PL176393B1 - Monoklonalne przeciwciało lub jego fragment, które wiąże się swoiście z ludzką interleukiną-5, hybrydoma wydzielająca monoklonalne przeciwciało, które wiąże się swoiście z ludzką interleukiną-5, polipeptyd izolowany DNA, zrekombinowany wektor komórki gospodarza, humanizowane monoklonalne przeciwciało oraz sposób wytwarzania polipeptydu, sposób wytwarzania humanizowanego monoklonalnego przeciwciała i kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Abstract

1. Monoklonalne przeciwcialo lub jego fragment, które wiaze sie swoiscie z ludzka interleukina-5, obejmujace region zmienny lancucha ciezkiego okreslony przez SEK NR ID: 1 i region zmienny lancucha lekkiego okreslony przez SEK NR ID: 2, wytwarzane przez hybrydoma o cechach identyfikacyjnych linii komórkowej zdeponowanej w Amerykanskiej Kolekcji Szczepów (American Type Culture Collection) pod numerem ATCC HB 10959. PL PL PL PL PL

Description

Monoklonalne prreciwriało lub jego Cragmeni, kióre wiąże się swoiście r ludrką inierleukiną-5, hybrydoma wydrielająco monoklonalne prfeciwciałz, kióre wiąże się swoiście r ludrką inierleukiną-5, polipepiyd, iłowany DNA, rrekombinowany wekior, komórki gospodorra, humanirowane monoklonalne prreciwciało orar sposób wytwarronio pzlipepiedu, sposób w^-^^;^:rrania humanirzwsnegz monoklonolnego prreciwciało i kompzrerja Carmoceuiyrrno.

Prredmioiem wynolorku jesi monoklonalne prreriwciałz prreciw ludrkiej inierleukinie-5, wytwarrająco je hybrydoma, humanirowane monoklonalne prfeciwriołz i polipepiyd oporie na monoklonalnym prreciwciele, kodujący je DNA, wektory i komórki gospodorro orar sposób wytwarronio polipepiedu i humanirowanego monoklonolnego prreciwciało i komporycja Cormaceuiycrno.

Inierleukina-5 (IL-5) jesi limCokiną wydzielaną prrer akiywowane limCzcyie T, wykarującą okiewnzść biologicrną w stosunku do limCzzcyiów B i ezrenzCili. Ponieważ IL-5 rosiępuje limCoceiy T w odpowiedz immunologicrnej in vitro no gradiro-foleżne aniygene, narywano ją poc^ikowo crynnikiem rasiępującym limCoryiy T [TRF; Duiion i wsp., Prog. Immunol. 1: 355 (1971; Schimpl i wsp., Noiure 237:15 (1972)]. Ponieważ stymuluje ono również rróżnirowanie limCocyiów B w iworrące łysinki komórki produkujące IgM i IgG orar wrrosi chłoniaków r limCZreiów B in vitro narwano ją iakże crynnikiem wrrostowym II limfocytów B [BCGFII; Takoisu i wsp., J. Immunol. 124:2414 (1980)].

IL-5 mesre składa się re 133 resri ominokwsdowech, włącrając w io 20-ominokwosową sekwencję sygnałową i irry poiencjalne miejsca N-glikzrelacji. Deglikzrelorjo nie wpływa na akieWność biologicrną mysiej IL-5 w ieście proliferacji komórek B [Tovemier i wsp., DNA 5:491 (1989)]. Ludrka IL-5 składa się re 134 resri sminokwadowerh w^crając w io 19-aminokwasową sekwencję sygnałową i dwa poiencjalne miejsca N-glikorylocji. Sirukiura obu białek rosiało opisano prrer Yokoia i wsp. [Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7388 (1987)] i Kinashi i wsp. [Nature 324:70 (1986)]. Stopnie homologii międry ludrką i mysią IL-5 no poriomie sekwencji nukleziedowej i sminokwsdowej wynoszą odpowiednio, 77 i 70%.

Obydwie, mysio i ludrka IL-5 występują jako homodimery po^crone wiąroniomi dwusiarcrkowemi. Dlaiego ież glikorylowana rrekombinowano ludrka IL-5 migruje podcras elekiroCorery w żelu akrelamidowem r SDS jako crąstecrka o masie 40000 dalionów w warunkach nieredukujących, o 20-22000 dalionów w warunkach redukujących [Tsujimoio i wsp.,/. Biochem. 106:23 (1989)].

Klonowanie i ekspresjo IL-5 mesre rosiały opisane na prrykład prrer Kinashi i wsp. [Nature 324:10 (1986)] orar Tokaisu i wsp. [/ Immunol 134:382 (1985)]. Komplemeniarny DNA (cDNA) dla ludrkiej IL-5 rosiał wyizolowany prrer Aruma i wsp. [Nucleic Acids Res. 14: 9149 (1986)] prry użyciu jako sondy mysiego cDNA dla IL-5.

Wykor^m, że IL-5 drioło jako crynnik uirremujące i różnicujący dla ezzenoCili. U crłowieko skiewność IL-5 wydaje się być specyCicrna i dziecryć głównie eofenoCili. Ludrka IL-5 indukuje prreksriałcenie komórki prekursor^owej dla eorynoCili w komórkę dojrzałą.

176 393

Co więcej, przeżywalność eozynofili izolowanych z krwi obwodowej może być zwiększona w obecności ludzkiej IL-5 w podłożu hodowlanym. Ludzka IL-5 stymuluje również degranulację w hodowli eozynofili i uwolnienie toksycznych białek takich jak główne zasadowe białko (MBP) i neurotoksyna pochodzenia eozynofilowego (EDN) [Kita i wsp., J. Immunol 149:629 (1992)].

Sugerowano, że eozynofUe zabijają pasożyty po infekcji, jak również odgrywają ważną rolę w stanach zapalnych i alergiach [patrz np. Sanderson, Blood 79:3101 (1992)]. Podwyższony poziom eozynofili wśród krążących leukocytów obserwowano po infekcji pasożytów i w niektórych tkankach będących w chronicznym stanie zapalnym, takich jak pęcherzyki płucne u astmatyków. Naciek komórkami eozynofili i uwolnienie z eozynofili toksycznych ziarnistości mogą odgrywać rolę w rozkładzie tkanek i mogą nasilać objawy astmy.

Przykładowo, Gleich i wsp. [Adv. Immunol. 39:177 (1986)] i Frigas i wsp. [/. Allergy Clin. Immunol. 77:527 (1986)] wykazali, że eozynofile o wysokiej gęstości i główne zasadowe białko eozynofili (MBP) towarzyszą astmie oskrzelowej i uszkodzeniom pokrewnych tkanek.

Ostatnio Coffman i wsp. (Publikacje Międzynarodowego Zgłoszenia Patentowego Nr WO/04979) wykazali, że przeciwciała przeciw IL-5 mogą zapobiegać lub ograniczać eozynofilię towarzyszącą niektórym chorobom alergicznym, takim jak astma. Przeciwciała monoklonalne, które wiążą się specyficznie i neutralizują biologiczną aktywność ludzkiego IL-5 mogą być użyte do tego celu.

Istnieją doniesienia, że monoklonalne przeciwciała przeciwciał IL-5 wyraźnie wpływają na cofanie się eozynofili wywołanej przez pasożyty u zwierząt eksperymentalnych [Schumacher i wsp., J. Immunol. 141:1516 (1988); Coffman i wsp., Science 245:308 (1989)], co sugeruje, że neutralizujące przeciwciała mogą znaleźć kliniczne zastosowanie w łagodzeniu objawów związanych z eozynofilią poprzez unieczynienie IL-5. Rzeczywiście wykazano, że kiedy gryzonie lub małpy cierpiące na zaindukowaną eksperymentalnie eozynofilię traktowano TRFK 5, szczurzym monoklonalnym przeciwciałem mysiej IL-5, liczba eozynofili, zarówno w obiegu, jak i popłuczynach oskrzelowych, wracała do poziomu normalnego. Tak więc neutralizujące monoklonalne przeciwciała mogą być skutecznymi antagonistami.

Ponieważ większość monoklonalnych przeciwciał pochodzi od gryzoni, istnieje zwiększone prawdopodobieństwo, że mogą być one immunogenne przy terapeutycznym stosowaniu u ludzi, szczególnie przy długotrwałym podawaniu. Aby zmniejszyć taką możliwość istnieje potrzeba stworzenia zrekombinowanych lub humanizowanych przeciwciał przeciw ludzkiej IL-5. Przeciwciała takie mogłyby być użyte do leczenia stanów związanych z eozynofilią lub leczenia innych stanów związanych z biologiczną aktywnością IL-5.

Początkowe wysiłki, zmierzające do zmniejszenia immunogenności przeciwciał gryzoni, obejmowały wytwarzanie chimerowych przeciwciał, w których zmienny region z myszy był połączony z ludzkim regionem stałym [Liu i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 54:3439 (1987)]. Wykazano jednakże, że u myszy, którym wstrzyknięto hybrydy ludzkich zmiennych regionów z mysimi stałymi regionami, rozwijała się bardzo silna odpowiedź skierowana przeciw zmiennemu regionowi ludzkiego przeciwciała. Sugeruje to, że pozostawienie w chimerowych przeciwciałach stosowanych u ludzi całego regionu Fv gryzoni, może prowadzić do wytworzenia ludzkich antymysich przeciwciał.

Uważa się zwykle, że pętle CDR w zmiennych domenach cząsteczek przeciwciał obejmują miejsce wiążące, toteż wszczepienie pętli CDR pochodzącej od gryzoni do struktury zrębowej ludzkiego przeciwciała (tzw. humanizacja) byłoby próbą dalszego ograniczania sekwencji pochodzących od gryzoni [Jones i wsp., Naturę 321:522 (1986); Verhoeyen i wsp., Science 239:1534 (1988)]. Badania prowadzone przez Kabat i wsp. [/. Immunol. 147:1109 (1991)] wykazały, że zrębowe reszty aminokwasowe w zmiennych domenach przeciwciał są zaangażowane w utrzymanie struktury pętli CDR. Stwierdzono również, że do zachowania przez humanizowane przeciwciała specyficzności wiązania antygenu konieczne mogą być zmiany w zrębowych resztach utrzymujących strukturę pętli.

17(6393

Istnieją doniesienia o zastosowaniu wszczepienia CDR z utrzymaniem reszt zrębowych przy konstruowaniu wielu humanizowanych przeciwciał, na przykład Queen i wsp. [Proc. Natl. Acad. Sci USA 56:10029 (1989)], Gorman i wsp. [Proc. Natl. Acad. Sci USA 55:4181 (1991)] and Hodgson [Bo/Technology 9:421 (1991)]. Dokładne dane o sekwencji zostały opublikowane tylko dla kilku humanizowanych konstruktów.

Jakkolwiek wiadomo, że wysoki stopień podobieństwa pomiędzy ludzkimi i zwierzęcymi przeciwciałami jest istotny przy wyborze sekwencji ludzkich przeciwciał użytych do humanizacji, w większości wcześniejszych badań stosowano różne ludzkie sekwencje w kombinacji ze zwierzęcymi zmiennymi sekwencjami lekkich i ciężkich łańcuchów. Użyte sekwencje pochodziły z poznanych przeciwciał lub częściej, z przeciwciał o znanej strukturze krystalicznej: przeciwciał NEW i KOL. Patrz np. Jones i wsp., jak wyżej; Verhoeyen i wsp., jak wyżej; i Gorman i wsp., jak wyżej.

Sposoby konstruowania przeciwciał zostały opisane, np. przez Boss i wsp. (Opis Patentowy USA, Nr 4816397), Cabilly i wsp. (Opis Patentowy USA, Nr 4816567), Law i wsp. (Publikacje Europejskiego Zgłoszenia Patentowego Nr 438 310) i Winter (Publikacje Europejskiego Zgłoszenia Patentowego Nr 239 400).

Bazowanie na stosunkowo niewielkiej liczbie przeciwciał o znanej strukturze krystalicznej, prowadziło do częstego używania różnych sekwencji lekkiego i ciężkiego łańcucha z różnych przeciwciał, ponieważ, jakkolwiek struktura krystaliczna była poznana tylko dla dwóch ludzkich Fab, struktura ta została określona dla kilku ludzkich łańcuchów lekkich. Tego typu podejście może wymagać zmian reszt zrębowych w ludzkich ciężkich i lekkich łańcuchach, tak aby zapewnić prawidłowe połączenie łańcuchów, co w rezultacie ogranicza zastosowanie humanizacji.

Istnieje więc potrzeba udoskonalonych metod wytwarzania humanizowanych przeciwciał tak aby nie opierały się na stosunkowo nielicznych znanych strukturach krystalograficznych.

Niniejszy wynalazek dotyczy monoklonalnego przeciwciała wytwarzanego przez hybrydoma, mającą cechy identyfikacyjne linii komórkowej zdeponowanej w Amerykańskiej Kolekcji Szczepów (American Type Culture Colection) pod numerem ATCC HB 10959, oraz samej hybrydoma.

Przeciwciało to wiąże się swoiście z ludzką interleukiną-5 i obejmuje region zmienny łańcucha ciężkiego określony przez SEK NR ID: 1 i region zmienny łańcucha lekkiego określony przez SEK NR ID: 2. . .

Dalsza część niniejszego wynalazku dotyczy polipetydów obejmujących region zmienny ciężkiego i lekkiego łańcucha monoklonalnego przeciwciała, mający sekwencję aminokwasów określoną jako SEK NR ID: 1 lub SEK Nr ID: 2, w tym regiony determinujące komplementamość (CDR) oraz izolowanych fragmentów DNA kodujących takie regiony zmienne i CDR. Izolowany DNA według wynalazku obejmuje około '12 do 333 zasad sekwencji nukleotydowej zdefiniowanej przez SEK NR ID: 1 lub około 9 do 384 zasad sekwencji nukleotydowej zdefiniowanej przez SEK NR ID: 2, bądź też jest funkcjonalnym odpowiednikiem takich sekwencji.

Te fragmenty DNA mogą być używane do konstruowania kompozycji wiążących, jednołańcuchowych białek wiążących, polipeptydów zawierających jeden lub więcej regionów CDR i zachowujących zdolność wiązania antygenu oraz zrekombinowanych przeciwciał zawierających takie regiony CDR.

Wynalazek dotyczy wektorów zawierających te fragmenty oraz komórek stransformowanych takimi wektorami i sposobu wytwarzania takich polipeptydów przez hodowanie komórek zawierających wektor wprowadzający określony powyżej izolowany DNA. Wynalazek dotyczy także humanizowanego monoklonalnego przeciwciała, które wiąże swoiście ludzką interleukinę-5 i zawiera sekwencje CDR z regionów zmiennych ciężkiego i lekkiego łańcucha monoklonalnego przeciwciała wytwarzanego przez określoną powyżej hybrydoma.

176 393

Humanizowane monoklonalne przeciwciało zawiera regiony zmienne ciężkiego i/lub lekkiego łańcucha przeciwciała, mające sekwencje, poczynając od 20 reszty aminokwasowej, zdefiniowane przez SEK NR ID: 36, 37, 40, 41, 46, 47, 56, 57,64 lub 65.

Wynalazek obejmuje również DNA, który koduje ten region zmienny lekkiego i ciężkiego łańcucha oraz zawierający go wektor i stransformowane tym wektorem komórki gospodarza a także sposób wytwarzania takich humanizowanych przeciwciał metodą rekombinacji DNA przez hodowanie tych stransformowanych komórek w warunkach umożliwiających ekspresję wymienionego DNA.

Niniejszy wynalazek w dalszej części dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej określone powyżej monoklonalne przeciwciało, kompozycję wiążącą, która swoiście wiąże ludzką interleukinę-5, zawierającą region zmienny łańcucha ciężkiego i region zmienny łańcucha lekkiego monoklonalnego przeciwciała, jednołańcuchowe białko wiążące, które swoiście wiąże ludzką interleukinę-5, zawierające sekwencje CDR z regionów zmiennych lekkiego i/lub ciężkiego łańcucha monoklonalnego przeciwciała oraz humanizowane monoklonalne przeciwciało, które wiąże się swoiście z interleukiną-5, zawierające sekwencje CDR z regionów zmiennych ciężkiego i lekkiego łańcucha monoklonalnego przeciwciała oraz fizjologicznie dopuszczalny nośnik.

Krótki opis figur

Niniejszy wynalazek może być lepiej zrozumiany poprzez odniesienie się do opisu i przykładu przedstawionego poniżej oraz do towarzyszących im figur, w których:

Figura 1 jest schematycznym przedstawieniem plazmidu pSRSMPA5H

Figura 2 jest schematycznym przedstawieniem plazmidu pDSRGMPA5H

Figura 3 jest schematycznym przedstawieniem plazmidu pDSRGMPA5L

Figura 4 jest schematycznym przedstawieniem plazmidu pSRSMPA5L.

