (1981), que se incorporan a modo de referencia a la presente en su totalidad.
Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden aumentarse mediante una amplificación del vector (por un informe, ver Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol . 3. (1987)) . Cuando un marcador en el sistema de vectores que expresa anticuerpos es amplificable , un aumento en el nivel de inhibidor presente en un cultivo de células hospederases aumenta la cantidad de copias del gen marcador.
Ya que la región amplificada está asociada con el gen de anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará (Crouse et al., Mol. Cell. Biol . 3:257 (1983)).
La producción in vitro permite un aumento para proporcionar cantidades grandes de los polipéptidos deseados. Las técnicas para el cultivo de células de mamífero en condiciones de cultivo de tejido son conocidas en la técnica e incluyen un cultivo de suspensión homogénea, por ejemplo, en un reactor de elevación con aire o en un reactor de agitación continua o cultivo de células encapsuladas o cultivo de células inmovilizado o atrapado, por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas , en microperlas de agarosa o cartuchos de cerámica. Si es necesario y/o deseado, las soluciones de los polipéptidos pueden purificarse mediante los métodos de cromatografía habituales, por ejemplo, filtración en gel, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía sobre la celulosa DEAE o cromatografía de ( inmuno) -afinidad, por ejemplo, después de una biosíntesis preferencial de un polipéptido de una región bisagra sintética o antes o después de la etapa de cromatografía HIC descrita en la presente.
Los constructos que codifican moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos, tal como se describen en la presente, también pueden expresarse en células que no son de mamíferos tales como células de bacterias o levadura o plantas. Las bacterias que fácilmente absorben ácidos nucleicos incluyen miembros de la las enterobacteriaceae como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tal como Bacillus subtilis; Pneumococcus,- Streptococcus y Haemophilus influenzae . Se apreciará además que, cuando se expresan en bacterias, los polipéptidos heterólogos típicamente se vuelven parte de cuerpos de inclusión. Los polipéptidos heterólogos deben aislarse, purificarse y luego ensamblarse en moléculas funcionales. Cuando las formas tetravalentes de anticuerpos son deseadas, las subunidades se auto-ensamblarán en anticuerpos tetravalentes (WO02/096948A2 ) .
En sistemas bacterianos, una cantidad de vectores de expresión pueden seleccionarse de manera ventajosa dependiendo del uso pretendido para la molécula de anticuerpo que se está expresando. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de la proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, los vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifican fácilmente pueden ser deseables. Los vectores incluyen, a modo no taxativo, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)), en el cual la secuencia que codifica anticuerpos puede ligarse individualmente en el vector en el marco con la región de codificación de lacZ de modo que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol . Chem. 24:5503-5509 (1989)) y similares. Los vectores pGEX también pueden utilizarse para expresar polipéptidos ajenos como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST, por sus siglas en inglés) . En general, las proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante la adsorción y unión a perlas de glutatión-agarosa en una matriz seguido por la elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir trombina o sitios de escisión de proteasa del factor Xa de modo que el producto génico clonado puede liberarse del resto de GST.
Además de las procariotas, también pueden utilizarse microbios eucariotas . Saccharomyces cerevisiae o la levadura de cerveza común, es la más utilizada entre los microorganismos eucariotas, aunque existe una cantidad de otras cepas comúnmente disponibles, por ejemplo, Pichia pastoris .
Para la expresión en Saccharomyces, el plásmido Y p7, por ejemplo, (Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene 10:157 (1980)) se utiliza comúnmente. Este plásmido ya contiene el gen TRP1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 (1977)). La presencia de la lesión trpl como una característica del genoma de la célula hospedera de levadura proporciona entonces un ambiente efectivo para la detección de la transformación mediante el crecimiento en ausencia de triptófano.
En un sistema de insectos, el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se utiliza típicamente como un vector para expresar genes ajenos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica anticuerpos puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de poliedrina) del virus y ubicarse bajo el control de un promotor AcNPV (por ejemplo el promotor de poliedrina) .
Una vez que la molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, tal como se describe en la presente se ha expresado de manera recombinante, puede purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio de iones, particularmente mediante afinidad para el antígeno específico después de la proteína A y cromatografía de columna de tamaño) , centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Otro método para aumentar la afinidad de anticuerpos de la descripción se describe en US 2002 0123057 Al.
VII. IDENTIFICACIÓN DE MOLÉCULAS DE UNIÓN INDIFERENTES A SEROTIPOS La descripción abarca un abordaje de célula entera indiferente objetivo para identificar moléculas de unión terapéuticas independientes de serotipo, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos con actividades terapéuticas superiores o deseadas. El método puede utilizarse para identificar las moléculas de unión que pueden antagonizar, neutralizar, quitar o bloquear una actividad no deseada de un agente infeccioso, por ejemplo, un patógeno bacteriano. Como se conoce en la técnica, muchos agentes infecciosos exhiben una variación importante en sus antígenos de superficie dominante, permitiéndoles evadir la vigilancia inmune. El método de identificación descrito en la presente puede identificar moléculas de unión que se dirigen a antígenos que se comparten entre muchas especies de Pseudomonas diferentes u otros patógenos Gram negativos, por lo tanto proporcionando un agente terapéutico que puede dirigirse a múltiples patógenos de múltiples especies. Por ejemplo, el método se utilizó para identificar una serie de moléculas de unión que se unen a la superficie de P. aeruginosa en un modo independiente de serotipo y cuando están unidas a los patógenos bacterianos, median, promueven o mejoran la actividad opsonofagocítica (OPK) en contra de las células bacterianas tales como patógenos bacterianos, por ejemplo, especies de Pseudomonas oportunistas (por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida y Pseudomonas alcaligenes) y/o inhiben la unión de las células bacterianas a células epiteliales.
Ciertas modalidades describen un método para identificar moléculas de unión indiferentes a serotipos que comprenden: (a) preparar bibliotecas de anticuerpos sin tratamiento previo y/o convalecientes en bacteriófagos, (b) retirar anticuerpos específicos de serotipos de la biblioteca mediante cribado de reducción, (c) detectar la biblioteca para anticuerpos que se une específicamente a células enteras independientemente del serotipo y (d) detectar los anticuerpos resultantes para propiedades funcionales deseadas.
Ciertas modalidades proporcionan un abordaje de detección fenotípica de célula entera tal como se describe en la presente con bibliotecas de bacteriófagos de anticuerpo derivadas de pacientes convalecientes inactivados o infectados por P. aeruginosa . Utilizando una estrategia de cribado que inicialmente selecciona contra reactividad específica a serotipos, se aislan los diferentes clones que se unieron a las células enteras de P. aeruginosa. Los clones seleccionados se convirtieron en anticuerpos de IgGl humana y se confirmó que reaccionan con aislados clínicos de P. aeruginosa independientemente de la clasificación del serotipo o sitio de aislamiento de tejido (Ver Ejemplos). Los ensayos de actividad funcional descritos en la presente indicaron que los anticuerpos fueron efectivos en prevenir la unión de P. aeruginosa a células de mamífero y mediaron la destrucción opsonofagocítica (OPK) de un modo dependiente de la concentración e independiente del serotipo.
En modalidades adicionales, las moléculas de unión descritas anteriormente o fragmentos de las mismas, anticuerpos o fragmentos de los mismos, o composiciones, se unen a dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más serotipos de P. aeruginosa diferentes, o a al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% de cepas de P. aeruginosa aisladas de pacientes infectados. En modalidades adicionales, las cepas de P. aeruginosa se aislan de uno o más de pulmón, esputo, ojo, pus, heces, orina, senos, una herida, piel, sangre, hueso o fluido de rodilla.
VIII. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS QUE COMPRENDEN MOLÉCULAS DE UNIÓN ANTI-PSL DE PSEUDOMONAS Las composiciones farmacéuticas utilizadas en la presente descripción comprenden portadores farmacéuticamente aceptables conocidos para los expertos en la técnica. Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Ciertas composiciones farmacéuticas tal como se describen en la presente pueden administrarse oralmente en una forma de dosificación aceptable incluyendo, por ejemplo, cápsulas, comprimidos, suspensiones acuosas o soluciones. Ciertas composiciones farmacéuticas también pueden administrarse mediante aerosol nasal o inhalación. Conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes y gases inertes y similares también pueden estar presentes. Formulaciones adecuadas para su uso en los métodos terapéuticos descritos en la presente se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 16th ed. (1980) .
La cantidad de una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, que puede combinarse con los materiales portadores para producir una única forma de dosificación variará dependiendo del huésped tratado y del modo particular de administración. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar una respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Las composiciones también pueden comprender las moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos, dispersas en un material portador que funciona como un sistema de administración o soporte adecuado para los compuestos.
IX. ÉTODOS DE TRATAMIENTO UTILIZANDO MOLÉCULAS DE UNIÓN TERAPÉUTICAS Los métodos para preparar y administrar una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, tal como se describe en la presente a un sujeto que la necesita son conocidos o se determinan fácilmente por los expertos en la técnica. La vía de administración de la molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, puede ser, por ejemplo, oral, parenteral, mediante inhalación o tópica. El término parenteral tal como se utiliza en la presente incluye, por ejemplo, administración intravenosa, intraarterial , intraperitoneal , intramuscular o subcutánea. Una forma adecuada para la administración sería una solución para inyección, en particular para una inyección intravenosa o intraarterial o goteo. Sin embargo, en otros métodos compatibles con las enseñanzas en la presente, una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, tal como se describe en la presente puede administrarse directamente al sitio de la población celular adversa, por ejemplo, una infección que aumenta así la exposición del tejido enfermo al agente terapéutico. Por ejemplo, una molécula de unión anti-Psl de Pseudomonas puede administrarse directamente al tejido ocular, lesión por quemadura o tejido de los pulmones.
Las moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos, tal como se describe en la presente pueden administrarse en una cantidad farmacéuticamente efectiva para el tratamiento in vivo de la infección por Pseudomonas. En este sentido, se apreciará que las moléculas de unión describedas se formularán de modo de facilitar la administración y promover la estabilidad del agente activo. A los efectos de la presente solicitud, una cantidad farmacéuticamente efectiva se considerará que significa una cantidad suficiente para alcanzar la unión efectiva a un objetivo y que alcanza un beneficio, por ejemplo, tratar, mejorar, disminuir, aclarar o prevenir una infección por Pseudomonas.
Algunas modalidades están dirigidas a un método para prevenir o tratar una infección por Pseudomonas en un sujeto que lo necesita que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de la molécula de unión o fragmento de la misma, el anticuerpo o fragmento del mismo, la composición, el polinucleótido, el vector o la célula hospedera descritos en la presente. En modalidades adicionales, la infección por Pseudomonas es una infección por P. aeruginosa. En algunas modalidades, el sujeto es un humano. En ciertas modalidades, la infección es una infección ocular, una infección pulmonar, una infección por quemaduras, una infección de herida, una infección en la piel, una infección en la sangre, una infección en los huesos o una combinación de dos o más de las infecciones. En modalidades adicionales, el sujeto padece neumonía, lesión de quemaduras, infección de la córnea, fibrosis quística o una combinación de éstas.
Ciertas modalidades están dirigidas a un método para bloquear o prevenir la unión de P. aeruginosa a células epiteliales que comprende poner en contacto una mezcla de células epiteliales y P. aeruginosa con la molécula de unión o fragmento de la misma, el anticuerpo o fragmento del mismo, la composición, el polinucleótido, el vector o la célula hospedera descrita en la presente.
También se describe un método para mejorar la OPK de P. aeruginosa que comprende poner en contacto una mezcla de células fagocíticas y P. aeruginosa con la molécula de unión o fragmento de la misma, el anticuerpo o fragmento del mismo, la composición, el polinucleótido, el vector o la célula hospedera descritos en la presente. En modalidades adicionales, las células fagocíticas son células HL-60 diferenciadas o leucocitos polimorfonucleares (PMN) humanos.