Opis wynalazku

Używany w niniejszym zgłoszeniu termin DNA i fragmenty DNA oznacza cząsteczki zawierające dezoksyrybonukleotydy połączone standardowym wiązaniem fosfodwuestrowym 5' do 3', włączając w to zarówno mniejsze oligodezoksyrybonukleotydy jak i większe cząsteczki kwasów dezoksyrybonukleinowych.

Przeciwciała składają się z połączonych łańcuchów polipeptydowych, związanych ze sobą mostkami dwusiarczkowymi. Dwa podstawowe łańcuchy polipeptydowe, określane jako łańcuch lekki i łańcuch ciężki, tworzą wszystkie główne strukturalne klasy (izotypy) przeciwciał. Zarówno ciężkie łańcuchy, jak i lekkie łańcuchy, są dalej podzielone na podregiony określane jako regiony i regiony stałe. Ciężkie łańcuchy składają się z jednego regionu zmiennego i trzech lub czterech różnych regionów stałych, natomiast lekki łańcuch składa się z jednego regionu zmiennego (różnego od obecnego w łańcuchu ciężkim) i pojedynczy region stały (różny od znajdujących się w łańcuchu ciężkim). Regiony zmienne łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego są odpowiedzialne za specyficzność wiązania przeciwciała.

Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin pętle strukturalne CDR oznaczają trzy regiony w części zmiennej łańcucha lekkiego i trzy regiony w części zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciała, które łączą łańcuchy β w obszarze wiążącym cząsteczki. Pętle te mają charakterystyczną kanoniczną strukturę [Chothia i wsp.,/. Mol. Biol. 196:901 (1987); Chothia i wsp.,/. Mol. Biol. 227:199 (1992)].

Termin Kabat CDR oznacza hiper-zmienne sekwencje przeciwciał w ciężkich i lekkich łańcuchach zdefiniowane przez Kabat i wsp. [Sequences and Proteins of Immunological Interest, wydanie 4, 1987, U.S. Department of Health and Human Services , National Institutes of Health].

Stosowany w niniejszym wynalazku termin region zmienny łańcucha ciężkiego oznacza polipeptyd o długości około 110-125 reszt aminokwasowych, którego sekwencja aminokwasowa odpowiada sekwencji ciężkiego łańcucha monoklonalnego przeciwciała

176 393 będącego przedmiotem wynalazku, poczynając od N-końcowej reszty aminokwasowej łańcucha ciężkiego. Analogicznie, termin region zmienny łańcucha lekkiego oznacza polipeptyd o długości około 95-130 reszt aminokwasowych, którego sekwencja aminokwasów odpowiada sekwencji łańcucha lekkiego monoklonalnego przeciwciała będącego przedmiotem wynalazku, poczynając od N-końcowej reszty aminokwasowej łańcucha lekkiego.

Oznaczania Fab, Fc, F(ab)₂ oraz Fv są stosowane w standardowym znaczeniu przyjętym w immunologii [Klein, Immunology (John Wiley, New York, 1982); Parham, Rozdział 14 w Weir, wyd. ImmunochemSttty, wydanie 4 (Blackwell Scientific Publishers, Oxford, 1986)].

Stosowany w niniejszym wynalazku termin przeciwciało monoklonalne oznacza jednorodną populację immunoglobulin, które wykazują zdolność do specyficznego wiązania ludzkiej IL-5. Bierze się pod uwagę, że ludzka IL-5 może mieć jedną lub więcej determinant antygenowych obejmujących (1) peptydowe determinanty antygenowe złożone z pojedynczych łańcuchów w obrębie ludzkiej IL-5, (2) konformacyjne determinanty antygenowe, złożone z więcej niż jednego przestrzennie ciągłych łańcuchów peptydowych, których odpowiednie sekwencje aminokwasowe są zlokalizowane w sposób nieciągły wzdłuż sekwencji białkowej ludzkiej IL-5 oraz (3) post-translacyjne determinanty antygenowe, złożone w całości lub w części ze struktur molekularnych, dołączonych kowalencyjnie do ludzkiej IL-5 po translacji, takich jak reszty węglowodanowe lub temu podobne. Przeciwciała będące przedmiotem wynalazku mogą być skierowane przeciw jednej lub kilku z tych determinant.

Stosowany w niniejszym wynalazku termin kompozycja wiążąca oznacza kompozycję składającą się z dwóch łańcuchów polipeptydowych, (1) które, efektywnie połączone, przyjmują konformację mającą wysoką zdolność wiązania ludzkiej IL-5, (2) które pochodzą od hybrydomy wytwarzającej monoklonalne przeciwciała specyficzne dla ludzkiej IL-5. Termin efektywnie połączone ma wskazywać, że dla uzyskania wiązania antygenu, dwa łańcuchy polipeptydowe mogą być usytuowane względem siebie różnymi sposobami, wliczając w to przyłączenie natywnego fragmentu przeciwciał, takiego jak Fab lub Fv, lub drogą genetycznie skonstruowanych łączników peptydowych zawierających cysteinę, bądź też innych łączników na końcu karbo ksylowym.

Przeciwciała monoklonalne mogą być przygotowywane przy użyciu standardowych metod, opisanych na przykład przez Kohler i wsp. [Nature 256:495 (1975); Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)]. W skrócie, zwierzę jest immunizowane wg standardowych metod w celu wytworzenia komórek somatycznych wydzielających przeciwciała. Komórki takie są następnie pobierane z immunizowanych zwi^^^:ząt do fuzji z komórkami szpiczaka.

Komórki somatyczne potencjalnie zdolne do tworzenia przeciwciał, w szczególności komórki B, są odpowiednie do fuzji z linią komórkową szpiczaka. Takie komórki somatyczne mogą pochodzić węzłów limfatycznych, śledziony i krwi obwodowej sprawdzonych zwierząt. W przykładzie ilustrującym niniejszy wynalazek użyte komórki pochodzą ze śledziony szczura, po części dlatego, że komórki te wytwarzają stosunkowo wysoki procent stabilnych fuzji z linią mysiego szpiczaka. Jednakże istnieje możliwość użycia komórek ludzkich, mysich, owczych lub kozich, jak również pochodzących z innych gatunków zwierząt.

Wyspecjalizowane linie komórkowe szpiczaka zostały wyprowadzone z nowotworów limfocytarnych w celu zastosowania w fuzjach prowadząc do powstania hybrydomy [Kohler i Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Shulman i wsp., Nature 276:269 (1978); Volk i wsp., J. Virol. 42:220 (1982)]. Istnieją co najmniej trzy powody wyprowadzenia takich linii komórkowych. Po pierwsze, dla ułatwienia selekcji połączonych komórek hybrydomy spośród nie połączonych i podobnie dzielących się w nieskończoność komórek szpiczaka. Zwykle osiąga się to poprzez zastosowanie szpiczaków z defektem enzymatycznym, który czyni je niezdolnymi do wzrostu na pewnych podłożach selektywnych podtrzymujących wzrost komórek hybrydomy. Drugi powód wynika z właściwej komórkom nowotworów limfocytarnych zdolności do wytwarzania swoich własnych przeciwciał. Celem zastosowania technik monoklonalnych jest otrzymanie linii połączonych hybrydowych komórek z

176 393 nieograniczonym czasem życia, które wytwarzałyby jeden żądany rodzaj przeciwciała pod kontrolą genetyczną komórki somatycznej, będącej częścią składową hybrydomy. Aby wyeliminować wytwarzanie przez hybrydomę przeciwciał specyficznych dla komórki nowotworowej, stosowane są linie komórkowe szpiczaka, niezdolne do wytwarzania własnych lekkich lub ciężkich łańcuchów immunoglobulinowych. Trzecim powodem selekcji tych linii komórkowych jest ich zdolność do fuzji i jej wydajność.

Wiele linii komórkowych szpiczaka może być użytych do wytwarzania połączonych komórek hybryd, włączając w to np. P3X63-Ag8, P3x63-AC8.653, p3/NS1-Ag4-1 (NS-1), Sp2/0-Ag14 i S194/5.XXO.Bu.1. Linie komórkowe P3X63-Ag8 i NS-1 zostały opisane przez Kohler i Milstein [Eur. J. Immunol 6:511 (1976)]. Shulman i wsp. [Nature 276 :269 (1978)] wyprowadzili linię komórkową szpiczaka Sp2/0-Agl4. Towbridge [/. Exp. Med. 148:313 (1979)] doniósł o linii S194/5. XXO.Bu.1.

Sposoby tworzenia hybryd komórek śledziony lub węzła limfatycznego produkującego przeciwciała z komórkami szpiczaka wymagają zwykle mieszania komórek somatycznych z komórkami szpiczaka w proporcji 10:1 (jakkolwiek proporcja ta może wahać się od 20:1 do 1:1) w obecności czynnika lub czynników (chemicznych, wirusowych lub elektrycznych), które przyczyniają się łączenia błon komórkowych. Sposoby fuzji zostały opisane przez Kohler i Milstein, jak wyżej, Cefter i wsp. [Somatic Cell Genet.3:231 (1977) oraz Volk i wsp. (J. Vrol. 42:220 (1982)]. Czynniki powodujące fuzje używane przez tych badaczy to wirus Sendai i glikol polietylenowy (PEC).

Ponieważ metodami fuzji otrzymuje się żywotne hybrydy z bardzo małą częstością (przykładowo, przy zastosowaniu śledziony jako źródła komórek somatycznych, otrzymuje się tylko jedną hybrydę na około 1Χ10⁵ komórek śledziony), istotne jest posiadanie sposobu selekcji komórek hybrydowych spośród pozostałych nie połączonych komórek, a w szczególności komórek szpiczaka, które nie uległy fuzji. Niezbędne są również sposoby wyróżniania żądanych hybrydom wytwarzających przeciwciała wśród innych hybryd komórkowych powstających w wyniku fuzji.

Najogólniej, selekcję hybryd po fuzji komórek uzyskuje się poprzez hodowanie komórek na podłożach, które umożliwiają wzrost hybrydomom, natomiast zapobiegają wzrostowi nie połączonym komórkom szpiczaka, które normalnie dzieliłyby się w nieskończoność. Komórki somatyczne użyte do fuzji nie zachowują żywotności przez dłuższy czas w hodowli in vitro, nie stanowią więc problemu. W przykładzie przedstawionym w niniejszym wynalazku użyto komórki szpiczaka pozbawione fosforybozylotransferazy hypoksantynowej (HPRT ujemne). Eliminację tych komórek uzyskuje się w podłożu zawierającym hipoksantynę/aminopterynę/tymidynę (HAT), w którym komórki hybrydowe po fuzji przeżywają dzięki HPRT-dodatniemu genotypowi komórek śledziony. Możliwe jest również zastosowanie komórek szpiczaka z różnymi defektami genetycznymi (wrażliwość na antybiotyki itp.), które mogą posłużyć do ich negatywnej selekcji na podłożu umożliwiającym wzrost komórkom hybrydowym o odpowiednim genotypie.

Kilka tygodni potrzeba dla selektywnego wyhodowania hybryd po fuzji komórek. W początkowym okresie konieczne jest zidentyfikowanie takich hybryd, które wytwarzają żądane przeciwciała, co umożliwia następnie ich klonowanie i namnożenie. Generalnie, około 10% uzyskanych hybryd wytwarza żądane przeciwciała, jakkolwiek zakres od 1 do 30% nie jest rzadkością. Wykrycie hybryd wytwarzających przeciwciała można osiągnąć poprzez jedną z kilku standardowych metod wykrywania, obejmujących enzymatyczny test immunosorpcyjny i techniki radioimmunologiczne opisane w literaturze [patrz np. Kennet i wsp., (wydawcy), Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses str. 376-384, Plenum Press, New York (1980)].

Po wyselekcjonowaniu żądanych hybryd powstałych w wyniku fuzji komórek i przeprowadzeniu ich w pojedyncze linie komórkowe produkujące przeciwciała, każda linia komórkowa może być namnażana jednym z dwóch standardowych sposobów. Zawiesina komórek hybrydomy może być wstrzyknięta do zwierząt o odpowiedniej zgodności tkankowej. U zwierzęcia po takim zastrzyku powstają nowotwory, które wydzielają specyficzne

176 393 przeciwciała monoklonalne wytwarzane przez hybrydy - produkty fuzji komórek. W celu otrzymania wysokiego stężenie monoklonalnych przeciwciał pobiera się z organizmu zwierzęcia płyny takie jak surowica lub płyn puchlinowy. Alternatywnie pojedyncze linie komórkowe mogą być namnażane in vitro w laboratoryjnych naczyniach hodowlanych. Jednorodne specyficzne przeciwciała monoklonalne, obecne w dużym stężeniu w podłożu hodowlanym, mogą być zagęszczane poprzez dekantację, filtację lub wirowanie, a następnie oczyszczane.

Przeciwciała monoklonalne mogą być również wytwarzane przy użyciu dobrze poznanych systemów bibliotek fagowych.

Dobrze znane są przypadki zastosowania i wytwarzania fragmentów przeciwciał np. fragmentów Fab [Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Imunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)], fragmentów Fv Hochman i wsp., Biochemistry 12:1130 (1973); Sharon i wsp., Biochemistry 25:1591 (1976); Ehrlich i wsp., Patent USA Nr 4355023] i połówek cząsteczki przeciwciała (Auditore-Hargreaves Patent USA Nr 4470925). Ponadto, takie cząsteczki i ich kompozycje mogą być używane do wytwarzania przeciwciał o podwójnej specyficzności przy zastosowaniu znanych technik, np. przez kolejne fuzje hybrydom (tzn. utworzenie tak zwanych quadrom; por. Patent USA Nr 4474493) lub poprzez reasocjację połówek cząsteczek [Brennan i wsp., Science 229:81 (1985)].

Hybrydomy i przeciwciała monoklonalne mogą być wytwarzane przeciw ludzkiej IL-5 pochodzącej z dowolnego źródła, np. dostępnej w handlu, w naturalnych źródłach, bądź też będącej wynikiem zastosowania metod syntezy chemicznej lub rekombinowania DNA. W niniejszym wynalazku zrekombinowana IL-5 oznacza IL-5 uzyskaną poprzez ekspresję kodującego ją zrekombinowanego DNA (cDNA) w prokariotycznym i eukariotycznym systemie ekspresyjnym. Ponadto, genomowy DNA może być użyty do wytwarzania IL-5 w systemach eukariotycznych. Produkowana IL-5 może być glikozylowana lub nieglikozylowana.

Ponieważ znane są sekwencje nukleotydowe fragmentów DNA kodujących mysią i ludzką IL-5 [patrz np. Azuma i wsp., Nuci. Acids Res. 14:9149 (1986)], można syntetyzować takie DNA chemicznie stosując metodę wg Matteuci i wsp., [Ź. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)], metodę wg Yoo i wsp., [/. Biol. Chem. 764:17078 (1989)] lub inne dobrze znane metody. Można to osiągnąć na przykład poprzez zsyntetyzowanie stosunkowo krótkich oligonukleotydów i połączenie ich przy użyciu ligazy, w analogiczny sposób w jaki Barr i wsp. (Publikacja Międzynarodowego Zgłoszenia Patentowego Nr WO 85/02200) chemicznie zsyntetyzowali DNA kodujący IL-5.

Alternatywnie, linie komórkowe zdolne do wytwarzania IL-5 mogą być pobudzane do produkowania mRNA dla IL-5, który może posłużyć jako matryca do zrobienia IL-5 cDNA wg standardowych metod. Można następnie skonstruować bibliotekę cDNA, w której cDNA dla IL-5 może być zidentyfikowany przy użyciu oligonukleotydowej złożonej sondy utworzonej w oparciu o dostępne dane o sekwencji. Taki cDNA może być następnie sklonowany i wyraźny w jednym z wielu dostępnych bakteryjnych, drożdżowych lub ssaczych systemów ekspresyjnych. Metoda ta została zastosowana do wytworzenia zrekombinowanej szczurzej, mysiej lub ludzkiej IL-5 [patrz np. Tavemier i wsp., DNA 8:491 (1989); Minamitake i wsp., J. Biochem. 107:292 (1990); Uberla i wsp. Cytokine 3:12 (1991)]. Według szeroko rozpowszechnionego amerykańskiego wdrożenia patentowego (Nr porządkowy 07/617061, rejestracja 16 listopada) ludzka IL-5 jest produkowana poprzez ekspresję cDNA kodującego ludzką IL-5 w komórkach jajnika z chomika (CHO). Również Tsujimoto i wsp., [/. Biochem. 106:23 (1989)] opisali wytwarzanie zrekombinowanej ludzkiej IL-5 w komórkach CHO.

Stosując jeszcze inne podejście, można użyć złożoną sondę oligonukleotydową, utworzoną w oparciu o znaną sekwencję nukleotydową IL-5, do wykrycia genów dla IL-5 w bibliotekach genomowego DNA przygotowanych wg standardowych metod. DNA w taki sposób zidentyfikowany może być wycięty z biblioteki poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi, zsekwencjonowany i wyrażony w eukariotycznym systemie ekspresyjnym

176 393 lub (po wycięciu intronów wg standardowych metod, o ile to konieczne) w prokariotycznym systemie ekspresyjnym. W ten sposób Campbell i wsp., [Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:6629 (1987)] wytworzyli ludzką IL-5 w komórkach małpiej nerki (COS).

Oczywiście, obydwie biblioteki, cDNA i genomowego DNA, mogą być przeszukane przy zastosowaniu standardowych metod klonowania i ekspresji, zamiast używania sond oligonukleotydowych. Wytwarzaną w taki sposób IL-5 wykrywa się poprzez zastosowanie znanych metod immunochemicznych lub biologicznych.

Polipeptydy IL-5 można również wyprodukować bezpośrednio stosując chemię syntetycznych peptydów, tak jak zostało opisane np. przez Merrifield [/. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)], bądź też IL-5 może być zakupiona.

Po otrzymaniu hybrydomy produkującej żądane monoklonalne przeciwciało można zastosować techniki prowadzące do wytworzenia międzygatunkowych monoklonalnych przeciwciał, w których region wiążący z jednego gatunku jest połączony z regionem niewiążącym z przeciwciała innego gatunku [Liu i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439 (1987)]. Na przykład, regiony CDR z monoklonalnego przeciwciała gryzoni mogą być włączone do ludzkiego przeciwciała, humanizując w ten sposób przeciwciało gryzoni [Riechman i wsp., Nature 332:323 (1981)]. Dokładniej, fragmenty CDR mogą być włączone do regionu zmiennego ludzkiego przeciwciała zawierającego lub nie zawierającego ludzkich regionów stałych. Taka metodologia może być zastosowana np. do humanizowania mysich monoklonalnych przeciwciał przeciw podjednostce p55 (Tac) receptora ludzkiej interleukiny-2 [Queen i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 56:10029 (1989)].

cDNA, o których mowa w mniejszym wynalazku, kodujące zmienne regiony ciężkiego i lekkiego łańcucha monoklonalnego przeciwciała, specyficznego w stosunku do ludzkiej IL-5 oraz regiony CDR z takiego przeciwciała, mogą być skonstruowane w ten sam sposób. Lokalizacja regionów CDR w obrębie zmiennych regionów przeciwciał może być określona poprzez zastosowanie licznych dobrze znanych standardowych metod. Przykładowo, zasady lokalizacji regionów CDR zostały opublikowane przez Kabat i wsp., (jak wyżej). Regiony CDR określone przy zastosowaniu tych reguł są określone w niniejszym wynalazku jako regiony CDR Kabata. Dostępne są także programy komputerowe, które można zastosować do identyfikacji pętli strukturalnych CDR na podstawie reszt aminokwasowych zaangażowanych w strukturę trzeciorzędową pętli w miejscu wiążącym łańcuchów przeciwciał, np. jak opisano poniżej.

Opisane tu sposoby mogą znaleźć zastosowanie do humanizowania szerokiego spektrum zwierzęcych przeciwciał. Stosowane jest dwuetapowe podejście, obejmujące (a) wybór sekwencji ludzkich przeciwciał, które mają być użyte jako ludzki region zrębowy do humanizacji oraz (b) określenie, które reszty regionu zmiennego zwierzęcych monoklonalnych przeciwciał powinny być wytypowane w celu włączenia ich do wybranego ludzkiego regionu zrębowego.

Pierwszy etap obejmuje wybór najlepszej dostępnej ludzkiej sekwencji zrębowej, dla której dostępne są dane o sekwencji. Ten proces selekcji opiera się na następujących kryteriach wyboru:

(1) Procent Zgodności

Sekwencje regionów zmiennych ciężkiego i lekkiego łańcucha zwierzęcych monoklonalnych przeciwciał, które mają być humanizowane są dopasowane względem siebie tak aby uzyskać optymalną zgodność, a następnie porównane z wszystkimi znanymi sekwencjami regionu zmiennego ciężkiego i lekkiego łańcucha ludzkich przeciwciał. Na tym polega różnica w stosunku do uprzednio stosowanych metod, które wykorzystywały tylko dwa ludzkie przeciwciała, NEW i KOL. Dla przeciwciał tych, nazwanych inicjałami pacjentów, od których pochodziły, dostępne są informacje o strukturze. Obecnie znana jest również struktura przeciwciał HIL (Brookhaven Code P8FAB).

176 393

Po porównaniu sekwencji zaznacza się identyczne reszty i określa procent zgodności. Przy zachowaniu identyczności wszystkich innych parametrów, wskazane jest wybranie ludzkich przeciwciał, które mają najwyższy procent zgodności z przeciwciałami zwierzęcymi.

(2) Niejednoznaczność Sekwencji

Znane sekwencje łańcuchów przeciwciał są następnie oceniane pod względem obecności reszt niezdefiniowanych i/lub niejednoznaczności wynikającej z wątpliwości co do sekwencji. Brak pewności wynika najczęściej z błędnego zidentyfikowania aminokwasu amidowego jako kwaśny wskutek utraty amoniaku w czasie sekwencjonowania, np. nieprawidłowe zidentyfikowanie kwasu glutaminowego wówczas, gdy aminokwas obecny w białku był glutaminą. Niejednoznaczności wykrywa się przez analizę baz danych takich, jak opisana przez Kabat i wsp. (jak wyżej). Przy założeniu identyczności wszystkich innych parametrów, wskazany jest wybór takiego łańcucha przeciwciała ludzkiego, który wykazuje najmniej tego typu niejednoznaczności.

(3) . Odstęp w Regionie Struktury Szpilki do włosów

Regiony zmienne łańcucha przeciwciał zawierają wewnątrzdomenowe mostki dwusiarczkowe. Odległość (ilość reszt aminokwasowych) pomiędzy cysternami tworzącymi te mostki jest określana jako odstęp w regionie struktury szpilki do włosów (Pin-region spacing) [Chothia i wsp., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)]. Przy założeniu identyczności wszystkich innych parametrów, wskazane jest, żeby odstęp w regionie struktury szpilki do włosów w wybranych ludzkich przeciwciałach był podobny lub identyczny do występującego w przeciwciałach zwierzęcych. Wskazane jest również żeby sekwencja odstępu w ludzkim regionie struktury szpilki do włosów była podobna do takiej, która znajduje się w przeciwciele o znanej strukturze trzeciorzędowej, co ułatwia modelowanie komputerowe.

Opierając się na powyższych kryteriach, jako strukturę zrębową do humanizacji zwierzęcych przeciwciał, wybiera się ludzkie przeciwciało (przeciwciała), wykazujące najlepszą kombinację żądanych cech. Wybrane ciężkie i lekkie łańcuchy mogą pochodzić z tego samego lub różnych ludzkich przeciwciał.

Druga część sposobu dotyczy określenia, które sekwencje regionu zmiennego zwierzęcych przeciwciał powinny być wytypowane do włączenia do ludzkiej sekwencji zrębowej. Przy wyborze tym bierze się pod uwagę następujące kryteria:

(1) Wybór Reszt Aminokwasowych

Ocenie podlegają dwa typy zespołów reszt aminokwasowych regionu zmiennego, z czego pierwszy jest nazywany 'minimalnymi resztami aminokwasowymi. Te minimalne reszty aminokwasowe obejmują pętle strukturalne CDR plus każda dodatkowa reszta aminokwasowa, która na podstawie modelowania komputerowego uważana jest za niezbędną do utrzymania i/lub zorientowania pętli strukturalnych CDR.

Drugi rodzaj zespołu reszt aminokwasowych regionu zmiennego określa się jako reszty maksymalne. Obejmują one reszty minimalne plus regiony CDR Kabata plus każdą dodatkową resztę aminokwasową, którą na podstawie modelowania komputerowego, lokuje się w odległości poniżej 10A od pętli strukturalnej CDR i która posiada powierzchnię około śA lub więcej, dostępną dla rozpuszczalników wodnych [Lee i wsp., J. Biol. Chem. 55:379 (1971)]. W przykładzie przytoczonym poniżej wytypowane są reszty aminokwasowe leżące w obrębie 4A od pętli strukturalnych CDR.

(2) Modelowanie Komputerowe

W celu wytypowania reszt aminokwasowych regionu zmiennego wykonuje się modelowanie komputerowe dotyczące (a) sekwencji regionu zmiennego przeciwciał, które miałyby być humanizowane, (b) wybranych sekwencji zrębowych ludzkiego przeciwciała oraz

176 393 (c) wszystkich możliwych zrekombinowanych przeciwciał zawierających sekwencje zrębowe ludzkiego przeciwciała, do którego włączono różne minimalne i maksymalne zespoły reszt aminokwasowych ze zwierzęcych przeciwciał.

Modelowanie komputerowe wykonywane jest przy użyciu oprogramowania odpowiedniego dla modelowania białek i przy wykorzystaniu danych o strukturze uzyskanych dla przeciwciał, które (a) mają sekwencje aminokwasów w regionie zmiennym niemal identyczne do odpowiednich sekwencji w przeciwciele zwierzęcym i (b) mają znaną strukturę trzeciorzędową. Przykładem oprogramowania, które może być użyte jest oprogramowanie SYBYL Biopolymer Module (Tripos Asscociates). Przeciwciała, których dotyczą informacje o strukturze mogą być, ale nie muszą, przeciwciałami ludzkimi.

W przykładzie przytoczonym poniżej użyto informacji o strukturze mysich przeciwciał oznaczonych 1F19.

Opierając się na rezultatach otrzymanych w wyniku powyższej analizy, do humanizacji wybrano takie zrekombinowane łańcuchy zawierające zwierzęce regiony zmienne, których komputerowa struktura była najbliższa strukturze zwierzęcego przeciwciała.

Sekwenqe nukleotydowe cDNA kodujących część regionu zmiennego ciężkiego łańcucha i kompletny region zmienny lekkiego łańcucha monoldonalnego przeciwciała JES1-39D10 skierowanego przeciw ludzkiej IL-5, których sposób wytwarzania jest opisany poniżej, są oznaczone w spisie sekwencji jako SEK NR ID: 1 i SEK NR ID: 2. Sekwencje aminokwasów przewidziane na podstawie tych sekwencji nukleotydowych są również określone jako SEK NR ID: 1 i 2.

W sekwencji nukleotydowej określonej jako SEK NR ID: 1 (sekwencja łańcucha ciężkiego), nukleotydy 1 do 26 pochodziły od startera reakcji łańcuchowej syntezy DNA (PCR). W związku z tym klonowana sekwencja rozpoczyna się od nukleotydu 27. Odpowiednia sekwencja aminokwasów SEK NR ID: 1 dotyczy dojrzałego polipeptydu Vh, nie włączając sekwencji lidera łub pierwszych czternastu aminokwasów regionu zrębowego nr 1. W sekwencji nukleotydowej określonej jako SEK NR ID: 2 (sekwencja łańcucha lekkiego), nukleotydy 1 i 2 pochodziły od startera PCR. W związku z tym, klonowana sekwencja rozpoczyna się od nukleotydu 3. Odpowiednia sekwencja aminokwasów obejmuje sekwencję liderową i dojrzały polipeptyd Vl

Regiony CDR w zmiennej części ciężkiego łańcucha monoklonalnego przeciwciała JES1-39D10, określone przy zastosowaniu metody wg Kabat i wsp. (jak wyżej) obejmują reszty aminokwasowe 26-30, 45-60 i 93-100 w sekwencji aminokwasowej oznaczonej jako SEK NR ID: 1. Jak stwierdzono na podstawie analizy komputerowej struktur pętli w miejscu wiążącym, opisanej poniżej, pętle strukturalne regionu CDR części zmiennej ciężkiego łańcucha monoklonalnego przeciwciała JES1-39D10 obejmują aminokwasy 21-27, 47-50 i 93-101 w sekwencji aminokwasów oznaczonej jako SEK NR ID: 1.

Sekwencje nukleotydowe, kodujące powyższe regiony CDR ciężkiego łańcucha obejmują nukleotydy 76-90, 133-180 oraz 277-300 (ustalenie wg Kabat) oraz nukleotydy 61-81, 139-150 oraz 277-303 (analiza pętli) w sekwencji nukleotydowej oznaczonej jako SEK NR ID: 1.

Regiony CDR części zmiennej lekkiego łańcucha monoklonalnego przeciwciała JES1-39D10, ustalone przy zastosowaniu metody wg Kabat i wsp. (jak wyżej), obejmują aminokwasy 44-54, 70-76 oraz 109-117 w sekwencji aminokwasowej oznaczonej jako SEK NR ID: 2. Jak stwierdzono na podstawie analizy komputerowej struktur pętli w miejscu wiążącym, opisanej poniżej, pętle strukturalne CDR w regionie zmiennym lekkiego łańcucha przeciwciała monoklonalnego JES1-39D10 obejmują aminokwasy 46-51, 70-76 oraz 111-116 w sekwencji aminokwasowej oznaczonej jako SEK NR ID: 2.

Sekwencje nukleotydowe, kodujące powyższe regiony CDR lekkiego łańcucha obejmują nukleotydy 130-162, 208-228 i 325-351 (ustalenie wg Kabata) oraz nukleotydy 136-222, 208-216 i 331-348 (analiza pętli) w sekwencji nukleotydowej oznaczonej jako SEK NR ID: 2.

Jak widać z powyższego, określone w taki sposób regiony CDR kodowane są przez 9 do 48 nukleotydów. Fragmenty DNA przydatne w inżynierii białek mają zatem długość od

176 393 około 12 do 333 nukleotydów oraz od około 9 do 384 nukleotydów w sekwencjach oznaczonych, odpowiednio, SEK NR ID: 1 i SEK NR ID: 2. Dla wyboru izotypu do inżynierii białek ważny jest również region stały.

W przypadku użycia regionów CDR, do wytwarzania humanizowanych przeciwciał poprzez wbudowanie ich do ludzkiego przeciwciała, może być wskazane dodanie jednego lub kilku aminokwasów, które jakkolwiek znajdują się poza regionami CDR, prawdopodobnie oddziaływują z nimi lub z IL-5 (Queen i wsp., jak wyżej).

Regiony CDR, mogą również stanowić podstawę do projektowania niebiałkowych związków, które imitowałyby funkcjonalne właściwości przeciwciała JES-39D10. Sposoby produkowania takich związków zostały opisane przez Saragovi i wsp. [Science 235:192 (1991)]. Obok dostarczenia podstaw do humanizacji przeciwciała, dane zawarte w SEK Nr ID: 1 i 2 mogą być użyte do wytworzenia jednołańcuchowych białek wiążących IL-5 zawierających połączone regiony CDR części zmiennych lekkiego i/lub ciężkiego łańcucha, jak zostało opisane przez Bird i wsp., [Science 242:423 (1988)] lub też biosyntetyczne miejsca wiążące przeciwciała (BABS), jak zostało opisane przez Huston i wsp., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:5879 (1988)]. Przy zastosowaniu danych z SEK NR ID: 1 można również zrobić przeciwciała z jedną domeną zawierającą wyizolowane regiony zmienne łańcucha ciężkiego [Ward i wsp., Nature 341: 544 (1989)].

Dwa lub więcej regionów CDR może być również połączonych razem w białku bądź bezpośrednio, bądź też przez sekwencję łącznika. Jeden lub więcej regionów CDR można również wbudować do innego polipeptydu lub białka (nie immunoglobuliny), nadając temu polipeptydowi lub białku zdolność wiązania IL-5.

Polipeptydami zawierającymi zmienne regiony lekkiego i ciężkiego łańcucha monoklonalnego przeciwciała o sekwencjach oznaczonych jako SEK NR ID: 1 i 2 lub ich fragmenty określa się w niniejszym wynalazku wszystkie wspomniane powyżej elementy zawierające regiony CDR. ,

DNA kodujące części zmienne ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała JES139D10 lub regiony CDR w nim zawarte mogą być przygotowane poprzez zastosowanie standardowych metod przy użyciu danych o sekwencji zawartych w SEK NR ID: 1 i 2.

Przykładowo, takie DNA może być syntetyzowane chemicznie np. przy zastosowaniu metody wg. Matteucci i wsp., [/. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1988)], metodę wg Yoo i wsp., [J. Biol. CHem. 764:11018 (1989)] lub inne dobrze znane metody.

Alternatywnie, ponieważ znana jest sekwencja genu i miejsca rozpoznawane przez wiele dostępnych enzymów restrykcyjnych, specjalista w tej dziedzinie może łatwo zidentyfikować i wyizolować gen z genomowego DNA hybrydomy wytwarzającej monoklonalne przeciwciało JES1-39D10 i wyciąć ze sklonowanego DNA żądaną sekwencję. Ten sam rezultat można osiągnąć stosując metodę PCR [Saiki i wsp., Science 239:481 (1988), co ilustruje przykład opisany przez Daugherty i wsp. [Nuci. Acids Res. 19:2411 (1991)]. Startery stosowane w reakcji PCR, jeśli jest to wskazane, mogą być tak zaprojektowane, że wprowadzają odpowiednie, nowe miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne, ułatwiające ustawienie do danego wektora.