De acuerdo con el alcance de la descripción, las moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos, pueden administrarse a un humano u otro animal de acuerdo con los métodos antemencionados de tratamiento en una cantidad suficiente para producir un efecto terapéutico. Las moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos, descritos en la presente pueden administrarse al humano u otro animal en una forma de dosificación convencional preparada mediante la combinación del anticuerpo de la descripción con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable convencional de acuerdo con técnicas conocidas.
Las dosis efectivas de las composiciones de la presente descripción para el tratamiento de la infección por Pseudomonas varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administración, sitio objetivo, estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Generalmente, el paciente es un humano pero los mamíferos no humanos incluyendo mamíferos transgénicos también pueden ser tratados. Las dosis de tratamiento pueden titularse utilizando métodos de rutina conocidos para los expertos en la técnica para optimizar la seguridad y eficacia.
Las moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos pueden administrarse en múltiples ocasiones a varias frecuencias dependiendo de varios factores conocidos para los expertos en la técnica. Alternativamente, las moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de la misma pueden administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente.
Las composiciones de la descripción pueden administrarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, parenteralmente, intraventricularmente , oralmente, mediante pulverización para inhalación, tópicamente, rectalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente o mediante una reserva implantada. El término "parenteral " , tal como se utiliza en la presente incluye inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial , intrasternal , intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal o técnicas de infusión.
X. INMUNOENSAYOS Las moléculas de unión anti-Psl de Pseudomonas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos, pueden someterse a ensayo para una unión inmunoespecífica mediante cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que pueden utilizarse incluyen a modo no taxativo sistemas de ensayo competitivos y no competitivos utilizando técnicas tales como western blots, radioinmunoanálisis , ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción), inmunoensayos "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión de gel, análisis de inmunodifusión, análisis de aglutinación, ensayos de fijación de complemento, análisis inmunorradiométricos , inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, entre otros. Los ensayos son de rutina y conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John iley & Sons, Inc., New York, Vol . 1 (1994), que se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad) . Los inmunoensayos ejemplares se describen brevemente a continuación (pero no pretenden ser taxativos) .
Existe una variedad de métodos disponibles para medir la afinidad de una interacción anticuerpo-antígeno, pero relativamente pocos para determinar constantes de tasa. La mayoría de los métodos se basan en etiquetar el anticuerpo o antígeno, lo que inevitablemente complica las mediciones de rutina e introduce incertidumbres en las cantidades medidas. La afinidad del anticuerpo puede medirse mediante distintos métodos, incluyendo OCTET®, BIACORE®, ELISA y FACS .
® El sistema OCTET utiliza biosensores en un formato de placa de 96 pocilios para reportar análisis cinético. Los eventos de unión y disociación de proteínas pueden monitorearse mediante la medición de la unión de una proteína en solución a una segunda proteína inmovilizada en el biosensor FortéBio. En el caso de medir la unión de anticuerpos anti-Psl a Psl, el Psl se inmoviliza en puntas OCTET con posterior análisis de unión del anticuerpo, que se encuentra en solución. La asociación y disociación del anticuerpo para Psl inmovilizado se detecta entonces mediante el instrumento sensor. Los datos se recogen y exportan entonces a GraphPad Prism para un ajuste a la curva de afinidad.
La resonancia de plasmones superficiales (SPR) realizada en BIACORE° ofrece una cantidad de ventajas con respecto a métodos convencionales para medir la afinidad de interacciones anticuerpo-antígeno : (i) no requiere etiquetar el anticuerpo ni el antígeno; (ii) los anticuerpos no necesitan purificarse por adelantado, el sobrenadante de cultivo celular puede utilizarse directamente; (iii) se permiten mediciones en tiempo real que permiten una comparación rápida semi-cuantitativa de diferentes interacciones de anticuerpo monoclonal, y son suficientes para muchos propósitos de evaluación; (iv) la superficie bioespecífica puede regenerarse de modo que una serie de diferentes anticuerpos monoclonales pueden compararse fácilmente en condiciones idénticas; (v) los procedimientos analíticos son completamente automatizados y puede realizarse una extensiva serie de mediciones sin la intervención del 1 1 usuario. BIAapplications Handbook, versión AB (reimpresa 1998), BIACORE8" código No. BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, versión AB (reimpresa 1998), BIACORE* código No. BR-1001-84.
Los estudios de unión en base a SPR requieren que un miembro de un par de unión se inmovilice en una superficie del sensor. La pareja de unión inmovilizada se denomina el ligando. La pareja de unión en solución se denomina el analito. En algunos casos, el ligando está unido indirectamente a la superficie a través de la unión a otra molécula inmovilizada, que se denomina la molécula de captura. La respuesta de SPR refleja un cambio en la concentración de masa en la superficie del detector mientras los analitos se unen o disocian.
® En base a SPR, las mediciones de BIACORE en tiempo real monitorean interacciones directamente mientras van sucediendo. La técnica es adecuada para la determinación de parámetros cinéticos. El ranking de afinidad comparativo es extremadamente simple de realizar y ambas constantes cinética y de afinidad puede derivarse de los datos del sensorgrama.
Cuando un analito se inyecta en un pulso discreto en toda una superficie de ligando, el sensorgrama resultante puede dividirse en tres fases esenciales: (i) Asociación del analito con ligando durante una inyección de muestra; (ii) Estado de equilibrio o estacionario durante la inyección de muestra, donde la tasa de unión de analitos se equilibra mediante la disociación del complejo; (iii) Disociación del analito desde la superficie durante el flujo de solución amortiguadora .
Las fases de asociación y disociación proporcionan información sobre la cinética de la interacción analito-ligando (ka y kd, las tasas de formación y disociación del complejo, kd/ka = D) . La fase de equilibrio proporciona información sobre la afinidad de la interacción analito-ligando (KD) .
El programa informático BIAevaluation proporciona recursos integrales para el ajuste de la curva utilizando integración numérica y algoritmos de ajuste global. Con un análisis adecuado de los datos, la tasa separada y constantes de afinidad para la interacción pueden obtenerse de investigaciones de BIACORE8 simples. El intervalo de afinidades mensurables mediante esta técnica es muy amplio en un intervalo de mM a pM.
La especificidad del epítopo es una característica importante de un anticuerpo monoclonal. El mapeo de epítopos con BIAC0RE<B, en contraste con técnicas convencionales utilizando radioinmunoensayo, ELISA u otros métodos de adsorción de superficie, no requiere etiquetar o purificar anticuerpos y permite pruebas de especificidad de múltiples sitios utilizando una secuencia de varios anticuerpos monoclonales . Adicionalmente , grandes números de análisis pueden procesarse automáticamente.
Los experimentos de unión con respecto a pares evalúan la capacidad de dos MAb de unirse simultáneamente al mismo antígeno. Los MAb dirigidos contra epítopos separados se unirán independientemente, mientras que los MAb dirigidos contra epítopos idénticos o estrechamente relacionados interferirán con la unión de cada uno. Estos experimentos de unión con BIACORE® son sencillos de llevar a cabo.
Por ejemplo, puede utilizarse una molécula de captura para unir el primer Mab, seguido por la adición del antígeno y segundo MAb secuencialmente . Los sensorgramas revelarán: 1. cuánto del antígeno se une al primer Mab, 2. en qué medida el segundo MAb se une al antígeno unido a la superficie, 3. si el segundo MAb no se une, si revertir el orden de la prueba con respecto a pares altera los resultados.
La inhibición de péptidos es otra técnica utilizada para el mapeo de epítopos. Este método puede complementar los estudios de unión de anticuerpos con respecto a pares y puede referirse a epítopos funcionales para características estructurales cuando la secuencia primaria del antígeno es conocida. Los fragmentos de péptidos o antígenos se evalúan para la inhibición de unión de diferentes MAbs a un antígeno inmovilizado. Los péptidos que interfieren con la unión de un MAb dado se asume están estructuralmente relacionados al epítopo definido por ese MAb.
La práctica de la descripción empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la técnica. Las técnicas se explican exhaustivamente en la bibliografía. Ver, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed.( Sambrook et al., ed.f Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., ed., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992) , DNA Cloning, D. N. Glover ed. , Volúmenes I y II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed. , (1984); Mullís et al. Patente de los Estados Unidos No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds . (1984); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984) ; the treatise, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller y M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols . 154 y 155 (Wu et al. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer y alker, eds., Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., (1986) ; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986) y en Ausubel et al . , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) .
Los trabajos de referencia estándar que establecen principios generales de inmunología incluyen Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Roitt, I., Brostoff, J. y Male D., Immunology, 6th ed. London: Mosby (2001); Abbas A., Abul , A. y Lichtman, A., Cellular and Molecular Immunology, Ed. 5, Elsevier Health Sciences División (2005) y Harlow y Lañe, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988) .
Habiendo descrito la descripción en detalle, la misma se comprenderá más claramente en referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen en la presente a efectos de ilustración solamente y no pretenden limitar la descripción. Todas las patentes y publicaciones a las que se hace referencia en la presente se incorporan expresamente a modo de referencia en su totalidad.
EJEMPLOS Ejemplo 1: Construcción y detección de bibliotecas de expresión de bacteriófagos de anticuerpos humanos Este ejemplo describe un abordaje de cribado de células enteras indiferente objetivo con bibliotecas de expresión de bacteriófagos de anticuerpos humanos derivados de pacientes convalecientes sin tratamiento previo e infectados con P. aeruginosa para identificar antígenos protectores novedosos contra la infección por Pseudomonas (Figura 1A) . Los ensayos incluidos en ensayos funcionales in vitro incluyeron ensayos de destrucción de opsonofagocitosis (OPK) y ensayos de unión celular utilizando una línea celular epitelial A549. Los candidatos principales, en base a una actividad in vitro superior, se evaluaron en modelos de neumonía aguda por P. aeruginosa, queratitis e infección por quemadura .
La Figura IB muestra la construcción de una biblioteca de expresión de bacteriófagos de anticuerpos de pacientes. Se reunió sangre entera de 6 pacientes en recuperación 7-10 días después del diagnóstico con posterior extracción de A y construcción de biblioteca de bacteriófagos como se describió previamente (Vaughan, T.J., et al., Nat Biotechnol 14, 309-314 (1996); Wrammert, J., et al., Nature 453, 667-671 (2008)). La Figura 1C muestra que la biblioteca de scFv clonada final contenía 5.4 x 108 transformantes y la secuenciación reveló que el 79% de los genes de scFv fueron de longitud completa y en marco. Los bucles de CDR3 de VH, a menudo importantes para determinar la especificidad del epítopo, fueron 84% distintos al nivel del aminoácido antes de la selección de la biblioteca .
Además de la biblioteca de pacientes, se utilizó una biblioteca de expresión de bacteriófagos de scFv humano sin tratamiento previo que contenía hasta lxlO11 miembros de unión (Lloyd, C, et al., Protein Eng Des Sel 22, 159-168 (2009)) para el aislamiento del anticuerpo (Vaughan, T.J., et al., Nat Biotechnol 14, 309-314 (1996) ) . Se inmovilizó P. aeruginosa muerta por calor (lxlO9) en tubos IMMUNO™ (Nunc; MAXISORP™) seguido por selecciones de expresión de bacteriófagos como se describió (Vaughan, T.J., et al., Nat Biotechnol 14, 309-314 (1996)) con la excepción de que se utilizó trietanolamina (?????) como la solución amortiguadora de elución. Para la selección en P. aeruginosa en suspensión, las células muertas por calor se bloquearon con posterior adición de bacteriófagos bloqueados a las células. Después del lavado, el bacteriófago eludido se utilizó para infectar células de E. coli como se describió (Vaughan, 1996) . El rescate del bacteriófago de E. coli y la unión a P. aeruginosa muerta calor mediante ELISA se realizó como se describió (Vaughan, 1996).