Jeszcze inny sposób otrzymania fragmentów DNA, kodujących regiony zmienne ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała JES1-39D10, wymaga otrzymania cDNA przy użyciu jako matrycy mRNA wyizolowanego z hybrydomy wytwarzającej monoklonalne przeciwciało JES1-39D10 i klonowania znajdujących się tam zmiennych regionów przy zastosowaniu standardowych metod [patrz np., Wall i wsp., Nucleic Acids Res. 5:3113 (1978); Zalsut i wsp., Nucleic Acids Res. 8:3591 (1980); Cabilly i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci,. uSa 81:3213 (1984); Boss i wsp., Nucleic Acids Res. 12:3191 (1984); Amster i wsp., Nucleic Acids Res. 5:2055 (1980); Moore i wsp., Patent USA Nr 4642234].

Oczywiście, ze względu na to, że kod genetyczny jest zdegenerowany, regiony CDR, polipeptydy i przeciwciała mające sekwencje aminokwasów określone w SEK NR ID: 1 i 2 znajdujące się tam regiony CDR, mogą być kodowane przez wiele różnych sekwencji nukleotydowych.

176 393

Poszczególne kodony dobiera się zarówno ze względu na dogodność wykonywania konstruktów, jak i optymalną ekspresję w systemach prokariotycznych i eukariotycznych. Tego rodzaju funkcjonalne ekwiwalenty są również przedmiotem niniejszego wynalazku. Ponadto dla biegłych w temacie wiadomym jest, że istnieją konserwatywnie zmodyfikowane warianty polipeptydów i białek, w których obecne są niewielkie podstawienia aminokwasowe, insercje lub delecje nie zmieniające w istotny sposób funkcji biologicznych [Anfinsen, Science 181:223 (1973); Crantham, Science 185:862 (1974)].

W niniejszym wynalazku rozważane są również wspomniane wyżej zmodyfikowane warianty sekwencji aminokwasowych oznaczonych jako SEK NR ID: 1 i 2 oraz humanizowanych przeciwciał opisanych poniżej. Modyfikacja fragmentów DNA, będących przedmiotem niniejszego wynalazku, w kierunku pożądanych wariantów pozostaje w granicach możliwości sprawnego laboratorium, np. poprzez syntezę chemiczną lub zastosowanie zmodyfikowanych starterów PCR lub też ukierunkowaną mutagenezę.

Korzystne może być również wprowadzenie bardziej istotnych modyfikacji. Przykładowo, Roberts i wsp., [Nature 328:131 (1987)] wyprodukowali przeciwciało o zwiększonym powinowactwie i specyficzności poprzez usunięcie w wyniku ukierunkowanej mutagenezy dwóch naładowanych reszt aminokwasowych na skraju miejsca wiążącego.

Włączenie do wektora fragmentów DNA kodujących regiony zmienne ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała JES1-39D10 można łatwo uzyskać, gdy końce fragmentów DNA i wektora mają odpowiadające sobie miejsca restrykcyjne. W przeciwnym wypadku koniecznym może być zmodyfikowanie końców fragmentów DNA i/lub wektora, poprzez usunięcie jednoniciowych odcinków DNA, powstających w wyniku działania endonukleazy restrykcyjnej i utworzenie w ten sposób tępych końców lub uzyskanie tego samego rezultatu przez wypełnienie jednoniciowych końców przez odpowiednią polimeryzację DNA. Alternatywnie, każde żądane miejsce może być wytworzone poprzez dołączenie sekwencji nukleotydowych (adaptorów) do końców cząsteczek DNA w wyniku ligacji. Przecięta cząsteczka wektora i fragmenty DNA mogą być również modyfikowane jeśli trzeba, poprzez wytworzenie homopolimerowych ogonów lub za pomocą PCR.

Kompozycje farmaceutyczne do leczenia schorzeń związanych z IL-5 mogą być przygotowane przy zastosowaniu przeciwciał, kompozycji wiążących lub jednołańcuchowych białek wiążących, będących przedmiotem wynalazku, bądź przeciwciał antyidiotypowych skierowanych przeciw takim monoklonalnym przeciwciałom. W kompozycjach takich mogą być również użyte fragmenty przeciwciał takie jak Fab lub Fv, izolowane ciężkie i lekkie łańcuchy lub ich części oraz krótkie polipeptydy zawierające np. poszczególne regiony CDR.

Niektóre kompozycje blokują IL-5 lub mają efekt antagonistyczny i mogą być stosowane do zniesienia aktywności IL-5. Kompozycje takie zawierają przeciwciała, mieszanki wiążące lub jednoniciowe białka wiążące, będące przedmiotem wynalazku oraz dopuszczalny fizjologicznie nośnik.

Inne kompozycje zawierają antyidiotypowe przeciwciała wytworzone przy użyciu jako antygenu przeciwciał monoklonalnych będących przedmiotem wynalazku i dopuszczalny fizjologicznie nośnik. Takie antyidiotypowe przeciwciała, monoklonalne bądź poliklonalne, wytworzone wg standardowych sposobów, mogą imitować aktywność wiążącą samej IL-5. Stąd, mogą być potencjalnie użyteczne jako współdziałające lub antagonistyczne w stosunku do IL-5.

Przydatnym nośnikiem farmaceutycznym może być jakkolwiek odpowiednia, nietoksyczna substancja umożliwiająca dostarczenie pacjentowi kompozycji będących przedmiotem wynalazku. W skład nośnika mogą wchodzić: jałowa woda, alkohol, tłuszcze, woski i chemicznie obojętne substancje stałe. Kompozycje farmaceutyczne mogą również zawierać farmaceutycznie dopuszczalne adjuwanty (czynniki buforujące, czynniki dyspergujące. Ogólnie rzecz biorąc, kompozycje mające zastosowanie przy zaleceniu pozajelitowego podawania takich lekarstw są dobrze znane, np. Remington’s Pharmaceutical Science, wyd. 15 (Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980). Alternatywnie, kompozycje będące

176 393 przedmiotem wynalazku mogą być wprowadzane do ciała pacjenta poprzez system implantacji lekarstwa [Urquhart i wsp., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24:199 (1984)].

Przykład. W podanym poniżej przykładzie, przedstawionym w celu zilustrowania wynalazku, skład procentowy substancji stałych w mieszaninach substancji stałych, płynnych w płynnych i stałych w płynnych podany jest odpowiednio: wagowo/wagowo, objętościowo/objętościowo i wagowo/objętościowo, o ile nie zaznaczono inaczej. Hodowlę komórek prowadzono w warunkach jałowych.

Metody Ogólne i Odczynniki

O ile nie zaznazzono inaczej, ctosowano standaraowe metody rękombinowania DNA opisane przez MaaLiatisa i wsp., Molncular Ο^ο^: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory

Izolację plazmidowego DNA na małą skalę ze stacjonarnej hodowli prowadzonej przez noc wykonywano sposobem wg Birbiom i wsp. [Nucleic Acids Res. 7:1513 (1979)]. Sposób ten pozwala oa izolację niewielkiej ilości DNA z hodowli bakteryjnej dla celów aoalitocooych. O ile nie zaznaczono inaczej, większe ilości plazmidowego DNA otrzymywano sposobem opisanym przez Clewell i wsp. [Ż. Bacteriol. 110:1135 (1972)].

Specyficzne fragmenty DNA, powstające po trawieniu plazmidowego DNA nooymzmi restrykcyjnymi, iznlnwaon poprzez preparatywną nlnktrnfnrnoę w agarozie. Elektroforezę prowadzono w żelach o wymiarach 9 x 5,5 cm przy natężeniu prądu 50 mA przez 1 godzinę w buforze Tris-boran (Maoiztis i wsp., jak wyżej, str. 454), a następnie barwinon bromkiem etydooy w stężeniu 0,5 ug/ml w celu uwidocznienia DNA Odpowiednie części żelu wycinano i DNA poddawano nlnktrnelucji (Maoiatis i wsp., jak wyżej, str. 164). Po nlektrnnlucSi DNa poddawano ekstrakcji fenolem (Maniatis i wsp., jak wyżej, str. 458) i strącano etanolem w temp. -20°C (Maniatis i wsp., jak wyżej, str. 461).

Enzymy restrykcyjne i DNA ligazę T4 zakupiono w New England Biolabs (BEVERLY; MA). Odwrotna transkryptaza Superdcript RNaza H’ pochodziła z BRL/GIBCO (Gaithesburg, MD), DNA polimnraoa Taq ze St^agene (LaJolla, CA), fragment Klenowa polimerazo DNA z Pharmacia LKB Bintnchnnlogo, Inc. (Piscataway, NJ), fosfataza z jelita cielęcia z Boehringer Mannheim Binchnmicals (Indianapolis, IN), i RNAzyna z Promega (Madison, WI). Wszystkie enzymy stosowano zgodnie z instrukcjami producentów. System do sekwencjonowania Sequnoase wersja 2.0 ntroomaoo z United States Biochemical (Clnvnlaod, OH).

Trójfosforany deooksyroboouklentodów i starter oligo dT12-is pochodził z Pharmacia LKB Biotechoologo, albumina z surowicy bydlęcej (BSA) z Boehringer Mannheim Biochemicals a redestolnwaoy fenol z BRL/GIBCO.

Wektory plazmidowe pSV. Sport i pUC19 oraz kompetentny szczep. E. coli DH5alfa (max Efficieoco) pochodziły z Amer^n Type Culture ^Ι^^^ο, Bnthnsda, MD. Podłoża do hodowli tkankowych, bydlęca surowica płodowa (FBS) i uzupełnienia pochodziły z BRL/GIBCO.

Ekspresję zrnkombioowaoej ludzkiej IL-5 uzyskiwano w jajnikach chomika chińskiego (CHO) wg standardowych sposobów przy użyciu plazmidu pDSRG (ATCC 68233) a białko czyszczono poprzez chromatografię immuoepowioowactwa.

Królicze przeciwciała przeciw zrnkombioowαoej ludzkiej IL-5 wytwarzano stosując standardowe sposoby. Biotyoolowaoe kozie aoty-królicze IgG otrzymano z Vector Labs, Burliogamn, CA, natomiast alkaliczna fosfataza sprzężona ze streptawidyną była produktem BRL/GIBCO. Bintooolowαon królicze anty-szczurze IgG pochodziły z Jackson Labs, West Grove, PA. Błękit oirrotetrazolowo (NBT) i 5-bromo-4-chloro-3-iodnlolo fosfatazę (BCIP) otrzymano z BRL/GIBCO.

ElIsA AMPLIFICATION SYSTEM® o wysokiej czułości, stosowany jako substrat do testu ELISA (enzymatyczny test immuoosuprnsojoy) w płytkach do mikromiareczknwania, był otroymowaoo z BRL/GIBCO.

176 393

Hodowle komórkowe

Linia komórek hybrydomy wytwarzających monoklonalne przeciwciało JES1-39D10 była produkowana tak, jak zostało opisane przez Denburg i wsp. [Blood 77:1462 (1991)] i wyjściowo utrzymywana w podłożu Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM/wysokie stężenie glukozy; GIBCO, Bethesda, MD) uzupełnionym 5% FBS, 2 mM glutaminą i penicyliną/streptomycyną 10 jednostek/ml w nawilżanej komorze z 5% CO2 w temp. 37°C. Linia komórkowa była następnie adaptowana do hodowli bez surowicy poprzez zamianę surowicy na uzupełnienie 1 x HB101 (Hana Biologics, Alameda, CA).

Charakteryzowanie Przeciwciała Monoklonalnego JES1-39D10

Oczyszczanie

Podłoże, na którym hodowano linię komórkową wytwarzającą przeciwciało 39D10.11 (subklon linii JES1-39D10) zbierano, filtrowano i nanoszono na kolumnę z antygenem (chromatografia powinowactwa) przygotowaną przez połączenie zrekombinowanej ludzkiej IL-5 z złożem AFFIGEL-15 ® (BioRad, Richmond, CA). Kolumnę następnie płukano kolejno: roztworem soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) i PBS z 0,5 NaCl, a następnie równoważono PBS. Przeciwciało 39D10.11 wymywano z kolumny 0.2 M buforem glicynowym pH 2.95, po czym wymyte białka natychmiast zobojętniano 1M Tris-HCl pH 8.0.

W celu rozdzielenia łańcuchów ciężkiego i lekkiego oczyszczone białko poddawano elektroforezie (SDS-PAGE) w 15% żelu poliakrylamidowym w warunkach redukujących, zasadniczo jak w metodzie wg Laemmli [Nature 227:680 (1970)]. Oba łańcuchy odzyskiwano poprzez przeniesienie na filtr IMMObILON® (filtr PVDF, Millipore, Bedford, MA) stosując głównie metodę elektrotransferu wg Matsuidara [/. Biol. Chem. 261:10035 (1987)].

Prążki odpowiadające ciężkim i lekkim łańcuchom wycinano z filtru po uprzednim wybarwieniu błękitem Coomassi i poddano sekwencjonowaniu od N-końca przy zastosowaniu aparatu do sekwencjonowania białek i peptydów Applied Biosystems Model 477A. Sekwencjonowanie izolowanych łańcuchów ciężkiego i lekkiego przeniesionych na filtr IMMOBILON® wykonywano zasadniczo zgodnie z metodą opisaną przez Yuen i wsp. [Biotechiques 7:74 (1989)].

Ciężki łańcuch nie mógł być sekwencjonowany w standardowych warunkach. Przy sekwencjonowaniu łańcucha lekkiego reakcję prowadzono do 15 cykli. Porównanie otrzymanej sekwencji z danymi publikowanymi potwierdziło zgodność z sekwencją łańcucha lekkiego imunnoglobuliny szczura.

Ustalanie izotypu przeciwciała

Stosując zestaw firmy Zymed (San Francisco, CA) do ustalenia izotypu przeciwciała JES1-39D10 wykazano dla łańcucha ciężkiego izotyp gamma 2a, natomiast dla łańcucha lekkiego izotyp kappa (izotyp y2a//).

Wpływ na aktywność biologiczną

Przeciwciało monoklonalne JES1-39D10 silnie hamuje aktywność biologiczną zrekombinowanej ludzkiej IL-5 (Denburg i wsp., jak wyżej). Badania wykazały, że przeciwciało wywołuje taki efekt poprzez hamowanie wiązania się IL-5 z jej receptorami komórkowymi.

Klonowanie przy użyciu PCR

Projektowanie oligonukleotydowych starterów i strategia klonowania

W skrócie, oligonukleotydowe startery przygotowano na podstawie znanych sekwencji końca aminowego i karboksylowego szczurzej IgG2a oraz ciężkiego i lekkiego łańcucha Kappa [Reichmann i wsp., Nature 332:323 (1988); Bruggemann i wsp., Proc. Natl Acad. Sci.

176 393

USA 53:6075 (1986); Hellman i wsp., Gene 40:107 (1985)]. Używając tych starterów wyizolowano fragmenty cDNA kompletnego łańcucha lekkiego i okrojonego łańcucha ciężkiego poprzez zastosowanie metody PCR [Saiki i wsp.,Science 239:487 (1988)]. Fragmenty cDNA sekwencjonowano i sprawdzano poprzez porównanie z innymi klonami wytworzonymi przy użyciu starterów PCR zaprojektowanych dla różnych regionów cDNA. Odczytaną sekwencję aminokwasów lekkiego łańcucha weryfikowano poprzez ustalenie sekwencji pierwszych 15 N-końcowych aminokwasów lekkiego łańcucha JES1-39D10.

Synteza oligonukleotydów

W oparciu o izotyp IgG2a/kappa przeciwciała JES1-39D10, zsyntetyzowano startery oligonukleotydowe o sekwencjach zamieszczonych w Spisie Sekwencji, stosując standardowe metody i syntetyzator model 380A lub 380B firmy Applied Biosystems.

Oznaczenia tych starterów (pierwsza litera wskazuje na użyty model syntetyzatora) i numery identyfikacyjne odpowiadających im sekwencji przedstawiają się następująco:

Oligonukleotydy	SEKIDNO
B2051CC	3
B2031CC	4
A2065CC	5
A2065CC	6
B2137CC	7
B2108CC	8
B2101CC	9
B1852CC	10

Starter B2051CC dla końca 5' łańcucha ciężkiego przeciwciała JES1-39, pochodził z fragmentu sekwencji szczurzej IgG2a opublikowanej przez Reichmann i wsp. (jak wyżej ) obejmuje sześć do czternastu aminokwasów dojrzałego ciężkiego łańcucha polipeptydowego. W celu ułatwienia klonowania, na końcu 5' startera dodano dwa miejsca restrykcyjne, XbaI i HindIII. Starter B2031CC na końcu 3' powstał w oparciu o cześć opublikowanej sekwencji trzeciego regionu stałego szczurzej IgG2a (Bruggeman i wsp., jak wyżej). Dla celów klonowania dodano trzy miejsca restrykcyjne, Smal, EcoKl i Sa7l.