Luego del desarrollo y la validación de la metodología de selección de afinidad de las células enteras, la biblioteca de pacientes convalecientes nueva y una biblioteca inactivada construida previamente (Vaughan, T.J., et al., Nat Biotechnol 14, 309-314 (1996)) se sometieron a una selección de afinidad en suspensiones de la cepa 3064 de P. aeruginosa que posee un antígeno 0 completo, así como una cepa mutante wapR isogénica que carecía de expresión de superficie de antígeno 0. La Figura ID muestra que se encontró que las titulaciones de salida de selecciones de bibliotecas de pacientes sucesivas aumentan a una tasa mayor para la biblioteca de pacientes que para las bibliotecas sin tratamiento previo (lxlO7 con respecto a 3xl05 en ronda 3, respectivamente) . Además, también se encontró que la duplicación de secuencias de bucle de CDR3 de VH en las bibliotecas (una medición de enriquecimiento clonal durante la selección) es mayor en la biblioteca de pacientes, alcanzando 88-92% en comparación con 15-25% en la biblioteca sin tratamiento previo en la ronda 3 (Figura ID) . El bacteriófago de scFv individual de selecciones de afinidad se evaluó a continuación mediante ELISA para la reactividad a cepas de serotipo heterologo de P. aeruginosa (Figura 1E) . Se recubrieron placas ELISA (Nunc; MAXISORP™) con cepas de P. aeruginosa de cultivos de la noche como se describió (DiGiandomenico, A., et al., Infect Immun 72, 7012-7021 (2004) ) . Los anticuerpos diluidos se agregaron a placas bloqueadas durante 1 hora, se lavaron y trataron con anticuerpos secundarios anti -humanos conjugados con HRP durante 1 hora con posterior desarrollo y análisis como se describió (Ulbrandt, N.D., et al., J Virol 80, 7799-7806 (2006) ) . Las especies dominantes de bacteriófagos obtenidas de selecciones de células enteras con ambas bibliotecas proporcionaron una reactividad específica de serotipo (los datos no se muestran) . Los clones que exhiben una unión independiente del serotipo en ausencia de unión no específica a E. coli o alúmina de suero se seleccionaron para una evaluación adicional.
Para la expresión de IgG, las cadenas de VH y VL de anticuerpos seleccionados se clonaron en vectores de expresión de IgGl humana, co-expresados en células HEK293 y purificados mediante cromatografía de afinidad de la proteína A como se describió (Persic, L., et al., Gene 187, 9-18 (1997) ) . Los anticuerpos de IgGl humana obtenidos con las regiones variables de estos bacteriófagos independientes de serotipo seleccionados se confirmaron para especificidad por P. aeruginosa y priorizaron para un análisis posterior mediante unión de células enteras a serotipos clínicamente relevantes dominantes mediante análisis FACS (Figura 1F) , ya que este método es más riguroso que ELISA. Para los ensayos de unión en base a citometría de flujo, cepas de P. aeruginosa en fase semi-logarítmica se concentraron en PBS hasta una OD650 de 2.0. Después de la incubación del anticuerpo (10 µg/mL) y bacterias (~1 x 107 células) durante 1 hr a 4°C con agitación, las células lavadas se incubaron con un anticuerpo anti-IgG humana de cabra ALEXA FLUOR 647® (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 0.5 hr a 4°C. Las células lavadas se tiñeron con tinción bacteriana verde BACLIGHT™ como se recomienda (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Las muestras se pasaron en un citómetro de flujo LSR II (BD Biosciences) y se analizaron utilizando BD FacsDiva (v. 6.1.3) y FlowJo (v. 9.2; TreeStar) . Los anticuerpos que exhibieron unión mediante FACS se priorizaron adicionalmente para una evaluación de la actividad funcional en un ensayo de destrucción de opsonofagocitosis (OPK) .
Ejemplo 2: Evaluación de los mAb que promueven la OPK de P. aeruginosa Este ejemplo describe la evaluación de anticuerpos de IgGl humana para promover la OPK de P. aeruginosa . La Figura 2A muestra que con la excepción de apR-007 y el anticuerpo testigo negativo R347, todos los anticuerpos mediaron la destrucción dependiente de la concentración de la cepa del serogrupo 05 de P. aeruginosa luminiscente (PAOl.lux). WapR-004 y Cam-003 exhibieron una actividad de OPK superior. Los ensayos de OPK se realizaron como se describe (DiGiandomenico, A., et al., Infect Immun 72, 7012-7021 (2004)), con modificaciones. Brevemente, los ensayos se realizaron en placas de 96 pocilios utilizando 0.025 mi de cada componente de OPK; cepas de P. aeruginosa; suero de conejo bebé diluido; células HL-60 diferenciadas y anticuerpo monoclonal . En algunos ensayos de OPK, se utilizaron cepas de P. aeruginosa luminiscente, que se construyeron como describió (Choi, K.H., et al., Nat Methods 2, 443-448 (2005)). Los ensayos de OPK luminiscente se realizaron como se describió anteriormente con determinación de unidades relativas de luciferasa (RLU) utilizando una lectora de placas Envision Multilabel de Perkin Elmer (Perkin Elmer) .
Se evaluó la capacidad de los anticuerpos apR-004 y Cam-003 de mediar la actividad de OPK contra otra cepa del serotipo de antígeno 0 clínicamente relevante, 9882-80. lux. La Figura 2B muestra que la actividad de OPK de WapR-004 y Cam-003 mejorada se extiende a la cepa 9882-80 (011) .
Se evaluó la capacidad de Cam-003 de mediar la actividad de OPK contra cepas no mucoides representativas de serotipos de antígeno O clínicamente relevantes y contra cepas de P. aeruginosa mucoides que se derivaron de pacientes con fibrosis quística. Cam-003 medió OPK potente de todas las cepas aisladas clínicas no mucoides evaluadas (Figura 2C) . Además, Cam-003 medió una destrucción potente de todas los aislados mucoides de P. aeruginosa que se evaluaron (Figura 2D) .
Además, este ejemplo describe la evaluación de imitantes de WapR-004 (W4) en formato scFv-Fc para promover la OPK de P. aeruginosa . Un mutante, Wap-004RAD (W4-RAD) , se creó específicamente a través de mutagénesis dirigida al sitio para eliminar un motivo RGD en VH. Otros mutantes W4 se prepararon de la siguiente forma. Se realizó una PCR anidada como se describió (Roux, K.H., PCR Methods Appl 4, S185-194 (1995) ) para amplificar variantes de W4 (derivadas de hipermutación somática) de la biblioteca scFv derivada de los pacientes infectados por P. aeruginosa convalecientes para análisis. Esta es la biblioteca de la cual se derivó apR-004 Se subclonaron y secuenciaron fragmentos de las variantes de W4 utilizando procedimientos estándar conocidos en la técnica Las cadenas ligeras (LC) de W4 imitante se recombinaron con la cadena pesada (HC) de WapR-004 para producir mutantes W4 en formato scFv-Fc. Además, los mutantes de cadena pesada (HC) RAD de WapR-004 se recombinaron con LC base de M7 y M8 en el formato scFv-Fc. Se prepararon constructos utilizando procedimientos estándar conocidos en la técnica. La Figura 11 (A-M) muestra que con la excepción del anticuerpo testigo negativo R347, todos los mutantes de WapR-004 (W4) mediaron la destrucción dependiente de la concentración de la cepa del serogrupo 05 de P. aeruginosa luminiscente (PAOl.lux).
Ejemplo 3: Anticuerpos anti-P. aeruginosa independientes del serotipo se dirigen al exopolisacárido Psl Este ejemplo describe la identificación del objetivo de los anticuerpos anti-P. aeruginosa derivados de la detección fenotípica. El análisis del objetivo se realizó para evaluar si los anticuerpos independientes del serotipo se dirigían a antígenos de proteína o carbohidrato. No se observó ninguna unión en ELISA a extractos de células enteras PA01 digeridos exhaustivamente con proteinasa K, lo que sugiere que la reactividad se dirigió a residuos de carbohidrato accesibles en la superficie (los datos no se muestran) . Se construyeron mutantes isogénicos en genes responsables de la biosíntesis del antígeno 0, alginato y núcleo de LPS; wbpL (deficiente en antígeno O) ; wbpL/algD (deficiente en antígeno 0 y alginato) ; rmlC (deficiente en antígeno 0 y núcleo exterior truncado) y galU (deficiente en antígeno O y núcleo interior truncado) . Se construyeron mutantes de P. aeruginosa en base a la estrategia de reemplazo de alelos descrita por Schweizer (Schweizer, H.P., Mol - Microbiol 6, 1195-1204 (1992); Schweizer, H.D., Biotechniques 15, 831-834 (1993)) . Se movilizaron vectores de la cepa de E. coli S17.1 a la cepa de P. aeruginosa PAOl; se aislaron recombinantes como se describió (Hoang, T.T., et al., Gene 212, 77-86 (1998)). La eliminación de genes se confirmó mediante PCR. Se complementaron mutantes de P. aeruginosa con constructos en base a pUCP30T que alojan genes de tipo salvaje. La reactividad de los anticuerpos se determinó mediante ELISA indirecta sobre placas recubiertas con las cepas de P. aeruginosa indicadas anteriormente: las Figuras 3A y 3J muestran que la unión de Cam-003 al wbpL o al mutante doble wbpL/algD no se vio afectada. Sin embargo, la unión a los mutantes rmlC y galU se abolió. Si bien estos resultados fueron coherentes con la unión al núcleo de LPS, no se observó reactividad a LPS purificado de PA01. Se mostró recientemente que los genes rmlC y galU se requieren para la biosíntesis del exopolisacárido Psl, un polímero pentasacárido de repetición que consiste en D-manosa, L-ramnosa y D-glucosa. Se evaluó la unión de Cam-003 a un PAOlApslA inactivado de pslA isogénico, ya que pslA se requiere para la biosíntesis de Psl (Byrd, M.S., et al., Mol Microbiol 73, 622-638 (2009)). La unión de Cam-003 a PAOlApslA se abolió cuando se evaluó mediante ELISA (Figura 3B) y FACS (Figura 3C) , mientras que la molécula de LPS en este mutante no se vio afectada (Figura 3D) . La unión de Cam-003 se restauró en un mutante triple de PAOl wbpL/algD/pslA complementado con pslA (Figura 3E) , así como la capacidad de Cam-003 de mediar la destrucción opsónica a PAOlApslA complementado a diferencia del mutante (Figura 3F y 3G) . La unión del anticuerpo Cam-003 a un mutante del exopolisacárido Peí tampoco se vio afectada, confirmando más adelante a Psl como nuestro anticuerpo objetivo (Figura 3E) . Los ensayos de unión confirmaron que los anticuerpos restantes también se unieron a Psl (Figura 3H y 31) .
Para confirmar que todos los anticuerpos se unieron al mismo antígeno, se realizó un ensayo de unión de captura a Psl utilizando un instrumento FORTEBIO*5 OCTET8 384 como se i describió anteriormente. El antígeno fue un carbohidrato enriquecido tratado con proteinasa K purificado de PAOl wbpL/algD/pelA (deficiente en antígeno 0, alginato y exopolisacárido Peí) . Anticuerpos individuales se unieron a biosensores de aminopropilsilano seguido por el bloqueo y la adición del antígeno de carbohidrato enriquecido. Después del lavado para eliminar el antígeno no unido, se evaluó la unión de los mAb sin etiquetar al antígeno capturado. Todos los anticuerpos unidos (Cam-003, Cam-004, Cam-005, WapR-001, WapR-002, apR-003, WapR-007 y WapR-016) , con la excepción del mAb R347 testigo, fueron capaces de capturar el antígeno que reaccionó con cada uno de Cam-003, WapR-001, WapR-002, WapR-003 y WapR-016 (Figura 3K) . La reactividad mínima para Psl capturado se observó con Cam-004, Cam-005 y WapR-007, aunque estos tres anticuerpos capturaron suficiente Psl para potencialmente reaccionar con Cam-003, WapR-001, WapR-002, WapR-003 y WapR-016 (Figura 3K) . Estos resultados sugieren que todos los mAb derivados por detección fenotípica que se unieron a P. aeruginosa independientemente del serotipo se dirigieron a epítopos asociados con el exopolisacárido Psl.