Sekwencje starterów dla łańcucha lekkiego, zarówno z końca 5' jak i 3', pochodziły z opublikowanej sekwencji szczurzego mRNA dla kappa (Hellman i wsp., jak wyżej). Starter A2064CC obejmuje część nie podlegającego translacji regionu 5' i pierwsze dwa nukleotydy z kodonu inicjującego translację. Dla ułatwienia klonowania dodano miejsca HindIII i BamHI. Starter A2065 z końca 3' powstał w oparciu o część opublikowanego regionu nie podlegającego translacji na końcu 3' (3'UTR) łańcucha lekkiego szczurzej immunoglobuliny kappa. Odcinek ten obejmuje ostatnie dwa nukleotydy kodonu stop i 22 nukleotydy 3' UTR bezpośrednio za kodonem stop. Dla ułatwienia klonowania dodano miejsca EcoRI i PstI.

Warunki reakcji PCR

Całkowity cytoplazmatyczny RNA był izolowany z linii komórkowej hybrydomy wytwarzającej przeciwciało JES1-39D10, zasadniczo według Cathala i wsp. [DNA 2:329 (1983)]. Syntezę pierwszej nici cDNA wykonywano używając izolowanego RNA jako matrycy, zasadniczo jak zostało opisane przez Larrick i wsp. [Bio/Technology 7:934 (1989)]. Powstałe cDNA poddano następnie reakcji PCR w 50 wl objętości mieszaniny reakcyjnej pokrytej 50 μ l oleju parafinowego w 0.5 ml probówce Eppendorfa.

176 393

Miesranina reakcyjno dla łańcucha ciężkiego rawierała 26.5 wl H2O, 5 wl buCoru dla polimerary DNA Taq (Thermus aquaticus) [końcowe siężenie w reakcji: 10 mM Tris-HC1, pH 8.3, 50 mM KC1,1.5 mM MgCh, 0.01% (wog/obj.) żeloiyny], 5/zl 1.25 mM dNTP, 4 μΐ startera B2051CC (60 pmol), 4 wl startera B2031CC (60 pmol), 5 μ l cDNA (rswierojącegz połowę jednoniciowego cDNA pochodzącego reakcji r 3-6 μq cołktTwiiego RNA) orar 0.5 μ l polimerary Taq (2.5 jed.). Miesranina reakcyjna dla łańcucha lekkiego miało podobny skład r iym, że użeiz siarierów A2064CC i A2065CC.

Reakcję prowadzono w urrądreniu PHC-1 Thermocycler (Techne, Princeion, NJ) prrer 30 nssiępująrech cykli: denaiurocjo prrer 1.5 min. w iemp. 94°C, prrełąrronie prrer 2 min. w iemp. 50°C orar syntera prrer 3 min. w iemp. 72°C. Po rakzńcreniu 30 cyklu miesraninę reakcyną inkubowano prrer dodaikowe 9 min. w iemp. 72°C w celu rakońcrenia procesu wydłużania.

Produki ampliCikocji PCR poddano elekiroCorerie w 1% żelu ogarorowym r 0.5 wg/ml bromku eiedene w buCorre Tris-boron. Fragmenty DNA o ocrekiwanych wielkościach (ok. 1.5 tysięcy por rasad dla łańcucha ciężkiego i ok. 0.7 tysięcy por rasod dla łańcucha lekkiego) wycinano r żelu i izcryszczono siosując elekiroelucję.

Weryfikacja Klonów cDNA Sekwencjonowonie DNA

Po odreskoniu r żelu, precypiiocji eionolem i irawieniu enrymami restrykcyjnymi, powsiołe w wyniku reakcji PCR fragmenty DNA, prawdopodobnie odpowiadające cDNA ciężkiego i lekkiego łańcucha, były klonowane w odpowiednich wekiorach celem sekwencjznowsnia.

Domniemane cDNA dla ciężkiego i lekkiego łańcucha klonowano zddrielnie w wekiorre pUC19 jako fragmenty odpowiednio, Hindlll/EcóRl i BamHl/Pstl. Poddane ligocji plarmidy iransCormowono nosiępnie do srczepu E. coli DH5-alCo siosując siandordowe sposoby. W celu sekwencjonowanio irolowano kolonie iransCormaniów i oirfemewono plormidowy DNA r co najmniej dwóch klonów iransCormaniów dla ciężkiego i dwóch dla lekkiego łańcucha.

Porównanie sekwencji regionu rmiennego oirfemonych w ien sposób (ornorrznerh dla ciężkiego i lekkiego łańcucha odpowiednio, SEK NR ID: 1 i 2) r publikowanymi sekwencjami immunoglobulin, wykarało wysoki siopień homologii w cręści rrębowej orar w usy^owomu domniemanych regionów CDR, co usiolono siosując sposób wg. Kobai i wsp. (jak wyżej). Ponadio, sekwencjo aminokwasowa końca N, wywnioskowano no podsiowie sekwencji cDNA lekkiego łańcucha, wykarywalo rgodność r określoną doświadcralnie sekwencją końca N lekkiego łańcucha prreriwciała JES-39D10.

Konsiruowonie Plarmidu Ekspresyjnego

W celu pziwierdrenia, że wyizolowane fragmenty cDNA kodują białko, kióre mogą specyficnie wiąroć się r ludrką IL-5, rrekonsiruowono prry użyciu PCR cDNA kodujący cały domniemany ciężki łańcuch prfeciwriało JES1-39D10. W celu modyfikacji wsiępnie sklonowanych niepełnych fragmentów cDNA dla ciężkiego łańcucha, raprojekizwsnz siariery B2137CC (SEK NR ID: 7) i B2108CC (SEK NR ID: 8). Startery ie dosiarcrafy sekwencje kodujące pepiyd liderowy, pięć brakujących aminokwasów r końca N rmiennego regionu i brakujące resriy ominokwosowe no końcu C regionu siałego.

W celu ułaiwienio iranslocji, no końcu 5' cDNA kodującego białko, dodano sekwencję najwięksrej rgodności dla inicjacji iranslocji u kręgowców [Korak, Nucl. Acids Res. 20: 8125 (1987)]. Dla ułaiwienia klonowania, wprowodrono miejsca resirykcyjne Sali i EcoRI, odpowiednio, na 5' i 3' końcu powsiałego cDNA.

Oirrymany cDNA dla lekkiego łańcucha również poddano rekonsirukcji siosując siariery B2101CC (SEK NR ID: 9) i B1852CC (SEK NR ID: 10). Dokonano iego głównie w celu modyfikacji miejsc resirykrejnyrh no końcach dla poirreb konsirukcji plarmidu

176 393 ekspresyjnego. Do tego cDNA również wprowadzono sekwencję największej zgodności dla inicjacji translacji u kręgowców.

Reakcję PCR prowadzono i produkty DNA izolowano tak, jak zostało opisane powyżej, a fragmenty DNA poddawano trawieniu Sa7I i EcoRI. cDNA dla lekkiego i ciężkiego łańcucha były następnie poddane osobno ligacji z wektorem ekspresyjnym pSRS (ATCC 68234) strawionym w analogiczny sposób. Plazmid pSRS zawiera promotor SRa oraz miejsce startu replikacji SV40, co umożliwia replikację i ekspresję wstawek cDNA w komórkach COS.

Transfekcja

Przed transfekcją, komórki COS były namnażane w podłożu DMEM/wysokie stężenie glukozy, uzupełnionym 10% FBS i 6 mM glutaminą. Komórki w fazie wzrostu logarytmicznego poddano działaniu trypsyny, przepłukano świeżym podłożem, a następnie zawieszono w świeżym podłożu tak, aby uzyskać gęstość 2x10' komórek/ml.

Elektroporację przeprowadzano używając GENEPULSER® (BioRad, Richmond, CA) zgodnie z instrukcjami producenta. Pokrótce, w każdej kuwecie umieszczano 250 μ zawiesiny komórek COS. Do kuwet dodawano po około 10 μ g plazmidu oczyszczonego poprzez CIRCLEPREP® (Bio101, LaJolla, CA) w objętości mniejszej niż 50 μΐ i mieszano z komórkami. Użyte próbki DNA obejmowały pSRS z wstawionymi cDNA dla łańcucha ciężkiego (pSRS-H), pSRS z wstawionym cDNA dla łańcucha lekkiego (pSRS-L), mieszaninę równych ilości pSRS-H i pSRS-L i wyjściowy pSRS.

Impuls elektryczny o napięciu 0.2 Volt był dostarczany przy 960/zF przez urządzenie rozszerzające pojemność. Komórki wysiewano następnie na 60 mm płytki hodowlane, dodawano do nich 5 ml świeżego podłoża i inkubowano w temp. 37°C w inkubatorze z 5% CO2. Po 16 godzinach, podłoże było usuwane przez odsysanie i wymieniane na podłoże bez surowicy. Inkubację kontynuowano przez następne 72 godziny, po czym podłoże zbierano.

Analiza przy zastosowaniu immunotransferu

Podłoża bez surowicy, w których hodowane były komórki po transfekcji, zagęszczano około dziesięciokrotnie poprzez wirowanie w probówkach CENTRICON® (Amicon, Danvers, MA), a następnie poddawano elektroforezie w gotowych 15% żelach poliakrylamidowych z SDS (Integrated Separation Systems, Hyde Park, MA) w warunkach nieredukujących. Na ten sam żel były nakładane dwa identyczne zestawy próbek. W tym samym żelu rozdzielano również dwie identyczne mieszaniny białek o znanej masie cząsteczkowej (zawierające białka o masie 97.4, 68, 43, 29,18.4 i 14.3 kilodaltonów).

Po elektroforezie, rozdzielone prążki przenoszono na filtr nitrocelulozowy używając Semi-dry Electroblotter (Integrated Separation System, Hyde Park, MA). Filtr był następnie inkubowany w temperaturze pokojowej z 3% BSA w PBS, po czym filtr rozcinano na dwie części. Każda część zawierała pełen zestaw próbek.

Jedną część filtru używano w pierwszym etapie analizy do wykrycia ekspresji łańcucha IgG szczura w podłożu znad komórek. Uzyskiwano to poprzez płukanie filtru w temperaturze pokojowej kolejno: jeden raz w roztworze rozcieńczonych 1:200 biotynylowanych króliczych antyszczurzych IgG w buforze TBST [10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl i 0.05% TWEEN-20®^ (monolaurynian polioksyetylenosorbitolowy)] z 3% BSA przez 45 min., trzy razy w samym buforze TBST przez 15 min., jeden raz w roztworze rozcieńczonej 1 do 10000 alkalicznej fosfatazy połączonej ze streptawidyną w buforze TBST przez 30 min. trzy razy w samym buforze TBST przez 15 min. i raz w substracie dla alkalicznej fosfatazy (44 μ l NBT i 33 μ l BCIP w 10 ml buforze dla alkalicznej fosfatazy zawierającym 100 mM Tris-HCl, pH 9,100 mM NaCl, 5 mM MgCE) przez 10-30 minut. Po przepłukaniu wodą destylowaną obserwowano pojawienie się na filtrze zabarwienia.

176 393

Drugą część filtru użyto w drugim etapie analizy do stwierdzenia, czy w którymkolwiek z podłóż znad komórek obecne jest białko wiążące ludzką IL-5. Filtr ten płukano w temperaturze pokojowej kolejno: jeden raz w buforze TBST zawierającym 1 ^g/ml zrekombinowanej ludzkiej IL-5 przez 1 godzinę, trzy razy po 15 minut samym buforem TBST, jeden raz rozcieńczoną 1:3000 surowicą odpornościową królika przeciw zrekombinowanej ludzkiej IL-5 w buforze TBST przez 1 godzinę, trzy razy po 15 minut samym buforem TBST, jeden raz rozcieńczonymi 1:200 biotynylowanymi kozimi antykróliczymi IgG w buforze TBST przez 1 godzinę, trzy razy po 15 min. samym buforem TOST, jeden raz rozcieńczoną 1:10000 alkaliczną fosfatazą połączoną ze streptawidyną w buforze TBST przez 30 minut, trzy po 15 minut razy samym buforem TBST i jeden raz substratem alkalicznej fosfatazy przez 30 minut. Następnie obserwowano pojawienie się zabarwienia na filtrze.

Wyniki pierwszego etapu analizy wykazały, że tylko w przypadku podłoża znad transformantów transfekowanych równocześnie plazmidami pSRS-H i pSRS-L otrzymuje się wykrywalne prążki. Wzór prążków był zgodny z oczekiwanym dla immunoglobulin. Zabarwienia nie obserwowano w ścieżkach zawierających podłoże znad komórek transfekowanych osobno ciężkim lub lekkim łańcuchem, co wskazuje bądź na małą ilość białka, bądź też na niezdolność przeciwciała do rozpoznania osobnych lekkich i ciężkich łańcuchów. W podłożu znad komórek nie spodziewano się obecności łańcucha ciężkiego, ponieważ zwykle nie jest on wydzielany w nieobecności łańcucha lekkiego [Bole i wsp., J. Celi Biol 102:1558 (1986)].

W drugim etapie analizy, mocne wiązanie IL-5 obserwowano dla próbek z podłożem znad transformantów transfekowanych równocześnie dwoma plazmidami pSRS-H i pSRS-L. Przejawiało się to w postaci głównych prążków barwnych w nieredukującym żelu z SDS migrujących jak cząsteczka o masie 160 kilodaltonów, wielkości oczekiwanej dla kompletnej cząsteczki przeciwciała.

Enzymatyczny Test Immunosorpcyjny

W celu potwierdzenia zdolności zrekombinowanego monoklonalnego przeciwciała do specyficznego wiązania się z ludzką IL-5, płytki do testów immunologicznych (EIA) z 96 kieszonkami zostały powleczone 50 3% BSA lub zrekombinowaną ludzką IL-5 (5 ^g/ml, blokowane następnie roztworem BSA). Powlekanie wykonywano przez około 2 godz. w temp. 4°C. Następnie do kieszonek dodawano próbki (50 μΣ) podłoża znad różnych transformantów komórek COS opisanych powyżej lub linii komórkowej hybrydomy wytwarzającej przeciwciało JES1-39D10, po czym płytki inkubowano przez 2 godz. w temp. 4°C.

Po inkubacji podłoże z kieszonek wymieniano na 300 μ! kolejnych roztworów o temp. pokojowej: 3 razy po 15 min. sam bufor TBST, 1 raz biotynylowane królicze antyszczurze IgG przez około 2 godz., 3 razy po 15 min. sam bufor TBST, raz alkaliczna fosfataza połączona ze streptawidyną w buforze TBST przez 30 min., 3 razy po 15 min. sam bufor TBST a następnie wywoływane przez BRL ELISA AMPLIFICATION SYSTEM® przez 15 min., przy czym stosowano wyżej opisane rozcieńczenia odczynników.

Wyniki powyższego testu wykazały, że zarówno naturalne przeciwciało JES1-39D10 (z podłoża znad hybrydomy) jak i zrekombinowane przeciwciało (z podłoża znad transformantów transfekowanych równocześnie dwoma plazmidami pSRS-H i pSRS-L) pozostawały w kieszonkach powleczonych IL-5, na co wskazywało pojawiające się silne zabarwienie. Nie obserwowano żadnego znaczącego zabarwienia większego niż tło w kontroli (nie zawierającej przeciwciał) w przypadku nieobecności IL-5 lub gdy badane próbki zawierały podłoże znad komórek transfekowanych wektorami niosącymi osobno ciężki lub lekki łańcuch.

176 393

Humanizacja Przeciwciał Modelowanie homologii

Stosując sposoby opisane powyżej stwierdzono, że przeciwciała HIL i LAY są najlepszymi kandydatami na ludzką strukturę zrębową. Pary łańcuchów ciężkiego i lekkiego przeciwciała HIL lub LAY lub ich kombinacja były użyte w pierwszej kolejności.

Poniższa tabela przedstawia spis potencjalnych minimalnych i maksymalnych zespołów reszt aminokwasowych JES1-39D10, które mogłyby być wbudowane do sekwencji zrębowych, co określono stosując powyżej opisane sposoby.

	Reszty aminokwasowea
Lista Minimalna Vh:	21-27,47-50, 66,93-101
Lista Maksymalna VHb:	19,28,29,30,32,40,45,46, 51, 52-60, 71,89,92
Lista Minimalna Vl:	46-51,68, 70-72,84,91,109,110-116
Lista Minimalna VLb:	44,45,52-54,56,66,73-76, 88,89,117

^a Reszty ammokwasowe dla VH i VL odpowiadają pozycji aminokwasu w SEK NR ID: 1 i SEK NR ID: 2 ^b Listy Maksymalne VH i Vl obejmują odpowiednie Listy Minimalne oraz dodatkowo zaznaczone reszty aminokwasowe

Specyficzne konstrukty opisane poniżej zawierają następujące reszty aminokwasowe zamieszczone w poniższej tabeli:

Humanizowane Przeciwciała	Zespół reszt aminokwasów
CMX5-1	Maksymalne Vh HIL; Maksymalne Vl LAY
CMX5-2	Maksymalne Vh HIL; Maksymalne Vl LAY (pomniejszone o koniec N strukturalnej pętli CDR H-1)
CMX5-3	Maksymalne Vh LAY; Maksymalne Vl LAY
CMX5-4	Minimalne Vh HIL; Minimalne Vl LAY
CMX5-5	Kabat Vh HIL tylko regiony CDR; Kabat Vl LAY tylko regiony CDR

Ponieważ celem zastosowania humanizowanych przeciwciał była neutralizacja biologicznej aktywności rozpuszczalnej ludzkiej IL-5, jako region stały do humanizowanych przeciwciał wybrano γ4. Powodem tego był fakt, że spośród czterech izotypów ludzkiej immunoglobuliny, γ4 najsłabiej wyzwala wiązanie dopełniacza.

Ludzki odpowiednik szczurzego izotypu X został wybrany jako region stały humanizowanych łańcuchów lekkich.

Konstruowanie Humanizowanych Przeciwciał CMX5-1

Syntetyczny DNA CMX5-1 skonstruowano stosując kombinację metody PCR z konwencjonalnymi technikami klonowania. Region V został podzielony na trzy części, przy czym każdą z nich tak zaprojektowano, żeby zawierała określone miejsca restrykcyjne na końcach 5' i 3'. Wybrano kodony występujące w genach ludzkich ze stosunkowo wysoką częstością. W celu zmniejszenia prawdopodobieństwa tworzenia się nieprzewidzianych struktur drugorzędowych, które mogłyby powodować rearanżacje sekwencji lub delecje,

176 393 przy projektowaniu oligonukleotydów unikano sekwencji palindromicznych lub powtarzających się, bądź też zastępowano je nie zmieniając zakodowanej sekwencji.

Oligonukleotydy odpowiadające całemu regionowi zmiennemu ciężkiego łańcucha (Vh) CMX5-1 syntetyzowano standardowymi metodami.

Oznaczenia tych oligonukleotydów i odpowiadających im SEK NR ID określających ich sekwencje przedstawiają się następująco:

Oligonukleotyd	SEK NR ID
B2474CC	11
B2419CC	12
B2420CC	13
B2475CC	14
B2477CC	15
B2479CC	16

Pary nukleotydów B2474CC i B2419CC, B2420CC i B2475CC, B2477CC i B2479CC były denaturowane termicznie, przyłączane i inkubowane z polimerazą Taq lub Pfu (Stratagene, La Jolla, CA). W reakcjach wydłużania łańcuchów (PCR), oligonukleotydy z każdej pary były komplementarne do siebie na odcinku około 24 do 30 nukleotydów. Tak więc, każdy oligonukleotyd stanowił matrycę dla innego.

Reakcje PCR prowadzono przez 18 cykli, po czym trzy otrzymane fragmenty DNA, odpowiadające trzem kolejnym fragmentom Vh, oznaczonym Vh1, Vh2 i Vh3, poddawano elektroforezie w żelu agarozowym i oczyszczano poprzez elektroelucję.

Wzajemne ułożenie trzech fragmentów DNA Vh, miejsca restrykcyjne do klonowania i mapa odcinka zawierającego miejsca restrykcyjne do klonowania w wektorze pSV. Sport przedstawiają się następująco:

Fragment	Miejsca restrykcyjne	Startery PCR
Vh1	.EcoRI	Spel	B2474CC + B2419CC
Vh2	SpeI	Xbal	B2420CC + B2475CC
Vh3	EcoRI/Xbal	Sa7!/Apal/Sstl	B2477CC + B2479CC

Miejsca restrykcyjne do klonowania w wektorze pSV.Sport PstI/KpnI/RsrII/RcoRI/SmaI/SalI/SstI/SpeI/NotI/XbaUBamHI/Hindni/SnaBI/MluI

Fragment Vh1 strawiono enzymami EcoRI i SpeI i sklonowano w wektorze pSV.Sport. Fragment Vh2 przyłączono następnie do Vh1 w wektorze pSV. Sport poprzez wstawienie w sposób zorientowany w miejsca SpeI i XbaI. Fragment Vh3 został sklonowany osobno w wektorze pSV. Sport jako fragment EcoRI/XbaI-Sa7I/ApaI/SstI. Te trzy fragmenty były sprawdzane poprzez sekwencjonowanie.

Kompletny CMX5-1 Vh cDNA został złożony poprzez przyłączenie Vh3 do genomowego DNA regionu stałego (Ch) łańcucha H y4, a następnie połączenie fragmentów Vh3-Ch i Vh1-Vh2 w sposób opisany bardziej obszernie poniżej.

CMX5-1 Vl cDNA złożono w podobny sposób, stosując sześć syntetycznych starterów oligonukleotydowych. Oligonukleotydy te oraz odpowiadające im SEK NR ID, oznaczające ich sekwencje przedstawiają się następująco:

176 393

Oligonukleotyd	SEK NR ID
B2425RCC	17
B2426CC	18
B2427CC	19
B2458CC	20
B2458CC	21
B2459CC	22

Trzy fragmenty, oznaczone Vl1, Vl2 i Vl3, pochodziły od par oligonukleotydów, odpowiednio, B2425RCC i B2426CC, B2427CC i B2458CC i B2459CC. Te fragmenty DNA, odpowiadające trzem kolejnym odcinkom Vl, były następnie oczyszczane poprzez elektroforezę w żelu agarozowym i elektroelucję.

Wzajemne położenie trzech fragmentów DNA Vl, miejsca restrykcyjne do klonowania oraz mapa odcinka zawierającego miejsca do klonowania w wektorze pUC19 przedstawiają się następująco:

Fragment	Miejsca restrykcyjne	Startery PCR
Vl1	PstI	BstEUIXbal	B2425RCC + B2426CC
Vl2	PstIBstEII	BamHI	B2427CC + B2427CC
Vl3	BamHI	Sa7I	B2459CC + B2460CC

Miejsca restrykcyjne do klonowania w pUC19 EcoRVSacI/KpnI/SmaI/BamHI/XbaI/SalI/PstI/SphI/HindIn

Vl1, Vl2 i Vl3 sklonowano początkowo osobno w wektorze pUC19 jako fragmenty, odpowiednio PstI-BstEIIIXbaI, PstIBstEIIIXbaI i BamHI-Sa7I. Fragmenty te były sprawdzane poprzez sekwencjonowanie. Vl1 i Vl2 połączono następnie razem w plazmidzie pUC19 poprzez wstawienie Vl2 jako fragmentu BstEII-BamHI do wektora już zawierającego Vl1.

Kompletny cDNA dla Vl utworzono przez dołączenie Vl3 do regionu stałego łańcucha lekkiego (Cl), a następnie połączenie fragmentów Vl-Vl2 i Vl3-Cl, tak jak zostało opisane obszerniej powyżej.

W celu ułatwienia syntezy i wydzielania humanizowanych przeciwciał, do końca aminowego dojrzałego łańcucha polipeptydowego zarówno H, jak i L, dołączono peptyd liderowy. Sekwencja nukleotydowa tego lidera odpowiadała sekwencji lidera przeciwciał anty-CAMPATH-1 (Reichmann i wsp., jak wyżej). Sekwencję kodującą peptyd liderowy (Reichmann i wsp., jak wyżej) włączono do obu fragmentów Vh1 i Vl1.

Dla skonstruowania DNA kodującego kompletny łańcuch H przeciwciała, syntetyczny cDNA dla Vh połączono z genomowym DNA regionu stałego ludzkiego y4 (ATCC 57413) poprzez trawienie enzymem ApaI i ligację. Zastosowany sposób postępowania zapoczątkowało trawienie plazmidu pSV. Sport zawierającego Vh3 enzymem NotI, a następnie działanie polimerazą DNA Klenowa (Boehringer Mannheim) w celu uzyskania tępych końców. Tak przygotowane DNA wytrącano etanolem, zawieszano i trawiono enzymem ApaI. Przecięty plazmid poddawano ligacji z fragmentem restrykcyjnym ApaIlSmaI pochodzącym z genomowego regionu stałego y4.

176 393

Genomowy DNA Vh3-Ch wycinano następnie jako fragment XbaI/HindIII i włączano do pSV.Sport już zawierającego Vh1-Vh2, kończąc w ten sposób tworzenie kompletnego DNA dla łańcucha ciężkiego.

W celu wytworzenia łańcuchów przeciwciała, plazmidy zawierające DNA dla łańcuchów H i L transfekowano równocześnie do komórek COS. Okazało się jednak, że wydzielana immunoglobulina była niewykrywalna na podstawie analizy podłoża znad komórek testem ELISA lub techniką Western. Alternatywny sposób polegał na zaprojektowaniu i skonstruowaniu cDNA dla regionu stałego ludzkiej y4.

W tym celu zsyntetyzowano sześć oligonukleotydowych starterów do reakcji PCR przy zastosowaniu standardowych sposobów. Oznaczenia tych nukleotydów i odpowiadających im SEK NR ID, określających ich sekwencje przedstawiają się następująco:

Oligonukleotyd	SEK NR ID
B2491CC	23
B2498CC	24
B2499CC	25
B2597CC	26
B2598CC	27
B2656CC	28

Startery B2491CC, B2499CC i B2598CC odpowiadają nici plus cDNA dla regionu stałego y4. Startery B2498CC, B2597CC i B2656CC odpowiadają nici minus. Stosując jako matrycę ludzki genomowy DNA dla y4, utworzono za pomocą PCR trzy kolejne dwuniciowe fragmenty DNA, obejmujące cDNA kodujący cały rejon stały y4.

Trzy odcinki DNA Ch, miejsca restrykcyjne do klonowania i użyte startery przedstawiają się następująco:

Odcinek	Miejsca restrykcyjne	Startery do PCR
ChA.	Sa7I	EcoRI	B2491CC + B2498CC
ChB.	EcoRI	XhoI/Sa7I	B2499CC + B2500CC
ChC.	Sa7JXhol	NotI	B2598CC + B2656CC

Odcinek A został sklonowany w plazmidzie pUC19 jako fragment restrykcyjny Sa7IEcol. Odcinek C został sklonowany w wektorze pSV.Sport jako fragment restrykcyjny Sa7I/XhoI-NotI. Odcinek B został wstawiony jako fragment EcoRl-Xhol/Sa7l do pSV.Sport, już zawierającego odcinek C. Wszystkie trzy odcinki sprawdzano poprzez sekwencjonowanie DNA.

cDNA dla y4 został utworzony poprzez wycięcie odcinka A enzymami Pstl i EcoRI i wklonowanie tego fragmentu do pSV.Sport zawierającego już odcinki B i C. Mapa restrykcyjna cDNA dla Ch ludzkiej y4 i jego położenie w stosunku do fragmentu, zawierającego miejsca do klonowania w wektorze pSV.Sport, przedstawiają się następująco:

ABC

PstI/e 71-------EccRl-------XhoI-------Notl/HiridU 1/SnaBl/MJul cDNA dla Ch y4 wycinano jako fragment Sa7I—HindII w celu wymiany z genomowym fragmentem y4 obecnym w opisanym wcześniej plazmidzie z kompletnym łańcuchem H.

176 393

Produktem końcowym był cDNA kodujący kompletny łańcuch H, sklonowany w wektorze pSV.Sport.

W celu stabilnej transfekcji, plazmid pSV.Sport zawierający kompletny cDNA dla łańcucha ciężkiego, trawiono enzymem KpnI, po czym traktowano polimerazą T4 aby wypełnić końce, a następnie trawiono enzymem SnaBI. Otrzymany fragment DNA izolowano poprzez elektroforezę w żelu agarozowym, a następnie oczyszczano przy użyciu zestawu do oczyszczania DNA GENECLEAN® (Bio 101, La Jolla, CA) i tępe końce łączono ligazą z plazmidem pSRS lub pDSRG strawionym enzymem SmaI. Produkty końcowe oznaczono jako sSRSMPA5H (Fig. 1) i pDSRGMPA5H (Fig. 2).

Istniały wcześniejsze doniesienia, że koniec aminowy łańcucha ciężkiego (H) przeciwciała HIL jest chemicznie zablokowany [Chiu i wsp., Biochemistry 18: 554 (1977)]. Za aminokwas N-końcowy uważano glutaminę, tak więc została ona uwzględniona w łańcuchach H zrekombinowanych przeciwciał CMX1,2,4 i 5. Na podstawie porównania aminokońcowej reszty aminokwasowej łańcucha H LAY z odpowiadającymi resztami innych sekwencji łańcucha ciężkiego w podgrupie III, do której należy łańcuch H LAY, w łańcuchu H przeciwciała CMX5-3 N-końcowa alanina łańcucha H LAY została zastąpiona przez kwas glutaminowy.

W celu ułatwienia konstruowania wariantów kompletnych cDNA dla łańcucha L, kodon kwasu glutaminowego w pozycji 105 został zastąpiony przez kodon kwasu asparaginowego, co dało w rezultacie powstanie miejsca restrykcyjnego Sa7I w pobliżu połączenia Vl i Cl. Taka modyfikacja umożliwiła podstawienie wariantów Vl w formie kaset w plazmidzie CMX-5, będącym plazmidem ekspresyjnym dla łańcucha L, opartym o wektor pSV.Sport.

cDNA dla ludzkiego łańcucha lekkiego kappa wyjściowo skonstruowano w oparciu o dane o sekwencji ludzkiego przeciwciała REI [Epp i wsp., Eur. J. Biochem. 45: 513 (1974)]. W tym celu przygotowano siedem syntetycznych oligonukleotydowych starterów, których oznaczenia i odpowiadające SEK NR ID przedstawiają się następująco:

Oligonukleotyd	SEK NR ID
B2262CC	29
B2281CC	30
B2293CC	31
B2294CC	32
B2495CC	33
B2496CC	34
B2704CC	35

Cztery spośród starterów oligonukleotydowych /syntetyzowano w taki sposób, aby obejmowały kompletny cDNA dla łańcucha lekkiego kappa. Oligonukleotydy te (B2262CC, B2281CC, B2293CC i B2294CC) mieszano i wydłużano w jednej reakcji PCR. Po zakończeniu reakcji PCR, produkt oczyszczano poprzez elektroforezę w żelu agarozowym i elektroelucję, klonowano w plazmidzie pUC19 i analizowano poprzez sekwencjonowanie DNA. Wszystkie sekwencjonowane klony zawierały niewłaściwie włączone zasady.

Następnie, aby utworzyć prawidłowy region stały ludzkiego łańcucha Lx, zsyntetyzowano startery PCR: A2495CC i A2496CC. Sekwencja A2495CC obejmowała kodony dla ostatnich czterech aminokwasów struktury zrębowej Vl ludzkiego przeciwciała LAY oraz początek regionu stałego ludzkiego x. Starter A2496CC odpowiadał końcowi karboksylowemu regionu stałego ludzkiego x.

176 393

Reakcję PCR prowadzono używając nieprawidłowe klony z kompletnym łańcuchem L oraz startery A2495CC i A2496CC, a produkt reakcji PCR klonowano w wektorze pSV.Sport. Analiza sekwencji wykazała jednakże, że konstrukt znowu zawierał nieprawidłowo włączone zasady. Ten nowy błąd został skorygowany poprzez dodatkową reakcję PCR ze starterami oligooukleotodnwomi A2495CC i B2704CC. Produkt otrzymany w taki sposób klonowano jako fragment restrykcyjny SalUHindUI w plazmidzie pUC19, który już zawierał fragment Vl8. Uzyskano w ten sposób prawidłowy cDNA dla regionu stałego lekkiego łańcucha x.

Aby złożyć kompletny cDNA dla łańcucha L, Vl1-Vl2 wycinano jako fragment HindlYilBamW. z tępymi końcami i wstawiano do strawionego SmaUBamHl plazmidu pUC19 zawierającego fragment Vl3-Cl. Fragment niosący kompletny łańcuch lekki wycinano z plazmidu pUC19 jako fragment PstlJEcoRI i klonowano oddzielnie w wektorach ekspresyjnych pDSRG i pSRS w celu utworzenia plazmidów oznaczonych odpowiednio, jako pDSRGMPA5L (Fig. 3) i pSRSMPA5L (Fig. 4).

Sekwencje aminokwasów regionów zmiennych ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała CMX5-1 zostały zdefiniowane w Spisie Sekwencji odpowiednio, jako SEK NR ID: 36 i SEK NR ID: 37. Ponieważ reszty amiookwasnwe 1-19 w tych sekwencjach obejmują lider sekrecojoo, który jest odcinany w czasie posttrαnslacySoej obróbki, właściwe sekwencje regionu stałego zdefiniowane są przez sekwencje SEK NR ID: 36 i SEK NR ID: 37, rozpoczynające się od reszty 20.