Ejemplo 4: Los mAb anti-Psl bloquean la unión de P. aeruginosa a células epiteliales cultivadas Este ejemplo muestra que los anticuerpos anti-Psl bloquearon la asociación de P. aeruginosa con células epiteliales. Se agregaron anticuerpos anti-Psl a una monocapa 17 confluente de células A549 (una línea celular epitelial basal alveolar humana de adenocarcinoma) cultivadas en placas de 96 pocilios opacas (Nunc Nunclon Delta) . Se agregó PAOl de P. aeruginosa luminiscente de fase logarítmica (PAOl. lux) a una MOI de 10. Después de la incubación de PAOl . lux con células A549 a 37°C durante 1 hora, las células A549 se lavaron, seguido por la adición de LB+0.5% de glucosa. Las bacterias se cuantificaron y luego se incubaron brevemente a 37°C como se realizó en el ensayo de OPK descrito en el Ejemplo 2. Las mediciones de los pocilios sin las células A549 se utilizaron para corregir uniones no específicas. La Figura 4 muestra que con la excepción de Cam-005 y apR-007, todos los anticuerpos redujeron la asociación de PAOl . lux a células A549 en un modo dependiente de la dosis. Los mAb con mejores resultados en ensayos de OPK, apR-004 y Cam-003 (ver Figuras 2A-B y Ejemplo 2), fueron también los más activos para inhibir la unión celular de P. aeruginosa a células epiteliales de pulmón A549, proporcionando una reducción de hasta -80% en comparación con el testigo negativo. WapR-016 fue el tercer anticuerpo más activo, que muestra una actividad inhibitoria similar a WapR-004 y Cam-003' pero a una concentración de anticuerpo 10 veces mayor.
Ejemplo 5: Las cepas de P. aeruginosa con pases in vivo mantienen/aumentan la expresión de Psl Para evaluar si la expresión de Psl in vivo se mantiene, se inyectaron intraperitonealmente ratones con cepas aisladas de P. aeruginosa seguido por el cultivo mediante lavaje peritoneal cuatro horas después de la infección. La presencia de Psl se analizó con un anticuerpo testigo y Cam-003 mediante citometría de flujo, ya que las condiciones para la unión de anticuerpo son más rigurosas y permiten una cuantificación de células que son positivas o negativas para la expresión de Psl. Para la unión ex vivo se prepararon inóculos bacterianos (0.1 mi) de una placa de TSA de toda la noche y se administraron intraperitonealmente a ratones BALB/c. A la hora 4 después del desafío, las bacterias se cosecharon, RBC se lisaron, sonicaron y resuspendieron en PBS complementado con 0.1% de Tween-20 y 1% de BSA. Las muestras se tiñeron y analizaron como se describió previamente en el Ejemplo 1. La Figura 5 muestra que las bacterias cosechadas después de lavaje peritoneal con tres cepas de P. aeruginosa de tipo salvaje mostraron tinción de Cam-003 que fue compatible con bacterias cultivadas de fase logarítmica (comparar las Figuras 5A y 5C) . Las bacterias de tipo salvaje con pases in vivo exhibieron una tinción mejorada en comparación con el inoculo (comparar las Figuras 5B y 5C) . Dentro de los inóculos, Psl no se detectó para la cepa 6077 y se detectó mínimamente para las cepas PAOl (05) y 6206 (Oll-citotóxica) . La unión de Cam-003 a bacterias aumentó en relación con los inóculos, lo que indica que la expresión de Psl · se mantiene o aumenta in vivo. Las cepas de tipo salvaje 6077, PAOl y 6206 expresan Psl después del pasaje in vivo. Sin embargo, la cepa PAOl que aloja una eliminación de pslA (PAOlApslA) no es capaz de reaccionar con Cam-003. Estos resultados enfatizan más a Psl como el objetivo de los anticuerpos monoclonales.
El nivel de expresión/accesibilidad de Psl en la superficie de cepas de P. aeruginosa PAOl y 6206 en el modelo de neumonía aguda también se evaluó. Las bacterias preparadas de placas confluentes incubadas toda la noche, como se describió anteriormente, se administraron intranasalmente a ratones BALB/c. A las 4 y 24 horas después de la infección, las bacterias se recuperaron de los pulmones mediante lavaje broncoalveolar . Las muestras se tiñeron y analizaron como se describió previamente en el Ejemplo 1. La tinción de Cam-003 fuerte se observó para PAOl 4 horas después de la infección, pero fue mínima para 6206 en este punto (Figura 5D) . Sin embargo, para ambas cepas PAOl y 6206, la tinción de Cam-003 fuerte se observó a las 24 horas después de la infección (Figura 5E) .
La unión de los anticuerpos específicos de P. aeruginosa (Cam-003, Cam-004 y Cam-005) a cepas representativas de serotipos de P. aeruginosa únicos (PAOl (05) (Figura 5F) , 2135 (01) (Figura 5G) , 2531 (01) (Figura 5H) , 2410 (06) (Figura 51) , 2764 (011) (Figura 5J) , 2757 (011) (Figura 5K) , 33356 (09) (Figura 5L) , 33348 (01) (Figura 5?) , 3039 (NT) (Figura 5N) , 3061 (NT) (Figura 50), 3064 (NT) (Figura 5P) , 19660 (NT). (Figura 5Q) , 9882-80 (011) (Figura 5R) , 6073 (011) (Figura 5S) , 6077 (011) (Figura 5T) y 6206 (011) (Figura 5U) , se evaluó mediante citometría de flujo como se describió anteriormente en,general.
Ejemplo 6: Tasas de supervivencia para animales tratados con los anticuerpos monoclonales anti-Psl Cam-003 y WapR-004 en un modelo de neumonía aguda de P. aeruginosa Se administraron anticuerpos o PBS 24 horas antes de la infección en cada modelo. Los modelos de neumonía aguda de P. aeruginosa, queratitis e infección por lesión térmica se realizaron como se describió (DiGiandomenico, A., et al., Proc Nati Acad Sci U S A 104, 4624-4629 (2007)) con modificaciones. En el modelo de neumonía aguda, los ratones BALB/c (The Jackson Laboratory) se infectaron con cepas de P. aeruginosa suspendidas en un inoculo de 0.05 mi. En el modelo de lesión térmica, los ratones CF-1 (Charles River) recibieron una quemadura en el 10% del área superficial corporal total con un hierro calentado hasta 92 °C durante 10 segundos. Los animales se infectaron subcutáneamente con cepa de P. aeruginosa 6077 en la dosis indicada. Para experimentos de carga de órganos, la neumonía aguda se indujo en ratones seguido por la cosecha de pulmones, bazos y ríñones 24 horas después de la infección para la determinación de UFC.
Los anticuerpos monoclonales Cam-003 y WapR-004 se evaluaron en un modelo de neumonía letal aguda contra cepas de P. aeruginosa que representan los serotipos más frecuentes asociados con enfermedad clínica. Las Figuras 6A y 6C muestran una supervivencia importante dependiente de la concentración en ratones tratados con Cam-003 infectados con cepas PAOl y 6294 cuando se compara con testigos. Las Figuras 6B y 6D muestran que la protección completa del desafío con 33356 y cepa citotóxica 6077 fue proporcionada por Cam-003 a 45 y 15 mg/kg mientras que 80 y 90% de la supervivencia se observó a 5 mg/kg para 33356 y 6077, respectivamente. Las Figuras 6E y 6F muestran una supervivencia importante dependiente de la concentración en ratones tratados con WapR-004 en el modelo de neumonía aguda con la cepa 6077 (011) (8 x 105 UFC) (Figura 6E) o 6077 (011) (6 x 105 UFC) (Figura 6F) . La Figura 6G muestra que a las 120 horas Cam-003 proporcionó 100% de supervivencia después de la infección con la cepa PAOl. No se observó una mayor supervivencia contra la cepa mutante Psl, PAOlApslA, utilizada como un testigo negativo en el estudio de neumonía aguda PAOl (Figura 6G) , confirmando la falta de actividad de Cam-003 contra las cepas deficientes en expresión de Psl.
Cam-003 y WapR-004 se examinaron a continuación para evaluar su capacidad de reducir la carga de órganos de P. aeruginosa en el pulmón y propagación a órganos distales y luego los animales se trataron con varias concentraciones de WapR-004, Cam-003 o anticuerpos testigo en varias concentraciones diferentes. Cam-003 fue efectivo para reducir la carga en el pulmón de P. aeruginosa con respecto a las cuatro cepas evaluadas. Cam-003 no fue muy efectivo contra la cepa citotóxica altamente patogénica, 6077, donde la dosis baja fue tan efectiva como la dosis más alta (Figuras 7D) . Cam-003 también tuvo un efecto marcado en reducir la diseminación al bazo y ríñones en ratones infectados con PA01 (Figura 7A) , 6294 (Figura 7C) y 6077 (Figura 7D) , mientras que la diseminación a estos órganos no se observó en ratones infectados con 33356 (Figura 7B) . Las Figuras 7E y 7F muestran que, de manera similar, WapR-004 redujo la carga de órganos después de la inducción de neumonía aguda con 6294 (06) y 6206 (011) . Específicamente, WapR-004 fue efectivo al reducir la diseminación de P. aeruginosa al bazo y ríñones en ratones infectados .
Ejemplo 7: Tasas de supervivencia para animales tratados con los anticuerpos monoclonales anti-Psl Cam-003 y WapR-004 en un modelo de infección de córnea por P. aeruginosa La eficacia de Cam-003 y WapR-004 se evaluó luego en un modelo de infección de córnea por P. aeruginosa que enfatiza la capacidad de los patógenos de unir y colonizar tejido dañado. Las Figuras 8A-8D y 8F-8G muestran que ratones que recibieron Cam-003 y WapR-004 tuvieron significativamente menos patología y recuentos bacterianos reducidos en homogenados de ojos totales en comparación con los observados en animales tratados con testigo negativo. La Figura 8E muestra que Cam-003 también fue efectivo cuando se evaluó en un modelo de lesión térmica, proporcionando una protección importante a 15 y 5 mg/kg en comparación con el testigo tratado con anticuerpos .
Ejemplo 8: Un anticuerpo mutante Fe de Cam-003, Cam-003 -TM, ha disminuido la OPK y la eficacia in vivo pero mantiene la actividad anti-unión de células.
Dado el potencial para mecanismos duales de acción, se creó un mutante Fe de Cam-003, Cam- 003 -TM, que aloja mutaciones en el dominio Fe que reduce su interacción con receptores Fcy (Oganesyan, V., et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 64, 700-704 (2008)) para identificar si la protección fue más correlativa a una unión anti -célula o actividad de OPK. Se construyeron mutantes de P. aeruginosa en base a la estrategia de reemplazo de alelos descrita por Schweizer (Schweizer, H.P., Mol Microbiol 6, 1195-1204 (1992); Schweizer, H.D., Biotechniques 15, 831-834 (1993)). Los vectores se movilizaron de la cepa de E. coli S17.1 a la cepa de P. aeruginosa PAOl; los recombinantes se aislaron como se describió (Hoang, T.T., et al., Gene 212, 77-86 (1998) ) . La eliminación de genes se confirmó mediante PCR. Se complementaron mutantes de P. aeruginosa con constructos en base a pUCP30T que alojan genes de tipo salvaje. La Figura 9A muestra que Cam-003-?? exhibió un descenso 4 veces mayor en la actividad de OPK en comparación con Cam-003 (CE50 de 0.24 y 0.06, respectivamente) pero fue igual de efectiva en el ensayo de unión celular (Figura 9B) . La Figura 9C muestra que Cam-003-?? también fue menos efectiva contra la neumonía, lo que sugiere que la actividad de OPK óptima es necesaria para una protección óptima. OPK y los ensayos de unión celular se realizaron como se describió previamente en los Ejemplos 2 y 4, respectivamente. Cuando se evaluó en el modelo de neumonía aguda de ratón, Cam-003-?? fue similar en potencia a Cam-003 con un inoculo infeccioso bajo de 6077 (2.4xl05 UFC) (Figura 9D) . Sin embargo, una titulación adicional de la dosis de anticuerpo seguida por el desafío con un inoculo infeccioso más grande (1.07xl06) reveló que la actividad de Cam-003 fue superior a Cam-003-??, sugiriendo que la actividad de OPK contribuye significativamente a una protección óptima in vivo (Figura 9E) .