Konstruowanie Humanizowanych Przeciwciał CMX5-2

W celu skonstruowania humanizowanych przeciwciał CMX5-2, komplementarne nlignouklnotoky oznaczone jako B3194CC i B3195CC (sekwencje określone odpowiednio przez SEK Nr ID: 38 i SEK NR ID: 39) syntetyzowano i przyłączano tak, aby utworzyć fragment BglWJSpel i wymienić z 42 nukleotydowym fragmentem BgRIJSpel łańcucha ciężkiego CMX5-1 w pSV.Sport. Zamieniony fragment sprawdzano poprzez snkwnocjnoowaoie.

Sekwencje aminokwasów regionów zmiennych ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała CMX5-2 są zamieszczone w Spisie Sekwencji odpowiednio, jako SEK NR ID: 40 i SEK NR ID: 41. Ponieważ reszty amionkwasowe 1-19 w tych sekwencjach obejmują lider sekretny, który jest odcinany w czasie posttraoslacojoej obróbki, właściwe snkweocjn regionu stałego zdefiniowane są przez sekwencje przedstawione jako SEK NR ID: 40 i SEK NR ID: 41, rozpoczynające się od reszty 20.

Konstruowanie Humanizowanych Przeciwciał CMX5-3

W celu skonstruowania Vh CMX5-3, osyntetooowaoo cztery nligoouklnotydo, mające sekwencję aminokwasów opartą o region CDR przeciwciała JES1-39D10 i sekwencje zrębowe ludzkiego Vh LAY. Oznaczenia i SEK NR ID odpowiadające tym nligoouklentOdom przedstawiają się następująco:

Olignouklenrok	SEK NR ID
B2784CC	42
B2785CC	43
B2786CC	44
B2921CC	45

Reakcje PCR wykonywano, stosując zestawy oligonukleotydów B2784CC i

B2785CC oraz B2786CC i B2921CC, a produkty poddawano trawieniu w celu uzyskania

176 393 fragmentów Pstl/Spel iXbal/Sa7l. Fragmenty te użyto do wymiany odpowiednio, fragmentów cDNA Vh1 i Vh3 łańcucha H przeciwciała CMX5-1 w pSV.Sport.

Sekwencje aminokwasów regionów zmiennych ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała CMX5-3 są zdefiniowane na liście sekwencji odpowiednio, pod SEK NR ID: 46 i SEK NR ID: 47. Ponieważ reszty aminokwasowe 1-19 w tych sekwencjach obejmują lider sekrecyjny, który jest odcinany w czasie posttranslacyjnej obróbki, właściwe sekwencje regionu stałego zdefiniowane są przez sekwencje przedstawione jako SEK NR ID: 46 i SEK NR ID: 47, rozpoczynające się od reszty 20.

Konstrukcja humanizowanych przeciwciał CMX5-4

Vh przeciwciała CMX5-4 skonstruowano w sposób analogiczny do tego, który zastosowano przy konstrukcji przeciwciała CMX5-1. Zsyntetyzowano w tym celu trzy zestawy zachodzących na siebie nukleotydów, oznaczenia których (oraz SEK NR ID) przedstawiają się następująco:

Oligonukleotyd	SEK NR ID
B2924CC	48
B2925CC	49
B2926CC	50
B2927CC	51
B2928CC	52
B2929CC	53

Używając zestawów oligonukleotydów B2924CC i B2925CC, B2926CC i B2927CC oraz B2928CC i B2929CC, zsyntetyzowano w reakcji PCR trzy odpowiadające fragmenty DNA. Trzy fragmenty sklonowano, ustalono ich sekwencję i połączono w pV.Sport poprzez trawienia enzymami restrykcyjnymi i ligacje.

Vl CMX5-4 skonstruowano poprzez przyłączenie oligonukleotydów oznaczonych B3093XY i B3094XY (sekwencje określone odpowiednio, przez SEK NR ID: 54 i SEK NR ID: 55), a następnie wydłużenie końców 3' każdego nukleotydu w reakcji PCR. Produkt był oczyszczany poprzez elektroforezę w żelu, trawiony enzymami BsEII i Sa7I i użyty do zastąpienia fragmentu BstEll/Sa7l obecnego w cDNA łańcucha L przeciwciała CMX5-1.

Sekwencje aminokwasów regionów zmiennych ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała CMX5-4 są zdefiniowane na liście sekwencji odpowiednio, pod SEK NR ID: 56 i SEK NR ID: 57. Ponieważ reszty aminokwasowe 1-19 w tych sekwencjach obejmują lider sekrecyjny, który jest odcinany w czasie posttranslacyjnej obróbki, właściwe sekwencje regionu stałego zdefiniowane są przez sekwencje przedstawione jako SEK NR ID: 56 i SEK NR ID: 57, rozpoczynające się od reszty 20.

Konstruowanie humanizowanych przeciwciał CMX5-5

DNAVh CMX5-5 skonstruowano poprzez zsyntetyzowanie dwóch fragmentów DNA, stosując pary nukleotydów oznaczone jako B3136CC i B3137CC oraz B3138CC i B3202CC i których sekwencje nukleotydowe są określone w Spisie Sekwencji jak następuje:

176 393

Oligonukleotyd	SEK NR ID
B3136CC	58
B3137CC	59
B3138CC	60
B3202CC	61

Powstałe w wyniku reakcji PCR fragmenty były oczyszczane poprzez elektroforezę w żelu, trawione enzymami restrykcyjnymi i użyte do wymiany fragmentów SpeI/BamHI i BamHIISa7I obecnych w cDNA dla Vhprzeciwciał CMX5-1.

DNA Vl CMX5-5 skonstruowano poprzez zamianę Vl3 (fragment BamHI/Sa7I) CMX5-1 w pSRS na fragment powstały w reakcji PCR w wyniku zastosowania starterów oznaczonych B3142CC i B3143CC (sekwencje określone odpowiednio, jako SEK NR ID: 62 i SEK NR ID: 63) oraz matrycy L CMX5-1.

Sekwencje aminokwasów regionów zmiennych ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała CMX5-5 są zdefiniowane na Liście Sekwencji odpowiednio, jako SEK NR ID: 64 i SEK NR ID: 65. Ponieważ reszty aminokwasowe 1-19 w tych sekwencjach obejmują lider sekrecyjny, który jest odcinany w czasie posttranslacyjnej obróbki, właściwe sekwencje regionu stałego zdefiniowane są przez sekwencje przedstawione jako SEK NR ID: 64 i SEK NR ID: 65, rozpoczynające się od reszty 20.

Ekspresja i Oczyszczanie Przeciwciał

W celu uzyskania ekspresji humanizowanych przeciwciał, 5-1^/wg każdego z pochodnych plazmidu pSRS z łańcuchem L i plazmidu pSV.Sport z łańcuchem H użyto do równoczesnej transfekcji komórek COS o gęstości 5 x 10⁶ poprzez elektroporację. Komórki były następnie wysiewane na podłoże kompletne na płytki hodowlane o średnicy 60 mm. Po opadnięciu i przytwierdzeniu się komórek do płytek (około 6 godzin po transfekcji i wysiewie), podłoże było odsysane i zastępowane podłożem nie zawierającym surowicy. Podłoża były zbierane znad komórek po 72 godzinach.

Stężenie humanizowanych przeciwciał w podłożu znad komórek określano stosując enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA) specyficzny dla ludzkiej IgG4. Płytki do testów immunologicznych Nunc Immunoplates opłaszczano w temp. 4°C przez 24 godziny mysimi monoklonalnymi przeciwciałami przeciw ludzkiej IgG4-Fc (CalBiochem, La Jolla, CA.) o stężeniu 5 μ g/ml w 50 mM buforze wodorowęglanowym, pH 9.5. Płytki blokowano następnie w temperaturze pokojowej przez 20 min. przy użyciu BLOTTO (5% odtłuszczone mleko i 0.05% (obj./obj.) Tween-20 w zmodyfikowanym przez Dulbecco roztworze soli buforowanym fosforanem).

Po odpłukaniu nadmiaru odczynnika blokującego, serie rozcieńczeń próbek w objętości 100 wl nakładano do kieszonek na płytkach. Płytki inkubowano w temp. 37°C przez 2 godziny, po czym próbki odsysano i kieszonki trzykrotnie płukano. Do każdej kieszonki dodawano sto mikrolitrów owczej anty-ludzkiej IgG (H + L) połączonej z peroksydazą (The Binding Site, San Diego, CA,) i płytki inkubowano przez 2 godziny w temp. 37°C. Następnie płytki płukano trzy razy i do każdej kieszonki dodawano 100 wl substratu peroksydazy ABTS (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN.) w celu otrzymania reakcji barwnej. Płytki poddano odczytowi spektrofotometrycznemu przy długości fali 405 nm.

Podłoże znad komórek w przypadku wszystkich pięciu humanizowanych przeciwciał dawało pozytywny wynik dla ludzkiej IgG4. Doświadczenia wykonywane w kilku powtórzeniach wykazały, że stężenie IgG4 w podłożu znad komórek po 3 dniach hodowli było podobne dla przeciwciał CMX5-1, CMX5-2 i CMX5-5 (około 200 μg na ml). Stężenie IgG4 w podłożu znad komórek wytwarzających CMX5-4 było zwykle 2 do 3 razy wyższe. Poziom IgG4 mierzony w podłożu znad komórek zawierających przeciwciało CMX5-3, w

176 393 kiórym obecno jesi sekwencja rrębowa Vh r prreriwriał LAY ramiasi r prreriwciał HIL, był rowsre 5-10 rary niżsry od poriomu wykrywanego dla prreciwciał CMX5-1, 2 i 5.

W celu oirrymonio więksrych ilości ocresrrrznech ludrkich prreriwrislł, wyprowadzono rrekombinowoną linię komórkową CHO wytwarzającą prreciwciała CMx5-1. Plormidy pSRSMPA5H i pDSRGMPA5L rawierające łańcuchy H i L r CMX5-1 iransCekowano równocreśnie w stosunku 20:1 do komórek CHO i selekcjonowano siabilne ironsCekianiy niewrażliwe na głodrenie hipokdanienowe i iemidenowe.

Spośród 106 opornych klonów, badanych pod kąiem wydzielania IgG4 prred radriałaniem meioireksaiem (MTX), 65 klonów dało wynik pofyiewny. Gdy siabilne klony poddano driałoniu meioireksoiu w celu uryskania ampliCikocji genu, okoroło się, że więksrość klonów jesi bordro oporno no ien rwiąrek chemicrny. Jakkolwiek komórki poddawano driałoniu meioireksoiu na poriomie 20, 60 i 200 nM, io nawei prry najweżdrym stężeniu MTX obserwowano iylko niewielkie opóźnienie wrrosiu.

Jeden r najbordriej wydajnych klonów, orna^ony CJA25, poddano siałemu driałaniu skokowo wfrasiająrerh stężeń MTX, aż do osiągnięcia stężenia końcowego 1 mM. Osiaiecrny poriom ekspresji prreciwriało prry siężeniu MTX 1 mM osroczwanz no około 15 pg/komórkę/drień. Siabilność iej linii komórkowej sprowdrano hodując komórki w nieobecności MTX prrer ponad dwa miesiące, w kiórym io crosie poriom ekspresji porostawoł niermieniony.

W równolegle prowodronym doświadcreniu komórki CHO były ponownie iransCekowane równocreśnie plarmidami pDSRGMPA5H i pSRSMPA5L, ale prry siosunku 1:20. Oirrymano 10 do 100 rary niżsrą wydajność ironsCekcji, mimo iż warunki były niemal identycrne jak opisane powyżej. Analira 40 klonów pokarało, że 10 klonów daje poreiewny wynik no sekrecję rrekombinowanej ludrkiej IgG4.

Poriomy prreciwciała JES1-39D10 mierzono w podobny sposób r ią różnicą, że jako odcrynnik wychwytujący użyto korie monoklonalne prreciwciało prreciw srcrurrej IgG Fc (Pierce, RockCord, IL), a owcre aniy-srrrurre IgG (H + L) połącrone r peroksydorą (The Binding Siie, Son Diego, CA) stosowano jako odcrynnik do wykrywania.

Prreriwciała w podłożu rnod komórek ocryszczano standardowymi metodami, stosując chromatografię powinowociwo dla białka G lub białko A/G (Pierce Chemical) rgodnie r roleceniami producentów moieriałów rhromaiogrsficrnech. Ocrysrczone prreciwciało wekarewały 99% rrestzści, co siwierdrono no podstawie anoliry składu ominokwasowego. Prreriwcioła w podłożu wolnym od surowicy rnad komórek hybrydomy JES1-39D10 i klonu CJA25 były również zcfesrcrane prrer chromatografię powinowociwo, siosując kolumny rawierające rwiązar (orresrczonej ludrkiej IL-5 re

Po nałożeniu podłoża rnod komórek na kolumnę, kolumno było płukano kolejno roriworem soli Cirrologicrnej r buCorem CosCzronowem (PBS) i PBS plus 0.5 M NaCl, o nosiępnie ponownie równoważona PBS. Prreciwcisła wiążące ludrką IL-5 nasiępnie wymywano r kolumny 0.2 M glicyną prry pH 2.95, po crym wymywane białka naiechmiasi rzbzJęinionz 1M Tris-HCl pH 8.

Siężenie w iaki sposób ocresrrrsnych prreriwcioł określano prrer obsorbcję UV prry 280 nm, siosując określone molarne współrrenniki obsorbcji. Ocresrcfzne białka ragęsrcronz, dialirowano wobec roriworu soli Cizoologicrnej r buCorem CosCooranowy^m, pH 7.2 i poddawano elekiroCorerie w żelu pzliskrylamidzwem r siorcranem sodowym dodecylu [SDS-PAGE; Laemmli, Nature 227: 680 (1970)] w dwóch 10-20% żelach w warunkach redukujących. Po elekiroCorerie jeden żel barwiono błękiiem Coomassie w celu uwidocznienia prążków białkowych. Białko poddane elekiroCorerie w równoległym żelu od^Uwano poprrer prreniesienie na IMMOBILON®w celu anoliry sekwencji końca N.

Siosując iaki jednoetapowy sposób rrysrczenio, uryskiwono siopień ocrysrcrenia odryskonego białka ponad 99%, co wykarano prrer SDS-PAGE. W warunkach redukujących obserwowano dwa prążki o masie crąstecrkowej 50 i 23.2 kilodolionów, ą ludrką IL-5. Kolumny iakie były prrygoiowywane prrer połącrente rłożem AFFIGEL-15®(BioRad, Richmond, CA).

176 393 odpowiadającej znanym masom cząsteczkowym odpowiednio, łańcuchów H i L immunoglobulin.

Charakteryzowanie Przeciwciał Stałe powinowactwa

W celu określenia czy humanizowane przeciwciała zachowały zdolność do specyficznego wiązania ludzkiej IL-5, mierzono stałe dysocjacji kompleksu przeciwciało/antygen. Było to wykonywane poprzez opłaszczanie płytek do testów immunologicznych mysimi przeciwciałami przeciw ludzkiej IgC4-Fc (5 ^g na ml, 100 na kieszonkę) w 50 mM buforze wodorowęglanowym, pH 9.5. Płytki były następnie blokowane w temperaturze pokojowej przez 90 minut przez BLOTTO, płukane 3 razy i inkubowane w 37C przez 2 godziny z jednym z humanizowanych przeciwciał, bądź oczyszczonym (100 μ l na kieszonkę przy końcowym stężeniu 0.05 μ glml), bądź też w formie podłoża znad komórek (100 μl na kieszonkę).

Tym sposobem cząsteczki zrekombinowanych przeciwciał, obecne w podłożu znad komórek, zostały związane z płytkami poprzez oddziaływanie pomiędzy regionami stałymi i powlekającymi przeciwciałami tak, że regiony zmienne badanych przeciwciał zostały zorientowane w jednolity sposób umożliwiając bezpośrednie i maksymalne oddziaływania z antygenem.

W celu dostarczenia standardu do porównania, równolegle testowano przeciwciało JES1-39D10, stosując kozie przeciwciała przeciw szczurzej IgC Fc, zamiast mysiego przeciwciała przeciw ludzkiej IgC4-Fc jako wychwytujące przeciwciało.

Po trzykrotnym przepłukaniu płytek, serie rozcieńczeń ludzkiej IL-5 znakowanej ¹²⁵I, w stężeniu między 4000 pM i 2 pM, nakładano w objętości końcowej 100 μl do kieszonek na każdej płytce. Każdy test wykonywano trzykrotnie. Wiązanie niespecyficzne określano stosując 1000 krotny molowy nadmiar nieznakowanej ludzkiej IL-5 w kieszonkach kontrolnych. Reakcje pozostawiano do osiągnięcia stanu równowagi w temp. pokojowej na 2 godz., a następnie kieszonki odsysano i przepłukiwano 5 razy TBST. Kieszonki były następnie rozdzielane i mierzone w liczniku y Pharmacja LKB. Wszystkie kontrole niespecyficznego wiązania były wykonywane w dwóch powtórzeniach. W celu uzyskania wartości stałej dysocjacji (kd), wyniki liczbowe otrzymane dla związanej ludzkiej IL-5 poddawano analizie Scatchard (stosując program RADLIC).