Ejemplo 9: Mapeo de epítopos y afinidad relativa para anticuerpos anti-Psl El mapeo de epítopos se realizó mediante ELISA de competición y se confirmó usando un sistema de flujo OCTET*8 con Psl derivado del sobrenadante de un cultivo durante toda la noche de la cepa PAOl de P. aeruginosa . Para ELISA por competición, los anticuerpos fueron biotinilados utilizando EZ-Link Sulfo-NHS-Biotina y el Kit de Biotinilación (Thermo Scientific) . Las placas recubiertas con antígenos se trataron con la EL50 de anticuerpos biotinilados coincubados con anticuerpos sin etiquetar. Después de la incubación con estreptavidina conjugada con HRP (Thermo Scientific) , las placas se desarrollaron como se describió anteriormente. Los experimentos de competición entre mAb anti-Psl determinaron que los anticuerpos se dirigieron al menos a tres epítopos únicos, denominados como anticuerpos clase 1, 2 y 3 (Figura 10A) . Los anticuerpos clase 1 y 2 no compiten para la unión. Sin embargo, el anticuerpo clase 3, apR-016, parcialmente inhibe la unión de los anticuerpos clase 1 y 2.
La afinidad de los anticuerpos se determinó mediante los ensayos de unión OCTET° utilizando Psl derivado del sobrenadante de cultivos PA01 de toda la noche. La KD de los anticuerpos se determinó mediante el promedio de la cinética de unión de siete concentraciones para cada anticuerpo. Las mediciones de afinidad se tomaron con un instrumento FORTEBIO® OCTET® 384 utilizando placas con 384 pocilios inclinadas. El sobrenadante de los cultivos PA01 de toda la noche + el gen pslA se utilizaron como la fuente de Psl. Las muestras se cargaron en sensores OCTET AmmoPropylSilane (hidratados en PBS) y se bloquearon, seguido por la medición de unión de mAb anti-Psl en varias concentraciones y disociación en PBS + 1% de BSA. Todos los procedimientos se realizaron como se describió (Wang, X., et al., J" Immunol Methods 362, 151-160) . La asociación y disociación de los datos de ??? sin procesar se ajustaron a la curva con GraphPad Prism. La Figura 10A muestra las afinidades de unión relativa de los anticuerpos anti-Psl caracterizados anteriormente. Los anticuerpos de clase 2 tenían las afinidades más altas de todos los anticuerpos anti-Psl. La Figura 10A también muestra un resumen de unión celular y experimentos de datos OPK. La Figura 10B muestra las afinidades de unión relativa y valores de EL50 de la OPK del mutante Wap-004RAD (W4RAD) , así como otros mutantes W4 preparados como se describió en el Ejemplo 1.
Ejemplo 10: La unión de conjugados de Polimixina B (PMB) -mAb a células PAOl de P. aeruginosa se evaluó mediante FACS En este Ejemplo, la PMB conjugada con un anticuerpo monoclonal (mAb) opsónico que fue capaz de mediar el aclaramiento bacteriano se evaluó para determinar si el conjugado mejoraría y/o expandiría la funcionalidad del mAb, reduciendo a la vez la toxicidad de la PMB. CAM-003, un mAb que se dirige al exopolisacárido de superficie Psl de P. aeruginosa, que media la actividad de destrucción opsonofagocítica (OPK) potente in vivo, se seleccionó para evaluación de conjugado.
Este ejemplo evalúa la unión de varios conjugados de Polimixina B (PMB) -mAb a células PA01 de P. aeruginosa . Utilizando un método de conjugación dirigido al sitio de dos etapas (Figura 12) , la Polimixina B (PMB) se conjugó con las variantes de mAb Cam-003 y A7 (testigo hlgGl) con una cisteína sola o doble manipulada en la región Fe. Las variantes Fe de mAb Cam-003 y A7 se prepararon utilizando protocolos estándar como se describió (Dimasi, N. et al . , J Mol Biol. 393 (3) :672-92 (2009)). El enlazante heterobifuncional SM(PEG)i2 (Pierce) se conjugó inicialmente con una de las aminas primarias en PMB a través del grupo NHS en el enlazante en condiciones determinadas para favorecer la conjugación de un enlazante único. Se disolvió sulfato de Polimixina B (Sigma) en PBS a pH 7.2 a 2 mg/ml y reaccionó con un enlazante SM(PEG)12 en una relación PMB : enlazante de 4:1. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 30 min y se detuvo con 50 mM de glicina. La eficiencia de la conjugación del enlazante SM(PEG)i2 a PMB fue de aproximadamente 25%. Las preparaciones crudas de PMB-PEGi2 luego se hicieron reaccionar con variantes de mAb de cisteína Fe desprotegidas y se conjugaron a través de maleamida en el enlazante PEGi2 (ver, por ejemplo, WO 2011/005481 y WO 2009/092011) . Los conjugados PMB-mAb se purificaron mediante diálisis extensiva. Los conjugados se dializaron inicialmente en 3.3X PBS pH 7.2 con 0.7% de CHAPS con cuatro intercambios de solución amortiguadora, seguido por diálisis en IX PBS pH 7.2 con cuatro intercambios de solución amortiguadora adicionales. Se determinó La eficiencia de la conjugación y los niveles de PMB libre de enlazante en las muestras mediante UPLC y espectrometría.
CAM-003 es específico para el exopolisacárido de superficie Psl de P. aeruginosa y media la actividad potente de OPK y la protección en múltiples modelos in vivo. La Figura 13A muestra los residuos mutados de la región Fe de Cam-003 y A7. SM (A339C) , DM1 (T289C/A339C) , DM2 (A339C/S442C) . La eficiencia de conjugación de variantes de PMB-mAb se determinó mediante análisis de espectrometría de masas de cadenas pesadas en conjugados purificados (ver, por ejemplo, O 2011/005481 y O 2009/092011) . La eficiencia de la conjugación total fue 75-85%. La pureza de los constructos fue >95% con relación al enlazante de PMB conjugada con respecto al libre. La Figura 13B muestra el número promedio de PMB en conjugados PMB-Cam-003 y PMB-A7 (mutante doble 2 (DM2) > mutante doble 1 (DM1) > mutante único (SM) ) . Los conjugados de A7 exhibieron una eficiencia de conjugación mayor en comparación a los conjugados de Cam-003. Se determinó que la contaminación con PMB libre en las preparaciones purificadas era insignificante. La unión de los conjugados PMB-Cam-003 y PMB-A7 a células PAOl de P. aeruginosa se evaluó mediante FACS . Se utilizó R347 como testigo negativo en todos los experimentos. Las muestras se tiñeron y analizaron como se describió previamente en el Ejemplo 1. No se observó una diferencia importante en la unión de conjugados de Cam-003 en comparación con Cam-003 sin conjugar o conjugado con testigo (Figura 14A) . La unión de los conjugados testigo A7 fue proporcional al número de moléculas de PMB por conjugado (Figura 14B) . Este análisis indica que la conjugación de PMB para Cam-003 no impacta significativamente en la célula entera y que la PMB conjugada puede mediar una unión directa a células, presumiblemente mediante la unión de LPS .
Ejemplo 11: Evaluación de conjugados PMB-mAb que promueve OPK de P. aeruginosa Este ejemplo describe dos series de experimentos que evalúan la capacidad de los conjugados PMB-mAb para promover la OPK de P. aeruginosa . En los primeros experimentos (Figuras 15 A-B) , la actividad de OPK mediada por conjugado mediante la línea celular de neutrófilos HL-60 en presencia del complemento de conejo se evaluó utilizando cepas de P. aeruginosa que expresan luciferasa bacteriana como se describió en el Ejemplo 2. Se utilizó R347 como testigo negativo en estos experimentos. Los conjugados de CAM-003 retuvieron una actividad de OPK potente, aunque disminuyó con un número creciente de PMB por conjugado (SM > DM1 > DM2) (Figura 15A) . Los conjugados de CAM-003 no exhibieron una actividad de OPK contra la cepa de P. aeruginosa ApslA que no expresa el Psl objetivo, indicando que se requirió la unión mediada por mAb para la destrucción (Figura 15B) . En la segunda serie de experimentos, la reducción en luminiscencia después de 2 h de incubación con respecto al mAb que carece de testigo se utilizó para determinar % de destrucción. La Figura 18A muestra que los conjugados de CAM-003 retuvieron la actividad de OPK, aunque disminuye con el número creciente de PMB por conjugado, particularmente en constructos DM y TM (WT>SM>DM>TM) . Los conjugados de CAM-003 no exhibieron la actividad de OPK contra la cepa PA01 ApslA que no expresa el Psl objetivo (no se muestra) . La Figura 18B muestra que los conjugados de A7-PMB no mediaron la OPK, lo que indica que la unión mediada por mAb se requería para la destrucción.
Ejemplo 12: Neutralización de LPS de P. aeruginosa por conjugados de PMB-mAb La neutralización de la actividad LPS de P. aeruginosa 010 se evaluó mediante preincubación de los conjugados de PMB-mAb o PMB sola con LPS durante 1 h, con posterior estimulación de macrófagos 264.7 RAW de murino y cuantificación de la secreción de TNF. La concentración final de LPS fue 2ng/ml. TNF se cuantifico mediante el método de cito etría de arreglo de perlas (CBA) BD™ en base a FACS (BD Biosciences) después de 6 h de estimulación. La neutralización de LPS se midió mediante un descenso en la producción de TNF con respecto a la respuesta máxima de LPS. Los conjugados de PMB-Cam-003, pero no Cam-003 de tipo salvaje conjugado con testigo, exhibieron una neutralización de LPS. La eficiencia de neutralización fue directamente proporcional al número promedio de PMB en el conjugado (DM2 > DM1 > SM) (Figura 16A) . Los conjugados de PMB-A7, pero no A7 de tipo salvaje con jugado con testigo, exhibieron una neutralización de LPS (Figura 16B) . Los conjugados de A7 exhibieron una mejor neutralización que los conjugados de CAM-003. Los conjugados de A7 exhibieron una mejor neutralización que los conjugados de CAM-003, probablemente debido a una eficiencia de conjugación mayor alcanzada con estas moléculas. Aproximadamente 2 moléculas de PMB/mAb conjugadas se requieren para neutralizar la cantidad de LPS neutralizado por una molécula de PMB libre.
Ejemplo 13: Evaluación de los conjugados dirigidos al sitio de Cam-003 -PMB en modelos de murino La eficacia de los conjugados de Cam-003 -PMB se evaluó en dos tipos de modelos de murino: 1) modelo de desafío de endotoxemia (LPS) , para determinar la capacidad de los conjugados de neutralizar y/o desintoxicar LPS in vivo; y 2) en modelo de sepsis de P. aeruginosa , para evaluar si el efecto de los conjugados de Cam-003-PMB mejoró la protección contra el desafío bacteriano con respecto al anticuerpo solo a través de la neutralización y/o eliminación de LPS mediada por PMB, además de la eliminación bacteriana mediada por anticuerpos. Los modelos de desafío de P. aeruginosa también pueden utilizarse para evaluar la eficacia de los conjugados de Cam- 003 -PMB (ver a continuación) .
A. Modelo de endotoxemia Es bien sabido que la PMB puede unir y neutralizar LPS in vivo y mediar la protección contra el desafío de LPS (Morrison, DC. et al. J. Immunochemistry 13 (10) : 813-818 (1976), Drabick, JJ. et al., Antimicrob Agents Chemother. 42 (3) : 583 -588 (1998)). En el modelo de endotoxemia se evaluarán los conjugados de Cam- 003 -PMB para ver cuál es su capacidad de proteger animales del desafío con LPS. Los LPS purificados de bacterias Gram-negativas , incluyendo P. aeruginosa y E. coli, se utilizarán para desafiar ratones en las dosis letales mínimas establecidas (LD100) . Ya que los ratones son relativamente resistentes a LPS, también puede coadministrarse D-galactosamina, ya que aumenta considerablemente la sensibilidad de los ratones a LPS a aproximadamente la de los humanos (Galanos, C. efe al., Proc Nati Acad Sci U S A. 76 (11) : 5939-5943 (1979)). Los modelos se han utilizado ampliamente para una evaluación de eficacia preclínica de moléculas neutralizadoras de LPS, incluyendo anticuerpos y conjugados de polimixina-proteína (Bailat, S. et al., Infect Im un. 65 (2) : 811-814 (1997), Birkenmeier, G. et al., J Pharmacol Exp Ther. 318 (2) : 762 - 771 (2006), Drabick, JJ. et al., Antimicrob Agents Chemother. 42 (3) : 583-588 (1998)). Los conjugados de Cam-003-PMB, conjugados testigo y Cam- 003 sin conjugars pueden administrarse terapéuticamente o profilácticamente y su capacidad de proteger animales del desafío con LPS puede evaluarse. El alcance de la protección mediada por conjugados de PMB puede correlacionarse con niveles de citocinas y quimiocinas proinflamatorias medidas en sueros o plasma, incluyendo TNF, KC e IL-6.
B. Modelos de desafío de P. aeruginosa Pueden utilizarse varios modelos de murino de infección por P. aeruginosa para evaluar la capacidad de conjugados de Cam-003-PMB de mediar protección. P. aeruginosa puede administrarse a ratones intraperitonealmente (modelo de sepsis) , intravenosamente (modelo de bacteriemia) o intranasalmente (modelo de neumonía) en las dosis LD100 determinadas. Estos modelos se han utilizado previamente para estudios de eficacia preclínica de vacunas pasivas o activas (Frank, DW. et al., J Infect Dis. 186 (1) : 64 - 73. (2002), Secher, T. et al . , J Antimicrob Chemother. 66 (5) : 1100-1109 (2011), Miyazaki, S. et al., J Med Microbiol . 43 (3) .-169-175 (1995), Dunn, DL. et al., Surgery 96 (2) :440-446 (1984)).
Como en el modelo de endotoxemia, puede ser necesario también sensibilizar ratones con D-galactosamina antes del desafío bacteriano para superar su resistencia innata a la toxicidad de LPS y poder evaluar la contribución de neutralización y/o eliminación de LPS a la eficacia in vivo de los conjugados de PMB. Se ha demostrado que la D-galactosamina reduce el LD100 de bacterias Gram-negativas , probablemente mediante el aumento de la sensibilidad a LPS eliminado durante la infección (Bucklin, SE. et al., J Infect Dis. 172 (6) : 1519-27 (1995)).
Los conjugados de Cam-003-PMB, conjugados testigo y Cam-003 sin conjugar pueden administrarse terapéuticamente o profilácticamente. La capacidad de los conjugados de CAM-003 de lograr una mayor protección con respecto a Cam-003 solo mediante la neutralización y/o eliminación de LPS bacteriano a través del resto de PMB conjugado puede determinarse en estudios de supervivencia. La eficacia de conjugados de Cam-003 -PMB en la eliminación bacteriana mediada también puede evaluarse mediante la cuantificación de bacterias P. aeruginosa en suero y órganos, incluyendo bazo, ríñones y pulmones, seguido de infección. Los niveles de LPS en suero o plasma también pueden cuantificarse para evaluar el alcance de la eliminación bacteriana y eliminación y/o neutralización de LPS por los conjugados de Cam-003 -PMB y compararlos a aquellos de Cam-003 sin conjugars y conjugados anticuerpo-PMB testigo.
C. Datos de modelo de endotoxemia En particular, ratones C57B1/6 (10 por grupo) se dosificaron i.p. con mAb o conjugado PMB-mAb 6h antes del desafío con LPS de PAO10 de P. aeruginosa (Sigma) y D-galactosamina . PMB testigo se dosificó i.p. 2h antes del desafío a razón de 0.2 mg/kg y típicamente proporciona 80-100% de protección. Los ratones testigo dosificados con CAM-003 sin conjugar murieron todos en las 18h siguientes. Las Figuras 19A y B muestran que, a 45 mg/kg, los conjugados DM y TM de CAM-003 y A7 proporcionaron 90-100% de protección, mientras que los conjugados de SM no fueron protectores.
Los conjugados de TM se dosificaron a 45, 15 y 5 mg/kg. Tal como se muestra en las Figuras 20A y B, la pérdida de actividad protectora fue más rápida con CAM-003 -TM-PMB que con A7 -TM-PMB, que retuvo 80% de protección a 5 mg/kg. Estas diferencias sugieren que las características estructurales únicas de un mAb pueden impactar en la actividad de neutralización de LPS de PMB conjugada, como se observó previamente in vitro.
D. Datos del modelo de sepsis Los ratones C57B1/6 (10 por grupo) se dosificaron con mAb o conjugados PMB-mAb i.p. (10, 1 y 0.1 mg/kg) 6 h antes del desafío i.p. con una dosis LD80-ioo de la cepa de P. aeruginosa 6294 (4E7 UFC) . Los datos de dos estudios se combinaron en este análisis. La supervivencia se monitoreó durante 72 h. Los resultados combinados de dos estudios se muestran en las Figuras 21 A-C. La mayoría de los ratones testigo dosificados con A7 o solución amortiguadora murieron a las 24h. CA -003 sin conjugar mostró 50-90% de protección. La actividad protectora parecía estar inversamente correlacionada con la dosis. Los conjugados de CAM-003-PMB confirieron una mejor protección que el mAb sin conjugar en la dosis alta de 10 mg/kg, lo que sugiere que la neutralización de la eliminación de LPS durante la infección contribuyó a la supervivencia. El conjugado de A7-DM-PMB testigo exhibió 50% de actividad protectora a 10 mg/kg, lo que sugiere que la neutralización de LPS puede proporcionar un beneficio de supervivencia. Por el contrario, los conjugados fueron menos protectores que CAM-003 en la dosis baja de 0.1 mg/kg y actividad protectora correlacionada con actividad de OPK in vi ro de los conjugados (WT>SM>DM>TM) . Juntos, los resultados indican que la PMB conjugada puede conferir actividad protectora agregada a un anticuerpo opsónico a través de la mediación de la neutralización de LPS y complementar su función de eliminación bacteriana.
La eficiencia de conjugación alta de PMB para residuos de cisteína de Fe manipulada se alcanzó utilizando el enlazante heterobifuncional SM-PEG12. Una serie de conjugados de PMB dirigidos al sitio de CAM-003, un exopolisacárido Psl de P. aeruginosa que se dirige a mAb protector y opsónico potente, se evaluó in vi tro e in vivo. Los conjugados de CAM-003-PMB retuvieron la actividad de OPK in vítro. Sin embargo la actividad de OPK se vio afectada por el aumento del número promedio de PMB por mAb. Los conjugados de PMB-mAb DM y TM confirieron protección en el modelo de endotoxemia de P. aeruginosa de ratón, lo que demuestra que la función de neutralización de LPS de PMB se confirió en el mAb. Los conjugados de CAM-003-PMB mostraron una mayor actividad - protectora que el mAb de CAM-003 sin conjugar en el modelo de sepsis de P. aeruginosa en altas dosis (10 mg/kg) y redujeron la actividad a dosis baja (0.1 mg/kg). Estos datos sugieren que la PMB conjugada puede complementar la eliminación bacteriana mediada por el mAb de CAM-003 opsónico y mejorar la protección por neutralización de LPS. La mejora en la actividad protectora por conjugados de CAM-003 -PMB en el modelo de sepsis se pierde en dosis más bajas, donde los niveles de PMB conjugada son demasiado bajos como para neutralizar LPS y el modo principal de protección es probablemente la eliminación bacteriana mediada por mAb. La pérdida de actividad protectora de los conjugados de CAM-003- PMB en dosis más bajas es consistente con la reducción en actividad de OPK in v ro como un resultado de conjugación PMB. Estos estudios muestran que la PMB conjugada en un mAb opsónico puede conferir una actividad de neutralización de LPS y resultar en una mayor actividad protectora en un modelo de infección por P. aeruginosa sistémica. La optimización de los sitios de conjugación para reducir el impacto negativo en la actividad de OPK puede mejorar además la actividad protectora de conjugados de PMB con respecto a mAb opsónico sin conjugar.
No se pretende que el alcance de la descripción quede limitado por las modalidades específicas descritas, las cuales se proporcionan como ilustraciones únicas de aspectos individuales de la descripción, y cualquier composición o método que sea funcionalmente equivalente se encuentra dentro del alcance de esta descripción. En efecto, varias modificaciones de la descripción, además de las que se muestran y describen en la presente, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y figuras adjuntas. Tales modificaciones se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la presente descripción se incorporan a la presente a modo de referencia de la misma manera que si se indicara que cada publicación o solicitud de patente individual se incorpora específica e individualmente a modo de refereneia .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (85)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígenos de la misma caracterizada porque se une específicamente a Psl de Pseudomonas, en donde la molécula de unión (a) puede inhibir la unión de Pseudomonas aeruginosa a células epiteliales, (b) puede promover la destrucción opsonofagocítica (OPK) de P. aeruginosa o (c) puede inhibir la unión de P. aeruginosa a células epiteliales y puede promover la OPK de P. aeruginosa.
2. La molécula de unión o fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo .
3. Una molécula de unión aislada o f agmento de unión a antígenos de la misma que se une específicamente al mismo epítopo de Psl de Pseudomonas como un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo, caracterizada porque comprende la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena liviana (VL) de WapR-004, Cam-003, Cam-004 o Cam-005.
4. Una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígenos de la misma, caracterizada porque se une específicamente a Psl de Pseudomonas e inhibe de forma competitiva la unión de Psl de Pseudomonas mediante un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende las VH y VL de WapR-004, Cam-003, Cam-004 o Cam-005.
5. La molécula de unión o fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 3 ó 4, caracterizada porque las VH y VL de WapR-004 comprenden la SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente, las VH y VL de Cam-003 comprenden la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, las VH y VL de Cam-0Ó4 comprenden la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, y las VH y VL de Cam-005 comprenden la SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 2, respectivamente.
6. Una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígenos de la misma, caracterizada porque se une específicamente al mismo epítopo de Psl de Pseudomonas como un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende las regiones VH y VL de WapR-001, WapR-002 o WapR-003.
7. Una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígenos de la misma, caracterizada porque se une específicamente a Psl de Pseudomonas e inhibe de forma competitiva la unión de Psl de . Pseudomonas mediante un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende las VH y VL de WapR-001, WapR-002 o WapR-003.
8. La molécula de unión o fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 6 o 7, caracterizada porque las VH y VL de WapR-001 comprenden la SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente, las VH y VL de WapR-002 comprenden la SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO : 8, respectivamente, y los VH y VL de WapR-003 comprenden la SEQ ID NO : 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente .
9. Una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígenos de la misma, caracterizada porque se une específicamente al mismo epítopo de Psl de Pseudomonas como un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende las regiones VH y VL de WapR-016.
10. Una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígenos de la misma, caracterizada porque se une específicamente a Psl de Pseudomonas e inhibe de forma competitiva la unión de Psl de Pseudomonas mediante un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que comprende las VH y VL de WapR-016.
11. La molécula de unión o fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 9 o 10, caracterizada porque las VH y VL de WapR-016 comprenden la SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente.
12. Una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígenos de la misma, caracterizada porque se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VH de anticuerpo, en donde la VH comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15.
13. La molécula de unión o fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la VH comprende la SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15.
14. Una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígenos de la misma, caracterizada porque se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VL de anticuerpo, en donde la VL comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16.
15. La molécula de unión o fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la VL comprende la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16.
16. La molécula de unión o fragmento de la misma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15, caracterizada porque comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo.
17. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígenos del mismo, caracterizado porque se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende secuencias de aminoácidos de VH y VL al menos 90% idénticas a: (a) SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, (b) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, (c) SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, (d) SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente, (e) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente, (f) SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente, (g) SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: : 12, respectivamente, (h) SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: : 14, respectivamente; o (i) SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: : 16, respectivamente.
18. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende las secuencias de aminoácidos de VH y VL : (a) SEQ ID NO : 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, (b) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, (c) SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, (d) SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente, (e) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente, (f) SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente, (g) SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: : 12, respectivamente (h) SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: : 14, respectivamente (i) SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: : 16, respectivamente
19. Una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígenos de la misma, caracterizada porque se une específicamente a Psl de Pseudowonas que comprende una VH de anticuerpo, en donde la VH comprende una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de VH-1 (VHCDR1) idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos a: SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 59.
20. Una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígenos de la misma, caracterizada porque se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VH de anticuerpo, en donde la VH comprende una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de VH-2 (VHCDR2) idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos a: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 54 o SEQ ID NO: 60.
21. Una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígenos de la misma, caracterizada porque se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VH de anticuerpo, en donde la VH comprende una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de VH-3 (VHCDR3) idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos a: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55 o SEQ ID NO: 61.
22. Una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígenos de la misma, caracterizada porque se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VL de anticuerpo, en donde la VL comprende una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de VL-1 (VLCDR1) idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos a: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 56 o SEQ ID NO: 62.
23. Una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígenos de la misma, caracterizada porque se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VL de anticuerpo, en donde la VL comprende una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de VL-2 (VLCDR2) idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos a: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 57 o SEQ ID NO: 63.
24. Una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígenos de la misma, caracterizada porque se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VL de anticuerpo, en donde la VL comprende una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de VL-3 (VLCDR3) idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos a: SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 58 o SEQ ID NO: 64.
25. Una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígenos de la misma, caracterizada porque se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VH de anticuerpo, en donde la VH comprende una secuencia de aminoácidos de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos en una o más de las VHCDR a: SEQ ID NOs : 17, 18, y 19, SEQ ID NOs: 23, 24, y 25, SEQ ID NOs : 26, 27, y 28, SEQ ID NOs : 29, 30, y 31, SEQ ID NOs : 35, 36, y 37, SEQ ID NOs : 41, 42, y 43, SEQ ID NOs: 47, 48, y 49, SEQ ID NOs : 53, 54, y 55 o SEQ ID NOs : 59, 60, y 61, respectivamente.
26. Una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígenos de la misma, caracterizada porque se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VL de anticuerpo, en donde la VL comprende una secuencia de aminoácidos de VLCDRl, VLCDR2 y VLCDR3 idéntica a, o idéntica salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos en una o más de las VHCDR a: SEQ ID NOs : 20, 21 y 22, SEQ ID NOs: 32, 33 y 34, SEQ ID NOs : 38, 39, y 40, SEQ ID NOs : 44, 45, y 46, SEQ ID NOs : 50, 51, y 52, SEQ ID NOs: 56, 57, y 58, o SEQ ID NOs: 62, 63 y 64, respectivamente.
27. La molécula de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26, caracterizada porque comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo.
28. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígenos del mismo, caracterizado porque se une específicamente a Psl de Pseudomonas que comprende una VH y una VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de VHCDRl, VHCDR2 y VHCDR3 , VLCDR1 , VLCDR2 y VLCDR3 idénticas a, o idénticas salvo por cuatro, tres, dos o una sustitución de aminoácidos en una o más de las CDR a: SEQ ID NOs : 17, 18, 19, 20, 21, y 22, SEQ ID NOs : 23, 24, 25, 20, 21, y 22, SEQ ID NOs : 26, 27, 28, 20, 21 y 22, SEQ ID NOs : 29, 30, 31, 32, 33 y 34, SEQ ID NOs : 35, 36, 37, 38, 39 y 40, SEQ ID NOs : 41, 42, 43, 44, 45 y 46, SEQ ID NOs: 47, 48, 49, 50, 51 y 52, SEQ ID NOs: 53, 54, 55, 56, 57 y 58, o SEQ ID NOs : 59, 60, 61, 62, 63 y 64, respectivamente.
29. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18, 27 o 28, caracterizado porque (a) puede inhibir la unión de Pseudomonas aeruginosa a células epiteliales, (b) puede promover la OPK de P. aeruginosa, o (c) puede inhibir la unión de P. aeruginosa a células epiteliales y puede promover la OPK de P. aeruginosa.
30. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la inhibición máxima de la unión de P. aeruginosa a células epiteliales se logra a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 50 ug/ml o menos, 5.0 ug/ml o menos o aproximadamente 0.5 ug/ml o menos .
31. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la inhibición máxima de la unión de P. aeruginosa a células epiteliales se logra a una concentración de anticuerpo en el intervalo de aproximadamente 30 µg/ml a aproximadamente 0.3 µg/ml .
32. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la EL50 de la OPK es menor que aproximadamente 0.5 pg/ml , menor que aproximadamente 0.05 ug/ml o menor que aproximadamente 0.005 ug/ml .
33. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la EL50 de la OPK varía de aproximadamente 0.001 µg/ml a aproximadamente 0.5 µ9/??1.
34. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-33, caracterizado porque se une específicamente a Psl de P. aeruginosa con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10"2 M, 10"2 M, 5 x 10~3 M, 10"3 M, 5 x 10~4 M, 10~4 M, 5 x 10"5 M, 10"5 , 5 x 10"6 M, 10"6 M, 5 x 10"7 M, 10"7 M, 5 x 10"8 M, 10"8 M, 5 x 10"9 M, 10"9 M, 5 x 10"10 M, 10"10 M, 5 x 10"11 M, 10"11 , 5 x 10"12 , 10"12 , 5 x 10"13 M, 10"13 M, 5 X 10"14 M, 10"14 M, 5 x 10"15 M o 10"15 M.
35. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad 5 con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-35, caracterizado porque la afinidad se caracteriza por una constante de disociación (KD) en un intervalo de aproximadamente 1 x 10"10 a aproximadamente 1 x 10"6 M.
36. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad 10 con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-35, caracterizado porque es humanizado.
37. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-35, caracterizado porque es quimérico. 15
38. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-35, caracterizado porque es completamente humano.
39. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-35, /20 caracterizado porque es un fragmento Fab.
40. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-35, caracterizado porque es un fragmento Fab'.
41. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad 25 con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-35, caracterizado porque es un fragmento F(ab)2.
42. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-35, caracterizado porque es un fragmento Fv de cadena única (scFv) .
43. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-41, caracterizado porque comprende regiones constantes de cadena liviana seleccionadas del grupo que consiste en una región constante kappa humana y una región constante lambda humana.
44. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-41, caracterizado porque comprende una región constante de cadena pesada o fragmento de la misma.
45. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la región constante de cadena pesada o fragmento de la misma es IgGl humana .
46. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-45, caracterizado porque es monoclonal.
47. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende una VH con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 y una VL con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.
48. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque comprende además una región constante de cadena liviana kappa humana o fragmento de la misma y una región constante de cadena pesada IgGl humana o fragmento de la misma.
49. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 47 o 48, caracterizado porque se une específicamente a P. aeruginosa con una afinidad caracterizada por una KD de aproximadamente 1.18 x 10"7 M, tal como se determina mediante el ensayo de unión OCTET®.
50. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 49, caracterizado porque la inhibición máxima de unión a células epiteliales se logra a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.3 pg/ml .
51. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 50, caracterizado porque la EL50 de la OPK es menor que aproximadamente 0.02 ug/ml .
52. El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende una VH con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una VL con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 2.
53. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque comprende además una región constante de cadena liviana lambda humana o fragmento de la misma y una región constante de cadena pesada IgGl humana o fragmento de la misma.
54. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 51 o 52, caracterizado porque se une específicamente a P. aeruginosa . con una afinidad caracterizada por una KD de aproximadamente 1.44 x 10"7 M, tal como se determina mediante el ensayo de unión OCTET*.
55. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51 a 54, caracterizado porque la inhibición máxima de unión a células epiteliales se logra a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 1.0 g/ml .
56. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 55, caracterizado porque la EL50 de la OPK es menor que aproximadamente 0.2 ug/ml .
57. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-56, caracterizado porque es conjugado con un agente seleccionado del grupo que consiste en agente antimicrobiano, un agente terapéutico, un profármaco, un péptido, una proteína, una enzima, un lípido, un modificador de respuesta biológica, agente farmacéutico, una linfocina, un anticuerpo heterologo o fragmento del mismo, una etiqueta detectable, polietilenglicol (PEG) y una combinación de dos o más de los agentes .
58. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la etiqueta detectable se selecciona del grupo que consiste en una enzima, una etiqueta fluorescente, una etiqueta quimioluminiscente , una etiqueta bioluminiscente , una etiqueta radiactiva o una combinación de dos o más de cualquiera de las etiquetas detectables .
59. Una composición caracterizada porque comprende el anticuerpo o un fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-58, y un portador.
60. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica la VH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-13, 16-21, 25 o 27-59.
61. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque comprende además un ácido nucleico que codifica la VL de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-11, 14-18, 22-24 o 26-59, en donde una molécula de unión o fragmento de unión a antígenos de la misma expresada por el polinucleótido se une específicamente a Psl de Pseudomonas.
62. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque codifica una molécula de scFv que incluye VH y VL, que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70.
63. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica la VL de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-11, 14-18, 22-24 o 26-59.
64. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque comprende además un ácido nucleico que codifica la VH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-13, 16-21, 25 o 27-59, en donde una molécula de unión o fragmento de unión a antígenos de la misma expresada por el polinucleótido se une específicamente a Psl de Pseudomonas .
65. Un vector caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 60.
66. El vector de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque comprende además un promotor operativamente asociado con el polinucleótido.
67. Un vector caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 63.
68. El vector de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque comprende además un promotor operativamente asociado con el polinucleótido.
69. Un vector caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61, 62 o 64.
70. El vector de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque comprende uno o más promotores operativamente asociados con el polinucleótido, en donde el vector puede expresar una molécula de unión que se une específicamente a Psl de Pseudomonas en una célula hospedera adecuada .
71. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60 a 64, o el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 a 70.
72. Un método para producir una molécula de unión o fragmento de unión a antígenos de la misma que se une específicamente a Psl de Pseudomonas, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 71, y recuperar la molécula .de unión o fragmento de la misma.
73. Una molécula de unión o fragmento de unión a antígenos de la misma caracterizada porque se une específicamente a Psl de Pseudomonas, producida por el método de conformidad con la reivindicación 72.
74. La molécula de unión o fragmento de la misma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o 19- 27, el anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-58, la composición de conformidad con la reivindicación 59, el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60 a 64, el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 a 70, o la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 71, caracterizados porque la especie de Pseudomonas es Pseudomonas aeruginosa .