Wyniki tej analizy wykazały, że wartości kd otrzymane dla humanizowanych przeciwciał CMX5-1, 2, 3 i 5 mieściły się w przybliżeniu w tym samym zakresie i były zbliżone do wartości otrzymanej dla przeciwciała JES1-39D10. Nie udało się ustalić wartości kd dla CMX5-4 ponieważ wykrywano bardzo niewielką ilość radioaktywności i nie obserwowano odpowiedzi na dawkę.

Testy Kompetencyjnego Wiązania

W celu ustalenia, czy humanizacja prowadzi do zmian w regionie przeciwciała JES1-39D10 wiążącym antygen, przeciwciała typu dzikiego znakowano biotyną, stosując zestaw X-NHS-biotyna (Calbiochem, La Jolla, CA) przy 20 mM stężeniu końcowym odczynnika. Produkt był testowany w bezpośrednim teście ELISA na bezpośrednie wiązanie do ludzkiej IL-5 i stężenie przekraczające około 3 krotnie wartość 50% stosowano w teście kompetycyjnym. To stężenie odpowiadało około 30 ng biotynylowanego przeciwciała JES1-39D10.

W przeprowadzonym teście kompetycyjnym wiązanie biotynylowanego przeciwciała do płytek opłaszczonych ludzką IL-5 mierzono w obecności niewyznakowanego przeciwciała JES1-39D10 lub przeciwciała CMX5-1, CMX5-2 lub CMX5-5, przy czym każde z nich było oczyszczone przez chromatografię powinowactwa białek A/C.

Płytki EIA traktowano 0.1 M NaHCO3, pH 9,2 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dodawano 100 μg ludzkiej IL-5 w TBS na kieszonkę. Płytki inkubowano przez

176 393 noc w temp. 4°C, a następnie blokowano 3% BSA-TBS ml przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Do każdej kieszonki dodawano pięćdziesiąt mikrolitrów z serii dwukrotnych rozcieńczeń współzawodniczących przeciwciał plus odpowiednią ilość biotynylowanego przeciwciała JES1-39D10 (również w objętości 50 μ!) i płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

Płytki płukano następnie 5 razy roztworem TBS-Tween-20, inkubowano z 1 μg/ml peroksydazy z chrzanu (HRP) połączonej ze streptawidyną przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, płukano 5 razy roztworem TBS-Tween-20 i wywoływano tMb, substratem dla HRP. Absorpcję próbek mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 450 nm.

Wyniki pokazały, że podczas gdy nieznakowane przeciwciało JES1-39D10 współzawodniczy z biotynylowaną formą przy stosunku około 1:1, ten sam stopień współzawodnictwa z przeciwciałami CMX5-1, 2 i 5 wymaga większych ilości przeciwciał. Przyjmując, że molarny stosunek przeciwciał niewyznakowanych do biotynylowanych wynosi 1.0, molarne stosunki przeciwciał CMX5-1,2 i 5 do biotynylowanego JES1-39D10, wymagane do wywołania tego samego stopnia hamowania wiązania, szacuje się odpowiednio na 3.3, 1.4 i 1.4.

Hamowanie Wiązania się Ludzkiej IL-5 z Receptorem

Badania nad zdolnością humanizowanych przeciwciał CMX5-1, 2 i 5 do hamowania wiązania się wyznakowanej radioaktywnie ludzkiej IL-5 ze zrekombinowanymi łańcuchami a receptora ludzkiej EL-5 na stransfekowanych komórkach COS wykazały, że wszystkie trzy przeciwciała blokują wiązanie receptora. Tą aktywność blokującą obserwowano przy użyciu zarówno podłoża znad komórek jak i oczyszczonych przeciwciał. Obliczono, że przy stałym 0.5 nM stężeniu znakowanej IL-5, stężenie przeciwciał CMX5-1, 2 i 5 konieczne do wywołania 50% zahamowania wiązania receptora (IC50) wynosi odpowiednio 1.5-3.0, 0.35-0.7 i 0.5-1.1 nM. Wartość IC50 dla przeciwciała typu dzikiego JES1-39D10 została określona na 0.15-0.55 nM.

Modyfikacja Łańcucha Lekkiego Przeciwciała CMX5-5

Wszystkie pięć humanizowanych przeciwciał zawierało kwas asparaginowy w pozycji 105 lekkiego łańcucha wskutek modyfikacji DNA wprowadzonych dla ułatwienia klonowania. W celu odtworzenia wyjściowej sekwencji, kwas asparaginowy w pozycji 105 zastąpiono przez kwas glutaminowy w łańcuchu lekkim przeciwciała CMX5-5. Zostało to wykonane przy użyciu syntetycznego oligonukleotydu, oznaczonego jako B3289CC (SEK NR ID: 66), mającego sekwencję aminokwasów odpowiadającą miejscu styku końca karboksylowego peptydu Vl i końca aminowego peptydu Cl ze zamianą kodonu GAC na GAG. Ta zmiana kodonu powoduje powstanie miejsca restrykcyjnego XhoI w miejscu Sa7I.

Przeprowadzono reakcję PCR stosując startery B3289CC i A2496CC (SEK NR ID: 34) i lekki łańcuch CMX5-5 jako matrycę. Powstały fragment DNA oczyszczono poprzez elektroforezę w żelu agarozowym, strawiono i użyto do zastąpienia fragmentu Sa7I/EcoRI w cDNA dla łańcucha lekkiego CMX5-5 w plazmidzie pSRS. Zmodyfikowany cDNA dla łańcucha lekkiego CMX5-5 wycięto następnie z pSRS i sklonowano w pDSRG w celu uzyskania stabilnej ekspresji. Nowy wariant, zawierający łańcuch ciężki CMX5-2 i zmodyfikowany łańcuch lekki CMX5-5, został oznaczony jako CMX5-OK1. Inny wariant, składający się z łańcucha ciężkiego CMX5-5 i zmodyfikowanego łańcucha lekkiego CMX5-5, oznaczono jako CMX5-OK2.

Efekty biologiczne

Hamowanie ekspresji CD11b indukowanej przez IL-5

Subklon HL-60 (ATCC CCL 240) był utrzymywany w podłożu Iscoves' Modified Dulbecco's Medium (JRH BioScience) uzupełnionym 10% FBS, 2 mM glutaminą i mieszaniną penicyliny ze streptomycyną. HL-60 jest multipotentną ludzką promielocytową linią komórkową, która w obecności maślanu lub ludzkiej IL-5, daje komórki wykazujące

176 393 charakterystyczne cechy fenotypowe eozynofili [Tomonaga i wsp., Blood 67:1433 (1986); Fabian i wsp., Blood 80: 788 (1992)]. Na powierzchni aktywowanych i obecnych w płucach pacjentów z alergią eozynofili obserwowano zwiększoną ekspresję cząsteczki związanej z adhezją komórki, zwanej CDllb/CD'18 [Georas i wsp.,/Am. J. Resp. Celi Mol Biol 7:261 (1992)].

Przed testem, komórki KL-60 były sprawdzane pod kątem różnicowania, poprzez hodowlę przez jeden tydzień w podłożu alkalicznym (pH doprowadzone do 7.6-7.8 przy użyciu NaOH lub wodorowęglanu sodu). Po okresie wzrostu, komórki przenoszono na płytki hodowlane z 24 kieszonkami przy gęstości 2 x 10⁵ komórek/ml. Seryjnie rozcieńczone przeciwciała testowe były wstępnie inkubowane ze stałą ilością ludzkiej IL-5 w temp. 37°C przez jedną godzinę, a następnie dodawane do komórek. Stężenie końcowe IL-5 w hodowli wynosiło 150 pM.

Siedemdziesiąt dwie godziny później komórki zbierano poprzez wirowanie i zawieszano tak, aby uzyskać stężenie u 1 x 10⁶ komórek/ml, a następnie po 50 μΐ (5 x 10⁴ komórek) na kieszonkę umieszczano na płytce do mikromiareczkowania z 96 kieszonkami. Komórki w kieszonkach suszono, a następnie płukano najpierw 70% etanolem, a potem TBS-Tween-20 i blokowano 10% odtłuszczonym sproszkowanym mlekiem i 5% BSA.

Dodawano pierwsze przeciwciało (mysie przeciwciało przeciw ludzkiej CD11b; Becton-Dickinson, Braintree, MA). Po dwugodzinnej inkubacji w temp. 37°C, płytki poddano kolejno: płukaniu 3 x roztworem TBS-Tween-20, przyłączaniu drugiego przeciwciała przeciw pierwszemu przeciwciału (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) i ponownemu trzykrotnemu płukaniu roztworem TBS-Tween-20. Specyficznie połączone przeciwciało wykrywano następnie stosując ELISA Amplification System (Gibco-BRL).

Stwierdzono, że humanizowane przeciwciała CMX5-1, CMX5-2 i CMX5-5 wykazywały zdolność do blokowania aktywności ludzkiej IL-5 indukującej CD11b. Względne wartości IC50 zostały oszacowane jak następuje:

PRÓBKA	IC50 (pM)	STOSUNEK MOLOWY CMX5/IL-5	IC50 CMX5/IC50 39D10
CMX5-1	1467	7.3:1	8.8
CMX5-2	467	2.3:1	2.8
CMX5-5	800	4:1	4.8
39D10	166	0.83:1	1

Jak widać z tabeli, humanizowane przeciwciała CMX5-2 i CMX5-5 wydają się być lepsze od przeciwciał CMX5-1.

Inhibicja Eozynofilii Wywołanej Alergenem u Myszy

W celu stwierdzenia, czy humanizowane przeciwciała wykazują zdolność do neutralizacji aktywności IL-5 in vivo, młode samce ze szczepu myszy B6D2F1/J uczulano albuminą z jaja kurzego wytrąconą ałunem, stosując 8 mg na zwierzę. Tydzień później podawano dawkę przypominającą. Z wyjątkiem nieuczulonej grupy kontrolnej liczącej 5 myszy, wszystkie inne grupy obejmowały 6 myszy.

Tydzień po dawce przypominającej i przed testem prowokacji, uczulonym zwierzętom wstrzyknięto dootrzewnowo testowane przeciwciała w objętości 0.5 ml. Każda grupa otrzymała jedno z następujących przeciwciał: 0.1 mg przeciwciała JES1-39D10 na kilogram wagi ciała, 1 mg przeciwciała JES1-39D10 na kilogram wagi ciała, 1 mg przeciwciała CMX5-1 na kilogram wagi ciała i 10 mg przeciwciała CMX5-1 na kilogram wagi ciała. Szczurze monoklonalne przeciwciało przeciw ludzkiej IL-5 (Schumacher i wsp., jak wyżej), oznaczone jako TRFk 5, użyto jako kontrolę pozytywną. Kontrolne uczulone myszy otrzymały roztwór soli fizjologicznej.

Zwierzęta prowokowano następnie dwukrotnie aerozolem z albuminy jaja kurzego przez 1 godzinę. Dwadzieścia cztery godziny po prowokacji pobierano próbki popłuczyn z płuc, krwi obwodowej i tkanki płucnej, utrwalano, traktowano barwnikami specyficznie barwiącymi eozynofile i poddano badaniom mikroskopowym w celu określenia rozkładu eozynofili.

U myszy, które otrzymały przeciwciało CMX5-1 w dawce 10 mg na kilogram wagi ciała, stwierdzono znacznie zmniejszoną liczbę eozynofili w płynie popłuczynowym z płuc, podczas gdy mniej ilościowe zmiany obserwowano w innych typach komórek. Myszy, które otrzymały JES1-39D10 wykazywały również obniżony poziom eozynofili.

Depozyt Hybrydomy

Linia komórkowa hybrydomy (JESl-39D10.11) wytwarzająca monoklonalne przeciwciało JES1-39D10 została zdeponowana 8 stycznia 1992 w Amerykańskiej Kolekcji Szczepów [American Type Culture Collection (ATCC)], Rockville, MD i zarejestrowana pod numerem Accession No. ATCC HB 10959. Depozyt założono na warunkach określonych w umowie ATCC dotyczącej Depozytu Kultur dla Celów Patentowych, które gwarantuje, że depozyty będą udostępniane Komisarzowi USA Do Spraw Patentów i Znaków Firmowych zgodnie z 35 USC 122 i 37 CFR 1.14 i staną się ogólnie dostępne po wydaniu patentu USA i która wymaga utrzymywania tych depozytów. Dokładność zdeponowanych szczepów nie powinna być rozumiana jako pozwolenie na stosowanie wynalazku sprzeczne z prawami nadanymi przez dany rząd zgodnie z jego ustawami patentowymi..

Wiele modyfikacji i wariantów tego wynalazku można dokonać nie oddalając się od jego ducha i zakresu, co stanie się oczywiste dla osób biegłych w tej dziedzinie. Konkretne dane przytoczone w niniejszym zgłoszeniu stanowią tylko przykład, a wynalazek ma być ograniczony jedynie przez załączone zastrzeżenia patentowe.

Claims (14)

1. Monoklonalne przeciwciało lub jego fragment, które wiąże się swoiście z ludzką interleukiną-5, obejmujące region zmienny łańcucha ciężkiego określony przez SEK NR ID: 1 i region zmienny łańcucha lekkiego określony przez SEK NR ID: 2, wytwarzane przez hybrydoma o cechach identyfikacyjnych linii komórkowej zdeponowanej w Amerykańskiej Kolekcji Szczepów (American Type Culture Collection) pod numerem ATCC HB 10959.

2. Hybrydoma wydzielająca monoklonalne przeciwciało, które wiąże się swoiście z ludzką interleukiną-5, obejmujące region zmienny łańcucha ciężkiego określony przez SEK NR ID: 1 i region zmienny łańcucha lekkiego określony przez SEK NR ID: 2 zdeponowana w Amerykańskiej Kolekcji Szczepów (American Type Culture Collection) pod numerem ATCC HB 10959.

3. Polipeptyd, znamienny tym, że obejmuje region zmienny monoklonalnego przeciwciała, posiadający sekwencję aminokwasów zdefiniowaną przez SEK NR ID: 1 lub SEK NR ID: 2, bądź część takich sekwencji.

4. Izolowany DNA, znamienny tym, że obejmuje około 12 do 333 zasad sekwencji nukleotydowej zdefiniowanej przez SEK NR ID: 1 lub około 9 do 384 zasad sekwencji nukleotydowej zdefiniowanej przez SEK NR ID: 2, bądź też jest funkcjonalnym odpowiednikiem takich sekwencji.

5. Zrekombinowany wektor, znamienny tym, że zawiera DNA według zastrz. 4.

6. Komórki gospodarza, znamienne tym, że zawierają zrekombinowany wektor według zastrz. 5.

7. Sposób wytwarzania polipeptydu, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórek gospodarza według zastrz. 6 w warunkach w których DNA podlega ekspresji.

8. Humanizowane monoklonalne przeciwciało, znamienne tym, że wiąże swoiście ludzką interleukinę-5 i zawiera sekwenqe CDR z regionów zmiennych ciężkiego i lekkiego łańcucha monoklonalnego przeciwciała określonego w zastrz. 1.

9. Humanizowane monoklonalne przeciwciało według zastrz. 8, znamienny tym, że zawiera regiony zmienne ciężkiego i/lub lekkiego łańcucha przeciwciała, mające sekwencje, poczynając od 20 reszty aminokwasowej, zdefiniowane przez SEK NR ID: 36, 37, 40, 41, 46, 47,56, 57,64 lub 65.

10. DNA, znamienne tym, że koduje region zmienny ciężkiego lub lekkiego łańcucha określonego w zastrz. 9.

11. Zrekombinowany wektor, znamienny tym, że zawiera DNA określony w zastrz. 10.

12. Komórki gospodarza, znamienne tym, że zawierają zrekombinowany wektor określony w zastrz. 11.

13. Sposób wytwarzania humanizowanego monoklonalnego przeciwciała, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórek gospodarza określonych w zastrz. 12 w warunkach, w których DNA podlega ekspresji.

14. Kompozycja farmaceutyczna,znamiemia żezawiera antagonistę ludzkiej

IL-5 wybranego r grupy obejmującej: mznzklznolne przeciwciało według rosirr. 1, kompozycję wiążąrą, kióro swoiście wiąże ludrką inierleukinę-5, zawierającą region zmienny łańcucha ciężkiego i region rmienny łańcucha lekkiego monoklonolnego prreciwrioło według radtrr.l, jednołańcuchowe białko wiążące, kióre swoiście wiąże ludrką interleukinę-5, rawierające sekwencje CDR r regionów rmiennych lekkiego i/lub ciężkiego łańcucha monoklonolnego prreriwciała według rasirr. 1 orar humanirowane monokłonalne prreciwciało, kióre wiąże się swoiście r inierleukiną-5, rawierające sekwencje CDR r regionów rmiennych ciężkiego i lekkiego łańcucha mznoklonalnegz prreciwciało według rasirr. 1 orar dopusrcralny Ciffzlogicrnie nośnik.