75. La molécula de unión o fragmento de la misma, el anticuerpo o fragmento del mismo, o la composición de conformidad con la reivindicación 74, caracterizados porque se unen a dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más serotipos de P. aeruginosa diferentes.
76. La molécula de unión o fragmento de la misma, el anticuerpo o fragmento del mismo, o la composición de conformidad con la reivindicación 74 o 75, caracterizados porque se unen a al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% de cepas de P. aeruginosa aisladas de pacientes infectados.
77. La molécula de unión o fragmento de la misma, el anticuerpo o fragmento del mismo, o la composición de conformidad con la reivindicación 76, caracterizados porque las cepas de P. aeruginosa son aisladas de uno o más de pulmón, esputo, ojo, pus, heces, orina, senos, una herida, piel, sangre, hueso o fluido de rodilla.
78. Un método para prevenir o tratar una infección por Pseudomonas en un sujeto que lo necesita, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de la molécula de unión o fragmento de la misma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o 19-27, el anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-58, la composición de conformidad con la reivindicación 59, el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60 a 64, el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 a 70, o la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 71.
79. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque la infección por Pseudomonas es una infección por P. aeruginosa .
80. El método de conformidad con la reivindicación 78 o 79, caracterizado porque el sujeto es un humano.
81. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 78 a 80, caracterizado porque la infección es una infección ocular, una infección pulmonar, una infección por quemadura, una infección de una herida, una infección en la piel, una infección en la sangre, una infección en los huesos o una combinación de dos o más de las infecciones.
82. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 78 a 81, caracterizado porque el sujeto padece neumonía aguda, lesión por quemadura, infección de la córnea, fibrosis quística o una combinación de éstas.
83. Un método para bloquear o prevenir la unión de P. aeruginosa a células epiteliales, caracterizado porque comprende poner en contacto una mezcla de células epiteliales y P. aeruginosa con la molécula de unión o fragmento de la misma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o 19-27, el anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-58, la composición de conformidad con la reivindicación 59, el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60 a 64, el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 a 70 o la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 71.
84. Un método para mejorar la OPK de P. aeruginosa caracterizado porque comprende poner en contacto una mezcla de células fagocíticas y P. aeruginosa con la molécula de unión o fragmento de la misma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o 19-27, el anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 16-18 o 27-58, la composición de conformidad con la reivindicación 59, el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60 a 64, el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 a 70 o la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 71.
85. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque las células fagocíticas son células HL-60 diferenciadas o leucocitos polimorfonucleares (PM ) humanos .
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE038509T2 (hu) 2011-06-10 2018-10-29 Medimmune Ltd Pseudomonas PSL elleni kötõmolekula és alkalmazása
JP6182152B2 (ja) * 2011-11-07 2017-08-16 メディミューン，エルエルシー 抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＰｓｌおよびＰｃｒＶ結合分子を用いた併用治療
EP2917236A2 (en) * 2012-11-06 2015-09-16 MedImmune, LLC Combination therapies using anti-pseudomonas psl and pcrv binding molecules
JP2016524606A (ja) * 2013-05-14 2016-08-18 メディミューン，エルエルシー 緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＰｓｌエキソ多糖の合成オリゴ糖サブユニットおよびその使用
TWI805109B (zh) * 2014-08-28 2023-06-11 美商奇諾治療有限公司 對cd19具專一性之抗體及嵌合抗原受體
GB201518668D0 (en) * 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic Comosition
CN108368149A (zh) 2015-11-30 2018-08-03 免疫医疗有限公司 用于预防或治疗医源性肺炎的方法
JP2019509737A (ja) 2016-03-11 2019-04-11 スカラー ロック インコーポレイテッドＳｃｈｏｌａｒ Ｒｏｃｋ，Ｉｎｃ． ＴＧＦβ１結合性免疫グロブリンおよびその使用
SG11201809778TA (en) * 2016-05-05 2018-12-28 Univ Pennsylvania Dna antibody constructs for use against pseudomonas aeruginosa
WO2018186225A1 (ja) 2017-04-03 2018-10-11 富士フイルム株式会社 インク組成物及びその製造方法、並びに画像形成方法
GB201816553D0 (en) 2018-10-10 2018-11-28 Centauri Therapeutics Ltd Novel compounds and therapeutic uses thereof
GB201816554D0 (en) 2018-10-10 2018-11-28 Centauri Therapeutics Ltd Novel compounds and therapeutic uses thereof
AU2020223205A1 (en) 2019-02-12 2021-08-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for using bispecific antibodies to bind complement and a target antigen
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
JP7474393B2 (ja) 2020-04-22 2024-04-25 センクシア株式会社 アンカーボルトの施工方法、及びその方法に使用する箱抜き用型枠
CN116693680A (zh) * 2020-08-07 2023-09-05 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 特异性识别假单胞菌psl的抗体及其用途
WO2024123712A1 (en) * 2022-12-04 2024-06-13 Genentech, Inc. Analysis of candidate cytotoxic compositions

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
EP0215131B1 (en) * 1985-03-11 1992-06-17 Teijin Limited E87ag antigen of pseudomonas aeruginosa, monoclonal antibody against it, and hybridoma
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB2183662B (en) 1985-04-01 1989-01-25 Celltech Ltd Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
AU4308689A (en) 1988-09-02 1990-04-02 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
ES2315612T3 (es) 1991-04-10 2009-04-01 The Scripps Research Institute Genotecas de receptores heterodimericos usando fagemidos.
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
WO1992022324A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Xoma Corporation Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
JPH09506262A (ja) 1993-12-08 1997-06-24 ジェンザイム・コーポレイション 特異的抗体の製造方法
ES2247204T3 (es) 1994-01-31 2006-03-01 Trustees Of Boston University Bancos de anticuerpos policlonales.
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6420140B1 (en) 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
KR20080059467A (ko) 1996-12-03 2008-06-27 아브게닉스, 인크. 복수의 ｖｈ 및 ｖｋ 부위를 함유하는 사람 면역글로불린유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된항체
WO1998046645A2 (en) 1997-04-14 1998-10-22 Micromet Gesellschaft Für Biomedizinische Forschung Mbh Method for the production of antihuman antigen receptors and uses thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
JP2002512624A (ja) 1997-05-21 2002-04-23 バイオベーション リミテッド 非免疫原性タンパク質の製造方法
WO1999004705A1 (en) 1997-07-25 1999-02-04 Tsui Ban C H Devices, systems and methods for determining proper placement of epidural catheters
NZ507381A (en) 1998-04-21 2003-12-19 Micromet Ag CD19xCD3 specific polypeptides and uses thereof
EP1051432B1 (en) 1998-12-08 2007-01-24 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
WO2002102855A2 (en) 2000-11-17 2002-12-27 University Of Rochester In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells
ATE489395T1 (de) 2000-12-12 2010-12-15 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
US7658921B2 (en) 2000-12-12 2010-02-09 Medimmune, Llc Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
US20020146753A1 (en) 2001-04-06 2002-10-10 Henrik Ditzel Autoantibodies to glucose-6-phosphate isomerase and their participation in autoimmune disease
US7119172B2 (en) * 2001-05-21 2006-10-10 The Brigham And Women's Hospital, Inc. P. aeruginosa mucoid exopolysaccharide specific binding peptides
US20030232387A1 (en) 2002-06-14 2003-12-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antibodies that bind alphaE integrin
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
MY169746A (en) 2005-08-19 2019-05-14 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US20090215992A1 (en) 2005-08-19 2009-08-27 Chengbin Wu Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2007147019A2 (en) 2006-06-13 2007-12-21 Zymogenetics, Inc. Il-17 and il-23 antagonists and methods of using the same
US7553936B2 (en) 2006-12-04 2009-06-30 The United States of America as represented by Secretary Department of Health and Human Services Anti-TREM-like transcript-1 (TLT-1) antibodies and compositions
EP2514767A1 (en) 2006-12-19 2012-10-24 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against a metalloproteinase from the ADAM family and polypeptides comprising the same for the treatment of ADAM-related diseases and disorders
WO2009073631A2 (en) 2007-11-30 2009-06-11 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to the pcrv antigen of pseudomonas aeruginosa
AU2009203426C1 (en) 2008-01-10 2012-05-31 Shionogi & Co., Ltd. Antibody directed against PcrV
BRPI0907046A2 (pt) 2008-01-18 2015-07-28 Medimmune Llc Anticorpo de cisteína engenheirada, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, conjugado de anticorpo, composição farmacêutica, métodos de detecção de câncer, doenças ou distúrbios autoimunes, inflamatórios ou infecciosos em um indivíduo e de inibição de proliferação de uma célula alvo
NZ606283A (en) 2008-11-28 2014-08-29 Abbvie Inc Stable antibody compositions and methods for stabilizing same
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
CA2751433A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Combination antibiotic and antibody therapy for the treatment of pseudomonas aeruginosa infection
WO2010107778A1 (en) 2009-03-18 2010-09-23 Wake Forest University Health Sciences Flagellin fusion proteins and use thereof to induce immune responses against pseudomonas aeruginosa
MX2011009798A (es) * 2009-03-20 2011-12-08 Amgen Inc Inmunoglobulinas portadoras y usos de las mismas.
US20120114657A1 (en) * 2009-04-09 2012-05-10 Kenta Biotech Ag Human Monoclonal Antibody Specific for Lipopolysaccharides (LPS) of Serotype IATS 01 of Pseudomonas Aeruginosa
WO2011005481A1 (en) 2009-06-22 2011-01-13 Medimmune, Llc ENGINEERED Fc REGIONS FOR SITE-SPECIFIC CONJUGATION
CA2784033A1 (en) 2009-12-22 2011-07-21 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. A method of treating a staphylococcus infection in a patient having a low-level pathogenic pseudomonas aeruginosa infection
SG10201600899PA (en) 2011-02-08 2016-03-30 Medimmune Llc Antibodies that specifically bind staphylococcus aureus alpha toxin and methods of use
HUE038509T2 (hu) 2011-06-10 2018-10-29 Medimmune Ltd Pseudomonas PSL elleni kötõmolekula és alkalmazása
JP2014533249A (ja) 2011-11-07 2014-12-11 メディミューン，エルエルシー 多重特異性を持つ多価結合タンパク質およびその使用
JP6182152B2 (ja) * 2011-11-07 2017-08-16 メディミューン，エルエルシー 抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＰｓｌおよびＰｃｒＶ結合分子を用いた併用治療
AU2013341361A1 (en) 2012-11-06 2015-06-04 Medimmune, Llc Antibodies to S. aureus surface determinants
EP2917236A2 (en) 2012-11-06 2015-09-16 MedImmune, LLC Combination therapies using anti-pseudomonas psl and pcrv binding molecules
CN112316135A (zh) 2012-11-06 2021-02-05 米迪缪尼有限公司 治疗金黄色葡萄球菌相关疾病的方法
JP2016524606A (ja) 2013-05-14 2016-08-18 メディミューン，エルエルシー 緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＰｓｌエキソ多糖の合成オリゴ糖サブユニットおよびその使用
WO2015171504A1 (en) 2014-05-05 2015-11-12 Medimmune, Llc Multi-specific anti-pseudomonas psl and pcrv binding molecules and uses thereof
TWI719938B (zh) 2014-06-19 2021-03-01 美商麥迪紐有限責任公司 多重細菌感染之治療
CN108368149A (zh) 2015-11-30 2018-08-03 免疫医疗有限公司 用于预防或治疗医源性肺炎的方法
SG11201809778TA (en) 2016-05-05 2018-12-28 Univ Pennsylvania Dna antibody constructs for use against pseudomonas aeruginosa
JP6988094B2 (ja) 2017-01-27 2022-01-05 富士フイルムビジネスイノベーション株式会社 ポリイミド前駆体組成物、及びポリイミド成形体の製造方法

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